CN104479005A - 一种促性腺激素纯化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种纯化尿促性腺激素的方法，包括以下四个步骤：(1)将去除好热原的尿促性腺激素供试品用pH7.0溶剂搅拌溶解；(2)用截留分子量5万的Millipore超滤膜进行超滤，截留产品中大分子，超滤过程中，不停补加pH7.0溶剂，直至超出液OD＜0.2为止；(3)超出液加入5倍量的药用乙醇沉淀、离心取固体；(4)真空干燥、粉碎、过筛既得尿促性腺激素原料药。本发明所述的纯化尿促性腺激素的方法，有效的去除了个别引发疼痛或者红疹等等不良反应的成分，制备出一种更加安全和适合临床使用的尿促性腺激素。
Description
技术领域
本发明涉及制药领域，具体涉及一种促性腺激素的纯化方法。
背景技术
促性腺激素(gonadotropin，gonadotropic hormone)是指能够促进雌雄两种性腺的发育，增加性激素分泌的一类激素，如脑垂体前叶分泌的黄体生成激素(LH)和卵泡刺激素(FSH)，人胎盘绒毛膜分泌的绒毛膜促性腺激素(HCG)。其中，FSH和LH的主要作用是促进卵巢或睾丸生成和分泌甾体性激素，它们与HCG合用，可治疗性腺激素分泌不足所致的原发性或继发性闭经，无排卵性稀发月经所致的不孕症等。绝经期妇女由于雌性激素和孕激素缺乏，从而反馈调节垂体，分泌大量FSH和LH，由尿中排出。因此，目前以FSH和LH为主要成分的促性腺激素生产方法多以绝经期妇女的尿液作为原料，经过高岭土吸附、酒精抽提得到＞3iu/mg的尿促性腺激素粗品，再从促性腺激素粗品开始生产，通过硅酸铝层析、阴离子交换树脂层析、除热原等工序而得尿促性腺激素原料。
在本发明中，“尿促性腺激素粗品”是指以绝经期妇女的尿液作为原料，经过高岭土吸附、酒精抽提得到效价为大于3iu/mg的尿促性腺激素，作为进一步纯化的起始物。
在本发明中，“尿促性腺激素原料”是“尿促性腺激素粗品”经过进一步的纯化工艺，得到的效价高于180iu/mg的尿促性腺激素。
根据临床使用反馈得到的资料，个别批次的尿促性腺激素原料制成注射用制剂后，在肌肉注射时容易造成某些过敏体质群体的疼痛或者红疹等不良反应，严重的不良反应可能会危及患者的生命；而其他批次的尿促性腺激素原料制成注射用制剂后并没有如此的不良反应。在排除了尿促性腺激素注射制剂使用中，因个体差异造成不同的后果外，人们发现这些不良反应的发生与尿促性腺激素注射制剂所使用不同批次尿促性腺激素原料药相关。
我们对于不同批次尿促性腺激素原料药留样按照国家和企业质量标准进行了详细的检测，在目前的注射用尿促性腺激素国家药典标准中，只有“酸碱度、效价、无菌、异常毒性与热源、细菌内毒素、干燥失重”及注射剂常规检查的指标，并没有发现按照现行质量标准生产的尿促性腺激素原料药存在有差别，现有检验项目无法检验出造成不良反应的原因。
因此，我们发现按照国家和企业质量标准和检测标准，在排除个体差异的影响后，发生不良反应与没有不良反应的尿促性腺激素原料药没有差异。
尿促性腺激素是从人尿中提取而得，存在较多的异源化学成分，如尿蛋白等。并且现在除了对尿促性腺激素粗品的效价有一定的行业规定外(要求高于3iu/mg)，对于其中其他的成分并没有严格的规定，导致工厂生产所使用的尿促性腺激素粗品的具体成分千差万别，企业得到的尿促性腺激素粗品按照统一的纯化工艺处理得到的尿促性腺激素原料批与批之间成分也存在着细微的差异。但是这些差异在现行的国家和企业质量标准并没有被体现出来。经过大量的资料和文献检索，也并没有发现对此相应的报道。
我们猜测，这些没有被体现出来的尿促性腺激素原料批与批之间成分细微的差异，导致了个别尿促性腺激素注射制剂部分会发生疼痛或者红疹等等不良反应。
发明内容
针对以上问题，本发明的目的就是寻找造成个别不良反映的原因。
更进一步的，本发明提供一种纯化尿促性腺激素的方法。本发明所述的纯化尿促性腺激素的方法，有效的去除了个别引发疼痛或者红疹等等不良反应的成分，制备出一种更加安全和适合临床使用的尿促性腺激素。
依据常规的科研思路，去除活性成分以外的异源化学成分，是避免注射时不良反应的一般手段。但是尿促性腺激素原料批与批之间存在细微的差异，而且尿促性腺激素的活性成分本身就包括了FSH和LH两种大分子化学物质，在不知到引发不良反应的化学物质信息情况下，确定其成分进而采取合适的纯化工艺需要耗费大量人力和时间。
根据现有的公开资料，我们发现在造成过敏等不良反应的原因中，住往是因为存在大分子物质。因此我们尝试对尿促性腺激素原料进行大分子物质的对照分析，希望能够寻找出造成个别不良反映的原因。
电泳图谱的分析(寻找出造成个别不良反映的原因)
照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(中国药典2010年版二部附录V F)
实验1：尿促性腺激素供试品与纯LH和FSH的电泳图比较
1号样品为Mark；
2号样品为尿促性腺激素供试品，来自上海丽珠制药有限公司，选择临床用有不良反应的批号，样品溶液浓度为1mg/ml，上样量为10μl；
3号样品为纯LH样品，来自雅培制药有限公司，样品溶液浓度为1mg/ml，上样量为10μl；
4号样品为纯FSH样品，来自上海丽珠制药有限公司制备，样品溶液浓度为1mg/ml，上样量为10μl；
电泳结果见图1。
从电泳图谱中可以看出，FSH纯品的分子量分布范围为21KD～28KD，LH纯品的分子量为23KD和31KD；HMG的分子量分布范围为18KD～35KD，但是在尿促性腺激素的原料图谱中，可以看到在55KD的位置有蛋白条带。
实验2：不良反应的尿促性腺激素供试品与未出现不良反应的尿促性腺激素供试品的电泳图比较
1号样为Mark；
2号样为尿促性腺激素供试品1，来自上海丽珠制药有限公司，选择临床用有不良反应的批号，样品溶液浓度为1mg/ml，上样量为10μl；
3号样为尿促性腺激素供试品2，来自上海丽珠制药有限公司，选择临床用有不良反应的批号，样品溶液浓度为1mg/ml，上样量为10μl；
4号样为尿促性腺激素供试品3，来自上海丽珠制药有限公司，选择临床用未有不良反应的批号，样品溶液浓度为1mg/ml，上样量为10μl；
5号样为尿促性腺激素供试品4，来自上海丽珠制药有限公司，选择临床用有不良反应的批号，样品溶液浓度为1mg/ml，上样量为10μl；
6号样为尿促性腺激素供试品5，来自上海丽珠制药有限公司，选择临床用未有不良反应的批号，样品溶液浓度为1mg/ml，上样量为10μl；
电泳结果见图2。
从电泳图谱中可以看出，尿促性腺激素供试品1、2、4的图谱以及尿促性腺激素供试品3、5的18-35KD位置条带出现位置类似；但是在55KD位置时，尿促性腺激素供试品1、2、4出现蛋白条带，而尿促性腺激素供试品3、5的未出现该蛋白条带。
HPLC图谱分析(寻找出造成个别不良反映的原因)
利用高纯尿促卵泡素的有关物质检查方法：“仪器及工作条件：采用凝胶色谱柱Superdex 75；以磷酸盐缓冲液(取85％H3P046.74ml，加水800ml，再加Na2S0414.2g，用50％NaOH调pH至6.7，用水定容为1000ml)；柱温30℃；流速0.5ml/min；检测波长214nm；进样量100μl。
测定法：本品适量，加水制成每1ml中约含100单位的溶液作为供试品溶液。照高效液相色谱法(中国药典2010版二部附录V D)试验，检测图谱。”
根据图3和图4的图谱来看，发现不良反应的尿促性腺激素在保留时间小于20分钟出现吸收峰。
根据两种分析方法来看，造成临床不良反应的原因应该是大分子造成的，分子量在55KD左右。
根据上述的分析结果，我们将解决个别尿促性腺激素过敏不良反应的方法定位为去除尿促性腺激素原料中分子量为55KD左右大分子。
基于促性腺激素是一种高分子的蛋白生物制品，去除尿促性腺激素原料中分子量为55KD左右大分子，我们考虑使用分子筛层析技术。在实验室研发阶段，我们对于分子筛层析技术要素进行了探索，但是在层析过程中很难进行中间控制，促性腺激素本身的混合物特性，以及在不同批次促性腺激素的具体成分种类及其含量存在差异，导致使用这一技术，重复性较差，无法满足产品批次间稳定性的要求。同时由于实验条件筛选涉及的要素过多，容易造成高分子去除不彻底，或者产品回收率低的问题。分子筛层析不能有效解决所述的问题。
经过反复筛选和尝试，我们意外发现一种有效去除尿促性腺激素原料中分子量为55KD左右大分子的方法。
本发明目的在于一种纯化尿促性腺激素的方法，具体为采用超滤法去除尿促性腺激素原料中分子量为55KD左右大分子的方法，该方法步骤包括：
(1)将去除好热原的尿促性腺激素供试品用pH7.0溶剂搅拌溶解；
(2)用截留分子量5万的Millipore超滤膜进行超滤，截留产品中大分子，超滤过程中，不停补加pH7.0溶剂，直至超出液OD＜0.2为止；
(3)超出液加入5倍量的药用乙醇沉淀、离心取固体；
(4)真空干燥、粉碎、过筛既得尿促性腺激素原料药。
步骤(1)和(2)中，所述pH7.0溶剂选自pH7.0的醋酸钠缓冲液、pH7.0的磷酸氢二钠缓冲液、纯化水。
附图说明
图1为尿促性腺激素与FSH、LH的电泳图；
图2为尿促性腺激素供试品的电泳图；
图3为未发现不良反应的HMG样品HPLC图谱；
图4为发现不良反应的HMG样品HPLC图谱；
图5为5万分子量超滤膜超滤后的图谱；
图6为10万分子量超滤膜超滤后的图谱。
具体实施方式
去除好热原的尿促性腺激素按照中国专利201010132785.X所述的技术方案进行操作。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1 不同型号的超滤膜对不良反应的影响
试验1(5万分子量超滤膜超滤)
(1)将去除好热原的尿促性腺激素供试品a，选择临床用有不良反应的批号，用pH7.0的醋酸钠缓冲液搅拌溶解；
(2)用截留分子量5万的Millipore超滤膜进行超滤，截留产品中大分子，超滤过程中，不停补加pH7.0的醋酸钠缓冲液，直至超出液OD＜0.2为止；
(3)超出液加入5倍量的药用乙醇沉淀、离心取固体；
(4)真空干燥、粉碎、过筛既得尿促性腺激素原料药d。
试验2(10万分子量超滤膜超滤)
(1)将去除好热原的尿促性腺激素供试品b，选择临床用有不良反应的批号，用pH7.0的醋酸钠缓冲液搅拌溶解；
(2)用截留分子量10万的Millipore超滤膜进行超滤，截留产品中大分子，超滤过程中，不停补加pH7.0的醋酸钠缓冲液，直至超出液OD＜0.2为止；
(3)超出液加入5倍量的药用乙醇沉淀、离心取固体；
(4)真空干燥、粉碎、过筛既得尿促性腺激素原料药e。
试验3(4万分子量超滤膜超滤)
(1)将去除好热原的尿促性腺激素供试品c，选择临床用有不良反应的批号，用pH7.0的醋酸钠缓冲液搅拌溶解；
(2)用截留分子量4万的Millipore超滤膜进行超滤，截留产品中大分子，超滤过程中，不停补加pH7.0的醋酸钠缓冲液，直至超出液OD＜0.2为止；
(3)超出液加入5倍量的药用乙醇沉淀、离心取固体；
(4)真空干燥、粉碎、过筛既得尿促性腺激素原料药f。
实验结果：
不同型号的超滤膜对不良反应的影响如下表所述：
表格1：不同型号超滤膜对不良反应的作用
| 超滤膜型号 | 收率 |
| 4万 | 70％ |
| 5万 | 96％ |
| 10万 | 98％ |
根据以上表格可以看出，4万分子量超滤膜超滤后的尿促性腺激素原料收率较低；5万分子量超滤膜超滤后的尿促性腺激素原料收率高；10万分子量超滤膜超滤后的尿促性腺激素原料收率高。
另外，5万分子量超滤膜超滤后的图谱见说明书附图图5；
10万分子量超滤膜超滤后的图谱见说明书附图图6。
从图5和图6的图谱上可以看到，采用5万分子量膜超滤后产品的大分子得到非常有效的去除，而10万分子量膜的超滤后，大分子还有较多的残留。
实施例2 药理实验
试验组1：如实施例1所述的尿促性腺激素供试品a
试验组2：如实施例1所述的尿促性腺激素供试品b
试验组3：如实施例1所述的尿促性腺激素供试品c
试验组4：尿促性腺激素供试品，选择临床用未有不良反应的批号
试验组5：如实施例1所述的尿促性腺激素原料药d
试验组6：如实施例1所述的尿促性腺激素原料药e
试验组7：如实施例1所述的尿促性腺激素原料药f
空白对照组：生理盐水
阳性对照组：2％牛血清白蛋白溶液。
动物：豚鼠，体重250～300g，雄性，每组6只；由上海市奉贤泰日镇银根养兔室提供。动物合格证号：SCXK(沪)2005-0003。
剂量设置依据：据注射用尿促性素使用说明书记述：“一次150单位”，按人体重50kg计，即为3.0单位/kg。按豚鼠在人体中mg/kg剂量的转换因子为5计，则与人用剂量3.0单位/kg等效的豚鼠剂量为15单位/kg。按豚鼠体重300g计，则剂量为4.5单位/只。致敏剂量为0.5ml/只，即供试品溶液的浓度应为9单位/ml。从临床用药的安全性角度考虑，故将试验剂量提高8倍，即供试品溶液的浓度为75单位/ml(一支制剂溶2ml生理盐水)。
给药途径：腹腔注射。
致敏剂量与次数：0.5ml/只；隔天一次，共3次。
激发剂量与时间：1ml/只；分别在第一次致敏后第14天注射。
观察指标与时间
在激发后30分钟内观察，不得出现过敏反应。如在同一动物身上出现竖毛、发抖、干呕、连续喷嚏3声、连续咳嗽3声、紫癜和呼吸困难等现象中的两种或者两种以上，或出现二便失禁、步态不稳或倒地、抽搐、休克、死亡现象之一的，判定供试品不符合规定。
试验方法
参照《2010年药典》附录ⅪK过敏反应检查法：取豚鼠随机分组，每组6只。每组隔日腹腔注射受试药物，共致敏注射三次，然后分别在第一次致敏注药后14天，21天分别腿静脉注射试液1ml，给药时间约15秒，在给药后30分钟内观察动物。
实验结果如下：
各试验组的实验结果统计如表2.
根据以下的表2，试验组1尿促性腺激素供试品a有明显的过敏反应；试验组5尿促性腺激素原料药d，过敏反应被消除；因此，5万分子量超滤膜超滤可以有效的去除。
试验组2尿促性腺激素供试品b有明显的过敏反应；试验组6尿促性腺激素原料药e，过敏反应未被消除；因此，10万分子量超滤膜超滤不可以有效的去除。
试验组3尿促性腺激素供试品c有明显的过敏反应；试验组7尿促性腺激素原料药f，过敏反应被消除；因此，4万分子量超滤膜超滤可以有效的去除。
试验组4尿促性腺激素供试品c没有过敏反应。
表格2：药理学实验的结果
综合实施例1和实施例2中的实验结果，4万分子量超滤膜可以去除大分子，消除不良反应，但是收率低；5万分子量超滤膜可以去除大分子，消除不良反应，但是收率较高；10万分子量超滤膜不可以去除大分子，不能消除不良反应，但是收率高。因此，选择5万分子量超滤膜用于纯化尿促性腺激素。
实施例3
(1)将去除好热原的尿促性腺激素供试品用0.2mol/L pH7.0醋酸钠缓冲液搅拌溶解；
(2)用截留分子量5万的Millipore超滤膜进行超滤，截留产品中大分子，超滤过程中，不停补加0.2mol/L pH7.0醋酸钠缓冲液，直至超出液OD＜0.2为止；
(3)超出液加入5倍量的药用乙醇沉淀、离心取固体；
(4)真空干燥、粉碎、过筛既得尿促性腺激素原料药。
实施例4
(1)将去除好热原的尿促性腺激素供试品用pH7.0磷酸氢二钠缓冲液搅拌溶解；
(2)用截留分子量5万的Millipore超滤膜进行超滤，截留产品中大分子，超滤过程中，不停补加pH7.0磷酸氢二钠缓冲液，直至超出液OD＜0.2为止；
(3)超出液加入5倍量的药用乙醇沉淀、离心取固体；
(4)真空干燥、粉碎、过筛既得尿促性腺激素原料药。
实施例5
(1)将去除好热原的尿促性腺激素供试品用纯化水搅拌溶解；
(2)用截留分子量5万的Millipore超滤膜进行超滤，截留产品中大分子，超滤过程中，不停补加纯化水，直至超出液OD＜0.2为止；
(3)超出液加入5倍量的药用乙醇沉淀、离心取固体；
(4)真空干燥、粉碎、过筛既得尿促性腺激素原料药。
Claims (2)
1.一种纯化尿促性腺激素的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将去除好热原的尿促性腺激素供试品用pH7.0溶剂搅拌溶解；
(2)用截留分子量5万的Millipore超滤膜进行超滤，截留产品中大分子，超滤过程中，不停补加pH7.0溶剂，直至超出液OD＜0.2为止；
(3)超出液加入5倍量的药用乙醇沉淀、离心取固体；
(4)真空干燥、粉碎、过筛既得尿促性腺激素原料药；
其特征在于，所述方法可以去除尿促性腺激素原料中分子量为55KD左右大分子。
2.根据权利要求1所述的一种纯化尿促性腺激素的方法，其特征在于步骤(1)和步骤(2)中，所述pH7.0溶剂选自pH7.0的醋酸钠缓冲液、pH7.0的磷酸氢二钠缓冲液、纯化水。
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