CN102485752B - 人绒毛膜促性腺激素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种人绒毛膜促性腺激素的纯化方法，该纯化方法包括以下步骤：(1)将人绒毛膜促性腺激素粗品溶解于pH值为4～5的0.05mol/L醋酸钠缓冲液后，加到载体为琼脂糖、葡聚糖凝胶或羟磷酸钙的羧甲基阳离子交换层析柱上，以pH值为4～5的包含0.05mol/L醋酸钠和0.2～0.5mol/L氯化钠的缓冲液洗脱，收集270～290nm，优选为280nm下光密度为0.6～0.7的洗脱液；(2)将洗脱液脱盐浓缩；(3)再加到羧甲基阳离子交换层析柱，以pH值为5.5～6.5的0.05～0.1mol/L醋酸钠缓冲液洗脱，收集270～290nm，优选为280nm下光密度为0.6～0.7的洗脱液。该纯化方法制得人绒毛膜促性腺激素效价不低于7000iu/mg的HCG产品，总收率超过90％。
Description
技术领域
本发明涉及一种激素类药物的纯化方法，具体涉及一种人绒毛膜促性腺激素的纯化方法。
背景技术
人绒毛膜促性腺激素(HCG)是由胎盘的滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，能够维持月经黄体的寿命，使月经黄体增大成为妊娠黄体；它还能促进雄激素被芳香化从而转化为雌激素，同时刺激孕酮形成；抑制植物凝集素对淋巴细胞的刺激作用，避免胚胎滋养层细胞被母体淋巴细胞攻击；刺激胎儿睾丸分泌睾酮，促进男性性分化；与母体甲状腺细胞TSH受体结合，刺激甲状腺活性。在临床上，人绒毛膜促性腺激素被用于女性无排卵或卵泡成熟障碍引起的不育症，也是辅助生育技术控制性超量刺激方案的一部分。它还被用于治疗男性低促性腺激素性性功能低下，精子生成不足引起的不育以及促性腺垂体功能不足引起的青春期延迟和隐睾。
目前，人绒毛膜促性腺激素的生产工艺还普遍存在着收率不高的缺陷，制得的产品纯度也有待于进一步提高。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种人绒毛膜促性腺激素的纯化方法，相比已有生产工艺，该纯化方法获得人绒毛膜促性腺激素纯度和收率更高，更有利于该药物的临床应用和运输、保存。
本发明提供的人绒毛膜促性腺激素的纯化方法包括以下步骤：
(1)将人绒毛膜促性腺激素粗品溶解于pH值为4～5的0.05mol/L醋酸钠缓冲液后，加到载体为琼脂糖、葡聚糖凝胶或羟磷酸钙的羧甲基阳离子交换层析柱上，以pH值为4～5的包含0.05mol/L醋酸钠和0.2～0.5mol/L氯化钠的缓冲液洗脱，收集270～290nm，优选为280nm下光密度为0.6～0.7的洗脱液；
(2)将洗脱液进行脱盐浓缩；
(3)再加到载体为琼脂糖、葡聚糖凝胶或羟磷酸钙的羧甲基阳离子交换层析柱上，以pH值为5.5～6.5的0.05～0.1mol/L醋酸钠缓冲液洗脱，收集270～290nm，优选为280nm下光密度为0.6～0.7的洗脱液；
在上述纯化方法中，HCG在280nm处有最大吸收。
在步骤(1)中，优选地，以pH值为4～5的包含0.05mol/L醋酸钠和0.2～0.5mol/L氯化钠的缓冲液洗脱之前以pH值为4～5的0.05mol/L醋酸钠缓冲液进行洗涤。
在步骤(2)中，脱盐浓缩可以利用超滤膜，优选为截留分子量为1万的超滤膜进行。优选地，洗脱液被脱盐浓缩至其电导率与pH值为4～5的0.05mol/L醋酸钠缓冲液的电导率相等时为止。
在步骤(3)中，优选地，在被加到羧甲基阳离子交换层析柱前，先将脱盐浓缩的洗脱液的pH值和电导率调节至与pH值为5.5～6.5的0.05～0.1mol/L醋酸钠缓冲液的pH值和电导率相等。
优选地，步骤(1)、(2)和/或(3)在0～15℃下进行。
进一步优选地，上述纯化方法还包括向步骤(3)获得的洗脱液中加入乙醇进行沉淀。更优选地，上述纯化方法还包括将沉淀进行脱水和真空干燥，例如脱水采用无水乙醇进行；真空干燥为在五氧化二磷存在下的真空干燥。
上述纯化方法还包括采用磷酸钙除去纯化的人绒毛膜促性腺激素中的热原。
本发明成功地将两个阳离子交换树脂以串联的方式应用于人绒毛膜促性腺激素(HCG)的纯化中，该纯化方法制得HCG效价不低于7000iu/mg的HCG产品，总收率超过90％。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为通过本发明的纯化方法与现有工艺制备的HCG产品的电泳图谱，从左至右分别为分子量标准品(Marker)、现有工艺1制备的产品、现有工艺2制备的产品、本发明的纯化方法制备的产品。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1
起始原料采用单位效价不低于120iu/mg的HCG粗品，该粗品是由孕妇尿液通过苯甲酸钠吸附、高盐抽提以及低盐反抽等方法制得的。
纯化工艺：
2.1层析1(层析环境为0～15℃)：
2.1.1将500g的HCG粗品用0～15℃、pH值为4～5的0.05mol/L醋酸钠缓冲液(平衡液1)溶解，共需40L。
2.1.2选用20L CM-葡聚糖凝胶层析柱(Sephadex LH-20，美国GE公司)，事先用平衡液1平衡至其流出液的电导和pH值与平衡液1的基本一致。
2.1.3将溶解好的上样液按照1～2个柱体积/小时上样，上样结束后用平衡液1洗涤3～4个柱体积，洗涤速度为2～3个柱体积/小时。
2.1.4用pH值为4～5，包含0.05mol/L醋酸钠、0.2～0.5mol/L氯化钠的缓冲液作为洗脱液进行洗脱，洗脱速度2～3个柱体积/小时，收集280nm下光密度为0.6～0.7的洗脱液，一般收集20L。
2.1.5用截留分子量为1万的超滤膜对洗脱液进行脱盐浓缩，至其电导值降至与平衡液1的电导值基本一致为止。
2.2层析2(层析环境0～15℃)：
2.2.1选用1L的CM-葡聚糖凝胶层析柱(Sephadex LH-20，美国GE公司)，事先用pH值为5.5～6.5的0.05～0.1mol/L醋酸钠缓冲液(平衡液2)平衡好。
2.2.2将2.1中经超滤浓缩的洗脱液的pH值和电导率调节至与平衡液2的基本一致。
2.2.3上CM葡聚糖凝胶层析柱，上样速度2～3个柱体积/小时，上样结束后用平衡液2洗涤，洗涤速度为2～3个柱体积/小时，直接收集280nm下光密度为0.6～0.7的洗脱液。
2.2.4洗脱液中加入5倍量的-10℃的药用酒精进行沉淀，过夜后用离心机(4000转/分钟)进行离心，再用无水乙醇进行脱水，五氧化二磷真空干燥制得HCG中间体25克。
2.3磷酸钙除热原
通过磷酸钙除热原处理，得到19克HCG产品。
实施例2
对实施例1纯化得到的人绒毛膜促性腺激素HCG产品与通过现有工艺1、现有工艺2制备得到的产品进行生物效价检测及电泳实验，结果如表1和图1所示。
其中，现有工艺1：参照中国专利ZL01805363.7中所述的方法；
现有工艺2：参照中国专利ZL200510110035.1中所述的方法；
生物效价检测方法如下：
1.实验动物
SPF级NIH小鼠，雌性，体重9～13g，日龄17～23天。由丽珠集团丽珠制药厂动物室提供。
2.方法
取人绒毛膜促性腺激素采用0.9％氯化钠溶液为溶媒制成每1mL中含10单位的溶液，再用0.5％羧甲基纤维素钠溶液按高、中、低剂量组制成0.125u/mL、0.075u/mL、0.045u/mL浓度的3种稀释液作为供试品溶液。取SPF级、体重9～13g、日龄17～23天、同一来源的雌性NIH小鼠共48只。其出生日数相差不超过3日，体重相差不超过3g。按照体重随机分成3组，每组实验小鼠16只。每日于大致相同的时间分别给每只小鼠皮下注入一种浓度的标准品或供试品稀释液0.2mL，每日一次，连续注入3次，于最后一次注入24h后，将动物处死，称体重，解剖，于阴道和子宫交接处剪断，摘出子宫，剥离附着的组织，去掉卵巢，压干子宫内液，直接称重(精密至0.5mg)并换算成每10g体重的子宫重，照生物检定统计法(中国药典附录X Ⅳ)中的量反应平行线测定法计算效价(即中国药典方法：标准品与供试品均采用0.9％氯化钠溶液为溶媒制成每1mL中含10单位的溶液后进行效价测定)。
电泳实验如下：
1.用1％琼脂将长玻璃板下端封住，冷凝30分，灌12％分离胶(4.9ml蒸馏水，6.0ml 30％丙烯酰胺，3.8ml 1.5mol/l Tris-HCl，150μl 10％SDS，150μl 10％过硫酸铵，6μl TEMED)，灌到至短玻璃板4cm，用水封住，冷凝30分后将水倒出，吸干，灌满5％浓缩胶(5.5ml蒸馏水，1.3ml 30％丙烯酰胺，1.0ml 1.5mol/l Tris-HCl，80μl 10％SDS，80μl 10％过硫酸铵，8μlTEMED)后立即插入梳子，冷凝30分后取出梳子，将1×电泳缓冲液倒入电泳槽，并淹没短玻璃板
2.取50mgHCG产品与50ml样品缓冲液混合，用微量进样器以10μl的量注入点样孔，不加样槽注入样品缓冲液。
3.以浓缩胶中80V，分离胶中120V电压进行电泳，至距底线1cm时关闭电源
4.将电泳后的凝胶取出，置于培养皿中，用蒸馏水冲去残留缓冲液，加入染色液将凝胶完全浸泡其中，放入微波炉内，高火档照射20秒，停留1min，再照射10秒，反复几次至凝胶上色后倒出染色液，用蒸馏水冲去残留染色液，加入脱色液，高火档照射20秒，倒出脱色液，再加入新鲜脱色液照射20秒，重复5-6次，直至背景清晰透明，于凝胶分析仪上成像分析。
表1 本发明的纯化方法与现有工艺的生产结果对比
由表1可知，通过本发明的纯化方法制备的最终产品生物效价达到8000iu/mg以上，收率达到90％以上，均优于现有工艺制备的产品。
由图1可以看出，本发明的纯化方法制备的产品电泳图上为两条清晰的条带，这与HCG纯品电泳图谱中有两条色带吻合，而现有工艺制备的产品电泳图上显示5条色带，这说明本发明的纯化方法获得的产品纯度高，基本接近纯品，而现有工艺纯化后的产品还存在一些杂质。
Claims (27)
1.一种人绒毛膜促性腺激素的纯化方法，该纯化方法包括以下步骤：
（1）将人绒毛膜促性腺激素粗品溶解于pH值为4～5的0.05mol/L醋酸钠缓冲液后，加到载体为琼脂糖、葡聚糖凝胶或羟磷酸钙的羧甲基阳离子交换层析柱上，以pH值为4～5的包含0.05mol/L醋酸钠和0.2～0.5mol/L氯化钠的缓冲液洗脱，收集270～290nm下光密度为0.6～0.7的洗脱液；
（2）将洗脱液脱盐浓缩，所述脱盐浓缩利用超滤膜进行；
（3）再加到载体为琼脂糖、葡聚糖凝胶或羟磷酸钙的羧甲基阳离子交换层析柱上，以pH值为5.5～6.5的0.05～0.1mol/L醋酸钠缓冲液洗脱，收集270～290nm下光密度为0.6～0.7的洗脱液。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤（1）中收集的洗脱液为280nm下光密度为0.6～0.7的洗脱液。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤（3）中收集的洗脱液为280nm下光密度为0.6～0.7的洗脱液。
4.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤（3）中收集的洗脱液为280nm下光密度为0.6～0.7的洗脱液。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，以pH值为4～5的包含0.05mol/L醋酸钠和0.2～0.5mol/L氯化钠的缓冲液洗脱之前以pH值为4～5的0.05mol/L醋酸钠缓冲液进行洗涤。
6.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，以pH值为4～5的包含0.05mol/L醋酸钠和0.2～0.5mol/L氯化钠的缓冲液洗脱之前以pH值为4～5的0.05mol/L醋酸钠缓冲液进行洗涤。
7.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，以pH值为4～5的包含0.05mol/L醋酸钠和0.2～0.5mol/L氯化钠的缓冲液洗脱之前以pH值为4～5的0.05mol/L醋酸钠缓冲液进行洗涤。
8.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，以pH值为4～5的包含0.05mol/L醋酸钠和0.2～0.5mol/L氯化钠的缓冲液洗脱之前以pH值为4～5的0.05mol/L醋酸钠缓冲液进行洗涤。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的纯化方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，所述脱盐浓缩利用截留分子量为1万的超滤膜进行。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的纯化方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，所述洗脱液被脱盐浓缩至其电导率与pH值为4～5的0.05mol/L醋酸钠缓冲液的电导率相等时为止。
11.根据权利要求9所述的纯化方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，所述洗脱液被脱盐浓缩至其电导率与pH值为4～5的0.05mol/L醋酸钠缓冲液的电导率相等时为止。
12.根据权利要求1至8中任一项所述的纯化方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，在被加到羧甲基阳离子交换层析柱前，先将脱盐浓缩的洗脱液的pH值和电导率调节至与pH值为5.5～6.5的0.05～0.1mol/L醋酸钠的缓冲液的pH值和电导率相等。
13.根据权利要求9所述的纯化方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，在被加到羧甲基阳离子交换层析柱前，先将脱盐浓缩的洗脱液的pH值和电导率调节至与pH值为5.5～6.5的0.05～0.1mol/L醋酸钠的缓冲液的pH值和电导率相等。
14.根据权利要求10所述的纯化方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，在被加到羧甲基阳离子交换层析柱前，先将脱盐浓缩的洗脱液的pH值和电导率调节至与pH值为5.5～6.5的0.05～0.1mol/L醋酸钠的缓冲液的pH值和电导率相等。
15.根据权利要求11所述的纯化方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，在被加到羧甲基阳离子交换层析柱前，先将脱盐浓缩的洗脱液的pH值和电导率调节至与pH值为5.5～6.5的0.05～0.1mol/L醋酸钠的缓冲液的pH值和电导率相等。
16.根据权利要求1至8中任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤（1）、（2）和/或（3）在0～15℃下进行。
17.根据权利要求9所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤（1）、（2）和/或（3）在0～15℃下进行。
18.根据权利要求10所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤（1）、（2）和/或（3）在0～15℃下进行。
19.根据权利要求11所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤（1）、（2）和/或（3）在0～15℃下进行。
20.根据权利要求12所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤（1）、（2）和/或（3）在0～15℃下进行。
21.根据权利要求13所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤（1）、（2）和/或（3）在0～15℃下进行。
22.根据权利要求14所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤（1）、（2）和/或（3）在0～15℃下进行。
23.根据权利要求15所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤（1）、（2）和/或（3）在0～15℃下进行。
24.根据权利要求1至8中任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法还包括向步骤（3）获得的洗脱液中加入乙醇进行沉淀。
25.根据权利要求24所述的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法还包括将沉淀进行脱水和真空干燥。
26.根据权利要求25所述的纯化方法，其特征在于，所述脱水采用无水乙醇进行；所述真空干燥为在五氧化二磷存在下的真空干燥。
27.根据权利要求25所述的纯化方法，其特征在于，在所述脱水和真空干燥之后，所述纯化方法还包括采用磷酸钙除去纯化的人绒毛膜促性腺激素中的热原。
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