CN114874125B - 一种从发酵液中分离纯化5-羟基色氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从发酵液中分离纯化5‑羟基色氨酸的方法，属于发酵产品分离纯化技术领域。本发明的方法仅需要膜分离、离交、层析、浓缩、脱色和结晶等常规制备手段，就可以完成5‑羟基色氨酸的分离和制备。本发明通过使用吸附层析法对5‑羟基色氨酸发酵液中的色氨酸和5‑羟基色氨酸进行分离，通过添加保护剂对5‑羟基色氨酸进行保护，不仅实现了5‑羟基色氨酸的高品质制备，同时还可以将发酵液中的主要杂质色氨酸进行分离纯化，得到高附加值的副产物；利用本发明的方法进行生产，工艺连续性强，主产品收率高，纯度好(纯度均＞99％，透光率均＞99％)，同时副产物纯度也可以达到99％以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种从发酵液中分离纯化5-羟基色氨酸的方法，属于5-羟基色氨酸制备技术领域。
背景技术
5-羟基色氨酸(5-hydroxytryptophan,5-HTP)，是一种氨基酸类物质，分子式为C11H12N2O3，分子量为220.23。5-羟基色氨酸在人体内可作为5-羟色胺(血清素,5-HT)的前体物质(继而作为褪黑素的前体物质)。一些研究表明5-HTP能够提高脑部血清素的浓度，改善忧郁症及促进褪黑素的形成、改善睡眠品质，并抑制食欲，但这些研究尚存在问题。因此，仍需要更多的研究来确认5-羟基色氨酸是否有这些生理作用。
目前5-羟基色氨酸的制备方法主要有植物提取法、化学合成法和发酵法，其中大规模生产制备5-羟基色氨酸基本上都是采用植物提取法从加纳籽中提取。但是，由于加纳籽的原材料主要来自于加纳、科特迪瓦和多哥等西非国家，所以植物提取法成本和工艺受原材料的影响非常大，这样严重限制了5-羟基色氨酸的大规模工业化生产。然而，化学合成法的合成工艺复杂，收率低，成本非常高，故而也不适宜大规模生产。发酵法相比于植物提取法不会受到原材料的限制，另外，相比于化学合成法其工艺路线更加简单，生产周期更加简短，成本更加低，所以发酵法制备5-羟基色氨酸与植物提取法和化学合成法相比会有其天然的优势。
现阶段，虽然发酵法制备5-羟基色氨酸的研究一直是国内外许多分子实验室的重点研究课题，但是目前5-羟基色氨酸的发酵水平还是比较低，对其产业化推进造成了很大的影响，分析其原因主要有两点，一方面是由于5-羟基色氨酸的前体色氨酸向5-羟基色氨酸转化率偏低，导致5-羟基色氨酸的发酵收率和含量偏低，且原料利用率差；另一方面是发酵体系中残留的色氨酸含量偏高，会对后续分离纯化产生不利的影响，色氨酸与5-羟基色氨酸的分离问题又凸显出来。
CN113563251A披露了一种从大肠杆菌发酵液中分离提取5-羟基色氨酸的方法，该方法的提取步骤包括发酵获得发酵液、菌体分离、色素分离、副产物分离、蛋白分离、干燥获得产品，收率可达55％，纯度可达99％。但是，该方法还存在两个方面的问题：一方面，5-羟基色氨酸的性质非常不稳定，在碱性条件下易氧化变黑，而该专利中多处使用了碱水进行洗脱，这样会对5-羟基色氨酸的成品外观产生影响，也应该也是为什么改专利中未提及产品外观和水溶液折光等方面信息的原因；另一方面，该专利中采用强酸性阳离子交换树脂对5-羟基色氨酸和色氨酸进行初步分离，此方法不能很好地分离色氨酸与5-HTP，最后还需要用甲酸对5-羟基色氨酸干粉进行再次处理，所以该工艺制备的5-羟基色氨酸纯度不稳定，收率不高，且无法实现对色氨酸的回收利用。
发明内容
[技术问题]
发酵法制备5-羟基色氨酸时，发酵体系中残留的色氨酸含量偏高，对5-羟基色氨酸的分离纯化带来了困难，并导致5-羟基色氨酸的收率低。
[技术方案]
本发明提供一种低成本、高效益的从发酵液中分离纯化5-羟基色氨酸的方法，所述的发酵液是以能够合成5-羟基色氨酸的重组大肠杆菌为发酵菌株，以葡萄糖、甘油和微量元素为底物进行发酵的，发酵液中的主要成分有5-羟基色氨酸、色氨酸、杂氨基酸(微量)、色素、糖份、盐份、蛋白质、多肽和菌体细胞；所述方法包括以下步骤：
1)微滤：将5-羟基色氨酸的发酵液pH调至2.5～3.5，然后使用陶瓷膜进行过滤，收集微滤清液；
2)超滤：将收集的微滤清液使用超滤膜进行超滤，收集超滤清液；
3)吸附层析：将收集的超滤清液用吸附层析柱进行吸附层析，上样流速0.5BV/h～2BV/h，优选1BV/h，上样完成后，用纯水或乙醇水溶液进行洗脱，洗脱流速1BV/h，用液相方法检测跟踪洗脱液中产品含量变化，洗脱液分段收集，其中，洗脱液①主要是高糖和高盐的杂质组分，洗脱液②主要是5-羟基色氨酸组分，洗脱液③主要是5-羟基色氨酸与色氨酸混合组分，洗脱液④主要是色氨酸组分；
4)离交1#：将收集的洗脱液②采用离交1#树脂柱进行吸附除杂，杂质吸附在树脂上，收集出料液；
5)脱色1#：将收集的离交1#柱的出料液采用活性炭脱色；
6)浓缩结晶1#：将脱色1#的脱色液进行减压蒸发浓缩，浓缩至体系中有少量白色沉淀生成为止，降温结晶5h，离心得到5-羟基色氨酸湿品；
7)离交2#：将收集的洗脱液④采用离交2#树脂柱进行吸附除杂，杂质吸附在树脂上收集出料液；
8)脱色2#：将收集的离交2#柱出料液采用活性炭脱色；
9)浓缩结晶2#：将脱色2#的脱色液进行减压蒸发浓缩，浓缩至体系中有少量白色沉淀生成为止，降温结晶5h，离心得到色氨酸湿品；
10)干燥：将步骤(6)和步骤(9)中得到的5-羟基色氨酸和色氨酸湿品分别进行真空干燥，分别得到5-羟基色氨酸和色氨酸纯品。
在本发明的某些实施方式中，所述能够合成5-羟基色氨酸的重组大肠杆菌是表达了原核微生物来源的苯丙氨酸4-羟化酶(P4H)的重组大肠杆菌，能够将色氨酸转化为5-羟基色氨酸。
在本发明的某些实施方式中，所述步骤1)选用硫酸或盐酸来调节pH。
在本发明的某些实施方式中，步骤1)使用陶瓷膜进行过滤以便除去菌渣、大分子蛋白、变性蛋白以及其它大分子的培养基成分。
在本发明的某些实施方式中，所述步骤1)中发酵液调pH前需要添加0.1％～0.5％的抗氧化剂，所述抗氧化剂可选亚硫酸钠、焦亚硫酸钠和VC等，进一步优选亚硫酸钠。
在本发明的某些实施方式中，所述步骤2)中使用超滤膜以除去小分可溶性蛋白、部分色素以及可溶性培养基成分，所用的超滤膜截留分子量在1KD～10KD，进一步优选3KD。
在本发明的某些实施方式中，所述步骤3)中吸附层析柱所用的树脂可以选用大孔吸附树脂，也可以选用弱碱阴离子交换树脂，大孔树脂可以是非极性大孔树脂、弱极性大孔树脂和极性大孔树脂，进一步优选非极性大孔树脂，弱碱阴离子交换树脂型号可以是D301、D201和335，进一步优选335型树脂。
在本发明的某些实施方式中，所述步骤3)中所述洗脱液可以是纯水或乙醇水溶液。
在本发明的某些实施方式中，所述步骤3)中吸附层析柱洗脱出料液采用分段收集，用HPLC对洗脱液中5-羟基色氨酸和色氨酸的含量进行检测，洗脱液①中不含有色氨酸，5-羟基色氨酸含量＜0.2g/L，洗脱液②中5-羟基色氨酸含量＞2g/L，色氨酸含量＜0.2g/L，洗脱液③中5-羟基色氨酸含量＜1g/L，色氨酸含量＜1g/L，洗脱液④中5-羟基色氨酸含量＜0.2g/L，色氨酸含量＞2g/L，其中，洗脱液①直接排入污水系统，洗脱液②进入离交1#柱继续纯化处理，洗脱液③返套泵入步骤2)的超滤液出料罐中与下一批次超滤出料液合并再次进行吸附层析，洗脱液④进入离交2#柱继续纯化处理。
在本发明的某些实施方式中，所述步骤4)和步骤7)中离交1#柱和离交2#柱均是采用弱酸阳离子交换树脂，可选型号包括：D110、D113、D151。离交1#柱用于除去5-羟基色氨酸层析组分中残留的小分子培养基成分、盐分和色素。离交2#柱用于除去色氨酸层析组分中残留的小分子培养基成分、盐分和色素。
在本发明的某些实施方式中，所述步骤5)和步骤8)中脱色1#与脱色2#均是采用相同型号的药用针剂活性炭进行脱色，活性炭的用量均为0.1％～0.5％，脱色时间为0.2-1.5h，脱色温度为20-70℃。
在本发明的某些实施方式中，所述步骤6)和步骤9)中浓缩结晶1#与浓缩结晶2#，均是采用减压真空浓缩，浓缩温度均＜70℃，且浓缩前均需要用少量稀NaOH水溶液调节料液pH≈6，浓缩终点均是以目测少量固体析出为止。
在本发明的某些实施方式中，所述步骤10)中干燥均是采用减压真空干燥，干燥温度均＜70℃，干燥时间＞5h。
[有益效果]
本发明的优势在于：依据5-羟基色氨酸与色氨酸结构和性质的微弱差异，利用层析分离的原理，实现了对5-羟基色氨酸发酵液的分离纯化，纯化过程中不仅制备了高纯度的5-羟基色氨酸，同时还得到了高附加值的色氨酸纯品，将发酵法制备5-羟基色氨酸工艺的原料利用率提升一倍以上，本发明的纯化工艺路线简单，成本低，设备投资小，产品收率高，成功地解决了5-羟基色氨酸发酵液纯化过程中遇到的主含量低、副产物多、成分复杂、分离纯化难度高和效益差等问题。
附图说明
图1.从发酵液中分离纯化5-羟基色氨酸的工艺流程框图。
具体实施方式
下述实施例所采用的检测5-羟基色氨酸和色氨酸的方法是：采用HPLC同时对5-羟基色氨酸和色氨酸进行检测，HPLC所用色谱柱为InfinityLab Poroshell HPH-C18 4.6*150mm，流动相75％水+25％甲醇，流速1ml/min，上样量10uL，检测波长254nm，配样浓度0.1g/L，柱温30℃，时间15min，其中，5-羟基色氨酸出峰时间4min，色氨酸出峰时间7.5min。
下述实施例所采用的培养重组大肠杆菌发酵生产5-羟基色氨酸得到发酵液的培养方法是：以表达了原核微生物来源的苯丙氨酸4-羟化酶(P4H)的重组大肠杆菌为菌株(例如：Yuheng Lin etal.,Engineering Bacterial Phenylalanine 4-Hydroxylase forMicrobial Synthesis of Human Neurotransmitter Precursor 5-Hydroxytryptophan,ACS Synth.Biol.,Just Accepted Manuscript·Publication Date(Web):17Jun 2014,Downloaded from http://pubs.acs.org on June 24,2014)，在LB固体培养基上划线活化，LB固体培养基成分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，琼脂糖20g/L；将固体平板上的单菌落挑至LB液体培养基中(液体培养基与固体培养基成分相同)，经两次活化后，接种至种子罐，进行种子罐培养，其中，种子罐培养基为：葡萄糖15g/L，酵母粉10g/L，柠檬酸0.5g/L，Vc 0.2mg/L，Vb1 0.4mg/L，VH 0.3mg/L，KH2PO4 5g/L，(NH4)2SO4 5g/L，FeSO4·7H2O15mg/L，MnSO4·7H2O 5mg/L，消泡剂0.5g/L，用氨酸调pH至6.8-7.0；当种子罐OD600≥15时接发酵罐，发酵培养基为改良型M9培养基，含10g l-1葡萄糖、6g l-1Na2HPO4、0.5g l-1NaCl、3gl-1KH2PO4、1g l-1NH4Cl、246.5mg l-1MgSO4·7H2O、14.7mg l-1CaCl2·2H2O、27.8mg l- 1FeSO4·7H2O、2g l-1酵母膏和2g l-1二水合柠檬酸钠(必要时添加抗生素)；接种量15％，连续流加40％(W/V)葡萄糖培养，当OD600≥25时，连续补加0.5g/L IPTG、40g/L(V/V)甘油和40％(W/V)葡萄糖，发酵50h得到5-羟基色氨酸发酵液。
下述实施例所述水溶液透光率是通过紫外分光光度计进行检测，先将产品溶于水配制成0.1mol/L水溶液，以1cm宽度的比色皿，检测550nm条件下的透光率。
实施例1
以上述培养方法，在50L发酵罐中发酵50h得到35L 5-羟基色氨酸发酵液，然后依照下列步骤进行纯化提取：
(1)微滤：5-羟基色氨酸发酵完毕后转移至调酸罐，先加入少量抗氧化剂亚硫酸钠，其含量占5-羟基色氨酸含量的0.3％，再用浓缩硫酸将发酵液pH调至2.5～3.5，室温静置30～60min后泵入陶瓷膜中微滤，收集滤清液。
(2)超滤：将陶瓷膜滤清液泵入超滤膜(截留分子量3KD)循环罐中，开启设备收集滤清液，期间缓慢加入少量纯水保证膜通量一直维持在初始通量的50％以上，当出料液中5-羟基色氨酸浓度＜0.2g/L后，停止超滤，将超滤膜滤清液转移至吸附层析的原料罐。
(3)吸附层析：吸附层析柱装填2L 335型弱碱阴离子交换树脂，以1BV/h流速持续进料，发酵液中5-羟基色氨酸和色氨酸，以及少量其它杂质会吸附在树脂上，发酵液中的糖分和盐分会流出树脂柱，收集出料液转入洗脱液①储罐，当出料液中5-羟基色氨酸含量＞0.2％时，停止上样，先用纯水洗去柱中残留的糖分和盐分，然后用纯水洗脱，洗脱流速1BV/h，当洗脱液中5-羟基色氨酸含量＞0.2％时，切换阀门，将洗脱出料液收集转入洗脱液②储罐，当洗脱液中检测出色氨酸，并且色氨酸含量＞0.2％时，切换阀门，将洗脱出料液收集转入洗脱液③储罐，当洗脱液中检测出5-羟基色氨酸含量＜0.2％时，再次切换阀门，将洗脱出料液收集转入洗脱液④储罐。其中，洗脱液①是高盐和高糖废水；洗脱液②中主要物质是5-羟基色氨酸；洗脱液③是过渡组分，主要成分是5-羟基色氨酸和色氨酸，所以将洗脱液③用于超滤膜顶料；洗脱液④中主要物质是色氨酸。
(4)离交1#：将洗脱液②储罐中的料液泵入离交1#柱，进行离交除杂，离交1#柱装填D110树脂，过柱流速1BV/h，当出料液中检测有5-羟基色氨酸流出时，开始收集洗脱液，上样完成后继续用纯水洗脱树脂，当出料液中检测5-羟基色氨酸含量＜0.2g/L时，停止洗脱，将收集的料液泵入脱色1#罐中；
(5)脱色1#：加入适量药用针剂炭(约占5-羟基色氨酸含量的0.5％)进行脱色，脱色后用脱碳器脱碳，将脱碳后的料液泵入结晶釜；
(6)浓缩结晶1#：先加入少量0.1mol/L NaOH溶液调解脱色液pH≈6，再进行减蒸浓缩，当结晶釜内发现有少量晶体析出时，停止蒸发，破真空，缓慢降温结晶，降温到10℃保温5h，卸料离心，将湿滤饼进行真空干燥，干燥时间10h，温度50℃，最终得到5-羟基色氨酸纯粉，纯度＞99％，收率＞88％。
(7)离交2#：将洗脱液④储罐中的料液泵入先泵入蒸发浓缩釜中进行浓缩，当色氨酸含量＞5g/L后，再泵入离交2#柱，进行离交除杂，离交2#柱装填D110树脂，过柱流速1BV/h，当出料液中检测有色氨酸流出时，开始收集洗脱液，上样完成后继续用纯水洗脱树脂，当出料液中检测色氨酸含量＜0.2g/L时，停止洗脱，将收集的料液泵入脱色2#罐中；
(8)脱色2#：向脱色2#罐中加入适量药用针剂炭(约占色氨酸含量的0.5％)进行脱色，脱色后用脱碳器脱碳，将脱碳后的料液泵入结晶釜；
(9)浓缩结晶2#：先加入少量0.1mol/L NaOH溶液调解脱色液pH≈6，再进行减蒸浓缩，当结晶釜内发现有少量晶体析出时，停止蒸发，破真空，缓慢降温结晶，降温到10℃保温5h，卸料离心，将湿滤饼进行真空干燥，干燥时间8h，温度60℃，最终得到色氨酸纯粉，纯度＞99％，收率＞85％。
实施例2
按照上述培养方法，在50L发酵罐中发酵50h得到35L发酵液，将这35L发酵液平均分成7份，以实施例1中所述方法对上述5-羟基色氨酸的发酵液进行分离纯化得到纯品5-羟基色氨酸和色氨酸，然后分别取样配制成1g/L的水溶液，用紫外分光光度法检测在550nm条件下的透光率，但，与实施例1的分离纯化方法的区别在于，步骤(1)微滤时，将0.3％的亚硫酸钠分别替换为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％的焦亚硫酸钠，0.4％的亚硫酸钠，0.4％的Vc或空白(不加)。
结果如表1和表2所示：
表1.保护剂品种和加入量对5-羟基色氨酸产品外观和纯度的影响
表2.保护剂品种和加入量对色氨酸产品外观和纯度的影响
实施例3
按照上述培养方法，在50L发酵罐中发酵50h得到35L发酵液，将这35L发酵液按照实施例1中所述方法对5-羟基色氨酸和色氨酸分离纯化，但，与实施例1分离纯化方法的区别在于，①步骤(1)的加入抗氧化剂是0.4％焦亚硫酸钠；②在步骤(5)、步骤(8)的5-羟基色氨酸和色氨酸的脱色工艺前将离交得到的料液平均分成5份，脱色时间20min，温度40℃，活性炭加入量分别为0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％。分别对脱色前、后料液单步损失率进行计算，以脱色前料液体积V0，脱色前主物料成分浓度C0，脱色后料液体积V1，脱色后主物料成分浓度C1，则脱色工艺的单步损失率S％＝(V0*C0-V1*C1)/V0*C0*100％。将纯化得到的5-羟基色氨酸和色氨酸产品分别取样配制成1g/L的水溶液，用紫外分光光度法检测在550nm条件下的透光率。以产品水溶液透光率、产品纯度和脱色单步损失率为指标，结果如表3和表4所示：
表3.活性炭加入量对5-羟基色氨酸产品外观、纯度和物料损失率的影响
表4.活性炭加入量对色氨酸产品外观、纯度和物料损失率的影响
实施例4例
按照上述培养方法，在50L发酵罐中发酵50h得到35L发酵液，将这35L发酵液按照实施例1中所述方法对5-羟基色氨酸和色氨酸分离纯化，但，与实施例1分离纯化方法的区别在于，①步骤(1)的加入抗氧化剂是0.4％焦亚硫酸钠；②在步骤(3)中的吸附层析前将超滤出料液分成5份，再准备5个相同的层析柱，分别填入等量的以下五种型号的树脂：D335、D301、D201、XDA-8G和AB-8，树脂加入量均了为2L，上样流速和洗脱流速均为1BV/h，吸附完成后用纯水洗脱，洗脱液分段收集，用液相方法检测各个组分中5-羟基色氨酸(5-HTP)和色氨酸(L-TP)的含量，用电导率仪检测各个组分料液的电导率值。结果如下列表5所示：
表5
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (7)
1.一种从发酵液中分离纯化5-羟基色氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1）微滤：将5-羟基色氨酸的发酵液pH调至2.5~3.5，然后使用陶瓷膜进行过滤，收集微滤清液，发酵液调pH前需要添加0.1%~0.5%的抗氧化剂，所述抗氧化剂选自：亚硫酸钠、焦亚硫酸钠或VC；
2）超滤：将收集的微滤清液使用超滤膜进行超滤，收集超滤清液；
3）吸附层析：将收集的超滤清液用吸附层析柱进行吸附层析，用纯水进行洗脱，洗脱液分段收集，具体如下：以1BV/h流速持续进料，收集出料液转入洗脱液①储罐，当出料液中5-羟基色氨酸含量＞0.2%时，停止上样，先用纯水洗去柱中残留的糖分和盐分，然后用纯水洗脱，洗脱流速1BV/h，当洗脱液中5-羟基色氨酸含量＞0.2%时，切换阀门，将洗脱出料液收集转入洗脱液②储罐，当洗脱液中检测出色氨酸，并且色氨酸含量＞0.2%时，切换阀门，将洗脱出料液收集转入洗脱液③储罐，当洗脱液中检测出5-羟基色氨酸含量＜0.2%时，再次切换阀门，将洗脱出料液收集转入洗脱液④储罐，其中，洗脱液①是高糖和高盐的杂质组分，洗脱液②是5-羟基色氨酸组分，洗脱液③是5-羟基色氨酸与色氨酸混合组分，洗脱液④是色氨酸组分，吸附层析柱所用的树脂是弱碱阴离子交换树脂；所述弱碱阴离子交换树脂型号是D335；
4）离交1#：将收集的洗脱液②采用离交1#树脂柱进行吸附除杂，杂质吸附在树脂上，收集出料液；
5）脱色1#：将收集的离交1#柱的出料液采用活性炭脱色；
6）浓缩结晶1#：将脱色1#的脱色液进行减压蒸发浓缩，浓缩至体系中有少量白色沉淀生成为止，降温结晶，离心得到5-羟基色氨酸湿品；
7）离交2#：将收集的洗脱液④采用离交2#树脂柱进行吸附除杂，杂质吸附在树脂上收集出料液；
8）脱色2#：将收集的离交2#柱出料液采用活性炭脱色；
9）浓缩结晶2#：将脱色2#的脱色液进行减压蒸发浓缩，浓缩至体系中有少量白色沉淀生成为止，降温结晶，离心得到色氨酸湿品；
10）干燥：将步骤（6）和步骤（9）中得到的5-羟基色氨酸和色氨酸湿品分别进行干燥，分别得到5-羟基色氨酸和色氨酸纯品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵液是以能够合成5-羟基色氨酸的重组大肠杆菌为菌株发酵所得。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中使用超滤膜截留分子量是1KD~10 KD。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4）和步骤7）中离交1#柱和离交2#柱均是采用弱酸阳离子交换树脂，型号包括：D110、D113或D151。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5）和步骤8）中脱色1#与脱色2#均是采用相同型号的药用针剂活性炭进行脱色，活性炭的用量均为0.1%~0.5%，脱色时间为0.2-1.5h，脱色温度为20 - 70℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤6）和步骤9）中浓缩结晶1#与浓缩结晶2#，均是采用减压真空浓缩，浓缩温度均＜70℃，且浓缩前均需要用少量稀NaOH水溶液调节料液pH≈6，浓缩终点均是以目测少量固体析出为止。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤10）中干燥均是采用减压真空干燥，干燥温度均＜70℃，干燥时间＞5h。
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| GR01 | Patent grant | ||
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