KR20220062080A - 전립선암 치료를 위한 면역요법 - Google Patents

전립선암 치료를 위한 면역요법 Download PDF

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KR20220062080A
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케이쓰 더글라스 밀러
로버트 보그덴
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헥사머 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은 테스토스테론 수준을 감소시켜 전립선암 세포 성장 및/또는 전이를 약화시키거나 제거할 수 있는 대상체에서 GnRH 수준을 중화하기 위한 GnRH 치료제를 기술한다. 치료제는 합성적으로 생산된다. GnRH 치료제는 GnRH 펩티드와 별도로 합성된 단량체 펩티드(MP)를 포함하는 합텐 담체(hC)를 포함하며, 이어서 hC의 자가-조립 후 GnRH는 공유 결합되어 치료제로서 기능할 수 있는 GnRH-hC 접합체를 형성한다. MP는 특정 패턴을 따르는 헵타드 반복부를 포함한다. hC는 자가-조립 전에 단량체 펩티드에 부착된 GnRH 펩티드를 포함하여 치료제를 형성할 수 있다. 선택적으로, GnRH-hC 접합체는 하나 이상의 양친매성 알파 나선의 N- 및/또는 C-말단에 하나 이상의 T-세포 에피토프를 추가로 포함한다. 본 개시내용은 또한 본원에 기술된 치료제를 포함하는 면역원성 조성물을 포함하는 조성물을 기술한다.

Description

전립선암 치료를 위한 면역요법
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2019년 9월 12일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제62/899,553호의 이익을 주장하며, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
서열 목록 정보
2020년 9월 9일에 또는 그 즈음에 생성되고 파일 크기가 약 22 KB인 "H197-0005PCT_ST25.txt" 라는 명칭의 컴퓨터 판독가능한 텍스트 파일은 본 출원에 대한 서열 목록을 포함하고 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
기술 분야
본 개시내용은 펩티드-기반 전립선암 치료의 합성을 기술한다.
진행성 전립선암 환자에서, 체내 테스토스테론의 양을 최소화하는 것이 매우 중요하다(전립선암 세포의 진행 및 확산을 방지하기 위함). 남성 인간에서 테스토스테론을 감소시키는 몇몇 FAD 승인 약물이 시장에 존재한다: 루프론(Lupron) 주사(류프로라이드 아세테이트, 성선자극 방출 호르몬(GnRH: gonadotropin releasing hormone) 작용제) 및 퍼마곤(Firmagon)(데가렐릭스, GnRH 길항제). 이러한 두 가지 강력한 약물은 심각한 부작용이 있으며, 일부 경우에는 환자의 심각한 건강 문제를 추가로 유발한다. 따라서, 전립선암 환자의 치료를 위해 부작용이 감소된 개선된 약물의 개발이 필요하다.
박테리아(주로 이. 콜라이(E. coli)), 효모, 곤충 세포, 및 포유류 세포와 같은 숙주에서의 재조합 단백질 발현은 현재 서브유닛 치료제를 생산하는 가장 보편적인 방법이다. 이는 매우 성공적이었으며 치료제 생산의 중요한 방법으로 남을 것이다. 전형적으로, 표적 단백질은 게놈 분석, 기능적 검정법, 인 실리코 분석(예를 들어, 기능적 예측, 구조적 분석, 에피토프 식별 등), 또는 이들 3개의 조합에 의해 식별된다. 발현 시험은 면역원성 시험에 대한 수율 및 용해도를 평가하기 위해 개시된다. 그 후에, 질환 표적에 대한 고-역가 항체를 생산하는 서브유닛은 치료제가 숙주를 질환 발현(manifestation) 및 진행으로부터 보호하는 능력에 대해 시험하는 기능을 평가하기 위해 이월된다. 그 후에, 모든 이들 기준들을 충족시키는 서브유닛은 치료제 생산 최적화, 안정성, 및 독성/안전성/투약량 연구로 진전된다. 발현 최적화 연구는 또한 생산 규모 및 실행 가능성을 결정하는 데 중요하다. 전체 과정은 시간 소모적이며, 노동 집약적이고, 매우 비용이 많이 드는 것으로 잘 알려져 있다.
따라서, 전립선암 치료를 위한 치료제를 생산하기 위한 더욱 효율적이고 비용-효과적인 방법을 개발하는 필요성이 또한 존재한다.
본 요약에는 하기 상세한 설명에서 추가로 설명되는 것의 단순화된 형태로 개념의 선택을 소개하기 위해 제공된다. 이러한 요약은 청구된 주제의 모든 주요 기능 또는 필수 기능을 식별하기 위한 것이 아니며, 청구된 주제의 범주를 결정하는데 도움을 주기 위해 단독으로 사용되지도 않는다.
본 개시내용은 단량체 펩티드(MP: monomeric peptide)에 부착된 합텐(h: hapten)을 포함하는 hMP 폴리펩티드를 기술한다. 본 개시내용은 또한 합텐 담체(hC: hapten carrier)에 접합된 합텐을 포함하는 접합체를 기술한다. 합텐은 표적 단백질 또는 표적 항원일 수 있다. 실시형태에서, 합텐은 GnRH 펩티드이고; hMP 폴리펩티드는 GnRH(G) 및 MP(GMP)를 포함하고; 접합체는 GnRH-hC이다. 실시형태에서, hMP는 자가-조립(self-assembly) 후에 hC 또는 올리고머 hC, 예컨대 HhC(육량체 hC)로 기능할 수 있는데, 그 이유는 이것이 동일한 2차, 3차 또는 4차 구조를 선택할 수 있기 때문이다. 실시형태에서, T-세포 에피토프가 합텐, 예컨대 GnRH 외에 MP에 부착되는 경우, GMP는 GnRH-hC 접합체와 유사하지만 접합된 GnRH 없이 기능할 수 있다. 실시형태에서, GnRH 펩티드는 SEQ ID NO: 28 내지 34에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 hC는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체 또는 십량체로 자가 조립되는 2개 이상의 헵타드 반복부를 포함하는 양친매성 알파-나선인 단량체 펩티드를 포함한다. 각각의 헵타드(heptad)는 SEQ ID NO: 1 내지 18에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 단량체 펩티드는 육량체 합텐 담체(HhC: hexameric hapten carrier)로 자가-조립된다. hC는 또한 GnRH와 같은 표적 항원을 포함할 수 있으며, 이 경우 hC는 올리고머(GhC 올리고머)로 자가-조립된 GMP이다. 실시형태에서, GMP는 육량체, 예를 들어 HhC(GHhC)에 연결된 GnRH 펩티드를 포함하는 hC로 자가-조립된다. 실시형태에서, 본원에 기술된 접합체는 HhC에 접합된 GnRH(GnRH-HhC)를 포함한다.
더욱이, 본 개시내용은 단량체 펩티드의 일부인 hC의 양친매성 알파-나선의 N- 및/또는 C-말단에 T-세포 에피토프를 함유하는 GnRH-hC의 GhC 올리고머 또는 접합체, 또는 GhC 또는 GnRH-hC에 공유 결합된 것을 기술한다.
실시형태에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 GnRH-hC 접합체 또는 GhC 올리고머 및 부형제를 포함하는 조성물을 기술한다. 실시형태에서, 조성물은 이를 필요로하는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있는 약학 조성물이다. 약학 조성물은 면역원성 조성물일 수 있다. 대상체는 질병 또는 상태, 예를 들어 전립선암을 앓고 있을 수 있다. 대상체는 전립선 종양 세포가 증식하거나 전이하지 않도록 테스토스테론 수준을 감소시켜야 할 수 있다. 실시형태에서, 약학 조성물 또는 GnRH-hC 접합체 또는 GhC 올리고머는 전립선암을 치료하기 위한 치료제로서 사용될 수 있다.
실시형태에서, 본 개시내용은 테스토스테론 수준 감소를 필요로 하는 대상체에서 강력하고 오래 지속되는 면역 반응을 유도하기 위한 치료제, 예컨대 면역원으로서 본원에 기술된 GnRH-hC 접합체 또는 GhC 올리고머를 사용하는 방법을 기술한다.
도 1은 GnRH-hC 접합체의 합성을 나타낸다. 리신은 처음에 hC 리신과 반응한 다음 GnRH의 C-말단 시스테인과 반응하여 GnRH-hC 접합체를 형성하는 이종이기능성(heterobifunctional) 가교제로 활성화되었다. 상기 반응은 hC가 완전히 로드되도록 하기 위해 과량(10 몰 초과 당량)의 가교제 및 GnRH로 수행되었다(12개의 공유 결합된 GnRH 펩티드가 여기에 도시됨). GnRH의 트립토판은 형광 분광법으로 커플링 효율을 정량화할 수 있다. HhC의 N-말단과 C-말단은 고상 펩티드 합성(SPPS: solid phase peptide synthesis) 동안 추가된 T-세포 에피토프를 함유한다.
도 2는 hC(단독) 및 GnRH-hC 접합체의 면역원성을 나타낸다. hC 및 GnRH-hC 접합체를 먼저 모델링한 다음 인 실리코 형태(conformational) B-세포 에피토프 예측을 수행하였다. 분석은 3개의 웹-기반 서버(BEPro, ElliPro 및 DiscoTope 2.0)와 1개의 독립-실행형 Linux 프로그램(정전기 탈용매 분석으로 단백질 표면에 대한 항원 영역을 예측하는 PTools)을 사용하였다. 네 가지 분석 모두의 결과를 정규화하고, 평균화했으며, 결과를 여기에 도시하였다.
도 3은 대조군과 비교하여 예시적인 GnRH-HhC 접합체 및 GHhC 올리고머에 의해 유도된 d14(14일), d28 및 d42에서의 마우스 항-GnRH IgG 역가를 나타낸다.
도 4는 대조군과 비교하여 예시적인 GnRH-HhC 접합체 및 GHhC 올리고머에 의해 유도된 d14에서의 마우스 항-GnRH IgG 역가 및 테스토스테론(T) 수준을 나타낸다.
도 5는 대조군과 비교하여 예시적인 GnRH-HhC 접합체 및 GHhC 올리고머에 의해 유도된 d28에서의 마우스 항-GnRH IgG 역가 및 T 수준을 나타낸다.
도 6은 대조군과 비교하여 예시적인 GnRH-HhC 접합체 및 GHhC 올리고머에 의해 유도된 d42에서의 마우스 항-GnRH IgG 역가 및 T 수준을 나타낸다.
합텐은 이의 작은 크기로 인해 항원 결정기가 결여된 소분자이다. 항원성이 되기 위해서는, 이들 합텐은 면역원성인 더 큰 담체 단백질에 커플링되어야 한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "합텐"은 더 큰 담체 단백질에 공유 또는 비-공유 부착될 때까지 항원 결정기가 결여되어 있는 임의의 분자, 또는 더 큰 담체 단백질에 공유 또는 비-공유 커플링됨으로써 그 항원성이 증가되는 분자를 지칭한다. 합텐과 유사하게, 작은 펩티드(즉, 통상 5,000 달톤 미만의 펩티드)도 또한 강력한 면역 반응을 유도하기 위한 항원 결정기가 결여되어 있으므로, 이들 역시 면역원성이 되기 위해 더 큰 담체 단백질에 커플링되어야 한다. 따라서, 용어 "합텐"은 그 자체로는 좋은 면역원이 아니지만, 더 큰 분자에 부착될 때 면역원성이 되는 분자를 지칭한다. 합텐은 예를 들어 작은 유기 분자, 단당류, 이당류, 올리고당류, 지질, 핵산, 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 합텐이 항체에 결합할 수 있지만, 합텐을 사용한 면역은 일반적으로 강한 항체 반응을 유발하지 않는다. 그러나, 면역원성은 합텐이 5,000 달톤 초과인 합텐-담체 접합체와 같은 더 큰 담체 분자를 연결하거나 접합함으로써 공유 부착될 때 달성될 수 있다.
본 개시내용은 GnRH와 같은 작은 펩티드에 대한 합텐 담체(hC)를 기술한다. GnRH가 본원에 기술된 hC에 접합될 때, GnRH는 강력한 면역 반응을 유도할 수 있다.
GnRH는 척추동물의 시상하부에서 생산되는 10-잔기 펩티드이다. 이는 뇌하수체가 황체형성 호르몬(LH: luteinizing hormone) 및 난포-자극 호르몬(FSH: follicle-stimulating hormone)을 합성하고 분비하도록 유도한다. 남성의 경우, 이러한 호르몬이 고환에서 테스토스테론을 생산하게 하고, 여성의 경우 난소에서 에스트로겐과 프로게스테론을 생산하게 한다. 따라서 GnRH 백신 접종으로 유도된 항체는 이를 중화하고 수용체에 결합하는 것을 방지하고 테스토스테론 생산을 차단한다.
본 개시내용은 또한 본원에 기술된 hC에 공유 부착된 GnRH를 포함하는 GnRH-hC 접합체와 GnRH 및 단량체성 펩티드를 포함하는 GhC 올리고머를 포함하는 치료제를 기술한다. GhC 올리고머는 또한 T-세포 에피토프를 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, GnRH-hC와 GhC를 모두 포함하는 GnRH 치료제는 적응(adaptive) 면역 반응 경로를 통해 강력하고 오래 지속되는 면역 반응을 유도하여 내인성 GnRH를 표적으로 하는 고역가 및 고친화성 항체를 만들어 LH(Luteinizing Hormone, 황체형성 호르몬)의 방출을 방지할 수 있고, 테스토스테론 생산을 급격히 감소시킬 수 있다. 예를 들어, GnRH는 T-세포 활성화, 수지상 세포 성숙, B-세포 활성화, 증식 및 성숙, 강력한 기억 반응의 확립, 및 기타 경로를 통해 강력하고 오래 지속되는 면역 반응을 유도할 수 있다. 이는 궁극적으로 GnRH가 시상 하부를 떠나 부신과 생식선 테스토스테론 생산을 조절하는 뇌하수체로 가는 도중 문맥 혈관으로 들어가기 전에 중화시킨다.
인간에서 초기 프라임/부스트 후, 테스토스테론 수주은 0.7(ng/dL) 미만이 되고 1 또는 2회의 연간 "부스터 주사"로 그 수준 미만으로 유지될 것으로 예상된다. 치료제의 부작용은 잘 특성분석된 T-세포 에피토프의 정확한 수의 존재, hC에 대한 면역우성 에피토프의 결여, 치료제의 완전한 합성(비-생물학적) 생산으로 인해 최소화될 것이다. 담체에 대한 다중 구조 및 선형 GnRH B-세포 에피토프의 정확한 공간 및 화학량론적 배치는 기존 약물보다 우수한 테스토스테론을 약화시킬 수 있는 강력한 치료제를 초래할 것이다.
또한, 본 개시내용은 GnRH-hC 접합체 또는 GhC 올리고머를 포함하는 GnRH 치료제의 신규한 제조 방법을 기술한다. 상기 방법은 전통적인 서브유닛 또는 단백질 담체-기반 치료제 개발에서 가장 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되는 많은 단계를 제거한다. 재조합 발현 숙주에서 담체 단백질을 생산하는 대신에, hC 및 GnRH 구성요소가 고상 펩티드 합성(SPPS)에 의해 합성적으로 생산되는 유연하고 모듈화된 시스템이다. 본원에서 기술된 방법은 하나 이상의 GnRH 펩티드가 hC에 부착된 후 강력한 면역 반응을 유도하기에 충분히 큰 담체 복합체를 형성하기 위해 양친매성 알파-나선으로 자가-조립되는 단량체 펩티드를 포함하는 hC 구성요소를 설계하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 단량체 펩티드는 육량체 hC(HhC) 코어로 자가-조립되고, GnRH 펩티드는 육량체로 자가-조립되기 전에 또는 육량체로 자가-조립된 후 HhC 코어로 접합되기 전에 단량체 펩티드의 N- 또는 C-말단에서 HhC 코어에 공유 부착될 수 있다. 실시형태에서, HhC 코어는 또한 양친매성 알파-나선의 N- 및/또는 C-말단에 T-세포 에피토프를 포함할 수 있다.
예로서, 도 1은 본원에 기술된 GnRH-HhC 접합체의 구성요소를 도시한다. 수화 후 코어를 형성하는 중앙 영역이 존재하며, 이러한 영역에서 리신은 GnRH를 접합하는 기능을 한다. HhC의 크기는 T-세포 에피토프 길이에 따라 다를 수 있다. 육량체 형성 시, 비접합된 육량체는 38.5 kDa이다(도 1). 접합된 육량체는 접합된 합텐의 길이와 크기에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 육량체에 탑재된 GnRH(1,200달톤)는 크기를 38.5 kDa에서 약 53 kDa으로 증가시킨다.
본 개시내용은 길이가 적어도 14개의 아미노산 잔기의 펩티드를 포함하고 적어도 2개의 헵타드 반복부를 포함하는 hC의 코어 영역을 기술하며, 각각의 헵타드는 hwxhxyz(SEQ ID NO: 1)를 가지며, 여기서
h는 소수성 또는 비-극성 잔기이고;
w는 양으로 하전된, 음으로 하전된, 극성 비하전된, 또는 비-극성 지방족 잔기이고;
x는 음으로 하전된, 양으로 하전된, 비-극성 지방족, 극성 비하전된 잔기, 또는 합텐 또는 임의의 다른 분자와 에피토프 커플링을 위한 임의의 천연 또는 비-천연 잔기이고;
y는 합텐 또는 임의의 다른 분자와 에피토프 커플링을 위한 임의의 천연 또는 비-천연 잔기이고;
z는 음으로 하전된, 양으로 하전된, 극성 비하전된, 비-극성 지방족 잔기, 또는 합텐 또는 임의의 다른 분자와 에피토프 커플링을 위한 임의의 천연 또는 비-천연 잔기이다.
실시형태에서, hC 코어 영역은 패턴 (hwxhxyz)n(SEQ ID NO: 2)을 갖는 펩티드를 포함하며, 여기서,
h는 I, L, V, F, W, Y, M, W, G, 또는 A이고;
w는 G, R, A, N, Q, H, S, D, E, K 또는 T이고;
x는 R, S, N, Q, A, G, T, D, E, K, H, 또는 C이고;
y는 K, H, C, D, E, R, W, Y, Q, N, 또는 공유 커플링될 수 있는 반응성기를 함유하는 비-천연 아미노산 또는 분자이고;
Z는 A, D, H, S, E, R, N, Q, K, 또는 G이고;
n은 1 초과의 정수이다.
실시형태에서, 본원에 기술된 예시적인 헵타드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
LRSIGKD(SEQ ID NO: 3);
LRSIGRD(SEQ ID NO: 4);
IREISRA(SEQ ID NO: 5);
IREVAQS(SEQ ID NO: 6);
IRDIAKA(SEQ ID NO: 7);
IRDIGRA(SEQ ID NO: 8);
IRDVGQS(SEQ ID NO: 9);
IRDLAKG(SEQ ID NO: 10);
VKDVARG(SEQ ID NO: 11);
IRDIGNS(SEQ ID NO: 12);
IKDLARG(SEQ ID NO: 13);
IKKLKKK(SEQ ID NO: 14);
IRSIGKE(SEQ ID NO: 15);
IRSIGRE(SEQ ID NO: 16);
IKSIGRE(SEQ ID NO: 17); 또는
IRSIGRG(SEQ ID NO: 18).
실시형태에서, hC의 코어 영역은 본원에 기술된 하나 이상의 헵타드를 포함하며, 여기서 n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11이다.
본 개시내용은 적어도 14개 잔기의 펩티드를 포함하는 hC의 코어 영역을 기술한다. 실시형태에서, 펩티드는 길이가 14개 잔기 내지 80개 잔기를 포함하고 2 내지 11개의 헵타드 반복부를 포함한다. 실시형태에서, hC 코어 영역은 20개 내지 70개 잔기, 25개 내지 60개 잔기, 28개 내지 50개 잔기, 28개 내지 40개 잔기, 또는 28개 내지 30개 잔기를 포함하는 펩티드를 포함한다. 길이가 14개 잔기 내지 80개 잔기를 포함하는 펩티드는 단량체이다.
용어 "단량체 펩티드(MP)" 및 "단량체 hC(MhC) 펩티드"는 본원에 기술된 단량체 펩티드를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 실시형태에서, 본원에 기술된 예시적인 단량체 펩티드 또는 단량체 hC 펩티드는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
LRSIGKDLRSIGKDLRSIGKDLRSIGKD(SEQ ID NO: 19)
LRSIGKDLRSIGKDLRSIGKDLRSIGKDS(SEQ ID NO: 20);
LRSIGKDLRSIGRDLRSIGKDLRSIGRD(SEQ ID NO: 21);
IREISRAIREVAQSIRDIAKAIREIGKS(SEQ ID NO: 22);
IRDIGRAIRDVGQSIRDLAKGIRDISKG(SEQ ID NO: 23);
VKDVARGIRDIGNSIKDLARGIRDIGRG(SEQ ID NO: 24);
IRSIGKEIRSIGREIKSIGREIRSIGRG(SEQ ID NO: 25);
IRSIGKEIRSIGREIRSIGKEIRSIGRE(SEQ ID NO: 26); 또는
IRSIGKEIRSIGREIRSIGREIRSIGRE (SEQ ID NO: 27).
본원에 기술된 펩티드는 하나 이상의 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함하고 상기 hwxhxyz(SEQ ID NO: 1)의 패턴을 유지하기 위해 변형(modification)될 수 있다. 헵타드 반복부 또는 펩티드 내의 각 위치의 변형은 양친매성 알파-나선 구조, 안정성, 및 펩티드의 올리고머화 상태를 유지해야 한다.
실시형태에서, 본원에 기술된 펩티드는 (SEQ ID NO: 3)n, (SEQ ID NO: 4)n, (SEQ ID NO: 5)n (SEQ ID NO: 6)n, (SEQ ID NO: 7)n, (SEQ ID NO: 8)n, (SEQ ID NO: 9)n, (SEQ ID NO: 10)n, (SEQ ID NO: 11)n, (SEQ ID NO: 12)n (SEQ ID NO: 13)n, (SEQ ID NO: 14)n, (SEQ ID NO: 15)n, (SEQ ID NO: 16)n, (SEQ ID NO: 17)n, 또는 (SEQ ID NO: 18)n과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함하며, 여기서 n은 2 내지 11의 정수이다. 실시형태에서, 본원에 기술된 펩티드는 SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함한다. 서열 동일성은 정렬된 2개 서열의 대응도(degree of correspondence)를 지칭하며, 종종 백분율로 표현된다. 2개 서열 사이의 차이는 동일성을 결정하기 위해 당업계에서 일상적으로 실시되는 방법에 의해 결정될 수 있으며, 상기 방법은 시험되는 서열 사이에서 가장 큰 일치를 제공하도록 설계된다. 서열 동일성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써 결정될 수 있다. 2개 서열 사이의 동일성을 결정하기 위한 컴퓨터 프로그램 방법은 BLASTP를 포함한다. 프로그램의 BLAST 계통은 NCBI 및 다른 출처로부터 공개적으로 이용 가능하다.
실시형태에서, 생체 내 펩티드 안정성을 증가시키기 위해 본원에 기술된 단량체 펩티드의 N- 또는 C-말단에 하나 이상의 잔기가 첨가될 수 있다. 예컨대, V(발린), M(메티오닌), G(글리신), I(이소류신), D(아스파르트산), 또는 P(프롤린) 또는 이들 잔기의 조합이 펩티드의 N- 또는 C-말단에 첨가될 수 있다. 또한, 펩티드의 안정성을 증가시키기 위해 잔기에 보호기가 첨가될 수 있다. 이러한 보호기의 예는 아세틸, 아릴, 9-플루오레닐메톡시카보닐, tert-부틸옥시카보닐, 알릴옥시카보닐, 벤질옥시카보닐, 및 PEG(폴리에틸렌글리콜), 및 C-말단의 아미드를 포함한다.
본원에 기술된 펩티드는 단량체 hC 펩티드일 수 있지만, 단량체 hC 펩티드가 자가-조립형이기 때문에, 이는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체 또는 십량체로 구성된 올리고머인 hC로 자가-조립될 수 있다. 실시형태에서, 단량체 펩티드는 6개의 양친매성 알파-나선을 갖는 육량체로 자가-조립된다. 실시형태에서, hC는 육량체 올리고머이다.
실시형태에서, 본 개시내용은 합텐, 예컨대 GnRH를 접합시키기 위한 하나 이상의 잔기를 포함하는 hC를 기술한다. 합텐을 접합시키기 위한 hC 상의 최적 부위는 헵타드 반복부 내의 y 잔기이지만, GnRH 커플링은 또한, w, x 및 z 잔기가 용매 접근성이기 때문에 반응성 측쇄를 함유하는 경우 w, x, 및 z 잔기에서도 발생할 수 있고, GnRH는 HhC를 포함하여, hC에 GnRH를 공유 결합할 수 있는 임의의 잔기를 사용하여 공유 결합될 수 있다. 실시형태에서, y 잔기는 K, H, C, D, E, R, W, Y, Q, N, 또는 공유 커플링될 수 있는 반응성기를 함유하는 비-천연 아미노산이다. 실시형태에서, 커플링 부위를 제공하기 위해 6개의 양친매성 알파-나선 각각의 한쪽 면 상에 2개 내지 4개의 y 잔기가 존재한다. 실시형태에서, y 잔기는 리신(K)이다.
실시형태에서, 하나 이상의 GnRH 펩티드는 y 잔기를 사용하여 SPPS 동안 또는 MP가 올리고머, 예컨대 육량체로 조립된 후에 접합될 수 있다. hC에 접합된 GnRH는 접합체이고 GnRH-hC 접합체 또는 GnRH-올리고머 접합체로 지칭된다. 실시형태에서, hC는 1개 내지 100개, 10개 내지 90개, 20개 내지 80개, 30개 내지 70개, 40개 내지 60개, 또는 50개 GnRH 펩티드로 연결된다. 실시형태에서, hC는 HhC이고, 접합체는 GnRH-HhC이다.
실시형태에서, GnRH 펩티드는 SPPS 동안 단량체 펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 첨가되어(자가-조립 전에) GMP를 형성할 수 있다. 이어서 GMP는 올리고머, 예컨대 GnRH 올리고머 또는 보다 구체적으로는 GnRH HhC(GnRH 육량체는 hC 또는 GHhC임)로 자가-조립될 수 있다.
실시형태에서, hMP(단량체 펩티드에 부착된 합텐)는 hhC(합텐 담체의 N- 또는 C-말단에 부착된 합텐)로 자가-조립될 수 있다. 합텐이 GnRH(G)일 때, hMP는 GMP이며, 이는 GhC 올리고머, 예컨대 GHhc(육량체 합텐 담체에 결합된 GnRH)로 자가-조립된다.
GnRH 펩티드는 GnRH 1 및 GnRH 2를 포함한다. GnRH 펩티드는 성선자극 방출 호르몬(GnRH 또는 GRH), LHRH(황체형성 호르몬 방출 호르몬), 및 성선자극-방출 인자(GRF 또는 GnRF)를 비롯하여 상이한 명칭을 갖는다.
GnRH 펩티드는 다양한 척추동물에서 발견될 수 있다. 척추동물의 예는 포유류, 어류, 조류, 파충류, 및 양서류를 포함한다. 포유류의 예는 영장류, 설치류, 토끼 및 산토끼, 개, 말, 돼지, 고래, 돌고래, 박쥐, 발가락이 홀수 및 짝수인 유제류, 및 기타 태반류를 포함한다. 포유류는 또한 단공류와 유대류를 포함한다. 어류의 예는 상어, 가오리, 경골어, 개붕어, 철갑상어, 캣상어, 및 실러캔스를 포함한다. 조류의 예는 새, 닭 및 타조를 포함한다. 파충류의 예는 뱀을 포함한다. 양서류의 예는 개구리, 두꺼비, 및 무족영원(caecilian)을 포함한다. 따라서, 척추동물은 GnRH의 좋은 공급원이다.
또한, 척추동물에서 GnRH 펩티드에 대한 아미노산 서열은 고도로 보존되어 있다. 이의 아미노산 서열은 하기 공통 서열을 포함하여 표시될 수 있다:
X1HWSX2GX3X4PG(SEQ ID NO: 28),
상기 식에서 X1은 극성 또는 하전된 아미노산이고; X2는 극성 아미노산이고; X3은 소수성 또는 양친매성 아미노산이고; X4는 소수성, 양친매성, 하전된, 또는 극성 아미노산이다. 하전된 아미노산은 R, K, D, 또는 E를 포함한다. 극성인 아미노산은 Q, N, H, S, T, Y, 또는 C를 포함한다. 양친매성인 아미노산은 W, Y, 또는 M을 포함한다. 소수성인 아미노산은 A, I, L, M, F, V, P, 또는 G를 포함한다. 실시형태에서, X1은 Q 또는 E이다. 실시형태에서, X2는 Y 또는 H이다. 실시형태에서, X3은 L 또는 W이다. 실시형태에서, X4는 L, Y, R, 또는 Q이다. 실시형태에서, X1은 Q 또는 E이고; X2는 Y 또는 H이고; X3은 L 또는 W이고; X4는 L, Y, R, 또는 Q이다.
실시형태에서, GnRH 펩티드는 다음의 아미노산 서열: QHWSYGLRPG(SEQ ID NO: 29)을 포함하는 GnRH 1 펩티드이다. 생체 내에서, GnRH의 첫 번째 잔기는 피로-글루탐산(pE: pyro-glutamic acid)으로서 이는 효소 촉매된 탈아미드화에 및 Q의 측쇄의 후속 환형화에 의해 발생한다. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 29를 포함하는 GnRH 펩티드의 공급원인 척추동물은 영장류(인간 포함), 설치류, 토끼 및 산토끼, 태반류, 박쥐, 발가락이 홀수인 유제류, 고래, 돌고래, 발가락이 짝수인 유제류, 개구리, 두꺼비, 유대류, 및 무족영원을 포함한다.
실시형태에서, GnRH 펩티드는 다음의 아미노산 서열: QHWSHGWLPG(SEQ ID NO: 30)을 포함하는 GnRH 1 펩티드이다. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 30을 포함하는 GnRH 펩티드의 공급원인 척추동물은 가시 개붕어, 작은 점박이 캣상어, 및 실러캔스를 포함한다.
실시형태에서, GnRH 펩티드는 다음의 아미노산 서열: EHWSYGLRPG(SEQ ID NO: 31)을 포함하는 GnRH 1 펩티드이다. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 31을 포함하는 GnRH 펩티드의 공급원인 척추동물은 러시아 철갑상어 및 중국 햄스터를 포함한다.
실시형태에서, GnRH 펩티드는 다음의 아미노산 서열: QHWSYGWYPG(SEQ ID NO: 32)을 포함하는 GnRH 1 펩티드이다. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 32를 포함하는 GnRH 펩티드의 공급원인 척추동물은 설치류, 및 뱀, 예컨대 킹 코브라를 포함한다.
실시형태에서, GnRH 펩티드는 다음의 아미노산 서열: EHWSYGLQPG(SEQ ID NO: 33)을 포함하는 GnRH 1 펩티드이다. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 33을 포함하는 GnRH 펩티드의 공급원인 척추동물은 닭을 포함한다.
실시형태에서, GnRH 펩티드는 다음의 아미노산 서열: QHWSHGWYPG(SEQ ID NO: 34)을 포함하는 GnRH 2 펩티드이다. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 34를 포함하는 GnRH 펩티드의 공급원인 척추동물은 영장류(인간 포함), 설치류, 태반류, 새, 거북이, 발가락이 짝수 및 홀수인 유제류, 경골 어류, 상어 및 가오리, 및 은상어를 포함한다.
실시형태에서, hC에 부착될 수 있는 하나 이상의 GnRH 펩티드는 동일한 GnRH 펩티드 또는 상이한 GnRH 펩티드일 수 있다. 예로서, 포유류 종과 상이한 GnRH 펩티드가 동일한 hC에 부착될 수 있다. 또 다른 예로서, GnRH 1와 GnRH 2 둘 모두는 동일한 hC에 부착될 수 있다. 실시형태에서, GnRH, GnRH 1 및 GnRH 2의 2개의 인간 이소형이 동일한 hC에 부착될 수 있다.
접합체 또는 올리고머의 맥락에서, 용어 "부착된(attached)" 또는 "결합된(joined)" 또는 "커플링된(coupled)"은 상호교환적으로 사용되어 자가-조립된 올리고머(hC)에 접합되거나 올리고머 hC로 자가-조립되기 전에 SPPS 동안 단량체 펩티드에 첨가되는 것을 지칭한다.
하나 이상의 잔기는 본원에 기술된 GnRH 펩티드의 N- 또는 C-말단에 첨가될 수 있다. 하나 이상의 잔기는 GnRH 펩티드를 보다 안정하게 만들 수 있다. 예컨대, 하나 이상의 잔기는 GnRH 펩티드의 생체 내 반감기를 증가시킨다. 실시형태에서, GnRH 펩티드의 N-말단에 하나 이상의 잔기를 첨가하면 이의 N- 또는 C-말단에 하나 이상의 첨가된 잔기가 없는 GnRH 펩티드의 반감기보다 GnRH 펩티드의 생체 내 반감기를 5배 초과 내지 120배 초과 더 길게 증가시킬 수 있다. 실시형태에서, 하나 이상의 잔기는 이의 N- 또는 C-말단에 첨가된 잔기가 없는 GnRH 펩티드의 생체 내 반감기보다 GnRH 펩티드의 생체 내 반감기를 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 110배, 또는 120배 초과 더 길게 증가시킬 수 있다. 실시형태에서, 잔기 예컨대 G(글리신), V(발린), M(메티오닌), 또는 A(알라닌), 또는 이들의 조합은 안정성을 위해 GnRH 펩티드의 N- 또는 C-말단에 첨가될 수 있다. 예컨대, N-말단에 G를 첨가하면 GnRH 펩티드의 예측된 생체 내 반감기가 0.8시간 내지 30시간 초과 증가하고 N-말단에 V를 첨가하면 GnRH 펩티드의 반감기를 0.8시간 내지 100시간 증가시킨다. 실시형태에서, GnRH 펩티드의 N-말단에 하나 이상의 잔기, 예컨대 G를 첨가하면 GnRH 펩티드의 반감기를 37.5배 더 길게 증가시키고, GnRH의 N-말단에 하나 이상의 잔기, 예컨대 V를 첨가하면 GnRH 펩티드의 반감기를 125배 더 길게 증가시킨다. 실시형태에서, GnRH 펩티드는 아미노산 서열: XQHWSYGLRPG(SEQ ID NO: 35)을 포함하며, 여기서 X는 G 또는 V이다.
실시형태에서, GnRH의 N-말단은 또한 안정성을 위해 아세틸화될 수 있다.
hC에 대한 접합을 돕기 위해 하나 이상의 GnRH 펩티드의 N- 또는 C-말단에 다른 잔기가 또한 첨가될 수 있다. 예컨대, hC와의 정전기적 반발을 감소시키는 pI(등전점)를 충분히 감소시키기 위해 GnRH 펩티드의 N- 또는 C-말단에 하나 이상의 잔기가 첨가될 수 있다. 예컨대, 접합을 위한 링커로서 그리고 GnRH 펩티드의 pI를 변형시키기 위해 C-말단에 잔기 GEDC(SEQ ID NO: 36) 또는 DGEGC(SEQ ID NO: 37)가 첨가될 수 있다. 또한, GnRH 펩티드의 안정성을 개선하기 위해, 상기 기타 잔기 외에, N-말단에 잔기 GEDC(SEQ ID NO: 36) 또는 DGEGC(SEQ ID NO: 37)가 또한 첨가될 수 있다.
선택적으로, 다른 분자는 GnRH 펩티드와 함께 hC 올리고머, 예컨대 HhC에 직접적으로 접합될 수 있다. 다른 분자가 또한 GnRH 펩티드에 부착되고 이어서 hC에 접합될 수 있다. 또한, 본원에 언급된 바와 같이, GnRH가 SPPS 동안 hC 단량체 펩티드의 N- 또는 C-말단에 부착되어 GhC 올리고머, 예컨대 GHhC로 자가-조립되기 전에 GMP를 형성할 수 있다. GnRH 외에 하나 이상의 다른 분자가 또한 hC 올리고머로 자가-조립되기 전에 SPPS 동안 hC 단량체(MhC) 펩티드의 N- 또는 C-말단에 부착될 수 있다.
hC 올리고머 또는 MP에 부착될 수 있는 다른 분자는 전립선암의 증상을 치료, 예방, 완화, 또는 테스토스테론 수치 상승으로 인해 대상체에서 질환 또는 장애를 발달시킬 위험을 감소시키는데 유용한 항체의 생산을 유발할수 있는 임의의 제제를 포함한다. GnRH 외에 다른 분자의 예는 면역조절제 및 합텐을 포함한다. 보조 분자를 포함하는 면역조절제의 예는 T-세포 에피토프 펩티드, 핵산, 지질, 지질펩티드, 지질단백질, 탄수화물, 및 짧은 펩티드를 포함한다. GnRH, 및 B-세포 에피토프를 포함하여 합텐으로서 사용될 수 있는 펩티드는 합성적으로 또는 재조합적으로 생산된 펩티드 또는 천연 펩티드 또는 천연 또는 비-천연 D- 또는 L-아미노산을 포함하는 단백질을 포함한다.
T-세포 반응을 활성화시키기 위해(B-세포에 T-세포 헬프를 제공하기 위해) 사용될 수 있는 T-세포 에피토프는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens), 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 세포외 단백질, 및 마이코박테리움(Mycobacterium) 및 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani)의 세포외 용질 결합 단백질에서 발견될 수 있다. T-세포 에피토프는 또한 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 유행성 이하선염(Mumps rubulavirus), 열대열 말라리아 원충(Plasmodium falciparum), 인간 면역결핍 바이러스 1(Human immunodeficiency virus 1), C형 간염, 및 인플루엔자 A 바이러스에 존재한다. 이러한 T-세포 에피토프의 예는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 38 및 39(클로스트리디움 보툴리눔의 세포외 단백질 유래, GenBank: STC78113.1); SEQ ID NO: 40(세포외 단백질 클로스트리디움 퍼프린젠스 유래, GenBank: SUY45886.1); SEQ ID NO: 41(세포외 단백질 스타필로코커스 아우레우스 유래, GenBank: SAO03917.1); SEQ ID NO: 42, 43, 44, 45, 및 46(다양한 종의 마이코박테리움의 세포외 용질-결합 단백질 유래, NCBI 참조 서열: WP_055398728.1); SEQ ID NO: 47, 48, 및 49(세포외 용질-결합 단백질 클로스트리디움 테타니 유래, GenBank: CDI50554.1; SEQ ID NO: 50(결핵균의 ESAT-6-유사 단백질 EsxB 유래); SEQ ID NO: 51(결핵균의 알파-결정질 단백질 유래); SEQ ID NO: 52(유행성 이하선염의 유행성 이하선염 단백질 유래); SEQ ID NO: 53(열대열 말라리아 원충의 DNAJ 단백질 유래); SEQ ID NO: 54(인간 면역결핍 바이러스 1의 Gag-Pol 폴리단백질 유래); SEQ ID NO: 55(C형 간염의 게놈 폴리단백질 유래); SEQ ID NO: 56(인플루엔자 A 바이러스의 매트릭스 단백질 1 유래); 및 SEQ ID NO: 57(인플루엔자 A 바이러스의 헤마글루티닌 유래)을 포함하는 펩티드를 포함한다.
hC에 부착될 수 있는 지질은 톨-유사 수용체(TLR: Toll-like receptor)에 대한 결합을 통해 선천적 면역 반응을 유도하는 것들을 포함한다. 지질은 또한 보조제로서 작용할 수 있다. 이러한 지질의 예는 모노포스포릴 지질-A, 스쿠알렌, 지질다당류(LPS), 지질단백질, 또는 지질펩티드를 포함한다. 합텐으로서 작용할 수 있는 탄수화물은 글루코스, 다이사카라이드, 트리사카라이드, 및 복합 탄수화물을 포함하여 보다 큰 사카라이드를 포함한다.
hC에 부착될 수 있는, TLR에 결합하는 펩티드의 예는 TLR 리간드, 예컨대 TLR-4 작용제 펩티드를 포함한다. 이러한 펩티드는 보조 펩티드로서 작용한다. 실시형태에서, 보조 펩티드는 아미노산 서열 APPHALS(SEQ ID NO: 58)을 포함한다.
다른 분자는 또한 합텐, 예컨대 B-세포 에피토프를 포함할 수 있다. 합텐으로서 사용될 수 있는 B-세포 에피토프는 키스펩틴(Kisspeptin) 펩티드, 및 키스펩틴 수용체 및 GnRH 수용체로부터 유도된 에피토프를 포함한다. 또한, 추가 GnRH 펩티드가 다른 분자로서 첨가될 수 있다.
합텐이 작은 펩티드, 예컨대 GnRH인 경우, 전체 펩티드가 합텐으로서 사용될 수 있다. 합텐이 단백질인 경우, 일부는 합텐으로서 사용될 수 있다. 합텐으로서 사용될 단백질의 일부는 잘 알려진 방법인, 실리코 예측 알고리즘 또는 전체 단백질의 펩티드-기반 에피토프 맵핑을 사용하여 결정될 수 있다. 많은 T-세포 및 B-세포 에피토프가 이러한 방법을 사용하여 식별되었다.
GnRH의 면역원성을 향상시키거나 GnRH의 면역 반응의 지속기간 또는 폭을 향상시킬 수 있는 합텐이 GnRH와 함께 hC에 접합될 수 있다. 예컨대, TLR에 결합하는 기능을 하는 접합된 펩티드는 보조제 기능을 포함할 수 있고 GnRH의 면역원성을 향상시킬 수 있다. 실시형태에서, GnRH-hC 접합체는 하나 이상의 상이하거나 동일한 GnRH 펩티드 외에 다른 합텐 또는 펩티드를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 GnRH-hC 접합체 및 GhC 올리고머를 포함하는 GnRH 면역원을 기술한다. 이러한 접합체 및 올리고머는 또한 다른 분자를 포함할 수 있다. GnRH 면역원을 만들기 위해 사용되는 펩티드는 단량체 펩티드, GnRH 펩티드, T-세포 에피토프를 포함하는 다른 분자, 합텐, 및 본원에 기술된 보조 펩티드를 포함한다. 이는 수동 기술이나 자동화 절차에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 예로서, 고상 폴리펩티드 합성(SPPS)은 1960년대 초반부터 수행되어 왔다. 수 년에 걸쳐, 초기 SPPS가 개선되었으며, 많은 방법이 자동화되었다.
펩티드, 특히, 본원에 기술된 더 긴 펩티드는 천연 화학 결찰(NCL: native chemical ligation)에 의해 생산될 수 있다. NCL을 사용하여, 보다 큰 펩티드(폴리펩티드)가 2개 이상의 더 작은 펩티드를 결찰(또는 커플링)하여 형성될 수 있다. 실시형태에서, 단량체 펩티드 및 2개 이상의 합텐을 포함하는 폴리펩티드가 2개 이상의 더 작은 펩티드 단편으로부터 제조되고 NCL 기술을 사용하여 함께 조립될 수 있다. 예로서, 단량체 펩티드 및 2개의 합텐(단량체 펩티드의 N- 및 C-말단 각각에 하나)을 포함하는 폴리펩티드는 2개의 더 작은 펩티드로부터 합성될 수 있고, 이는 NCL에 의해 공유적으로 부착된다. NCL을 사용하여, 2개의 보다 작은 펩티드 중 하나의 N-말단에 C(시스테인)가 첨가되고 2개의 보다 작은 펩티드의 다른 것의 C-말단에 티오에스터 작용기가 첨가되고 이들 2개의 펩티드는 후속적으로 전장 폴리펩티드로 결찰된다. 실시형태에서, 잔기는 보다 긴 폴리펩티드의 합성의 용이성을 위해 본원에 기술된 펩티드에 첨가된다.
실시형태에서, 단량체 펩티드와 GnRH 펩티드 또는 하나 이상의 다른 합텐 사이에 스페이서가 첨가된다. 스페이서로서 삽입될 수 있는 하나 이상의 잔기의 예는 G(글리신), D(아스파르트산), S(세린), C(시스테인), 또는 이들의 조합을 포함한다. 실시형태에서, 스페이서는 또한 D, GD, 또는 GSG를 포함한다.
본원에 기술된 펩티드 및 합텐은 또한 이종 발현 시스템에서 생물학적으로 또는 재조합적으로 생산될 수 있다. 임의의 이종 발현 시스템이 본원에 기술된 펩티드의 생산을 위해 사용될 수 있다. 실시형태에서, 발현 시스템은 본원에 기술된 펩티드를 생산하기에 적합한 숙주가 되도록 하는, 번역 후 수정을 위한 기구(machinery)가 결핍된 대장균(E. coli.)을 포함한다.
GnRH를 포함하는 다른 분자는 클릭 화학 또는 동종- 또는 이종이기능성 가교결합제 또는 펩티드 결합 형성을 포함하여 임의의 공지된 방법을 사용하여 hC에 부착될 수 있다. 실시형태에서, 합텐은 접합 반응에서 일상적으로 사용되는 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보다이이미드 히드로클로라이드)/NHS(N-히드록시숙신이미드) 또는 NHS/말레이미드 가교결합 화학을 사용하여 hC에 접합될 수 있다. y 잔기, 예컨대, 리신은 잘 정의된 합텐 배치 및 커플링 화학량론을 제공하도록 배치된다.
GnRH를 포함하여 다른 분자는 또한 임의의 적합한 링커 모이어티를 통해 hC에 부착될 수 있다. 링커의 예는 아미드 연결, 에스터 연결, 및 다이설파이드 연결을 형성하는 것들을 포함한다. 링커는 절단가능한 링커 예컨대 프로테아제 절단가능한 펩티드 링커, 뉴클레아제 민감성 핵산 링커, 리파제 민감성 지질 링커, 글루코시다제 민감성 탄수화물 링커, pH 민감성 링커, 저산소증 민감성 링커, 광-절단가능한 링커, 열-불안정성 링커, 또는 효소 절단가능한 링커일 수 있다. 링커는 또한 비-절단가능한 링커일 수 있다. 임의의 공지된 방법, 예컨대 클릭 화학, 수동 흡착, 다가 킬레이트화, 고친화성 비-공유 결합, 또는 공유 결합 형성이 링커를 hC와 결합시키는데 사용될 수 있다. 합텐은 또한 링커 없이 hC에 부착될 수 있다.
추가로, GnRH를 포함하여 다른 분자는 또 다른 분자를 통해 hC에 접합될 수 있다. 예컨대, GnRH 또는 또 다른 B-세포 또는 T-세포 에피토프는 우선 관심 에피토프를 나타내기(display) 위해 담체에 부착될 수 있고, 이어서 HhC에 접합될 수 있다. 이러한 담체의 예는 단백질, 펩티드, 나노입자, 바이러스-유사 입자, 또는 GnRH 또는 다른 관심 에피토프를 나타내기 위한 담체로서 기능할 수 있는 임의의 것을 포함한다.
또한, 본 개시내용은 본원에 기술된 것을 포함하는, 하나 이상의 다른 분자를 선택적으로 포함하는 GnRH-hC 접합체 또는 GhC 올리고머를 기술한다. 하나 이상의 다른 분자는 면역조절제 및/또는 합텐을 포함한다. 실시형태에서, 하나 이상의 다른 분자는 T-세포 에피토프, B-세포 에피토프, 짧은 펩티드 예컨대 GnRH 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 실시형태에서, 하나 이상의 다른 분자는 hC의 코어에 있는 하나 이상의 나선의 N- 및/또는 C-말단에 연결된다. 실시형태에서, 하나 이상의 다른 분자는 hC의 코어의 하나 이상의 나선의 N-말단에 연결된다. 실시형태에서, 하나 이상의 분자는 hC의 코어의 하나 이상의 나선의 C-말단에 연결된다.
실시형태에서, hC의 코어의 하나 이상의 나선의 N- 및/또는 C-말단에 있는 T-세포 에피토프는 T 헬퍼 세포를 모집하고 B 세포를 유도하여 강력한 면역 반응을 제공하기 위한 최대 IgG 역가가 생산되고, 친화도 성숙 및 클래스 전환이 촉진된다. T-세포 에피토프 펩티드를 선택하는 방법이 잘 알려져 있다. 예컨대, T-세포 에피토프는 당업계에 공지된 실험 방법, 과학 문헌에서 확인, 생물정보학 도구를 사용하여 예측, 새롭게 설계, 또는 이러한 방법의 조합에 의해 선택될 수 있다. 실시형태에서, N-말단 및 C-말단에 있는 T-세포 에피토프는 동일하거나 상이하다. 실시형태에서, T-세포 에피토프는 예컨대 CD4+ T-세포 에피토프이며, 이는 고친화성 항체를 생산하는 기억 B 세포 및 형질 세포의 발달을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 실시형태에서, hC의 하나 이상의 나선의 N- 및/또는 C-말단에 포함될 수 있는 T-세포 에피토프는 TCE1(SEQ ID NO: 59 또는 78), TCE2(SEQ ID NO: 60), TCE3(SEQ ID NO: 61), TCE4(SEQ ID NO: 62), 또는 이들의 조합을 포함한다. 실시형태에서, T-세포 에피토프는 또한 아미노산 서열 SEQ ID NO: 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 61, 62 또는 78을 포함하는 펩티드를 포함한다. 이러한 T-세포 에피토프 중 하나 이상이 hC 또는 GnRH에 부착될 수 있다.
하나 이상의 T-세포 에피토프 및/또는 B-세포 에피토프는 또한 hC에 접합되기 전에 GnRH 펩티드에 연결될 수 있다. 다시, 이들 에피토프 T 헬퍼 세포를 모집하고 B 세포를 유도하기 위해 사용하여 최대 IgG 역가가 생산되고, 친화도 성숙 및 클래스 전환이 촉진된다.
합텐 또는 면역조절제, 예컨대 T-세포 및 B-세포 에피토프는 hC 또는 단량체 펩티드의 N- 및/또는 C-말단으로의 접합을 위해 GnRH에 연결되고, 하나 이상의 스페이서가 합텐과 GnRH 사이에 또는 합텐과 단량체 펩티드 사이에 삽입될 수 있다. 면역조절제, 예컨대 T-세포 에피토프를 위한 스페이서가 첨가되어 T-세포 에피토프를 올바르게 처리하여 MHC II 결합 틈(cleft)에 맞는 크기를 생산하는 단백질 분해 트리밍이 보장된다. 이러한 스페이서의 예는 잔기 D(아스파르트산), G(글리신), P(프롤린), S(세린), 또는 이들의 조합을 포함한다. 실시형태에서, 스페이서는 D, GD, PGP, GSG, GPGP(SEQ ID NO: 63), GPGPG(SEQ ID NO: 64), GPGPGC(SEQ ID NO: 65), 또는 SGPGPG(SEQ ID NO: 66) 중 하나 이상을 포함한다. 실시형태에서, T-세포 에피토프의 올바른 처리를 위한 스페이서는 GPGPG(SEQ ID NO: 64)를 포함한다.
작은 펩티드인 본원에 기술된 합텐 또는 면역조절제는 hC의 코어의 하나 이상의 나선의 N- 및/또는 C-말단에서 연결될 수 있다. 이는 고상 합성 또는 천연 화학 결찰(NCL)을 사용하여 단량체 펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 공유적으로 부착되도록 단량체 펩티드 내로 통합될 수 있다. 합텐은 동종 또는 이종이기능성 가교제를 사용하여 또는 커플링 분자를 위한 잘 알려진 시약인 클릭 화학 시약을 사용하여 N- 및/또는 C 말단에 공유적으로 부착될 수 있다. 실시형태에서, 면역조절제 또는 합텐, 예컨대 T-세포 에피토프 및/또는 B-세포 에피토프는 hC 코어, 예컨대 HhC 코어로 자가-조립되기 전에 N- 및/또는 C-말단에 이미 부착되어 있으며, GnRH는 hC 코어로 자가-조립된 후에 접합될 수 있다.
N- 및/또는 C-말단에서 합텐 또는 면역조절제는 또한 중간 기능성 시약(intermediary functional reagent) 예컨대 반응성 소분자 또는 큰 분자를 통해 hC에 연결 또는 접합될 수 있다. 이러한 소분자의 예는 촉매, 안정한 중간체, 또는 염을 포함한다. 이러한 큰 분자의 예는 다중 항원성 펩티드, 단백질, 또는 효소를 포함한다.
또한, GnRH 및/또는 다른 분자를 포함하는 합텐의 hC의 코어에 대한 접합은 임의의 종류의 링커를 사용하여 수행될 수 있다. 링커는 절단가능한 또는 절단불가능할 수 있다. 절단가능한 링커는 프로테아제 절단가능한 펩티드 링커, 뉴클레아제 민감성 핵산 링커, 리파제 민감성 지질 링커, 글루코시다제 민감성 탄수화물 링커, pH 민감성 링커, 효소 절단가능한 링커, 열-불안정한 링커, 광-절단가능한 링커를 포함한다. 가교제는 또한 공유 결합을 형성하기 위해 중간(intermediary) 또는 최종 분자 원자와의 공유 반응을 위해 측쇄 원자 또는 말단 원자의 활성화에 의해 사용될 수 있다.
본 개시내용은 이의 N- 또는 C-말단에 연결된, hC 단량체 펩티드 및 하나 이상의 합텐 및/또는 면역조절제, 예컨대 하나 이상의 T-세포 에피토프 및/또는 GnRH를 포함하는 스캐폴드 펩티드를 기술한다. 본원에 기술된 바와 같이, 스캐폴드 펩티드는 또한 하나 이상의 스페이서, 예컨대 T-세포 에피토프를 올바르게 처리 및/또는 합텐 또는 hC 단량체 펩티드를 안정화하기 위한 하나 이상의 잔기를 포함할 수 있다. 표 1은 예시적인 스캐폴드 펩티드를 개시한다.
스캐폴드 펩티드 명칭* 서열
GnRH -Hex-TCE2 G QHWSYGLRPG GDIRSIGKEIRSIGREIKSIGREIRSIGRGPGPFNNFTVSFWL
RVPRVSASHLEQY(SEQ ID NO: 67)
TCE3-Hex-TCE4 GQEAFSHIRIPLPHDIRSIGKEIRSIGREIRSIGKEIRSIGRE FQDAYNAAGGHNAVF
(SEQ ID NO: 68)
GnRH -Hex- GnRH G QHWSYGLRPG GSGDIRSIGKEIRSIGREIRSIGREIRSIGREGSG QHWSYGLRPG (SEQ ID NO: 69)
*GnRH에 대한 아미노산 서열은 굵게 표시하고 밑줄로 표시함. Hex에 대한 아미노산 서열은 밑줄로 표시함. T-세포 에피토프에 대한 아미노산 서열은 굵게 표시함.
예로서, GnRH-Hex-TCE2 스캐폴드 펩티드는 GnRH 펩티드, hC 단량체 펩티드(SEQ ID NO: 25), 및 T-세포 에피토프 2(TCE2) 펩티드를 포함한다. 이는 또한 하나 이상의 안정화 잔기 및 하나 이상의 스페이서로서 하나 이상의 잔기를 포함한다. 예컨대, G는 펩티드를 안정화하기 위해 GnRH 펩티드의 N-말단에 첨가되고; GD는 GnRH 펩티드와 단량체 펩티드 사이의 스페이서로서 삽입되고; PGP는 단량체 펩티드와 TCE2 사이에 삽입된다. GnRH 펩티드와 하나 이상의 T-세포 에피토프는 자가-조립 전에 hC 단량체 펩티드에 부착된다. 실시형태에서, hC 단량체 펩티드(SEQ ID NO: 25)는 육량체로 자가-조립되어 스캐폴드 펩티드를 형성한다. 따라서, 스캐폴드 펩티드, GnRH-Hex-TCE2는 육량체(Hex) 코어를 포함한다.
본 개시내용은 또한 치료제 제조를 위한 합텐-hC 접합체를 형성하기 위한 hC로의 접합을 위한 펩티드 면역원을 기술한다. 펩티드 면역원은 하나 이상의 합텐, 예컨대 GnRH 펩티드 및 선택적으로 하나 이상의 면역조절제, 예컨대 T-세포 에피토프를 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이, 펩티드 면역원은 또한 합텐을 안정화하기 위한, 예컨대 GnRH 펩티드를 안정화하기 위한, 또는 T-세포 에피토프의 올바른 처리를 위한 하나 이상의 다른 잔기를 포함할 수 있다. 표 2는 hC로의 접합을 위한 예시적인 면역원을 개시한다.
면역원 펩티드 명칭* 서열
GnRH QHWSYGLRPG DGEGC(SEQ ID NO: 70)
GnRH-TCE1 QHWSYGLRPG SGPGPGLTAELKIYSVIQAEINKHLGPGPGSFERFEIFPKEGPGPGC(SEQ ID NO: 71)
*GnRH에 대한 아미노산 서열은 굵게 표시하고 밑줄로 표시하고, T-세포 에피토프에 대한 아미노산 서열은 굵게 표시함.
추가로, 본 개시내용은 합텐-hC 접합체를 기술한다. 예시적인 합텐-hC 접합체는 다음을 포함한다: GnRH-Hex-TCE2 + GnRH-TCE1; TCE3-Hex-TCE4 + GnRH; TCE3-Hex-TCE4 + GnRH-TCE1; 및 GnRH-Hex-GnRH + GnRH-TCE1. "+"는 그것이 접합체이고 면역원이 스캐폴드 펩티드에 접합되었음을 나타낸다. 예시로서, GnRH-Hex-TCE2 + GnRH-TCE1 접합체는 GnRH-Hex-TCE2(GHhC) 스캐폴드 펩티드에 접합된 면역원 GnRH-TCE1 펩티드(합텐)를 포함한다.
실시형태에서, 본원에 기술된 스캐폴드 펩티드(합텐-hC 올리고머)는 또한 면역원일 수 있다. 이러한 올리고머 스캐폴드 펩티드의 예는 다음을 포함한다: GnRH-Hex-TCE2; TCE2-Hex-GnRH; GnRH-Hex-GnRH; 및 GnRH-Hex. 이러한 예시적인 합텐-hC 올리고머는 펩티드 면역원과 스캐폴드 펩티드 둘 모두로서 작용할 수 있다. 선택적으로, 추가 합텐, 예컨대 GnRH가 이러한 스캐폴드 펩티드의 올리고머 코어에 접합될 수 있다.
본원에 기술된 합텐-hC 접합체 및 합텐-hC 올리고머는 조성물, 예컨대 약학 조성물을 제조하는데 사용된다. 하나 이상의 합텐-hC 접합체 및 하나 이상의 합텐-hC 올리고머를 포함하는 약학 조성물은 치료제로서 사용될 수 있거나 치료제 또는 치료 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기술된 약학 조성물은 또한 이들이 합텐, 예컨대 GnRH 펩티드의 면역원성을 향상시키므로 면역조절제를 포함하는 면역원성 조성물이다. 본원에 기술된 약학 조성물은 또한 이들이 이를 필요로 하는 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있으므로 치료 조성물이다.
본 개시내용은 본원에 기술된 hC 및 하나 이상의 부형제를 포함하는 조성물을 기술한다. 실시형태에서, hC는 하나 이상의 GnRH 펩티드 및/또는 합텐 또는 조절제(합텐-hC 접합체 또는 GhC 올리고머)에 그리고 선택적으로 hC의 코어의 양친매성 나선의 하나 이상의 N- 및/또는 C 말단의 하나 이상의 T-세포 에피토프에 부착된다. 실시형태에서, 조성물은 약학 조성물이고 부형제는 약학적으로 허용되는 부형제이다. 실시형태에서, hC는 HhC이다.
용어 "부형제"는 hC가 함께 투여되는 희석제, 보조제, 또는 비히클을 지칭한다. 보조제의 예는 완전 및 불완전 프로인트(Freund's) 보조제를 포함하고, 이는 동물, 특히 연구 동물과 함께 사용된다. 약학적으로 허용되는 부형제는 멸균 액체, 예컨대 물, 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등을 포함한 오일일 수 있다. 약학 조성물이 정맥 내로 투여될 때 물이 바람직한 부형제이다. 식염수 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액 또한 특히 주사 용액을 위한 액체 부형제로서 이용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 소듐 클로라이드, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 약학적으로 허용되는 보조제는 스쿠알렌과 같이 오일과 혼합된 모노포스포릴 지질-A에 기반한 것들을 포함한다.
조성물 또는 약학 조성물은 요망된다면 또한 미량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속-방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 경구 제형은 표준 부형제, 예컨대 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등을 포함할 수 있다. 이러한 제형은 대상체로의 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 적합한 양의 부형제와 함께, 치료적 유효량의 정제된 형태의 hC를 함유할 것이다. 상기 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
본원에 기술된 약학 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 투입, 주입(implantation) 또는 이식(transplantation)에 의한 것을 포함하여 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기술된 조성물은 또한, 대상체에게 경구로, 국소로, 비내로, 장내로, 직장으로, 협측으로, 질내로, 설하로, 피하로, 피내로, 종양내로, 결절내로, 골수강내로, 근육내로, 정맥내로, 두개내로, 복강내로, 또는 이들의 조합에 의해 투여될 수 있다. 약학 조성물의 투여는 이를 필요로 하는 대상체에게 치료적 및/또는 예방적 유효량의 본원에 기술된 접합체를 전달하기에 효과적인 임의의 방식으로 수행될 수 있다.
본원에 기술된 조성물은 면역원성 조성물을 포함한다. 실시형태에서, 본원에서의 조성물은 치료제이다. 본 개시내용은 GnRH 면역원성 치료제를 생산하기 위한 펩티드 스캐폴드를 기술한다. 본 개시내용은 또한 본원에 기술된 hC의 코어를 위한 단량체 펩티드를 설계 및 제조하는 단계, 단량체 펩티드가 올리고머화되도록 하는 단계, 및 하나 이상의 GnRH 펩티드를 올리고머화된 hC에 접합시켜 예컨대 GnRH + hC(GnRH-hC) 접합체를 수득하는 단계를 포함하는 치료제 제조 방법을 기술한다. 추가로, 본 개시내용은 본원에 기술된 hC의 코어를 위한 단량체 펩티드를 설계 및 제조하는 단계, 합텐, 예컨대 GnRH 펩티드를 단량체 펩티드에 공유적으로 부착하는 단계, 및 단량체 펩티드가 올리고머화되도록 하여 합텐-HC 올리고머, 예컨대 GhC 올리고머를 수득하는 단계를 포함하는 치료제 제조 방법을 기술한다. 상기된 바와 같이, 단량체 펩티드는 제조된 단량체 펩티드를 동결건조된 형태로 제공하는 것을 포함하는 SPPS에 의해 합성될 수 있다. 동결건조된 단량체 펩티드의 수화는 올리고머화가 일어나도록 한다. 염 및 완충 기능을 포함하는 PBS가 동결건조된 단량체 펩티드를 수화하기 위해 사용될 수 있다. 실시형태에서, 올리고머화된 hC는 HhC이다.
본원에 기술된 방법은 GnRH의 면역원성을 증가시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 GnRH를 본원에 기술된 hC에 접합시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 hC의 코어의 하나 이상의 나선의 N- 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 다른 합텐 또는 면역조절제, 예컨대 T-세포 또는 B-세포 에피토프를 사용하여 단량체 펩티드를 합성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 실시형태에서, 단량체 펩티드는 N- 및/또는 C-말단에 존재하는 T-세포 및/또는 B-세포를 사용하여 합성된다. GnRH의 면역원성 증가는 예컨대 hC 또는 부형제와 연결되거나 결합되지 않은 GnRH 자체의 면역원성과 비교된다. 추가로, 본원에 기술된 방법은 GnRH 외에 하나 이상의 다른 합텐 또는 면역조절제를 접합시켜 GnRH의 면역원성을 증가시키는 단계를 포함한다. 이러한 합텐 및 면역조절제의 예는 소분자, 지질, 지질단백질, 및 TLR-4 작용제를 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용은 전술된 바와 같은 GnRH-hC 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 기술한다. GnRH-hC 접합체는 선택적으로 GnRH 외에, 하나 이상의 T-세포 및/또는 B-세포 에피토프 및/또는 하나 이상의 추가 합텐 또는 면역조절제를 포함한다. 실시형태에서, hC는 HhC이다. 면역원성 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 부형제는 치료 효과적인 방식으로 GnRH-hC 접합체에 대한 면역 반응을 개선 또는 향상시키기 위해 사용되는 보조제일 수 있다. 면역원성 조성물은 암 환자, 또는 테스토스테론 수준이 감소될 필요가 있는 임의의 대상체에 GnRH 면역원성 치료제를 유효량으로 전달하기 위해 본원에 기술된 임의의 경로에 의해 이를 필요로 하는 대상체에 투여될 수 있다.
본원에 기술된 약학적 및 면역원성 조성물을 대상체에 투여하기 위한 투약량은 치료될 병태의 정확한 성질 및 치료의 수혜자에 따라 달라질 것이다. 인간 투여를 위한 투약량의 양조절(scaling)은 당업계에서 허용된 관행에 따라 의사에 의해 다양한 인자들에 따라 수행될 수 있다.
본원에 기술된 약학적 또는 면역원성 조성물은 제형일 수 있다. 실시형태에서, 약학적 또는 면역원성 조성물은 즉시 방출을 위해 또는 지속 방출 또는 느린 방출을 위해 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 잘 알려진 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 지속 방출 제형은 부형제 매트릭스 내에 분산되고/거나 속도 제어 막에 의해 둘러싸인 저장소(reservoir) 내에 함유된 접합체인 본원에 기술된 접합체를 함유할 수 있다. 이러한 제형 내에서 사용하기 위한 부형제는 생체적합성 및/또는 생체분해성이다. 상기 제형은 상대적으로 일정한 수준의 활성 구성요소 방출을 제공한다. 지속 방출 제형 내에 함유된 접합체의 양은 주입 부위, 방출 속도 및 예상된 지속기간, 및 치료되거나 예방되어야 할 병태의 성질에 좌우된다.
본 개시내용은 또한 본원에 기술된 접합체의 단위 용량과 함께 키트를 기술한다. 이러한 키트는 단위 용량을 함유하는 용기, 관심 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하기 위해 상기 키트를 사용하는 설명서를 포함하는 정보 패키지 삽입물, 및 선택적으로 조성물의 전달을 위한 기기 또는 장치를 포함할 수 있다.
추가로, 본 개시내용은 합텐 예컨대 GnRH의 면역원성을 향상시키는 방법을 기술한다. 실시형태에서, 상기 방법은 본원에 기술된 단량체 펩티드를 수득하는 단계, 단량체 펩티드가 올리고머(hC), 예컨대 육량체로 자가-조립되도록 하는 단계, 및 합텐, 예컨대 GnRH 펩티드를 올리고머(육량체 hC)에 접합시켜 합텐-hC, 예컨대 GnRH-HhC를 수득하는 단계를 포함한다. 면역조절제는 또한 올리고머에 접합될 수 있다. 실시형태에서, 상기 방법은 또한 N- 및/또는 C-말단 상에 GnRH(G) 펩티드를 함유하도록 단량체 펩티드(MP)를 합성하는 단계, 및 GnRH-MP(GMP)가 올리고머, 예컨대 육량체로 자가-조립되도록 하여 합텐-hC 올리고머, 예컨대 GnRH-HhC 올리고머를 수득하는 단계를 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이, 합텐-hC 접합체 또는 올리고머는 하나 이상의 추가 합텐 또는 면역조절제 예컨대 GnRH, 하나 이상의 T-세포 에피토프, 또는 B-세포 에피토프를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 합텐-hC 접합체 또는 올리고머는 합텐을 안정화하기 위한 하나 이상의 잔기, T-세포 에피토프의 적절한 처리를 위한 하나 이상의 잔기, 및/또는 합텐과 단량체 펩티드 사이에 삽입된 하나 이상의 스페이서를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기술된 방법은 대상체를 예방 또는 치료하기 위해 이를 필요로 하는 대상체에 투여하기 위한 치료제 또는 치료 조성물, 예컨대 GnRH 면역원성 치료 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용은 또한 이를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해 본원에 기술된 접합체, 올리고머, 약학 조성물, 치료제, 치료 조성물 및 백신의 용도를 기술한다. 조성물과 유사하게, 백신은 본원에 기술된 접합체 또는 올리고머를 포함한다. 본 개시내용은 또한 이를 필요로 하는 대상체의 치료 방법을 기술한다.
본원에 기술된 방법은 대상체, 예컨대 인간, 수의학적 동물(개, 고양이, 파충류, 조류 등), 가축(말, 소, 염소, 돼지, 닭 등), 및 연구 동물(원숭이, 래트, 마우스, 어류 등)을 포함한다. 치료를 필요로 하는(이를 필요로 하는) 대상체는 질환 또는 장애의 대상체를 치료하기에 충분하거나 치료적으로 효과적인, 대상체에서 면역 반응을 유도할 GnRH 치료제 또는 면역원성 조성물로 치료될 필요가 있는 질환 또는 장애를 갖는 대상체이다. 따라서, 이를 필요로 하는 대상체는 전립선암으로 진단되거나 이를 앓고 있을 수 있다.
예시로서, 본원에 기술된 GnRH-hC 접합체를 사용한 백신접종에 의해 유도된 항체는 GnRH가 이의 수용체에 결합하는 것을 중화 및 방지하고 테스토스테론 생산을 차단할 수 있다. 테스토스테론 생산 차단은 테스토스테론이 증식하거나 전이하는데 필요한 세포, 예컨대 전립선 종양 세포를 억제할 수 있다. 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 전립선암으로 진단된 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
치료는 유효량의 본원에 기술된 접합체 또는 본원에 기술된 접합체를 유효량으로 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. "유효량"은 생체 내에서 또는 시험관 내에서 요망되는 생리학적 변화를 초래하는데 필요한 활성 제제, 예를 들어 본원에 기술된 접합체 또는 조성물의 양이다. 치료적 유효량은 유효량을 제공하는 것들을 포함한다.
유효한 치료제는 면역화 후 선천 면역 반응과 적응 면역 반응 둘 다를 유도할 수 있는 구성요소를 함유한다. 선천 면역력이 보조제를 사용하여 유도되는 반면, 실시형태에서, 본원에 기술된 치료제는 도 1에 도시된 바와 같이 적응 B-세포 및 T-세포 에피토프를 함유하는 GnRH-hC 접합체를 포함한다. GnRH 접합 후, GnRH-hC 접합체는 GnRH B-세포 에피토프에 대한 더욱 초점화되고 강력한 면역 반응을 위해 최소의 외래 서열을 함유한다. 실시형태에서, CD4+ T-세포 활성화를 위해, HhC의 6개 나선 및/또는 코어 각각의 N- 및 C-말단은 T-세포 헬프를 동원하며, 장기-수명 형질 세포 및 고역가/고친화도 항체를 생산하고, 강력한 면역 기억 반응을 지향시키는(directing)데 필요한 종-특이적 CD4+ T-세포 에피토프를 함유한다. 이러한 에피토프는 HhC의 말단에 배치되어, 이들은 합텐 커플링을 간섭하지 않는다. 이는 리신 및 시스테인 잔기가 결여되어 있어서 이것이 B-세포 에피토프 커플링 과정 동안 합텐화되지 않거나 비제어가능하게 가교되지 않도록 선택된다. T-세포 에피토프에서 리신 합텐화는 이의 활성 및 기능을 크게 감소시키는 것으로 나타났다. 많은 상이한 종들로부터의 T-세포 에피토프는 IEDB 데이터베이스로부터 획득될 수 있고 MHC 리간드 결합 검정법을 포함한 양성 T-세포 및 B-세포 검정법, T-세포 헬프를 동원시키는 능력, 및 B-세포 증식의 유도에 기반하여 선택된다. 본원에 기술된 치료제 기술의 모듈형 성질은 종들 사이에서 치료제 작제물의 전달을 단순화시키는데, 이것은 상이한 질환 또는 병태가 표적화되는 경우 T-세포 에피토프를 대체하고 B-세포 에피토프를 변형시키는 단순한 문제가 되기 때문이다.
본원에 기술된 HhC 코어 영역의 명백한 이점은 특히 합텐 접합 후 이의 감소된 면역원성(도 2)이며, 이는 비생산적 면역우성 에피토프의 제시를 최소화한다. 그러므로, 다수의 GnRH B-세포 에피토프의 제시와 비-생산적 면역우성 에피토프의 감소의 조합과, 다수의 T-세포 에피토프의 제시는 고도로 유효한 치료제를 생산한다.
완전히 합성적인 GnRH-hC 접합체 치료제 스캐폴드 또는 GhC 올리고머 스캐폴드를 사용하는 이점은 무수히 많다. 최신의 SPPS는 최대 70개 내지 75개의 잔기 길이의 펩티드를 일상적으로 생산한다. 본원에 기술된 HhC는 크기가 55개 내지 65개 잔기 범위일 것이고, 이때 T-세포 에피토프의 길이는 HhC의 28개 내지 30개 잔기 코어 영역보다 얼마나 훨씬 더 길 것인지 정의한다. GnRH 펩티드는 10개 잔기 길이이고 간격을 두거나 고유한 화학적 성질을 부여하기 위해 추가 아미노산을 함유할 수 있으므로 치료제의 전체 합성 작제가 실현되게 한다. cGMP 설비에서 킬로그램 양의 치료제 펩티드를 생산하는 것은 비용이 많이 들며, 시간 소모적이고, 자원 집약적인 산업적 생산 및 재조합 단백질의 정제를 없애고 후속적인 바이러스 청소, 내독소 제거, 또는 감염성 병원체의 존재에 대한 시험에 대한 필요성이 없다. 통상적으로 펩티드 합성은 대규모 치료제 제조에는 비용이 너무 많이 드는 것으로 인지된다. 그러나, 고(high) 나노그램 내지 저(low) μg 용량이 사용될 수 있는 경우, 펩티드 치료제는 재조합 서브유닛 치료제에 접합된 GnRH보다 몇 배 더 비용 효율적일 수 있다.
용어 "잔기" 및 "아미노산"은 개시내용 전반에 걸쳐 상호 교환적으로 사용되어 "아미노산"을 지칭한다.
당업자가 이해하게 될 바와 같이, 본원에 개시된 각각의 실시형태는 이의 특정하게 언급된 요소, 단계, 성분 또는 구성요소를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성될 수 있다. 따라서, 용어 "포함하다(include)" 또는 "포함하는(including)"은, "포함하다(comprise), 구성되다, 또는 본질적으로 구성된다"를 언급하는 것으로 해석되어야 한다. 과도기 용어(transitional term) "포함하다(comprise)" 또는 "포함한다(comprises)"는 심지어 주요량이라도 명시되지 않은 요소, 단계, 성분 또는 구성요소를 포함하지만, 이로 제한되지 않고, 이의 포함을 가능하게 함을 의미한다. 과도기 어구 "구성되는(consisting of)"은 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 성분 또는 구성요소를 배제한다. 과도기 어구 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"은 실시형태의 범위를 명시된 요소, 단계, 성분 또는 구성요소로, 그리고 실시형태에 물질적으로 영향을 주지 않는 것들로 제한한다. 실시형태에서, 실시형태에 물질적으로 영향을 미치지 않는 것은 질환에 대한 면역을 제공하는 것과 같이 시험관 내 또는 생체 내에서 기능을 수행하는 통계적으로 유의한 방식으로 실시형태의 능력을 감소시키지 않는 요소, 단계, 성분 또는 구성요소이다. 실시형태에서, GnRH, hC, 또는 T-세포 에피토프와 같은 본원에 기술된 접합체 및 올리고머의 구성요소는 특정 서열로 본질적으로 구성될 수 있거나 이로 구성될 수 있다. 실시형태에서, 치료제 또는 치료 조성물은 GnRH-hC 접합체 또는 GhC 및 부형제로 본질적으로 구성될 수 있거나 이로 구성될 수 있다.
또한, 다르게 지시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에서 사용되는 성분, 구성 성분, 반응 조건 등의 양을 표현하는 숫자는 용어 "약(about)"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 대조적으로 지시되지 않는 한, 명세서 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치 매개변수는 본원에 제시된 주제에 의해 수득되고자 하는 요망되는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 최소한으로, 그리고 청구범위의 범주의 등가물의 원칙의 적용을 제한하려는 시도가 아니면서, 각각의 수치 매개변수는 보고된 유효 숫자의 측면에서 그리고 일반적인 반올림 기법을 적용함으로써 적어도 간주되어야 한다. 본원에 제시된 주제의 광범위한 범주를 설정하는 수치 범위 및 매개변수가 근사치임에도 불구하고, 구체적인 예에 제시된 수치 값은 가능한 한 정밀하게 보고된다. 그러나, 임의의 수치 값은 본질적으로 이들 각각의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로 인해 소정의 오차를 본질적으로 함유한다.
추가의 명료성이 필요할 때, 용어 "약"은 언급된 수치 값 또는 범위와 함께 사용될 때 당업자에 의해 이에 합리적으로 기인되는 의미를 가지며, 즉, 언급된 값 또는 범위보다 다소 많거나 또는 다소 적은 값, 언급된 값의 ±20%; 언급된 값의 ±15%; 언급된 값의 ±10%; 언급된 값의 ±5%; 언급된 값의 ±4%; 언급된 값의 ±3%; 언급된 값의 ±2%; 언급된 값의 ±1%; 또는 언급된 값의 1% 내지 20% 사이의 임의의 백분율을 의미한다.
본 발명을 설명하는 문맥에서(특히 하기 청구범위의 문맥에서) 사용되는 용어 단수형("a", "an", "the") 및 유사한 지시물은 본원에서 다르게 지시되거나 문맥상 명확하게 상충되지 않는 한, 단수형과 복수형 둘 다 망라하는 것으로 간주되어야 한다.
본원에서 값의 범위에 대한 언급은 단지, 상기 범위에 속하는 모든 개별 값을 개별적으로 지칭하는 속기법으로서 역할을 하고자 한다. 본원에서 다르게 지시되지 않는 한, 각각의 개별값은 이것이 본원에서 개별적으로 언급된 것처럼 명세서에 포함된다. 범위 형식의 설명은 단순히 편의성과 단순성을 위한 것이고 개시내용의 범위에 융통성이 없는 제한으로서 간주되어서는 안됨을 이해해야 한다. 이에, 범위의 설명은 해당 범위 내의 모든 가능한 하위범위뿐만 아니라 개별 수치값을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 범위, 예컨대 1 내지 6의 설명은 구체적으로 개시된 하위범위, 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등, 뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 수치, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 갖는 것으로 고려되어야 한다. 이는 범위의 폭과 상관없이 적용된다.
본원에 기술된 모든 방법은 본원에서 다르게 지시되거나 문맥상 명확하게 상충되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다.
본원에 제공된 임의의 그리고 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 본 발명을 더 양호하게 예시하고자 할 뿐이고 본 발명의 범주에 청구된 것과 다르게 제한을 두는 것은 아니다. 명세서 내의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 비-청구 요소를 지시하는 것으로 간주되어서는 안된다.
본원에 개시된 본 발명의 대안적인 요소 또는 실시형태의 그룹핑은 제한으로서 간주되어서는 안된다. 각각의 그룹 구성원은 개별적으로 또는 본원에서 발견되는 그룹의 다른 구성원 또는 다른 요소와 임의의 조합되어 지칭되고 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원은 편의성 및/또는 특허성의 이유에서 그룹으로 포함되거나 그룹으로 결실될 수 있는 것으로 예상된다. 임의의 이러한 포함 또는 결실이 발생할 때, 명세서는 변형 그룹을 함유하는 것으로 여겨져서, 첨부된 청구항에 사용된 모든 마쿠시 그룹들의 기술된 설명을 충족시킨다.
하기 예시적인 실시형태 및 실시예는 본원에 제공된 예시적인 방법을 예시한다. 이들 실시예는 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않고, 이들이 제한하는 것으로 간주되어서도 안된다. 상기 방법은 본원에서 특정하게 기술된 것과 다르게 실시될 수 있음이 명확할 것이다. 많은 변형들 및 변화들은 본원의 교시의 측면에서 가능하고, 따라서, 개시내용의 범위 내에 포함된다.
예시적인 실시형태
1. 합텐 담체(hC)에 공유 부착된 하나 이상의 성선자극 방출 호르몬(GnRH) 펩티드을 포함하는 GnRH 접합체(GnRH-hC) 또는 GnRH 올리고머(GhC)로서, 상기 hC는 하기 아미노산 서열을 포함하는 단량체 펩티드를 포함하는 올리고머를 포함하는 GnRH 접합체(GnRH-hC) 또는 GnRH 올리고머(GhC):
(hwxhxyz)n(SEQ ID NO: 2),
상기 식에서
h는 소수성 또는 비-극성 잔기이고;
w는 양으로 하전된, 음으로 하전된, 극성 비하전된, 또는 비-극성 지방족 잔기이고;
x는 음으로 하전된, 양으로 하전된, 비-극성 지방족, 또는 극성 비하전된 잔기이고;
y는 에피토프 커플링을 위한 잔기이고;
z는 음으로 하전된, 양으로 하전된, 극성 비하전된, 또는 비-극성 지방족 잔기이고;
n은 1 초과의 정수임.
2. 실시형태 1에 있어서, 단량체 펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2를 포함하는 GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머로서, 여기서
h는 I, L, V, F, W, Y, M, W, G, 또는 A이고;
w는 G, R, A, N, Q, H, S, D, E, K 또는 T이고;
x는 R, S, N, Q, A, G, T, D, E, K, H, 또는 C이고;
y는 K, H, C, D, E, R, W, Y, Q, N, 또는 공유 커플링될 수 있는 반응성기를 함유하는 비-천연 아미노산 또는 분자이고;
z는 A, D, H, S, E, R, N, Q, K, 또는 G이고;
n은 2 내지 10인, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
3. 실시형태 1 또는 2에 있어서, 단량체 펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18을 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
4. 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 단량체 펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27을 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
5. 실시형태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 단량체 펩티드는 N-말단 및/또는 C-말단에 잔기 V, M, G, I, D, P, C, S, C, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 올리고머는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체 또는 십량체인, 접합체 또는 올리고머.
7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 올리고머는 육량체인, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
8. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 GnRH 펩티드는 척추동물로부터 수득되는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 GnRH 펩티드는 포유류로부터 수득되는, 접합체.
10. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 GnRH 펩티드는 인간으로부터 수득되는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 GnRH 펩티드는 아미노산 서열을 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머:
X1HWSX2GX3X4PG(SEQ ID NO: 28),
상기 식에서,
X1은 극성 또는 하전된 아미노산이고;
X2는 극성 아미노산이고;
X3은 소수성 또는 양친매성 아미노산이고;
X4는 소수성, 양친매성, 하전된, 또는 극성 아미노산이다.
12. 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 GnRH 펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 28을 포함하는 GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머로서, 여기서
X1은 Q 또는 E이고;
X2는 Y 또는 H이고;
X3은 L 또는 W이거나;
X4는 L, Y, R, 또는 Q임.
13. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 GnRH 펩티드는 아미노산 서열을 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머:
QHWSYGLRPG(SEQ ID NO: 29);
QHWSHGWLPG(SEQ ID NO: 30);
EHWSYGLRPG(SEQ ID NO: 31);
QHWSYGWYPG(SEQ ID NO: 32);
EHWSYGLQPG(SEQ ID NO: 33); 또는
QHWSHGWYPG(SEQ ID NO: 34).
14. 실시형태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 GnRH 펩티드는 하나 이상의 GnRH 펩티드를 안정화시키기 위해 및/또는 hC에 하나 이상의 GnRH 펩티드를 접합시키기 위해 N- 및/또는 C-말단에 추가의 아미노산을 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
15. 실시형태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 GnRH 펩티드는 아세틸화된 하나 이상의 GnRH 펩티드의 N- 및/또는 C-말단 또는 N-말단에 G, V, M, A, 또는 이들의 조합을 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
16. 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 GnRH 펩티드는 N- 또는 C-말단에 GEDC(SEQ ID NO: 36) 또는 DGEGC(SEQ ID NO: 37)를 추가로 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
17. 실시형태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머는 2개 이상의 GnRH 펩티드를 포함하고 상기 GnRH 펩티드는 상이한 공급원으로부터 수득되고/되거나 SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 또는 34로부터 선택되는 상이한 아미노산 서열을 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
18. 실시형태 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 GnRH 펩티드는 단량체 펩티드 상의 y 잔기를 통해 hC에 접합되는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
19. 실시형태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머는 하나 이상의 면역조절제 또는 추가 합텐을 추가로 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
20. 실시형태 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 면역조절제 또는 추가 합텐은 단량체 펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 공유적으로 융합되거나(혼입되거나) 올리고머의 나선의 하나 이상의 N- 및/또는 C-말단에 공유 부착되는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
21. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머는 합텐 또는 면역조절제와 단량체 펩티드 사이에 하나 이상의 스페이서를 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
22. 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 스페이서는 G(글리신), D(아스파르트산), S(세린), C(시스테인), 또는 이들의 조합을 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
23. 실시형태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 스페이서가 D, GD, 및/또는 GSG를 포함하는 GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
24. 실시형태 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 합텐 또는 면역조절제는 GnRH 펩티드, 하나 이상의 T-세포 에피토프, 및/또는 하나 이상의 B-세포 에피토프를 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
25. 실시형태 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 T-세포 에피토프는 CD4+ T-세포 에피토프를 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
26. 실시형태 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, T-세포 에피토프는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 또는 78을 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
27. 실시형태 25 또는 26에 있어서, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머는 하나 이상의 T-세포 에피토프의 올바른 처리를 위한 하나 이상의 잔기를 추가로 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
28. 실시형태 27에 있어서, 하나 이상의 잔기는 D, G, P, 또는 S, 또는 이들의 조합을 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
29. 실시형태 27 또는 28에 있어서, 하나 이상의 잔기는 D, GD, PGP, GSG, GPGP(SEQ ID NO: 63), GPGPG(SEQ ID NO: 64), GPGPGC(SEQ ID NO: 65), 및 SGPGPG(SEQ ID NO: 66)를 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
30. 실시형태 20 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 면역조절제 또는 추가 합텐은 하나 이상의 GnRH 펩티드의 면역원성을 향상시키거나 하나 이상의 GnRH 펩티드의 면역 반응의 지속기간 또는 폭을 향상시키는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
31. 실시형태 20 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 면역조절제 또는 추가 합텐은 지질, 펩티드, 핵산, 또는 이들의 조합을 포함하고, 상기 하나 이상의 면역조절제 또는 추가 합텐은 hC에 접합되거나 올리고머의 나선의 하나 이상의 N- 및/또는 C-말단에 공유 부착되는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
32. 실시형태 20 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 면역조절제 또는 추가 합텐은 모노포스포릴 지질-A, 스쿠알렌, 지질다당류, 지질단백질, 지질펩티드, APPHALS(SEQ ID NO: 58), 키스펩틴 펩티드, 키스펩틴 수용체, 또는 GnRH 수용체를 포함하는, GnRh 접합체 GnRH 올리고머.
33. 실시형태 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 67, 68, 또는 69를 포함하는 올리고머 스캐폴드 펩티드를 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
34. 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 GnRH 펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 70을 포함하거나 하나 이상의 GnRH 펩티드가 아미노산 서열 SEQ ID NO: 71을 포함하는 GnRH-TCE1 에피토프를 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
35. 실시형태 1 내지 34 중 어느 하나의 GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머 및 부형제를 포함하는, 조성물.
36. 실시형태 35에 있어서, 조성물은 약학 조성물이고 부형제는 약학적으로 허용되는 부형제인, 조성물.
37. 질환이 있는 대상체의 치료 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 실시형태 1 내지 34 중 어느 하나의 접합체 또는 실시형태 36의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 합텐은 대상체를 치료하기 위한 면역 반응을 유도하는, 방법.
38. 실시형태 37에 있어서, 대상체는 포유류인, 방법,
39. 실시형태 37 또는 38에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
40. 실시형태 37 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 질환은 전립선암인, 방법,
41. GnRH 펩티드의 면역원성을 강화시키는 방법으로서, 상기 방법은 다음을 포함하는 방법:
실시형태 1 내지 34 중 어느 하나의 단량체 펩티드를 수득하는 단계;
단량체 펩티드가 hC로 자가-조립되도록 하는 단계; 및
실시형태 1 내지 34 중 어느 하나의 GnRH 펩티드를 hC에 접합시켜 GnRH-hC 접합체를 수득하는 단계.
42. 실시형태 41에 있어서, GnRH-hC 접합체는 GnRH 육량체(GnRH-HhC) 접합체인, 방법.
43. GnRH 펩티드의 면역원성을 강화시키는 방법으로서, 상기 방법은 다음을 포함하는 방법:
GnRH 단량체 펩티드(GMP)를 합성하는 단계, 여기서 상기 GMP는 실시형태 1 내지 34 중 어느 하나의 단량체 펩티드 및 실시형태 1 내지 34 중 어느 하나의 GnRH 펩티드를 포함하고; 및 GMP가 GnRH-hC 올리고머(GhC)로 자가-조립되도록 하는 단계.
44. 실시형태 42에 있어서, GnRH 올리고머는 GnRH 육량체 올리고머(GHhC)인, 방법.
45. GnRH 치료제의 제조 방법으로서, 상기 방법은 다음을 포함하는 방법:
실시형태 1 내지 34 중 어느 하나의 단량체 펩티드를 수득하는 단계;
단량체 펩티드가 hC로 자가-조립되도록 하는 단계; 및
실시형태 1 내지 34 중 어느 하나의 GnRH 펩티드를 hC에 접합시켜 GnRH-hC 접합체를 수득하는 단계.
46. 실시형태 45에 있어서, GnRH-hC 접합체는 GnRH-HhC 접합체인, 방법.
47. GnRH 치료제의 제조 방법으로서, 상기 방법은 다음을 포함하는 방법:
GnRH 단량체 펩티드(GMP)를 합성하는 단계, 여기서 상기 GMP는 실시형태 1 내지 34 중 어느 하나의 단량체 펩티드 및 실시형태 1 내지 34 중 어느 하나의 GnRH 펩티드를 포함하고; 및
GMP가 GnRH-hC 올리고머(GhC)로 자가-조립되게 함에 따라 GnRH 치료제가 수득되는 단계.
48. 실시형태 42에 있어서, GnRH-hC 올리고머는 GnRH 육량체 올리고머(GHhC)인, 방법.
49. 실시형태 1 내지 34 중 어느 하나의 GnRH 펩티드 및 실시형태 1 내지 34 중 어느 하나의 단량체 펩티드를 포함하는, 펩티드.
50. 실시형태 49에 있어서, 펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 67을 포함하는, 펩티드.
51. 아미노산 SEQ ID NO: 70 또는 SEQ ID NO: 71을 포함하는, 펩티드 면역원.
52. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 15, 16, 17, 또는 18을 포함하는 헵타드를 포함하는, 단량체 펩티드.
53. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 25, 26, 또는 27을 포함하는, 단량체 펩티드.
실시예
실시예 1. GnRH 치료제 작제
합텐 접합체(도 1)를 위한 각 육량체 담체 상에 최대 24개의 커플링 부위가 존재하지만, 입체 장해(steric hindrance)로 인해, 접합은 모든 부위 상에서 발생할 것 같지 않다. 담체를 합텐으로 포화시키는 것이 가장 강력한 면역 반응을 항상 발휘하는 것은 아니고, 커플링 밀도, 올바른 B-세포 에피토프 제시를 위한 에피토프 공간적/입체적 이용 가능성과 항체 역가 사이에서 균형(trade-off)이 존재한다는 것이 이전에 제시되었다. 따라서, 3개의 별개의 육량체 접합 반응을 수행하여 상이한 에피토프 로딩 수준을 갖는 접합체를 수득하였다. 예를 들어, 하나의 반응을 3 내지 5 몰 당량의 GnRH로 수행하여 단지 3개 또는 4개의 펩티드가 접합되며, 또 다른 반응은 8 내지 10 몰 당량을 함유하여 6개 내지 10개의 펩티드와 함께 접합체를 형성하고, 제3 반응은 25 내지 50 몰 당량을 사용하여 가능한 한 많은 에피토프와 커플링되도록 수행된다(포화 조건).
도 1은 GnRH 접합 절차를 예시한다. GnRH는 N-말단 잔기가 아세틸화되어 N-말단 아민을 가교제에 의한 유도체화로부터 보호하도록 설계된다. C-말단은 pI를 조절하기 위해 첨가된 잔기(GEDC)를 포함하였는데, 이는 천연 GnRH가 8.3의 pI를 갖고 육량체 담체의 pI가 10.1이기 때문에 GnRH에 순음전하(net negative charge)를 부여함으로써 커플링 효율이 증가되기 때문이다. QHWSYGLRPGGEDC(SEQ ID NO: 72)의 pI는 5.3이다. 시스테이닐 설프히드릴기를 통해 특이적 공유 결합을 위한 C-말단 Cys 잔기를 첨가하였다. 반응 효율을 결정하기 위해 커플링 후 형광-기반 펩티드 정량화를 위해 Trp 잔기는 천연 GnRH에 존재하였다.
트립토판 형광, 겔 여과 크로마토그래피, 천연 PAGE, 및 SELDI-TOF(단백질-펩티드 접합체의 분자량을 결정하도록 이상적으로 적합화된 MALDI-유사 MS 기기)는 펩티드 에피토프 커플링 효율을 정량화하기 위해 사용되는 방법이다. 육량체성 담체에 그리고 BSA(GnRH-BSA는 ELISA 분석에서 코팅 시약으로서 사용됨)에 접합된 GnRH 펩티드의 수를 계산하는 것이 상대적으로 간단하다. KLH는 항원성 "황금-표준(gold-standard)" 합텐 담체이기 때문에 양성 면역화 대조군으로서 사용하였다. 그러나, 이는 너무 커서 접합된 펩티드의 정확한 수를 계산하지 않고 성공적인 접합을 확인하는 것만 가능할 수 있다.
실시예 2. GnRH-hC 접합체 작제물의 특성분석
보조제 : 적응 B-세포 및 T-세포 반응을 향상시키며, 보호 면역력의 정도를 조절하고, GnRH-특이적 항체 반응을 최대화하기 위해, 보조제를 모든 면역화에 사용하였다. 최상의 보조제는 수지상 세포 성숙화를 직접 자극시키고 이를 가이드하는 가장 효율적인 방식은 TLR-매개 활성화를 통하는 것이다. 합성 TLR4-기반 보조제는 가장 효과적인 것들 중 일부이며, 이들 중 적어도 2개를 시험하였다. 모노포스포릴 지질 A(MPL)는 1차 보조제로서 기능할 수 있는 강력한 TLR4 작용제이다. MPL은 스쿠알렌(Sq)으로 유화되어 MPL-Sq를 형성한다. 에멀젼은 기억 및 장기-수명 GnRH 항체 반응 둘 모두를 유도하는데 중요한 CD4+ T-세포를 효율적으로 프라임(prime)한다. 인간에 사용하기 위해 승인된 보조제 E6020 및 GLA를 또한 시험하였다. 모든 보조제는 수지상 세포 내로의 CD4+ 유도된 GnRH-hC 접합체 흡수(uptake)를 도울 수 있고 T-세포 에피토프 결합을 위한 GnRH-hC 접합체 특이적 Th1 CD4+ T 세포를 유도할 수 있다. 보조제 기능을 평가하기 위해, CD4+ T 세포와 IgG 이소타입 클래스 스위칭 둘 모두를 면역화된 마우스 혈청에서 정량화하였다. 보조제의 또 다른 중요한 이익은 또한 시험될 것인 항원 용량-스페어링(antigen dose-sparing)의 높은 가능성이다. 용량-스페어링은 면역화 당 GnRH-hC 접합체의 양을 감소시킬 있고 합성 펩티드 배치로부터 수득될 수 있는 용량의 수를 증가시킬 수 있으며 합성 GnRH-hC 접합 제조 비용을 감소시키는데 있어서 중요한 결정 인자이다.
각각의 GnRH-hC 접합체에 대해, 적어도 3개 세트의 실험을 수행하였다. 마우스는 프라임-부스트 면역화(IM)를 받고, B-세포 및 T-세포 기능을 면역화 후 여러 번 측정하였다. GnRH-hC 접합체의 3개 용량 수준을 비교하여 어떤 수준에서 최대 항-GnRH IgG 역가가 수득되었는지 결정하였다. 육량체를 GnRH와 함께 최대로 로딩하고 면역화 전에 MPL-Sq 보조제와 함께 제형화하였다. 3개 용량 수준(예컨대, 0.1, 1, 및 10 μg GnRH-hC)을 시험하였고 항-GnRH IgG 역가에 따라 최적화하였다. 이 실험 또한 hC 단독, GnRH 단독, 및 GnRH + hC(비접합되었으나 조합됨)에 대한 IgG 반응을 측정함으로써 항-GnRH IgG 특이성을 시험한다.
GnRH-hC 접합체로 마우스 면역화 : 동계교배한 마우스(10 마리/그룹)는 보조제 GnRH-hC 접합체 또는 대조군(GnRH-KLH 접합체)에 의한 프라임/부스트 면역화를 받았다. 제1 세트의 연구는 최적의 GnRH-hC 접합체 용량을 제공하였고 각각의 용량 수준에서 항-GnRH IgG 역가를 측정하였다. 프라임 면역화와 부스트(d35) 면역화 둘 다 이후 14일차에 혈청을 수집하였고 항체 중간점 역가를 측정하였다. B-세포 및 T-세포 검정법을 수행하기 위해 마우스 혈액을 사용하였다.
B-세포 기능 : 표준 ELISA를 사용하여 수집된 마우스 혈청 중 GnRH-특이적 항체 역가에 의해 치료제 효능을 측정하였다. ELISA 플레이트를 펩티드 GnRH-BSA 접합체로 코팅하고 블로킹 완충액 중 혈청의 8개의 순차적 10-배 희석물(1:103 내지 1:1010)을 만들고 ELISA 플레이트 웰에 첨가하였다. HRP-표지 항-마우스 2차 항체를 첨가하고 플레이트를 비색 기질로 발색시키고 ELISA 플레이트 판독기에서 측정하였다. 데이터를 플롯팅하고, 곡선 피팅하고, 중간점 및 종말점 역가를 계산하기 위해 Prism Graph Pad 소프트웨어를 사용하여 통계학적으로 분석하였다.
T-세포 기능: 잘-확립된 T-세포 ELISA 검정법에 의해 T-세포 에피토프 및 보조제 기능을 측정하였다. 상업적으로 입수 가능한 코팅 시약 및 1차/2차 항체를 구매하고 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하였다. IFN-γ, IL-2, IL-4, 및 TNF-α를 GnRH-hC 접합체 면역화된 마우스에서 T-세포 기능의 판독물로서 마우스 혈청에서 정량화하였다. 이들 표적은 IL-5, IL-8, IL-10, IL-12p70, 및 IL-13을 포함하여 T-세포 기능의 다른 마커를 포함하도록 확장(expand)될 수 있다. 총 IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, 및 IgA에 대해 특이적인 시약을 사용하여 ELISA에 의해 GnRH-hC 접합체 유도된 T-세포 의존적 이소타입 클래스 및 서브클래스 스위칭을 분석하였다.
GnRH-hC 접합체 안전성: 안전성의 초기 평가를 비-GLP 설정에서 수행하여 마우스가 치료제 구성요소(GnRH-hC, 보조제)에 대해 부작용을 갖지 않음을 보장하였다. 더욱 정밀하고 상세한 안전성 연구를 이후에 GLP 연구에서 수행하였지만, 이러한 초기 평가는 일부 중요한 판독물을 제공하여 치료제 용량, 보조제 용량, 및 면역화 스케쥴링을 가이드하였다. 주사 부위 반응 및 염증징후 뿐만 아니라 마우스 행동(예를 들어, 무기력의 징후)을 관찰함으로써 잠재적인 국소 및 전신 독성을 평가하였다. 독성이 관찰되는 경우, 상이한 보조제 및/또는 T-세포 에피토프를 평가하였다.
실시예 3. 치료제로서 사용하기 위한 GnRH-hC 접합체 및 GHhC의 제조
합텐-hC 접합체를 제조하기 위해, 펩티드 면역원을 (트리스(2-카복시에틸)포스핀)으로 시스테이닐 설프히드릴기를 환원시킨 후 육량체 스캐폴드 펩티드에 공유 결합시킨 다음, 이종이기능성 공유 가교제로 먼저 활성화된 올리고머 스캐폴드와 함께 인큐베이션 하였다. 펩티드 면역원은 GnRH 펩티드 및 GnRH-TCE1 펩티드를 포함한다. 육량체 스캐폴드 펩티드는 GnRH-Hex-TCE2, TCE3-Hex-TCE4 및 GnRH-Hex-GnRH를 포함한다. 이들의 서열은 표 1 및 2에 제공된다. 다음 4개의 GnRH 작제물(4개의 GnRH-hC 접합체)을 치료제로서 사용하기 위해 표 1 및 2의 펩티드 면역원 및 육량체 스캐폴드 펩티드로부터 제조하였다.
1. GnRH-Hex-TCE2 + GnRH-TCE1
2. TCE3-Hex-TCE4 + GnRH
3. TCE3-Hex-TCE4 + GnRH-TCE1
4. GnRH-Hex-GnRH + GnRH-TCE1
GnRH 작제물 5(GHhC)는 SPPS 동안 GnRH 펩티드와 TCE2를 단량체 펩티드의 N- 및 C-말단(표 1 참조)에 부착한 다음 단량체 펩티드가 조립되도록 하여 수득한 스캐폴드 펩티드이다.
5. GnRH-Hex-TCE2
키홀 림펫 헤모시아닌(KLH: keyhole limpet hemocyanin)이 항체 생산에서 합텐에 대한 담체 단백질로 일상적으로 사용되기 때문에, 대조군으로서 사용하기 위해 KLH를 선택하였다. 대조군으로 사용하기 위해 하기 2가지 작제물(접합체)을 제조하였다.
6. KLH + GnRH
7. KLH + GnRH-TCE1
작제물 1 내지 7(1 및 10 ug)을 모노포스포릴 지질-A/스쿠알렌-기반 보조제로 보조하고 BALB/cJ 마우스에 주사하였다. 각 작제물을 5마리의 마우스에 주입한다(작제물 당 n=5). 14일, 28일 및 42일 후, 10-3 내지 10-9까지의 희석액(순차 10배 희석액)을 사용하여 ELISA에 의해 항-GnRH IgG 종말점 역가를 측정하기 위해 마우스 혈청을 수득하였다. 치료 기능을 확인하기 위해, 테스토스테론을 3개 군의 혈청 분취량에서 측정하였다: 가장 높은 항체 역가를 갖는 작제물 중 2개(TCE3-Hex-TCE4 + GnRH 및 GnRH-Hex-GnRH + GnRH-TCE1(작제물 4)), 양성 KLH 대조군(KLH + GnRH), 및 PBS 음성 대조군(PBS + 보조제). 테스토스테론을 혈청에서 추출하고, 유도체화하고, 분리하고 LC-MS/MS로 정량화하였다.
도 3은 프라임 면역화 후 14일, 28일, 및 42일차에 5개의 상이한 GnRH 치료제(작제물 1-5), 3개의 양성 대조군(작제물 6 및 7 및 ReproBloc, 수의학적 적용에 사용되는 GnRH 서브유닛 백신), 및 1개의 음성 대조군(PBS + 보조제)로 면역화된 마우스에서 항체 종말점 역가를 나타낸다. 점 그룹의 실선은 기하 평균이고 오차 막대는 기하 표준 편차이다. 이러한 연구를 위해 2가지 용량을 선택하였다: 1 및 10 ug. IgG 역가는 프라임 면역화 후 42일에 최대 수준에 도달하였다. 5개의 GnRH 작제물 중 3개에서, 최대 역가는 1 ug에서 도달하였다. 하나의 작제물은 1 및 10 ug(TCE3-Hex-TCE4 + GnRH(작제물 2)) 둘 모두에서 항체 역가가 동일하였다. 이 동일한 작제물은 d28과 d42 사이에서 거의 동일한 수준에서 역가를 유도하였다(d42에서 유의한 증가는 아님).
작제물 2((TCE3-Hex-TCE4 + GnRH) 및 작제물 4(GnRH-Hex-GnRH + GnRH-TCE1) 및 작제물 5는 이들이 가장 높은 역가를 가졌거나 더 빨리 높은 역가를 유도하였기 때문에(도 3) 테스토스테론 수준을 측정함으로써 치료 기능을 확인하기 위해 선택하였다. 이러한 작제물 2 또는 작제물 4 및 하나의 양성 대조군(KLH + GnRH(작제물 6), 및 하나의 음성 대조군(PBS 대조군))으로 면역화된 마우스에서 테스토스테론(T) 수준을 분석하고 LC-MS/MS를 사용하여 정량화하였다. 도 4 내지 6은 각 마우스의 테스토스테론 수준과 해당 항체 역가 데이터를 도시한다(도 3에 도시됨). 각 마우스의 IgG 역가와 T 수준은 개별 모양으로 표시된다. d14, d28, 및 d42의 T 수준을 측정하여 T의 거세 수준(castrate level)이 관찰되는 시점을 결정하였다. 거세 T 수준은 점선으로 표시된다. 도 6은 d42까지, 두 작제물에 대한 항-GnRH IgG 역가가 T의 거세 수준을 유도하고 KLH + GnRH 양성 대조군과 유사한 항체 역가 및 T 수준을 초래하였음을 나타낸다.
도 4 내지 6은 GnRH-HhC 접합체, 예를 들어 TCE3-Hex-TCE4 + GnRH 및 GnRH-Hex- GnRH + GnRH_TCE1이 T의 IgG 역가 및 거세 수준을 유도할 때 KLH + GnRH(양성 대조군)와 거의 동일하고 전립선암과 같은 질병을 치료하기 위한 치료제로서 유용하다는 것을 확인시켜준다.
본 발명자들이 본 발명을 수행하기 위해 알려진 최선의 방식을 포함하여 본 발명의 소정의 실시형태가 본원에 기술된다. 당연하게도, 이러한 기술된 실시형태에 대한 변화는 상기 설명을 읽을 때 당업자에게 분명해질 것이다. 본 발명자들은 당업자가 이러한 변화를 적절하게 이용할 것임을 예상하고, 본 발명자들은 본 발명이 본원에서 구체적으로 기술된 것과 다르게 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 본 개시내용은 적용 법에 의해 허용되는 한 본원에 첨부된 청구항에서 언급된 주제의 모든 변형들 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 이의 모든 가능한 변화들에서 상기 기술된 요소들의 임의의 조합은 본원에서 다르게 지시되거나 문맥상 명확하게 다르게 상충되지 않는 한 본 발명에 의해 포괄된다.
본 명세서에서 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별적인 공보, 특허 또는 특허 출원이 인용되어 포함되는 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 지시된 것과 같이 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 상기 내용은 다양한 실시형태의 측면에서 기술되긴 하였지만, 당업자는 다양한 변형, 치환, 생략 및 변화가 이의 사상으로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
참고문헌
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25 Ile Arg Ser Ile Gly Lys Glu Ile Arg Ser Ile Gly Arg Glu Ile Lys 1 5 10 15 Ser Ile Gly Arg Glu Ile Arg Ser Ile Gly Arg Gly 20 25 <210> 26 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monomeric hC peptides <400> 26 Ile Arg Ser Ile Gly Lys Glu Ile Arg Ser Ile Gly Arg Glu Ile Arg 1 5 10 15 Ser Ile Gly Lys Glu Ile Arg Ser Ile Gly Arg Glu 20 25 <210> 27 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monomeric hC peptides <400> 27 Ile Arg Ser Ile Gly Lys Glu Ile Arg Ser Ile Gly Arg Glu Ile Arg 1 5 10 15 Ser Ile Gly Arg Glu Ile Arg Ser Ile Gly Arg Glu 20 25 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH peptide sequence pattern <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa ia a polar or charged amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa ia a polar amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa ia a hydrophobic or amphipathic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa ia a hydrophobic, amphipathic, charged, or polar amino acid <400> 28 Xaa His Trp Ser Xaa Gly Xaa Xaa Pro Gly 1 5 10 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH peptide <400> 29 Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH peptide <400> 30 Gln His Trp Ser His Gly Trp Leu Pro Gly 1 5 10 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH peptide <400> 31 Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH peptide <400> 32 Gln His Trp Ser Tyr Gly Trp Tyr Pro Gly 1 5 10 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH peptide <400> 33 Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Gln Pro Gly 1 5 10 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH peptide <400> 34 Gln His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly 1 5 10 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Gly or Val <400> 35 Xaa Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 <210> 36 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 36 Gly Glu Asp Cys 1 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> residues of GnRH peptides <400> 37 Asp Gly Glu Gly Cys 1 5 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 38 Leu Leu Val Leu Val Phe Thr Phe Ser Leu Ile Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 39 Phe Ser Leu Ile Ile Ser Ala Ser Ser Ala Asn Gln Val Tyr Ala 1 5 10 15 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium perfringens <400> 40 Arg Leu Ile Thr Ala Met Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ser Ile Gly 1 5 10 15 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 41 Asn Arg Asn Phe Leu Gln Arg Ile Trp Asp Ala Ile Val Ala Phe 1 5 10 15 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycobacterium <400> 42 Thr Pro Ser Thr Asp Ser Thr Ala Phe Thr Ala Val Ala Gln Glu 1 5 10 15 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycobacterium <400> 43 Arg Gly Gln Phe Asp Arg Phe Thr Arg Asp Thr Gly Ile Ala Val 1 5 10 15 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycobacterium <400> 44 Gly Gln Phe Asp Arg Phe Thr Arg Asp Thr Gly Ile Ala Val Asn 1 5 10 15 <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycobacterium <400> 45 Phe Thr Arg Asp Thr Gly Ile Ala Val Asn Leu Val Glu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycobacterium <400> 46 Val Ile Gly Leu Ala Ala Val Thr Ile Ala Ala Ala Ala Thr Ala 1 5 10 15 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 47 Ile Glu Ile Ile Asp Ser Leu Gln Trp Asp Arg Asn Leu Arg Ile 1 5 10 15 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 48 Glu Ile Ile Asp Ser Leu Gln Trp Asp Arg Asn Leu Arg Ile Asn 1 5 10 15 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 49 Ile Ile Asp Ser Leu Gln Trp Asp Arg Asn Leu Arg Ile Asn Leu 1 5 10 15 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 50 Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser Arg 1 5 10 15 <210> 51 <211> 20 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 51 Ser Glu Phe Ala Tyr Gly Ser Phe Val Arg Thr Val Ser Leu Pro Val 1 5 10 15 Gly Ala Asp Glu 20 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Mumps virus <400> 52 Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Pro Asn Ala Arg Ala Asn Leu Thr Ala 1 5 10 15 <210> 53 <211> 16 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 53 Glu Glu Asn Val Glu Glu Asn Val Glu Glu Asn Val Glu Glu Asn Val 1 5 10 15 <210> 54 <211> 20 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 54 Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly 1 5 10 15 Ala Thr Pro Gln 20 <210> 55 <211> 21 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 55 Gly Glu Gly Ala Val Gln Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala Phe Ala Ser 1 5 10 15 Arg Gly Asn His Val 20 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 56 Phe Val Phe Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg 1 5 10 <210> 57 <211> 20 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 57 Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe Ala Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ile Ile Ile 20 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR-4 agonist <400> 58 Ala Pro Pro His Ala Leu Ser 1 5 <210> 59 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCE1 <400> 59 Leu Thr Ala Glu Leu Lys Ile Tyr Ser Val Ile Gln Ala Glu Ile Asn 1 5 10 15 Lys His Leu <210> 60 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCE2 <400> 60 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Arg Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr 20 <210> 61 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCE3 <400> 61 Gly Gln Glu Ala Phe Ser His Ile Arg Ile Pro Leu Pro His 1 5 10 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCE4 <400> 62 Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Ala Gly Gly His Asn Ala Val Phe 1 5 10 15 <210> 63 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 63 Gly Pro Gly Pro 1 <210> 64 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 64 Gly Pro Gly Pro Gly 1 5 <210> 65 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 65 Gly Pro Gly Pro Gly Cys 1 5 <210> 66 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 66 Ser Gly Pro Gly Pro Gly 1 5 <210> 67 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH_Hex_TCE2 <400> 67 Gly Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Asp Ile Arg Ser 1 5 10 15 Ile Gly Lys Glu Ile Arg Ser Ile Gly Arg Glu Ile Lys Ser Ile Gly 20 25 30 Arg Glu Ile Arg Ser Ile Gly Arg Gly Pro Gly Pro Phe Asn Asn Phe 35 40 45 Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Arg Val Ser Ala Ser His Leu 50 55 60 Glu Gln Tyr 65 <210> 68 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCE3_Hex_TCE4 <400> 68 Gly Gln Glu Ala Phe Ser His Ile Arg Ile Pro Leu Pro His Asp Ile 1 5 10 15 Arg Ser Ile Gly Lys Glu Ile Arg Ser Ile Gly Arg Glu Ile Arg Ser 20 25 30 Ile Gly Lys Glu Ile Arg Ser Ile Gly Arg Glu Phe Gln Asp Ala Tyr 35 40 45 Asn Ala Ala Gly Gly His Asn Ala Val Phe 50 55 <210> 69 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH_Hex_GnRH <400> 69 Gly Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ser Gly Asp Ile 1 5 10 15 Arg Ser Ile Gly Lys Glu Ile Arg Ser Ile Gly Arg Glu Ile Arg Ser 20 25 30 Ile Gly Arg Glu Ile Arg Ser Ile Gly Arg Glu Gly Ser Gly Gln His 35 40 45 Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 50 55 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH <400> 70 Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Asp Gly Glu Gly Cys 1 5 10 15 <210> 71 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH_TCE1 <400> 71 Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Gly Pro Gly Pro Gly 1 5 10 15 Leu Thr Ala Glu Leu Lys Ile Tyr Ser Val Ile Gln Ala Glu Ile Asn 20 25 30 Lys His Leu Gly Pro Gly Pro Gly Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile Phe 35 40 45 Pro Lys Glu Gly Pro Gly Pro Gly Cys 50 55 <210> 72 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH peptide with synthetic peptide <400> 72 Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Glu Asp Cys 1 5 10 <210> 73 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH peptide with synthetic peptide <400> 73 Gln His Trp Ser His Gly Trp Leu Pro Gly Gly Glu Asp Cys 1 5 10 <210> 74 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH peptide with synthetic peptide <400> 74 Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Glu Asp Cys 1 5 10 <210> 75 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH peptide with synthetic peptide <400> 75 Gln His Trp Ser Tyr Gly Trp Tyr Pro Gly Gly Glu Asp Cys 1 5 10 <210> 76 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH peptide with synthetic peptide <400> 76 Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Gln Pro Gly Gly Glu Asp Cys 1 5 10 <210> 77 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH peptide with synthetic peptide <400> 77 Gln His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly Gly Glu Asp Cys 1 5 10 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCE1 <400> 78 Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu 1 5 10

Claims (40)

  1. 하기 아미노산 서열을 포함하는 단량체 펩티드에 공유 부착된 하나 이상의 성선자극 방출 호르몬(GnRH: Gonadotropin releasing hormone) 펩티드를 포함하는, 스캐폴드 펩티드:
    (hwxhxyz)n(SEQ ID NO: 2),
    상기 식에서,
    h는 소수성 또는 비-극성 잔기이고;
    w는 양으로 하전된, 음으로 하전된, 극성 비하전된, 또는 비-극성 지방족 잔기이고;
    x는 음으로 하전된, 양으로 하전된, 비-극성 지방족, 또는 극성 비하전된 잔기이고;
    y는 에피토프 커플링을 위한 잔기이고;
    z는 음으로 하전된, 양으로 하전된, 극성 비하전된, 또는 비-극성 지방족 잔기이고;
    n은 1 초과의 정수임.
  2. 제1항에 있어서,
    단량체 펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2를 포함하는 펩티드로서, 여기서
    h는 I, L, V, F, W, Y, M, W, G, 또는 A이고;
    w는 G, R, A, N, Q, H, S, D, E, K 또는 T이고;
    x는 R, S, N, Q, A, G, T, D, E, K, H, 또는 C이고;
    y는 K, H, C, D, E, R, W, Y, Q, N, 또는 공유 커플링될 수 있는 반응성기를 함유하는 비-천연 아미노산 또는 분자이고;
    z는 A, D, H, S, E, R, N, Q, K, 또는 G이고;
    n은 2 내지 10인, 펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    단량체 펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18을 포함하는, 펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    단량체 펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27을 포함하는, 펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 GnRH 펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함하는, 펩티드:
    X1HWSX2GX3X4PG(SEQ ID NO: 28),
    상기 식에서
    X1은 극성 또는 하전된 아미노산이고;
    X2는 극성 아미노산이고;
    X3은 소수성 또는 양친매성 아미노산이고;
    X4는 소수성, 양친매성, 하전된, 또는 극성 아미노산임.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 GnRH 펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 28을 포함하는, 펩티드로서, 여기서
    X1은 Q 또는 E이고;
    X2는 Y 또는 H이고;
    X3은 L 또는 W이거나;
    X4는 L, Y, R, 또는 Q인, 펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 GnRH 펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함하는, 펩티드:
    QHWSYGLRPG(SEQ ID NO: 29);
    QHWSHGWLPG(SEQ ID NO: 30);
    EHWSYGLRPG(SEQ ID NO: 31);
    QHWSYGWYPG(SEQ ID NO: 32);
    EHWSYGLQPG(SEQ ID NO: 33); 또는
    QHWSHGWYPG (SEQ ID NO: 34).
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 GnRH 펩티드는 N- 및/또는 C-말단에 G, V, M, A, 또는 이들의 조합을 포함하는, 펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 GnRH 펩티드는 C-말단에 GEDC(SEQ ID NO: 36) 또는 DGEGC(SEQ ID NO: 37)를 추가로 포함하는, 펩티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    펩티드는 2개 이상의 GnRH 펩티드를 포함하고, 상기 GnRH 펩티드는 상이한 공급원으로부터 수득되고/되거나 SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 또는 34로부터 선택되는 2개 이상의 상이한 아미노산 서열을 포함하는, 펩티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    펩티드는 면역조절제 또는 합텐을 추가로 포함하는, 펩티드.
  12. 제11항에 있어서,
    면역조절제 또는 합텐은 T-세포 에피토프 또는 B-세포 에피토프인, 펩티드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 67 또는 69를 포함하는, 펩티드.
  14. 합텐 담체(hC)에 공유 부착된 하나 이상의 성선자극 방출 호르몬(GnRH) 펩티드를 포함하는 GnRH 접합체(GnRH-hC) 또는 GnRH 올리고머(GhC)로서,
    상기 hC는 하기 아미노산 서열을 포함하는 단량체 펩티드를 포함하는 올리고머를 포함하는, GnRH 접합체(GnRH-hC) 또는 GnRH 올리고머(GhC):
    (hwxhxyz)n(SEQ ID NO: 2),
    상기 식에서,
    h는 소수성 또는 비-극성 잔기이고;
    w는 양으로 하전된, 음으로 하전된, 극성 비하전된, 또는 비-극성 지방족 잔기이고;
    x는 음으로 하전된, 양으로 하전된, 비-극성 지방족, 또는 극성 비하전된 잔기이고;
    y는 에피토프 커플링을 위한 잔기이고;
    z는 음으로 하전된, 양으로 하전된, 극성 비하전된, 또는 비-극성 지방족 잔기이고;
    n은 1 초과의 정수임.
  15. 제14항에 있어서,
    단량체 펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2를 포함하는 GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머로서, 여기서
    h는 I, L, V, F, W, Y, M, W, G, 또는 A이고;
    w는 G, R, A, N, Q, H, S, D, E, K 또는 T이고;
    x는 R, S, N, Q, A, G, T, D, E, K, H, 또는 C이고;
    y는 K, H, C, D, E, R, W, Y, Q, N, 또는 공유 커플링될 수 있는 반응성기를 함유하는 비-천연 아미노산 또는 분자이고;
    z는 A, D, H, S, E, R, N, Q, K, 또는 G이고;
    n은 2 내지 10인, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    단량체 펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18을 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단량체 펩티드가 아미노산 서열 SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27을 포함하는 GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고머는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체 또는 십량체를 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 GnRH 펩티드는 하기의 아미노산 서열을 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머:
    X1HWSX2GX3X4PG(SEQ ID NO: 28),
    상기 식에서,
    X1은 극성 또는 하전된 아미노산이고;
    X2는 극성 아미노산이고;
    X3은 소수성 또는 양친매성 아미노산이고;
    X4는 소수성, 양친매성, 하전된, 또는 극성 아미노산임.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 GnRH 펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 28을 포함하는 GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머로서, 여기서
    X1은 Q 또는 E이고;
    X2는 Y 또는 H이고;
    X3은 L 또는 W이거나;
    X4는 L, Y, R, 또는 Q인, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 GnRH 펩티드는 하기의 미노산 서열을 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머:
    QHWSYGLRPG(SEQ ID NO: 29);
    QHWSHGWLPG(SEQ ID NO: 30);
    EHWSYGLRPG(SEQ ID NO: 31);
    QHWSYGWYPG(SEQ ID NO: 32);
    EHWSYGLQPG(SEQ ID NO: 33); 또는
    QHWSHGWYPG (SEQ ID NO: 34).
  22. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 GnRH 펩티드는 N- 및/또는 C-말단에 G, V, M, A, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
  23. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 GnRH 펩티드는 C-말단에 GEDC(SEQ ID NO: 36) 또는 DGEGC(SEQ ID NO: 37)를 추가로 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
  24. 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머는 2개 이상의 GnRH 펩티드를 포함하고, 상기 GnRH 펩티드는 상이한 공급원으로부터 수득되고/되거나 SEQ ID NO: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 또는 34로부터 선택되는 상이한 아미노산 서열을 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
  25. 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 GnRH 펩티드는 단량체 펩티드 상의 y 잔기를 통해 hC에 접합되는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
  26. 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머는 하나 이상의 면역조절제 또는 합텐을 추가로 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
  27. 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머는 합텐 또는 면역조절제와 단량체 펩티드 사이에 하나 이상의 스페이서를 포함하고, 상기 스페이서는 G(글리신), D(아스파르트산), S(세린), C(시스테인), 또는 이들의 조합을 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
  28. 제14항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 합텐 또는 면역조절제는 GnRH 펩티드, 하나 이상의 T-세포 에피토프, 및/또는 하나 이상의 B-세포 에피토프를 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
  29. 제28항에 있어서,
    하나 이상의 T-세포 에피토프는 CD4+ T-세포 에피토프를 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서,
    GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머는 하나 이상의 T-세포 에피토프의 올바른 처리를 위한 하나 이상의 잔기를 추가로 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
  31. 제27항에 있어서,
    하나 이상의 잔기는 D, G, P, S, GD, PGP, GSG, GPGP(SEQ ID NO: 63), GPGPG(SEQ ID NO: 64), GPGPGC(SEQ ID NO: 65), 또는 SGPGPG(SEQ ID NO: 66)를 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 추가 합텐 또는 면역조절제는 지질, 펩티드, 핵산, 또는 이들의 조합을 포함하고, 상기 하나 이상의 추가 합텐 또는 면역조절제는 hC에 접합되거나 올리고머의 나선의 하나 이상의 N- 및/또는 C-말단에 공유 부착되는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
  33. 제14항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 67, 68, 또는 69를 포함하는 스캐폴드 펩티드를 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
  34. 제14항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 70 또는 SEQ ID NO: 71을 포함하는 펩티드 면역원을 포함하는, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 펩티드, GnRH 접합체 또는 GnRH 올리고머 및 부형제를 포함하는, 조성물.
  36. 제35항에 있어서,
    조성물은 약학 조성물이고, 부형제는 약학적으로 허용되는 부형제인, 조성물.
  37. 질환이 있는 대상체의 치료 방법으로서.
    상기 방법은 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 펩티드, 제14항 내지 제34항 중 어느 한 항의 접합체 또는 제36항의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 합텐은 대상체를 치료하기 위한 면역 반응을 유도하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    대상체는 포유류인, 방법,
  39. 제38항에 있어서,
    포유류는 인간인, 방법.
  40. 제37항에 있어서,
    질환은 전립선암인, 방법,
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