CN116082489A - 一种孕马血清促性腺激素纯化生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种孕马血清促性腺激素纯化生产方法，本发明生产方法依次包括偏磷酸沉淀、低浓度乙醇沉淀、高浓度乙醇沉淀、缓冲液溶解沉淀、一次透析除盐、琼脂糖凝凝胶阴柱层析、琼脂糖凝凝胶阳柱层析和二次透析除盐共8个步骤。本发明在原有的工艺基础上加入了层析及超滤，大大增加了活性，以最小的工艺变更，快速、低成本地解决了产品活性问题，本发明可以加在任何现有的PMSG工艺流程上。本发明方法大大提高了产品活性，根据本发明中的实验数据，本发明纯化生产方法使得最终产品活性有显著提高，大大提高了产品质量。本发明纯化生产方法采用琼脂糖凝胶层析法分离纯化得到活性达到两千以上的产品，解决了现有技术中存在的产品质量问题。
Description
技术领域
本发明属于对PMSG提纯工艺的研究技术领域，具体的说是涉及一种孕马血清促性腺激素纯化生产方法。
背景技术
PMSG是从妊娠母马身上分离纯化的促性腺激素，具有LH和FSH两种活性，由于PMSG在动物体内半衰期较长，所以在动物繁殖领域有广泛用途，现有技术中原工艺的主要提取方法是采用偏磷酸去除部分杂蛋白，再利用乙醇去除部分杂蛋白后，再利用透析法去除小分子杂质，但是现有技术中这种已有的提取方法得到的产品活性较低，为了提高产品活性，需要提供一种新型的纯化提取生产方法，使分离纯化得到活性达到两千以上的产品，从而解决现有技术中的产品质量问题。
发明内容
本发明为了克服现有技术存在的不足，提供一种孕马血清促性腺激素纯化生产方法，使分离纯化得到活性达到两千以上的产品，从而解决现有技术中的产品质量问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：本发明公开了一种孕马血清促性腺激素纯化生产方法，该纯化生产方法具体包括如下步骤：
（1）偏磷酸沉淀：在孕马血浆中加入偏磷酸溶液，使溶液pH达到3.2～3.8，收集上清液，弃沉淀；
（2）低浓度乙醇沉淀：偏磷酸上清液加入乙醇，使乙醇含量达到25％～45％的质量百分比，搅拌、过滤，收集上清液，弃沉淀；
（3）高浓度乙醇沉淀：上清液继续加入乙醇，乙醇含量达到55％～75％的质量百分比，搅拌，过滤，收集沉淀，弃上清夜；
（4）缓冲液溶解沉淀：按照1000mL纯化水加入2.5g～5.5g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液，充分搅拌溶解步骤3中的沉淀；
（5）透析除盐：将步骤 4 中的溶解液超滤透析清洗，使电导率0.5mS/cm～2.5mS/cm，收集浓相，弃透出液；
（6）琼脂糖凝凝胶阴柱层析：按照1000mL纯化水加入4g～4.2g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液，平衡层析柱，上样，之后按照1000mL纯化水加入16g～17g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制的缓冲液洗脱PMSG，并全部收集；
（7）琼脂糖凝凝胶阳柱层析：按照1000mL纯化水加入2g～2.5g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液，平衡层析柱，上样步骤6洗脱液，之后按照1000mL纯化水加入16g～17g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制的缓冲液洗脱PMSG，并全部收集；
（8）透析除盐：将步骤 7 洗脱液超滤透析清洗，电导率＜6mS/cm，收集浓相，弃透出液，得到高纯度的孕马血清促性腺激素PMSG液体制品。
作为本发明的优选实施方式，步骤1偏磷酸沉淀中，在孕马血浆中加入偏磷酸溶液，使溶液pH达到3.6。步骤2低浓度乙醇沉淀中，偏磷酸上清液加入乙醇，使乙醇含量达到30％～40％的质量百分比。步骤3高浓度乙醇沉淀中，上清液继续加入乙醇，乙醇含量达到50％～60％的质量百分比。步骤4缓冲液溶解沉淀中，按照1000mL纯化水加入3g～4g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液。步骤5透析除盐中，将步骤 4 中的溶解液超滤透析清洗，使电导率1mS/cm～2mS/cm。
作为本发明的优选实施方式，步骤6琼脂糖凝凝胶阴柱层析中，按照1000mL纯化水加入4g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液，平衡层析柱，上样，之后按照1000mL纯化水加入16g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制的缓冲液洗脱PMSG，并全部收集。步骤7琼脂糖凝凝胶阳柱层析中，按照1000mL纯化水加入2g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液，平衡层析柱，上样步骤6洗脱液，之后按照1000mL纯化水加入16g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制的缓冲液洗脱PMSG，并全部收集。
本发明的有益效果是：本发明生产方法依次包括偏磷酸沉淀、低浓度乙醇沉淀、高浓度乙醇沉淀、缓冲液溶解沉淀、一次透析除盐、琼脂糖凝凝胶阴柱层析、琼脂糖凝凝胶阳柱层析和二次透析除盐共8个步骤。现有技术中已有的提取方法得到的产品活性较低，为了提高产品活性，需要提供一种新型的纯化提取生产方法。本发明在原有的工艺基础上加入了层析及超滤，大大增加了活性，以最小的工艺变更，快速、低成本地解决了产品活性问题，本发明中的技术方案可以加在任何现有的PMSG工艺流程上。
本发明属于对PMSG提纯工艺的研究，本发明孕马血清促性腺激素纯化生产方法大大提高了产品活性。根据本发明中的实验数据，本发明纯化生产方法使得最终产品活性有显著提高，大大提高了产品质量，本发明纯化生产方法采用琼脂糖凝胶层析法分离纯化得到活性达到两千以上的产品，解决了现有技术中存在的产品质量问题。
具体实施方式
以下结合具体实施例和实验数据对本发明作详细描述。
实施例1：一种孕马血清促性腺激素纯化生产方法，具体包括如下步骤：（1）偏磷酸沉淀：在孕马血浆中加入偏磷酸溶液，使溶液pH达到3.2，收集上清液，弃沉淀；（2）低浓度乙醇沉淀：偏磷酸上清液加入乙醇，使乙醇含量达到25％的质量百分比，搅拌、过滤，收集上清液，弃沉淀；（3）高浓度乙醇沉淀：上清液继续加入乙醇，乙醇含量达到55％的质量百分比，搅拌，过滤，收集沉淀，弃上清夜；（4）缓冲液溶解沉淀：按照1000mL纯化水加入2.5g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液，充分搅拌溶解步骤3中的沉淀；（5）一次透析除盐：将步骤 4 中的溶解液超滤透析清洗，使电导率0.5mS/cm，收集浓相，弃透出液；（6）琼脂糖凝凝胶阴柱层析：按照1000mL纯化水加入4g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液，平衡层析柱，上样，之后按照1000mL纯化水加入16g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制的缓冲液洗脱PMSG，并全部收集；（7）琼脂糖凝凝胶阳柱层析：按照1000mL纯化水加入2g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液，平衡层析柱，上样步骤6洗脱液，之后按照1000mL纯化水加入16g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制的缓冲液洗脱PMSG，并全部收集；（8）二次透析除盐：将步骤 7 洗脱液超滤透析清洗，电导率＜6mS/cm，收集浓相，弃透出液，得到高纯度的孕马血清促性腺激素PMSG液体制品。
实施例2：一种孕马血清促性腺激素纯化生产方法，具体包括如下步骤：（1）偏磷酸沉淀：在孕马血浆中加入偏磷酸溶液，使溶液pH达到3.6，收集上清液，弃沉淀；（2）低浓度乙醇沉淀：偏磷酸上清液加入乙醇，使乙醇含量达到35％的质量百分比，搅拌、过滤，收集上清液，弃沉淀；（3）高浓度乙醇沉淀：上清液继续加入乙醇，乙醇含量达到65％的质量百分比，搅拌，过滤，收集沉淀，弃上清夜；（4）缓冲液溶解沉淀：按照1000mL纯化水加入4g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液，充分搅拌溶解步骤3中的沉淀；（5）一次透析除盐：将步骤4 中的溶解液超滤透析清洗，使电导率2mS/cm，收集浓相，弃透出液；（6）琼脂糖凝凝胶阴柱层析：按照1000mL纯化水加入4g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液，平衡层析柱，上样，之后按照1000mL纯化水加入16.5g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制的缓冲液洗脱PMSG，并全部收集；（7）琼脂糖凝凝胶阳柱层析：按照1000mL纯化水加入2.2g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液，平衡层析柱，上样步骤6洗脱液，之后按照1000mL纯化水加入16.5g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制的缓冲液洗脱PMSG，并全部收集；（8）二次透析除盐：将步骤 7 洗脱液超滤透析清洗，电导率＜6mS/cm，收集浓相，弃透出液，得到高纯度的孕马血清促性腺激素PMSG液体制品。
实施例3：一种孕马血清促性腺激素纯化生产方法，具体包括如下步骤：（1）偏磷酸沉淀：在孕马血浆中加入偏磷酸溶液，使溶液pH达到3.8，收集上清液，弃沉淀；（2）低浓度乙醇沉淀：偏磷酸上清液加入乙醇，使乙醇含量达到45％的质量百分比，搅拌、过滤，收集上清液，弃沉淀；（3）高浓度乙醇沉淀：上清液继续加入乙醇，乙醇含量达到75％的质量百分比，搅拌，过滤，收集沉淀，弃上清夜；（4）缓冲液溶解沉淀：按照1000mL纯化水加入5.5g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液，充分搅拌溶解步骤3中的沉淀；（5）一次透析除盐：将步骤 4 中的溶解液超滤透析清洗，使电导率2.5mS/cm，收集浓相，弃透出液；（6）琼脂糖凝凝胶阴柱层析：按照1000mL纯化水加入4.2g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液，平衡层析柱，上样，之后按照1000mL纯化水加入17g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制的缓冲液洗脱PMSG，并全部收集；（7）琼脂糖凝凝胶阳柱层析：按照1000mL纯化水加入2.5g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液，平衡层析柱，上样步骤6洗脱液，之后按照1000mL纯化水加入17g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制的缓冲液洗脱PMSG，并全部收集；（8）二次透析除盐：将步骤 7 洗脱液超滤透析清洗，电导率＜6mS/cm，收集浓相，弃透出液，得到高纯度的孕马血清促性腺激素PMSG液体制品。
本发明沉淀溶解液经超滤后的浓缩液上样琼脂糖凝胶柱，经不同浓度缓冲液进行洗脱，收集中间浓度洗脱液，洗脱液再进行浓缩，将浓缩液进行冻干，最终产品冻干粉活性达到2000IU/mg。具体实验数据如表1所示：
表1：实验一、实验二和实验三的实验数据。
本发明纯化生产方法大大提高了产品活性，根据以上表格中实验一、实验二和实验三的三组实验数据，得出本发明工艺使得最终产品的活性有显著提高，大大提高了产品质量。
本发明在原有的工艺基础上加入了层析及超滤，大大增加了活性，以最小的工艺变更，快速、低成本地解决了产品活性问题，本发明中的技术方案可以加在任何现有的PMSG工艺流程上。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (8)
1.一种孕马血清促性腺激素纯化生产方法，其特征在于：所述孕马血清促性腺激素纯化生产方法具体包括如下步骤：
（1）偏磷酸沉淀：
在孕马血浆中加入偏磷酸溶液，使溶液pH达到3.2～3.8，收集上清液，弃沉淀；
（2）低浓度乙醇沉淀：
偏磷酸上清液加入乙醇，使乙醇含量达到25％～45％的质量百分比，搅拌、过滤，收集上清液，弃沉淀；
（3）高浓度乙醇沉淀：
上清液继续加入乙醇，乙醇含量达到55％～75％的质量百分比，搅拌，过滤，收集沉淀，弃上清夜；
（4）缓冲液溶解沉淀：
按照1000mL纯化水加入2.5g～5.5g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液，充分搅拌溶解步骤3中的沉淀；
（5）透析除盐：
将步骤 4 中的溶解液超滤透析清洗，使电导率0.5mS/cm～2.5mS/cm，收集浓相，弃透出液；
（6）琼脂糖凝凝胶阴柱层析：
按照1000mL纯化水加入4g～4.2g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液，平衡层析柱，上样，之后按照1000mL纯化水加入16g～17g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制的缓冲液洗脱PMSG，并全部收集；
（7）琼脂糖凝凝胶阳柱层析：
按照1000mL纯化水加入2g～2.5g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液，平衡层析柱，上样步骤6洗脱液，之后按照1000mL纯化水加入16g～17g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制的缓冲液洗脱PMSG，并全部收集；
（8）透析除盐：
将步骤 7 洗脱液超滤透析清洗，电导率＜6mS/cm，收集浓相，弃透出液，得到高纯度的孕马血清促性腺激素PMSG液体制品。
2.根据权利要求1的一种孕马血清促性腺激素纯化生产方法，其特征在于：所述步骤1偏磷酸沉淀中，在孕马血浆中加入偏磷酸溶液，使溶液pH达到3.6。
3.根据权利要求1或2的一种孕马血清促性腺激素纯化生产方法，其特征在于：所述步骤2低浓度乙醇沉淀中，偏磷酸上清液加入乙醇，使乙醇含量达到30％～40％的质量百分比。
4.根据权利要求1或2的一种孕马血清促性腺激素纯化生产方法，其特征在于：所述步骤3高浓度乙醇沉淀中，上清液继续加入乙醇，乙醇含量达到50％～60％的质量百分比。
5.根据权利要求1或2的一种孕马血清促性腺激素纯化生产方法，其特征在于：所述步骤4缓冲液溶解沉淀中，按照1000mL纯化水加入3g～4g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液。
6.根据权利要求1或2的一种孕马血清促性腺激素纯化生产方法，其特征在于：所述步骤5透析除盐中，将步骤 4 中的溶解液超滤透析清洗，使电导率1mS/cm～2mS/cm。
7.根据权利要求1或2的一种孕马血清促性腺激素纯化生产方法，其特征在于：所述步骤6琼脂糖凝凝胶阴柱层析中，按照1000mL纯化水加入4g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液，平衡层析柱，上样，之后按照1000mL纯化水加入16g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制的缓冲液洗脱PMSG，并全部收集。
8.根据权利要求1或2的一种孕马血清促性腺激素纯化生产方法，其特征在于：所述步骤7琼脂糖凝凝胶阳柱层析中，按照1000mL纯化水加入2g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制缓冲液，平衡层析柱，上样步骤6洗脱液，之后按照1000mL纯化水加入16g碳酸氢铵的比例加入碳酸氢铵配制的缓冲液洗脱PMSG，并全部收集。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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