PT87080B - Processo para a preparacao de moleculas biologicamente activas - Google Patents

Description

A presente invenção refere-se a moléculas bio logicamente activas, mais particularmente pêptidos.

Muitas hormonas polipêptidas sao importantes em medicina ou em criaçao animal, em particular as hormonas do crescimento. As hormonas do crescimento encontram—se em todos os vertebrados, tendo a hormona de crescimento (GH) de cada es pécie, usualmente, uma sequência de aminoácidos ligeiramente diferente da da GH de outra espécie. Falando de um modo geral a molécula contém uma só sequência linear de cerca de 191 aminoácidos. A sequência de aminoácidos da hormona de crescimento humana (hGH) ê descrita por Choh Hao Li em Molecular

N

and Cellular Biochemistry, 46, 31-41 (1932). Conhece-se que as hormonas de crescimento favorecem o crescimento (somatogênese), favorecem a produção de leite (lactogênese) e tem um efeito hipoglicêmico semelhante à insulina.

Conhece-se de EPA-137 234 (Wellcome) que cer tos anticorpos da hormona de crescimento podem potenciar a ac tividade de toda a hormona enquanto que anteriormente se pensava geralmente que os anticorpos, pelo menos in vivo, antago nisariam a acçao da hormona. Podem produzir-se estes anticorpos potenciadores in situ vacinando-se o animal hospedeiro com um fragmento adequado da hormona de crescimento, de modo a criar-se uma classe de anticorpos policlonais de especificida de restringida, que potenciarao a actividade da hormona endógena. Apresenta-se neste primeiro documento um grande fragmen to (7 K) como sendo apto para tal objectivo.

Também se conhece, por exemplo a partir de WO84/O4915 (Amgen), que péptidos correspondendo a porçoes da molécula GH podem ter actividade biológica ótil, em particular para gerar efeitos hipoglicêmicos quando administrados con temporaneamente com insulina exógena· Em WO84/O4915 nao se en sina a administrar tais péptidos numa formaÇao antigênica.Uma vez que o objectivo da administração em WO84/O4915 nao é criar anticorpos contra o péptido.

Descobriu-se agora que certas sequências parciais da molécula GH sao especialmente adequadas para desenvolver anticorpos que potenciarao a actividade da hormona num vertebrado. Estes péptidos sao substancialmente mais pequenos que o fragmento 7& acima referido, e assim pode sintetizar—se mais facilmente e mais economicamente.

A presente invenção fornece um processo de po tenciar o efeito de um péptido biologicamente activo pré-sele ccionado, por exemplo, uma hormona,-num vertebrado. 0 processo usa pequenos péptidos contendo sequências pré-determinadas

de grupos aminoácido que tem homologia estrutural primária com J fragmentos do pêptido biologicamente activo, e caracteriza-se | por se tratar o vertebrado * com uma quantidade pré-determinada | do pequeno pêptido para favorecer o efeito do pêptido biologi !

- i camente activo pre-seleccionado. I

I j

A presente invenção também fornece pequenos | péptidos contendo sequências de aminoácidos de uma hormona de um vertebrado, pequenos péptidos esses que potenciam a activi ' dade da hormona no vertebrado. Tipicamente os péptidos da in- !

A» vençao sao constituídos por cerca de 25 grupos aminoacido ou menos, e mais preferencialmente menos de que 20 grupos aminoá eidos. 0 número de grupos aminoacido que têm homologia estru- tural com a hormona que estão contidos nos pequenos péptidos da invenção ê tipicamente dependente do comprimento do pequeno pé ! ptido e pode variar de uma sequência de poucos grupos aminoá- j eido a uma sequência contendo substancialmente o total do pe- | queno pêptido. Tipicamente a sequência de grupos aminoêcido tendo a homologia estrutural tem de preferência o comprimento de 5 grupos aminoácido e de preferência o comprimento de pelo menos 8 a 10 grupos aminoacido.

í

Tal como aqui se usa o termo potenciar” significa que o pequeno pêptido actua directamente ou indirecta mente para aumentar ou favorecer a actividade da hormona com ί a qual tem a homologia estrutural.

De acordo com isto um aspecto da presente invenção fornece um pêptido tendo homologia estrutural primária com uma sequência de preferência contínua de grupos aminoáci— do de hormona de crescimento bovina na região estendendo-se da posição 35 a 53 ou péptidos antigenicamente equivalentes ou sais seus derivados. I i í

A dita região da GH bovina1 (e ovinal) é:

NH -Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-Gln-Asn-Thr-Gln-Va1-Ala-Ph e-Cy s-COOH.

Por ”homologia estrutural primária” quer-se dizer: péptidos que duplicam precisamente esta região; pêptidos que duplicam regiões correspondentes de moléculas de hormona de crescimento de outras espécies; e outros péptidos que tem pequenas faltas ou substituições conservativas de um ou mais aminoácidos de modo que a configuração terciária do pêptido nao e substancialmente modificada. 0 termo ”substituiçao conservativa” é definido funcionalmente acima. Exemplos de

ÍV substituições que podem ser conservativas neste contexto incluem as que tem substancialmente a mesma hidrofobicidade, ta i manho, carga e/ou aromaticidade que o grupo aminoácido origi- J nal. Todas estas substituições e modificações sao em geral bem conhecidas dos especialistas da arte da química dos péptidos.

Por exemplo_} substituições candidatas incluem: glicina por pro j lina e vice versa; glicina por alanina ou valina e vice versai I leucina por isoleucina e vice versai tiro sina por triptofano e vice versai licina por histidina e vice versai asparagina por serina e vice versai glutamato por arginina e vice versai treonina por cisteína e vice versai treonina por serina ou ala ! nina e vice versai e glutamina por asparagina e vice versa· !

Os seguintes sao exemplos de GH’s nao bovinas que correspondem à região 35-53 da hormona de crescimento bovina. '

Humana 35-53

NH -Tyr-Ile-Pro-Lys-Glu-Gln-Lys-Tyr-Ser- Phe-Leu-Gln-Asn— ’

Pro—Gin—Thr-Ser—Leu—Cys—COOH.

I Porcina e rato 35-53

Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-Gln-Asn-ÀlaGln-Ala-Ala-Phe-Cys

I Avícola (35-53) ί

Thr—Tyr—11e—Pro-G1u— A sp—GIn-Arg-Tyr-Thr-Asn-Ly s-A sn-Ser- <

Gln-Ala—Ala-Phe-Cys

SaImao (ou truta) 31-49

Thr-Leu-Leu-Pro-Asp-Glu-Arg-Arg-Gln-Leu-Asn-Lys-Ile-PheLe u— Le u- A sp-Ph e— Cy s termo antigeneticamente equivalente que _ ** se pode usar o peptido, numa formulação adequada, para desenvolver anticorpos num vertebrado, actuando os anticorpos para

A* potenciarem a acçao da hormona de crescimento nesse vertebrado· Descobriu—se que, em particular, péptidos que sao ligeira mente menores ou maiores que as ditas regiões ou que se sobre poem substancialmente as ditas regiões, por exemplo 30-48 ou 26-43, sao antigeneticamente equivalentes. Os termos ligeira mente menor^', ligeiramente maior e sobrepoe parcialmente designam péptidos nos quais 45% (de preferência 5θ%, 60%, 7θ%» 8θ%, 9θ% ou 100%) do pêptido equivalente se sobrepoe a peio menos 35% (de preferência 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100 %) das ditas regiões 35-53· Em particular, podem usar-se péptidos antigeneticamente equivalentes que sao menores que os ditos fragmentos, por exemplo 35-43 ou 34-48.

A# At

Com relaçao específica embora nao exclusiva com a GH bovina, as seguintes sequências sao uteis na pratica da invenção: 26-43 (Ala-Tyr), 35-43 (Thr-Tyr), 37-48 (Ile-Thr), 39-46 (Glu-Gln), 43-54 (Tyr-Phe) e 43—61 (Tyr-Pro).

Descobriu-se que usar um pequeno peptido da in vençao de uma espécie que nao a do animal a qual o peptido es tá a ser administrado pode ser vantajoso, por exemplo adminis

At trar-se porcina 35-53 a carneiros ou a gado bovino. Variações da sequência da GH do próprio animal podem causar uma resposta imunológica maior, produzindo ainda anticorpos capazes de reconhecer a própria GH do animal.

Além disso, podem usar-se péptidos nos quais um ou mais dos grupos aminoácido sao modificados antes ou depois de se sintetisar o péptido, desde que se tenha em conta que a função do péptido, nomeadamente a da produção de anticorpos específicos in vivo permaneça substancialmente inalte- 5 -

rada. Tais modificações incluem a formaÇao de sais com ácidos ou bases em especial ácidos e bases orgânicos ou inorgânicos fisiològicamente aceitáveis, formaçao de um éster ou de uma amida de um grupo carboxilo terminal, e introdução de grupos protectores de aminoácidos tais como N-ter-butoxicarbonilo. Tais modificações podem proteger o peptido do metabolismo in vivo. Os péptidos podem estar presentes como cópias simples ou m&ltiplas, por exemplo repetições sucessivas tais como 35—53+ 35-53· Essas repetições sucessivas ou móltiplas podem sereias próprias suficientemente antigênicas para obviar o uso de um veículo. Pode ser vantajoso para o péptido existir como estru tura cíclica com os extremos N-terminal e C-terminal ligados entre si, ou adicionarem-se um ou mais grupos Cys a uma extre midade para aumentar a antogenicidade e/oU permitir que se for mem ligações di-sulfureto. Se o péptido se encontrar covalen— temente ligado a um veículo, de preferência um polipéptido, então o arranjo é de preferência tal que o péptido da invenção forma uma estrutura cíclica.

Um segundo aspecto da invenção refere-se a uma composição farmacêutica antigénica caracterizada por conter um ou mais de qualquer dos pÓptidos do primeiro aspecto da inven çao com possibilidade de fornecer funções de veículo e de adju vante.

De acordo com as teorias imunológicas correntes, uma função veículo deve estar presente em qualquer formu laçao imunogénica de modo a estimular ou a aumentar a estimulação do sistema imunológico. Pensa-se que os veículos contêm (ou, em conjunto com o antigene, criam) um epítopo ajudante de célula T. Os péptidos podem estar associados, por exemplo por meio de ligações cruzadas, com um veículo exterior, tal como albuminas de soro, mioglobinas, toxoides bacterianos e hemocianina. Mais recentemente, os veículos desenvolvidos que incluem as células T, ajudam na resposta imunológica incluindo o antigene da hepatite B (também chamado proteína nucleocapsi dica), supostos epítopos ajudantes de células T como Thr-Ala- 6 -

-Ser-Gly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn, betagalactosidase e o pépti do 163-171 da interleuquina-1· O último composto pode conside rar-se como um veículo ou um adjuvante ou ambos. Em alternati va, podem ligar-se entre si por meio de ligações cruzadas, vá rias cópias do mesmo péptido ou de péptidos diferentes de acor do com a invenção neste caso nao há veículo externo, podendo a função de veículo ser fornecida pelas ligações cruzadas. Agentes de ligaçao cruzada (cross-linking’¹) adequados sao os indicados nos catálogos da Sigma e da Pierce, por exemplo glu taraldeído, carbodiimida e 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo, utilizando este último agente o grupo SH no grupo C-terminal da cisteína na região 35-53·

Adjuvantes adequados sao os conhecidos na prá tica da vacinaÇao, por exemplo adjuvante de Freund completo ou incompleto, hidróxido de alumínio, saponina, dextran-DEAE, dipéptido muramilo, óleos minerais, óleos neutros (como migliol), óleos vegetais (como óleo de araquis), Iscorns”, lipossomas, poliois plurónicos do sistema adjuvante de Ribi (vi de, por exemplo, GB-A-2 189 141). Pluronic” é uma marca registada.

péptido da invenção pode ligar—se a outros antigenes de modo a conseguir-se um efeito duplo. Por exemplo, pode ligar-se o péptido com uma parte ou com a totalidade da molécula de somatostatina de modo a criar, para além de anticorpos anti-GH, anticorpos anti-somatostatina promotores de crescimento, ou pode ligar-se a uma parte ou à totalidade de | uma molécula de uma hormona sexual de modo a promover uma imu í nocastraÇao simultânea, ou a uma parte ou à totalidade da hor ί mona que produz a hormona da luteinizaçao (LHRH).

Os péptidos e adjuvantes e/ou veículos podem i formular-se de qualquer modo adequado que pode ser estabeleci do pelo especialista na arte usando veículos e critérios já conhecidos ou ainda a descobrir. Em particular, as formulações podem basear-se em polímeros biodegradáveis como copolí- 7 - í

meros lactido-glicólido, tal como os descritos na EP-A-58418 (ICI).

** i

Um outro aspecto da invenção refere-se a um método de tratamento de um animal vertebrado normal ou anormal, com um pequeno péptido ou com uma composição antigénica como descrito anteriormente, de modo a, por exemplo, aumentar o crescimento desse vertebrado para além dos níveis normais ou a uma velocidade acelerada, para levar níveis de crescimen to anormalmente baixos até ao normal» para aumentar o rendimento em leite ou para aumentar outros efeitos biológicos associados com a GH. A proporção carne magra/gordura num animal ί pode aumentar-se também usando estes métodos. 0 termo verteAí brado abrange seres humanos e nao humanos.

Os pequenos peptidos e composiçoes antigénicas da invenção destinam-se geralmente a administraçao intravenosa, subcutânea ou intramuscular, embora as vias intranasal, transdermal, oral e rectal possam ser também modos de ad j ministraçao convenientes para as formulações da invenção. A I formulação apresenta-se normalmente numa forma estéril e (para uso parenteral) nao pirogénica e a unidade de dosagem contém tipicamente 1 a 1000 ug do pequeno péptido da invenção, normalmente 10 a 5θθ ug, de preferência cerca de 5θ ug ou menos. Pode ser vantajoso proceder-se a uma ou mais imunisaçoes I repetidas, como 6 habitual na arte da imunologia» As formulaçoes podem preparar-se geralmente e/ou administrar-se por um médico ou cirurgião veterinário de acordo com a sua perícia e . A í expenencis.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um í

Aí J processo para a pteparaÇao de um dos peptideos acima menciona dos, por meio de métodos conhecidos de síntese peptídica ou por meio de uma cisão apropriada da molécula de GH nativa. A síntese peptídica pode efectuar-se de acordo com o método geral de Stewart et al, descrito em Solid Phase Peptide Syn- ! thesis (W H Freeman, San Francisco, 19&9) ou pelos métodos j

descritos por Marglin e Merrifield em Annual Reviews of Bioche mistry 39» 841-866 em 862 (1970)» e nos artigos seguintes. Os métodos estabelecidos de síntese peptídica em fase sólida e técnicas similares nao sao norirtalmente adequadas para a produ çao em larga escala (embora o possam vir a ser no futuro) e, deste modo, a produção comercial dos peptidos efectua—se normalmente por cultura de um organismo adequado transformado com uma sequência de polinucleótido que codifica o péptido deseja do, Assim, outros aspectos da invenção referem-se a esses polinucleótido s, a vectores de transformação e de expressão que j suportam esses polinucleótidos, a organismos com eles trans- formados e a processos de cultura desses organismos.

I rvι

Um outro aspecto da invenção refere-se a vertebrados nao humanos cujas características foram alteradas por I métodos de acordo com a invenção.| í

Descrevem-se em seguida exemplos de acordo com I ~ *i a invenção, referentes as figuras anexas, em queí

Figura 1 - mostra os resultados de uma experiência preliminar em rato anao. As barras representam 1 s, d. com 6 animais por tratamento;| !

Figura 2 - mostra os resultados de uma segun- | da experiência com rato anao, na qual se comparou a actividade de IgG (globulina) de dois carneiros 772 (apenas 35-53+FCA) e 775 (35-53 conjugada com KLM + FCA) com OALL a diferentes concentrações de globulina. !

772 limpo = 10,5 mg de proteína/mlj 775 = 9,6 mg de proteína/id, 0A11 s 5 mg de proteína/ml. Barras = 1 s· d. j n=6j |

Figura 3 - mostra os resultados de uma tercei i ra experiência em rato anao, mostrando a actividade de globulinas de diferentes carneiros, todos tratados 35-53 ligado a | X + FCA (4600, 4609, 4602, 4612, 4610) ou do controle de imunização negativo (4660, 4608). Barras = 1 s.d., n=6j

Figura 4 - mostra como antisoros cultivados B35-53 de diferentes modos podem, em certos casos, ligar-se hormona de crescimento bovino e à molécula de porcina. A afinidade para a última é cerca de 10 vezes menor. Mostram-se os

A ** tesultados de uma experiencia em rato anao. Barras β 1 s. d. , n=6;

em * a

Figura 5 - mostra os resultados de uma experiencia num rato que sofreu hipofisectomia, efectuada como des crito a seguir, mostrando o ganho de peso de grupos (n=b) de ratos durante um período de 9 dias. As barras representam 1 s. d. Todos os tratamentos receberam hormona.

• anti-soros anti—bovinos 35-53 retirados de 4 carneiros imunizados, positivos para a LigaÇao da hormona de cres cimento bovino (RIA).

x anti-soros como acima, de um dos quatro carneiros.

o anti-soros de controlo negativo.

H anticorpo monoclonal (tratado como anti-soro) 0A15·

Q anticorpo monoclonal 0A17 (vide Aston et al, 19^6);

Figura 6 - mostra o resultado de uma outra ex periencia em rato que sofreu hipofisectomia.

A: imunoglobulina de carneiro — controlo.

Bí anti-soro anti-35-53» carneiro 1064, 5 mg/ml.

Cí anti-soro-35-53, carneiro 1064, 15 mg/ml. Limpo.

As barras representam 1 s. d., n=6;

Figura 7 - mostra os resultados de uma nova experiência em rato que sofreu hipofisectomia, nomeadamente uma comparaçao de anticorpos antipeptídicos conjugados com ovalbumina ou com somatostatina.

As barras representam 1 s.d., n=6.

Complexou-se cada uma destas preparações de globulina com hor mona de crescimento bovino antes de se proceder à administraçao aos ratos.

Figura 8 - mostra os resultados de uma outra ex periencia em rato que sofreu hipofisectomia, ilustrando como a

35-53 anti-bovina também pode aumentar a hormona de crescimen ! to porcino; administrou-se aos ratos apenas uma dose de 15 ug por dia, mantendo-se o nível habitual de anti-globulina· As barras representam 1 s. d. , n=6;

Figura 9 - mostra os resultados de uma outra experiência em rato que sofreu hipofisectomia, na qual se tra i taram os ratos com anticorpos antipeptidicos, cultivados numa variedade de péptidos relacionados com a molécula bovina ou j porcina. Complexaram-se todos com hormona de crescimento por- j cino antes de se proceder a administraçao aos ratos. As barras representam 1 s. d. , n=6. |

MÉTODOS

Preparaçao de péptidos I

Todos os péptidos se sintetizaram pelo método da poliamida-Fmoc da síntese peptídica em fase sélida. ;

( i ί

A protecçao temporária do grupo N^-amino efe- ι ctua-se por meio do grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). A cisão repetitiva deste grupo protector altamente reactivo em meio básico efectua-se usando piperidina a 20% e Ν,Ν-dimetil- i

I formamida.

i w ί

As funções existentes como cadeias laterais protegem-se na forma dos seus éteres de butilo (no caso da se ί rina, treonina e tirosina), esteres de butilo (no caso do áci do glutâmico e do ácido aspártico), derivado butiloxicarbonilo (no caso da lisina e da histidina), derivado tritilo ( no j caso da cisteína) e derivado 4-metoxi-2,356-trimetilbenzenosulfonilo (no caso da arginina). Nos casos em que a glutamina ou a asparagina sao grupo C-terminais, utiliza-se o grupo ^^•-dimetoxibenzidrilo para a protecçao das funções amido das cadeias laterais.

suporte de fase sólida baseia-se num políme

ro de polidimetilacrilamida constituído pelos três monómeros dimetilacrilamida (monómero base), bis-acriloiletileno diamina (agente de ligaçao cruzada (cross linker”)) e éster metílico da acriloilsarcosina (agente funcionalizante).

í 0 agente ligado removível péptido-resina utii lizado ê o derivado reactivo em meio ácido do ácido 4-hidroxi i metilfenoxiacêtico.

Todos os derivados de aminoâcido se adicionam na forma dos respectivos derivados de anidrido simétrico com j a excepçao da asparagina e da glutamina que se adicionam por ¹ meio de um processo de acoplamento reverso N,N—diciclohexilcarbodiimida/l-hidroxibenzotriazole.

I i I

Todas as reacçoes de acoplamento e de despro- , tecçao se seguem usando os processos de teste da ninidrina, ácido trinitrobenzenosulfónico ou isotina.

ApÓs terminada a síntese, os pêptidos removem !

— ! -se do suporte de resina com a remoção concomitante dos grupos protectores da cadeia lateral, por tratamento com ácido trifluoroacético a 95% contendo 5% de uma mistura de captores, j A*

Os captores geralmente utilizados sao etanoditiol, fenol, ani sole e água, dependendo a escolha exacta dos aminoácidos cons tituintes do pêptido a sintetizar. 0 ácido trifluoroacético *** . A* I remove-se por evaporaçao em vácuo, seguida por trituração com j éter dietílico, obtendo-se o pêptido bruto. Os captores presentes removem-se por um simples processo de extracçao após o qual, por liofilizaÇao da fase aquosa, se obtêm o pêptido bru to livre de captores.

** Λ i

A purificação pode efectuar-se por uma técnica ou por uma combinação de técnicas, como cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de permuta iónica e, principalmente, cromatografia líquida de alta perfomance em fase reversa.

cromatografia em camada fina, cromatografia líquida de alta perfomance em fase reversa, análise de aminoácidos após hidró lise ácida e por espectrometria de massa com bombardeamento com átomos acelerados (FAB), como e conhecido dos especialistas na matéria.

X. EXPERIÊNCIAS EM CARNEIROS: PRELIMINAR

Métodos: 1:PreparaÇao da composição imunogénica

Ligaçao (cross-linking) a hemocianina usando glutaraldeldo:

Dissolveram-se 10 mg do péptido (sequência 35-53 ovina/oovina) em 5θθ ul de dimetilformamida, e misturaram-se com 10 mg de hemocianina em 400 ul de tampao 0,05 M de fosfato a pH 7,8. Adicionou-se gota a gota durante uma hora 1 ml de uma solução 0,02M de glutaraldeldo em tampao de fosfato 0,05M a pH 7,8, com agitaÇao à temperatura ambiente. Deixou-se a mistura com agitaçao a temperatura ambiente durante mais tres horas e di? lizou-se depois com uma solução salina tamponizada com fosfato a pH 7,2.

•tf

Misturou—se metade da preparaÇao com o dobro do volume de adjuvante de Freund completo e injectou-se em dois carneiros em locais subcutâneos múltiplos. 28 dias mais tarde emulcionou-se do mesmo modo p segunda metade da prepara ção e injectou-se em adjuvante de Breund incompleto. Sangraram -se os carneiros em intervalos semanais durante a imunização, tendo-se obtido a resposta óptima de anticorpos cerca de 14 •tf dias depois da segunda imunização.

2. Ensaio radioimunológico do soro de carneiro

A produção de anticorpos pelos carneiros após a imunização com o fragmento peptídico 35-53 da CH determinou -se num ensaio de ligaçao directa em fase líquida com

125 » essencialmente da forma descrita anteriormente (Aston et al, 1985).;

i

3· Ensaio de crescimento

I

Os antisoros peptídicos promotores de cresci- ; / \ *** \I mento (anti-35-53) testaram-se em relaçao a sua actividade, após preparaÇao de f-globulinas a partir dos soros, utiiizan^uί

Λ»I do como modelo de crescimento o rato anao, como descrito an- j teriormente (Aston et al, 19®®» 1987)·|

I

Resultadosi j i soro de carneiros imunizados com péptidos ! derivados de GH bovina/ovina testaram-se em relaÇao a sua li— ~ 125 gaçao a Ι-bGH e aos seus efeitos na bioactividadeda bGH in vivo. Administrou-se a ratos anoes bGH em complexo com antisoro anti-35-53 θ verificou-se que eles cresciam significativamente melhor dos que os tratados com bGH e com o controle de globulina de carneiro.

Os resultados apresentam-se na figura 1.

II- EXPERIÊNCIAS EM CARNEIROS: INVESTIGAÇÃO

I Métodos: 1. ConjugaÇao com ovalbumina ou com hemocianina (KLH) ;

Dissolveu-se 1,4 mg de péptido (por exemplo,

35-53 bovina) em 140 ul de dimetilformamida. Adicionou-se 7θ ul de uma solução salina de 10 mg/mi de ovalbumina ou KLH em meio de Dulbecco tamponizado com fosfato (PBS) e agitou-se vi gorosamente. Adicionou-se lentamente 200 ul de glutaraldexdo 0,04 M recentemente preparado, com agitaÇao, durante um perxo do de 10 minutos, deixando-se depois à temperatura ambiente durante mais 6θ minutos. Adicionou-se·0,7 ml de PBS e em seguida uma nova quantidade de 100 ul de glutaraldexdo 0,04 como anteriormente. Deixou-se a mistura durante 6ϋ minutos a tem [ peratura ambiente antes de se proceder a dialise durante a nox i

I

Dissolveu-se 1,4 mg de péptido em 140 ul de di metilformamida e adicionou-se 170 ul de glutaraldeído 0,í)4M como anteriormente. Procedeu-se em seguida como descrito acima· Se nao se pretendesse eíectuar uma ligaçao cruzada ou uma conjugação dissolvia-se o péptido em dimetilformamida, disper ·

Λ* / i sa em PBS, mas nao se efectua dialise. I

3· Controlos negativos

Preparam-se contrdos negativos paralelos às ex periências anteriores, nao utilizando péptido com ovalbumina (ou KLH) ou usando poli-lisina (peso molecular 1000-2000 Da) e efectuando o ''cross-linking”.

4. Adjuvantes e administração - Freunds

I

Após a diálise, perfizeram-se os volumes das preparações anteriores a 4,5 ml com PBS e preparam-se emulsões i oleosas em água usando dois volumes de adjuvante completo de I Freund (FCA) (Difco ou Sigma)# Tal conseguiu-se por sonificaÇao a frio ou usando um homogeneizador de Potter - Elvehjen. As emulsões testaram-se por dispersão (ou ausência desta) a superfície da água. Administraram-se as injecçoes por via sub cutânea em dois locais (um de cada flanco) a carneiros Cheviot (9-12 meses de idade, machos castrados, 3θ — 35 Kg). Admi- !

i nistrou-se 1 ml em cada local. Efectuou-se uma segunda imuni- j zaÇao semelhante usando peptido recentemente preparado conju- I gado do mesmo modo mas emulsionado em adjuvante incompleto de Freund (FIA) (Difco ou Sigma). Todas as imunizações subsequen tes se efectuaram do mesmo modo, mas com intervalos de 28 dias

5· Adjuvantes e administraÇao - Outros

Utilizaram-se dextron - DEAE (completamente hi

dratado durante a noite em água duplamente destilada) (Píiarma cia), saponina (Sigma) e hidrogel de alumínio, quer isolada•w - _ «W mente quer em combinações. Apos dialise, fizeram-se adições de 3,1 ml de PBS, mais 7 ml de dextron - DEAE a 5% (Dd), mais2,8 ml de saponina a 5 mg/mlj ou de 5>9 ml de PBS, mais 7 ml de Dd a ou de 10,1 ml de PBS, mais 2,8 ml de saponina a 5 mg/ml.

Quando apropriado, usou-se alumínio (’ΆΙΟΗ) a uma concentração final de 1,0 mg/ml.

Nao foi necessário proceder a emulsionaçao mas houve o cuidado de manter os constituintes em suspensão homogénea. Administrou-se 1 ml aos carneiros acima mencionados do modo descrito. As imunizações ocorreram com os mesmos interva los de tempo.

6. Amostras de sangue

Retiraram-se amostras de sangue de 10 ml por venopunctura jugular dos carneiros em teste, imediatamente an tes de qualquer administração e em seguida em intervalos de três vezes por semana· Após deixar-se coagular à temperatura ambiente (cerca de 5 horas) removeu-se o soro apÓs centrífuga çao e efectuou-se imediatamente o ensaio radioimune para dete cçao de anticorpos. Recolheram—se do mesmo modo amostras maio res de soro, de aproximadamente 15θ ml de sangue e congelaram -se a -20°C para posterior fraccionamento e uso em ensaios de crescimento.

7· Ensaio radioimune

A detecçao dos anticorpos aos peptidos que se ligariam também à hormona de crescimento bovino, efectuou-se por ligaÇao directa em fase líquida como descrito anteriormen te (Aston et al, 19θ5; Chard, 1987)·

Resultados

A tabela 1 resume os resultados das experiên16 -

cias em carneiros e mostra a superioridade do FCA com a maior parte dos conjugados (ou só com o péptido) usando o péptido 35-53· Pequenas variações como na porcina 35-53 introduzida nos carneiros mostraram ainda um melhor nível de resposta (bem como o nível actual, nao apresentado)· Os péptidos com uma se quência semelhante (mas incluindo-a) à 35-53 ou que a contêm, deram origem pelo menos a respostas moderadas.

Tabela 1 Ensaio radioimune para detectar anticorpos em soro de carneiros capazes de se ligarem bovino intacta, em fase líquida.

Tratamento

Conjugado Adjuvante à hormona de crescimento i

I

I i

% de respostas após 56 diasi com uma concentração de | t

1/1000 ou mais (n=5) |

35-53 bovina	variações:
KLH	FCA	60
KLH	AloH	nenhuma
KLH	Saponina	20
KLH	Dd	20
KLH	Dd+AIOH	20
Ovalbumina	FCA (sónicada)	20
1!	*FCA	80
ti	A10H	20
H	Saponina	60
II	Dd	nenhuma
11	Dd+AIOH	80
Com ligaÇao cruzada	FCA	80
lt	Saponina	20
lt	Dd+Saponina	80
1!	só Dd	20
Nenhum	FCA	4o
	A10H	20

Saponina

Dd

Dd+A10H

Outros péptidos - todos os bovinos acima mencionados (salvo indicaçao em contrário) conjugados com ovalbumina e administrados em FCA.

46-61	Cys	60
43-53		20
35-43	Cys	20
35-53	porcina	100

Salvo indicaçao em contrário, as emulsões preparam-se por tosquia.

III - EFEITOS IMUNOESTIMULATÔRIOS

............... ... ......MUI fM III· |

Ι Método j i

Efectuou-se uma experiência para demonstrar ¹ que a sequência 35-53 (ou sequências análogas ou com elas re- : lecionadas) se podia ligar a outro péptido ou a outra molécula de interesse imunolégico e melhorar-se a resposta de ambos os péptidos.

i

I í _A í

Neste contexto, e com relevância especial pa- | ra o papel da imunoneutralizaÇao em animais, seleccionou-se a I i somatostatina para fins ilustrativos e pela dificuldade em cul j tivar anticorpos efectivos na imunoneutralizaÇao (vide Spencer, 1986).

Usando sometostatina (1-14) (Sigma) efectuou- ¹

I -se a conjugação como descrito acima (II-I), exceptuando que se adicionou- a somatostatina numa concentração de apenas 4mg/ ml e que n_ao se procedeu a di&lise em qualquer dos tratamentos. Todos os outros conjugados se prepararam como descrito acima (II-I).

Os ensaios radioimunológicos para os anticorpos ligados à hormona de crescimento efectuaram-se como anteriormente (11-7) para a somatostatina, como descrito por Spen

125 * cer et al, (1983) usando Tyr-somatostatina marcada com I.

Resultados

Os resultados resumidos na Tabela 2 ilustram a habitual dificuldade em conseguir bons níveis de anticorpos rw S A na somatostatina e como a ligaÇao cruzada a sequencia 35-53 bovina (nao apenas cross-linking” interno) prevalece marcada mente em relaçao a própria tolerância.

Tabela 2 Ensaios radioimunes para anticorpos à hormona de crescimento bovino intacta e/ou à somatostatina, após um pro•W /tf cesso de imunização utilizando a-conjugação 35-53-somatostati na·

Tratamento	% de produtores de anticorpos (n=5) reconhecendo
bGH	Somatostatina
M 35-53 com ligações cruzadas	: FCA	80	nenhum
	FIA	nenhum	nenhum
	Dd+Saponina	80	nenhum
Somatostina com
ligações cruzadas	: FCA	nenhuma	40
	FIA	nenhuma	nenhuma
	Dd+Saponina	nenhuma	nenhuma
35—53 mais
Somatostatina	: FCA	80	80
	FIA	40	60
	Dd+Saponina	80	40
Ligado à somatostatina	: 35-43 Cys	60	4o
(vide Tabela 1)	43-53	40	40

IV - EXPERIÊNCIA EM PORCOS

Métodos

1. Geral

Introduziu-se a sequência 35-53 mais o epitope de células T descrito anteriormente, em porcos, após disso luçao em dimetilformamida, dispersão em PBS (vide II-2) e emul sionaçao em FIA. Nesta sequência nao se utilizou conjugação ou ! cro s s— linking ·'.

péptido assim preparado administrou-se por via sub-cutânea em 4 locais na região do pescoço de leitões White (5 semanas de idadej cerca de 9 kg de peso corporal) de modo a introduzir 5θθ ug de péptido por porco. Efectuou-se uma segunda imunização, com uma preparaÇao semelhante, 28 dias mais tarde. Nesta ocasiao todas as administrações se fizeram em FIA. Recolheram-se amostras de sangue imediatamente antes desta imunizaÇao e em seguida semanalmente, por venepunctura assistida por vácuo (Corvac, Sarstadt, U.K.) da veia pulmonar. Testaram-se os soros para reconhecimento do anticorpo da hormona de crescimento porcino, por meio de um ensaio imunosorvente ligado a um enzima (ELISA) baseado em Voller, 1979» ao qual se fez em seguida uma ligaÇao cruzada, por competição, num ensaio semelhante, com hormona aquosa.

2. ELISA

Cobriram-se placas de 96 orifícios, tratadas para consistência em ensaio imunolÓgico (Nunc, Immuno-quality, High-binding capacity), usando 50 ug de hormona/ml a 5 ug.ori fício (100 ul) em tampao de carbonato de sódio/bicarbonato de sódio 0,05M, a pH 9»5> e deixaram-se em repouso durante a noi i »0 *** te a +4 C. Removeu-se cuidadosamente a solução de hormona e lavaram-se os orifícios uma vez com PBS. Adicionou-se uma solução de hemoglobina a 3% para bloquear os orifícios e deixou-se durante a noite a +4°C. Removeu-se esta solução a lava / í

ram-se os orifícios três vezes com PBS e Tween 0,05%· Deixa ram-se secar as placas lentamente à temperatura ambiente e ar mazenaram-se a -20°C individualmente embrulhados em fita aderente· Adicionaram-se os soros a testar a cada um dos orifícios em diluições de 1/50 e depois loglO (100 ul) e deixou-se durante 2 horas à temperatura ambiente. Removeram-se e lavaram—se os orifícios três vezes com PBS, e encheram-se com 100 ul de conjugado de fosfato alcalino IgG de coelho anti-porco (Sigma) a uma diluição de 10 . Removeu-se este e lavou-se co mo anteriormente. Adicionaram-se 100 ul de fosfato de p-nitro fenilo a 1,0 mg/ml e leram-se as absorvancias dos orifícios usando Titertek Multiscan Plus 2 com filtro de 405 nm.

Resultados

A Tabela 3 mostra que a presença de anticorpos que reconheceram a hormona de crescimento porcino (competindo esta com a hormona aquosa) se pode detectar num determi nado número de porcos.

Tabela 3 Anticorpos anti-pGH em porcos imunizados com pêpti do, apús 42 dias, medidos pela técnica ELISA % de animais positivos (n=6) ¹/^oo *

100 100

V - ENSAIOS BIOLÓGICOS DA ACTIVIDADE DA GH

Métodos

1. Preparações de imunoglubulinas

Fraccionaram-se soros provenientes de amostras de sangue maiores, recolhidas de determinados animais (indicados pelos ensaios imunolúgicos), por meio de precipitação com

Tratamento Peptídico epítope de célula T 35-53 diluição dos anti-soros.

sulfato de sódio (Johnston e Thorpe, 1982) para isolar princi palmente as gama-globulinas (IgG) que se dialisaram extensiva mente com PBS antes de se recongelarem a -20°C. Antes de se

A *** usarem em experiencias com animais, reticularam-se as fracçoes de IgG purificadas para detectar os efeitos da precipitação, caso presentes· j

A#

2. Rato anao i 1

Este método consiste na incorporação de í na cartilagem da costela do rato anao (deficiente em pituitária) e encontra-se descrito em Aston et al, 1986.

3. Rato com hipofisectomia

Tornaram-se estes animais deficientes em pituitária (hipófise) por remoção cirúrgica. 0 ensaio testa o efeito global da hormona no peso corporal do rato bem como os níveis circulatórios da somatomedina-C.

I i i

A cirurgia em ratos Wistar machos foi efectua da por Charles River U.K. limited (Margate, Kent, U.K.) e for neceu após 14 dias uma gama de pesos de 125-145 g. Pesaram-se e observaram-se durante mais 7-10 dias, para assegurar um peso corporal estável e características físicas (por exemplo o nao aparecimento de testículos) consistentes com boa saúde e cirurgia completa. Dispuseram-se aleatoriamente os animais sa tisfatórios de modo a obter-se seis animais por tratamento. Injectaram-se estes diariamente com 0,5 ml de PBS contendo aproximadamente 1 mg de IgG de carneito do tratamento de imunização em estudo (incluindo comtrolos negativos), ao qual se adicionam 50 ug (excepcionalmente 10 ug — vide resultados) de hormona de crescimento bovina ou porcina, conforme o caso. An tes da administraçao, misturaram-se a hormona e a IgG e deixa ram-se em repouso à temperatura ambiente durante 60 minutos. · As injecçoes efectuaram-se por via subcutânea e intraescapular Pesaram-se e injectaram—se os animais diariamente durante 8

dias, à mesma hora do dia em cada ocasiao. No nono dia, pesa— ram-seos animais, anestesiaram-se e retirou-se-lhes uma amos tra de sangue da bifurcação aortica. Congelou-se o plasma-EDTA a -20°C para determinação subsequente dos níveis de Somatomedina-C totais relativos, utilizando materiais fornecidos pelo Nichols Institute (San Juan Capristano, CA 92675, USA).

Resultados

1. Modelo do rato anao

Pelos resultados sumarizados nas figuras 2, 3 e 4 pode ver-se como os ratos anoes tratados com hormona de crescimento em complexo com anti-soros anti-bovinos de carnei ro (b) 35-53 incorporam quantidades significativamente maio— res de ''S (de Na₂ ^SO^) na sua cartilagem costal do que os i tratados com bGH e com globulina de carneiro como controlo.Is to resulta da variedade dos processos de imunização e está re lacionado com a diluição dos anti-soros antes da complexaçao (Figura 2). Pode também verificar-se este fenómeno, quando um anti-soro cultivado em 35-53 bovina, que também reconhece a hormona de crescimento porcina intacta (contudo muito mais fra camente do que reconhece a hormona homóloga), se encontra com ~ 35^- plexado com ela, verificando—se uma maior incorporação de S na cartilagem costal.

2. Modelo do rato com hipofisectomia

Por meio de um modelo de crescimento pode verificar-se (Figuras 5-9) que um grande número de soros antipe ptidicos aumentam a actividade das hormonas de crescimento bo vina e porcina, quando administrados a estes ratos cirúrgica- ¹ mente modificados.

Neste sistema, os anti-soros aos peptidos re- i lacionados com a região 35-53 sao activos no aumento da resposta à hormona de crescimento (Figura 7)· Este fenómeno ven23 -

ce certas barreiras, como indicado (Figura 7) desde que os an ti-soros se liguem a hormona desejada em questão. Em certos casos, se a capacidades de ligaçao ou a afinidade forem limitadas, pode ser necessário ajustar a razao globulina/hormona para maximizar a proporção dos complexos hormona/anticorpo, como se mostra na Figura 8.

VI - ANTICORPOS CONJUGADOS (SOMATOSTATINA)

Método

Usando o método in vivo prèviamente descrito (Hart et al, 1984) mediu-se a actividade dos anti-soros anti-somatostatina sobre a libertação da hormona de crescimento a j partir das células de pituitária ovina (em cultura primária).

** X í

Uma vez que as propriedades de ligaÇao a hormona de crescimen to, dos anticorpos, interfeririam com o ensaio, removeram-se i estes através da passagem por uma coluna de afinidade à qual se tinha ligado a hormona de crescimento bovino. Preparou-se uma coluna de Sepharose-CNBr activada do modo descrito pelo í i fabricante (Pharmacia, Milton Keynes, Bucks, U.K.).

Adicionou-se Somatostatina-14 (Sigma) aos orifícios em 10 ul de soro de carneiro imune (actividade de anti -somatostatina por RIA) ou nao imune (apenas anti-35-53), na gama de 5-25θ^χ1θ mol/1, e determinou-se a actividade inibi téria deste péptido sobre os níveis de libertação da hormona de crescimento no meio.

Resultados i

A Tabela 4 mostra claramente como a actividade inibitória da somatostatina, adicionada num anti-soro con tendo anticorpos da somatostatina, é nitidamente reduzida. As j sim, é importante verificar que o anti-soro desenvolvido con- I tra o conjugado 35-53 bovina+somatostatina, contém duas populações de anti-corpos - uma que se liga à hormona de cresci- ! mento bovina intacta e que aumenta a sua·actividade e outra

que se liga à somatostatina-14 intacta e que a neutraliza.

Tabela 4 Efeito da somatostatina sobre as células de pituitá ria ovina crescidas em cultura primária como descrito por Hart et al, 1984

Nível de somatostatina

125

250 % média de inibição da libertação da GH apenas anti-soros anti-35-53 anti-soros antisomatostatina

Referencias

1. Aston, R. , Cooper, L. , Holder. A.T. 5 Ivanyi, J. , and

Preece, Μ. A. (1985)· Molecular Immunol. 22 271-275·

2. Aston, R. , Holder, A.T. , Preece, M.A. , and ¹

Ivanyi, J. (1986) J. Endocrinol. 110 381-388.

i

3. Aston, R. , Holder, A.T. , Ivanyi, J. and Bomford, R.

(1987). Molec. Immunol. 24 143-150. ;

4. Chard, T. (1987)· An Introduction to Radioimmunossay and j

Related Techniques. 3**d Edition. Êlsevier, Amsterdam.

I

I

5. Hart, I.C., James, S. , Perry, B.N. , and Simmonds, j

A.D. , (1984). J. Endocrinol. 103 173-178. i

6. Johnstone, A., and Thorpe, R. (1982). Immuno- chemistry in Practice, Blackwells, London.

7· Spencer, G.S^G. (1986). Control and Manipulation of

Animal Growth. Pp 179-293» Butterworths, London.

i

8. Spencer, G.S.G. , Garssen, G. J. , and Hart, I. C. , (1983). Livestock Production Science 10 25-37· i ί

I

9· Voller, A., Bidwell, D.E. and Bartlett, A. (1979)·

The Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Dynatech j

Europe, Guernsey.

ANEXO

FIGURAS

N. do T.ί As legendas das figuras encontram-se traduzidas em seguida· As abcissas e ordenadas dos gráficos e pa lavras contidas nas próprias figuras encontram-se traduzidas no próprio original.

Figura 1: Experiência preliminar em rato anao. As barras re- < presentam 1 s.d. com 6 animais por tratamento. ί ί

I

A ***

Figura 2. Experiência em rato anao em que se compara a actividade da IgG (globulina) de dois carneiros 772 (apenas 35- i -53+FCA) e 775 (35-53 conjugada com KLH+FCA) com 0A11 a diferentes concentrações de globulina. 772 limpo=10,5 mg de proteína/mlj 775-9,6 mg de protelna/mi; 0Α11=15 mg de proteina/ml Barras=l s. d. j n=6

Figura 3: Experiência em rato anao, mostrando a actividade I de globulinas de diferentes carneiros, todos tratados com 35-53 ligada a X+FCA (4600, 4609, 4602, 4612, 4610), ou do controlo de imunização negativo (4660, 46o8). Barras=l s.d.J n=6

Figura 4: Anticorpos desenvolvidos em b 35-53 de diferentes ί modos, podem, em certos casos, ligar-se à hormona de cresci- í mento bovino e à molécula de porcina. A afinidade para a últi ma è cerca de 10 vezes menor. Mostram-se os resultados de uma experiência em rato anao. Barras= 1 s.d.J n=6

Figura 5» Experiência em rato que sofreu hipofisectomia. Efe cbuada como descrito no texto, mostrando o ganho de peso de grupos (n=6) de ratos durante um período de 9 dias. As barras ' j

representam 1 s.d.. Todos os tratamentos receberam hormona.

φ anti-soros anti-bivinos 35-53 retirados de 4 carneiros imu a* nizados, positivos para a ligaçao da hormona de crescimento bovino (RIA) x anti-soros como acima, de um dos 4 carneiros

O anti-soros de controlo negatico φ anticorpo monoclonal (tratado como anti-soro) 0A1?

Q anticorpo monoclonal 0A17 (vide Aston et al, 1986) i

Figura 6: Experiência em rato que sofreu hipofisectomiaj i

A; imunoglobulina de carneiro de controlo|

B: anti-soro anti-35-53> carneiro 1064, 5 mg/ml

C: anti-soro anti-35-53» carneiro 1064, 15 mg/ml (limpo)

As barras representam 1 s. d. j n=6

Figura 7: Experiência em rato que sofreu hipofisectomia. Comparaçao de anticorpos anti-peptídicos conjugados com ovalbumina ou com somatostatina.

As barras representam 1 s. d.j n=6 i

Complexou-se cada uma destas preparações de globulina com hor mona de crescimento bovino antes de se proceder à administraçao aos ratos.

!

Figura 8: Experiência em rato que sofreu hipofisectomia. Mos tra como a 35-53 anti-bovina também pode aumentar a hormona de crescimento porcino. Administrou-se aos ratos uma dose de í apenas 15 ug por dia, mantendo-se o nível habitual de anti-globulina.

As barras representam 1 s. d. j n=6

Figura 9'· Experiência em rato que sofreu hipofisectomia· Tra _t ~ I taram-se os ratos com anti-corpos antipeptidicos em relaçao a ; uma variedade de péptidos relacionados com a molécula bovina.

Complexaram-se todos com hormona de crescimento porcino antes j \ *** de se proceder a administração aos ratos.

Claims (1)

1. Processo para a preparaçao de um pêptido de ; estrutura primária homóloga à da sequência de aminoácidos da

   A* hormona de crescimento bovino na região entre as posiçoes 35 e 53, ou de póptidos antigènicamente equivalentes, ou dos res pectivos sais, caracterizado por se efectuar a síntese peptidica

   a) pelo método da fase sólida, utilizando como suporte sólido um polímero de polidimetilacrilamida, fornecendo os amino— ácidos na forma dos seus anidridos simétricos com os grupos amino temporariamente protegidos pelo grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) separável após acoplamento por tratamento com uma solução de piperidina a 20% em N,N-dime tilformamida, utilizando ainda os aminoácidos protegidos em outras funções laterais quando estas existam, e procedendo finalmente, após síntese completa, à separaçao do pê ptido do suporte e à desprotecçao dos grupos laterais, por meio de tratamento com uma mistura de 95% de ácido trifluo roacêtico e 5% de um captor como etanoditiol, fenol, aniso le ou água» ou

   b) por meio de cultura de organismos adequados transformados com uma sequência de polinucleótidos codificante para o pê ptido desejado.

   - 2® - ** A

   Processo para a preparaçao de uma sequencia de polinucleótidos que codifique um péptido tal como definido na reivindicação 1, caracterizado por se sintetizarem quimica mente os nucleótidos necessários, se efectuar a biossintese do respectivo cDNA, ou de proceder a selecçao por meio de mRNA ou de outras sondas adequadas.

   - 3* -

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um páptido seleccionado de entre os seguintes!

   (a) NH —Tyr-Ile-Pro—Lys—Glu—Gin—Lys—Tyr—Ser—Phe-Leu-Gln-Asn— -Pro-Gln-Thr-Ser-Leu-Cys-COOH.

   (b ) NH -Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile-Gln-AsnM

   -Thr—Gin—Va1-Ala—Phe—Cys—COOH.

   (c) Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg~Tyr-Ser-Ile-Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe—Cys.

   (d) Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu—Asp-Gln—Arg-Tyr-Thr-Asn-Lys-Asn—Ser- —Gin—Ala-Ala-Phe-Cys.

   (e) Thr—Leu—Leu—Pro—Asp—Glu—Arg—Arg—Gin—Leu—Asn—Lys—Ile—Phe— —Leu—Leu-Asp—Phe—Cys.

   ou pèptidos antigènicamente equivalentes ou os respectivos sais.

   - 4a -

   Processo de acordo com a reivindicação 1, ca— racterizado por se preparar um pêptido seleccionado de entre os seguintes pêptidos!

   (f) bGH 26-43 (g) bGH 35-43 (h) bGH 37-43 ^··......

   (i) bGH 39-46 (j) bGH 43-54 (k) bGH 43-61 ou os análogos humanos, avícolas de salmao ou porcinos dos pê ptidos (f) a (k), ou os sais de quaisquer deles.

   _ ₅< _

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um pêptido de estrutura primária homóloga à do pêptido preparado de acordo com as reivindicações 2 ou 3, ou um dos seus sais.

   — ó a — <w

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um pêptido que coincide em pelo menos 45% com pelo menos 35% do pêptido preparado de acordo com a reivindicação 2, ou de um pêptido de estrutura primária homóloga à deste.

   - 7» Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por se preparar um pêptido contendo entre 5 è 20 unidades de aminoácido.

   - 8a Processo de acordo com qualquer das reivindi—

   30 caçoes anteriores, caracterizado por se preparar um pêptido conjugado com (a) ele próprio, (b) um outro pêptido, preparado de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, (c) um pêptido de célula—T ou (d) uma parte ou a totalidade da mo lêcula de somatostatina.

   - 9« ~

   Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica antigênica, capaz de alterar as características biológicas de um animal vertebrado, como por exemplo, aumentar a somatogénese ou a lactogénese, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um pêptido, quando preparado de acordo com quaisquer das reivindicações anteriores , com substancias que desempenhem as funções de adjuvante e de suporte.

   - IO Processo para a preparaçao de uma composição A ** farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por se ligar o pêptido a um suporte.

   - lia Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica, de acordo com as reivindicações 9 ou 10, caracterizado por se misturar o pêptido, ligado ou nao a um supor te, com um adjuvante.

   - 12® 31 Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por se obter um péptido codificado por uma sequência de polinucleótidos.