CN101117351A

CN101117351A - 一种从转基因牛乳中纯化重组人乳铁蛋白的方法

Info

Publication number: CN101117351A
Application number: CNA2007101020356A
Authority: CN
Inventors: 李宁; 汤波; 杨鹏华; 王建武
Original assignee: BEIJING JIPULIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: WUXI KGBIO BIOTECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2007-04-30
Filing date: 2007-04-30
Publication date: 2008-02-06
Anticipated expiration: 2027-04-30
Also published as: CN101117351B

Abstract

本发明提供了一种从转基因牛乳中纯化重组人乳铁蛋白的方法，该方法首先制得去除乳脂和酪蛋白的乳清，然后用阳离子交换色谱进行纯化，并用0.4－1M NaCl、20mM Na₃PO₄梯度洗脱，最后对洗脱液进行超滤或透析处理得到高纯度的重组人乳铁蛋白。采用本发明所述方法得到的重组人乳铁蛋白纯度高达95％以上，具有和天然人乳铁蛋白相似的抵抗胰蛋白酶消化和结合铁离子的能力，而且纯化成本低，适合工业化规模生产。

Description

一种从转基因牛乳中纯化重组人乳铁蛋白的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种从转基因牛乳中纯化重组人乳铁蛋白的方法。

背景技术

人乳铁蛋白(Human lactoferrin，HLF)是一种属于铁结合蛋白家族的糖基化蛋白，由Sorensen首次发现，并由Blanc和Isliker命名。

一系列研究表明乳铁蛋白具有多种重要的生理功能：(1)乳铁蛋白在结构上和生物化学特征上与转铁蛋白的高度相似性表明，乳铁蛋白作为铁转移分子在铁代谢中可能起着很重要的作用；(2)乳铁蛋白通过各种不同的机制实现其抗菌作用，它是一种铁结合蛋白，能限制可利用自由铁的含量，而铁是微生物生长所必须的一种生长因子，故能抑制细菌生长，此外它还可以破坏革兰氏阴性细菌的外膜，释放抗菌活性肽；(3)乳铁蛋白具有非常强的抑制各种具有包膜的病毒侵染的能力，如人细胞巨化病毒、HIV、简单疱疹病毒和人的丙型肝炎病毒等；(4)乳铁蛋白能调节炎症反应；(5)乳铁蛋白可以通过络合铁离子来降低含氧自由基对细胞的损害；(6)乳铁蛋白还具有抗癌作用；(7)乳铁蛋白对免疫系统的作用非常广泛，它对抗体生成、T细胞成熟等都有一定的调控作用；(8)乳铁蛋白除了上述功能之外，还有一些其他的功能，如RNA酶活性、蛋白酶活性、转录调控功能等。

在过去的二十年时间里，人乳铁蛋白转基因研究已取得了很大进展。一些成功的转基因系统可得到较高表达量的重组人乳铁蛋白(高于1克/升)。重组人乳铁蛋白的许多属性都与人乳铁蛋白相同。

关于从乳中纯化乳铁蛋白方法的专利比较多，例如：美国专利US4,436,658描述了从脱脂和去除了酪蛋白的乳清中纯化牛乳铁蛋白的方法，采用pH7.7-8.8的微碱性介质，让乳清通过硅胶颗粒，然后用0.5M MaCl/0.1N乙酸洗脱，得到乳铁蛋白。美国专利US4,791,193和欧洲专利No.EP.0 253 395(Okonogi等)报道了相似的方法，采用偶联了羟甲基的弱酸性阳离子交换树脂，吸附的乳铁蛋白用10％NaCl梯度洗脱。美国专利US4,668,771采用单克隆抗体纯化牛的乳铁蛋白。而专利W089/04608则描述了一种从牛的乳清中获得牛乳过氧化物酶和乳铁蛋白的方法，用滤过的牛乳清通过强阳离子交换剂，在pH＜6.0条件下，采用较高的流速，选择性吸附牛乳过氧化物酶和乳铁蛋白，然后用0.5-2.0M NaCl溶液洗脱。美国专利US4,997,914描述了一种从人初乳或生鲜乳中纯化人乳铁蛋白的方法，采用交联多糖的硫酯吸附人乳铁蛋白，然后0.4-1.5M NaCl溶液洗脱。中国专利CN03152940.2描述了从牛初乳中分离牛乳铁蛋白的方法，采用肝素—琼脂糖(Heparin-Sepharose CL-6B)亲和层析柱，用缓冲液(0～1M NaCl，pH6.5～8.5，0.05～0.005摩尔磷酸钾)洗脱。中国专利CN200410016117.5描述了一种从牛初乳、牛奶或乳浆中提取乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法，应用阳离子交换树脂吸附乳铁蛋白和乳过氧化物酶，用高渗离子渗透液洗脱吸附的乳铁蛋白和乳过氧化物酶，低浓度的缓冲液(02-0.5M NaCl)洗脱乳过氧化物酶，高浓度的缓冲液(2.5M NaCl)洗脱乳铁蛋白，中浓度的缓冲液(＞0.7M NaCl)同时洗脱乳铁蛋白和乳过氧化物酶。中国专利CN200410080264.9将活化的羟甲基弱酸性阳离子交换树脂与脱脂初乳(或初乳乳清)混合，在0-50℃范围内，轻轻搅拌2-20h，用滤布将树脂分离，用去离子水洗脱树脂来除去杂蛋白，然后用0.1％-15％的盐溶液(NaCl，KCl，CaCl₂，MgCl₂，Na₂CO₃等)洗脱树脂，得到乳铁蛋白。美国专利US5,849,885采用Mono S琼脂糖或S Sepharose，20mM磷酸钠缓冲液，0-1M NaCl溶液梯度洗脱，从转基因牛乳中纯化人乳铁蛋白。美国专利5,861,491则采用疏水相互作用色谱，从人和牛乳铁蛋白混合物中分离人乳铁蛋白。

Querinjean等(1971)采用CM Sephadex C-50从人乳中纯化人乳铁蛋白，用0.33M NaCl洗脱。Johannson(1969)采用CM Sephadex C-50，并且报道了使用磷酸钙缓冲液。Torres(1979)报道从豚鼠乳中纯化乳铁蛋白，预先脱脂和去酪蛋白，采用Whatman CM-52，0.5M NaCl/5mM磷酸钠，pH7.5，洗脱。Roberts和Boursnell(1975)报道了从猪乳中纯化乳铁蛋白的方法，采用CM-Sephadex柱子，0.5M NaCl/20mM磷酸盐(pH7)洗脱，然后又上CM-Sephadex，用0.4M NaCl洗脱。Zagulski(1979)采用CM-Sephadex C-50，0.5M NaCl/0.02M磷酸钠(pH7)洗脱，从脱脂牛乳中纯化乳铁蛋白。Moguilevsky(1975)采用CM-Sephadex，1M NaCl洗脱，从人乳中纯化乳铁蛋白。Ekstrand和Bjorck(1986)报道了从牛乳或人初乳中纯化乳铁蛋白的方法，脱脂的乳汁酸化，再调pH＝7.8，上Mono S柱，然后用线性NaCl浓度梯度洗脱。Foley和Bates(1987)报道了从人初乳乳清中分离乳铁蛋白，乳清与弱离子交换树脂(磷酸纤维素)混匀，然后用stepped盐浓度和pH梯度(0.25M NaCl/0.2M sodium phosphate)洗脱。Yoshida和Ye-Xiuyun(1991)采用羧甲基阳离子交换树脂分离乳铁蛋白，0.05M磷酸盐缓冲液(pH7.7)，线性梯度(0-0.55M NaCl)洗脱。羧甲基Toyopearl柱子只结合牛乳清中的乳铁蛋白和乳过氧化物酶，然后用0.4-0.55M NaCl洗脱，得到乳铁蛋白A和乳铁蛋白B。此外，还有报道采用亲和层析的方法，例如Kawakami(1987)报道采用人或牛乳铁蛋白的单克隆抗体纯化乳铁蛋白，Hutchens(1989)采用单链DNA亲和柱从母乳喂养婴儿的尿中分离乳铁蛋白。Chen和Wang(1991)采用亲和层析和过滤结合的方法从牛奶酪中纯化乳铁蛋白，他们使用肝素-琼脂糖结合乳铁蛋白，Bezwoda等(1986)报道Cibacron Blue F3GA树脂纯化乳铁蛋白的方法。对于从牛乳铁蛋白中纯化人乳铁蛋白的方法并未见报道。

综上所述，纯化人乳铁蛋白的方法主要有吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、超滤和盐析法，这些方法在应用上都存在一定的局限性，例如吸附色谱法操作简单，但吸附容量小、效率低；亲和色谱法的优点是分离效果好、纯度高，但柱的制备工艺复杂，成本昂贵；而超滤和盐析法不能实现规模化生产。

随着转基因大家畜的成功，从这些转基因大动物的乳中规模化生产人乳铁蛋白已经成为可能。本发明针对现有技术的空白，建立了从转基因牛乳中分离有生物活性的重组人乳铁蛋白的方法。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种经济高效的从转基因牛乳中纯化重组人乳铁蛋白的方法，并且使纯化的目的蛋白具有正常的理化特性和生理功能。

(二)技术方案

本发明提供了一种从转基因牛乳中纯化重组人乳铁蛋白的方法，它包括如下步骤：

(1)制备乳清：将转基因牛乳在4℃下离心15min，转数为4500rpm，去除乳脂。然后调节pH值去除酪蛋白：先用1M HCl将乳样pH值调至3.8-4.6，脱脂乳与1M HCl的体积比为25∶1；待酪蛋白沉淀后，再用1M NaOH将pH值调回至7.5，乳清与1M NaOH的体积比为25∶1。离心，得到备用乳清；

(2)用阳离子交换色谱进行纯化，采用的介质为偶联了磺酸基的琼脂糖凝胶(SP Sepharose)，所用缓冲液Na₃PO₄的pH是7.5。并用0.4-1M NaCl、20mM Na₃PO₄梯度洗脱，得到两个洗脱峰P1和P2，分别是在0.6M NaCl和0.7M NaCl被洗脱，收集合并同一峰值的洗脱液；

(3)对洗脱液进行超滤或透析处理，制得高纯度的重组人乳铁蛋白。

其中，超滤的操作为：先将洗脱液经5KD的超滤管5000rpm、15min离心浓缩，然后加双蒸水恢复至原体积，再经超滤管5000rpm、15min离心浓缩。

透析的操作采用本领域技术人员熟知的常规方法。

纯化得到的重组人乳铁蛋白可在-55℃冷冻干燥48h，然后于4℃下保存。

本发明所述的方法可应用于从转基因家畜乳中分离转基因蛋白。

(三)有益效果

采用本发明所述方法得到的重组人乳铁蛋白纯度高达95％以上，具有和天然人乳铁蛋白相似的抵抗胰蛋白酶消化和结合铁离子的能力，而且纯化成本低，适合工业化规模生产。

附图说明

图1是梯度洗脱结果图，其中UB表示未结合到柱子上的其它乳蛋白，P1、P2分别表示洗脱下来的重组人乳铁蛋白；

图2是纯度测定结果图，其中M表示低分子量蛋白标准，hLF表示标准人乳铁蛋白，P1表示纯化的P1峰，P2表示纯化的P2峰，W表示上柱前的乳清，U表示未结合到柱子上的乳清；

图3是MOLDI-TOF质谱结果图；

图4是LC-ESI-MS质谱结果图，上图为P1结果，下图为P2结果；

图5是糖基化实验结果图，其中M表示分子量标准，LF’、P1’、P2’分别表示糖苷酶处理的标准LF、纯化的P1、纯化的P2，而LF、P1、P2分别表示标准LF、纯化的P1、纯化的P2，A表示10％SDS-PAGE减性(reducing)电泳结果，B表示对应A的WESTERN结果，C表示10％SDS-PAGE非减性(non-reducing)电泳结果，D表示对应C的WESTERN结果；图6是胰蛋白酶消化结果图，其中M表示低分子量标准，1表示去糖基化重组人乳铁蛋白，2表示Trypsin处理的去糖基化重组人乳铁蛋白，3表示去糖基化LF，4表示Trypsin处理的去糖基化LF，5表示重组人乳铁蛋白，6表示Trypsin处理的重组人乳铁蛋白，7表示LF，8表示Trypsin处理的LF，A表示12％SDS-PAGE减性电泳结果，B表示WESTERN结果；

图7是结合铁的乳铁蛋白波长扫描结果图，其中A表示结合铁的重组人乳铁蛋白，B表示结合铁的人乳铁蛋白标准品，C表示未结合铁的人乳铁蛋白标准品。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中所用的主要试验仪器与试剂如下：

试剂配置：

30％丙烯酰胺：称29g丙烯酰胺和1g N，N′-亚甲双丙烯酰胺溶于60ml水中，加热助溶，加水定容至100ml，0.22um滤器过滤，4℃避光保存。

10％过硫酸胺：称1g过硫酸胺溶于水，定容至10ml，于4℃保存数周。1.5M Tris.Cl(pH8.8)：溶解18g Tris于80ml水中，调pH值至8.8，定容至100ml。1M Tris.Cl(pH6.8)：溶解12.1g Tris于80ml水中，调pH值至6.8，定容至100ml。染色液：考马斯亮蓝R₂₅₀ 1g，甲醇450ml，冰醋酸100ml，加水450ml，溶解后过滤使用。

脱色液：醋酸70ml，甲醇200ml，加水1730ml，混匀使用。25％甲醇，10％乙酸，现配

2×蛋白电泳上样缓冲液：SDS 500mg，巯基乙醇1ml，甘油3ml，1mol/LTris.Cl(pH6.8)2ml，用蒸馏水溶解并定容至10ml。

电极缓冲液(pH8.3)：Tris 3.03g，甘氨酸14.4g，SDS 1.0g，溶于水，定容至1000ml。

10×蛋白电泳缓冲液(pH8.3)：Tris 30.3g，甘氨酸144.2g，SDS 10g，溶于蒸馏水并定容至1000mL。

TEMED：Sigma公司产品。

浓缩胶缓冲液：Tris 6.0g，SDS 0.4g，溶于水，用3N HCl调至pH6.8，定容至100ml。

分离胶缓冲液：Tris 18.17g，SDS 0.4g，溶于水，用3N HCl调至pH8.8，定容至100ml。

转移电泳缓冲液(pH8.3)：Tris 5.8g，甘氨酸2.9g，SDS 0.39g，溶于水，甲醇200ml，定容至1000ml。

10×丽春红储存液：丽春红2g，三氯乙酸30g，磺基水杨酸30g，溶于1000ml水中。

TBS：20mM TrisCl(pH7.5)，150mM NaCl。

TBST：20mN TrisCl(pH7.5)，10mM NaCl，0.05％Tween20。

10％4-氯-1-萘酚：0.1g 4-氯-1-萘酚溶于甲醇中，-20℃保存

12.5％分离胶： 30％丙烯酰胺 12.5ml

1mol/L Tris.Cl(pH8.8) 11.2ml

10％SDS 0.3ml

10％过硫酸铵 0.2ml

TEMED 20ul

H₂O 6.2ml；

7.5％分离胶：30％丙烯酰胺 2.5ml

1mol/L Tris.Cl(pH8.8) 2ml

10％SDS 100ml

10％过硫酸铵 0.1ml

TEMED 5ul

H₂O 5.4ml；

浓缩胶： 30％丙烯酰胺 1.67ml

1mol/L Tris.Cl(pH6.8) 1.25ml

10％SDS 0.1ml

10％过硫酸铵 0.1ml

TEMED 10ul

H₂O 7.03ml。

蛋白质Marker：购自华美生物工程公司，其六条带的大小分别是(Da)：14400，20100，31000，43000，66200，97400。

实验仪器

(1)电泳仪：DYY-III2稳压电泳仪，北京六一仪器厂；

(2)超净工作台：北京净化设备厂；

(3)-80℃超低温冰箱：日本SANYO公司；

(4)制冰机：日本SANYO公司；

(5)超纯水仪：美国MILLIPORE公司；

(6)低温离心机：HETTICH公司；

(7)高速冷冻离心机：BECKMAN公司；

(8)凝胶成像系统：ALPHAINNOTECH公司；

(9)PHS-3C酸度计：上海虹益仪器厂；

(10)自动灭菌锅：日本SANYO公司；

(11)真空离心沉淀机：E-C公司；

(12)37℃恒温水浴仪：美国LIFESCIENCE公司；

(13)AKTA purifer10液相色谱仪：AMERSHAM公司；

(14)HiLoad^TM 16/10 SP Sepharose High performance色谱柱：AMERSHAM公司。

实施例1从转基因牛乳中纯化重组人乳铁蛋白

1.1动物催乳及乳样采集：

采用国营西安草滩制药厂生产的不孕牛催乳针。该产品为盒装，I号针10支，II号针3支。I号针连续肌肉注射10天，每日一次，剂量按说明书的1/2做两组6-8月龄普通牛和转基因牛。II号针在第13、15、17天各注射一支。从注射7天开始每天温水按摩乳房，II号针注射完毕后开始人工挤乳两周，每天两次，乳样收集到50ml离心管中，每次奶样装1.5ml离心管，-20℃保存。

1.2制备乳清：

将奶样于4℃、4500rpm离心15min。取出，可见上层为凝固的乳脂，将下层液体吸出并转移到另一个离心管。将脱脂乳用1M盐酸调节pH值至3.8-4.6，使得酪蛋白沉淀出来，其中脱脂乳与1M HCl的体积比为25∶1；然后将调好pH值的奶样于4℃、5000rpm离心12min。取出，沉淀为酪蛋白，上清液为乳清蛋白，将上清液转移到另一离心管。用1M NaOH将乳清pH值调回至7.5，其中乳清与1M NaOH的体积比为25∶1。将调好pH值的奶样于4℃、5000rpm离心15min，将上清收集到一个新离心管，即为备用乳清。

1.3用阳离子交换色谱进行纯化，并进行梯度洗脱：

HiLoadTM 16/10SP Sepharose High performance色谱柱预先用0.4MNaCl、20mM Na₃PO₄(pH7.5)平衡5个柱体积。15ml脱脂乳通过注射器上样，进入上样环。用0.4M NaCl、20mM Na₃PO₄(pH7.5)平衡5个柱体积，未结合的蛋白收集到一离心管中，用0.4M-1M NaCl、20mM Na₃PO₄(pH7.5)洗脱15个柱体积，收集分离到的各个峰值蛋白，并合并同一峰值的洗脱液。再用1MNaCl、20mM Na₃PO₄(pH7.5)继续洗脱2个柱体积，最后用1M NaCl、20mMNa₃PO₄(pH7.5)洗脱5个柱体积。上述操作均在AKTA purifer10液相色谱仪上进行。最后得到两个洗脱峰P1和P2，分别是在0.6M NaCl和0.7M NaCl被洗脱，如附图1所示。收集合并同一峰值的洗脱液。对P1和P2做了N端测序，证明P1和P2确实是重组人乳铁蛋白。

1.4对洗脱液进行超滤处理，制得高纯度的重组人乳铁蛋白：

将洗脱液经5KD的超滤管5000rpm、15min离心浓缩，然后加双蒸水恢复至原体积，再经超滤管5000rpm、15min离心浓缩。

1.5冷冻干燥：

实施例2重组人乳铁蛋白纯度测定实验

将实施例1得到的纯化产物用超纯水配成1mg/ml，与蛋白上样缓冲液按体积比1∶1稀释，100℃水浴5min，使之充分变性，取出后立即冰浴5min，然后5000rpm离心30秒，准备上样。配制15％SDS-PAGE，上样，电泳参数：浓缩胶，50V，30min；分离胶90V，1.5h。电泳结束后用考马斯亮蓝G-250染色，检测纯度。结果如附图2所示，结果证明得到了纯度很高的重组人乳铁蛋白，而且未结合到柱子上的乳清中基本不含重组人乳铁蛋白，说明柱子的结合效率非常高。

并采用MOLDI-TOF质谱实验(操作见说明书)进行验证，结果重组人乳铁蛋白的分子量为79494道尔顿，并且只有一个峰，充分说明得到的重组人乳铁蛋白纯度相当高，结果如附图3所示。同时，采用LC-ESI-MS质谱检测，结果如附图4所示，经NCBI数据库检索证明P1和P2均为重组人乳铁蛋白。

实施例3糖基化分析实验

PNGaseF消化：按说明书操作，各取10μl纯化的重组人乳铁蛋白和标准LF，加入终浓度为5％的SDS，100℃水浴10分钟，然后冰浴5分钟。依次加入10×NP-40缓冲液1μl，10×G7缓冲液1μl，糖苷酶F。37℃水浴1h，取出终止反应。用不连续15％SDS-PAGE检测，电泳完后转到硝酸纤维素膜上，做WESTERN BLOTING(具体操作参见《分子克隆》第三版，科学出版社，2002年8月出版)。

EndoH消化：按说明书操作，各取10μl纯化的重组人乳铁蛋白和标准LF，加入终浓度为5％的SDS，100℃水浴10分钟，然后冰浴5分钟。依次加入10×G5缓冲液1μl，EndoH糖苷酶。37℃水浴1h，取出终止反应。用不连续15％SDS-PAGE检测，电泳完后转到硝酸纤维素膜上，做WESTERNBLOTTING。

结果如附图5所示，重组人乳铁蛋白比标准人乳铁蛋白略微小一些，经人乳铁蛋白在被糖苷酶消化后表现为相同条带，说明这种差异是由不同的糖基化引起的。

实施例4蛋白酶消化实验

胰蛋白酶消化：胰蛋白酶购自sigma公司。各取10μl去糖基重组人乳铁蛋白、纯化重组人乳铁蛋白、标准LF(乳铁蛋白)，加入终浓度为200μg/ml的胰蛋白酶，37℃水浴15min。从每组中取出2.5μl消化液，加入等体积的上样缓冲液，100℃水浴5分钟后终止反应。用不连续12％SDS-PAGE检测，电泳完后转到硝酸纤维素膜上，做WESTERN BLOTING。

胃蛋白酶消化：胃蛋白酶购自sigma公司。各取10μl去糖基重组人乳铁蛋白、纯化重组人乳铁蛋白、标准LF，加入10μl HCl(终浓度50mM)，胃蛋白酶(终浓度1μg/ml)，37℃水浴1h。从每组中取出5μl消化液，加入等体积的上样缓冲液，100℃水浴5分钟后终止反应。用不连续12％SDS-PAGE检测，电泳完后转到硝酸纤维素膜上，做WESTERN BLOTING。

结果如附图6所示，表明转基因人乳铁蛋白糖基化与人乳铁蛋白相似，具有一定的抗胰蛋白酶消化作用，但是相比较而言人乳铁蛋白更容易被胰蛋白酶消化。

实施例5铁结合能力分析实验

新鲜配置FeNTA溶液(10mM硝酸铁，8.5mM NTA，用固体NaHCO₃调pH＝7.0)，将重组人乳铁蛋白溶解到FeNTA溶液中，使乳铁蛋白与Fe离子的摩尔比为1∶4，20℃下反应1小时，然后用0.15M NaCl溶液透析36小时。所得到的蛋白溶液用分光光度计测量260到700nm的波长。同时在7.5％SDS-PAGE上检测铁结合情况。结果如附图7所示，结合铁的乳铁蛋白在465nm处会出现一个明显的峰，由此可知重组人乳铁蛋白与天然人乳铁蛋白一样都具有结合铁的能力。

Claims

1.一种从转基因牛乳中纯化重组人乳铁蛋白的方法，其特征在于它包括如下步骤：

(1)制备乳清：将转基因牛乳离心去除乳脂，然后调节pH值去除酪蛋白，得到备用乳清；

(2)用阳离子交换色谱进行纯化，并用0.4-1M NaCl、20mM Na₃PO₄梯度洗脱，收集合并同一峰值的洗脱液；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中去除乳脂时离心参数为：在4℃下离心15min，转数为4500rpm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中去除酪蛋白时是先将乳样pH值调至3.8-4.6，待酪蛋白沉淀后再将pH值调至7.5。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于当调节乳样pH值至3.8-4.6时，脱脂乳与1M HCl的体积比为25∶1；当乳样pH值调回至7.5时，乳清与1M NaOH的体积比为25∶1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中用阳离子交换色谱进行纯化时采用的介质为偶联了磺酸基的琼脂糖凝胶。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中所用缓冲液Na₃PO₄的pH是7.5。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中得到两个洗脱峰P1和P2，分别是在0.6M NaCl和0.7M NaCl被洗脱。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中超滤的操作为：先将洗脱液经5KD的超滤管5000rpm、15min离心浓缩，然后加双蒸水恢复至原体积，再经超滤管5000rpm、15min离心浓缩。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于得到的重组人乳铁蛋白可在-55℃冷冻干燥48h，然后于4℃下保存。

10.根据权利要求1-9之任一项所述的方法在从转基因家畜乳中分离转基因蛋白上的应用。