DE60226324T2

DE60226324T2 - Glykopeptide, deren herstellung und verwendung in der diagnose oder behandlung von multipler sklerose

Info

Publication number: DE60226324T2
Application number: DE60226324T
Authority: DE
Inventors: Anna Maria Papini; Mario Chelli; Paolo Rovero; Francesco Lolli
Original assignee: Universita degli Studi di Firenze
Current assignee: Universita degli Studi di Firenze
Priority date: 2001-06-22
Filing date: 2002-06-19
Publication date: 2009-07-09
Anticipated expiration: 2022-06-20
Also published as: EP1406927B1; AU2002316989B2; HUP0400262A2; IL159479A; PL368158A1; US7037893B2; WO2003000733A2; PT1406927E; US20040235713A1; WO2003000733A3; CA2451347C; EP1406927A2; PL207174B1; IL159479A0; ITFI20010114A1; CZ2004122A3; HUP0400262A3; CA2451347A1; ATE393785T1; DE60226324D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Glykopeptide, die aus 11–24 Aminosäuren gebildet werden und Multiple-Sklerose-Antikörper identifizieren können und daher als diagnostische Werkzeuge oder für die Behandlung von genannter Pathologie von Nutzen sind.
Stand der Technik
Multiple Sklerose (MS) ist eine entzündliche Entmarkungskrankheit des Zentralnervensystems, die stark zu Invalidität führt und daher hohe soziale Auswirkungen hat. Sie verursacht den Abbau der weißen Substanz des Zentralnervensystems (Myelin), was zu schweren Schäden bei der Übermittlung von Nervensignalen führt.
Die Pathogenese dieser Erkrankung wurde bisher noch nicht eindeutig definiert, aber es besteht die Vermutung, dass ein Autoimmunprozess, der gegen die wesentlichen Myelinproteine gerichtet ist, ein wichtiger pathogenischer Mechanismus der Erkrankung ist. Die Myelinschädigung liegt sehr wahrscheinlich in der synergistischen Wirkung der T-Zell-Antwort und der Antikörperantwort gegen Myelinproteine und Glykoproteine begründet. Insbesondere können Autoantikörper eine Schlüsselrolle bei der Aktivierung von Makrophagen, bei der Entmarkung und bei der Blockierung der Nervenleitung spielen.
In einer vorherigen Untersuchung [A. M. Papini et al., Proceedings of the 10th International Congress of Immunology, Monduzzi Editore, International Proceeding Division, Bologna, Italien (1998), S. 1239–1244] wurde die Möglichkeit der Identifizierung von MS-spezifischen Antikörpern durch ein glykosyliertes Peptid, das aus einer Sequenz von 21 Aminosäuren des Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteins (MOG) (von Positionen 30 bis 50) besteht und durch die Formel Asn³¹(Glc)hMOG(30-50) bezeichnet wird, nachgewiesen.
Das Interesse an einer Entwicklung von neuen glykosylierten Peptiden, welche die Funktion der Identifizierung von genannten Antikörpern mit größerer Wirksamkeit durchführen können und die daher sowohl für die Diagnose als auch für die Behandlung von Multipler Sklerose von Nutzen sind, ist offensichtlich.
Kurze Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Glykopeptide, die aus 11–24 Aminosäuren bestehen und ein Tetrapeptid der folgenden Formel (I) enthalten: X-Asn(G)-Y-Z (I)in der:
X = Aminosäure, die eine Amino- oder Carboxylgruppe an der Seitenkette trägt;
Y = Pro, Gly;
G ein Zucker ist
Z = Ala, Val, Ile, His
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, und ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, dass kurze, aus 11–24 Aminosäuren bestehende Glykopeptide, die das oben definierte Tetrapeptid enthalten, eine sehr wirksame Rolle bei der Erkennung von für MS typischen Antikörpern spielen und daher bei der Diagnose oder ihrer therapeutischen Behandlung von Nutzen sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind Glykopeptide der folgenden Formel (II) bevorzugt: A-B-X-Asn(G)-Y-Z-C-D (II)in welchen Y und G wie oben definiert sind,
A = 2–5 Aminosäuren oder fehlend
B und C = trifunktionale Aminosäuren, die mittels der jeweiligen Seitenketten eine Lactambrücke untereinander einander bilden können, oder fehlend;
D = 5–15 Aminosäuren;
X = Glu, Asp, Lys, Arg, Orn, Dap;
Z = Ala, Val, Ile, His
Mit trifunktionalen Aminosäuren, die untereinander eine Lactambrücke bilden, wie oben definiert, ist zum Beispiel das Paar Dap-Asp oder Asp-Dap, Dab-Glu oder Glu-Dab, Orn-Asp oder Asp-Orn gemeint, sowie das Paar, das durch weitere Aminosäuren, z. B. nicht natürliche Aminosäuren mit analogen Eigenschaften gebildet wird.
Mit Zucker sind vorzugsweise Mono- und Disaccharide vom Typ Glc, GlcNAc, (β-D-Glcp-(1 → 4)-D-Glc (Cellobiose), usw. gemeint.
Mit Aminosäuren sind, wenn nicht anders definiert, natürliche und nicht natürliche Aminosäuren gemeint.
Offensichtlich können die Reste A, sofern vorhanden, und D einen geeigneten Alkyispacer enthalten, um die Kette zu verlängern, wobei mit Alkylspacer, in dem hier verwendeten Sinn, ω-Aminosäuren mit linearen Alkylketten (H₂N-(CH₂)_n-CO₂H gemeint sind, wobei n 2–6 ist.
Das Vorhandensein des Tetrapeptids der Formel (I) wie oben definiert kann das Falten in die Peptidformation induzieren, die aus diesem Grund eine „hakenähnliche" Form (wenn das Tetrapeptid im terminalen Teil des Peptids vorhanden ist) oder eine „haarnadelähnliche" Form (wenn das Tetrapeptid im Mittelteil des Peptids vorhanden ist) einnimmt. Diese Konformationen ermöglichen eine optimale Bindung der Autoantikörper des Patienten; diese Tatsache ist für die unerwarteten Eigenschaften der erfindungsgemäßen Peptide wesentlich.
Insbesondere bevorzugt sind gemäß der vorliegenden Erfindung die Peptide, die durch die folgenden Sequenzen dargestellt werden:

1. H-Thr-Pro-Arg-Val-Glu-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Ser-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
2. H-Thr-Pro-Arg-Val-cyclo[Dap-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Asp]-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
3. H-Thr-Pro-Arg-Val-cyclo[Asp-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Orn]-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
4. H-Ala-Lys-Thr-Ala-Lys-Asn(Glc)-Gly-His-Val-Glu-Ala-Ser-Gly-OH
5. H-Glu-Asn(Glc)-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro-OH
6. H-Asp-Asn(Glc)-Pro-Val-Glu-Ala-Phe-Lys-Gly-Ile-Ser-OH
7. H-Thr-Pro-Arg-Val-Glu-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Ser-HN-(CH₂)₆-CO-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
8. H-Asp-Asn(Glc)-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-(βAla)₃-OH

Die Peptide wie oben definiert können auch eine -HN-(CH₂)_n-CO₂H-Gruppe am C-Terminus enthalten (wobei n = 2–6), um so die Bindung an ein Harz zu ermöglichen, wie es für ihre praktische Anwendung bei Diagnose oder bei therapeutischen Behandlungen erforderlich ist.
Die erfindungsgemäßen Peptide können gemäß bekannter Verfahren für Fest- oder Flüssigphasensynthese hergestellt werden.
Das Festphasenverfahren ist insbesondere von Nutzen und Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt; es beruht darauf, dass der C-terminale Rest kovalent an einen geeigneten festen Träger, zum Beispiel Polystyrol (Wangs Harz), Polystyrol-Polyoxyethylen (TentaGel-Harz oder PEG-PS) oder Polyethylenglykol- und Polyacrylamid-Copolymere (PEGA-Harz) gebunden wird und die nachfolgenden Aminosäuren werden nacheinander addiert, indem die Aminogruppe des an den Harz gebundenen Rests, zum Beispiel durch das symmetrische Anhydrid der folgenden Aminosäure acyliert wird, wobei die Seitenkette gegebenenfalls auf geeignete Weise geschützt wird. Nach Abschluss der Synthese wird das rohe Peptid mittels Behandlung des Harzes mit einer geeigneten Säure, zum Beispiel Fluorwasserstoffsäure oder Trifluoressigsäure, erhalten und mittels Ausfällen in Ethylether und nachfolgender Lyophilisierung abgetrennt. Das Peptid wird schließlich unter Verwendung von chromatographischen Techniken, wie zum Beispiel präparativer HPLC, gereinigt. Es ist auch möglich, das synthetische Peptid an den festen Träger gebunden zu lassen (zum Beispiel Polystyrol-Polyoxyethylen TentaGel-Harz oder PEG-PS), wobei an den Seitenketten eine selektive Entschützung mit einem geeigneten Reagenz durchgeführt wird.
Alternativ wird, noch immer gemäß bekannter Techniken, die Bindung des Peptids an den geeigneten Träger erreicht, so dass die entsprechenden Konjugate erhalten werden, die für die Diagnose oder bei der Therapie von Nutzen sind. Die bevorzugten Träger für diese Zweck umfassen Harze, die in Wasser unlöslich sind und mit organischen Flüssigkeiten vollkommen verträglich sind, wie z. B. Silicagel, Cellulose, Polyacrylat, Sepharose und Analoga sowie die gleichen, normalerweise von Fachleuten für die Herstellung von synthetischen Peptiden verwendeten Harze, wie z. B. Wangs Harz, Polystyrol-Polyoxyethylen (TentaGel-Harz oder PEG-PS) oder Polyethylenglykol- und Polyacrylamid-Cpolymere (vollständig kompatibel mit Wasser) wie z. B. PEGA-Harz und stabilere analoge Harze wie z. B. POEPS (Polyoxyethylen-polystyrol), POEPOP (Polyoxyethylen-polyoxypropylen), sowie makroporöse Harze, die aufgrund ihres Interesses für die Festphasenglykosylierung von Peptiden beschrieben werden, wie z. B. SPOCC (PEG substituiert mit Oxethan) [Rademann, J; Gretli, M; Meldal, M; and Bock, K. J.. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 5459–5466] oder Derivate davon wie EXPO3000 (Copolymer mit Tetrakis-[4-(3-methyl-oxethan-3-ylmethyl)phenyl]silan) [Tornøe, C. W.; and Meldal M. In: Peptides 2000, J. Martinez and J. A. Fehrentz (Hrgs.) EDK, Paris, France 2001].
Im Folgenden werden Beispiele, welche die Herstellung einiger erfindungsgemäßer Peptide beschreiben, für erläuternde, nicht die Erfindung einschränkende Zwecke gegeben.
Beispiel 1. Synthese eines linearen Peptids Herstellung von H-Thr-Pro-Arg-Val-Glu-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Ser-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
Das Harz Fmoc-Lys(Boc)-NovaSyn (0,5 g, 0,11 mmol/g) wurde zum Quellen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in DMF gegeben und dann in die Glassäule (150 × 15mm) eines kontinuierlichen, halbautomatischen Synthesisers gepackt. Nach dem Entschützen der am Harz vorhandenen Aminogruppe mit einer 20%igen Piperidinlösung in DMF wurde für die Insertion von jeder Aminosäure die Säule mit einer Fmoc-Aminosäure (2,5 Äq., 0,137 mmol), gelöst in DMF (1,3 ml), enthaltenden Lösung und als Aktivierungsreagenz HOBt (2,5 Äq., 0,137 mmol), TBTU (2,5 Äq., 0,137 mmol) und NMM (3,75 Äq., 0,205 mmol) beladen.
Es wurden der Reihe nach die folgenden Aminosäuren verwendet:

1) Fmoc-Val-OH
2) Fmoc-Met-OH
3) Fmoc-Trp(Boc)-OH
4) Fmoc-Gly-OH
5) Fmoc-Tyr(tBu)-OH
6) Fmoc-Pro-OH-
7) Fmoc-Ala-OH
8) Fmoc-Leu-OH
9) Fmoc-Phe-OH
10) Fmoc-Val-OH
11) Fmoc-Ser(tBu)-OH
12) Fmoc-His(Trt)-OH
13) Fmoc-Gly-OH
14) Fmoc-Asn(Glc)-OH (N^α-Fmoc-N^γ-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl)-L-Asn-OPfp)
15) Fmoc-Arg(Pmc)-OH
16) Fmoc-Glu(OtBu)-OH
17) Fmoc-Val-OH
18) Fmoc-Arg(Pmc)-OH
19) Fmoc-Pro-OH
20) Fmoc-Thr(tBu)-OH

Nach Abschluss der Synthese wurde das Harz mit 20%igem Piperidin in DMF entschützt, filtriert, mit DMF, DCM und Ether gewaschen und schließlich unter Vakuum getrocknet. Das rohe Peptid wurde durch Behandeln des Harzes mit einer Mischung aus TFA/Phenol/Anisol/Ethandithiol (94:2:2:2) (10 ml) erhalten, wobei diese unter Rühren 30 Minuten bei 0°C und 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gehalten wurde. Der Harz wurde filtriert und mit TFA gewaschen und das Filtrat unter Vakuum auf das halbe Volumen eingeengt. Das Peptid wurde mittels Behandlung mit kaltem Ether ausgefällt. Das erhaltene Peptid wurde lyophilisiert, was 112 mg des rohen Peptids ergab.
Deacetylierung wurde durch tropfenweise Zugabe einer Lösung von 0,1 M NaOMe in MeOH, um einen pH-Wert = 12 zu erreichen, zu einer Lösung des Peptids in wasserfreiem MeOH (15 ml) unter Rühren in einer Stickstoffatmosphäre erreicht. Die NaOMe-Lösung wurde durch Zugabe von metallischem Natrium (270 mg in Ligroin (Petrolether), 117 mmol) zu destilliertem MeOH (11 ml) in einer Stickstoffatmosphäre hergestellt. Nach 1 Stunde wurde Trockeneis zu der Mischung gegeben, bis diese neutralisiert war. Die Lösung wurde eingeengt, um das rohe Peptid zu ergeben, das mittels halbpräparativer HPLC (HPLC-Reinheit größer als 97%) gereinigt wurde.
Charakterisierung: ESI-MS: gefunden: [M+3H]3+ m/z = 869,9, [M+2H]2+ m/z = 1304,2; berechnet: PM monoisotop = 2605,38.
Die anderen linearen Peptide wurden in Anlehnung an das gleiche Verfahren hergestellt, aber unter Verwendung der notwendigen Aminosäuren für die jeweiligen Sequenzen.
Beispiel 2. Synthese eines cyclischen Peptids Herstellung von H-Thr-Pro-Arg-Val-cyclo[Dap-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Asp]-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
TentaGel-Harz SPHB-Lys(Boc)-Fmoc (1,00 g, 0,22 mmol/g) wurde wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Für jede Kupplung wurden 4 Äq. Fmoc-Aminosäuren (0,88 mmol), gelöst in DMF (1,3 ml), verwendet und als Aktivierungsreagenzien wurden HOBt (4 Äq., 0,88 mmol) und TBTU (4 Äq., 0,88 mmol,) und NMM (6 Äq., 1,68 mmol,) verwendet.
Es wurden der folgenden Reihe nach die folgenden Aminosäuren verwendet:

1) Fmoc-Val-OH
2) Fmoc-Met-OH
3) Fmoc-Trp(Boc)-OH
4) Fmoc-Gly-OH
5) Fmoc-Tyr(tBu)-OH
6) Fmoc-Pro-OH
7) Fmoc-Ala-OH
8) Fmoc-Leu-OH
9) Fmoc-Phe-OH
10) Fmoc-Val-OH
11) Fmoc-Asp(OAII)-OH
12) Fmoc-His(Trt)-OH
13) Fmoc-Gly-OH
14) Fmoc-Asn(Glc)-OPfp
15) Fmoc-Arg(Pmc)-OH
16) Fmoc-Dap(Alloc)-OH
17) Fmoc-Val-OH
18) Fmoc-Arg(Pmc)-OH
19) Fmoc-Pro-OH
20) Fmoc-Thr(tBu)-OH

Bei Abschluss der Synthese wurden die allylischen Schutzgruppen der Dap- und Asp-Seitenketten selektiv durch Behandlung mit einer Pd(PPh₃)₄-Lösung (3 Äq.) in 7,5 ml CHCl₃/AcOH/NMM 37:2:1 in einer Argonatmosphäre entfernt. Die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung eines mechanischen Arms 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wurde dann abfiltriert und dreimal mit einer 0,5%igen DIPEA-Lösung in DMF, dreimal mit einer 0,05%igen Natriumdiethylcarbamat-Lösung in DMF, dreimal mit DMF und dreimal mit DCM gewaschen.
Für die nachfolgende Cyclisierungsreaktion wurde das Harz zum Quellen 1 Stunde lang in einem Kolben in DMF gegeben. Dann wurde NMM (4 Äq.) zugegeben und nach 10 Minuten PyBOP (4 Äq.). Die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung eines mechanischen Arms 3 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wurde filtriert, mehrere Male mit DMF, DCM und Et₂O gewaschen und schließlich unter Vakuum getrocknet.
Anschließend wurde das Harz mittels 20%igem Piperidin in DMF von Fmoc entschützt, dann wurde das Peptid abgelöst und isoliert, genau wie in Beispiel 1 beschrieben.
Beispiel 3. Synthese eines harzgebundenen Peptids Herstellung von H-Thr-Pro-Arg-Val-Glu-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Ser-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-(βAla)₃-PEG-PS
Das Basisharz PEG-PS in Aminoform (1 g, 0,09 Äq.) wurde zum Quellen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in DMF gegeben und dann in die Glassäule (150 × 15 mm) eines kontinuierlichen, halbautomatischen Synthesisers gepackt. Für das Ankoppeln der ersten Aminosäure wurde die Säule mit einer Fmoc-βAla-OH (4 Äq., 0,36 mmol), gelöst in DMF (1,5 ml), enthaltenden Lösung und als Aktivierungsreagenzien mit HOBt (4 Äq., 0,36 mmol), TBTU (4 Äq., 0,36 mmol) und NMM (6 Äq., 0,54 mmol) beladen. Die Reaktion wurde 1 Stunde lang ausgeführt und später, nach geeignetem Waschen, folgte die Entschützung der Aminogruppen durch Behandlung mit 20%igem Piperidin in DMF. Der Kopplungszyklus für βAla wurde zweimal wiederholt und dann wurde fortgefahren, indem auf die gleiche Weise ein Rest Fmoc-Lys(Boc)-OH angekoppelt wurde. Danach wurde der Aufbau der gesamten Peptidsequenz fortgesetzt, genau wie in Beispiel 1 angegeben. Nach der Endbehandlung mit Piperidin wurde das Harz-Peptid durch Behandlung mit einer Mischung aus TFA/Phenol/Anisol/Ethandithiol (94:2:2:2) (10 ml) unter 30-minütigem Rühren bei 0°C und 1,5-stündigem Rühren bei Raumtemperatur entschützt, sorgfältig gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet.
Beispiel 4. Konjugation eines Peptids an Harz.
Ein freies, lineares oder cyclisches Peptid, das wie in den Beispielen 1 bzw. 2 beschrieben hergestellt wurde, wurde an Sepharose-Harz, das mit CNBr voraktiviert war, gemäß den üblichen von den Herstellern empfohlenen Reaktionsprotokollen konjugiert, um ein Harz-Peptid-Konjugat zu erhalten. Das so erhaltene Produkt ist zum Beispiel bei der Herstellung von Platten für die Diagnose oder Behandlung von Patienten, die von MS betroffen sind (siehe auch das Folgende) von Nutzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Kit, das die erfindungsgemäßen Glykopeptide, die für diagnostische Zwecke von Nutzen sind, umfasst.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst ein wie oben genanntes Kit:

– eine Mikroplatte
– eine Pufferlösung für die Haftung des Peptids an der Platte;
– ein modifiziertes Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung (lyophilisiert);
– FCS-Puffer (10% FCS, 9 g/l NaCl, Tween 20 0,05%);
– konzentrierte Waschlösung (20fach konzentriert);
– positives Kontrollserum;
– negatives Kontrollserum;
– einen Antikörper, der mit dem Antikörper von Multipler Sklerose reagiert [Konjugat-(AP konjugiert mit anti-Igm)];
– ein Substrat (p-Nitrophenylphosphat, Dinatriumsalz);
– einen Substratpuffer (1 M Diethanolamin-Puffer, pH 9,8);
– eine Stopplösung (1 M Natriumhydrat).

Wenn bevorzugt, können die Pufferlösung für die Haftung des Peptids auf der Platte und das erfindungsgemäße, modifizierte Peptid direkt in die Mikroplatte eingebaut werden.
Diagnostische Verwendung
Für die diagnostische Verwendung wurden die erfindungsgemäßen Glykopeptide verdünnt und auf bindendem Kunststoff in den Wells von Mikrotiterplatten (ELISA-Systeme) absorbiert. Dann wurde Patientenserum oder -plasma in einer Reihe mit unterschiedlichen Konzentrationen (Verdünnungsreihe) zugegeben. Der für unsere Produkte spezifische Autoantikörper ging mit dem auf dem Kunststoff absorbierten Peptid eine Bindung ein. Gemäß der Fachleuten bekannten Technik ELISA (Enzyme Linked Immun-Sorbent Assay) wurden darin an das Glykopeptid gebundene Autoantikörpermoleküle durch die Bindung von geeigneten sekundären, zu den ELISA-Platten gegebenen Antikörpern, die das konstante Fragment des Immunglobulins erkennen, nachgewiesen. Diese zweiten, mit geeigneten Enzymen konjugierte Antikörper können mittels einer kolorimetrischen Reaktion sichtbar gemacht werden: Die entwickelte Extinktion ist proportional zur Menge an spezifisch gebundenem Autoantikörper.
Quantitativ wird das Ergebnis als der Antikörpertiter ausgedrückt, definiert als der Kehrwert des Verdünnungsfaktors, bei dem keine weitere Reaktion beobachtet wird. Der Antikörpertiter, wie oben definiert, wurde bei verschiedenen von Multipler Sklerose betroffenen Patienten gemessen; die erfindungsgemäßen Glykoproteine zeigten höhere Antikörpertiter verglichen mit solchen, die mit bekannten Glykopeptiden gemessen wurden.
Therapeutische Verwendung
Die erfindungsgemäßen Peptide, in freier Form oder an geeignete Harze gebunden, können für die Behandlung von Patienten, die von Multipler Sklerose betroffen sind, verwendet werden, da sie, dank ihrer hohen Spezifizität der Antikörpererkennung, zur Neutralisierung und/oder selektiven Entfernung der Autoantikörper verwendet werden können. SEQUENCE LISTING

Claims

Glykopeptide, bestehend aus 11–24 Aminosäuren, enthaltend ein Tetrapeptid der Formel (I) X-Asn(G)-Y-Z (I)in der: X = Aminosäure, die eine Amino- oder Carboxylgruppe an der Seitenkette trägt; Y = Pro, Gly; G = Zucker Z = Ala, Val, Ile, His
Glykopeptide gemäß Anspruch 1, in denen die Aminosäuren die natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren sind.
Glykopeptide gemäß den Ansprüchen 1 und 2 der Formel (II): A-B-X-Asn(G)-Y-Z-C-D (II)in der: Y und G wie oben definiert sind; A eine Gruppe aus 2–5 Aminosäuren oder abwesend ist; B und C trifunktionale Aminosäuren sind, die mittels der jeweiligen Seitenketten eine Lactambrücke zwischen einander bilden können, oder beide abwesen sind; D eine Gruppe aus 5–15 Aminosäuren darstellt; X eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Glu, Asp, Lys, Arg, Orn, Dap ist; Z eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Ala, Val, Ile, His ist.
Glykopeptide gemäß Anspruch 3, in denen B und C die Paare: Dap-Asp oder Asp-Dap, Dab-Glu oder Glu-Dab, Orn-Asp oder Asp-Orn darstellen und die Paare, die durch andere Aminosäuren gebildet werden, analoge Eigenschaften besitzen.
Glykopeptide gemäß den Ansprüchen 1–4, in denen der Zucker aus der Gruppe bestehend aus Mono- und Disacchariden wie z. B. β-D-Glucopyranosyl (Glc), 2-Acetylglucosamin (GlcNAc), Cellobiose und Analoga ausgewählt wird.
Glykopeptide gemäß Anspruch 5, in denen der Zucker β-D-Glucopyranosyl (Glc) ist.
Glykopeptide gemäß den Ansprüchen 1–6, die durch die folgenden Formeln dargestellt werden. H-Thr-Pro-Arg-Val-Glu-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Ser-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH H-Thr-Pro-Arg-Val-cyclo[Dap-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Asp]-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH H-Thr-Pro-Arg-Val-cyclo[Asp-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Orn]-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH H-Ala-Lys-Thr-Ala-Lys-Asn(Glc)-Gly-His-Val-Glu-Ala-Ser-Gly-OH H-Glu-Asn(Glc)-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro-OH H-Asp-Asn(Glc)-Pro-Val-Glu-Ala-Phe-Lys-Gly-Ile-Ser-OH H-Thr-Pro-Arg-Val-Glu-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Ser-HN-(CH₂)₆-CO-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH H-Asp-Asn(Glc)-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-(βAla)₃-OH
Glykopeptide gemäß den Ansprüchen 1–7, enthaltend einen Alkylspacer in nichtterminalen Positionen.
Glykopeptide gemäß Anspruch 8, in denen genannter Alkylspacer eine Gruppe der Formel -HN-(CH₂)_n-CO₂ ist, wobei n zwischen 2 und 6 liegt.
Glykopeptide gemäß Anspruch 1–9, enthaltend eine weitere C-terminale -HN-(CH₂)_n-CO₂H-Gruppe, wobei n zwischen 2 und 6 liegt.
Verfahren für die Festphasentrennung von Glykopeptiden gemäß den Ansprüchen 1–10, in welchem: a) der C-terminale Rest kovalent an einen geeigneten festen Träger gebunden wird; b) die aufeinanderfolgenden Aminosäuren nacheinander durch Acylierung der Aminogruppe des an den Harz gebundenen Rests addiert werden; c) das Rohpeptid mittels Behandlung des Harzes mit einer geeigneten Säure erhalten wird; d) das Peptid unter Rückgriff auf chromatographische Techniken gereinigt wird; e) das Peptid letztendlich an einen geeigneten festen Träger gebunden wird.
Verfahren gemäß Anspruch 11, in dem der feste Träger aus Stufe (a) aus der Gruppe bestehend aus Silicagel, Cellulose, Polyacrylat, Sepharose und Analoga, Polystyrol (Wang's Harz), Polystyrol-Polyoxyethylen (TentaGel-Harz oder PEG-PS), Copolymere aus Polyethylenglykol und Polyacrylamid (PEGA-Harz), POEPS (Polyoxyethylen-Polystyrol), POEPOP (Polyoxyethylen-Polyoxypropylen), SPOCC (PEG, substituiert mit Oxethan) oder Derivaten davon ausgewählt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, in dem der feste Träger aus Stufe (e), wenn vorhanden, aus der Gruppe bestehend aus Silicagel, Cellulose, Polyacrylat und Sepharose ausgewählt wird.
Konjugate, bestehend aus einem Harz, das in Wasser unlöslich und mit organischen Flüssigkeiten vollständig verträglich ist, und einem Glykopeptid gemäß den Ansprüchen 1–10.
Konjugate gemäß Anspruch 14, in denen das Harz aus der Gruppe bestehend aus Sepharose, Cellulose und Silicagel ausgewählt wird.
Platten für die Diagnose, enthaltend die Glykopeptide gemäß den Ansprüchen 1–10.
Diagnostische Verfahren, in denen die freien Glykopeptide gemäß den Ansprüchen 1–10 verwendet werden.
Diagnostische Verfahren, in denen die Konjugate gemäß den Ansprüchen 14 und 15 verwendet werden.
Kit für die Diagnose von Multipler Sklerose, umfassend: – eine Mikroplatte; – eine Pufferlösung für die Haftung des Peptids an der Platte; – ein modifiziertes Peptid gemäß den Ansprüchen 1–10 (lyophilisiert); – FCS-Puffer (10% FCS, 9 g/l NaCl, Tween 20 0,05%); – konzentrierte Waschlösung (20fach konzentriert); – positives Kontrollserum; – negatives Kontrollserum; – einen Antikörper, der mit dem Antikörper von Multipler Sklerose reagiert [Konjugat-(AP konjugiert mit anti-Igm)]; – ein Substrat (p-Nitrophenylphosphat, Dinatriumsalz); – einen Substratpuffer (1 M Diethanolamin-Puffer, pH 9,8); – eine Stopplösung (1 M Natriumhydrat).
Kit gemäß Anspruch 19, wobei genannte Pufferlösung für die Haftung des Peptids auf der Platte und genanntes modifiziertes Peptid direkt in die Mikroplatte eingebaut werden.