CN116217698A - 一种血促性素提取纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制品和兽药技术领域，公开了一种血促性素提取纯化方法，步骤为：1）采用偏磷酸调节孕马血清的pH为4.5～5.0，进行固液分离，收集上清液；2）采用第一沉淀剂对上清液进行沉淀处理，收集滤液；3）采用第二沉淀剂对滤液进行沉淀处理，收集沉淀物，沉淀物经干燥处理，得到血促性素粗品；4）将血促性素粗品溶解依次进行第一超滤、亲和层析、第二超滤、阳离子交换层析处理，得到血促性素粗品过滤液；采用第三沉淀剂对血促性素粗品过滤液进行沉淀处理，收集沉淀物，沉淀物经干燥得到血促性素纯品。本发明提取纯化方法制备的血促性素纯度能够达到99.9%以上，总收率能够达到88.9%，效价能够达到11000 IU/mg。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品和兽药技术领域，具体涉及一种血促性素提取纯化方法。
背景技术
血促性素为孕马血清或血浆中提取的血清促性腺激素，是来自于妊娠40～120天怀孕母马血清(浆)加工纯化制品，具备用于繁殖中促卵泡素及黄体生成素的双重性质；对于雌性动物，可促进其卵巢中卵泡发育及黄体生成；对于雄性动物，可促进睾丸精细管中精子生成及睾丸间质细胞分泌。试验证明，PMSG在同期发情、超数排卵、胚胎移植、治疗不发情、弱发情、情期不孕等方面应用效果极佳。1992年，我国农业部首次将兽用血促性素纳入《中国兽药规范》(1992年版)中，至2011年又收至我国农业部药典中。
随着血促性素应用范围的扩大和规模化养殖的普及，导致市场对血促性素的需求量大幅上升。目前，孕马血清促性腺激素的提取纯化的方法主要有偏磷酸分离-盐析-乙醇沉淀-透析法、偏磷酸分离-离子交换法和硫酸铵盐析-透析法等。但现有的血促性素提取纯化方法生产工艺繁琐，劳动强度大，生产成本高，血促性素收率低；而且，制备的血促性素的纯度低、效价低，使用效果差。因此，亟需提供一种血促性素的高效纯化提取方法。
发明内容
针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的旨在提供一种血促性素提取纯化方法。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种血促性素提取纯化方法，包括以下步骤：
(1)采用偏磷酸调节孕马血清的pH为4.5～5.0，然后进行固液分离，收集上清液；
(2)采用第一沉淀剂对所述上清液进行沉淀处理，固液分离，收集滤液；
(3)采用第二沉淀剂对所述滤液进行沉淀处理，固液分离，收集沉淀物，沉淀物经干燥处理，得到血促性素粗品；
(4)将血促性素粗品溶解，得到血促性素粗品溶液；将血促性素粗品溶液依次进行第一超滤、亲和层析、第二超滤、阳离子交换层析处理，得到血促性素粗品过滤液；采用第三沉淀剂对血促性素粗品过滤液进行沉淀处理，收集沉淀物，沉淀物经干燥处理，得到血促性素纯品。
优选地，所述亲和层析中亲和层析柱的层析基质为Blue Sepharose 6Fast Flow。
优选地，亲和层析过程中上样后先采用洗涤液冲洗亲和层析柱，然后采用洗脱缓冲液进行洗脱；所述亲和层析采用的洗涤液为氯化钠和磷酸二氢钠的混合水溶液，洗涤液的电导率为10～15ms/cm，洗涤液中磷酸二氢钠的浓度为0.05mol/L，氯化钠的浓度为0.07mol/L。亲和层析采用的洗脱缓冲液为氯化钠溶液，氯化钠溶液的电导率为40～50ms/cm，氯化钠溶液的浓度为0.45mol/。更加优选地，所述亲和层析采用的洗涤液的pH为6.0～7.0；所述亲和层析采用的洗脱缓冲液的pH为6.0～7.0。
优选地，所述阳离子交换层析中阳离子交换层析柱的层析基质为SP-SepharoseFast Flow。
优选地，阳离子交换层析过程中上样后先采用洗涤液冲洗阳离子交换层析柱，然后采用洗脱缓冲液进行洗脱。所述阳离子交换层析采用的洗涤液为氯化钠和醋酸钠的混合水溶液，洗涤液的电导率为10～15ms/cm，洗涤液中醋酸钠的浓度为0.01mol/L，氯化钠的浓度为0.13mol/L。阳离子交换层析采用的洗脱缓冲液为氯化钠和和醋酸钠的混合水溶液，洗脱缓冲液的电导率为30～40ms/cm，洗脱缓冲液中醋酸钠的浓度为0.01mol/L，氯化钠的浓度为0.35mol/L。更加优选地，所述阳离子交换层析采用的洗涤液的pH为4.0～5.0；所述阳离子交换层析采用的洗脱缓冲液的pH为7.0～8.0。
优选地，所述第一超滤采用的滤膜的截留分子量为10KDa，第一超滤处理后血促性素粗品溶液的电导率为10～15ms/cm。
优选地，所述第二超滤采用的滤膜的截留分子量为10KDa，第二超滤处理后血促性素粗品溶液的电导率为7～10ms/cm。
优选地，亲和层析处理前，将第一超滤处理后的血促性素粗品溶液pH调节至6.0～7.0；阳离子交换层析处理前，将第二超滤处理后的血促性素粗品溶液pH调节至4.0～5.0。
优选地，所述第一沉淀剂为乙醇和硅藻土；采用第一沉淀剂对所述上清液进行沉淀处理的操作为：向所述上清液中加入乙醇至上清液中的乙醇体积分数为55％～60％，然后再加入硅藻土，边加边搅拌。更加优选地，第一沉淀剂中所述乙醇为无水乙醇；所述硅藻土的用量为孕马血清总重的0.3％～0.5％。
优选地，所述第二沉淀剂、第三沉淀剂均为乙醇。更加优选地，所述第二沉淀剂、第三沉淀剂均为无水乙醇。
优选地，采用第二沉淀剂对所述滤液进行沉淀处理的操作为：向所述滤液中加入无水乙醇至滤液中的乙醇体积分数为70％～80％，边加边搅拌。
优选地，采用第三沉淀剂对所述血促性素粗品过滤液进行沉淀处理的操作为：向所述血促性素粗品过滤液中加入无水乙醇至血促性素粗品过滤液中的乙醇体积分数为80％～90％，边加边搅拌。
优选地，步骤(4)中，所述干燥是在真空干燥箱中进行干燥，干燥温度为25℃。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果如下：
(1)本发明血促性素提取纯化方法中采用偏磷酸对孕马血清进行分离处理时，将孕马血清的pH设置为4.5～5.0，该pH范围能够减少偏磷酸分离处理过程中血促性素糖链分解、失活，提取得到的血促性素收率高、效价高，有效避免了偏磷酸分离处理过程中因pH值过低(pH为3.0～3.5)引起血促性素糖链分解、失活，导致血促性素收率低、效价低的技术问题。
(2)本发明在进行亲和层析前对血促性素粗品溶液进行第一次超滤处理，在进行阳离子交换层析前对血促性素粗品溶液进行第二次超滤处理，超滤处理能够去除溶液中的小分子蛋白杂质，同时还能降低血促性素粗品溶液的电导率。通过第一超滤处理能够将血促性素粗品溶液的电导率为10～15ms/cm，该电导率能够保证后续亲和层析处理过程中血促性素能吸附在层析柱上并可以用洗脱缓冲液洗脱，有效解决了第二沉淀处理过程中高浓度乙醇导致部分偏磷酸析出致使血促性素粗品盐浓度高，亲和层析时血促性素无法吸附在层析柱上直接流穿层析柱的技术难题。通过第二超滤处理能够将血促性素粗品溶液的电导率为7～10ms/cm，该电导率能够保证后续阳离子交换层析处理过程中血促性素能吸附在阳离子交换层析柱上并可以用洗脱缓冲液洗脱，有效解决了亲和层析得到的含血促性素洗脱缓冲液盐浓度高，阳离子交换层析时血促性素无法吸附在阳离子交换层析柱上直接流穿层析柱的技术难题。
(3)本发明通过血促性素提取纯化方法通过对孕马血清依次进行偏磷酸分离、第一沉淀处理、第二沉淀处理、第一超滤、亲和层析、第二超滤、阳离子交换层析、第三沉淀处理，制备的血促性素纯度高(纯度能够达到99.9％以上)、收率高(收率能够达到88.9％)、效价高(效价能够达到11000IU/mg)，同时操作简单、环境污染小、成本低；解决了现有制备工艺血促性素提取工艺繁琐、收率低、纯度低、效价低的技术难题。
(4)对提取的血促性素粗品，本发明先进行亲和层析，再进行阳离子交换层析，亲和层析通过特异性吸附血促性素，然后再进行洗脱，能有效去除血促性素粗品中的杂蛋白，提高血促性素的纯度，阳离子交换层析能够进一步去除血促性素中亲和层析无法去除的杂质。
(5)本发明采用Blue Sepharose 6Fast Flow作为亲和层析柱的层析基质，BlueSepharose 6Fast Flow能够特异性亲和吸附血促性素，对血促性素进行纯化后，得到的血促性素的纯度高、收率高。
(6)本发明采用SP-Sepharose Fast Flow作为离子交换层析柱的层析基质，具有高分辨率，载量大等优点。
具体实施方式
以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均采用本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1：孕马血清偏磷酸分离处理时pH筛选实验
为了研究孕马血清偏磷酸分离处理时pH对血促性素提取纯化的影响，本发明进行了实施例1-1～实施例1-6的实验研究。实施例1-1～实施例1-6的具体实验内容如下：
实施例1-1：
一种血促性素提取纯化方法，步骤为：向孕马血清中加入偏磷酸，边加边搅拌，采用偏磷酸调节孕马血清的pH为3.0，然后进行固液分离，收集上清液。
实施例1-2～实施例1-6的内容与实施例1-1基本相同，其不同之处在于：步骤(1)中采用偏磷酸调节孕马血清的pH不同；其中，实施例1-2～实施例1-6中采用偏磷酸调节孕马血清的pH分别为：3.5、4.0、4.5、5、5.5。
分别对实施例1-1～实施例1-6收集的上清液进行血促性素纯度、效价检测，并计算血促性素的收率，其结果如表1所示。
表1偏磷酸调节孕马血清的pH筛选结果
由表1可知，pH低于3.5时，上清液中血促性素的纯度较高，但收率较低；随着pH增大，血促性素的收率逐渐增大。综合考虑血促性素的纯度和收率，采用偏磷酸调节孕马血清的pH优选为4.5～5.0，pH更加优选为5.0。
实施例2：亲和层析洗脱缓冲液筛选实验
为了研究亲和层析洗脱缓冲液成分对血促性素提取纯化的影响，本发明进行了实施例2-1～实施例2-6的实验研究。实施例2-1～实施例2-6的具体内容如下：
实施例2-1：
一种血促性素提取纯化方法，包括以下步骤：
(1)向孕马血清中加入偏磷酸，边加边搅拌，采用偏磷酸调节孕马血清的pH为5.0，然后进行固液分离，收集上清液。
(2)将步骤(1)收集的上清液中加入无水乙醇至上清液中乙醇的体积分数为58％，同时加入硅藻土，硅藻土的用量为孕马血清总重的0.35％；边加边搅拌；然后静置10h，静置后进行固液分离，收集滤液。
(3)向步骤(2)得到的滤液中加入无水乙醇至滤液中的乙醇体积分数为78％，边加边搅拌，然后静置10h，静置后进行固液分离，收集沉淀物，沉淀物经干燥处理，得到血促性素粗品。
(4)将步骤(3)得到的血促性素粗品溶解在纯化水中，得到血促性素粗品溶液，对血促性素粗品溶液进行第一次超滤处理，第一次超滤采用的滤膜的截留分子量为10KDa，第一次超滤处理后血促性素粗品溶液的电导率为10～15ms/cm。
(5)将经第一次超滤处理后的血促性素粗品溶液pH调节至6.5，然后开始进行亲和层析。亲和层析的具体操作为：将经第一超滤处理后的血促性素粗品溶液上样至亲和层析柱，上样结束后采用洗涤液对亲和层析柱进行洗涤除去杂蛋白，洗涤结束后采用洗脱缓冲液洗脱吸附在亲和层析柱上的血促性素，洗脱的同时进行检测，待A280吸光度有持续上升趋势时开始收集洗脱流份，收集结束得到收集液。其中，亲和层析采用的洗涤液为氯化钠和磷酸二氢钠的混合水溶液，洗涤液的电导率为13ms/cm，洗涤液的pH为6.5，洗涤液中磷酸二氢钠的浓度为0.05mol/L，氯化钠的浓度为0.07mol/L；亲和层析采用的洗脱缓冲液为氯化钠溶液，氯化钠溶液的电导率为45ms/cm，氯化钠溶液的浓度为0.45mol/L，pH为6.5。
实施例2-2：
实施例2-2的内容与实施例2-1基本相同，其不同之处在于：步骤(5)中，亲和层析采用的洗脱缓冲液为磷酸二氢钠溶液，磷酸二氢钠溶液的电导率为45ms/cm，磷酸二氢钠溶液的浓度为0.35mol/L，磷酸二氢钠溶液的pH为6.5。
实施例2-3：
实施例2-3的内容与实施例2-1基本相同，其不同之处在于：步骤(5)中，亲和层析采用的洗脱缓冲液为磷酸二氢钾溶液，磷酸二氢钾溶液的电导率为45ms/cm，磷酸二氢钾溶液的浓度为0.35mol/L，磷酸二氢钾溶液的pH为6.5。
实施例2-4：
实施例2-4的内容与实施例2-1基本相同，其不同之处在于：步骤(5)中，亲和层析采用的洗脱缓冲液为磷酸二氢钾和氯化钠混合溶液；洗脱缓冲液中磷酸二氢钾浓度为0.15mol/L，氯化钠的浓度为0.25mol/L；洗脱缓冲液的电导率为45ms/cm，洗脱缓冲液的pH为6.5。
实施例2-5：
实施例2-5的内容与实施例2-1基本相同，其不同之处在于：步骤(5)中，亲和层析采用的洗脱缓冲液为醋酸钠溶液，醋酸钠溶液的浓度为0.48mol/L，醋酸钠溶液的电导率为45ms/cm，醋酸钠溶液的pH为6.5。
实施例2-6：
实施例2-6的内容与实施例2-1基本相同，其不同之处在于：步骤(5)中，亲和层析采用的洗脱缓冲液为醋酸钠和氯化钠混合溶液；洗脱缓冲液中醋酸钠浓度为0.15mol/L，氯化钠的浓度为0.32mol/L；洗脱缓冲液的电导率为45ms/cm，洗脱缓冲液的pH为6.5。
分别对实施例2-1～实施例2-6提取到的含血促性素的收集液进行血促性素纯度、效价检测，并计算血促性素的收率，其结果如表2所示。
表2亲和层析洗脱缓冲液筛选结果
由表2可知，亲和层析采用浓度为0.45mol/L氯化钠溶液作为洗脱缓冲液进行洗脱时，收集的含血促性素洗脱流份中血促性素的纯度最高、收率最高。因此，亲和层析洗脱液优选为0.45mol/L氯化钠溶液。
实施例3：亲和层析洗脱缓冲液pH筛选实验
为了研究亲和层析洗脱缓冲液pH对血促性素提取纯化的影响，本发明进行了实施例3-1～实施例3-6的实验研究。
实施例3-1～实施例3-6的实验内容与实施例2-1基本相同，其不同之处在于：步骤(5)中，亲和层析采用的洗脱缓冲液——氯化钠溶液的pH分别为5.0、5.5、6.0、7.0、7.5、8.0。
分别对实施例3-1～实施例3-6提取得到的血促性素进行纯度、效价检测，并计算血促性素的收率，其结果如表3所示。
表3亲和层析洗脱缓冲液pH筛选结果
由表3可知，随着洗脱缓冲液pH的增大，含血促性素洗脱流份中血促性素的纯度逐渐降低。综合考虑亲和层析采用的洗脱缓冲液——氯化钠溶液的pH优选为6.0-7.0，更加优选为6.5。
实施例4：阳离子交换层析洗脱缓冲液筛选实验
为了研究阳离子交换层析洗脱缓冲液成分对血促性素提取纯化的影响，本发明进行了实施例4-1～实施例4-4的实验研究。实施例4-1～实施例4-4的具体内容如下：
实施例4-1：
一种血促性素提取纯化方法，包括以下步骤：
(1)向孕马血清中加入偏磷酸，边加边搅拌，采用偏磷酸调节孕马血清的pH为5.0，然后进行固液分离，收集上清液。
(2)将步骤(1)收集的上清液中加入无水乙醇至上清液中乙醇的体积分数为58％，同时加入硅藻土，硅藻土的用量为孕马血清总重的0.35％；边加边搅拌；然后静置10h，静置后进行固液分离，收集滤液。
(3)向步骤(2)得到的滤液中加入无水乙醇至滤液中的乙醇体积分数为78％，边加边搅拌，然后静置10h，静置后进行固液分离，收集沉淀物，沉淀物经干燥处理，得到血促性素粗品。
(4)将步骤(3)得到的血促性素粗品溶解在纯化水中，得到血促性素粗品溶液，对血促性素粗品溶液进行第一次超滤处理，第一次超滤采用的滤膜的截留分子量为10KDa，第一次超滤处理后血促性素粗品溶液的电导率为10～15ms/cm。
(5)将经第一次超滤处理后的血促性素粗品溶液pH调节至6.5，然后开始进行亲和层析。亲和层析的具体操作为：将经第一超滤处理后的血促性素粗品溶液上样至亲和层析柱，上样结束后采用洗涤液对亲和层析柱进行洗涤除去杂蛋白，洗涤结束后采用洗脱缓冲液洗脱吸附在亲和层析柱上的血促性素，洗脱的同时进行检测，待A280吸光度有持续上升趋势时开始收集洗脱流份，收集结束得到收集液。其中，亲和层析采用的洗涤液为氯化钠和磷酸二氢钠的混合水溶液，洗涤液的电导率为13ms/cm，洗涤液的pH为6.5，洗涤液中磷酸二氢钠的浓度为0.05mol/L，氯化钠的浓度为0.07mol/L；亲和层析采用的洗脱缓冲液为氯化钠溶液，氯化钠溶液的电导率为45ms/cm，氯化钠溶液的浓度为0.45mol/L，pH为6.5。
(6)将亲和层析收集的收集液进行第二次超滤处理，第二次超滤采用的滤膜的截留分子量为10KDa，第二次超滤处理后收集液的电导率为7～10ms/cm。
(7)将经第二次超滤处理后的收集液pH调节至4.0-5.0，然后开始进行阳离子交换层析。阳离子交换层析的具体操作为：将经第二次超滤处理后的收集液上样至阳离子交换层析柱，上样结束后采用洗涤液对阳离子交换层析柱进行洗涤除去杂蛋白，洗涤结束后采用洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱的同时进行检测，待A280吸光度有持续上升趋势时开始收集洗脱流份，即得血促性素粗品过滤液。其中，阳离子交换层析采用的洗涤液为氯化钠和醋酸钠的混合水溶液，洗涤液的电导率为14ms/cm，洗涤液的pH为4.5，洗涤液中醋酸钠的浓度为0.01mol/L，氯化钠的浓度为0.13mol/L；阳离子交换层析采用的洗脱缓冲液为氯化钠和和醋酸钠的混合水溶液，洗脱缓冲液的电导率为35ms/cm，洗脱缓冲液的pH为7.5，洗脱缓冲液中醋酸钠的浓度为0.01mol/L，氯化钠的浓度为0.35mol/L。
实施例4-2：
实施例4-2的内容与实施例4-1基本相同，其不同之处在于：步骤(7)中，阳离子交换层析采用的洗脱缓冲液为醋酸钠溶液，醋酸钠溶液的浓度为0.36mol/L，醋酸钠溶液的电导率为35ms/cm，醋酸钠溶液的pH为7.5。
实施例4-3：
实施例4-3的内容与实施例4-1基本相同，其不同之处在于：步骤(7)中，阳离子交换层析采用的洗脱缓冲液为氯化钠溶液，氯化钠溶液的浓度为0.35mol/L，氯化钠溶液的电导率为35ms/cm，氯化钠溶液的pH为7.5。
实施例4-4：
实施例4-4的内容与实施例4-1基本相同，其不同之处在于：步骤(7)中，阳离子交换层析采用的洗脱缓冲液为醋酸铵溶液，醋酸铵溶液的浓度为0.42mol/L，醋酸铵溶液的电导率为35ms/cm，醋酸铵溶液的pH为7.5。
分别对实施例4-1～实施例4-4得到的血促性素粗品过滤液进行血促性素纯度、效价检测，并计算血促性素的收率，其结果如表4所示。
表4阳离子交换层析洗脱缓冲液筛选结果
由表4可知，阳离子交换层析采用的洗脱缓冲液为氯化钠和和醋酸钠的混合溶液时，得到的血促性素粗品过滤液中血促性素的纯度和收率最高。因此，阳离子交换层析洗脱缓冲液优选为氯化钠和和醋酸钠的混合溶液，洗脱缓冲液中醋酸钠的浓度为0.01mol/L，氯化钠的浓度为0.35mol/L。
实施例5：阳离子交换层析洗脱缓冲液pH筛选实验
为了研究阳离子交换层析洗脱缓冲液pH对血促性素提取纯化的影响，本发明进行了实施例5-1～实施例5-6的实验研究。实施例5-1～实施例5-6的具体内容如下：
实施例5-1～实施例5-7的实验内容与实施例4-1基本相同，其不同之处在于：步骤(7)中，阳离子交换层析洗脱缓冲液的pH分别为6.0、6.5、7.0、8.0、8.5、9.0。
分别对实施例5-1～实施例5-6得到的血促性素粗品过滤液进行血促性素纯度、效价检测，并计算血促性素的收率，其结果如表5所示。
表5阳离子交换层析洗脱缓冲液pH筛选结果
由表5可知，阳离子交换层析采用的洗脱缓冲液pH为7.0～8.0时，得到的血促性素粗品过滤液中血促性素的纯度和收率均较高。因此，阳离子交换层析洗脱缓冲液优选pH为7.0～8.0，更加优选为7.5。
实施例6：超滤处理探讨
为了研究超滤对血促性素提取纯化的影响，本发明进行了实施例6-1～实施例6-4的实验研究。实施例6-1～实施例6-4的具体内容如下：
实施例6-1：
一种血促性素提取纯化方法，包括以下步骤：
(1)向孕马血清中加入偏磷酸，边加边搅拌，采用偏磷酸调节孕马血清的pH为5.0，然后进行固液分离，收集上清液。
(2)将步骤(1)收集的上清液中加入无水乙醇至上清液中乙醇的体积分数为58％，同时加入硅藻土，硅藻土的用量为孕马血清总重的0.35％；边加边搅拌；然后静置10h，静置后进行固液分离，收集滤液。
(3)向步骤(2)得到的滤液中加入无水乙醇至滤液中的乙醇体积分数为78％，边加边搅拌，然后静置10h，静置后进行固液分离，收集沉淀物，沉淀物经干燥处理，得到血促性素粗品。
(4)将步骤(3)得到的血促性素粗品溶解在纯化水中，得到血促性素粗品溶液，对血促性素粗品溶液进行第一次超滤处理，第一次超滤采用的滤膜的截留分子量为10KDa，第一次超滤处理后血促性素粗品溶液的电导率为10～15ms/cm。
(5)将经第一次超滤处理后的血促性素粗品溶液pH调节至6.5，然后开始进行亲和层析。亲和层析的具体操作为：将经第一超滤处理后的血促性素粗品溶液上样至亲和层析柱，上样结束后采用洗涤液对亲和层析柱进行洗涤除去杂蛋白，洗涤结束后采用洗脱缓冲液洗脱吸附在亲和层析柱上的血促性素，洗脱的同时进行检测，待A280吸光度有持续上升趋势时开始收集洗脱流份，收集结束得到含血促性素洗脱流份。其中，亲和层析采用的洗涤液为氯化钠和磷酸二氢钠的混合水溶液，洗涤液的电导率为13ms/cm，洗涤液的pH为6.5，洗涤液中磷酸二氢钠的浓度为0.05mol/L，氯化钠的浓度为0.07mol/L；亲和层析采用的洗脱缓冲液为氯化钠溶液，氯化钠溶液的电导率为45ms/cm，氯化钠溶液的浓度为0.45mol/L，pH为6.5。
(6)将亲和层析收集的收集液进行第二次超滤处理，第二次超滤采用的滤膜的截留分子量为10KDa，第二次超滤处理后收集液的电导率为7～10ms/cm。
(7)将经第二次超滤处理后的收集液pH调节至4.0-5.0，然后开始进行阳离子交换层析。阳离子交换层析的具体操作为：将经第二次超滤处理后的收集液上样至阳离子交换层析柱，上样结束后采用洗涤液对阳离子交换层析柱进行洗涤除去杂蛋白，洗涤结束后采用洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱的同时进行检测，待A280吸光度有持续上升趋势时开始收集洗脱流份，即得血促性素粗品过滤液。其中，阳离子交换层析采用的洗涤液为氯化钠和醋酸钠的混合水溶液，洗涤液的电导率为14ms/cm，洗涤液的pH为4.5，洗涤液中醋酸钠的浓度为0.01mol/L，氯化钠的浓度为0.13mol/L；阳离子交换层析采用的洗脱缓冲液为氯化钠和和醋酸钠的混合水溶液，洗脱缓冲液的电导率为35ms/cm，洗脱缓冲液的pH为7.5，洗脱缓冲液中醋酸钠的浓度为0.01mol/L，氯化钠的浓度为0.35mol/L。
(8)向步骤(7)得到的血促性素粗品过滤液中加入无水乙醇至滤液中的乙醇体积分数为86％，边加边搅拌，然后静置10h，静置进行固液分离，收集沉淀物，将沉淀物放入真空干燥箱中进行干燥处理，得到血促性素纯品。
实施例6-2：
实施例6-2的内容与实施例6-1基本相同，其不同之处在于：步骤(4)中不对血促性素粗品溶液进行第一次超滤处理；步骤(5)进行亲和层析得到收集液后不进行第二次超滤处理，直接将亲和层析得到的收集液pH调节至4.0-5.0后开始进行阳离子交换层析。
实施例6-3：
实施例6-3的内容与实施例6-1基本相同，其不同之处在于：步骤(5)进行亲和层析得到收集液后不进行第二次超滤处理，直接将亲和层析得到的收集液pH调节至4.0-5.0后开始进行阳离子交换层析。
实施例6-4：
实施例6-4的内容与实施例6-1基本相同，其不同之处在于：步骤(4)中不对血促性素粗品溶液进行第一次超滤处理。
分别对实施例6-1～实施例6-4提取得到的血促性素纯品进行纯度、效价检测，并计算血促性素的收率，其结果如表6所示。
表6超滤处理对血促性素提出纯化效果的影响结果
由表6可知，血促性素提取过程中如果不进行超滤或只进行第二次超滤处理，得到的血促性素产品纯度均较低，这是因为第二沉淀处理过程中高浓度乙醇导致部分偏磷酸析出致使血促性素粗品盐浓度高，亲和层析时血促性素无法吸附在层析柱上直接流穿层析柱，无法实现血促性素中杂质的有效去除。只进行第一次超滤处理，得到血促性素产品纯度虽有较大提升，但纯度最高仅能达到85.3％；当两次超滤相结合时，制备的血促性素产品纯度最高(达到99.9％)，收率能达到88.9。因此，血促性素提取方法优选为进行两次超滤处理，第一次超滤是在亲和层析前进行，第二次超滤处理是在阳离子交换层析前进行。
实施例7：亲和层析、阳离子交换层析处理探讨
为了研究亲和层析、阳离子交换层析对血促性素提取纯化的影响，本发明进行了实施例7-1～实施例7-3的实验研究。实施例7-1～实施例7-3的具体内容如下：
实施例7-1：
实施例7-1的内容与实施例6-1基本相同，其不同之处在于：步骤(4)对血促性素粗品溶液进行第一次超滤处理后直接按步骤(6)的操作对血促性素粗品溶液进行第二次超滤处理，第二次超滤处理后直接按步骤(8)进行处理；即血促性素粗品溶液不进行亲和层析、阳离子交换层析处理。
实施例7-2：
实施例7-2的内容与实施例6-1基本相同，其不同之处在于：步骤(6)进行第二次超滤处理后，不进行阳离子交换层析处理，直接将第二次超滤处理后滤液按步骤(8)进行处理；即血促性素粗品溶液不进行阳离子交换层析处理。
实施例7-3：
实施例7-3的内容与实施例6-1基本相同，其不同之处在于：步骤(4)进行第一次超滤处理后，不进行亲和层析处理，直接将第一次超滤处理后的血促性素粗品溶液进行第二次超滤处理；即血促性素粗品溶液不进行亲和层析处理。
分别对实施例7-1～实施例7-4提取得到的血促性素进行纯度、效价检测，并计算血促性素的收率，其结果如表7所示。
表7亲和层析、阳离子交换层析对血促性素提取纯化的影响结果
由表7可知，在进行血促性素提取时，先进行亲和层析然后再进行离子交换层析得到的血促性素产品纯度最高，收率最高。
综上所述，采用本发明血促性素的提取纯化方法能够极大地提高制备的血促性素的纯度和收率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型。这等同变化的等效实施例。但是，凡是未脱离本发明技术构思，依据本发明的技术实质对以上实施例所作出的简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种血促性素提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采用偏磷酸调节孕马血清的pH为4.5～5.0，然后进行固液分离，收集上清液；
（2）采用第一沉淀剂对所述上清液进行沉淀处理，固液分离，收集滤液；
（3）采用第二沉淀剂对所述滤液进行沉淀处理，固液分离，收集沉淀物，沉淀物经干燥处理，得到血促性素粗品；
（4）将所述血促性素粗品溶解，得到血促性素粗品溶液；将血促性素粗品溶液依次进行第一超滤、亲和层析、第二超滤、阳离子交换层析处理，得到血促性素粗品过滤液；采用第三沉淀剂对血促性素粗品过滤液进行沉淀处理，收集沉淀物，沉淀物经干燥处理，得到血促性素纯品。
2. 根据权利要求1所述的血促性素提取纯化方法，其特征在于，所述亲和层析采用的层析基质为Blue Sepharose 6 Fast Flow。
3.根据权利要求2所述的血促性素提取纯化方法，其特征在于，亲和层析过程中上样后先采用洗涤液冲洗亲和层析柱，然后采用洗脱缓冲液进行洗脱；所述亲和层析采用的洗涤液为氯化钠和磷酸二氢钠的混合水溶液，洗涤液的电导率为10～15ms/cm，洗涤液中磷酸二氢钠的浓度为0.05mol/L，氯化钠的浓度为0.07mol/L；亲和层析采用的洗脱缓冲液为氯化钠溶液，氯化钠溶液的电导率为40～50ms/cm。
4. 根据权利要求1～3任一所述的血促性素提取纯化方法，其特征在于，所述阳离子交换层析采用的层析基质为SP-Sepharose Fast Flow。
5.根据权利要求4所述的血促性素提取纯化方法，其特征在于，阳离子交换层析过程中上样后先采用洗涤液冲洗阳离子交换层析柱，然后采用洗脱缓冲液进行洗脱；所述阳离子交换层析采用的洗涤液为氯化钠和醋酸钠的混合水溶液，洗涤液的电导率为10～15ms/cm，洗涤液中醋酸钠的浓度为0.01mol/L，氯化钠的浓度为0.13mol/L；阳离子交换层析采用的洗脱缓冲液为氯化钠和和醋酸钠的混合水溶液，洗脱缓冲液的电导率为30～40ms/cm，洗脱缓冲液中醋酸钠的浓度为0.01mol/L，氯化钠的浓度为0.35mol/L。
6.根据权利要求5所述的血促性素提取纯化方法，其特征在于，所述第一超滤采用的滤膜的截留分子量为10KDa，第一超滤处理后血促性素粗品溶液的电导率为10～15ms/cm。
7.根据权利要求6所述的血促性素提取纯化方法，其特征在于，所述第二超滤采用的滤膜的截留分子量为10KDa，第二超滤处理后血促性素粗品溶液的电导率为7～10ms/cm。
8.根据权利要求7所述的血促性素提取纯化方法，其特征在于，所述亲和层析采用的洗涤液的pH为6.0～7.0；所述亲和层析采用的洗脱缓冲液的pH为6.0～7.0；所述阳离子交换层析采用的洗涤液的pH为4.0～5.0；所述阳离子交换层析采用的洗脱缓冲液的pH为7.0～8.0。
9.根据权利要求8所述的血促性素提取纯化方法，其特征在于，所述第一沉淀剂为乙醇和硅藻土；采用第一沉淀剂对所述上清液进行沉淀处理的操作为：向所述上清液中加入乙醇至上清液中的乙醇体积分数为55%～60%，然后再加入硅藻土，边加边搅拌，硅藻土用量为孕马血清总重的0.3%～0.5%。
10.根据权利要求9所述的血促性素提取纯化方法，其特征在于，所述第二沉淀剂、第三沉淀剂均为乙醇；采用第二沉淀剂对所述滤液进行沉淀处理的操作为：向所述滤液中加入乙醇至滤液中的乙醇体积分数为70%～80%，边加边搅拌；采用第三沉淀剂对所述血促性素粗品过滤液进行沉淀处理的操作为：向所述血促性素粗品过滤液中加入乙醇至血促性素粗品过滤液中的乙醇体积分数为80%～90%，边加边搅拌。
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