CN102348387A - 生产乳转铁蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产乳转铁蛋白的方法，至少包括步骤：a)使用没有在高于50℃的温度下处理过的原料，b)使该原料接受处理，以获得乳抑菌素(LN)或乳碱性蛋白(MBP)的溶液，c)使该LN或MBP溶液接受在阳离子交换树脂上纯化的步骤，该树脂用4至9pH的醋酸盐缓冲液平衡，并用含有不同溶质浓度的不同缓冲液洗脱，和d)收集含有纯度超过95％，不含有聚合物并且基本上没有LPS、内毒素和血管生成素的乳转铁蛋白的级分。还涉及所获得的乳转铁蛋白，其具有超过95％的纯度，基本上无LPS、内毒素和血管生成素，具有9％至15％的铁饱和水平。

Description

生产乳转铁蛋白的方法
发明领域
本发明涉及乳转铁蛋白(Lf)达到其所有最佳活性并且避免任何继发效应的品质。
发明背景
自从超过65年前其第一次鉴定为牛奶中的“红色蛋白”，并且在1960年纯化，乳转铁蛋白引起了研究者的兴趣并使他们感到困惑。随后其氨基酸序列、三维结构和详细的铁结合特性的测定坚定地证实了乳转铁蛋白是糖蛋白，作为转铁蛋白家族的成员，并且增强了其生物功能与铁结合相关的自然推测。
不同的研究中心起着重要作用，着重于蛋白质的一些生物关键功能。乳转铁蛋白作为多形核白细胞的特定颗粒中的主要成分得到分离，在炎症反应的扩增中起着重要作用。Masson及其比利时小组的大量工作已经证实了乳转铁蛋白在细胞免疫性中的明确作用，并且已经导致巨噬细胞上的特异性乳转铁蛋白-受体的鉴定，内毒素性休克和hyposideremia的媒介作用。Montreuil及其法国小组的开拓性努力阐明了乳转铁蛋白的生物化学。已经公开了乳转铁蛋白在吸收肠道中的金属离子的营养作用。Broxmeyer及其同事报道了乳转铁蛋白在骨髓组织生成中的调控作用。从他的观点看，Reiter报道了奶乳转铁蛋白抑制一些微生物生长的能力，并且发现了细菌的铁营养缺失导致了抗微生物活性。Arnold及其合作者报道了乳转铁蛋白对各种微生物的杀菌活性。Tomita及其在日本Morinaga乳品业的研究小组发现了乳转铁蛋白的酸/胃蛋白酶水解可以产生阳离子抗微生物肽“乳铁多肽(lactoferricin)”。
几项研究已经证实了补充乳转铁蛋白可以提供特别的健康益处和对抗几种疾病的有效的保护。功能表征技术已经说明了乳转铁蛋白介导的多功能活性的分子机理。此外，全世界的实验室研究人员已经在随机的人体试验和体内实验模型中验证了乳转铁蛋白补充的功能成果。
但如果使用实验室生产的高品质的乳转铁蛋白证明了作为对抗环境攻击的一级哺乳动物免疫防御的关键成分的这种胞外糖蛋白的多功能活性，我们发现了商业上生产的乳转铁蛋白不是这种情况。
在工业方法过程中，在其他乳碱性蛋白(MBP)(如，乳过氧化物酶)、一些免疫球蛋白和浓度依赖于阳离子交换树脂特异性的其他杂质的存在下，从奶或乳清中提取出Lf。这构成提取和纯化Lf的简单方法。实际上，我们具有有利条件：MBP中所含的大部分蛋白和酶是着色的。结合于树脂上的不同成分的洗脱将使用含有不同NaCl浓度的溶液进行。使用这样的程序，工业生产者认为90至92％的纯度对应于足够纯以被用于不同的应用中的Lf。
然而，这些方法中没有一种，也没有用于乳转铁蛋白的商业规模纯化的任何其他现有的方法，能够除去影响乳转铁蛋白的稳定性和活性的杂质。
看来杂质酶存在于目前现有的商业乳转铁蛋白制剂中。在从奶或乳清纯化乳转铁蛋白的过程中，这些酶被共同纯化。
关于杂质，如以下将证明的，我们还发现了在Lf的纯化过程中可以纯化血管生成素。该分子具有15kDa的分子量和非常接近于Lf的9.5的等电点pH。
该分子引起供养癌细胞的血管形成、对于肿瘤生长和转移的发展必不可少的新血管形成。在Lf的纯化过程中，该分子被浓缩至少4倍，这无疑对于消费者的健康是没有益处的。
血管生成素促进炎症过程，使得内皮细胞和平滑肌细胞通过基底膜移动以进入损伤部位。血管生成素促进肿瘤细胞的新血管并且促进癌细胞转移的增殖。
血管生成素是一种15kDa的蛋白质，具有非常接近于Lf的9.5的等电点pH。如St rydom等在1997年(Eur.J.Bi ochem，247，535-544)所述的，将血管生成素施加于CM-52(阳离子交换色谱树脂)并用50mM磷酸钠，pH6.6的溶液中的1M NaCl来洗脱。因此，该分子与Lf被共同纯化并且在所有商业Lf存在下已经在SDS-PAGE凝胶中检测到并不令人惊讶。
另一个问题是我们也已经证明的通过Lf聚合物的热处理的生产，参见下文。
因此，对乳转铁蛋白制剂的新的纯化和稳定方法以便除去杂质、蛋白质降解和LPS以增强对细菌生长的活性和保持蛋白质稳定性，并持续较长的一段时间存在很大需求。
尽管最初被鉴定为奶分泌中的丰富蛋白，但乳转铁蛋白主要通过表面上皮细胞来表达并分泌至粘膜环境中。如所述的，不仅在奶中高水平地产生乳转铁蛋白，而且在鼻和气管通道中以及在胃、生殖器和眼分泌物中也高水平地产生。乳转铁蛋白还在嗜中性粒细胞中高水平地产生，其贮存在次级颗粒中，并在炎症过程中释放，有助于它们的抗微生物活性。
乳转铁蛋白含有2个螯合可用铁的同源铁结合结构域，并使需铁结构域的细菌失去这种必需的生长要素。以这种方式，该蛋白发挥出对抗大范围的微生物和某些酵母的抑菌作用。此外，乳转铁蛋白，通过其位于该蛋白的氨基端附近的阳离子肽的存在，已经显示出具有与该蛋白的铁结合功能无关的灭菌和抗内毒素活性。该区域通过破坏细菌膜和通过结合并灭活含有脂质-A的细菌脂多糖(也称为内毒素)来起作用(参见图1)。
乳转铁蛋白还能够调节细胞信号途径，其影响如炎症的减轻、骨生长的促进和癌形成的抑制这样的活性。
因此，其抗炎活性与抑制促炎细胞因子产生的能力相关，但通过几种截然不同的机制，和通过有丝分裂素-激活的蛋白激酶途径产生的骨生长的调节。数量日增的研究表明乳转铁蛋白具有抗癌特性，抑制癌症的生长，这源于其调节影响细胞周期的途径或导致细胞因子(如白细胞介素-18)表达的上调的能力。
此外，乳转铁蛋白的抗微生物功能取决于其蛋白构象、金属结合和环境条件(Naidu AS和Arnold RR.，1995，Lactoferrin interactionsand biological Functions(乳转铁蛋白相互作用和生物功能)，pp259-275，Totowa，NJ，Humana Press)。当乳转铁蛋白结合微生物表面时，抗微生物活性增强。已经对不同的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌病原体鉴定出特定的乳转铁蛋白结合微生物靶(Naidu SS等，1991，APMIS，99，1142-1150)。乳转铁蛋白与包括大肠杆菌的革兰氏阴性肠细菌的孔形成外膜蛋白的高亲和性相互作用对于乳转铁蛋白的抗微生物结果是关键的(Erdei等，1994，Infect Immun，62，1236-1240)。因此，革兰氏阴性细菌中乳转铁蛋白介导的外膜损伤和通过引起改变的外膜渗透的乳转铁蛋白诱导的抗生素强化作用是这种抗微生物结果的典型实例(Naidu等，Diagn Microbiol Infect，1988，Infect Immun，56，2774-2781)。乳转铁蛋白与微生物表面(特别是外膜)的相互作用，形成其他抗微生物机制，如对肠上皮的微生物粘附-阻断和病原体从消化道粘膜上的特异性脱离。乳转铁蛋白的特异性结合快速地瓦解了细菌外膜屏障功能并导致病原体定殖因子和肠毒素产生的停工。
从另一方面看，Appelmelk及其合作者(Appelmelk BJ等，1994，Infection and Immunity，62，2628-2632)发现了Lf结合脂质A，这是LPS的一部分，并且Elass(Elass-RochartE等，1995，Biochem J.312，839-845)证明了该结合位点位于乳转铁蛋白的N-端(肽1至52)，其中还位于Lf活性的主要部分。从这些结果看，容易理解存在于乳转铁蛋白活性与乳转铁蛋白分子结构上结合的LPS存在之间的关联。
存在着LPS和内毒素从肠腔连续转移至血流中。在健康的个体中，血浆阻止LPS和内毒素的肠流入，并且保护内部器官免受损伤。然而，消化道渗透性的任何失调可能提高LPS和内毒素转移至血流中。这样的大规模流入会耗尽血浆灭活LPS和内毒素的能力并最终导致临床内毒素血症(Opal SM，2002，J. Endotoxin Res，8，473-476)。实验证据表明活性氧物质是内毒素血症过程中细胞损伤的重要介质，作为大分子损伤的结果或通过干扰胞外或胞内调节过程。防止生理内毒素血症的重要机理是减少来自肠腔的脂多糖(LPS)。
在N-端(乳转铁多肽)Lf结合脂质-A(具有高亲和性的LPS的毒性部分)，并作为治疗剂起作用来抵消LPS和内毒素的影响(AppelmelkBJ等，1994，Infect Immun，62，2628-2632)。Lf可以有效地减少LPS和内毒素流入至血流中，同时毒素仍然在肠腔内部，但没有达到这样的结果，重要的是无LPS和内毒素地制造了Lf。此外，如果健康人供给的Lf被LPS覆盖，这些LPS可以从该分子中移出并转移至血流中。
然而，在此过程中，如果LPS和内毒素以大量连续释放，Lf也被快速耗尽，并且不可能从足量存在来执行此功能(Caccavo等，2002，J.Endotoxin Res，8，403-417)。已经报道了Lf对抗通过静脉内给予内毒素诱导的致命休克的保护作用。Lf-介导的对抗内毒素(如果分子自身在生产过程中无内毒素)激发的保护与抵抗诱导体温过低和健康的整体提高相关联。使用流式细胞计数测量的体外研究表明Lf以剂量依赖性方式抑制内毒素结合单核细胞，这表明体内的Lf作用机理可能是由于防止诱导单核细胞/巨噬细胞驱动的炎症毒性细胞因子引起的(Lee WJ等，1998，Infect Immun，66，1421-1421)。
人的临床试验也已经显示了食用Lf在宿主防御的初级激活中的积极影响(Yamauchi等，1998，Adv Exp Med Biol，443，261-265)。健康的人显示出其血清嗜中性粒细胞功能的改善，包括增强的吞噬活性和过氧化物产生。此外，Lf与肺泡巨噬细胞、单核细胞、库普弗细胞、肝内皮细胞、嗜中性粒细胞、血小板和T-淋巴细胞的特异性相互作用使Lf在粘膜和细胞免疫中的作用显得突出(Hanson LA，1988，Biology ofhuman milk。Nestl éNutrition Workshop series，15，New York，Raven Press)。然而，Lf结构上该LPS的存在、由于在制造过程中使用太高的温度(15秒后＞550℃)和由于该分子干燥的太高温度引起的Lf聚糖链的损坏以及在该分子热处理过程中出现的Lf聚合物的存在降低了由Lf与这些细胞的相互作用引起的所有这种活性。
关于消化道成熟和粘膜修复，已经证明了口服Lf给药可以起到肠粘膜中的免疫刺激因子的作用。
在母乳喂养期间的新生儿中，胃肠道更快地成熟。这种激活依赖于结合到肠上皮上的Lf。Lf可以在体内加强胸腺嘧啶掺入隐窝细胞DNA中。这种营养作用有助于如肠胃炎这样的病症中的肠粘膜的细胞再生和组织修复(Nichols等，1990，Pediatr Res.，27，525-528)。由于Lf结合肠上皮位于与LPS相同位置的肽(1-52)这一事实，Lf结构上该LPS的存在可降低Lf的这种活性。
Lf在铁和其他微量必需元素(如，锌、铜)的肠吸收中也起着重要作用(
Figure BDA0000089754920000061
B.，1989，J.Nutr.Suppl，119，1839-1844)。Lf还保护消化道粘膜，以免过量吸收重金属离子。人十二指肠刷状缘中的特定Lf结合受体参与铁吸收(Cox等，1979，Biochem Biophy Acta，588，120-128)。鉴定了肠Lf受体。已经报道了通过这种肠刷状缘膜中的Lf受体提高的铁吸收(Kawakami H等，1991，Am.J.Physiol，261，G841-G846和Rosa G等，J.Med Biol.Res，27，1527-1531)，并且在此还报道了负责该分子结合到其特异性受体上的Lf肽被局限于也负责LPS结合的肽1-52。
关于其抗肿瘤活性，Lf显示出能以剂量依赖性方式增强单核细胞的自然杀伤(NK)活性。Lf强烈地提高NK和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞的细胞毒性功能。如果LPS没有结合在Lf结构上和如果Lf没有受到血管生成素污染，低剂量的Lf是有效的细胞介导的免疫应答的调节剂和血清细胞毒性因子。然而，在较高浓度下，Lf-介导的诱导可能导致正反馈或负反馈，这不必定是根据免疫细胞群的密度和亚组以及Lf结构上该LPS的存在。
巨噬细胞、T和B-淋巴细胞和白血病细胞上的特异性Lf受体的发现确定了Lf的潜在抗肿瘤潜能(Shau等，1992，L.Leukoc Biol，51，343-349)，其结构上LPS的存在可以消除这。
Lf的抗炎活性主要与其清除铁的能力相关。已知发炎组织中铁的累积可能导致催化产生高毒性自由基。在炎症应答过程中，嗜中性粒细胞移动至激发位点，以释放其含有Lf的酸性颗粒。这导致了发炎组织部位的强酸性环境的形成，以扩大Lf的铁螯合和解毒能力。除了调节炎症过程中铁的动态平衡，存在日增的Lf可以直接调节各种炎症应答的证据。这种铁依赖性的作用模式是基于Lf结合细菌LPS，这是细菌感染和脓毒性休克过程中的主要促炎调节剂(Miyazawa等，1991，J.Immunol，146，723-729)。Lf在胃炎的调节中起着重要作用，因为这种蛋白也在胃的胃粘膜中表达，并且与位于胃肠上皮细胞上的受体相互作用。当LPS覆盖Lf结构时，Lf的这种活性完全降低乃至消除。几项体内研究已经显示出口服Lf可以降低幽门螺杆菌诱导的胃炎并且保护内毒素血症过程中的胃肠道粘膜完整性。当LPS结合在Lf结构上时，Lf这样的活性也非常差。
可以如下描述Lf的铁依赖性活性：内皮细胞的重要促炎功能之一是在炎症组织部分募集循环的淋巴细胞。脂多糖(LPS)或内毒素是革兰氏阴性细菌外膜中的主要糖脂。LPS是炎症的有效刺激剂，其直接诱导或通过细胞因子的介导来诱导粘附分子的表达，粘附分子如内皮-白细胞粘附分子(E-分泌素)和胞内粘附分子(ICAM-1)。通过CD14发现的可溶性蛋白(sCD14)(特异性受体)来介导内皮细胞的内毒素刺激。CD14是一种55kDa的糖蛋白，其存在于血清中并且作为单核细胞-巨噬细胞表面上的锚定蛋白(mCD14)。在这种机理中，根据LPS(内毒素)的浓度，存在称为LPS-结合蛋白(LBP)的中间产物，其催化LPS单体从聚集体转移至CD14，以形成s CD14-LPS复合物。因此，通过sCD14-LPS复合物或通过单独的LPS的内皮细胞的激活引起包括发烧和低血压的各种病理反应，促进淋巴细胞浸润和微脉管血栓形成，并且在脓毒性休克中，引起弥散性血管内炎症的发病。
然而，哺乳动物的外分泌腺分泌物中发现的和在炎症过程中从嗜中性粒细胞的颗粒中释放出来的乳转铁蛋白能够调节细胞的激活并且避免由LPS存在引起的严重损伤。
感染后，可以在血液中检测到高于20μgr/ml的乳转铁蛋白浓度。乳转铁蛋白是对抗炎症的初级防御系统的一部分。生物体中任何的细菌存在将诱导炎症、癌症和其他病状。这种诱导将刺激免疫应答，包括细胞因子产生、细胞粘附分子表达的提高以及单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞的促炎介质分泌，其通过全身性LPS暴露进入特定的宿主组织中。通过免疫调节分子，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)家族的成员、活性氧物质和脂质，来介导宿主对LPS的应答。那些调节剂的过度产生诱导组织损伤，随后产生多器官衰竭。
乳转铁蛋白防止LBP介导的LPS与mCD14的结合，并降低细胞因子从LPS-刺激的单核细胞中的释放。乳转铁蛋白还可以调节炎症过程。实际上，研究报道了乳转铁蛋白在小鼠中对抗次致死剂量的LPS的保护性功能，乳转铁蛋白结合游离LPS的能力可以部分地说明该分子的抗炎活性。
这就是为什么当人和动物口服或通过注射摄入乳转铁蛋白来修补或避免初级防御系统的缺陷时，根本的是该乳转铁蛋白的品质与产生于必须保护自身对抗微生物侵入的健康人中的内生途径的相同的原因。已知在衰老过程中，内生性乳转铁蛋白产生变得非常差，迫使患者口服或通过注射摄取外源性乳转铁蛋白。
源材料中的杂质会损害Lf的人体健康应用。包括源材料的来源、蛋白质纯化、干燥过程和收集方法、制造环境和贮存条件的几个因素，全部累积地造成Lf蛋白的生物负载。因此，当用作源材料时，奶、乳清或奶清可能携带可发酵的链球菌(嗜热链球菌...)，并且具有酸性环境的培养基选择性地富集几种酵母和霉菌。附带地，通常已知这些微生物群增殖并竞争性地限制几种益生菌的生长。
源自具有来自乳腺炎来源的奶集合的污染的奶的Lf能引入来自革兰氏阳性球菌的LPS的存在，所述革兰氏阳性球菌包括乳房链球菌、金黄色葡萄球菌和凝固阴性的葡萄球菌。另一方面，环境污染物，如形成孢子的杆菌属、乙酸钙不动杆菌、产酸克雷伯氏菌、假单胞菌属种和大肠菌，包括大肠杆菌，以及这些微生物的LPS可以通过洗脱缓冲液、生物污染的设备、风道等...进入Lf材料中。对于GMO衍生的Lf和来自各种表达(如水稻、烟草、酵母、细胞培养物或转基因动物)的重组Lf蛋白，存在相似的微生物学品质问题。因此，一般而言，消除或显著减少这类LPS微生物污染物对于商业Lf的人类健康应用是非常需要的。
如上文所解释的，源材料中的LPS和内毒素内含物会不利地影响Lf应用。革兰氏阴性细菌外膜中的脂多糖(LPS)通常由称为脂质-A(或内毒素)的疏水性结构域、非重复核心寡糖和末端多糖(或O-抗原)组成(Erridge等，2002，Microbes Infect，4，837-851)。LPS和内毒素可以刺激细胞因子和炎症的其他介体的诱导，其随后会引发大范围的不利生理响应(Raetz等，2002，Annu Rev Biochem，71，635-700)。蛋白质分离中所用的奶或其衍生物的革兰氏阴性细菌生物负载、加工厂环境和条件累积地影响Lf源材料中的LPS和内毒素水平。已经综述了蛋白质材料分离过程中内毒素污染的潜在贮藏所(Majde等，1993，Peptides 14，629-632)。Rylanders(Rylander 2002，J.EndotoxinRes，8，241-252)也综述了不同环境条件中内毒素水平的出现，并且进一步指出了与非细菌内毒素相关的风险，特别是来自霉菌细胞壁的1-3-β-D-葡聚糖。因此，色谱树脂的微生物保持标准，加工设备的卫生操作，更重要地Lf纯化中所用水的品质，会累积地影响纯化的Lf材料的LPS和内毒素水平，并因此会限制商业Lf的体内应用。Lf-LPS和内毒素复合物的预先存在可降低Lf与消化道上皮相互作用的潜能，并削弱其控制LPS和内毒素肠流入的能力。
因此，所有商业乳转铁蛋白都应当除去结合在其分子结构上的LPS。例如，Ward、Loren和同事在WO2009/009706中描述了除去结合Lf的内毒素并生产无内毒素乳转铁蛋白产品(EFL)的方法。如果使用鲎测试分析LPS浓度，则不是这种情况。还证明了乳转铁蛋白结构上结合的这种LPS浓度太重要时，复合LPS-Lf能够在一定程度上诱导巨噬细胞中炎症介体的产生，而不是全部抑制LPS活性。这主要是由于以下事实：LPS浓度太重要时，LPS结合→LPS游离之间存在平衡，并且LPS-游离的存在诱导炎症介体的产生。为了安全是迫使Lf生产者纯化该分子除去结合在Lf分子结构的表面上的LPS的原因。
从奶和/或乳清制造，通常的情况是：乳转铁蛋白通过奶中存在的细菌LPS覆盖在其分子结构上，并且如果这样的奶集合已经受到引起乳腺炎奶牛的微生物污染的奶的污染，将是危险的。我们知道一部分乳转铁蛋白活性是由其结合奶中存在的细菌LPS的抗细菌作用引起的。这意味着从奶中提取的乳转铁蛋白蛋白完全由LPS覆盖并不令人惊讶，其已经失去了生物活性的重要部分所述生物活性分别为抗氧化活性、抗细菌活性及其抑制细菌生物膜形成和益生元活性。
此外，通过热处理可以使Lf变性。存在不同的可以用于研究乳转铁蛋白热稳定性的参数。热处理变性遵循一级动力学。变性随着温度增加。无铁乳转铁蛋白(脱辅基乳转铁蛋白)显示出比铁饱和的乳转铁蛋白(全乳转铁蛋白)更快的变性。这反映出当结合铁时，构象更稳定。在热变性过程中，几个结合的破坏引起了Lf结构的重要变化。由于乳转铁蛋白与酪蛋白酸盐和其他奶蛋白质之间的相互作用，在其他奶成分的存在下，热稳定性提高。
从奶中提取出来的乳转铁蛋白具有9至20％的铁饱和乳转铁蛋白的铁饱和水平。然而，与奶或干酪乳清任何热处理前提取的乳转铁蛋白相比，奶或干酪乳清巴氏灭菌后提取的蛋白不具有相同的活性水平并且不具有相同的值。
实际上，热处理能够破坏对于保护乳转铁蛋白对抗胃中存在的蛋白水解酶重要的分子的多糖链并且能够产生Lf聚合物。还通过如下事实证明了这种作用：使乳转铁蛋白接受热处理时，该分子在280nm下具有较高的吸光度(表1)。
对热处理敏感的多糖链的破坏还将提高细胞上乳转铁蛋白的非特异性结合。替代促进细胞生长，乳转铁蛋白的非特异性结合反而将诱导细胞的窒息。实际上，商业Lf的生产者已经确定了使用乙腈梯度通过反相HPLC来测定Lf的纯度。分析一些商业Lf的纯度，我们观察到蛋白质杂质相对Lf峰为约8至9％。然而，稀释相同量的商业Lf，通过灰分和含水量调节，我们在280nm处没有发现相同的光密度。这意味着如同Lf一样稀释一些蛋白质可以增加光密度。在图2等中，我们能够观察到通过离子交换色谱FPLC(Mono-S树脂-Sulfopropyl)分析的Lf显示出与热处理Lf表面相比较小的表面。表面高度的降低是由于新表面的存在引起的，该新表面对应于用FPLC分析观察到的肩部，并且我们称为峰C，来简化色谱图的描述。我们还可观察到Lf表面分裂成两个部分：峰A和峰B，彼此非常接近，峰A对应于一个唾液酸含量的存在，这使该分子与不含有唾液酸的天然分子相比具有较小的碱性。就Lf-NFQ而言，Lf表面也是由两个表面组成(表面A和表面B)。肩部(表面C)只在商业Lf中观察到。与天然Lf相比，肩部或表面C在280nm处具有较高的吸光度，参见以下的表1。
无论如何，我们可以认为峰A和峰B是纯Lf的一部分。使用反相色谱不能检测到峰C的存在。为了了解这个峰C的存在，我们已经进行了280nm至800nm的完整吸收光谱，并且我们在410nm处观察到Soret条带(图2)，这与Lf的铁含量无关，因为该Soret条带应当必须存在于接近465nm的波长处。此外，该峰C在280nm处的吸光度几乎是Lf的两倍。
只收集峰A和B，并且再次施加于Mono S树脂上，我们可以注意到只有峰A和B存在于色谱图上，没有受到峰C的污染。另一方面，如果我们使含有峰A和B的溶液在5分钟期间接受72℃的温度，并且我们在Mono S树脂上分析该溶液，我们观察到与原始色谱图相比，峰A的表面和峰B的表面的明显下降，并且还出现了峰C(图2)。我们使Lf接受更长时间的热处理，更多的峰A和B将具有较低的面积，而峰C更明显。
如果我们在反相上比较，没有热处理的Lf色谱图和经过了5分钟热处理(72℃)的相同Lf的色谱图，我们可以注意到没有热处理的Lf的表面低于经过了热处理的Lf的表面(图3)。已经将峰C表征为具有更高吸光度的Lf聚合物。
  加热(30秒)   1mg/ml的Lf溶液在280nm处的吸光度
  ＜50℃   1,326
  70℃   1,38
  80℃   1,42
  85℃   1,42
表1
问题不仅是基于如下的事实：由制造商纯化的乳转铁蛋白已经失去了一定百分比的生物活性，这可以通过加入较高浓度的该分子来补偿，而且更多地是基于以下的事实：我们建议使用高Lf浓度，以达到一定水平的活性，我们更多地推荐使用高LPS浓度。这会自动地诱导炎症过程，而不是保护患者(表3)。
目前在世界上的健康食品市场中可获得几种Lf产品。这些产品中的大部分源自从初乳、奶或干酪乳清部分分离的Lf。此外，微生物和毒理学品质问题有损于Lf作为有效食品材料的体内性能标准。
通常通过一种或多种不同类型的色谱树脂(如离子交换，尤其是阳离子交换、亲和性(固定化肝素、单链DNA、赖氨酸或精氨酸)、染料亲和性和大小排阻)，从奶或乳清(奶乳清或干酪乳清)中纯化出乳转铁蛋白。超滤膜也可以用于从奶或乳清中分离乳转铁蛋白。Tomita及其合作者(Tomita等，2002，biochem Cell Biol，80，109-112)已经给出了一个工业生产过程的实例，其使用阳离子交换色谱和切向流膜滤。Okonogi及其同事(Okonoki等，新西兰专利No.221，082)、Ulber(Ulber等，2001，Acta Biotechno l，21，27-34)和Zhang及其同事(Zhang等，Milchwissenschaft 2002，57，614-617)已经描述了使用阳离子交换色谱的其他纯化。一些研究者已经使用了该分子的疏水特性，使用疏水性相互作用的色谱来纯化乳转铁蛋白。Machold已经描述了在一系列盐浓度下乳转铁蛋白在几种疏水性相互作用树脂上的保留行为(Machold等，2002，J.Chroma togr.A972，3-19)。
Denis Petitclercq博士在专利申请WO2006/119644中广泛地描述了不同的方法，而该发明的目的在于提供一种除去引起乳转铁蛋白降解的酶杂质的方法。这些酶的去除或特定抑制剂的添加将防止乳转铁蛋白制剂的降解和乳转铁蛋白活性的丧失。他已经将该方法应用于所有商业乳转铁蛋白中，证明了可以提高乳转铁蛋白的稳定性和活性。他提供了一种纯化乳转铁蛋白的方法，包括如下步骤：以结合-洗脱模式和吸附性方式将乳转铁蛋白的溶液接触亲水性吸附剂，并且在表面活性剂存在下接触疏水性吸附剂，两者都在排除的溶质存在下，并且收集基本上没有杂质酶和/或乳转铁蛋白抑制剂的含有乳转铁蛋白的级分。
他已经证明了与使用该方法的纯化乳转铁蛋白相比，由相同供应商以及市场上可获得的其他供应商制造的商业乳转铁蛋白没有呈现出相同的活性。关于抗细菌活性，纯化的乳转铁蛋白在介质中较高浓度的乳转铁蛋白下没有失去其活性(图4)。市场上可获得的商业乳转铁蛋白制剂中没有一种能够呈现出最小抑制浓度，并且他已经证明了从奶或乳清中提取的这些商业乳转铁蛋白在高浓度下已经失去了其生长抑制活性。然而，Petitclerc博士已经推断出这样的现象是由于蛋白酶或降解的肽Lf的存在引起的，但他从未提及血管生成素的存在。
尽管描述了所有研究，但没有一种工业生产方法，也没有用于商业规模纯化的任何其他现有的方法，能够纯化如同它存在于我们的不同分泌液体中那样的乳转铁蛋白。
发明概述
本发明的目的是使用已经研发的新技术避开这些问题以及与生物体中产生的相同品质的Lf，避免杂质(如，蛋白水解酶和血管生成素)的存在，避免细菌脂多糖(包括内毒素)的存在，避免通过使用超过55℃温度的任何热处理引起的多糖链的破坏和Lf聚合物的出现，该新技术可以在商业上产生这种能够具有至少90％生物活性的Lf。
本发明的目的是提供一种方法，该方法可以：
-有效地除去影响乳转铁蛋白稳定性和活性的杂质和除去具有健康负面作用的杂质，
-当心多糖链的热稳定性，该多糖链负责保护分子对抗蛋白酶的蛋白水解降解，并且对于提高特定细胞上的分子的结合和避免Lf聚合物的出现也是重要的。
-除去乳转铁蛋白的分子结构上结合的细菌LPS和内毒素的存在，这些物质影响分子的活性，而且借助于它们的存在可以诱导炎症过程。
根据本发明，提供了一种用于生产乳转铁蛋白的方法，其包括至少以下的步骤：
a)使用没有在高于55℃的温度下处理过的原料，
b)使该原料接受处理，以获得乳抑菌素(LN)或乳碱性蛋白(MBP)的溶液，
c)使该LN或MBP溶液接受在阳离子交换树脂上纯化的步骤，该树脂用4至9pH的醋酸盐缓冲液平衡，并用含有不同溶质浓度的不同缓冲液洗脱，
d)收集含有纯度超过95％，基本上没有LPS、内毒素和血管生成素的乳转铁蛋白的级分。
在一个实施方案中，步骤b)是使该原料接受在阳离子交换树脂上的提取的步骤，使用排除的溶质浓度溶液，以获得乳抑菌素(LN)的溶液(图5a)。
在一个实施方案中，以流过或结合和洗脱模式来进行在阳离子交换树脂上的提取或纯化的步骤。
在一个实施方案中，排除的溶质是氯化钠。在另一个实施方案中，在步骤b)后进行了浓缩和渗滤的步骤。
在进一步的实施方案中，步骤c)包括至少四个洗脱步骤，一个收集杂质的步骤，一个收集乳过氧化物酶的步骤，一个收集LPS、内毒素和血管生成素的步骤和一个收集乳转铁蛋白的步骤(图5b)。
在一个实施方案中，收集杂质、乳过氧化物酶、LPS、内毒素和血管生成素的步骤在4至8之间的pH下进行，并且优选6至7。
在一个实施方案中，收集乳转铁蛋白的步骤在7至9之间的pH下进行。
在一个实施方案中，在纯化步骤中，溶质是0.02至1.5M浓度的氯化钠。
根据本发明，提供了一种具有高于95％的纯度、基本上无LPS和内毒素并且具有9至20％铁饱和的乳转铁蛋白。
在进一步的实施方案中，乳转铁蛋白包含低于50pg/mg的LPS、内毒素和血管生成素。
在进一步的实施方案中，乳转铁蛋白具有9％至20％的铁饱和水平。
附图简述
图1说明了革兰氏阴性细菌的细胞壁上的LPS和脂质A(内毒素)的定位。
图2，说明了未接受热处理的Lf的离子交换FPLC色谱上的色谱图(绿色)和接受了热处理的相同Lf的色谱图(红色)。
图3，说明了未接受热处理的Lf和接受了热处理的相同Lf的反相色谱HPLC上的色谱图。
图4：说明了使用称为Lf-NFQ的在SP-Sepharose Fast Flow上纯化的牛Lf的培养基微稀释液的最小抑制浓度(MIC)的测定，与不同的商业Lf制剂相比较。
图5：说明了乳过氧化物酶和乳转铁蛋白的生产流程图。
图6：说明了Lf纯化的总图。
图7说明了通过连续添加等份三价铁溶液逐渐完全饱和的乳转铁蛋白的光密度来测量铁结合能力。
图8说明了从巴氏灭菌奶提取的乳转铁蛋白、来自UHT奶的乳转铁蛋白、来自微滤奶的乳转铁蛋白和本发明乳转铁蛋白(Lf-NFQ)的铁结合活性。
图9说明了抗细菌活性。与无LPS的Lf(Lf-NFQ)相比，Lf结构(Lf)上的LPS的存在降低了其对大肠杆菌的抗细菌活性。
图10说明了抗细菌活性。与无LPS的Lf(Lf-NFQ)相比，Lf结构(Lf)上的LPS的存在降低了其对抗幽门螺杆菌的抗细菌活性。
图11说明了通过动力学试验测量的Lf-NFQ的抗氧化活性，并且与从牛奶提取的Lf(12.000pg LPS/mg Lf)和从牛乳清提取的Lf(30.000pgLPS/mg Lf)相比较。
优选实施方案的详述
因为根据条件通过热处理可使Lf变性，因此巴氏灭菌的原料，如牛初乳、牛奶和干酪乳清不适于作为bLf(牛乳转铁蛋白)纯化的来源。因此，没有经历严酷加热的脱脂乳、干酪乳清和初乳可以是bLf的来源。因为根据氨基酸组成，Lf具有阳离子性质，其可以通过阳离子交换色谱，如羧甲基(CM)-Sephadex(Law等，1977；Yoshida等，2000)来纯化，并且这种纯化方法是bLf-供应公司中最常用的bLf纯化程序。例如，将脱脂奶(pH6.7)或干酪-乳清(pH6.4)过滤，并施加于阳离子交换色谱柱上，没有pH调节。
如图5中所述，将使用高NaCl浓度溶液(8％)从阳离子交换树脂(提取树脂)洗脱的材料称为乳抑菌素(LN)或乳碱性蛋白(MBP)。LN是含有乳转铁蛋白、乳过氧化物酶和一些其他分子(+/-5％)的溶液。
将该LN微滤、浓缩和渗滤，然后施加于另一种阳离子交换树脂上，该树脂用pH5.5的醋酸盐缓冲液平衡并且我们称为纯化树脂。实际上，在第二个色谱过程中，将通过应用含有不同NaCl浓度的不同缓冲液来洗脱LN中所含的不同分子。这第二个色谱对于获得所要求的乳转铁蛋白是非常重要的。(图6)
通过超滤将乳转铁蛋白浓缩，并通过渗漏与NaCl分离。此后，将Lf溶液在低温和真空下干燥(冷冻干燥技术)，并且贮存在食品级铝袋中。
通过所述的方法获得的乳转铁蛋白在以下的描述中称为Lf-NFQ。
乳转铁蛋白的热和化学稳定性
存在可以用于研究乳转铁蛋白热稳定性的不同参数。热处理变性遵循一级动力学。变性随着温度提高。无铁乳转铁蛋白(脱辅基乳转铁蛋白)显示出比铁饱和的乳转铁蛋白(全乳转铁蛋白)更快的饱和。这反映出当结合铁时，构象更稳定。在热变性过程中，几个结合的破坏引起了Lf结构的重要变化。由于乳转铁蛋白与酪蛋白酸盐和其他奶蛋白质之间的相互作用，在其他奶成分的存在下，热稳定性提高。
从奶中提取出来的乳转铁蛋白具有9至20％的铁饱和乳转铁蛋白的铁饱和水平。然而，与奶或干酪乳清任何热处理前提取的乳转铁蛋白相比，奶或干酪乳清巴氏灭菌后提取的蛋白不具有相同的活性水平并且不具有相同的值。
实际上，热处理能够破坏对于保护乳转铁蛋白对抗胃中存在的蛋白水解酶重要的分子的多糖链并且能够产生Lf聚合物。还通过如下事实证明了这种作用：使乳转铁蛋白接受热处理时，该分子在280nm下具有较高的吸光度。
乳转铁蛋白的铁结合活性
已经对其铁结合活性测试了从微滤的奶提取的乳转铁蛋白的活性。通过连续加入等份三价铁溶液使乳转铁蛋白逐渐到达完全饱和。在465nm处通过分光光度计监视铁饱和的比率。
当测量的光密度不在改变时，到达饱和(图7)。在图中，在计算天然蛋白(b1)和饱和蛋白(b2)的465nm处测量的吸光度比率中，存在两种评价铁饱和初始比率的方式。
b1-----X100＝％初始饱和b2
或通过计算a1/a，其中
-a1：＝结合天然蛋白的三价铁的μmole
-a＝结合饱和蛋白的三价铁的μmole
a1-------X100＝％初始饱和
当乳转铁蛋白是完整和有活性时，维持了其结合铁的能力。另一方面，当该蛋白由于UHT处理而变性时，或由于巴氏灭菌处理部分失去时，它失去其铁结合能力(图8)。
牛乳转铁蛋白具有9至20％之间的铁饱和水平。结果已经表明铁的能力在从微滤的奶提取的乳转铁蛋白和本发明的乳转铁蛋白之间相似。两种结果之间的差异是不显著的。
抗细菌活性
如以上所解释的，抗微生物活性功能性取决于其蛋白构象、金属结合和介质条件(Naidu等，1995)。当Lf结合微生物细胞表面时，抗微生物活性增强(Naidu等，1993)。Lf与革兰氏阴性肠细菌(包括大肠杆菌)的孔形成外膜蛋白的高亲和性相互作用对于Lf的抗微生物结果是关键的(Ellison等，1988)。
因此，重要的是：当我们从牛奶或乳清干酪产生Lf时，我们确保不再有细菌脂多糖结合在Lf结构上。
针对大肠杆菌和幽门螺杆菌两种微生物测试了乳转铁蛋白，图9和图10中分别给出了结果。
大肠杆菌程序
生物材料
来自BCCM/LMG细菌保藏中心：laboratorium van MicrobiologyUniversiteit Gent K.L.Lededanckstraat 35B，9000Gent的大肠杆菌K99
选择培养基SCC Coli/大肠菌色原-琼脂
蛋白胨水
蒸馏水
多批乳转铁蛋白
细菌溶液的制备
将冻干菌株放入到含有0.5ml蛋白胨的溶液中
将100μl溶液喷雾
重复
同时，取100μl，放入到9ml蛋白胨中
制成3管，并在37℃下培养24小时
取1ml细菌溶液，来获得OD
使细菌溶液的OD达到104至105CFU/ml的浓度
Lf溶液的制备
每批Lf取500mg
加入100ml蒸馏水
50mg/ml的溶液
过滤溶液
在每个蛋白胨水试管中(9ml)，取出400μl，以达到8.6ml的体积，并加入0.4ml每种待分析的Lf粉，以达到2mg/ml
加入1ml 105至106CFU/ml的细菌溶液
对于试管对照，取0.0ml蛋白胨溶液，并加入1ml细菌溶液。
操作
制备差异溶液：10-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7
皮氏培养皿的培养
将100μl差异稀释的溶液放入皮氏培养皿的中间
将皮氏培养皿在37℃培养24小时。
评价
24小时后，我们测定了大肠杆菌的CFU。
幽门螺杆菌程序
生物材料
幽门螺杆菌菌株：在BCCM/LMG细菌保藏中心：laboratorium vanMicrobiology Universiteit Gent K.L. Lededanckstraat 35B，9000Gent定购的LMG 8775：3冷冻BCCMTM培养物
皮氏培养皿中含有绵羊血的胰蛋白胨大豆琼脂培养基
蛋白胨水
蒸馏水
多批乳转铁蛋白
细菌溶液的制备
将冻干菌株放入到含有0.5ml蛋白胨的溶液中
将100μl溶液喷雾
重复
同时，取100μl，放入到9ml蛋白胨中
制成3管，并在厌氧条件下培养2天
取1ml细菌溶液，来获得OD
使细菌溶液的OD达到105至106CFU/ml的浓度
Lf溶液的制备
每批Lf取500mg
加入10ml蒸馏水
50mg/ml的溶液
过滤溶液
在每个蛋白胨水试管中(9ml)，取出400μl，以达到8.6ml的体积，并加入0.4ml每种待分析的Lf粉，以达到2mg/ml
加入1ml 105至106CFU/ml的细菌溶液
对于试管对照，取9.0ml蛋白胨溶液，并加入1ml细菌溶液。
操作
制备差异溶液：10-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7
皮氏培养皿的培养
将100μl差异稀释的溶液放入皮氏培养皿的中间
将皮氏培养皿在37℃和厌氧条件下培养2天
评价
2天后，我们测定了H.P.的CFU。
益生菌增殖和肠健康
存在2种可能性：
生长阻抗检测试验和微尺度光密度测定
1)生长阻抗检测试验
通过测量培养基中的阻抗信号(电容和电导的函数)，将bactometer微生物监控系统用于监控益生菌乳杆菌或双歧杆菌菌株的生长。
将0.25ml体积的Lf-NFQ，接着在0.9％盐水中制备的0.25ml的细菌悬浮液(104细胞/ml)加入到孔中。加入0.5ml细菌悬浮液作为对照。将接种的模块在32℃下培养，并且通过Bactometer以6分钟的间隔持续监控培养基中的阻抗变化，持续48小时。通过图将细菌生长曲线呈现为阻抗信号相对培养时间的百分比变化。将引起一系列明显偏离基线阻抗值需要的时间量限定为检测时间。如果该检测时间低于对照，则认为测试样品引起了“益生菌作用”。
2)微尺度光密度测定
这种测量体外微生物生长的方法是基于浊度测定(turbidometric)试验。简而言之，将0.1ml的无菌培养基加入到孔中。将0.05ml体积的测试溶液加入到指定的孔中，接着接种0.05ml含有+：-105细胞/ml的微生物细胞悬浮液(从660nm的1的O.D.＝109细胞/ml稀释)。接种后，将孔在37℃下培养，并使用微量平板阅读器，通过测量660nm的O.D，作为培养基中的浊度变化，在不同的时间监控微生物生长。含有肉汤但不含微生物接种物的孔作为无菌对照。含有接种了细菌的肉汤培养基但不含测试化合物的孔作为阳性生长对照。当与生长对照相比试剂增强了微生物增殖时，则出现了益生菌作用。
与对照相比，无LPS乳转铁蛋白应当将检测时间缩短30％。通常，估计益生菌的检测时间为15小时，无LPS乳转铁蛋白应当将该检测时间缩短4-5小时。此外，使用无LPS乳转铁蛋白，益生菌测试菌株的增殖将提高＞100％，这至少为脂多糖覆盖的乳转铁蛋白的效率的两倍。
为了被视为Lf-NFQ，与对照相比，Lf溶液应当将检测时间缩短25至30％，并且在48小时培养后，与对照相比，提高最少100％。
如我们之前所述的，Lf通过铁耗尽停滞机理引起了微生物生长抑制。铁对于许多生命体(包括肠病原体)通过细胞色素依赖性电子转运系统产生ATP是重要的。然而，肠益生菌ABL(ABL＝Acidophilus、双歧杆菌、乳杆菌)与细胞能量合成的细胞色素途径无关，因此选择性地逃避Lf的铁耗尽抗微生物停滞。这种Lf在肠环境中的益生菌作用是天然选择的现象，以通过细菌抑制来富集有益的益生菌菌丛和实现有害病原体的竞争性排除。公知母乳喂养婴儿的大肠主要由双歧杆菌种定殖，其具有对抗肠病原体的保护性作用。Lf结构上的LPS和内毒素的存在将降低该分子的这种益生菌作用(表2)。
表2：益生菌活性：从乳清或从奶提取的商业Lf与Lf-NFQ相比具有较低的益生菌活性。
表2
 益生菌活性   Lf-乳清   Lf-奶   Lf-NFQ
 双歧杆菌spp(n＝2)   124％   141％   213％
 乳杆菌spp(n＝8)   97％   145％   200％
“抗氧化活性”
按照以下所述的铁还原/抗氧化剂效力(FRAP BENZI E I.F.F.andSTRAIN J.J.in Methods in Enzymology，vol 299，1990，p15)试验已经用于测量Lf-NFQ的抗氧化活性。通过混合40ml的0.3M醋酸盐缓冲液(pH 3.6)、4ml的20mM氯化铁和4ml的10mM TPTZ(2，4，6-tris(2-吡啶基-s-三嗪)来制备FRAP试剂。将6-OH-2，5，7，8-四甲基色满-2-羧酸的系列溶液(0.1至1.0mM)用作FRAP标准。在试验前，使所有试剂达到37℃。通过混合20μl蒸馏水、10μl Lf-NFQ样品和150μl FRAP试剂，在96-孔微量平板中进行了FRAP试验。在组合研究中，将10μl蒸馏水和20μl Lf-NFQ与150μl FRAP试剂混合。此后，立即在37℃下培养，5分钟(对于抗坏血酸)和5分钟至24小时的时间(对于Lf-NFQ)。在593nm处测量反应混合物的吸光度。与抗坏血酸的FRAP值相比，给出测试化合物的抗氧化剂(FRAP)值。
无LPS乳转铁蛋白(Lf-NFQ)应当在6小时内达到0.660mM的值，在24小时内达到0.994mM的峰值(图11)。
达到该值的90至100％的值，则认为Lf是可接受的。
细菌脂多糖(LPS)与Lf的结合涉及蛋白质对一些革兰氏阴性细菌的灭菌机制(Ellison等，1991)。Miyazawa及其同事已经证明了(1991)LPS与乳转铁蛋白的结合改变了乳转铁蛋白结合骨髓细胞系的机制。已知很有可能在革兰氏阴性感染部位Lf遇到相当大含量的LPS，我们检测了LPS结合Lf对抑制OH°形成能力的影响，OH°形成是由补充铁的黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统导致的，如通过脱氧核糖氧化试验所测定的(Cohen等，1992)。
可以将LPS结合乳转铁蛋白降低其对嗜中性粒细胞的引发作用的机制比作不同的假设。可能性包括对LPS受体的亲和性的降低或导致引发的信号传导机制的同时改变。无论如何，数据表明了以下的可能性：LPS与乳转铁蛋白的结合可以提供降低脓毒性休克情况下发生的促炎事件的方式。与该可能性相一致，已经报道了乳转铁蛋白能降低大肠杆菌诱导的脓毒性休克的小鼠模型中的死亡率(Zagulski等，1989)。总之，如我们在图10中所观察到的，Lf结构上LPS的存在，强烈地限制了其抗氧化活性。
如图11中所说明的，已经证明了与其最初来源Lf-乳清或Lf-奶相比，无LPS和内毒素Lf(Lf-NFQ)具有上等的抗氧化活性。
图表3中所说明的，已经证明了LPS-Lf能够诱导肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素8(IL-8)的产生。
为了分析Lf的这种活性，我们已经在用大肠杆菌HB101(pRI203)感染的和未感染的肠上皮细胞中研究了其对促炎细胞因子表达的下调作用，我们遵照了Berlutti所述的实验方案(Berlutti等，2006)，使用Caco-2细胞以及各自具有1.650pg LP/mg Lf、22.000pg LPS/mg Lf和105.000pg/mg Lf的样品Lf-A、Lf-B和Lf-C，并且我们比较了使用Lf-NFQ(39pg LPS/mg Lf)的结果。当我们在Lf不存在下感染Caco-2细胞时，我们观察到与未感染的细胞相比，促炎细胞因子(如，IL-6、IL-8和TNF-α)的表达显著提高(表3)。在Lf的存在下，在Lf-NFQ的情况下，细胞因子的表达降低，但在其他Lf样品的情况下，没有降低(表3)。我们可以推断Lf结构上的LPS的存在抑制了其下调感染细胞的细胞因子表达的活性。令人惊讶的是，在含有一定量的结合其结构的LPS的Lf的存在下，在未感染细胞的情况下，细胞能够诱导细胞因子的表达，并且这种表达与Lf结构上结合的LPS的浓度无关，对于仅具有39pg LPS/mg Lf的Lf-NFQ，就不是这样的情况(表3)。这种表达可能是由于以下事实引起的：可能是由于用于细胞培养的介质，一些LPS从Lf结构上脱离，并且对于未感染细胞起着促炎剂的作用。这种作用似乎比Lf的下调作用更重要。
用于这种测试的实验方案如下：
细胞培养
在补充1.2gr的NaHCO3/升，2mmol谷氨酰胺/升，100U青霉素/ml，0.1mg链霉素/ml和20％热灭活的胎牛血清的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基中，在37℃的5％CO2培养箱中，使人结肠癌Caco-2细胞生长成半汇合单层。在感染前十二小时，用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗涤单层，然后在不含胎牛血清的新鲜培养基中培养，以避免感染过程中转铁蛋白的存在。
用大肠杆菌HB101(pRI203)感染宿主细胞
Berlutti等，2006已经描述了该方法。在无LPS-Lf的不存在或存在下，或在含有不同水平的LPS的Lf(100μg蛋白/ml)的存在下，在每个细胞100个细菌的感染复数下，用大肠杆菌HB101(pRI203)感染半汇合的Caco-2细胞单层。4小时培养后，用不含Ca2+和Mg2+的PBS将细胞彻底洗涤。洗涤后，将含有100μg庆大霉素/ml的新鲜培养基加入到大肠杆菌HB101(pRI 203)感染的单层中，以杀灭胞外细菌，并且将细胞在37℃下再培养2小时，并且彻底洗涤。然后，用0.3ml胰蛋白酶-EDTA混合物(0.05％胰蛋白酶(1/250)和0.02％EDTA)在37℃下将单层处理5分钟，并通过加入0.5ml1％脱氧胆酸来裂解。将细胞裂解物在不含Ca2+和Mg2+的PBS中稀释，并涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的琼脂上，以确定活的胞内大肠杆菌HB101(pRI 203)的数量。
通过ELISA检测Caco-2上清液中的IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子α(TNF-α)
如Berlutti等2006所述，按照以上所述的，在无LPS-Lf的不存在或存在下，或在含有不同水平的LPS的Lf(100μg蛋白/ml)的存在下，感染半汇合Caco-2细胞单层。4小时培养后，用PBS将细胞彻底洗涤，将含有100μg庆大霉素/ml的新鲜培养基加入到单层中，并且将细胞在37℃下再培养24小时。最后，收集每个孔的上清液，并且使用标准ELISA Quantikine试剂盒(R&D Systems，Wiesbaden，德国)和HBT试剂盒(Holland Biotechnology BV，Firma Bierman，Bad Nauheim，德国)来测定IL-6、IL-8和TNF-α的浓度。
表3
没有感染的Caco-2细胞
  细胞因子(pg/ml)   无Lf   Lf-NFQ   Lf-A   Lf-B   Lf-C
  TNF-α   44   40   105   130   165
  IL-6   112   87   140   220   430
  IL-8   2700   2750   3600   3650   4600
用大肠杆菌HB101(pRI203)感染的Caco-2细胞
  细胞因子(pg/ml)   无Lf   Lf-NFQ   Lf-A   Lf-B   Lf-C
  TNF-α   160   48   154   164   160
  IL-6   1200   150   1240   1350   1300
  IL-8   12250   3200   10700   10800   11500
表3：
在Lf-NFQ、Lf-A、Lf-B、Lf-C(100μg/ml)的存在或不存在下，培养未感染的Caco-2细胞或用大肠杆菌HB101(pRI203)感染的Caco-2细胞。通过ELISA测定分泌的细胞因子的浓度。认为P值＜0.01是显著的。
鲎试验
如我们以上所述的，认为LPS和内毒素的存在是Lf活性性能降低的最重要杂质之一。基于杂质的类型和水平，以及微生物性质，确保了Lf工业规模制造中的良好制造实践，已经在加工方法的不同步骤中使用特定的缓冲剂作为纯化剂来研发了纯化方法。这种技术可以系统地延伸污染减轻的处理范围，以增强Lf的多功能特性，由此形成有力的生理系统。
此外，在纯化过程中，已经用于制备所有缓冲液的水是蒸馏过的，并且通过微滤、臭氧(O3)和UV254nm处理过。该水是无热原的。
通过根据美国食品管理局(FDA)细菌学分析手册的标准试验测量了不同商业Lf制剂的生物负荷。使用Cambrex Bioscience，Walkerville，MD研发的测试试剂盒，通过鲎变形细胞裂解物试验来定量商业Lf制剂中的LPS和内毒素污染。商业Lf的分析揭示了乳清衍生的Lf比奶衍生的Lf带有更多生物负荷。乳清衍生Lf的好氧平板计数的显著部分鉴定为革兰氏阳性微生物，如青霉属和曲霉属。两种商业Lf制剂的LPS和内毒素水平反映出它们的大肠菌和革兰氏阴性细菌的负荷。乳清衍生的Lf中的中值LPS和内毒素比奶衍生的Lf高约3倍。两种Lf制剂中的LPS和内毒素杂质是生物活性的，并且诱导受激单核细胞和肠上皮细胞(Caco-2细胞)中的TNF-α(肿瘤坏死因子)产生。
(表3)
为了避免这个问题，覆盖乳转铁蛋白结构的LPS和内毒素的含量应当处于50至100pg/mg乳转铁蛋白的值(图13)，优选值＜50pg/mg Lf。
对肠细胞粘膜的活性
一些研究已经证明了实验室中的Lf能够对肠粘膜细胞更新具有活性。将该分子加入到5至9个月大的由于胃肠炎住院的婴儿特定方案中时，我们研究了这种活性，比较了对照(标准商业Lf)和Lf-NFQ。Lf的浓度与母乳提供的Lf相似(15mg/kg/天)。在处理开始后第2天和第4天，以及5天后，进行了空肠活体检查。使用免疫染色技术(PCNA-细胞周期蛋白免疫染色-Galand et Degraef，Cell tissue Kinet，1989，22，383-392)评价了细胞更新。二十名患者接受了不含Lf的特定方案，十七名患者接受了含有商业Lf的特定方案，而十八名患者接受了含有Lf-NFQ的特定方案。在处理头4天的过程中，在所有三组中，S-期有丝分裂细胞的百分比没有显著差异(6至15％)。
5天后，S-期有丝分裂细胞的百分比有明显差异，我们观察到在两个Lf组中快速增加，与水平为5至8％的对照组相比，接受了商业Lf的婴儿为12至15％，接受了Lf-NFQ的婴儿为18至21％。
此外，表4中描述了两个Lf组的刷状缘肠上皮细胞的二糖酶活性提高，但对照组仍然停留在低水平。这些结果表明Lf在急性胃肠炎恢复期中对肠上皮细胞更新具有有利的作用。与商业Lf比较，就Lf-NFQ而言这种作用更优。
表4
研究：将Lf加入重新喂养方案后，急性胃肠炎期间提高的肠上皮细胞更新。
测试：17名婴儿-年龄：5至10个月大-商业Lf：15mg/kg/天
18名婴儿-年龄：5至9个月大-Lf-NFQ：15mg/kg/天
对照：20名婴儿-年龄：5至15个月大-无Lf
第(2-4)天和5天后的肠活体检查
肠上皮细胞更新(细胞周期蛋白/PCNA)
  对照   商业Lf   Lf-NFQ
  第2-4天：S-期有丝分裂细胞   6-15   6-15   6-15
  5天后：S-期有丝分裂细胞   5-8   12-15   18-21
刷状缘双糖酶
 对照  商业Lf   Lf-NFQ
  乳糖  3-5％  10-12％   24％
  麦芽糖  2-6％  19-20％   31％
  蔗糖  2-4％  10-12％   24％
实施例：
原料
如所解释的，为了避免由于热处理引起的乳转铁蛋白变性/或其多糖链的破坏和/或Lf聚合物的出现，重要的是从未经巴氏灭菌的原料提取Lf，如巴氏灭菌前的脱脂奶或无酪蛋白盐的奶，或干酪-乳清或脱脂初乳。
首先，在从AFSCA(联邦食品链安全署)收到了控制安全性编号的农场中，在最高10℃下，收集原料。
将原料在50℃下脱脂，并且在提取含有LN的Lf之前，不需要微滤。然而，一些奶合作社优选将原料在1.4μ陶瓷膜上微滤，这为它们建立了巴氏灭菌的替代。
乳转铁蛋白的提取
其活性部分具有12m3体积的提取柱色谱含有2.000升(流化床)或更多的提取树脂(依待处理的原料的数量而定)。通过这种阳离子交换树脂施加原料，并且在pH6.6下阳离子下的分子结合在树脂上，因此该树脂可以提取LN。LN是主要由碱性蛋白/酶组成的混合物。考虑到分子的颜色，易于观察到它们与树脂的结合。我们将观察到从开始时，由于碱性分子的结合，并且主要是由于乳过氧化物酶(其特征在于墨绿色，该颜色是主要的)，树脂从白色变成黑色。流速可以为每小时25.000升至50.000升，这取决于原料的品质、数量及其来源。
我们继续施加原料，直至使树脂的结合能力饱和(65％Lf，30％LP和5％杂质)，并且我们将观察到树脂的颜色仍然是黑色的。基于该分子的等电pH，表示最高等电pH等电的Lf，我们可以继续施加原料通过柱子，并且我们将观察到Lf能够移动结合在树脂上的LN的其他分子并且将它们置于树脂上。对应于等于使树脂饱和所需体积的2.5倍体积的一定时间后，我们可以观察到树脂变成红色，这意味着树脂几乎只使Lf结合在其支持物上。在这样的条件下，乳抑菌素将由88％的Lf、10％的LP和2％的杂质组成。
通过施加1.35M NaCl溶液(8％)来洗脱这种LN，其成分的浓度将取决于原料的来源、施加的时间或体积。将如此收集的我们称为乳抑菌素(LN)或乳碱性蛋白(MBP)的溶液浓缩，并且使用30kD膜渗滤。考虑到我们开始纯化过程(第二个步骤)的时间，MBP溶液将通过0.8μm陶瓷膜进行微滤。
乳转铁蛋白的纯化
在施加于另一种阳离子交换树脂之前，将LN贮存在4℃。将LN溶液施加于阳离子交换树脂上。将要施加的体积将取决于与LN中乳转铁蛋白浓度相关的树脂的体积。这种纯化树脂是Amersham制造的Sepharose Fast Flow。
每天，将根据纯化树脂体积的一定体积的LN溶液施加于阳离子交换树脂上，该树脂用pH4至8.8的50mM醋酸钠缓冲液和0.02M至1.5M浓度的NaCl溶液来平衡。
纯化过程将如下进行：
-杂质A：使用pH6.5的醋酸钠缓冲液，0.05M的NaCl来洗脱
-乳过氧化物酶：使用pH6.5的醋酸钠缓冲液，0.3M的NaCl来洗脱
-LPS、内毒素、蛋白酶和血管生成素：使用pH8的醋酸钠缓冲液，0.5M的NaCl洗脱
-乳转铁蛋白：使用pH8的醋酸铝缓冲液，1M NaCl洗脱。
在洁净室，如层流洁净室中收集洗脱的Lf。
超滤-渗滤
通过使用30kD有机膜的超滤(切线超滤)来浓缩乳转铁蛋白溶液，并渗滤，以获得最终的3M溶液；
浓缩
此后将低传导性乳转铁蛋白溶液浓缩，以达到15-16％的浓度。
微滤
使乳转铁蛋白接受使用0.22μm膜的最后微滤。
冷冻干燥
将乳转铁蛋白溶液在45℃下真空冷冻干燥。
研磨
对于一些应用，将乳转铁蛋白粉碾碎并微粉化，以获得80目大小的粉末。
混合
将不同生产的乳转铁蛋白混合，以获得一批200kg。将获得50g和10g的样品。
包装
将乳转铁蛋白粉包装在食品级铝-聚乙烯袋中。
用于操作或操纵纯化乳转铁蛋白的所有步骤均在环境受控制的封闭空间中进行，以避免纯化乳转铁蛋白的污染，例如，在无菌洁净室中进行。
本发明还涉及通过如上所述的方法获得的乳转铁蛋白用于促进新生儿胃肠道的成熟，或胃肠炎恢复条件下肠粘膜的组织修复的用途。
本发明还涉及通过如上所述的方法获得的乳转铁蛋白用于提高新生儿的肝合成的用途。
本发明还涉及通过如上所述的方法获得的乳转铁蛋白用于增强单核细胞的自然杀伤(NK)活性以及提高NK和淋巴因子-激活杀伤(LAK)细胞细胞毒性功能的用途。
本发明还涉及通过如上所述的方法获得的乳转铁蛋白通过其在巨噬细胞、T和B-淋巴细胞以及白细胞细胞上的特异性受体作为潜在抗肿瘤剂的用途。
本发明还涉及通过如上所述的方法获得的乳转铁蛋白用于降低一些促炎细胞因子的表达的用途。
本发明还涉及通过如上所述的方法获得的乳转铁蛋白用于抑制或杀灭细菌或治疗与生物膜细菌相关的疾病，如囊性纤维化或口腔炎症这样的疾病的用途。
本发明还涉及通过如上所述的方法获得的乳转铁蛋白用于制备伤口护理溶液、创伤护理溶液、耳部护理溶液、伤口愈合软膏或眼部护理溶液的用途。
本发明还涉及通过如上所述的方法获得的乳转铁蛋白用于就缺铁症和缺铁性贫血患者而言以及对于孕妇通过上皮细胞吸收铁的用途。
本发明还涉及通过如上所述的方法获得的乳转铁蛋白用于治疗呼吸道传染病(URTI和LRTI)的用途。

Claims (23)

1.一种生产乳转铁蛋白的方法，至少包括下列步骤：
a)使用没有在高于50℃的温度下处理过的原料，
b)使该原料接受处理，以获得乳抑菌素(LN)或乳碱性蛋白(MBP)的溶液，
c)使该LN或MBP溶液接受在阳离子交换树脂上纯化的步骤，该树脂用4与9之间pH的醋酸盐缓冲液平衡，并用含有不同溶质浓度的不同缓冲液洗脱，和
d)收集含有纯度超过95％，不具有聚合物并且基本上没有LPS、内毒素和血管生成素的乳转铁蛋白的级分。
2.如权利要求1中所限定的方法，其中在洁净室中进行收集乳转铁蛋白的步骤。
3.如权利要求1或2中所限定的方法，其中步骤b)是使该原料接受在阳离子交换树脂上的提取步骤的步骤，使用排除的溶质浓度溶液，以获得LN或乳碱性蛋白(MBP)的溶液。
4.如权利要求1至3中所限定的方法，其中以流过或结合和洗脱模式来进行在阳离子交换树脂上的提取或纯化步骤。
5.如权利要求1至4中所限定的方法，其中排除的溶质是氯化钠。
6.如权利要求1至5中所限定的方法，其中在步骤b)后进行浓缩和渗滤的步骤。
7.如权利要求1至6中所限定的方法，其中步骤c)包括至少四个洗脱步骤，一个收集杂质的步骤，一个收集乳过氧化物酶的步骤，一个收集LPS、内毒素、蛋白酶和血管生成素的步骤和一个收集乳转铁蛋白的步骤。
8.如权利要求1至7中所限定的方法，其中在4与7之间的pH下进行收集乳过氧化物酶、LPS、内毒素、蛋白酶和血管生成素的步骤。
9.如权利要求1至8中所限定的方法，其中在介于7和9之间的pH下进行收集乳转铁蛋白的步骤。
10.如权利要求1至9中所限定的方法，其中在纯化步骤中，溶质是浓度介于0.02至1.5M之间的氯化钠。
11.一种乳转铁蛋白，其具有超过95％的纯度，基本上无LPS、内毒素和血管生成素，具有介于9％至15％之间的铁饱和水平。
12.如权利要求11中所限定的乳转铁蛋白，包含低于50pg/mg的LPS、内毒素和血管生成素。
13.如权利要求11至12中所限定的乳转铁蛋白，其中其铁饱和水平为15％至20％。
14.通过权利要求1至10中所限定的方法获得的乳转铁蛋白用于促进新生儿胃肠道的成熟，或胃肠炎恢复条件下肠粘膜的组织修复的用途。
15.通过权利要求1至10中所限定的方法获得的乳转铁蛋白用于提高新生儿的肝合成的用途。
16.通过权利要求1至10中所限定的方法获得的乳转铁蛋白用于增强单核细胞的自然杀伤(NK)活性以及提高NK和淋巴因子-激活杀伤(LAK)细胞细胞毒性功能的用途。
17.通过权利要求1至10中所限定的方法获得的乳转铁蛋白通过其在巨噬细胞、T和B-淋巴细胞以及白细胞细胞上的特异性受体作为潜在抗肿瘤剂的用途。
18.通过权利要求1至10中所限定的方法获得的乳转铁蛋白用于降低一些促炎细胞因子的表达的用途。
19.通过权利要求1至10中所限定的方法获得的乳转铁蛋白用于抑制或杀灭细菌或治疗与生物膜细菌相关的疾病的用途。
20.权利要求19的用途，与生物膜细菌相关的疾病是囊性纤维化或口腔炎症。
21.通过权利要求1至10中所限定的方法获得的乳转铁蛋白用于制备伤口护理溶液、创伤护理溶液、耳部护理溶液、伤口愈合软膏或眼部护理溶液的用途。
22.通过权利要求1至10中所限定的方法获得的乳转铁蛋白用于就缺铁症和缺铁性贫血患者而言以及对于孕妇的情况下通过上皮细胞摄取铁的用途。
23.通过权利要求1至10中所限定的方法获得的乳转铁蛋白用于治疗呼吸道传染病(URTI和LRTI)的用途。
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