CN115444865A - 一种转化熊胆粉底物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药技术领域，公开了一种转化熊胆粉底物及其制备方法。该制备方法包括以下步骤：(1)采用蛋白酶对禽胆胆汁进行酶解，得到粗膏1；(2)对所述粗膏1进行醇沉、萃取，得到粗膏2；(3)以十八烷基硅烷键合硅胶作为层析柱的填充剂，以乙腈水溶液为流动相，采用柱层析技术对所述粗膏2进行洗脱后，将目的溶液浓缩干燥，制得转化熊胆粉底物。采用该制备方法能够在有效去除牛磺胆酸的同时，又能实现对牛磺鹅去氧胆酸和其他营养成分的保留，从而制得高品质的转化熊胆粉底物。
Description
技术领域
本发明属于中药技术领域，尤其涉及一种转化熊胆粉底物及其制备方法。
背景技术
熊胆粉是一种由熊科动物黑熊或棕熊干燥胆囊胆汁得到的名贵中药材，有2000余年的入药历史，大量处方中都含有熊胆成分。已知熊胆粉具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶胆石等作用，是保肝护胆的良药。各种现代临床实践应用也表明，熊胆能够治疗多种肝胆疾病。由于野生熊资源有限，现在普遍使用人工养殖“引流取胆”的方法生产熊胆粉(即天然熊胆粉)。目前，我国每年的天然熊胆粉产量仅约为30吨，已无法满足人们日益增长的健康需求。
为了解决天然熊胆粉短缺的问题，通常以其他动物胆为原料，经除杂和化学/生物转化得到与天然熊胆粉整体成份类似的转化熊胆粉。已知在天然熊胆粉中牛磺胆酸(TCA)的含量较低，且TCA的毒性较大，对心脏、中枢神经系统有抑制作用，因此在制备转化熊胆粉底物的过程中需要对TCA进行除杂。然而，现有的除杂和提纯方法仅能除去部分非胆汁酸类杂质，而牛磺胆酸(TCA)与牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)理化性质极为接近导致二者很难分离，牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)又能通过化学或生物方法部分转化为天然熊胆粉中的关键成分-牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)。
因此，本领域希望开发得到一种在去除牛磺胆酸(TCA)的同时又能保留牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)和其他营养物质的方法，从而制得高质量的转化熊胆粉底物，为制备转化熊胆粉产品提供高品质的原料。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种转化熊胆粉底物及其制备方法，采用该制备方法能够在有效去除牛磺胆酸(TCA)的同时，又能实现对牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)和其他营养成分的保留，从而制得高品质的转化熊胆粉底物。
本发明提供一种转化熊胆粉底物的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用蛋白酶对禽胆胆汁进行酶解，得到粗膏1；
(2)对所述粗膏1进行醇沉、萃取，得到粗膏2；
(3)以十八烷基硅烷键合硅胶作为层析柱的填充剂，以乙腈水溶液为流动相，采用柱层析技术对所述粗膏2进行洗脱后，将目的溶液浓缩干燥，制得转化熊胆粉底物。
本发明将胆汁中的蛋白质进行酶解使脂蛋白复合体中的脂肪释放出来，便于后面的萃取；而醇提可以去除蛋白酶、大分子肽类以及不溶于醇的无机盐等杂质。选取十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，并乙腈水溶液作为流动相进行洗脱，可快速有效分离原料中的TCA，实现了TCA的去除，并保留TCDCA和胆汁中的其他营养物质，使原料的成份与天然熊胆粉更为近似，更有利于后续制备高品质转化熊胆粉。
优选地，步骤(1)中所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。
优选地，步骤(1)中所述酶解的温度为50-60℃，pH＝6.0-7.0，酶量为0.01-0.02％。酶量的含义为蛋白酶占禽胆胆汁的质量分数。
优选地，步骤(2)中采用乙醇进行所述醇沉。
优选地，步骤(2)中所述醇沉的温度为5-15℃。
优选地，步骤(2)中所述醇沉的时间为≥4h。
优选地，步骤(2)中采用正己烷进行所述萃取，所述萃取的次数≥3次。
优选地，步骤(3)中所述层析柱的上样量为12-18％。所述上样量为粗膏2与填充剂的质量比值。
优选地，步骤(3)中所述洗脱的步骤为：
S1、在粗膏2中加入乙腈并上样至层析柱中，得到流穿液；
S2、再以23-25％乙腈水溶液进行洗脱，得到洗脱液1；
S3、再以80-90％乙腈水溶液进行洗脱，得到洗脱液2；
S4、合并流穿液和洗脱液2，即为目的溶液。
本发明还提供了一种转化熊胆粉底物，由上述制备方法所制得。所述转化熊胆粉底物中TCDCA的质量含量≥60％，TCA的质量含量≤1％。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明的制备方法不仅可有效去除蛋白和脂肪杂质，还可以在去除TCA的同时最大程度保留了TCDCA和胆汁中的其他营养物质，使其成份与天然熊胆粉更为近似，更有利于后续制备高品质转化熊胆粉。该方法快速便捷，节省时间，便于操作；且流动相成份简单，仅含有乙腈一种化学试剂，可实现重复回收利用。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
一、转化熊胆粉底物的粗制方法
实施例1提供一种转化熊胆粉底物的粗制方法，包括以下步骤：
(1)取1kg冷冻禽胆放置室温解冻，破胆取胆汁，经减压浓缩，得到约200g胆汁(原始胆汁)；
(2)在所得胆汁中加入质量分数为0.015％的木瓜蛋白酶，调节pH至6.5，温度55℃，酶解2h，得到粗膏1；
(3)在粗膏1加入95％乙醇至乙醇终浓度为75％，以10℃醇沉4h以上；醇沉液通过0.45μm孔径的过滤器过滤，收集滤液减压浓缩至无醇味，加入等体积的正己烷，萃取三次，收集水相，减压浓缩，得到粗膏2。
实施例2-13、对比例1-6中转化熊胆粉底物的粗制方法与实施例1基本相同，区别之处在于各参数的选择，具体参数选择如表1所示。
表1实施例2-13、对比例1-6的参数选择
将实施例1-13、对比例1-6所制得的粗膏2和原始胆汁进行脂质、TCDCA和TCA含量测试，测试结果如表2所示。
表2实施例1-13、对比例1-6与原始胆汁的含量测定结果
由表2可知，在pH＝6.0-7.0，温度50-60℃，酶量0.01-0.02％的条件下酶解蛋白，均可水解脂蛋白复合体，后续除脂效果相当，利于后续的柱层析。当酶量过低时，酶解效果不佳，后续除脂效果差，而酶量增大至0.02％除脂效果与0.01％相当未见明显提升。且同等酶量条件下，酶解0.5h时难以酶解完全，酶解1h与4h效果近似。当醇沉温度过高、时间过短时，沉淀与清液成混悬状难以分离；当醇沉温度为5-15℃，醇沉时间4-8h时，所产生的醇沉效果相当。萃取3次和4次除脂效果相当，但萃取2次时除脂不完全，仍有大量脂肪残留，因此萃取次数应不小于3次。
二、转化熊胆粉底物的精制方法
实施例14提供一种转化熊胆粉底物的精制方法，包括以下步骤：
S1、以实施例1所制得的粗膏2为原料，在粗膏2中加入乙腈至乙腈终浓度为10％，将其上样至C18柱中(填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，柱长13.5cm，内径1.5cm)，上样量为15％(即粗膏2与填充剂的质量比值为15％)，流速为3mL/分钟，收集流穿液；
S2、再以23％乙腈水溶液(即乙腈与水的体积比为23:77)为流动相，洗脱1个柱体积，收集洗脱液1(经检测，洗脱液1中含有TCA且基本不含TCDCA)；
S3、再以80％乙腈水溶液(即乙腈与水的体积比为80:20)为流动相，洗脱2个柱体积，收集洗脱液2；
S4、合并流穿液和洗脱液2，经减压浓缩、真空干燥，制得转化熊胆粉底物。
实施例15-17、对比例7-10中转化熊胆粉底物的精制方法与实施例14基本相同，区别之处在于各参数的选择，具体参数选择如表3所示。
表3实施例15-17、对比例7-10的参数选择
对比例11
对比例11提供一种转化熊胆粉底物的精制方法，包括以下步骤：
以实施例1所制得的粗膏2为原料，上样至硅胶G柱(填充剂为硅胶G，柱长12cm，内径1.2cm)中，上样量为15％，用体积比为3：1：2的氯仿、异丙醇和乙醇作为流动相进行洗脱，流速为0.4mL/分钟，收集460nm处有吸收值的液体，浓缩干燥成粉。
对比例12
以实施例1所制得的粗膏2为原料，上样至硅胶G柱(填充剂为硅胶G，柱长3.5cm，内径2.2cm)中，上样量为15％，流速为3mL/分钟。先用体积比为80：20：1的乙酸乙酯、甲醇和甲酸作为流动相进行洗脱，收集20mL洗脱液作为12-1；再用体积比为75：25：1的乙酸乙酯、甲醇和甲酸作为流动相进行洗脱，收集40mL洗脱液作为12-2。将洗脱液12-1和洗脱液12-2分别浓缩干燥成粉。
将实施例14-17、对比例7-12所制得的产品和天然熊胆粉进行成分含量的测试，测试结果如表4所示(其余未列出成分主要为无机盐和水)。
表4实施例14-17、对比7-12的含量测定结果
由表4可知，当上样量为12-18％时，均可将TCDCA和TCA分离，但随着上样量变大其分离效果越差，TCDCA的回收率下降，上样量为25％时，二者难以分离，上样量小会导致上样次数增加。步骤S3选用60％乙腈水溶液进行洗脱时，可以分离TCA和TCDCA并回收TCDCA，但其他非胆汁成份结合在柱上未能完全洗脱，既影响最终产物中非胆汁成分的含量也影响连续纯化和柱效，选用90％乙腈水溶液进行洗脱，纯度与回收率与80％相当，说明80％乙腈已实现完全洗脱；步骤S2选用20％乙腈水溶液进行洗脱，乙腈浓度低不能有效分离去除TCA，导致最终产物的TCA含量较高；选用28％乙腈水溶液进行洗脱，乙腈浓度偏高，部分TCDCA会随着TCA一起去除，导致TCDCA回收率偏低。当采用对比例11和对比例12的方法进行纯化时，虽然收集液中TCDCA的含量较高，但TCA并未得到有效分离，且其他非胆汁成份含量偏低，仅适合制备纯品化合物，并不适合制备转化熊胆粉的底物。
上面对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种转化熊胆粉底物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用蛋白酶对禽胆胆汁进行酶解，得到粗膏1；
(2)对所述粗膏1进行醇沉、萃取，得到粗膏2；
(3)以十八烷基硅烷键合硅胶作为层析柱的填充剂，以乙腈水溶液为流动相，采用柱层析技术对所述粗膏2进行洗脱后，将目的溶液浓缩干燥，制得转化熊胆粉底物。
2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。
3.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述酶解的温度为50-60℃，pH＝6.0-7.0，酶量为0.01-0.02％。
4.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤(2)中采用乙醇进行所述醇沉。
5.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述醇沉的温度为5-15℃。
6.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述醇沉的时间为≥4h。
7.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤(2)中采用正己烷进行所述萃取，所述萃取的次数≥3次。
8.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述层析柱的上样量为12-18％。
9.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述洗脱的步骤为：
S1、在粗膏2中加入乙腈并上样至层析柱中，得到流穿液；
S2、再以23-25％乙腈水溶液进行洗脱，得到洗脱液1；
S3、再以80-90％乙腈水溶液进行洗脱，得到洗脱液2；
S4、合并流穿液和洗脱液2，即为目的溶液。
10.一种转化熊胆粉底物，其特征在于，由权利要求1-9中任一项所述的制备方法所制得。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210935046.7A CN115444865A (zh) | 2022-08-04 | 2022-08-04 | 一种转化熊胆粉底物及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210935046.7A CN115444865A (zh) | 2022-08-04 | 2022-08-04 | 一种转化熊胆粉底物及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115444865A true CN115444865A (zh) | 2022-12-09 |
Family
ID=84296581
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202210935046.7A Pending CN115444865A (zh) | 2022-08-04 | 2022-08-04 | 一种转化熊胆粉底物及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002064166A1 (en) * | 2001-02-13 | 2002-08-22 | Korea Institute Of Science And Technology | Formulation to enhance bioavailability of bioactive matrials and preparation method thereof |
| CN102911234A (zh) * | 2011-08-01 | 2013-02-06 | 天津科技大学 | 以鸡胆汁为原料生产鹅去氧胆酸 |
| CN112779175A (zh) * | 2021-02-10 | 2021-05-11 | 上海中医药大学 | 一种制备人工熊胆粉的工程酿酒酵母及方法 |
-
2022
- 2022-08-04 CN CN202210935046.7A patent/CN115444865A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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