JP4904004B2 - ルムブロキナーゼ乾燥粉末の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ルムブロキナーゼ乾燥粉末（ｌｕｍｂｒｏｋｉｎａｓｅ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ）の製造方法に関する。
ルムブロキナーゼ乾燥粉末は生きているミミズを原料として、やや黄色い粉末である製品である。この製品は多成分を含むものであり、プラスミン（ｐｌａｓｍｉｎ）とプラスミノーゲンアクチベーター（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）を含み、繊維蛋白を直接的に溶解する作用、およびプラスミノーゲンを活性化して間接的に蛋白を溶解する作用を持ち、また、心臓および脳の血管栓塞症を治療し、フィブリノゲナーゼの増加と血小板凝集率の上昇などを予防するのに適用されるものである。臨床試験では、本薬剤の剤型としてのカプセル剤は、虚血性脳血管症、中風による躯体麻痺及び言語障害の回復に著しい効果を持ち、安全的な繊維溶解薬剤であり、当該薬剤を患者に投用したあと、フィブリノゲナーゼは明らかに正常レベルまでに低下し、ユーグロブリンの溶解時間は明らかに短くなり、血液粘度は明らかに下降すると共に、患者の血小板凝集機能の強化を減退し、老人患者の心臓、脳血管症に対して、明らかな予防作用を働くことが確認される。
現在、ルムブロキナーゼ乾燥粉末の製造方法として、一般的に生きているミミズを原料とし、ミミズの腹中の泥などをきれいに去除してから、日光下で照射して脱水し、直接に粉末に粉砕したものが使用される方法がある。この方法は簡単ではあるが、ミミズの腹中から汚物を除く工程において、薬物の活性成分は一部失われ、かつ得られたミミズの乾燥粉末はかびが生じ、変質することになる傾向がある。中国特許出願番号８８１０６１６８．９では、水或いはやや酸性の水溶液で生きているミミズの腹中を洗い、また清浄したミミズをそのまま湿様態で研磨し、冷凍乾燥した後、８０℃の温度、１０ｍｍＨｇ未満の真空の条件で乾燥し、ミミズの乾燥粉末を製造する方法が開示された。しかし、この方法で得られたミミズの乾燥粉末は有効成分の含有量が低く、不純物が多くて治療の目的に合わず副作用を起こしやすいおそれなどがある。
中国特許出願番号８８１０６１６８．９
本発明は、その目的として従来技術で製造したルムブロキナーゼ乾燥粉末の有効成分の含有量が低く、不純物が多いという問題を解決し、ルムブロキナーゼ乾燥粉末における有効成分の含有量が高く、製品の品質がコントロールでき、かつ工業的に大量生産しやすいルムブロキナーゼ乾燥粉末を製造する方法を提供するものである。
本発明の目的は、下記の技術思想によって達成することができる。
すなわち、本発明は、ルムブロキナーゼ乾燥粉末の総重量に対して、６０重量％以上の蛋白質（すなわち、酵素を指す）を含み、かつルムブロキナーゼ乾燥粉末における酵素の活性価が１４，０００〜２８，０００Ｕ／ｍｇであるルムブロキナーゼ乾燥粉末を提供する。
前記蛋白質の含有量は中国薬局方（２０００年）に基づく窒素法（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｅｔｈｏｄ）によって測定されたものである。
また前記酵素の活性価は中国薬局方（２０００年）に基づくウロキナーゼ・ゲロース−繊維蛋白平板法あるいは本技術分野公知の組織繊維溶解酵素原活性化剤−繊維蛋白平板法によって測定されたものである。
また、本発明は下記工程１）〜９）を含むことを特徴とするルムブロキナーゼ乾燥粉末を製造する方法に関する。
工程１）ミミズの洗浄：生きているミミズを水で洗浄してから、ミミズ１ｋｇに対して、糖０．１〜０．３ｋｇ、或いは塩化ナトリウム０．２〜０．４ｋｇを添加し、室温で、均一に攪拌して、２０〜４０分間静置し、ミミズを刺激し、その消化管中の分泌物を吐き出させた後、３０〜５０℃の温水でミミズの体に付いている糖或いは塩化ナトリウム及び汚れ物を洗い落とす；
工程２）ホモジェネートスラリーの調製：ミミズ自身の体積に対して１〜８倍の水を入れて、ボールミル、コロイドミルあるいは高圧ホモジェナイザーで、工程１）で清浄したミミズを細胞破砕し、ホモジェネートスラリーを調製する；
工程３）残渣の去除：工程２）で得られたホモジェネートスラリーを濾過或いは遠心で、その中の粗残渣を去除する；
工程４）上清の調製：工程３）で得られたホモジェネートスラリーを高速遠心機或いは微孔膜付きフィルターにより処理し、上清を得る；
工程５）溶離：ＤＥＡＥ−イオンアニオン交換クロマトグラフィーカラム（ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｌｕｍｎ）あるいはＤＥＡＥ Ａｆｆｉ Ｇｅｌ Ｂｌｕｅトリアジン染料アフィニティークロマトグラフィーカラム（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて、工程４）で得られたミミズの上清を０．０１〜０．８Ｍの酢酸塩溶液、リン酸塩溶液または０．０１〜１．８Ｍの塩化ナトリウム溶液で溶出して、活性成分のピークに対応する溶離液を収集する；
工程６）濃縮および脱塩：工程５）で収集された溶離液を濾過し、その中に存在している無機塩および小分子物質を去除し、大部分の水を脱水し、蛋白質の濃度が２０ｇ／Ｌに達し、かつ濃縮液の電気伝導率が０．１５×１０３μｓ／ｃｍ以下になるように、脱塩を終了させ、脱塩濃縮液を得る；
工程７）浄化濾過（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）：０．４５〜２μｍの微孔を有する深層微孔膜（ｄｅｅｐ ｌａｙｅｒ ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）或いは折り畳み式膜微孔膜（ｃａｒｔａｇｅ ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）付き濾過手段を用いて、工程６）で得られた脱塩濃縮液中の懸濁粒子を濾過、去除してから、上清を得る；
工程８）除菌：孔径０．２２μｍの微孔を有する除菌濾過膜付き濾過手段を用いて、工程７）で得られた上清を処理し、その中の細菌を去除する；
工程９）乾燥：無菌の条件で、工程８）において除菌された上清を−３０〜−４０℃の低温で、８〜１２時間冷凍し、次に０．２ｍｍＨｇの真空条件で、２５〜３０℃の温度まで上昇させ、１０時間乾燥し、続いて３６〜３８℃の温度まで上昇させ、真空条件下で１４〜１５時間乾燥し、ルムブロキナーゼ乾燥粉末を得る。
工程２）ホモジェネートスラリーの調製：ミミズ自身の体積に対して１〜８倍の水を入れて、ボールミル、コロイドミルあるいは高圧ホモジェナイザーで、工程１）で清浄したミミズを細胞破砕し、ホモジェネートスラリーを調製する；
工程３）残渣の去除：工程２）で得られたホモジェネートスラリーを濾過或いは遠心で、その中の粗残渣を去除する；
工程４）上清の調製：工程３）で得られたホモジェネートスラリーを高速遠心機或いは微孔膜付きフィルターにより処理し、上清を得る；
工程５）溶離：ＤＥＡＥ−イオンアニオン交換クロマトグラフィーカラム（ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｌｕｍｎ）あるいはＤＥＡＥ Ａｆｆｉ Ｇｅｌ Ｂｌｕｅトリアジン染料アフィニティークロマトグラフィーカラム（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて、工程４）で得られたミミズの上清を０．０１〜０．８Ｍの酢酸塩溶液、リン酸塩溶液または０．０１〜１．８Ｍの塩化ナトリウム溶液で溶出して、活性成分のピークに対応する溶離液を収集する；
工程６）濃縮および脱塩：工程５）で収集された溶離液を濾過し、その中に存在している無機塩および小分子物質を去除し、大部分の水を脱水し、蛋白質の濃度が２０ｇ／Ｌに達し、かつ濃縮液の電気伝導率が０．１５×１０３μｓ／ｃｍ以下になるように、脱塩を終了させ、脱塩濃縮液を得る；
工程７）浄化濾過（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）：０．４５〜２μｍの微孔を有する深層微孔膜（ｄｅｅｐ ｌａｙｅｒ ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）或いは折り畳み式膜微孔膜（ｃａｒｔａｇｅ ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）付き濾過手段を用いて、工程６）で得られた脱塩濃縮液中の懸濁粒子を濾過、去除してから、上清を得る；
工程８）除菌：孔径０．２２μｍの微孔を有する除菌濾過膜付き濾過手段を用いて、工程７）で得られた上清を処理し、その中の細菌を去除する；
工程９）乾燥：無菌の条件で、工程８）において除菌された上清を−３０〜−４０℃の低温で、８〜１２時間冷凍し、次に０．２ｍｍＨｇの真空条件で、２５〜３０℃の温度まで上昇させ、１０時間乾燥し、続いて３６〜３８℃の温度まで上昇させ、真空条件下で１４〜１５時間乾燥し、ルムブロキナーゼ乾燥粉末を得る。
前記工程１）に記載される糖は、砂糖、三温糖、氷砂糖を含む。
前記工程３）に記載される濾過は、ステンレス製メッシュ５〜２０ｍｍを有するステンレスフィルターで濾過すること。
前記工程５）に記載される酢酸塩は、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムを含む。
前記工程５）に記載されるリン酸塩は、リン酸ジナトリウム、リン酸ジカリウムを含む。
前記工程６）に記載される濾過は、標準遮断分子量（ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｔｏｐ−ｆｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）が５００〜５０，０００である平板膜（ｆｌａｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、ロール膜（ｒｏｌｌｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ）或いは中空繊維膜（ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）付き限外濾過手段を用いて行うこと。
前記工程６）に記載される濾過は、標準遮断分子量（ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｔｏｐ−ｆｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）が５００〜５０，０００である平板膜（ｆｌａｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、ロール膜（ｒｏｌｌｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ）或いは中空繊維膜（ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）付き限外濾過手段を用いて行うこと。
前記工程９）が、無菌の条件で工程８）で除菌した上清をポンプでスプレー乾燥機の中に入れて、圧縮空気でスプレーしてから、１５０〜２５０℃の熱風中で脱水し、ルムブロキナーゼ乾燥粉末を作り得たものでもよい。
本発明に関する方法は、従来技術と比べて、高速遠心機及び微孔膜単離技術を採用するため、ホモジェネートスラリー中の懸濁粒子及び脂質を効果的に去除することができ、そしてイオン交換クロマトグラフィーとアフィニティークロマトグラフィー単離技術を通して、雑蛋白、核酸などの不純物が効果的に去除できることで、純度の高いルムブロキナーゼ乾燥粉末を作り得て、これ以外の方法を使った時に得られたミミズ乾燥粉末の不純物の含有量が高いことによる問題を解決することができ、それに、本発明に関する方法は工業的に大量生産することができる。
次のようにしてルムブロキナーゼ乾燥粉末を調製した。
実施例１
１）ミミズの洗浄：１０ｋｇの生きているミミズを水で洗ってから、ミミズ１ｋｇに対して０．２ｋｇの三温糖を入れて、室温の条件で、均一に攪拌してから、４０分間静置し、ミミズを刺激し、その消化管中の分泌物を吐き出させ、３０℃の温水でミミズ体に付いている三温糖及び汚れ物を洗い落とす；
２）ホモジェネートスラリーの調製：ミミズ自身の体積に対して１倍の水を入れて、高圧ホモジェナイザーで、工程１）で清浄したミミズを細胞破砕し、ホモジェネートスラリーを調製する；
３）残渣の去除：工程２）で得られたホモジェネートスラリーをメッシュ５ｍｍのステンレス鋼製フィルターで濾過し、その中の粗残渣を去除する；
４）上清の調製：工程３）で得られたホモジェネートスラリーを高速遠心機により２時間処理し、上清を得る；
５）溶離：ＤＥＡＥ−イオン交換クロマトグラフィーカラムを用いて、工程４）で得られたミミズの上清を０．０１Ｍの酢酸ナトリウム溶液で溶出して、活性成分のピーク（第２峰）に対応する溶離液を収集する；
６）濃縮および脱塩：工程５）において収集された溶離液を、標準遮断分子量が５００である平板膜付き限外濾過手段を用いて、濾過し、その中の無機塩および小分子物質を去除し、大部分の水を脱水し、蛋白質の濃度が２０ｇ／Ｌに達し、かつ濃縮液の電気伝導率が０．１５×１０３μｓ／ｃｍ以下になるように、脱塩を終了させ、脱塩濃縮液を得る；
７）浄化濾過：孔径２μｍの微孔を有する深層微孔膜付き濾過手段を用いて、工程６）で得られた脱塩濃縮液中の懸濁粒子を濾過してから、上清を得る；
８）除菌：孔径０．２２μｍの微孔を有する除菌濾過膜付き濾過手段を用いて、工程７）で得られた上清を８時間処理し、その中の細菌を去除する；
９）乾燥：無菌の条件で、工程８）において除菌された上清を−３０℃の低温で、８時間冷凍し、次に０．２ｍｍＨｇの真空条件で、２５℃の温度まで上昇させ、１０時間乾燥し、続いて３６℃の温度まで上昇させ、真空条件下で１５時間乾燥し、６５ｇのルムブロキナーゼ乾燥粉末を得た。その含水量は７．５％であり、蛋白質の含有量は６０％であり、酵素の活性価は１５，０００Ｕ／ｍｇであった。
１）ミミズの洗浄：１０ｋｇの生きているミミズを水で洗ってから、ミミズ１ｋｇに対して０．２ｋｇの三温糖を入れて、室温の条件で、均一に攪拌してから、４０分間静置し、ミミズを刺激し、その消化管中の分泌物を吐き出させ、３０℃の温水でミミズ体に付いている三温糖及び汚れ物を洗い落とす；
２）ホモジェネートスラリーの調製：ミミズ自身の体積に対して１倍の水を入れて、高圧ホモジェナイザーで、工程１）で清浄したミミズを細胞破砕し、ホモジェネートスラリーを調製する；
３）残渣の去除：工程２）で得られたホモジェネートスラリーをメッシュ５ｍｍのステンレス鋼製フィルターで濾過し、その中の粗残渣を去除する；
４）上清の調製：工程３）で得られたホモジェネートスラリーを高速遠心機により２時間処理し、上清を得る；
５）溶離：ＤＥＡＥ−イオン交換クロマトグラフィーカラムを用いて、工程４）で得られたミミズの上清を０．０１Ｍの酢酸ナトリウム溶液で溶出して、活性成分のピーク（第２峰）に対応する溶離液を収集する；
６）濃縮および脱塩：工程５）において収集された溶離液を、標準遮断分子量が５００である平板膜付き限外濾過手段を用いて、濾過し、その中の無機塩および小分子物質を去除し、大部分の水を脱水し、蛋白質の濃度が２０ｇ／Ｌに達し、かつ濃縮液の電気伝導率が０．１５×１０３μｓ／ｃｍ以下になるように、脱塩を終了させ、脱塩濃縮液を得る；
７）浄化濾過：孔径２μｍの微孔を有する深層微孔膜付き濾過手段を用いて、工程６）で得られた脱塩濃縮液中の懸濁粒子を濾過してから、上清を得る；
８）除菌：孔径０．２２μｍの微孔を有する除菌濾過膜付き濾過手段を用いて、工程７）で得られた上清を８時間処理し、その中の細菌を去除する；
９）乾燥：無菌の条件で、工程８）において除菌された上清を−３０℃の低温で、８時間冷凍し、次に０．２ｍｍＨｇの真空条件で、２５℃の温度まで上昇させ、１０時間乾燥し、続いて３６℃の温度まで上昇させ、真空条件下で１５時間乾燥し、６５ｇのルムブロキナーゼ乾燥粉末を得た。その含水量は７．５％であり、蛋白質の含有量は６０％であり、酵素の活性価は１５，０００Ｕ／ｍｇであった。
実施例２
１）ミミズ洗浄：１０ｋｇの生きているミミズを水で洗ってから、ミミズ１ｋｇに対して０．３ｋｇの塩化ナトリウムを入れて、室温の条件で、均一に攪拌してから、４０分間静置し、ミミズを刺激し、その消化管中の分泌物を吐き出させ、４０℃の温水でミミズ体に付いている塩化ナトリウムおよび汚れを洗い落とす；
２）ホモジェネートスラリーの調製：ミミズ自身の体積に対して８倍の水を入れて、ボールミルで、工程１）で清浄したミミズを細胞破砕し、ホモジェネートスラリーを調製する；
３）残渣の去除：工程２）で得られたホモジェネートスラリーを遠心機で濾過し、ホモジェネートスラリーにおける粗い残渣を去除する；
４）上清の調製：工程３）において粗い残渣を去除したホモジェネートスラリーを高速遠心機で２時間処理し、上清を得る；
５）溶離： ＤＥＡＥ−イオン交換クロマトグラフィーカラムを用いて、工程４）で得られたミミズの上清は０．０１Ｍ酢酸カリウム溶液で溶離し、活性成分のピーク（第２峰）に対応する溶離液を収集する；
６）濃縮および脱塩：工程５）において収集された溶離液を、標準遮断分子量５０，０００の中空繊維膜付き限外濾過手段を用いて、濾過し、その中の無機塩および小分子物質を去除し、大部分の水を脱水し、蛋白質の濃度が２０ｇ／Ｌに達し、かつ濃縮液の電気伝導率が０．１５×１０３μｓ／ｃｍ以下になるように、脱塩を終了させ、脱塩濃縮液を得る；
７）浄化濾過：孔径０．４５μｍの微孔を有する折り畳み式微孔膜付きフィルターを用いて、工程６）で得られた脱塩濃縮液中の懸濁粒子を濾過してから、上清を得る；
８）除菌：孔径０．２２μｍの微孔を有する除菌膜付き濾過手段を用いて、８時間照射し、工程７）で得られた上清を処理し、その中の細菌を去除する。
１）ミミズ洗浄：１０ｋｇの生きているミミズを水で洗ってから、ミミズ１ｋｇに対して０．３ｋｇの塩化ナトリウムを入れて、室温の条件で、均一に攪拌してから、４０分間静置し、ミミズを刺激し、その消化管中の分泌物を吐き出させ、４０℃の温水でミミズ体に付いている塩化ナトリウムおよび汚れを洗い落とす；
２）ホモジェネートスラリーの調製：ミミズ自身の体積に対して８倍の水を入れて、ボールミルで、工程１）で清浄したミミズを細胞破砕し、ホモジェネートスラリーを調製する；
３）残渣の去除：工程２）で得られたホモジェネートスラリーを遠心機で濾過し、ホモジェネートスラリーにおける粗い残渣を去除する；
４）上清の調製：工程３）において粗い残渣を去除したホモジェネートスラリーを高速遠心機で２時間処理し、上清を得る；
５）溶離： ＤＥＡＥ−イオン交換クロマトグラフィーカラムを用いて、工程４）で得られたミミズの上清は０．０１Ｍ酢酸カリウム溶液で溶離し、活性成分のピーク（第２峰）に対応する溶離液を収集する；
６）濃縮および脱塩：工程５）において収集された溶離液を、標準遮断分子量５０，０００の中空繊維膜付き限外濾過手段を用いて、濾過し、その中の無機塩および小分子物質を去除し、大部分の水を脱水し、蛋白質の濃度が２０ｇ／Ｌに達し、かつ濃縮液の電気伝導率が０．１５×１０３μｓ／ｃｍ以下になるように、脱塩を終了させ、脱塩濃縮液を得る；
７）浄化濾過：孔径０．４５μｍの微孔を有する折り畳み式微孔膜付きフィルターを用いて、工程６）で得られた脱塩濃縮液中の懸濁粒子を濾過してから、上清を得る；
８）除菌：孔径０．２２μｍの微孔を有する除菌膜付き濾過手段を用いて、８時間照射し、工程７）で得られた上清を処理し、その中の細菌を去除する。
９）乾燥：無菌の条件で、工程８）で除菌した上清を−４０℃の低温で１２時間冷凍し、０．２ｍｍＨｇの真空条件で３０℃までに上昇させ、１０時間乾燥し、続いて３８℃の温度まで上昇させ、真空条件下で１４時間乾燥し、６５ｇのルムブロキナーゼ乾燥粉末を得た。その含水量は７．６％であり、蛋白質の含有量は６４％であり、酵素の活性価は１６，０００Ｕ／ｍｇであった。
実施例３
１）ミミズ洗浄：１０ｋｇの生きているミミズを水で洗ってから、ミミズ１ｋｇに対して０．３ｋｇの砂糖を入れて、室温で均一に攪拌してから、２０分間静置し、ミミズを刺激し、その消化管中の分泌物を吐き出させ、５０℃の温水でミミズ体に付いている砂糖及び汚れ物を洗い落とす；
２）ホモジェネートスラリーの調製：ミミズ自身の体積に対して６倍の水を入れて、コロイドミルで、工程１）で清浄したミミズを３０分間細胞破砕し、ホモジェネートスラリーを調製する；
３）残渣の去除：工程２）で得られたホモジェネートスラリーをメッシュ２０ｍｍのステンレス鋼製フィルターで濾過し、ホモジェネートスラリーにおける粗い残渣を去除する；
４）上清の調製：工程３）において粗い残渣を去除したホモジェネートスラリーを微孔膜付きフィルターで２時間処理し、上清を得る；
５）溶離：ＤＥＡＥ Ａｆｆｉ Ｇｅｌ Ｂｌｕｅトリアジン染料アフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて、工程４）で得られたミミズの上清を０．５Ｍの酢酸ナトリウム溶液で溶離し、活性成分のピーク（第２峰）に対応する溶離液を収集する；
６）濃縮および脱塩：工程５）において収集された溶離液を、標準遮断分子量２０，０００のロール式膜付き限外濾過手段を用いて濾過し、その中の無機塩および小分子物質を去除し、大部分の水を脱水し、蛋白質の濃度が２０ｇ／Ｌに達し、かつ濃縮液の電気伝導率が０．１５×１０３μｓ／ｃｍ以下になるように、脱塩を終了させ、脱塩濃縮液を得る；
７）浄化濾過：孔径１μｍの微孔を有する深層微孔膜付き濾過手段を用いて、工程６）で得られた脱塩濃縮液中の懸濁粒子を濾過してから、上清を得る；
８）除菌：孔径０．２２μｍの微孔を有する除菌膜付き濾過手段を用いて、８時間照射し、工程７）で得られた上清を処理し、その中の細菌を去除する；
９）乾燥：無菌の条件で、工程８）で除菌した上清を−３５℃の低温で１０時間冷凍し、０．２ｍｍＨｇの真空条件で２８℃までに上昇させ、１０時間乾燥し、続いて３７℃の温度まで上昇させ、真空条件下で１５時間乾燥し、６５ｇのルムブロキナーゼ乾燥粉末を得た。その含水量は７．３％であり、蛋白質の含有量は６５％であり、酵素の活性価は１７，０００Ｕ／ｍｇであった。
１）ミミズ洗浄：１０ｋｇの生きているミミズを水で洗ってから、ミミズ１ｋｇに対して０．３ｋｇの砂糖を入れて、室温で均一に攪拌してから、２０分間静置し、ミミズを刺激し、その消化管中の分泌物を吐き出させ、５０℃の温水でミミズ体に付いている砂糖及び汚れ物を洗い落とす；
２）ホモジェネートスラリーの調製：ミミズ自身の体積に対して６倍の水を入れて、コロイドミルで、工程１）で清浄したミミズを３０分間細胞破砕し、ホモジェネートスラリーを調製する；
３）残渣の去除：工程２）で得られたホモジェネートスラリーをメッシュ２０ｍｍのステンレス鋼製フィルターで濾過し、ホモジェネートスラリーにおける粗い残渣を去除する；
４）上清の調製：工程３）において粗い残渣を去除したホモジェネートスラリーを微孔膜付きフィルターで２時間処理し、上清を得る；
５）溶離：ＤＥＡＥ Ａｆｆｉ Ｇｅｌ Ｂｌｕｅトリアジン染料アフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて、工程４）で得られたミミズの上清を０．５Ｍの酢酸ナトリウム溶液で溶離し、活性成分のピーク（第２峰）に対応する溶離液を収集する；
６）濃縮および脱塩：工程５）において収集された溶離液を、標準遮断分子量２０，０００のロール式膜付き限外濾過手段を用いて濾過し、その中の無機塩および小分子物質を去除し、大部分の水を脱水し、蛋白質の濃度が２０ｇ／Ｌに達し、かつ濃縮液の電気伝導率が０．１５×１０３μｓ／ｃｍ以下になるように、脱塩を終了させ、脱塩濃縮液を得る；
７）浄化濾過：孔径１μｍの微孔を有する深層微孔膜付き濾過手段を用いて、工程６）で得られた脱塩濃縮液中の懸濁粒子を濾過してから、上清を得る；
８）除菌：孔径０．２２μｍの微孔を有する除菌膜付き濾過手段を用いて、８時間照射し、工程７）で得られた上清を処理し、その中の細菌を去除する；
９）乾燥：無菌の条件で、工程８）で除菌した上清を−３５℃の低温で１０時間冷凍し、０．２ｍｍＨｇの真空条件で２８℃までに上昇させ、１０時間乾燥し、続いて３７℃の温度まで上昇させ、真空条件下で１５時間乾燥し、６５ｇのルムブロキナーゼ乾燥粉末を得た。その含水量は７．３％であり、蛋白質の含有量は６５％であり、酵素の活性価は１７，０００Ｕ／ｍｇであった。
実施例４
１）ミミズ洗浄：１０ｋｇの生きているミミズを水で洗ってから、ミミズ１ｋｇに対して０．１ｋｇの氷砂糖をいれ、室温の条件で均一に攪拌してから、３０分間静置し、ミミズを刺激し、その消化管中の分泌物を吐き出させ、４０℃の温水でミミズ体に付いている氷砂糖及び汚れ物を洗い落とす；
２）ホモジェネートスラリーの調製：ミミズ自身の体積に対して５倍の水を入れて、コロイドミルで、工程１）で清浄したミミズを３０分間細胞破砕し、ホモジェネートスラリーを調製する；
３）残渣の去除：工程２）で得られたホモジェネートスラリーをメッシュ５ｍｍのステンレスフィルターで濾過し、ホモジェネートスラリーにおける粗い残渣を去除する；
４）上清の調製：工程３）において粗い残渣を去除したホモジェネートスラリーを微孔膜付きフィルターで２時間処理し、上清を得る；
５）溶離：ＤＥＡＥ Ａｆｆｉ Ｇｅｌ Ｂｌｕｅトリアジンアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて、工程４）で得られたミミズの上清を０．８Ｍのリン酸ジナトリウム溶液で溶離し、活性成分のピーク（第２峰）に対応する溶離液を収集する；
６）濃縮および脱塩：工程５）において収集された溶離液を、標準遮断分子量２０Ｋの平板膜付き限外濾過手段を用いて、濾過し、その中の無機塩および小分子物質を去除し、大部分の水を脱水し、蛋白質の濃度が２０ｇ／Ｌに達し、かつ濃縮液の電気伝導率が０．１５×１０３μｓ／ｃｍ以下になるように、脱塩を終了させ、脱塩濃縮液を得る；
７）浄化濾過：孔径１μｍの微孔を有する深層微孔膜付き濾過手段を用いて、工程６）で得られた脱塩濃縮液中の懸濁粒子を濾過してから、上清を得る。
１）ミミズ洗浄：１０ｋｇの生きているミミズを水で洗ってから、ミミズ１ｋｇに対して０．１ｋｇの氷砂糖をいれ、室温の条件で均一に攪拌してから、３０分間静置し、ミミズを刺激し、その消化管中の分泌物を吐き出させ、４０℃の温水でミミズ体に付いている氷砂糖及び汚れ物を洗い落とす；
２）ホモジェネートスラリーの調製：ミミズ自身の体積に対して５倍の水を入れて、コロイドミルで、工程１）で清浄したミミズを３０分間細胞破砕し、ホモジェネートスラリーを調製する；
３）残渣の去除：工程２）で得られたホモジェネートスラリーをメッシュ５ｍｍのステンレスフィルターで濾過し、ホモジェネートスラリーにおける粗い残渣を去除する；
４）上清の調製：工程３）において粗い残渣を去除したホモジェネートスラリーを微孔膜付きフィルターで２時間処理し、上清を得る；
５）溶離：ＤＥＡＥ Ａｆｆｉ Ｇｅｌ Ｂｌｕｅトリアジンアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて、工程４）で得られたミミズの上清を０．８Ｍのリン酸ジナトリウム溶液で溶離し、活性成分のピーク（第２峰）に対応する溶離液を収集する；
６）濃縮および脱塩：工程５）において収集された溶離液を、標準遮断分子量２０Ｋの平板膜付き限外濾過手段を用いて、濾過し、その中の無機塩および小分子物質を去除し、大部分の水を脱水し、蛋白質の濃度が２０ｇ／Ｌに達し、かつ濃縮液の電気伝導率が０．１５×１０３μｓ／ｃｍ以下になるように、脱塩を終了させ、脱塩濃縮液を得る；
７）浄化濾過：孔径１μｍの微孔を有する深層微孔膜付き濾過手段を用いて、工程６）で得られた脱塩濃縮液中の懸濁粒子を濾過してから、上清を得る。
８）除菌：孔径０．２２μｍの微孔を有する除菌膜付き濾過手段を用いて、８時間照射し、工程７）で得られた上清を処理し、その中の細菌を去除する；
９）乾燥：無菌の条件で、工程８）で除菌した上清をポンプでスプレー乾燥機に導入し、圧縮空気でスプレーしてから、１５０℃の熱風中に脱水乾燥し、６５ｇのルムブロキナーゼ乾燥粉末を得た。その含水量は７．５％であり、蛋白質の含有量は６４％であり、酵素の活性価は１６，５００Ｕ／ｍｇであった。
９）乾燥：無菌の条件で、工程８）で除菌した上清をポンプでスプレー乾燥機に導入し、圧縮空気でスプレーしてから、１５０℃の熱風中に脱水乾燥し、６５ｇのルムブロキナーゼ乾燥粉末を得た。その含水量は７．５％であり、蛋白質の含有量は６４％であり、酵素の活性価は１６，５００Ｕ／ｍｇであった。
実施例５
１）ミミズ洗浄：１０ｋｇの生きているミミズを水で洗ってから、ミミズ１ｋｇに対して０．４ｋｇの塩化ナトリウムを入れて、室温の条件で、均一に攪拌してから、２０分間静置し、ミミズを刺激し、その消化管中の分泌物を吐き出させ、５０℃の温水でミミズ体に付いている塩化ナトリウム及び汚れ物を洗い落とす；
２）ホモジェネートスラリーの調製：ミミズ自身の体積に対して４倍の水を入れて、高圧ホモジェナイザーで、工程１）で清浄したミミズを細胞破砕し、ホモジェネートスラリーを調製する；
３）残渣の去除：工程２）で得られたホモジェネートスラリーを遠心機で濾過し、ホモジェネートスラリーにおける粗い残渣を去除する；
４）上清の調製：工程３）において粗い残渣を去除したホモジェネートスラリーを高速遠心機で２時間処理し、上清を得る；
５）溶離：ＤＥＡＥ Ａｆｆｉ Ｇｅｌ Ｂｌｕｅトリアジン染料クロマトグラフィーカラムを用いて、工程４）で得られたミミズの上清を０．８Ｍの塩化ナトリウム溶液で溶離し、活性成分のピーク（第２峰）に対応する溶離液を収集する；
６）濃縮および脱塩：工程５）において収集された溶離液を、標準遮断分子量２０，０００の中空繊維膜付き限外濾過手段を用いて、濾過し、その中の無機塩および小分子物質を去除し、大部分の水を脱水し、蛋白質の濃度が２０ｇ／Ｌに達し、かつ濃縮液の電気伝導率が０．１５×１０３μｓ／ｃｍ以下になるように、脱塩を終了させ、脱塩濃縮液を得る；
７）浄化濾過：孔径１．２μｍの微孔を有する深層微孔膜付き濾過手段を用いて、工程６）で得られた脱塩濃縮液中の懸濁粒子を濾過してから、上清を得る；
８）除菌：孔径０．２２μｍの微孔を有する除菌膜付き濾過手段を用いて、８時間照射し、工程７）で得られた上清を処理し、その中の細菌を去除する；
９）乾燥：無菌の条件で、工程８）で除菌した上清をポンプでスプレー乾燥機に導入して、圧縮空気でスプレーして、２５０℃の熱風中に脱水乾燥し、６６ｇのルムブロキナーゼ乾燥粉末を得た。その含水量は７．１％であり、蛋白質の含有量は６３％であり、酵素の活性価は１６，５０００Ｕ／ｍｇであった。
１）ミミズ洗浄：１０ｋｇの生きているミミズを水で洗ってから、ミミズ１ｋｇに対して０．４ｋｇの塩化ナトリウムを入れて、室温の条件で、均一に攪拌してから、２０分間静置し、ミミズを刺激し、その消化管中の分泌物を吐き出させ、５０℃の温水でミミズ体に付いている塩化ナトリウム及び汚れ物を洗い落とす；
２）ホモジェネートスラリーの調製：ミミズ自身の体積に対して４倍の水を入れて、高圧ホモジェナイザーで、工程１）で清浄したミミズを細胞破砕し、ホモジェネートスラリーを調製する；
３）残渣の去除：工程２）で得られたホモジェネートスラリーを遠心機で濾過し、ホモジェネートスラリーにおける粗い残渣を去除する；
４）上清の調製：工程３）において粗い残渣を去除したホモジェネートスラリーを高速遠心機で２時間処理し、上清を得る；
５）溶離：ＤＥＡＥ Ａｆｆｉ Ｇｅｌ Ｂｌｕｅトリアジン染料クロマトグラフィーカラムを用いて、工程４）で得られたミミズの上清を０．８Ｍの塩化ナトリウム溶液で溶離し、活性成分のピーク（第２峰）に対応する溶離液を収集する；
６）濃縮および脱塩：工程５）において収集された溶離液を、標準遮断分子量２０，０００の中空繊維膜付き限外濾過手段を用いて、濾過し、その中の無機塩および小分子物質を去除し、大部分の水を脱水し、蛋白質の濃度が２０ｇ／Ｌに達し、かつ濃縮液の電気伝導率が０．１５×１０３μｓ／ｃｍ以下になるように、脱塩を終了させ、脱塩濃縮液を得る；
７）浄化濾過：孔径１．２μｍの微孔を有する深層微孔膜付き濾過手段を用いて、工程６）で得られた脱塩濃縮液中の懸濁粒子を濾過してから、上清を得る；
８）除菌：孔径０．２２μｍの微孔を有する除菌膜付き濾過手段を用いて、８時間照射し、工程７）で得られた上清を処理し、その中の細菌を去除する；
９）乾燥：無菌の条件で、工程８）で除菌した上清をポンプでスプレー乾燥機に導入して、圧縮空気でスプレーして、２５０℃の熱風中に脱水乾燥し、６６ｇのルムブロキナーゼ乾燥粉末を得た。その含水量は７．１％であり、蛋白質の含有量は６３％であり、酵素の活性価は１６，５０００Ｕ／ｍｇであった。
実施例６
１）ミミズ洗浄：１０ｋｇの生きているミミズを水で洗ってから、ミミズ１ｋｇに対して０．２ｋｇの塩化ナトリウムを入れて、室温の条件で、均一に攪拌してから、４０分間静置し、ミミズを刺激し、その消化管中の分泌物を吐き出させ、３０℃の温水でミミズ体に付いている塩化ナトリウム及び汚れ物を洗い落とす；
２）ホモジェネートスラリーの調製：ミミズ自身の体積に対して１倍の水を入れて、コロイドミルで、工程１）で清浄したミミズを細胞破砕し、ホモジェネートスラリーを調製する；
３）残渣の去除：工程２）で得られたホモジェネートスラリーを遠心機で濾過し、ホモジェネートスラリーにおける粗い残渣を去除する；
４）上清の調製：工程３）において粗い残渣を去除したホモジェネートスラリーを高速遠心機で２時間処理し、上清を得る；
５）溶離： ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーカラムを用いて、工程４）で得られたミミズの上清を０．０１Ｍの塩化ナトリウム溶液で溶離し、活性成分のピーク（第２峰）に対応する溶離液を収集する。
１）ミミズ洗浄：１０ｋｇの生きているミミズを水で洗ってから、ミミズ１ｋｇに対して０．２ｋｇの塩化ナトリウムを入れて、室温の条件で、均一に攪拌してから、４０分間静置し、ミミズを刺激し、その消化管中の分泌物を吐き出させ、３０℃の温水でミミズ体に付いている塩化ナトリウム及び汚れ物を洗い落とす；
２）ホモジェネートスラリーの調製：ミミズ自身の体積に対して１倍の水を入れて、コロイドミルで、工程１）で清浄したミミズを細胞破砕し、ホモジェネートスラリーを調製する；
３）残渣の去除：工程２）で得られたホモジェネートスラリーを遠心機で濾過し、ホモジェネートスラリーにおける粗い残渣を去除する；
４）上清の調製：工程３）において粗い残渣を去除したホモジェネートスラリーを高速遠心機で２時間処理し、上清を得る；
５）溶離： ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーカラムを用いて、工程４）で得られたミミズの上清を０．０１Ｍの塩化ナトリウム溶液で溶離し、活性成分のピーク（第２峰）に対応する溶離液を収集する。
６）濃縮および脱塩：工程５）において収集された溶離液を、標準遮断分子量１５，０００のロール式膜付き限外濾過手段を用いて、濾過し、その中の無機塩および小分子物質を去除し、大部分の水を脱水し、蛋白質の濃度が２０ｇ／Ｌに達し、かつ濃縮液の電気伝導率が０．１５×１０３μｓ／ｃｍ以下になるように、脱塩を終了させ、脱塩濃縮液を得る；
７）浄化濾過：孔径０．８μｍの微孔を有する折り畳み式膜付き微孔膜濾過手段を用いて、工程６）で得られた脱塩濃縮液中の懸濁粒子を濾過してから、上清を得る；
８）除菌：孔径０．２２μｍの微孔を有する除菌濾過膜付き濾過手段を用いて、８時間濾過し、工程７）で得られた上清を処理し、その中の細菌を去除する；
９）乾燥：無菌の条件で、工程８）で除菌した上清をポンプでスプレー乾燥機に導入し、圧縮空気でスプレーして、２００℃の熱風中で脱水し、６２ｇのルムブロキナーゼ乾燥粉末を得た。その含水量は７．０％であり、蛋白質の含有量は６６％であり、酵素の活性価は１６，８００Ｕ／ｍｇであった。
７）浄化濾過：孔径０．８μｍの微孔を有する折り畳み式膜付き微孔膜濾過手段を用いて、工程６）で得られた脱塩濃縮液中の懸濁粒子を濾過してから、上清を得る；
８）除菌：孔径０．２２μｍの微孔を有する除菌濾過膜付き濾過手段を用いて、８時間濾過し、工程７）で得られた上清を処理し、その中の細菌を去除する；
９）乾燥：無菌の条件で、工程８）で除菌した上清をポンプでスプレー乾燥機に導入し、圧縮空気でスプレーして、２００℃の熱風中で脱水し、６２ｇのルムブロキナーゼ乾燥粉末を得た。その含水量は７．０％であり、蛋白質の含有量は６６％であり、酵素の活性価は１６，８００Ｕ／ｍｇであった。
Claims (5)
- ルムブロキナーゼ乾燥粉末を製造する方法であって、
工程１）ミミズの洗浄：生きているミミズを水で洗浄してから、ミミズ１ｋｇに対して、砂糖、三温糖、及び氷砂糖のうち少なくとも１種を含む糖０．１〜０．３ｋｇ、或いは塩化ナトリウム０．２〜０．４ｋｇを添加し、室温で、均一に攪拌し、２０〜４０分間静置し、３０〜５０℃の温水でミミズの体に付いている糖或いは塩化ナトリウムおよび汚れ物を洗い落とす；
工程２）ホモジェネートスラリーの調製：ミミズ自身の体積に対して１〜８倍の水を入れて、ボールミル、コロイドミルあるいは高圧ホモジェナイザーで、工程１）で清浄に洗ったミミズを細胞破砕し、ホモジェネートスラリーを調製する；
工程３）残渣の去除：工程２）で得られたホモジェネートスラリーを濾過或いは遠心で、その中の粗残渣を去除する；
工程４）上清の調製：工程３）で得られたホモジェネートスラリーを高速遠心機或いは微孔膜付きフィルターにより処理し、上清を得る；
工程５）溶離：ＤＥＡＥ−イオン交換クロマトグラフィーカラム或いはＤＥＡＥ Ａｆｆｉ Ｇｅｌ Ｂｌｕｅトリアジン染料アフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて、工程４）で得られたミミズの上清を０．０１〜０．８Ｍの酢酸塩溶液、０．０１〜０．８Ｍのリン酸塩溶液または０．０１〜１．８Ｍの塩化ナトリウム溶液で溶離して、ウロキナーゼ活性として測定される活性成分の第２峰のピークに対応する溶離液を収集する；
工程６）濃縮および脱塩：工程５）で収集された溶離液を標準遮断分子量５００〜５０，０００で濾過し、その中に存在している無機塩および小分子物質を去除し、大部分の水を脱水し、蛋白質の濃度が２０ｇ／Ｌに達し、かつ濃縮液の電気伝導率が０．１５×１０３μｓ／ｃｍ以下になるように、脱塩を終了させ、脱塩濃縮液を得る；
工程７）浄化濾過：孔径０．４５〜２μｍの微孔を有する深層微孔膜或いは折り畳み式膜付き微孔濾過手段を用いて、工程６）で得られた脱塩濃縮液中の懸濁粒子を濾過、去除してから、上清を得る；
工程８）除菌：孔径０．２２μｍの微孔を有する除菌濾過膜付き濾過手段を用いて、工程７）で得られた上清を処理し、その中の細菌を去除する；
工程９）乾燥：無菌の条件で、工程８）において除菌された上清を−３０〜−４０℃の低温で、８〜１２時間冷凍し、次に０．２ｍｍＨｇの真空条件で、２５〜３０℃の温度まで上昇させ、１０時間乾燥し、続いて３６〜３８℃の温度まで上昇させ、真空条件下で１４〜１５時間乾燥し、ルムブロキナーゼ乾燥粉末を得る
前記工程１）〜９）を含むことを特徴とするルムブロキナーゼ乾燥粉末の製造方法。 - 前記工程３）における濾過は、メッシュ５〜２０ｍｍを有するステンレスフィルターで濾過することを特徴とする請求項１に記載のルムブロキナーゼ乾燥粉末の製造方法。
- 前記工程５）における酢酸塩は、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムを含み、またリン酸塩溶液は、リン酸ジナトリウム、リン酸ジカリウムを含むことを特徴とする請求項１または２に記載のルムブロキナーゼ乾燥粉末の製造方法。
- 前記工程６）における濾過は、標準遮断分子量５００〜５０，０００の平板膜、ロール膜或いは中空繊維膜付き限外濾過手段を用いて行うことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のルムブロキナーゼ乾燥粉末の製造方法。
- 前記工程９）が、無菌の条件で工程８）で除菌した上清をポンプでスプレー乾燥機の中に入れて、圧縮空気でスプレーしてから、１５０〜２５０℃の熱風中で脱水し、ルムブロキナーゼ乾燥粉末を得るものであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のルムブロキナーゼ乾燥粉末の製造方法。
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