KR0134117B1 - 성장 호르몬 펩티드를 포함하는 성장 호르몬의 활성을 상승시키기 위한 약학 제제, 이를 동물에게 투여하여 생물학적 특성을 변경시키는 방법 - Google Patents

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Description

성장 호르몬 펩티드를 포함하는 성장 호르몬의 활성을 상승시키기 위한 약학 제제, 이를 동물에게 투여하여 생물학적 특성을 변경시키는 방법

본 발명은 생물학적 활성 분자, 더욱 구체적으로는 성장 호르몬 펩티드를 포함하는, 성장 호르몬의 활성을 상승시키기 위한 약학 제제, 이를 동물에게 투여하여 생물학적 특성을 변경시키는 방법에 관한 것이다.

대다수의 폴리펩티드 호르몬들, 특히 성장 호르몬은 의학적인 면 또는 동물 사육적인 면에서 중요하다. 성장 호르몬은 모든 척추 동물내에서 발견되며, 통상 특정 종의 성장 호르몬 (GH)은 다른 종들의 GH와 아미노산 서열이 약간 다를 뿐이다. 일반적으로 이 분자는 약 191개의 아미노산으로 이루어진 단일 선형 서열로 되어 있다. 인체 성장 호르몬(hGH)의 아미노산 서열은 문헌 [ 초 하오 리 (Chon Hao Li), Molecular and Cellular Biochemistry, 46, 31-41(1982)]에 개시되어 있다. 성장 호르몬은 성장 (체형성)을 촉진시키고, 젖 생산(락토게네시스)을 증진시키며, 인슐린과 유사한 혈당감소 효과를 갖는 것으로 공지되어 있다.

예전에는 성장 호르몬에 대한 특정 항체가 최소한 생체내에서 이 호르몬의 작용에 대해 길항 작용을 하는 것으로 생각되어 왔으나, EP-A-137 234 호 (Wellcome)를 통해, 이 항체들이 전체 호르몬의 활성에 상승작용을 할 수 있음이 밝혀졌다. 이와 같이 상승 작용을 수행하는 항체들은 내인성 호르몬의 활성을 상승시키는, 제한된 특이성의 폴리클로날 항체들의 부류가 생성되도록 적당한 성장 호르몬 단편을 숙주 동물에 백신접종함으로써 동일계에서 생성시킬 수 있다. 상기 문헌에는 이러한 목적에 적합한 것으로서 큰 (7K)단편이 기술되어 있다.

또한, 예를 들어 WO 84/04915호 (Amgen)에는 GH분자의 일부분들에 대응하는 펩티드들이, 특히 외인성 인슐린과 동시에 투여할 경우 혈당감소 효능을 발휘하는 유용한 생물학적 활성을 가질 수도 있는 것으로 공지되어 있다. 상기 WO 84/04915호는 그 투여 목적이 펩티드에 대한 항체를 생성시키기 위한 것이 아니므로 항원으로서 상기한 펩티트를 투여하는 것에 대해서는 교시하고 있지 않다.

본 발명에 따라, GH 분자의 특정한 일부 서열들이 척추동물내에서 호르몬의 활성을 상승시키는 항체들을 생성시키는데 특히 적합한 것으로 밝혀졌다. 이들 펩티드들은 전술한 7K 단편에 비해 상당히 작으며, 따라서 보다 용이하게 그리고 저렴한 비용으로도 합성할 수가 있다.

본 발명은 소정의 생물학적 활성 펩티드, 예를 들면 호르몬의 효능을 척추 동물내에서 상승시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 생물학적 활성 펩티드 단편들과 일차 구조면에서 상동성을 갖는 소정의 아미노산 잔기 서열을 함유하는 소형의 펩티드들을 사용하는 것으로, 그 구체적인 과정은 척추동물을 소정량의 상기 소형 펩티드로 처치하여 소정의 생물학적 활성 펩티드의 효능을 증진시키는 것으로 이루어진다.

본 발명은 또한 척추동물 호르몬의 아미노산 서열을 함유하는 소형 펩티드들을 제공하는 것으로, 이들 소형의 펩티드들은 척추동물내에서 호르몬의 활성을 상승시킨다. 통상, 본 발명에 따른 펩티드들은 약 25개 이하의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 20개 이하의 아미노산 잔기들로 이루어진다. 본 발명에 따른 소형 펩티드들내에 함유된, 호르몬과 구조면에서 상동성을 갖는 아미노산 잔기들의 수는 통상적으로 소형 펩티드의 길이에 따라 좌우되며, 수개의 아미노산 잔기 서열에서 실질적으로 소형 펩티드 전체를 이루는서열에 이르기까지 다양할 수 있다. 통상적으로, 구조적인 상동성을 갖는 아미노산 잔기들의 서열 길이는 5개 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 약 8-10개 이상의 아미노산 잔기이다.

본 명세서내에서 사용된 용어 상승작용이란 소형의 펩티드가 직접 또는 간접적으로 작용하여 구조적인 상동성을 갖는 호르몬의 활성을 증가 또는 증진시키는 것을 의미한다.

따라서, 본 발명의 제 1 양태는 소의 성장 호르몬내 아미노산 잔기 서열 35 내지 53 위치에 걸친 영역의 (바람직하기로는 연속) 서열과 1차 구조면에서 상동성을 갖는 펩티드 또는 이것과 항원성이 동등한 펩티드 또는 이들의 염을 제공하는 것이다.

상기 소(및 양)의 GH 영역은 다음과 같다 :

NH₂-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-Gln-Asn-Thr-Gln-Val-Ala-Phe-Cys-COOH

일차 구조면에서의 상동성이란 상기 영역과 완전히 동일한 펩티드; 다른 종들로부터 유래된 성장 호르몬 분자들의 대응 영역과 동일한 펩티드; 및 펩티드의 3차 구조가 거의 변화되지 않도록 1 이상의 아미노산들이 보존성 치환되었거나 또는 소폭 결실된 다른 펩티드를 의미한다. 용어보존적 치환는 상기에서 기능적으로 정의한 바와 같다. 본 명세서에서 보존성으로 볼 수 있는 치환의 예로서는 원래의 아미노산 잔기와 거의 동일한 소수성, 크기, 전하및/또는 방향성을 갖는 것들을 들수 있다. 이와 같은 모든 치환 및 변형은 일반적으로 펩티드 화학 기술 분야의 당업자들이라면 잘 알고 있는 사실이다. 예를 들어, 가능한 치환의 예로는 글리신에 대한 프롤린의 치환 및 그 역치환; 글리신에 대한 알라닌 또는 발린의 치환 및 그 역치환; 로이신에 대한 이소로이신의 치환 및 그 역치환; 티로신에 대한 트립토판의 치환 및 그 역치환; 리신에 대한 히역치환; 아스파라긴에 대한 세린의 치환 및 그 역치환; 글루탐산에 대한 아르기닌의 치환 및 그 역치환; 시스테인에 대한 트레오닌의 치환 및 그 역치환; 트레오닌에 대한 세린 또는 알라닌의 치환 및 그 역치환; 및 아스파라긴에 대한 글루타민의 치환 및 그 역치환을 들수 있다.

이하에 기재하는 것들은 소 성장 호르몬의 35-53 영역에 대응하는 비-소 GH 영역들의 예이다.

인체 35-53

NH₂-Thr-Ile-Pro-Lys-Glu-Gln-Lys-Tyr-Ser-Phe-Leu-Gln-Asn-Pro-Gln-Thr-Ser-Leu-Cys-COOH

돼지 및 쥐 35-53

Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-Cys

조류 35-53

Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Asp-Gln-Arg-Tyr-Thr-Asn-Ser-Gln-Ala-Ala-Phe-Ala-Phe-Cys

연어 (또는 송어) 31-49

Thr-Leu-Leu-Pro-Asp-Glu-Arg-Arg-Gln-Leu-Asn-Lys-Ile-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Cys

용어 항원성이 동등한은 펩티드가 적절한 제형의 형태로 사용할 때 척추동물에 있어서 성장 호르몬의 작용에 대해 상승작용을 하는 항체를 척추동물내에서 생성시킬 수 있는 것임을 의미한다. 구체적으로, 상기 예시한 영역들에 비해 다소 짧거나 긴 펩티드, 또는 상기 예시한 영역들과 거의 중첩되는 펩티드 (예를 들면 30-48 또는 26-43)이 항원성이 동등한것으로밝혀졌다. 용어 다소 긴, 다소 짧은 및 거의 중첩은 해당 펩티드의 45% 이상 (바람직하게는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%)이 상기 35-53 영역의 35% 이상 (바람직하게는 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%)과 중첩되는 펩티드를 의미한다. 구체적으로 상기 예시한 단편보다 짧은, 항원성이 동등한 펩티드, 예를 들면 35-43 또는 35-48을 이용할 수도 있다.

본 발명을 실시하는데 있어서 유용한 소 GH관련 서열의 구체적인 예로는 다음과 같은 것들이 있으나, 이들로만 국한되지 않는다 : 26-43(Ala-Tyr), 35-43(Thr-Tyr), 37-48(Ile-Thr), 39-46(Glu-Gln), 43-54(Tyr-Phe) 및 43-61(Tyr-Pro).

펩티드를 투여하고자 하는 동물이외의 다른 종으로부터 수득한 본 발명의 소형 단편을 사용하는 것, 예를 들면 돼지의 35-53을 양 또는 소에게 투여하는 것이 유리한 것으로 밝혀진 바 있다. 동물 자체의 GH 서열을 변화시키는 것에 의해서도 보다 큰 면역 응답반응을 유도하여 동물 자체의 GH를 인지할 수 있는 항체들을 생성할 수 있다.

또한, 펩티드 합성전 또는 후에, 펩티드의 기능, 즉 생체내에서 특이적 항체들을 생성시키는 기능을 거의 변화시키지 않는 범위에서, 1개 이상의 아미노산 잔기들을 화학적으로 변형시킨 펩티드를 사용할 수도 있다. 이와 같은 변형으로는 산 또는 염기, 특히 생리학적으로 허용되는 유기 또는 무기산 및 염기들과의 염 형성, 말단 카르복시기의 에스테르 또는 아미드 형성, 및 N-t-부톡시카르보닐과 같은 아미노산 보호기의 부착을 들 수 있다. 이와 같은 변형을 통해 펩티드가 생체내에서 대사되지 않도록 보호할 수 있다. 펩티드는 단일 복제체 또는 다중체, 예를 들면 35-53+35-53과 같은 직렬 반복체 형태로 존재할 수 있다. 이와 같은 직렬형 또는 다중형 반복체들은 그 자체로도 충분히 항원으로서 기능할 수 있으므로 담체를 사용할 필요가 없다. 상기 펩티드는 N-말단 및 C-말단 단부가 함께 결합된 루우프(loop)를 형성하거나, 또는 1개 이상의 Cys 잔기를 단부에 부가하여 항원성을 증대 시키고/시키거나 이황화물 결합이 형성되도록 하는 것이 유리하다. 펩티드가 담체, 바람직하게는 폴리펩티드와 공유 결합을 이루는 경우에는, 본 발명의 펩티드가 루우프를 형성하도록 배열되는 것이 바람직하다.

본 발명의 제 2 양태는 담체 및 보조제 기능을 제공하는 물질과 함께 전술한 본 발명의 제 1 양태의 펩티드들중 1개 이상의 임의의 펩티드를 함유하는 약학적 항원 조성물을 제공하는 것이다.

현재 거론되고 있는 면역학적 이론들에 따르면, 면역계를 자극하거나 또는 자극을 촉진시키기 위한 목적으로 임의의 면역원 제제내에 담체 기능이 존재하여야 하는 것으로 알려져 있다. 상기 담체 (또는, 항원과 함께)들은 헬퍼(helper) T-세포 에피토프(epitope)를 형성하는(생성하는)것으로 추정된다. 펩티드는 일례로서 혈청 알부민, 미오글로빈, 세균 톡소이드 및 키홀 림펫 헤모시아닌과 같은 별도의 담체와 교차-결합시켜 결합시킬 수 있다. 면역 응답반응시에 T-세포의 도움을 유도하는 것으로, 보다 최근에 개발된 담체들로는 B형 간엽 코어 항원 (뉴클레오켑시드 단백질로 불리우기도 함), Thr-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn과 같은 추정되는 헬퍼 T-세포 에피토프, 베타-갈락토시다제 및 인터류킨-1의 163-171 펩티드를 들 수 있다. 상기 후자의 화합물은 담체로서 또는 보조제로서 또는 둘다 모두로서 다양하게 사용될 수 있다. 대안으로, 동일하거나 상이한 본 발명 펩티드들의 여러 복사물 서로가 교차-결합을 형성할 수도 있는데; 이 경우에는 별도의 담체 자체가 존재하지 않아도 상기 교차-결합에 의해 담체 기능이 제공될 수 있다. 적합한 교차-결합제로는 시그마 앤드 피어스 (Sigma and Pierce)카탈로그에 기재된 것들, 예를 들면 글루타르알데히드, 카르보디이미드 및 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트가 있으며, 상기 후자의 제제는 35-53 영역의 C-말단 시스테인 잔기상의 -SH기를 이용한 것이다.

적합한 보조제들은 백신 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있으며, 그 예로는 프로인트의 완전 도는 불완전 보조제, 수산화 알루미늄, 사포닌, DEAE-덱스트란, 뮤라밀 디펩티드, 광유, 중성유(예, 미글리올), 식물성 오일 (예, 낙화생 오일), 이스콤즈, 리포좀, 플루로닉 폴리올 또는 리비 보조제 시스템 (예, GB-A-2 189 141 참조)이 있다. 상기 플루로닉은 등록 상표이다.

본 발명의 펩티드는 다른 항원들과 결합되어 이중 효과를 발휘하기도 한다. 예를 들면, 펩티드가 소마토스타틴 분자의 일부분 또는 전체와 결합하면 항-GH 항체외에도, 성장을 촉진하는 항-소마토스타틴 항체를 생성하거나, 또는 성 호르몬 분자의 일부분 또는 전체와 결합하면 동시에 면역거세하도록 하거나, 또는 황체형성 호르몬 분비 호르몬 (LHRH)의 일부분 또는 전체와 결합할 수도 있다.

이들 펩티드 및 보조제 및/또는 담체들은 공지의 또는 아직 개발중인 전달부형제 및 기술을 이용하여 당해 기술 분야에 숙련된 이들에 의해 고안된 적당한 방법으로 제형화 가능하다. 특히, 이들 제제는 EP-A-58481(IC)에 개시된 것들과 같은, 락티드 글리콜라이드공중합체류의 생체분해가능한 중합체를 기제로 할 수 있다.

본 발명의 제 3 양태는 정상 또는 비정상 상태의 척추동물을 전술한 소형 펩티드 또는 항원성 조성물로 처치하여, 예를 들면 정상 수준을 능가하는 수준으로 또는 가속된 속도로 해당 척추동물의 성장을 증대시키거나, 비정상적으로 낮은 수준의 성장을 정상 상태로 끌어올리거나, 젖 생산을 증진시키거나 또는 GH와 관련된 다른 생물학적 효능들을 증진 또는 증대시키는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 동물 체 내에서의 육질과 지방의 비율도 본 발명의 방법에 의하면 향상될 수 있다. 본 명세서내에서 기술하는 용어 척추동물은 사람 및 사람 이외의 모든 척추 동물을 포함하여 총칭하는 것이다.

본 발명에 따른 소형 펩티드 및 항원성 조성물은 보통 정맥내, 피하 또는 근육내로 투여하지만, 본 발명의 일부 제제에 있어서는 비내, 경피, 경구 및 직장 경로로 투여하는 것이 적당한 경우도 있다. 제제는 통상적으로 멸균 상태로, (비경구용으로 사용하는 경우에 있어서) 비-발열성이어야 하며, 단위투여량은 본 발명의 소형 펩티드 1-1000μg, 통상적으로 10-500μg, 바람직하기로는 약 50μg 또는 그 이하로 한다. 면역 기술 분야에 공지되어 있는 바와 같이 1회 이상 반복하여 면역시키는 것이 유리하다. 이들 제제는 일반적으로 의사 또는 수의사의 숙련된 기술 및 전문 지식에 따라 제조 및/또는 투여할 수가 있다.

본 발명의 제 4 양태는 공지의 펩티트 합성 방법을 이용하거나 천연 GH 분자를 적절히 절단하여 전술한 펩티드들을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 펩티드 합성은 문헌[Solid Phase Peptide(W H Freeman, 샌 프란시스코, 1969)]에 발표된 스튜워트 (Stewart) 등에 의한 일반적인 방법에 따르거나, 또는 마글린 (Marglin) 및 메리필드(Merrifield)가 문헌 [Annual Reviews of Biochemistry, 39, 841-866 (862)(1970)] 및 후속 논문에서 발표한 방법을 이용하여 수득할 수 있다. 고체상에 의한 펩티드 합성 방법 및 유사 기술은 보통 대규모 생산에 (장래에는 실현 가능하나)는 적합치 않으므로, 펩티드를 상업적으로 생산하는데 있어서는 통상적으로 목적 펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드 서열로 형질전환시킨 적당한 생물체를 배양하는 방법이 이용되고 있다. 따라서, 본 발명의 제 5 양태는 이와 같은 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 보유하는 형질전환 및 형질발현 벡터, 이들 벡터로 형질전환시킨 유기체 및 상기 유기체를 배양하는 방법들을 포함한다.

본 발명의 제 6 양태는 본 발명에 따른 방법에 의해 특성이 변형된 사람 이외의 척추 동물에 관한 것이다.

이하에서는 본 발명에 따른 구체예들을 첨부하는 도면들과 관련지어 설명하고자 한다.

제1도는 발육부진 생쥐에 대한 예비 실험 결과를 나타내는 도면으로, 도면내에서 막대는 처리군당 6마리의 동물을 사용하여 1 s.d.를 나타낸 것이다.

제2도는 발육부진 생쥐에 대한 두 번째 실험 결과를 나타내는 도면으로, 2종의 양 772 (35-53 단독 + FCA) 및 775 (35-53과 KLH의 접합체 + FCA)로부터 얻은 IgH(글로불린)의 활성을 OAll과 각기 다른 글로불린 농도에서 비교한 것이다.

772 니트 = 10.5 mg 단백질/ml; 775 = 9.6 mg 단백질/ml; OAll-5 mg 단백질/ml. 막대 = 1.s.d., n=6.

제3도는 발육부진 생쥐에 대한 세번째 실험 결과를 나타내는 도면으로, 모두 35-53 X-결합체 + FCA (4600, 4609, 4602, 4612, 4610)로 처리하거나 또는 대조용으로 면역 처리하지 않은 (4660, 4608) 각기 다른 양으로부터 얻은 글로불린의 활성을 나타낸 것이다. 막대 = 1 s.d., n=6.

제4도는 b35-53을 사용하여 각기 다른 방법으로 수득한 항 혈청이 일부 경우들에 있어서 얼마나 소의 성장 호르몬 및 돼지의 분자와 결합할 수 있는가를 나타낸 도면이다. 결과로서 후자에 대한 친화도는 약 10X 감소되었다. 이 또한 발육 부진 생쥐에 대한 실험의 결과를 나타낸 것이다. 막대 = 1 s.d., n=6

제5도는 이하에 기술하는 바대로 뇌하수체 절제한 생쥐의 실험 결과를 나타낸 도면으로, 여러군 (1군 6마리)의 쥐들에 있어서 9일에 걸친 체중 증가를 나타낸 것이다. 막대는 1 s.d를 나타낸다. 모두 호르몬 투여 처리를 하였다.

● 소의 성장 호르몬과의 결합에서 양성을 나타내는 4마리의 면역 처리한 양으로부터 모은 항-소 35-53 항-혈청

X 상술한 바대로 4마리중 1마리의 양으로부터 얻은 항-혈청

○ 대조용으로 처리하지 않은 항-혈철

■ (항혈청으로 처리한)모노클로날 항체 OA15

□ 모노클로날 항체 OA17 (Aston외, 1986)

제6도는 뇌하수체 절제한 쥐의 추가 실험 결과를 나타낸 도면이다.

A : 대조용 양 면역글로불린

B : 항-35-53 항혈청, 양 1064, 5mg/ml

C : 항-35-53 항혈청, 양 1064, 15mg/ml, 니트. 막대 = 1 s.d., n=6

제7도는 뇌하수체 절제한 쥐의 또다른 실험 결과를 나타내는 도면으로, 즉 오브알부민 또는 소마토스타틴과 접합체을 이룬 항-펩티드 항체들을 비교한 것이다. 막대 = 1 s.d., n=6. 이들 각각의 글로불린 제제는 쥐에 투여하기에 앞서 소의 성장 호르몬과 혼합하였다.

제8도는 뇌하수체 절제한 쥐의 또 다른 결과를 나타내는 도면으로, 항-소 35-53이 또한 돼지의 성장 호르몬을 얼마나 증가시킬 수 있는가를 예시한 것이다. 쥐들에게 통상적인 수준의 항-글로불린을 사용하되 1일에 단 15μg만을 투여하였다. 막대 = 1 s.d., n=6

제9도는 뇌하수체 절제한 쥐의 또 다른 실험 결과를 나타내는 도면으로, 소 또는 돼지의 분자들과 관련된 각종 펩티드들에 대해 생성된 항-펩티드 항체들로 쥐들을 처치한 결과를 나타낸 것이다. 쥐들에게 투여하기에 앞서 항체들 모두를 돼지의 성장 호르몬과 혼합하였다. 막대 = 1 s.d., n=6

[방법]

[펩티드의 제조]

펩티드들은 모두 Fmoc-폴리아미드 방식의 고체상 (solid-phase)펩티드 합성법에 의해 합성하였다.

N^α- 아미노기를 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc)기로 일시적으로 보호시켰다. 상기 매우 염기-불안정한 보호기를 N,N-디메틸포름아미드중에서 20% 피페리딘을 사용하여 반복 절단하였다.

측쇄 작용기들을 그들의 부틸 에테르 (세린, 트레오닌 및 티로신의 경우), 부틸 에스테르 (글루탐산 및 아스파르트산의 경우), 부틸옥시카르보닐 유도체 (리신 및 히스티딘의 경우), 트리틸 유도체 (시스테인의 경우) 및 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐 유도체 (아르기닌의 경우)로서 보호시켰다. 글루타민 또는 아스파라긴이 C-말단 잔기인 경우에 있어서는 4,4'-디메톡시벤즈히드릴기를 이용하여 측쇄 아미도기를 보호하였다.

고체상 지지체는 3개의 단량체, 디메틸아크릴아미드 (주쇄-단량체), 비스-아크릴로일 에틸렌 디아민(교차 결합제) 및 아크릴로일사르코신 메틸 에스테르 (작용화제)로 구성된 폴리디메틸 아크릴아미드 중합체를 기제로 한다.

펩티드-수지 절단가능한 결합제로는 산-불안정한 4-히드록시메틸-페녹시아 세트산 유도체를 사용하였다.

역 N,N-디시클로헥실카르본이미드/1-히드록시벤조트리아졸 중개된 결합 방법을 이용하여 첨가하는 아스파라긴 및 그루타민을 제외하고 모든 아미노산 유도체들을 자체가 지니고 있는 대칭 무수물 유도체 상태로 첨가하였다.

모든 결합 및 탈보호 반응들을 닌히드린, 트리니트로벤젠 술폰산 또는 아이소틴 시험 방법을 이용하여 모니터하였다.

합성이 완결되면, 5% 스캔빈저 믹스를 함유하는 95% 트리플루오로아세트산으로 처리하여 측쇄 보호기들을 제거함과 동시에 수지 지지체로부터 펩티드를 절단하였다. 스캐빈저로는 보편적으로 에탄디티올, 페놀, 아니솔 및 물이 사용되며, 합성하고자 하는 펩티드의 구성 아미노산을 고려하여 적절하게 선택한다. 진공중에서 증발시켜 트리플루오로아세트산을 제거하고, 이어서 디에틸 에테르로 연마하여 미정제 펩티드를 수득하였다. 간단한 추출 공정을 이용하여 존재하는 모든 스캐빈저를 제거하고, 수성상을 동결건조시켜 스캐빈저가 제거된 미정제 펩티드를 수득하였다.

정제 공정은 임의의 방법으로, 또는 사이즈 배제 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피 및 (기본적으로) 역상 고 성능 액체 크로마토그래피와 같은 기술들을 병용하여 수행할 수 있다.

당해 발명이 속하는 기술분야에 숙련된 이들에게 주지되어 있는 박충 크로마토그래피, 역상 고 성능 액체 크로마토그래피, 산 가수분해후의 아미노산 분석을 이용하고, 급속 원자 충돌(FAB) 질량 분광 분석에 의해 펩티드 분석을 수행하였다.

I. 양에 대한 실험 : 예비 실험

[방법]

1. 면역원 조성물의 제조

글루타르알데히드를 이용한 키홀 림펫 헤모시아닌과의 교차-결합 :

펩티드(양/소의 서열 35-33) 10mg을 디메틸 포름아미드 500μl에 용해시키고, pH 7.8의 0.05M 인산염 완충액 400μl중의 키홀 림펫 헤모시아닌 10mg과 혼합하였다. pH 7.8의 0.05M 인산염 완충액중의 0.02M 글루타르알데히드 용액 1ml를 1시간에 걸쳐 실온에서 교반하면서 적가하였다. 상기 혼합물을 이후 3시간 동안 실온에서 교반한 후, 인산염 완충 식염수 (pH 7.2)에 대해 투석했다.

제제의 1.2을 2배 부피의 프로인트 완전 보조제와 혼합하고, 2마리 양의 여러부위에 피하 주사했다. 28일 후, 제제의 나머지 절반을 마찬가지로 프로인트 불완전 보조제내에 유화시켜 주사했다. 면역처리중에 매주 간격으로 양으로부터 채혈하여 조사한 결과, 2차 면역처리후 14일경에 최고의 항체 응답반응이 수득되었다.

2. 양 혈청의 방사선면역분석

GH 펩티드 단편 35-53으로 양을 면역처리한 후, 종래 발표된 (Aston 외, 1985)바와 실질적으로 동일하게,¹²⁵I-bGH를 사용한 액상 직접 결합 분석을 수행하여 항체 생산을 측정했다.

3. 성장 분석

종래 발표된 바 (Aston외, 1986; 1987)와 같이 발육부진 생쥐 성장 모델에 있어서 상기 혈청으로부터 -글로불린을 제조한 후 성장 촉진 펩티드 항혈청(항-35-53)의 활성을 평가했다.

[결과]

소/양의 GH로부터 유래된 펩티드로 면역처리한 양으로부터 얻은 혈청에 대하여,¹²⁵I-bGH에 대한 결합성 및 생체내에서 bGH의 생체활성에 미치는 효과를 평가하였다. 항-35-53 항혈청과 함께 bGH를 투여한 발육부진 생쥐는 bGH 및 대조용 양 글로불린으로 처리한 것들에 비해 훨씬 잘 성장하였다.

그 결과는 첨부하는 도면 제1도에 나타내는 바와 같다.

II. 양에 대한 실험 : 연구

[방법]

1. 오브 알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과의 접함

펩티드(예.소의 35-53) 1.4mg을 디메틸 포름아미드 140μl에 용해시켰다. 둘베코스 인산염 완충 식염수(PBS)중의 10mg/ml 오브알부민 또는 KLH 70μl를 첨가하여 철저히 혼합했다. 새로 제조한 0.04M글루타르알데히드 200 μ l를 교반하에 10분에 걸쳐 서서히 첨가한후, 실온에서 다시 60분간 방치했다. PBS0.7ml를 첨가한후, 다시 상기 0.04M 글루타르알데히드 100μl를 첨가했다. 실온에서 60분간 방치한후, +4℃에서 PBS에 대해 밤새 투석했다.

2.교차-결합

펩티드 1.4mg을 디메틸포름아미드 140μl에 용해시키고, 전술한 바와같이, 0.04M 글루타르알데히드 170μl를 첨가했다. 그렇지 않으면, 상술한 바와 동일하게 실시한다. 교차-결합이나 접합이 필요치않은 경우에 있어서는 펩티드를 디메틸 포름아미드중에 용해시키고, PBS 내에 분산시키되 투석은 하지 않는다.

3.음성 대조물질

상술한 것과 병행하여 사용하는 음성 대조물질을 오브알부민(또는 KLH)과 결합된 펩티드를 사용하지 않거나 또는 폴리-리신(분자량 1000-2000 Da)을 사용하고 교차-결합하여 제조했다.

4.보조제 및 투여-프로인트

투석후, PBS 및 2배 부피의 프로인트 완전 보조제(FCA)(디프코 또는 시그마)를 사용하여 제조한 '유중수형'에멀젼을 사용하여 상기 제제의 부피를 4.5ml로 만들었다. 이와 같은 공정은 냉각하에서 음파처리하거나 또는 포터-엘베젠 균질화기를 사용하여 수행하였다. 에멀젼에 대해 수 표면상의 분산 여부를 시험하였다. 체비오트(Cheviot)양(9-12 개월령, 거세된 수컷, 30-35kg)의 2부위(각각의 양쪽 옆구리)에 피하 주사하여 투여했다. 각각의 부위에 1ml씩을 투여했다. 동일한 방법으로 접합시키되 프로인트 불완전 보조제(FIA)(디프코 또는 시그마)중에 유화시킨 새로이 제조한 펩티드를 사용하여 유사하게 2차 면역처리를 실시했다. 임의의 후속적인 면역처리를 유사하게 실시하되 28일 간격으로 수행했다.

5.보조제 및 투여-기타

DEAE-덱스트란(2배 부피의 증류수중에서 밤새 완전 수화시킨 것)(파마시아),사포닌(시그마) 및 알루미늄 히드로겔을 단독으로 및 배합하여 사용했다. 투석후, 3.1ml의 PBS + 7ml의 5% DEAE-덱스트란(Dd) + 2.8ml 5mg/ml 사포닌; 또는 5.9ml의 PBS + 7ml의 5% Dd;또는 10.1ml의 PBS + 2.8ml의 5mg/ml 사포닌을 첨가했다. 경우에 따라, 알루미늄(AlOH)을 최종 농도 1.0mg/ml로 사용했다.

유화 공정은 필요치 않으나, 균일한 현탁액중에 구성성분이 유지되도록 주의를 기울여야한다. 전술한 바와 같이, 양에게 1ml씩 투여했다. 동일한 시간 간격으로 면역처리를 실시했다.

6.혈액 시료

투여 직전 및 그후 매주 3회 경정맥 천자에 의해 시험중인 양으로부터 혈액시료 10ml씩을 채혈했다. 실온에서 혈병이 형성되도록 방치한 후(약 5시간), 즉각적인 항체-검출 방사선면역분석용으로 원심분리한후 혈청을 회수했다. 동일한 방식으로 약150ml의 혈액으로부터 보다 많은 양의 혈청 시료를 수거한후, 후속 분별 공정 및 성장 분석에 사용할 수 있도록 -20℃에서 동결시켰다.

7.방사선 면역 분석법

전술한바 (Aston 외, 1985; Chard,1987)와 같이, 액상 직접 결합을 이용하여 소의 성장 호르몬과도 또한 결합하는 펩티드에 대한 항체를 결정했다.

[결과]

하기 표1 은 양에 대한 실험 결과들을 요약한 것으로, 펩티드 35-53을 이용한 대부분의 접합체(또는 펩티드 단독)를 함유하는 FCA의 우월성을 나타내는 것이다. 돼지 35-53을 소폭 변화시킨 것을 양에 주입한 결과, 또한 향상된 응답 반응을(뿐만아니라 실제적인 역가-미제시)이 나타났다. 35-53 서열을 포함한 그 부근 및 상기 서열 내부의 펩티드는 최소한 중간정도의 응답 반응을 나타냈다.

오브알부민에 접합체시켜 FCA중으로 해서 투여한 기타 다른 펩티드-상기 모든 소(별다른 언급이 없는 한)의 펩티드들 :

* 별다른 언급이 없는 경우, 전단 공정을 이용하여 에멀젼을 제조했다.

III. 면역자극 효능

[방법]

35-53(또는 그의 유사체 및 관련 서열)이 면역학적으로 관심있는 다른 펩티드나 분자에 결합할 수 있으며, 그 결과 이들 두 펩티드에 대한 응답반응이 개선될 수 있다는 것을 입증하고자 실험을 수행하였다.

특히 동물 체 내에서의 면역중화작용의 역할과 관련된 본 실험에서는 효과적인 면역중화 항체를 생성하는데 있어서의 어려움을 고려하여 예시의 목적으로 소마토스타틴을 선택하였다(참고 : Spencer, 1986.)

(1-14) 소마토스타틴(시그마)을 사용하되, 소마토스타틴을 단지 4mg/ml로 첨가하고 어떠한 처리에 있어서도 투석은 실시하지 않았다는 점을 제외하고는, 전술한 (II-1)것과 동일한 방법으로 접합체를 제조하였다. 나머지 모든 접합체들도 전술한 (II-1)과 동일한 방법으로 제조하였다.

문헌[Spencer et al., 1983)에 기술된 바와 같이,¹²⁵I-표지된 Tyr-소마토스타틴을 사용하여 소마토스타틴에 대하여 성장 호르몬 결합 항체에 대한 방사선면역분석을 수행하였다.

[결과]

하기 표 2에 요약된 자료는 소마토스타틴에 대해 높은 항체 역가를 수득하는데 있어서는 통상적으로어려움이 따른다는 것과 소의 35-53과의 교차 결합 (단순한 내부의 교차결합만이 아님)이 자가 내성을 얼마나 극복하는지를 입증하는 것이다.

IV. 돼지에 대한 실험

[방법]

1. 일반적인 방법

전술한 바있는 서열 35-53+T-세포 에피토프를 디메틸 포름아미드에 용해시키고, PBS중에 분산시킨후 (II-2 참조), FLA중에 유화시켜 돼지에게 주입하였다. 상기 서열에는 접합 또는 교차 결합은 이루어지지 않았다.

이와같이 하여 제조한 펩티드를 큰 화이트 새끼돼지(생후 5주된 것; 체중 약 9kg)의 목부위 4군데에 피하 투여하여 돼지 1마리당 500μg의 펩티드를 투여하였다. 28일 후에 유사한 제제를 사용하여 2차 면역을 실시했다. 이 경우, 모두를 FLA중으로 해서 실시하였다. 상기 면역처리 직전 및 그후로 매주 진공-이용 정맥천자 (Corvac, Sarstedt, 영국)를 사용하여 폐 정맥으로부터 혈액 시료를 채혈하였다. 볼러(Voller, 1979)들이 발표한 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA)법을 이용하여 돼지 성장 호르몬을 인지하는 항체에 대해 혈청을 시험하고, 이어서 유사한 분석방법으로 수성 호르몬을 사용하여 경쟁에 의해 이를 교차 결합시켰다.

2. ELISA

면역분석 컨시스텐시 (Nunc, 면역-특성, 고-결합 성능)에 대해 처리한 96-웰 평판에 탄산 나트륨/중탄산 나트륨 완충액 0.05M (pH 9.5)중의 50μg 호르몬/ml을 5μg.웰(100μl)로 피복한 다음, +4℃에서 밤새 방치하였다. 호르몬 용액을 조심스럽게 제거하고, 웰을 PBS로 1회 세척하였다. 3% 헤모글로빈 용액을 첨가하여 웰을 블로킹시키고, 40℃에서 밤새 방치하였다. 이어서 내용물을 제거하고, 웰을 PBS-0.05% 트윈으로 3회 세척하였다. 평판 모두를 실온에서 천천히 건조시키고 각각을 점착 필름으로 싸서 -20℃에 보관하였다. 시험중인 혈청을 각 웰에 1/50로 첨가하고, 이어서 log₁₀희석 (100μl)후, 2시간 동안 실온에서 방치하였다. 내용물을 제거하고, 웰을 PBS로 3회 세척한후 10^-3배로 희석한 토끼 항-돼지 IgG 알칼리 인산염 접합체 (시그마) 100μl로 교환해주었다. 전술한 바와같이 내용물을 제거하고 세척하였다. 1.0mg/ml 농도의 p-니트로페닐 포스페이트 100μl를 첨가하고 405nm 필터를 갖는 타이터텍 멀티스캔 플러스 2를 이용하여 웰의 흡광도를 판독하였다.

[결과]

하기 표 3은 피복된 돼지의 성장 호르몬 (수성 호르몬과 경쟁함)을 인지하는 항체의 존재가 다수의 돼지내에서 검출될 수 있다는 것을 나타낸다.

* 항혈청 희석율

V.GH 활성의 생체 분석

[방법]

1. 면역글로불린 제제

특정 동물로부터 채혈한 보다 다량의 혈액 시료로부터 얻은 혈청 (면역분석에 의해 조사)을 황산 나트륨 침전법 (Johnstone Thorpe, 1982)으로 분별하여 주종을 이루는 감마-글로불린 (IgG)을 분리하고, PBS에 철저히 투석한후, -20℃에서 다시 동결시켰다. 동물 실험에 사용하기에 앞서, 정제된 IgG 분획을 다시 적정하여, 침전이 있는 경우 그 효능에 대해 모니터하였다.

2. 발육부진 생쥐

본 실험은 발육부진(뇌하수체 결손) 생쥐의 늑골 연골내로³⁵SO₄ ^--가 흡수되는 것을 이용한 것으로, 문헌 [Aston외, 1986]등지에 개시되어 있다.

3. 뇌하수체 절제된 쥐

외과 수술에 의해 이들 동물들의 뇌하수체를 제거하여 뇌하수체 결손 상태로 만들었다. 본 분석에서는 호르몬이 쥐의 체중에 미치는 전반적인 효과뿐만아니라 소마토메딘-C의 혈중 농도를 모니터하였다.

수컷의 위스타르 쥐를 챨스 리버 유.케이.리미티드(Margate, Kent, 영국)에 의해 외과수술로 처리한 결과, 14일후 125-145g의 체중을 나타냈다. 이들의 체중을 측정하고, 다시 7-10일간 관찰한 결과, 안정된 체중 및 신체적 특성들 (예, 고환 비발현)을 확인하였는데, 이는 양호한 건강 상태와 성공적인 수술을 나타내는 것이다. 만족스럽게 처리된 동물들을 처리군당 6마리씩 무작위 할당하였다. 이들에게 연구중인 면역 처리로부터 얻은 대략 1mg의양 IgG를 함유하며, 경우에 따라 적절하게 50μg (에외적으로 10μg-결과 참조)의 소 또는 돼지 성장 호르몬이 첨가된 0.5ml의 PBS를 매일 주사하였다. 투여전에, 호르몬과 IgG를 혼합하고 실온에서 60분간 방치하였다. 피하 및 견갑골내로 주사하였다. 동물들의 체중을 측정하고 8일간 매일, 각 경우에 있어서 동시에 주사하였다. 9일째 되는 날에 동물의 체중을 측정하고, 마지막으로 마취시킨후, 대동맥 분기로부터 혈액 시료를 채혈하였다. EDTA-혈장을 -20℃에서 동결시키고, 이후 니콜즈 인스티튜트(San Juan Capistrano, CA 92675, 미국)가 공급하는 재료들을 사용하여 상대적인 총 소마토메딘-C 농도를 평가하였다.

[결과]

1. 발육부진 생쥐 모델

제2도, 제3도및 제4도에 요약된 자료로부터, 양의 항-소 (b) 35-53 항혈청과 성장 호르몬의 복합체를 투여한 발육부진 생쥐에게 있어서, bGH 및 대조용의 양 글로불린으로 처치한 것들에 비해 현저히 다량의³⁵S(Na₂ ³⁵SO4로부터)가 늑골의 연골내로 흡수되었음을 알 수 있다. 이러한 현상은 여러 면역처리 절차에서도 일어나며, 복합체형성 이전의 항혈청 희석과도 관련이 있다 (제2도). 이러한 현상은 또한 원형의 돼지 성장 호르몬도 또한 인지하는 소 35-53에 대해 생성된 항혈청이 (상동 호르몬을 인지하는 것보다는 훨씬 더 약함에도 불구하고)이와 복합체를 형성하였을 때 늑골 연골내로의³⁵S의 흡수가 보다 증가되는 것으로부터도 알 수 있다.

2. 뇌하수체 절제된 쥐 모델

성장-관련 모델을 이용하여, 각종 항-펩티드 혈청이 외과수술로 변형시킨 쥐에게 투여시 소 및 돼지의 성장 호르몬의 활성을 보다 증진시킴을 알 수 있다 (제5도 내지 제9도).

이와 같은 시스템에서는 35-53 영역 관련 펩티드에 대한 항혈청이 성장 호르몬에 대한 응답반응 향상의 활성을 갖는 것으로 나타났다 (제7도). 이와 같은 현상은 항혈청이 문제의 표적 호르몬과 결합하는데 있어 제7도에 제시된 바와같이 종간의 장벽을 뛰어넘음을 나타낸다. 결합 능력 또는 친화도가 제한되는 특정한 경우에 있어서는, 글로불린:호르몬의 비를 호르몬-항체 복합체의 비율이 최대가 되게 조절할 필요가 있다 (제8도 참조).

VI. 접합 항체 (소마토스타틴)

[방법]

종래 발표된 시험관내 방법 (Hart외, 1984)을 이용하여, 양의 뇌하수체 세포(일차 배양물)로부터 성장 호르몬 분비에 미치는 항-소마토스타틴 항혈청의 활성을 측정하였다. 항체들의 성장 호르몬 결합 특성들은 분석시에 방해가 되므로, 이들을 소 성장 호르몬이 부착된 친화도 칼럼에 통과시켜 제거하였다. 활성화된 세파로스-CNBr 칼럼은 공급원 (Pharmacia, Milton Keynes, Bucks, 영국)이 제시하는 방법으로 제조하였다.

소마토스타틴-14(시그마)를 면역성(항-소마토스타틴 활성, RIA) 또는 비-면역성(항-35-53 단독)양 혈청 10μl를 함유하는 웰에 5-250 x 10^-11mol/L 범위로 첨가하고, 배치내로의 성장 호르몬 방출 농도에 미치는 상기 펩티드의 억제 활성을 평가하였다.

[결과]

하기 표 4는 소마토스타틴 항체를 함유하는 항혈청내에 첨가시 소마토스타틴의 억제 활성이 얼마나 현저히 저하되는 가를 나타낸 것이다. 소의 35-53+소마토스타틴 접합체에 대해 생성된 항혈청이 2군의 항체 즉, 원형의 소 성장 호르몬에 결합하여 그의 활성을 증진시키는 군 및 원형의 소마토스타틴-14와 결합하여 이를 중화시키는 또 다른 군을 함유한다는 점은 중요한 사실이다.

참고문헌

1. Aston, R., Cooper, L., Holder, A.T., Ivanyi, J., and Preece, M.A. (1985.) Molecular Immunol. 22 271-275

2. Aston, R., Holder, A.T., Preece, M.A. and Ivanyi, J. (1986). J. Endocrinol. 110 381-388.

3. Aston, R., Holder, A.T., Ivanyi, J., and Bomford, R. (1987). Molec. Immunol. 24 143-150.

4. Chard, T. (1987). An Introduction to Radio-immunoassay and Related Techniques. 3rd Edition. Elsevier, Amsterdam.

5. Hart., I.C., James, S., Perry, B.N., and Simmonds, A.D., (1984). J. Endocrinol. 103 173-178.

6. Johnstone, A., and Thorpe, R. (1982). Immuno-chemistry in Practice, Blackwells, London.

7. Spencer, G.S.G. (1986). Control and Manipulation of Animal Growth. pp 179-293, Butterworths, London.

8. Spencer, G.S.G., Garssen. G.J., and Hart, I.C., (1983). Livestock Production Science 10 25-37.

9. Voller, A., Bidwell, D.E. and Bartlett, A.(1979). The Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Dynatech Europe, Guernsey.

Claims (6)

1. 하기의 펩티드들로부터 선택된 펩티드 및 보조제와 담체를 포함하는, 성장 호르몬의 활성을 상승시키기 위한 약학 제제 :

   (1) NH₂-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Art-Tyr-Ser-Ile-Gln-Asn-Thr-Gln-Val-Ala-Phe-Cys-COOH,

   (2) Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-Cys,

   (3) Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Asp-Gln-Arg-Tyr-Thr-Asn-Lys-Asn-Ser-Gln-Ala-Ala-Phe-Cys,

   (4) Thr-Leu-Leu-Pro-Asp-Glu-Arg-Arg-Gln-Leu-Asn-Lys-Ile-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Cys,

   (5) bGH 26-43,

   (6) bGH 35-43,

   (7) bGH 37-48,

   (8) bGH 39-46,

   (9) bGH 43-54,

   (10) bGH 43-61.
2. 제1항에 있어서, 상기 펩티드가 담체에 결합된 제제.
3. 제1항에 있어서, 상기 펩티트가 (a) 펩티드 자체, (b) 제 16항에서 정의된 또다른 펩티드, (c) T-세포 에피토프 또는 (d) 소마토스타틴 분자의 일부 또는 전부에 접합된 제제.
4. 제1항, 제2항, 및 제3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티트가 담체와의 결합 여부와는 무관하게 보조제와 혼합된 제제.
5. 비-인체 척추동물에 제 1항, 제 2항, 및 제 3항중 어느 한 항에 따른 제제를 투여하는 것을 포함하여, 비-인체 척추동물의 생물학적 특성들을 변경시키는 방법.
6. 제5항에 있어서, 체형성 또는 젖 생산 (락토게네시스)을 증진시키기 위한 방법.

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