CN104402895A - 一种高三尖杉酯碱的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物化学领域，具体公开了一种高三尖杉酯碱纯化方法。本发明所述纯化方法用流动相溶解高三尖杉酯碱粗品，以硅胶为固定相、以乙酸乙酯/正己烷/DIEA混合溶液为流动相进行柱层析，收集含有高三尖杉酯碱的层析液，浓缩为固体；将所述固体用乙酸乙酯溶解，然后加入正己烷或正庚烷混匀，静置析晶，抽滤，滤饼干燥后获得高三尖杉酯碱固体。本发明以普通硅胶替代反相柱层析中三氧化二铝为固定相，并以其为基础选择适宜的流动相，配合后续的经过优化搭配的有机溶剂重结晶，保证所纯化的高三尖杉酯碱的纯度大于99.5％，提高了重结晶收率至90～95％，同时简化了操作和降低了成本，利于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学领域，特别涉及高三尖杉酯碱的分离提纯方法。
背景技术
高三尖杉酯碱(Homoharringtonine，HHT)，又名高粗榧碱、后哈莫林通碱、高俣林通碱，分子式为C29H39NO9，为类白色或微黄色结晶性粉末或无定型疏松固体，其具有如式I所示结构：
高三尖杉酯碱是从我国特有三尖杉属植物海南粗榧中分离得到的有效抗癌药物，我国从七十年代起率先将其用于急性髓系白血病(AML)和慢性髓系白血病(CML)的临床治疗，疗效显著。高三尖杉酯碱是具有多种抗肿瘤功效的四骈环生物碱类药物，为周期特异性抗肿瘤药，对G1和G2期细胞杀伤作用最强，而对S期细胞作用较小，能使核糖体解聚，抑制蛋白质合成，使肿瘤细胞分裂指数减少，瘤组织核酸含量下降。目前，国内已批准临床应用，而且已于2012年获得FDA批准上市。海南粗榧的根、茎、叶和果实都含有高三尖杉酯碱，尤其树皮中高三尖杉酯碱含量较高，是生产此类抗癌药物的主要原料。但因其生长缓慢、繁殖困难以及过度采伐，资源越来越少，研究者已开始寻找新的来源提取高三尖杉酯碱或通过微生物发酵、化学合成等方法得到高三尖杉酯碱。
采用人工合成方法获取高三尖杉酯碱，价格昂贵，目前国内仍大多采用提取的方法获得高三尖杉酯碱。在提取高三尖杉酯碱的过程中，由于三尖杉酯碱等物质结构相近，分离比较困难。目前公开的纯化方法中，在采用柱层析、重结晶等方法的同时，大多结合了逆流分配法进行分离提纯。如美国专利申请US2004/0072790A1中公开的高三尖杉酯碱纯化方法，包括在提取得到粗三尖杉酯碱类化合物后，先通过乙醇/乙醚重结晶纯化，然后通过逆流分配法进一步纯化分离得到高三尖杉酯碱；如专利CA1261829A中，公开的提取分离过程，涉及用三氧化二铝做固定相，用氯仿，氯仿/甲醇梯度洗脱的柱层析，然后进一步用逆流色谱进行提纯得到高三尖杉酯碱。
目前所公开的柱层析方法中，大多采用了反相柱层析，用三氧化二铝作固定相、以氯仿/甲醇或者醇和磷酸盐缓冲溶液的混合水溶液为流动相进行分离，需要专门的仪器设备，成本较高，操作较为繁琐，不利于工业化生产，特别是以醇和磷酸盐缓冲溶液的混合水溶液为流动相时还需要控制pH值在合适的范围内。此外，在柱层析之后的重结晶步骤，现有的技术基本上以甲醇、甲醇/水、乙醚为重结晶溶剂，所得高三尖杉酯碱的重结晶收率最多到80％左右，收率较低。
发明内容
有鉴于此，本发明目的是提供一种操作简便、纯度高、重结晶收率高的高三尖杉酯碱纯化方法。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种高三尖杉酯碱纯化方法，包括：
步骤1、用流动相溶解高三尖杉酯碱粗品，以硅胶为固定相、以乙酸乙酯/正己烷/DIEA(N,N-二异丙基乙胺)混合溶液为流动相进行柱层析，收集含有高三尖杉酯碱的层析液，浓缩为固体；
步骤2、将所述固体用乙酸乙酯溶解，然后加入正己烷或正庚烷混匀，静置析晶，抽滤，滤饼干燥后获得高三尖杉酯碱固体。
针对当下以柱层析、重结晶纯化高三尖杉酯碱的纯化方法中存在的成本高、操作繁琐、重结晶收率低的缺陷，本发明调整了其中的纯化操作，实现高纯度的目的同时，使纯化方法更加简便、成本低廉，提高重结晶的收率。
其中，作为优选，本发明纯化方法还包括将步骤1浓缩后的固体重复步骤1的操作，具体如下：
用流动相溶解前次获得的所述固体，以硅胶为固定相、以乙酸乙酯/正己烷/DIEA混合溶液为流动相进行柱层析，收集含有高三尖杉酯碱的层析液，浓缩为固体。
更优选地，所述重复次数为1-2次。
作为优选，本发明纯化方法还包括将步骤2获得的高三尖杉酯碱固体重复步骤2的操作，如下：
前次获得的高三尖杉酯碱固体用乙酸乙酯溶解，然后加入正己烷或正庚烷混匀，静置析晶，抽滤，滤饼干燥后获得高三尖杉酯碱固体。
更优选地，所述重复次数为1-2次。
更优选地，所述析晶的温度为室温或0～5℃。
作为优选，在步骤1浓缩为固体后还包括将所述固体用甲醇溶解后再旋干为固体的步骤。在此优选方案中，本发明发现浓缩后的固体先用甲醇溶解，再旋干，有利于后续重结晶步骤的溶解，可以减少重结晶步骤乙酸乙酯的用量，提高收率。
作为优选，所述乙酸乙酯、正己烷、DIEA之间的体积比为1～6:1:0.001～0.010。更优选地，所述所述乙酸乙酯、正己烷、DIEA之间的体积比为4:1:0.005。
作为优选，所述高三尖杉酯碱粗品与硅胶的质量比为1～5:100。
作为优选，步骤2所述乙酸乙酯的用量为每克步骤1所述固体加入10～20mL乙酸乙酯。
作为优选，步骤2所述乙酸乙酯和正己烷的体积比或所述乙酸乙酯和正庚烷的体积比均为1:1～5。更优选地，所述乙酸乙酯和正己烷或正庚烷两者之间的体积比为1:4、1:3、1:2或1:1.1在本发明的一些实施例中，
作为优选，所述高三尖杉酯碱粗品的纯度大于10％。
作为优选，所述硅胶的目数为160-300目。
按照本发明所述纯化方法获得高三尖杉酯碱纯度大于99.5％，并且重结晶的收率高达90～95％。
由以上技术方案可知，本发明以普通硅胶替代反相柱层析中三氧化二铝为固定相，并以其为基础选择适宜的流动相，配合后续的经过优化搭配的有机溶剂重结晶，保证所纯化的高三尖杉酯碱的纯度大于99.5％，提高了重结晶收率至90～95％，同时简化了操作和降低了成本，利于工业化生产。
附图说明
图1是实施例1中第一次柱层析后的HPLC图谱；
图2是实施例1中第二次柱层析后的HPLC图谱；
图3是实施例1中第一次重结晶后的HPLC图谱；
图4是实施例1中第二次重结晶后的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种高三尖杉酯碱纯化方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的材料均为普通市售品，皆可于市场购得。
其中，具体实施方式中采用的高三尖杉酯碱粗品原料为纯度大于10％的高三尖杉酯碱粗品，在市售领域通常为15％～20％的高三尖杉酯碱粗品，可通过市场购买。
本发明中所述的DIEA为N,N-二异丙基乙胺。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：
将纯度约为11％的高三尖杉酯碱粗品15g用少量乙酸乙酯：正己烷：DIEA＝4:1:0.005的溶液溶解，加入到300g大小为300目的硅胶柱上，用乙酸乙酯：正己烷：DIEA＝4:1:0.005的溶液作流动相，进行柱层析分离，用薄层色谱或HPLC跟踪，收集含有高三尖杉酯碱的层析液，真空浓缩，得到纯度≥50％的固体，其HPLC图谱见图1。重复第一次柱层析的步骤，将第一次柱层析后的固体溶解后，用乙酸乙酯：正己烷：DIEA＝4:1:0.005的溶液作流动相，进行硅胶柱层析分离，收集含有高三尖杉酯碱的层析液，真空浓缩为固体，用甲醇溶解该固体后再旋干，得到纯度为90％的固体，其HPLC图谱见图2。
将两次柱层析后的固体1.4g，用30ml乙酸乙酯，室温搅拌溶解，加入120ml正己烷混合均匀，室温下静置析晶，抽滤，滤饼减压干燥得到高三尖杉酯碱固体，HPLC纯度≥99.0％，其HPLC图谱见图3。重复重结晶步骤，将第一次重结晶后的固体用乙酸乙酯溶解后，再加入正己烷，放置析晶，过滤，滤饼减压干燥得到高三尖杉酯碱1.2g，重结晶收率为95.2％左右(计算公式1.2/(1.4*90％))，HPLC检测纯度≥99.5％。HPLC检测图谱见图4。
对比例：
采用本实施例两次柱层析后的固体1.4g(未经甲醇溶解后旋干)，用15ml甲醇，室温搅拌溶解，加入40ml水混合均匀，室温静置析晶，抽滤，滤饼减压干燥，得到HPLC纯度≥97.8％的高三尖杉酯碱固体；将得到的重结晶后的高三尖杉酯碱固体重复此重结晶步骤，得到HPLC纯度≥99.3％的高三尖杉酯碱0.94g，重结晶收率为74.6％左右(计算公式0.94/(1.4*90％))。
实施例2：
将纯度约为15％的高三尖杉酯碱粗品15g用少量乙酸乙酯：正己烷：DIEA＝1:1:0.001的溶液溶解，加入到1200g大小为160目的硅胶柱上，用乙酸乙酯：正己烷：DIEA＝1:1:0.001的溶液作流动相，进行柱层析分离，用薄层色谱或HPLC跟踪，收集含有高三尖杉酯碱的层析液，真空浓缩，得到纯度≥52％的固体。重复第一次柱层析的步骤，将第一次柱层析后的固体溶解后，用乙酸乙酯：正己烷：DIEA＝1:1:0.001的溶液作流动相，进行硅胶柱层析分离，收集含有高三尖杉酯碱的层析液，真空浓缩为固体，用甲醇溶解后再旋干，得到纯度为91％的固体物质。
将两次柱层析后的固体2.2g，用37ml乙酸乙酯，室温搅拌溶解，加入111ml正己烷混合均匀，0-5℃静置析晶，抽滤，滤饼减压干燥得到高三尖杉酯碱固体。重复重结晶步骤，将第一次重结晶后的固体用乙酸乙酯溶解后，再加入正己烷，放置析晶，过滤，滤饼减压干燥得到高三尖杉酯碱1.85g，重结晶收率为92.4％左右(计算公式1.85/(2.2*91％))，HPLC检测纯度≥99.6％。
对比例：
采用本实施例两次柱层析后的固体2.2g(未经甲醇溶解后旋干)，用15ml乙醇，室温搅拌溶解，0-5℃静置析晶，抽滤，滤饼减压干燥，得到HPLC纯度≥98.2％的高三尖杉酯碱固体；将重结晶后的高三尖杉酯碱固体用少量乙醚溶解，室温放置重结晶，得到HPLC纯度≥99.2％的高三尖杉酯碱1.4g，重结晶收率为69.9％(计算公式1.4/(2.2*91％))。
实施例3：
将纯度约为20％的高三尖杉酯碱粗品15g用少量乙酸乙酯：正己烷：DIEA＝3:1:0.01的溶液溶解，加入到600g大小为200目的硅胶柱上，用乙酸乙酯：正己烷：DIEA＝3:1:0.01的溶液作流动相，进行柱层析分离，用薄层色谱或HPLC跟踪，收集含有高三尖杉酯碱的层析液，真空浓缩，得到纯度≥55％的固体。重复第一次柱层析的步骤，将第一次柱层析后的固体溶解后，用乙酸乙酯：正己烷：DIEA＝3:1:0.01的溶液作流动相，进行硅胶柱层析分离，收集含有高三尖杉酯碱的层析液，真空浓缩为固体，用甲醇溶解后再旋干，得到纯度为93％的固体物质。
将两次柱层析后的固体2.9g，用33ml乙酸乙酯，加热条件下搅拌溶解，加入66ml正庚烷混合均匀，0～5℃条件下静置析晶，抽滤，滤饼减压干燥得到高三尖杉酯碱固体。重复重结晶步骤，将第一次重结晶后的固体用乙酸乙酯溶解后，再加入正庚烷，放置析晶，过滤，滤饼减压干燥得到高三尖杉酯碱2.45g，重结晶收率为90.8％左右(计算公式2.45/(2.9*93％))，HPLC检测纯度≥99.65％。
对比例：
采用本实施例两次柱层析后的固体2.9g(未经甲醇溶解后旋干)，用25ml甲醇，室温搅拌溶解，0～5℃静置析晶，抽滤，滤饼减压干燥，得到HPLC纯度≥98.7％的高三尖杉酯碱固体；将重结晶后的高三尖杉酯碱固体重复此重结晶步骤，得到HPLC纯度≥99.4％的高三尖杉酯碱1.95g，重结晶收率为72.3％(计算公式1.95/(2.9*93％))。
实施例4：
将纯度约为45％的高三尖杉酯碱粗品15g用少量乙酸乙酯：正己烷：DIEA＝4:1:0.005的溶液溶解，加入到900g大小为200目的硅胶柱上，用乙酸乙酯：正己烷：DIEA＝4:1:0.005的溶液作流动相，进行柱层析分离，用薄层色谱或HPLC跟踪，收集含有高三尖杉酯碱的层析液，真空浓缩为固体，用甲醇溶解后再旋干，得到纯度为88％的固体。
将柱层析后的固体6.5g，用90ml乙酸乙酯，加热条件下搅拌溶解，缓慢加入99ml正己烷混合均匀，-10～0℃条件下静置析晶，抽滤，滤饼减压干燥得到高三尖杉酯碱5.3g，重结晶收率为92.7％(计算公式5.3/(6.5*88％))，HPLC检测纯度≥99.5％。
对比例：
采用本实施例两次柱层析后的固体6.5g(未经甲醇溶解后旋干)，用45ml甲醇，室温搅拌溶解，加入100ml水混合均匀，-10～0℃静置析晶，抽滤，滤饼减压干燥，得到HPLC纯度≥99.2％的高三尖杉酯碱固体4.5g，重结晶收率为78.7％(计算公式4.5/(6.5*88％))。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种高三尖杉酯碱纯化方法，其特征在于，包括：
步骤1、用流动相溶解高三尖杉酯碱粗品，以硅胶为固定相、以乙酸乙酯/正己烷/DIEA混合溶液为流动相进行柱层析，收集含有高三尖杉酯碱的层析液，浓缩为固体；
步骤2、将所述固体用乙酸乙酯溶解，然后加入正己烷或正庚烷混匀，静置析晶，抽滤，滤饼干燥后获得高三尖杉酯碱固体。
2.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，还包括将步骤1浓缩后的固体重复步骤1的操作，如下：
用流动相溶解前次获得的所述固体，以硅胶为固定相、以乙酸乙酯/正己烷/DIEA混合溶液为流动相进行柱层析，收集含有高三尖杉酯碱的层析液，浓缩为固体。
3.根据权利要求2所述纯化方法，其特征在于，所述重复次数为1-2次。
4.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，还包括将步骤2获得的高三尖杉酯碱固体重复步骤2的操作，如下：
前次获得的高三尖杉酯碱固体用乙酸乙酯溶解，然后加入正己烷或正庚烷混匀，静置析晶，抽滤，滤饼干燥后获得高三尖杉酯碱固体。
5.根据权利要求4所述纯化方法，其特征在于，所述重复次数为1-2次。
6.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，在步骤1浓缩为固体后还包括将所述固体用甲醇溶解后再旋干为固体的步骤。
7.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，所述乙酸乙酯、正己烷、DIEA之间的体积比为1～6:1:0.001～0.010。
8.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，所述高三尖杉酯碱粗品与硅胶的质量比为1～5:100。
9.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，步骤2所述乙酸乙酯的用量为每克步骤1所述固体加入10～20mL乙酸乙酯。
10.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，步骤2所述乙酸乙酯和正己烷的体积比或所述乙酸乙酯和正庚烷的体积比均为1:1～5。
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