CN103193880A - Hcg粗品的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种HCG粗品的制备方法。HCG粗品的制备方法,包括下述的步骤:a.收集孕妇尿液,超滤得浓缩液;b.在浓缩液中加入浓度为0.5-0.8%的无水氯化钙,搅拌溶解;c.再将步骤b中的浓缩液加入到2-3倍体积的丙酮中静置10-16小时,所述的丙酮温度为4℃,并将加入了浓缩液的丙酮置于4℃下保存;d.虹吸步骤c中的上层液,并用丙酮洗涤沉淀两次;抽干或真空干燥。采用以上的方法制备HCG粗品,和传统的采用苯甲酸钠的制备方法相比,无需采用苯甲酸钠和盐酸,降低了成本;而且本发明的方法中,减少了由于中间反应环节带来的HCG的损失。

Description

HCG粗品的制备方法
技术领域
本发明属于技术生物医药技术领域,具体涉及一种HCG粗品的制备方法。
背景技术                          
HCG即人绒毛膜促性腺激素,是英文human chorionic gonadotrophin三个英文的首字字母缩写,是由胎盘的滋养层细胞分泌的一种糖蛋白,它是由α和β二聚体的糖蛋白组成。
HCG在受精后第六天前后就进入母血并快速增殖一直到孕期的第8周,然后缓慢降低浓度直到第18~20周,然后维持10天左右,并开始下降(但仍高于正常水平)。完整的HCG全部是由胎盘绒毛膜的合体滋养层产生。其主要功能就是刺激黄体,有利于雌激素和黄体酮持续分泌,以促进子宫蜕膜的形成,使胎盘生长成熟。现代认为HCG是由滋养层过渡型细胞和合体细胞产生的。HCG在受精后6左右天开始分泌,60-70天达到高峰。在妊娠的前8周增值很快,以维持妊娠。在大约孕8周以后, HCG逐渐下降,直到大约20周达到相对稳定。
HCG性状呈白色粉末,易溶于水,不溶于乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂,pH3.2-3.3,干品较稳定,临床上主要用于男性垂体机能不足所致的性机能过低的隐睾症,用于由黄体功能不全引起的功能行子宫出血病和习惯性流产与HMG合同可诱发排卵和治疗不育症。HCG的另一个重要用途是制备妊娠试剂盒放射免疫试剂,用以妊娠检验和绒毛膜癌的诊断,HCG在医学上有重要的用途。
HCG的传统制备方法是:收集孕妇尿液,在尿液中加入苯甲酸钠,再加入盐酸,充分反应,生成苯甲酸,将HCG吸附住,再加入食用酒精使HCG沉淀下来,再干燥HCG,该方法的缺点是,该方法的步骤繁多,尿液中的HCG损失较大;而且该方法中使用到了苯甲酸钠和盐酸,其成本较高,而且盐酸的复新过程需要消耗热量。
CN1302818A公开的方法中,采用醋酸钠的高盐抽提和低盐反抽技术得到HCG中间体,经过SP-葡聚糖凝胶的分离纯化技术制得一种高纯度的人绒毛膜促性腺激素,经过无菌无热原的处理制得医用的注射用HCG精品原料。其具体的工艺流程是:中间体制造工段和纯品HCG制造工段,中间体制造工段过程中,称取HCG粗品,投入到氯化钠的醋酸钠氯化钙乙醇的缓冲液中,搅拌提取,静置过夜虹吸上清液,残渣继续提取,离心取上清液;加入乙醇继续提取;采用预冷丙酮脱水后真空干燥,得中间体;过色谱柱对HCG中间体纯化,收集,加乙醇沉淀,的效价为3000-3500iu/mg的HCG纯品。该方法的缺点是:采用的试剂较多,步骤较为繁琐,而且在该方法中采用了有机试剂乙醇,增加了溶剂回收的步骤。
CN1047507A披露了一种提取人绒毛膜促性腺激素的吸附剂和方法,该方法的具体步骤是:使用硅藻土作为吸附剂,从早、中期(2-6个月)孕妇新鲜尿液中,在37℃以下提取人绒毛膜促性腺激素。具体为:调节孕妇尿液pH值,加硅藻土吸附,取硅藻土装柱,用洗脱液洗脱,加酒精沉淀,经脱水干燥制得人绒毛膜促性腺激素。该方法的缺点是:采用硅藻土作为吸附剂,会吸附一部分HCG,带来HCG的损失。
发明内容
为了解决上述的技术问题,本发明提供了一种成本低、步骤简单、易于工业化生产的HCG粗品的制备的方法。
HCG粗品的制备方法,包括下述的步骤:
a.收集孕妇尿液,采用40目滤网过滤;采用微滤设备预处理过滤,再在超滤设备中超滤得到浓缩液,超滤的条件是:pH3.8-4.0,超滤膜的截留分子量为10000Da,超滤至浓缩液为原尿液重量的4-5%为止;
b.在浓缩液中加入占浓缩液重为0.5-0.8%的无水氯化钙,搅拌溶解;
c.再将步骤b中的浓缩液加入到2-3倍体积的预冷到4℃的丙酮中静置6-15小时,并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于4℃下保存;
d.虹吸步骤c中的上层液,并用丙酮洗涤沉淀两次;抽干或真空干燥得HCG粗品。
上述的步骤a中,超滤尿液后,用反渗透水清洗超滤设备,清洗液冷藏并入下次尿液,可以将尿液中的有效成份更彻底的清洗出来,减少提取中的损失。
上述的步骤b中,在浓缩液中加入战浓缩液总重为0.65%的无水氯化钙,搅拌溶解。
优选的,上述的步骤c中,具体为:再将步骤b中的浓缩液中加入到2.5倍体积的丙酮中静置12小时,所述的丙酮为预冷到4℃的丙酮,并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于4℃下保存。
上述的步骤a中,收集的孕妇尿液中,不得检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab。
上述的步骤a中,所得到的HCG粗品成品中不得检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab。
步骤a中,在4-10℃的区间范围内,有利于HCG粗品的提取。
HCG粗品的制备方法,包括下述的步骤:
a.收集孕妇尿液,采用40目滤网过滤;采用微滤设备预处理过滤,再在超滤设备中超滤得到浓缩液,超滤的条件是:pH3.9,超滤膜的截留分子量为10000Da,超滤至浓缩液为原尿液重量的4.5%为止;
b.在浓缩液中加入占浓缩液重为0.6%的无水氯化钙,搅拌溶解;
c.再将步骤b中的浓缩液加入到2.5倍体积的预冷到4℃的丙酮中静置8小时,并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于4℃下保存;
d.虹吸步骤c中的上层液,并用丙酮洗涤沉淀两次;抽干或真空干燥得HCG粗品。
本发明的有益效果在于,采用以上的方法制备HCG粗品,和传统的采用苯甲酸钠的制备方法相比,无需采用苯甲酸钠和盐酸,降低了成本;而且本发明的方法中,减少了由于中间反应环节带来的HCG的损失。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明,以便本领域的技术人员更了解本发明,但并不因此限制本发明。
实施例1
HCG粗品的制备方法,包括下述的步骤:
a.收集孕妇尿液,该孕妇尿液中,未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab,采用40目滤网过滤;采用微滤设备预处理过滤,再在超滤设备中超滤得到浓缩液,超滤的条件是:pH3.9,超滤膜的截留分子量为10000Da,超滤至浓缩液为原尿液重量的4%左右;
超滤后用反渗透水清洗超滤设备,清洗液冷藏并入下次尿液;
b.在浓缩液中加入浓度为0.65%的无水氯化钙,搅拌溶解;
c.再将步骤b中的浓缩液加入到2.5倍体积的预冷到4℃的丙酮中静置6小时以上,并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于4℃下保存;
d.虹吸步骤c中的上层液,并用丙酮洗涤沉淀两次;真空干燥,得HCG粗品,经检测, HCG粗品中未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab。
采用以上的实施例中的方法制备HCG粗品,其实验结果如下:
                                                 
Figure 337041DEST_PATH_IMAGE001
对比例
收集孕妇尿液,该孕妇尿液中,未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab,;在尿液中加入苯甲酸钠,苯甲酸钠的加入量为2.2%,再加入盐酸至pH值3.9充分反应,生成苯甲酸,苯甲酸将HCG吸附住,2小时后弃去废尿甩干沉淀。再将甩干物加入食用酒精,使HCG沉淀下来并真空干燥得HCG粗品,粗品的比活为5-8IU/mg。
Figure 296032DEST_PATH_IMAGE002
 
从以上表格中的数据可以看出来,实施例1中的粗品比活大于对比例中的粗品比活,而实施例1中的HCG产品每50克的生产成本要比对比例中生产成本低15%左右,每批次的生产时间要少将近一半,由此可见,本发明的HCG粗品的制备方法,其成本低,时间少,效率高。
实施例2
HCG粗品的制备方法,包括下述的步骤:
a.收集孕妇尿液,该孕妇尿液中,未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab,采用40目滤网过滤;采用微滤设备预处理过滤,再在超滤设备中超滤得到浓缩液,超滤的条件是:pH3.8,超滤膜的截留分子量为10000Da,超滤至浓缩液为原尿液重量的4.5%左右;
超滤后用反渗透水清洗超滤设备,清洗液冷藏并入下次尿液;
b.在浓缩液中加入浓度为0.6%的无水氯化钙,搅拌溶解;
c.再将步骤b中的浓缩液加入到3倍体积的预冷到4℃的丙酮中静置10小时以上,并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于4℃下保存;
d.虹吸步骤c中的上层液,并用丙酮洗涤沉淀两次;真空干燥,得HCG粗品,经检测,成品HCG粗品中未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab。
实施例3
HCG粗品的制备方法,包括下述的步骤:
a.收集孕妇尿液,该孕妇尿液中,未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab,采用40目滤网过滤;采用微滤设备预处理过滤,再在超滤设备中超滤得到浓缩液,超滤的条件是:pH4.0,超滤膜的截留分子量为10000Da,超滤至浓缩液为原尿液重量的4%左右;
超滤后用反渗透水清洗超滤设备,清洗液冷藏并入下次尿液;
b.在浓缩液中加入浓度为0.7%的无水氯化钙,搅拌溶解;
c.再将步骤b中的浓缩液中加入到3倍体积的预冷到4℃的丙酮中静置10小时以上,并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于4℃下保存;
d.虹吸步骤c中的上层液,并用丙酮洗涤沉淀两次;真空干燥,得HCG粗品,经检测,成品HCG粗品中未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab。
实施例4
HCG粗品的制备方法,包括下述的步骤:
a.收集孕妇尿液,该孕妇尿液中,未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab,采用40目滤网过滤;采用微滤设备预处理过滤,再在超滤设备中超滤得到浓缩液,超滤的条件是:pH3.8,超滤膜的截留分子量为10000Da,超滤至浓缩液为原尿液重量的5%左右;
超滤后用反渗透水清洗超滤设备,清洗液冷藏并入下次尿液;
b.在浓缩液中加入浓度为0.7%的无水氯化钙,搅拌溶解;
c.再将步骤b中的浓缩液加入到2.5倍体积的预冷到4℃的丙酮中静置10小时以上,并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于6℃下保存;
d.虹吸步骤c中的上层液,并用丙酮洗涤沉淀两次;真空干燥,得HCG粗品,经检测,成品HCG粗品中未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab。
实施例5
HCG粗品的制备方法,包括下述的步骤:
a.收集孕妇尿液,该孕妇尿液中,未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab,采用40目滤网过滤;采用微滤设备预处理过滤,再在超滤设备中超滤得到浓缩液,超滤的条件是:pH3.9,超滤膜的截留分子量为10000Da,超滤至浓缩液为原尿液重量的4.5%为止;
b.在浓缩液中加入占浓缩液重为0.6%的无水氯化钙,搅拌溶解;
c.再将步骤b中的浓缩液加入到2.5倍体积的预冷到4℃的丙酮中静置8小时,并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于4℃下保存;
d.虹吸步骤c中的上层液,并用丙酮洗涤沉淀两次;抽干或真空干燥得HCG粗品,经检测,成品HCG粗品中未检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab。

Claims (8)

1.HCG粗品的制备方法,包括下述的步骤:
a.收集孕妇尿液,采用40目滤网过滤;采用微滤设备预处理过滤,再在超滤设备中超滤得到浓缩液,超滤的条件是:pH3.8-4.0,超滤膜的截留分子量为10000Da,超滤至浓缩液为原尿液重量的4-5%为止;
b.在浓缩液中加入占浓缩液重为0.5-0.8%的无水氯化钙,搅拌溶解;
c.再将步骤b中的浓缩液加入到2-3倍体积的预冷到4℃的丙酮中静置6-15小时,并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于4℃下保存;
d.虹吸步骤c中的上层液,并用丙酮洗涤沉淀两次;抽干或真空干燥得HCG粗品。
2.如权利要求1所述的HCG粗品的制备方法,其特征在于,所述的步骤a中,超滤尿液后,用反渗透水清洗超滤设备,清洗液冷藏并入下次尿液。
3.如权利要求1所述的HCG粗品的制备方法,其特征在于,所述的步骤b中,在浓缩液中加入浓度为0.65%的无水氯化钙,搅拌溶解。
4.如权利要求1所述的HCG粗品的制备方法,其特征在于,所述的步骤c中具体为:再将步骤b中的浓缩液中加入到2.5倍体积的丙酮中静置12小时,所述的丙酮为预冷到4℃的丙酮,并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于4℃下保存。
5.如权利要求1所述的HCG粗品的制备方法,其特征在于,所述的步骤a中,所述的孕妇尿液中,不得检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab。
6.如权利要求1所述的HCG粗品的制备方法,其特征在于,所述的步骤a中,所述的成品HCG粗品中不得检出艾滋病毒、乙肝病毒HBs-Ab、HBc-Ab、Hbe-Ab。
7.如权利要求1所述的HCG粗品的制备方法,其特征在于,所述的步骤a中,超滤的温度为4-10℃。
8.如权利要求1所述的HCG粗品的制备方法,包括下述的步骤:
a.收集孕妇尿液,采用40目滤网过滤;采用微滤设备预处理过滤,再在超滤设备中超滤得到浓缩液,超滤的条件是:pH3.9,超滤膜的截留分子量为10000Da,超滤至浓缩液为原尿液重量的4.5%为止;
b.在浓缩液中加入占浓缩液重为0.6%的无水氯化钙,搅拌溶解;
c.再将步骤b中的浓缩液加入到2.5倍体积的预冷到4℃的丙酮中静置8小时,并将浓缩液和丙酮的混合溶液置于4℃下保存;
d.虹吸步骤c中的上层液,并用丙酮洗涤沉淀两次;抽干或真空干燥得HCG粗品。
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