CN111303274B - 一种人绒毛膜促性腺激素纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人绒毛膜促性腺激素纯化方法，涉及生物制药技术领域。其包括如下步骤：S1，取1重量份人绒毛膜促性腺激素粗品溶解于50体积份的水中，加入0.1重量份的聚乙二醇，搅拌离心，过滤，调pH=7；S2，对滤液进行HS凝胶疏水柱层析提纯，用洗涤液充分洗涤，再用洗脱液洗脱，收集有效成分；S3，对有效成分进行单抗亲和层析，用洗涤液充分洗涤，再用洗脱液洗脱，收集有效成分，调pH=7；S4，对步骤S3得到的有效成分加入无水乙醇，沉淀24h，弃去上清物，收集沉淀物，真空干燥12h，即得人绒毛膜促性腺激素固体；当重量份的单位为kg时，体积份的单位为L。与现有技术中已有的HCG的提取纯化方法相比，本发明收率可达到90%以上，同时单位效价可达到7000IU/mg以上。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，更具体地说，它涉及一种人绒毛膜促性腺激素纯化方法。
背景技术
促性腺激素(gonadotropin,gonadotropic hormone)是指能够促进雌雄两种性腺的发育，增加性激素分泌的一类激素，如脑垂体前叶分泌的黄体生成激素(LH)和卵泡刺激素(FSH)人胎盘绒毛膜分泌的绒毛膜促性腺激素(HCG)。其中HCG能刺激女性或男性的性腺活力，有促进体内性腺发育的作用，使性机能得到维持或兴奋，适量服用HCG后能使已衰退的或已出现病理性障碍的性分泌机能逐渐恢复正常。
HCG的制备多以孕妇尿液作为原料，通过苯甲酸钠吸附、酒精抽提等过程得到大于120IU/mg的HCG粗品。而国内多采用一步阳离子交换树脂进行纯化得到单位效价大于2500IU/mg的精品，这些方法收率一般都小于80％，同时精品的效价在3000IU/mg左右。
在申请公布号为CN104497128A的中国发明申请专利中公开了一种低浓度的盐溶液抽提法从绒促性素粗品中进一步提纯绒促性素的方法，技术方案是通过在绒促性素粗品低盐抽提液，对其分别进行抽提、沉淀、脱水、干燥等步骤来实现从粗品中进一步提纯绒促性素。而这种纯化方法得到的效价也只有3000IU/mg，效果依然不理想。
因此，需要提出一种新的方案来解决上述问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种人绒毛膜促性腺激素纯化方法，其与现有技术中已有的HCG的提取纯化方法相比，本发明收率可达到90％以上，同时单位效价可达到7000IU/mg以上。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种人绒毛膜促性腺激素纯化方法，包括如下步骤：
S1，取1重量份人绒毛膜促性腺激素粗品溶解于50体积份的水中，加入0.1重量份的聚乙二醇，搅拌离心，过滤，采用乙酸或氢氧化钠对滤液调pH＝7；
S2，对步骤S1得到的滤液进行HS凝胶疏水柱层析提纯，用洗涤液充分洗涤，再用洗脱液洗脱，收集有效成分；
S3，对步骤S2得到的有效成分进行单抗亲和层析，用洗涤液充分洗涤，再用洗脱液洗脱，收集有效成分，采用氢氧化钠调pH＝7；
S4，对步骤S3得到的有效成分加入无水乙醇，沉淀24h，弃去上清物，收集沉淀物，真空干燥12h，即得人绒毛膜促性腺激素固体；
当所述重量份的单位为kg时，所述体积份的单位为L。
通过采用上述技术方案，本发明首先将人绒毛膜促性腺激素溶解于水中，然后离心过滤以初步除去杂质，然后采用上HS凝胶疏水层析柱，并采用洗涤液和洗脱液进行洗涤和洗脱，以除去粗品中的蛋白质，之后再进行单抗亲和层析，并用洗涤液和洗脱液洗涤和洗脱，从而得到有效成分，最后对其进行后处理，采用无水乙醇进行沉淀和干燥，最终得到高纯度人绒毛膜促性腺激素固体。
本发明优化了纯化工艺，使得纯化过程更加简单易操作，收率明显提高，效价高于药典要求和现有工艺。
进一步优选为，步骤S1中，所述搅拌离心的条件为3800-4200rpm，温度8-15℃，时间18-25min。
通过采用上述技术方案，步骤S1中加入聚乙二醇，可起到浓缩蛋白的作用，然后离心和过滤处理，以初步除去蛋白质和其他杂质，为后续纯化提供基础。
进一步优选为，步骤S1中，过滤时采用0.65μm、2.5inch滤芯。
通过采用上述技术方案，采用0.65μm、2.5inch滤芯可对离心液中的蛋白和杂质进行初步过滤。
进一步优选为，步骤S3中，所述单抗亲和层析所用的单抗亲和层析由抗HCG单克隆抗体免疫原和溴化氢预活化胶合成。
通过采用上述技术方案，离心过滤和凝胶层析分级除去粗品中蛋白和杂质后再结合单抗亲和层析法对粗品进一步纯化，得到高纯度的人绒毛膜促性腺激素。
进一步优选为，步骤S2中，所述洗涤液采用0.5mol/L的NaCl，所述洗脱液采用0.2mol/L的NaCl；
步骤S3中，所述洗涤液采用0.5mol/L的NaCl，所述洗脱液采用0.1mol/L的HCl。
进一步优选为，步骤S2中，所述洗涤液用量为45-55体积份，所述洗脱液用量为8-12体积份。
进一步优选为，步骤S3中，所述洗涤液用量为3-8体积份，所述洗脱液用量为8-12体积份。
进一步优选为，步骤S4中，所述无水乙醇加入量为有效成分的5-8倍，所述无水乙醇的温度小于0℃。
通过采用上述技术方案，采用无水乙醇对层析后的洗脱液进行沉淀处理，之后再进行真空管干燥，即得。
综上所述，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明首先将人绒毛膜促性腺激素溶解于水中，然后离心过滤以初步除去杂质，然后采用上HS凝胶疏水层析柱，并采用洗涤液和洗脱液进行洗涤和洗脱，以除去粗品中的蛋白质，之后再进行单抗亲和层析，并用洗涤液和洗脱液洗涤和洗脱，从而得到有效成分，最后对其进行后处理，采用无水乙醇进行沉淀和干燥，最终得到高纯度人绒毛膜促性腺激素固体；
(2)本发明优化了纯化工艺，使得纯化过程更加简单易操作，收率明显提高，效价高于药典要求和现有工艺。
附图说明
图1为实施例1中人绒毛膜促性腺激素的纯化工艺。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行详细描述。
实施例1：一种人绒毛膜促性腺激素的纯化方法，如图1，具体操作步骤如下：
S1，取1kg、效价为200IU/mg的人绒毛膜促性腺激素粗品溶解于50L的水中，加入0.1kg的聚乙二醇，于3800rpm、8℃条件下搅拌离心25min，采用0.65μm、2.5inch滤芯过滤，并用乙酸对滤液调pH＝7；
S2，对步骤S1得到的滤液进行上样5L的HS凝胶疏水柱层析提纯，用45L、0.5mol/L的NaCl洗涤液充分洗涤以去除杂蛋白，用8L、0.2mol/L的NaCl洗脱液洗脱，收集有效成分约8L；
S3，对步骤S2得到的有效成分进行单抗亲和层析，用3L、0.5mol/L的NaCl洗涤液充分洗以去除杂蛋白涤，用8L、0.1mol/L的HCl洗脱液洗脱，收集有效成分约2L，边收集边用氢氧化钠调pH＝7，所用单抗亲和层析柱采用购于基蛋生物医药有限公司的抗HCG单克隆抗体免疫原和GE公司的溴化氰预活化胶合成。
S4，对步骤S3得到的有效成分加入5倍重量份-4℃的无水乙醇，沉淀24h，弃去上清物，收集沉淀物，真空干燥12h，即得人绒毛膜促性腺激素固体。
实施例2：一种人绒毛膜促性腺激素的纯化方法，具体操作步骤如下：
S1，取1kg、效价为200IU/mg的人绒毛膜促性腺激素粗品溶解于50L的水中，加入0.1kg的聚乙二醇，于4000rpm、10℃条件下搅拌离心20min，采用0.65μm、2.5inch滤芯过滤，并用乙酸对滤液调pH＝7；
S2，对步骤S1得到的滤液进行上样5L的HS凝胶疏水柱层析提纯，用50L、0.5mol/L的NaCl洗涤液充分洗涤以去除杂蛋白，用10L、0.2mol/L的NaCl洗脱液洗脱，收集有效成分约10L；
S3，对步骤S2得到的有效成分进行单抗亲和层析，用5L、0.5mol/L的NaCl洗涤液充分洗以去除杂蛋白涤，用10L、0.1mol/L的HCl洗脱液洗脱，收集有效成分约2L，边收集边用氢氧化钠调pH＝7，所用单抗亲和层析柱采用购于基蛋生物医药有限公司的抗HCG单克隆抗体免疫原和GE公司的溴化氰预活化胶合成。
S4，对步骤S3得到的有效成分加入6倍重量份-4℃的无水乙醇，沉淀24h，弃去上清物，收集沉淀物，真空干燥12h，即得人绒毛膜促性腺激素体。
实施例3：一种人绒毛膜促性腺激素的纯化方法，具体操作步骤如下：
S1，取1kg、效价为200IU/mg的人绒毛膜促性腺激素粗品溶解于50L的水中，加入0.1kg的聚乙二醇，于4200rpm、15℃条件下搅拌离心18min，采用0.65μm、2.5inch滤芯过滤，并用乙酸对滤液调pH＝7；
S2，对步骤S1得到的滤液进行上样5L的HS凝胶疏水柱层析提纯，用55L、0.5mol/L的NaCl洗涤液充分洗涤以去除杂蛋白，用12L、0.2mol/L的NaCl洗脱液洗脱，收集有效成分约12L；
S3，对步骤S2得到的有效成分进行单抗亲和层析，用8L、0.5mol/L的NaCl洗涤液充分洗以去除杂蛋白涤，用12L、0.1mol/L的HCl洗脱液洗脱，收集有效成分约3L，边收集边用氢氧化钠调pH＝7，所用单抗亲和层析柱采用购于基蛋生物医药有限公司的抗HCG单克隆抗体免疫原和GE公司的溴化氰预活化胶合成。
S4，对步骤S3得到的有效成分加入8倍重量份-4℃的无水乙醇，沉淀24h，弃去上清物，收集沉淀物，真空干燥12h，即得人绒毛膜促性腺激素固体。
对比例1：按照中国专利ZL01805363.7中的实施例1所述方法进行。
对比例2：按照中国专利ZL200510110035.1中的实施例1所述方法进行。
生物活性测试
参考“尿促性素第三批国家标准品的标定”，中国药品标准，2007年第8卷第4期第50-52页；《中国药典》[S]二部，2005，附录XII N。将实施例1-3和对比例1-2进行生物效价检验，检验结果计入下列表1中。
由表1中检验数据可以看出，通过本发明的纯化方法制备得到的成品生物效价达到7000IU/mg以上，收率达到90％以上，均优于现有的工艺纯化方法；并且相比较而言，本发明更加简单易操作，适合大规模生产使用。
表1检验结果
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | |
| 生物效价(IU/mg) | 7010 | 7082 | 7154 | 3604 | 5120 |
| 粗品→成品收率 | 93％ | 92％ | 93％ | 80％ | 88％ |
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种人绒毛膜促性腺激素纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，取1重量份人绒毛膜促性腺激素粗品溶解于50体积份的水中，加入0.1重量份的聚乙二醇，搅拌离心，过滤，采用乙酸或氢氧化钠对滤液调pH＝7；
S2，对步骤S1得到的滤液进行HS凝胶疏水柱层析提纯，用洗涤液充分洗涤，再用洗脱液洗脱，收集有效成分；
S3，对步骤S2得到的有效成分进行单抗亲和层析，用洗涤液充分洗涤，再用洗脱液洗脱，收集有效成分，采用氢氧化钠调pH＝7；
S4，对步骤S3得到的有效成分加入无水乙醇，沉淀24h，弃去上清物，收集沉淀物，真空干燥12h，即得人绒毛膜促性腺激素固体；
当所述重量份的单位为kg时，所述体积份的单位为L；
步骤S1中，过滤时采用0.65μm、2.5inch滤芯；
步骤S2中，所述洗涤液采用0.5mol/L的NaCl，所述洗脱液采用0.2mol/L的NaCl，所述洗涤液用量为45-55体积份，所述洗脱液用量为8-12体积份；
步骤S3中，所述洗涤液采用0.5mol/L的NaCl，所述洗脱液采用0.1mol/L的HCl，所述洗涤液用量为3-8体积份，所述洗脱液用量为8-12体积份；
步骤S3中，所述单抗亲和层析所用的单抗亲和层析由抗HCG单克隆抗体免疫原和溴化氰预活化胶合成；
步骤S4中，所述无水乙醇加入量为有效成分的5-8倍，所述无水乙醇的温度小于0℃。
2.根据权利要求1所述的人绒毛膜促性腺激素纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述搅拌离心的条件为3800-4200rpm，温度8-15℃，时间18-25min。
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2020
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