DE3417413A1

DE3417413A1 - Dicarbonsaeure-monohydrazid-derivate, ihre herstellung und ihre verwendung als kopplungskomponenten

Info

Publication number: DE3417413A1
Application number: DE19843417413
Authority: DE
Inventors: Erfinder Wird Nachtraeglich Benannt Der
Original assignee: Dr Karl Thomae GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Priority date: 1984-05-11
Filing date: 1984-05-11
Publication date: 1985-11-14

Description

Dicarbonsäure-monohydrazid-Derivate, ihre Herstellung und
ihre Verwendung als Kopplungskomponenten Das Interesse an Reagenzien zur Bindung von Naturstoffen oder biologischen Wirkstoffen an biologisch aktive Proteine oder an Träger nimmt laufend zu. So ist es beispielsweise für die Darstellung synthetischer Antigene in der Immunbioloqie von großer Bedeutung, das Hapten eindeutig definiert an Biopolymerträger binden zu können. Das Gleiche gilt für die Affinitätschromatoqraphie, bei welcher das Antigen oder der Antikörper an Trägermatrizen eindeutig gebunden werden muß.
Ferner besteht ein steigendes Interesse an immobilisierten, insbesondere an träqerqebundenen enzymatisch aktiven Proteinen. Durch die Immobilisierung wird das biologisch aktive Material stabilisiert und kann leicht aus wässriqen Reaktionsmedien abgetrennt werden. Bei den älteren Verfahren zur kovalenten Bindung von Natur- und Wirkstoffen an Biopolymere und umgekehrt, bediente man sich homobifunktioneller Reaqenzien wie Glutardialdehyd, Diisocyanate oder Diepoxiden.
Es wurden dabei die zu verknüpfenden Stoffe gleichzeitig umqesetzt, was oft eine unerwünschte Vernetzung der Reaktionsnartner unter- und nebeneinander zur Folge hatte. Dies wurde auch bei Verwendung von Carbodiimiden als Kondensationsmittel beobachtet. Als günstiger erwiesen sich Verfahren, bei welchen in 2-stufiger Arbeitsweise gearbeitet wird, zuerst Verknüpfung des Brückenbildungsmoleküls (Crosslinker) mit dem Wirk- oder Naturstoff und anschließend mit dem Biopolymerträger etc. oder auch umgekehrt.
In neuer Zeit wurden außerdem eine Reihe von heterobifunktionellen Brückenbildungsreagenzien entwickelt, viele davon auf der Basis der N-Hydroxysuccinimidester. Auf der anderen Seite werden Funktionen verwendet, welche sehr spezifisch reagieren, z.B. nur mit SH-Gruppen. Ihr Anwendungsbereich ist dementsprechend eingeschränkt. Die Grundgerüste sind meist komplex aufgebaut und aufgrund ihrer aufwendigen Synthese oft sehr teuer.
Es besteht daher nach wie vor ein zusätzlicher Bedarf an Crosslinker-Verbindungen, durch die eine Alternative bei der kovalenten Anknüpfung von Natur- und Wirkstoffen an Polymere und Biopolymere geschaffen wird, vor allem aber auch ein Bedarf an Reagenzien, welche ein weites Anwendungsspektrum, eine hohe Reaktionsselektivität unter milden Bedingungen sowie eine leichte und wirtschaftliche Zugänglichkeit aufweisen.
Gegenstand der Erfindung sind somit die neuen N-geschützten Dicarbonsäure-monohydrazid-derivate der allgemeinen Formel X - NH - NH - CO - A - CO - B - Y ,(I) Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als heterobifunktionelle Verbrückungsreagenzien, insbesondere zur Fixierung biologisch aktiver Wirkstoffe und Naturstoffe an Proteine und Polymere, welche eine oder mehrere Aminofunktionen enthalten.
In der obigen allgemeinen Formel I bedeutet X einen Sctlutztest tür eine Aminogruppe, Y eine Hydroxygruppe oder eine in der Peptidchemie übliche Schutz- oder reaktive Austrittsgruppe, A eine gegebenenfalls durch 1 bis 4 Alkylgruppen mit jeweils 1 bis 3 Kohlenstoffatomen substituierte geradkettige Alkylengruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, wobei in einer gegebenenfalls substituierten n-Propylengruppe die mittlere Methylengruppe durch ein Sauerstoffatom ersetzt sein kann, und B eine Bindung oder einen Aminosäurebaustein, bei dem gegebenenfalls vorhandene weitere funktionelle Gruppen frei oder geschützt sein können.
Als Schutzreste für eine Aminogruppe kommen beispielsweise leicht abspaltbare Schutzgruppen vom Typ der Acyl-, Alkyl-, Aryl- oder Alkylidenschutzgruppen und für Y leicht abspaltbare Schutzgruppen vom Typ der Ester-und Etherschutzgruppen bzw. als Aktivestergruppen solche vom Typ der Imidazolide, Imidosäureester, N-Hydroxysuccinimidester, N-Hydroxysulfosuccinimidester, N-Hydroxybenzotriazolester, Nitrophenylester, 1,3-Oxazolidinone, Vinylester, Chlorphenylester, Polymer-nitrophenylester und Polymer-N-hydroxysuccinimidester in Betracht.
Für die bei der Definition der Reste X, Y, A und B eingangs erwähnten Bedeutungen kommt somit beispielsweise für X die Bedeutung der Trifluoracetyl(Tfa)-, Formyl-, Phthalyl(Pht)-, Toluolsulfonyl(Tos)-, 2-Nitrophenylsulfenyl(Nps)-, Benzyloxycarbonyl (Z) -, tert.Butoxycarbonyl(Boc)-, tert.Amyloxycarbonyl(Aoc)-, Adamantyl- (l)-oxycarbonyl(Adoc)-, [2-Biphenyl-(4)-propyl-(2)loxycarbonyl(Bpoc)-, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc)-, Piperidinoxycarbonyl(Pioc)-, 3,5-Dimethoxy-(a,a-dimethyl)-benzyloxycarbonyl (DdZ)-, Furfuryloxycarbonyl-, Phenylthiocarbonyl (Ptc)-, Polymer( -tert.amyloxycarbonyl(Aoc)-, Isopropyl(Ip)-, Benzyl(Bzl)-, Phenyl-, Trityl(Trt)-, Benzyliden-oder Isopropylidengruppe, für Y die der Hydroxy(OH)-, Methoxy(OMe)-, Ethoxy(OEt)-, tert.Butoxy(OBut)-, Benzyloxy(OBzl)-, N-Oxysuccinimid(OSu)-, 4-Nitrophenyloxy(ONp)-, Polymer-2-nitrophenyloxy(OONp)- oder Polymer-(N-oxysuciinimid(OOSu)-Gruppe in Betracht.
für A die der Ethylen-, n-Propylen-, n-Butylen-, l-Methylethylen-, 2-Methyl-ethylen-, l,l-Dimethyl-ethylen-, 1,2-Dimethyl-ethylen-, 1,1,2-Trimethyl-ethylen-, Tetramethylethylen-, l-Propyl-ethylen-,2-Isopropyl-ethylen-, l-Methyln-propylen-, 2-Ethyl-n-propylen-, l-Ethyl-n-butylen-, 3-Isopropyl-n-butylen-, 4-Methyl-n-butylen- oder Dimethylenoxidgruppe sowie andere Spacergrupen mit lipophilen Resten wie Alkylgruppen mit 3 bis 19 Kohlenstoffatomen oder hydrophilen Resten wie Polyoxyethylene und für B der Rest eines in der Peptidchemie üblichen Aminosäurebausteins wie Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Trp, Ser, Ser(But), Ser(Bzl), Thr, Thr(But), Thr(Bzl), Cys, Cys(SIp), Cys(Bzl), Cys(But), Met, Lys, Lys(Z), Lys(Boc), Arg, Arg(Mtr (NG-Methoxy-2,3 ,6-trimethyl-phenylsulfonyl)), Arg(Z), Arg(NO2), Asp, Asp(OBut), Asp(OBzl), Asn, Gln, Glu(OBut), Glu(OMe), Glu(OBzl), Gln, Phe, Tyr, t Tyr(OBu ), Tyr(2,6-Dichlorbenzyl), His, His((Dnp)(2,4- Dinitrophenyl)), His(Trt), Trp, Pro, a-Aminoisobuttersäure(a-Aib), y-Aminobuttersäure(y-Abu) und Isovalin(Iva) in Betracht.
Bevorzugte Verbindungen der obigen allgemeinen Formel I sind diejenigen, in denen B wie vorstehend definiert ist, X eine hydrolytisch oder hydrogenolytisch abspaltbare Schutzgruppe wie die tert.Butoxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl- oder 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe, Y die Hydroxygruppe oder eine Estergruppe wie die Methoxy-, tert.Butoxy- oder Benzyloxygruppe oder eine aktive Estergruppe wie die N-Oxy-succinimid-, N-Oxy-sulfosuccinimid-, Nitrophenyloxy-, l-Imidazolo- oder N-Hydroxybenzotriazolgruppe und A eine gegebenenfalls durch eine oder zwei Methylgruppen substituierte geradkettige Alkylengruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine n-Propylengruppe, in der die mittlere Methylengruppe durch ein Sauerstoffatom ersetzt ist, bedeuten.
Besonders bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel I sind diejenigen, in denen X wie vorstehend erwähnt definiert ist, A eine Ethylen- oder n-Propylengruppe, B eine Bindung und Y eine Hydroxygruppe oder B einen Aminosäurebaustein, bei dem gegebenenfalls vorhandene funktionelle Gruppen frei oder geschützt sein können, darstellen und Y die vorstehend erwähnten Bedeutungen besitzt.
Erfindungsgemäß erhält man die neuen Verbindungen nach folgenden Verfahren: a) Zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der Y eine Hydroxygruppe oder eine in der Peptidchemie übliche Schutzgruppe darstellt: Umsetzung eines Hydrazids der allgemeinen Formel X - NH - Nu2 , (11) in der X wie eingangs definiert ist, mit einer gegebenenfalls im Reaktionsgemisch hergestellten Carbonsäure der allgemeinen Formel HOOC - A - CO - B - Y' ,(III) in der A und B wie eingangs definiert sind und Y' eine in der Peptidchemie übliche Esterschutzgruppe darstellt, oder mit deren reaktionsfähigen Derivaten und gegebenenfalls anschließende selektive Abspaltung eines in B zusätzlich verwendeten Schutzrestes und/oder des Restes Y'.
Die Umsetzung wird in einem geeigneten Lösungsmittel wie Methylenchlorid, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethylformamid, Acetonitril, Wasser oder deren Gemischen vorzugsweise in Gegenwart eines die Säure aktivierenden Mittels wie N,N'-Dicyclohexyl-carbodiimid, N,N'-Carbonyl-diimidazol, Disuccinimidylcarbonat, N,N'-Thionyldiimidazol, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid/N-Hydroxysuccinimid, N,N'-Dicyclohexyl-carbodiimid/N-Hydroxysulfosuccinimid oder N,N'-Dicyclohexyl-carbodiimid/l-Hydroxybenzotriazol (HOBt) bei Temperaturen zwischen 0 und 800C, vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 15 und 500C, durchgeführt.
Die gegebenenfalls anschließende selektive Abspaltung eines verwendeten Schutzrestes in B und/oder des Restes Y' kann je nach dem verwendeten Schutzrest entweder hydrogenolytisch oder hydrolytisch mit einer Säure oder Base erfolgen.
So kann beispielsweise ein als Schutzrest verwendeter Benzyloxyrest hydrogenolytisch abgespalten werden, z.B. mittels Hydrierung in einem Lösungsmittel wie Methanol, Äthanol, Essigsäure oder Essigsäureäthylester in Gegenwart eines Hydrierungskatalysators, eine tert.Butoxygruppe hydrolytisch mit einer Säure wie Trifluoressigsäure oder Chlorwasserstoff/Eisessig oder eine Fluorenylmethoxygruppe hydrolytisch in Gegenwart einer Base wie Piperidin.
b) Zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der B einen Aminosäurebaustein, bei dem gegebenenfalls vorhandene weitere funktionelle Gruppen frei oder geschützt sein können, und Y eine Hydroxygruppe oder eine in der Peptidchemie übliche Schutzgruppe darstellen: Umsetzung einer Verbindung der allgemeinen Formel X - NH - NH - CO - A - COOH ,(IV) in der A und X wie eingangs definiert sind, oder deren reaktionsfähigen Derivaten wie ein gemischtes Anhydrid mit einer Aminosäure der allgemeinen Formel H - B - Yw ,(V) in der B einen Aminosäurebaustein, bei dem gegebenenfalls weitere funktionelle Gruppen frei oder geschützt sein können, und y" eine in der Peptidchemie übliche Esterschutzgruppe darstellen und gegebenenfalls anschließende Abspaltung eines in B zusätzlich verwendeten Schutzrestes und/oder des Restes V".
Die Umsetzung wird in einem geeigneten Lösungsmittel wie Methylenchlorid, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethylformamid, Acetonitril, Wasser oder deren Gemischen vorzugsweise in Gegenwart eines die Säure aktivierenden Mittels wie N,N'-Dicyclohexyl-carbodiimid, N,N'-Carbonyl-diimidazol, N,N'-Thionyl-diimidazol, Disuccinimidylcarbonat, N,N'-Dicyclohexyl-carbodiimid/N-Hydroxy-succinimid, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid/N-Hydroxysulfosuccinimid oder N,N'-Dicyclohexyl-carbodiimid/l-Hydroxy-benzotriazol (HOBt) bei Temperaturen zwischen 0 und 800C, vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 15 und 500C, durchgeführt.
Die gegebenenfalls anschließende selektive Abspaltung eines verwendeten Schutzrestes in B und/oder des Restes Y" kann je nach dem verwendeten Schutzrest entweder hydrogenolytisch oder hydrolytisch mit einer Säure oder Base erfolgen.
So kann beispielsweise ein als Schutzrest verwendeter Benzyloxyrest hydrogenolytisch abgespalten werden, z.B. mittels Hydrierung in einem Lösungsmittel wie Methanol, Äthanol, Essigsäure oder Essigsäureäthylester in Gegenwart eines Hydrierungskatalysators, eine tert.Butoxygruppe hydrolytisch mit einer Säure wie Trifluoressigsäure oder Chlorwasserstoff/Eisessig oder eine Fluorenylmethoxygruppe hydrolytisch in Gegenwart einer Base wie Piperidin.
c) Zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der Y eine in der Peptidchemie übliche reaktive Austrittsgruppe darstellt: Umsetzung einer Verbindung der allgemeinen Formel X - NH - NH - CO - A - CO - B - OH , (VI) in der A, B und X wie eingangs definiert sind, oder deren reaktionsfähige Derivate wie ein gemischtes Anhydrid mit einer Verbindung der allgemeinen Formel H ye n (VII) in der Y'" eine in der Peptidchemie übliche reaktive Austrittsgruppe darstellt.
Die Umsetzung wird in einem geeigneten Lösungsmittel wie Methylenchlorid, Tetrahydrofuran, Dioxan, Acetonitril oder Dimethylformamid oder deren Gemischen vorzugsweise in Gegenwart eines die Säure aktivierenden Mittels wie N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, N,N'-Carbonyl-diimidazol, Disuccinimidylcarbonat, N,N'-Thionyldiimidazol, N,N'-Dicyclohexyl-carbodiimid/l-Rydroxybenzotriazol oder ein wasserlösliches Carbodiimid bei Temperaturen zwischen 0 und 80°C, vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 10 und 500C, durchgeführt.
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Verbindungen der allgemeinen Formeln II, III, V und VI sind zum größten Teil literaturbekannt bzw. man erhält sie nach literaturbekannten Verfahren, beispielsweise eine Verbindung der allgemeinen Formel II durch entsprechende Monoacylierung von Hydrazin und eine Verbindung der allgemeinen Formel III durch Umsetzung eines entsprechenden Carbonsäureanhydrids mit einem entsprechenden Aminosäurederivat. Eine Verbindung der allgemeinen Formel VI erhält man durch Umsetzung eines entsprechenden Hydrazids mit einer entsprechenden Carbonsäure und gegebenenfalls anschließende selektive Abspaltung eines verwendeten Schutzrestes im Rest B. Eine Ausgangsverbindung der allgemeinen Formel IV erhält man beispielsweise durch Umsetzung eines entsprechenden geschützten Hydrazids mit einem entsprechenden Carbonsäurederivat wie einem Carbonsäureanhydrid.
Bei den gemäß den Verfahren a) bis c) erfindungsgemäß erhaltenen Verbindungen handelt es sich um geschützte Carbonsäurehydrazidderivate, also um Verbindungen mit latenter Funktionalität. So kann beispielsweise ein als Schutzrest X verwendeter Benzyloxycarbonylrest hydrogenolytisch abgespalten werden, z.B. mittels Hydrierung in einem Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol, Dimethylformamid und Essigsäure in Gegenwart eines Hydrierungskatalysators, eine tert.Butyloxycarbonylgruppe hydrolytisch in Gegenwart von Säuren wie Trifluoressigsäure oder Chlorwasserstoff/Eisessig, oder eine Fluorenylmethoxycarbonylgruppe hydrolytisch in Gegenwart einer Base wie Piperidin. Außerdem können DdZ-geschützte Hydrazide unter äußersten milden Bedingungen zum freien Hydrazid entacyliert werden. Das freie Hydrazid kann nach literaturbekannten Methoden, z.B. nach Medzihradsky (siehe beispielsweise J. Amer. Chem. Soc. 90, 4711 (1968)) oder Honzl-Rudinger (siehe beispielsweise Helv. Chim. Acta. 53, 2135 (1979)) mit Nitrit bzw. Isoamylnitrit in Gegenwart einer Säure in ein sehr reaktionsfähiges Azid übergeführt werden. Azide reagieren unter äußerst milden Bedingungen mit Aminogruppen. Auf der anderen Seite reagiert z.B. im Falle des N-Hydroxysuccinimidesters selektiv mit Aminogruppen.
Stellt Y eine Hydroxygruppe dar, wird z.B. mittels Carbodiimid/N-Hydroxysuciinimid, Carbodiimid/l-Hydroxybenzotriazol oder Disuccinimidylcarbonat in situ der entsprechenden Aktivester hergestellt.
Wie bereits eingangs erwähnt, stellen die neuen Verbindungen der allgemeinen Formel I wertvolle Kopplungskomponenten dar.
Hierbei ergibt sich durch die Kombination von Schutzgruppen, welche sauer, alkalisch oder hydrogenolytisch abgespalten werden können, eine große Variationsbreite der zu koppelnden Verbindungen.
Außerdem können die neuen Derivate direkt zur Peptid-Synthese eingesetzt werden. Nach Abspaltung der verwendeten Schutzgruppen kann dann das Peptid gezielt an Biopolymere oder Trägergele gekoppelt werden. So konnte beispielsweise das Tetrapeptid H-Gly-Pro-Ala-Thr-OH (C-terminale Sequenz des Tabak-Mosaic-Virus (TMV)-Hüllproteins) mit Bernsteinsäure-mono-Nh-tert,butoxycarbonyl-hydrazid als Verbrückungsreagenz an Polylysine mit unterschiedlicher und jeweils definierter Beladung gekoppelt werden. Je nach dem Molverhältnis von Peptid zu £ -Aminogruppen des Lysins (siehe Beispiel J) konnten z.B. Beladungen von 32, 64, 170 bzw. 380 Peptidresten an der Polylysinkette mit 380 Lysin-Bausteinen erhalten werden. Dasselbe Tetrapeptid wurde mit einer Beladung von 6 - 8 und ca. 18 - 20 Resten an Humanserumalbumin mittels Azidkupplung über den neuen Crosslinker gekoppelt.
Die Polylysinderivate eignen sich im indirekten Enzymelinked-immunosorbent-assay-(ELISA) hervorragend zur Beschichtung von Polystyrol-Mikrotiterplatten und zum Nachweis von Antikörpern gegen das Hapten. Die Polylysinkonjugate zeigen dabei bei gleicher Beschichtungskonzentration eine 10- bis 50-fach höhere Nachweisgrenze der Antikörper als die entsprechenden HSA-Derivate mit niederer Beladung.
Die Tatsache, daß es zum ersten Mal gelungen ist, Polylysin-Oligopeptid-Konjugate mit einer vollständigen Beladung zu bekommen (d.h. an jeden Lys-Rest ist ein Peptidrest gekoppelt), zeigt deutlich die hohe Reaktivität der Derivate, welche mit den neuen erfindungsgemäßen Verbrückungsreagenzien gekoppelt werden.
Das C-terminale Tetrapeptid von TMV kann mittels Azidkopplung über die neuen Verbrückungsreagenzien auch an Aminosepharose 4B (Pharmacia) gebunden werden. Die Beladung mit Tetrapeptid ist hierbei mit 10-11 pmol/g gequollenem Gel maximal, außerdem ist die anschließende affinitätschromatographische Abtrennung der Antikörper gegen das Tetrapeptid eindeutig.
Die erfindungsgemäßen Verbrückungsbildner sind auch bestens geeignet zur Immobilisierung von biologisch aktiven Polymeren (Enzymen). Ist das Verbrückungsreagenz als Aktivester oder mittels eines Carbodiimids an Aminosepharose 4B angekoppelt, wird die Schutzgruppe des Hydrazinrestes abgespalten, das Azid gebildet und an das entsprechende Enzym, vorzugsweise bei pH 7-8 und bei 40C, gekoppelt. Die Azidkopplung zeichnet sich durch milde Reaktionsbedingungen und hohe Selektivität aus.
Die gleichen Anwendungsbereiche wie das Azid haben beispielsweise die N-Hydroxysuccinimidester. Beide Methoden sind für die Boc, Z, Fmoc geschützten Hydrazidbernsteinsäureglycin-Derivate anwendbar. Im Gegensatz zu der 4-gliedrigen Verbrückung bei den Boc-,Z-,Fmoc-Bernsteinsäure-Derivaten zeichnen sie sich durch 7-gliedrige Verbrückung aus. Die aktiven Ester können in 90-95 % - Reinheit dargestellt werden und sind bei 0-40C längere Zeit lagerfähig. Sie reagieren in ca. 1,2-fachem Überschuß in Wasser, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran oder Dioxan innerhalb von 1-2 Stunden quantitativ mit Aminogruppen enthaltenden Verbindungen.
Da Glycin selbst keine immunogene Eigenschaften besitzt, eignen sich die Glycin-Derivate auch zur Darstellung von Protein-Hapten-Konjugaten. Ein Vorteil bei der Verwendung von Glycin oder anderen Aminosäuren zur Kettenverlängerung besteht weiterhin darin, daß die Kopplung der Verbrückungsreagenzien, z.B. an Trägergele, mittels Aminosäureanalyse quantitativ überprüft werden kann. Eine radioaktive Markierung des Reagenz ist daher zur Beladungsbestimmung überflüssig. Andererseits können über die Verbrückungsreagenzien hohe radioaktive Markierungen eingeführt werden, z.B. durch Einbau von 14C- bzw. 3H-markierten Aminosäuren oder von 1251od- markiertem Tyrosin an Stelle des Glycins im oben erwähnten Crosslinker-Derivat. Dies ist eine mögliche Alternative zu der Markierung nach Bolton-Hunter.
An dieser Stelle soll nochmals auf die Bedeutung der Verbrückungsreagenzien für die Peptidchemie hingewiesen werden.
Mit den Boc-' Z-, Fmoc-HSc- bzw. Boc-, Z-, Fmoc-HSc-Gly-Derivaten (HSc = NHNH-CO-CH2CH2-CO-) stehen in beiden Fällen geeignete Verbindungen bereit, welche an geschützte Aminosäuren oder Peptide direkt wie normale Bausteine angekoppelt werden können. Nach Abspaltung der Schutzgruppen erhält man kopplungsfähige Peptide für viele Zwecke, wie beispielsweise oben dargelegt. Sämtliche Derivate lassen sich ohne Schwierigkeit auch bei Synthesen an polymeren Trägern, z.B. in der Festphasenpeptidsynthese nach Merrifield, verwenden. Anstelle der Aminosäure Gly kann zur Herstellung der Boc-, Z-, Fmoc-HSc-B-OSu (OH)-Derivate jede andere Aminosäure verwendet werden. Dies erhöht den Anwendungsbereich dieser Derivate in der Peptidchemie um ein Vielfaches, wie aus dem nachfolgenden Syntheseschema hervorgeht: P1 und P2 = z.B. Peptid, biol. Wirkstoff, Protein, Polyaminosäuren, Polymere, Trägergele usw.
Selbstverständlich sind die geschilderten Anwendungen nicht nur auf Peptide beschränkt, sondern sie gelten für alle Wirk- oder Naturstoffe, die eine Aminogruppe enthalten, welche über die erfindungsgemäßen Verbrückungsreagenzien mit einer anderen Aminogruppe gekoppelt werden sollen.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern: Vorbemerkungen: 13C-NMR- und 1H-NMR-Spektren wurden auf einem BRUKER WP 80, HFX90 und WM 400 aufgenommen.
Aminosäureanalysen wurden auf einem BIOTRONIK Aminosäureanalysator LC 6000 E durchgeführt. Die Totalhydrolysate wurden unter üblichen Hydrolysebedingungen (6N HC1, 1100C, 18 Stunden) erhalten.
Für die Dünnschichtchromatographie wurden folgende Laufmittelsysteme verwendet: (1) CHC13/MeOH/AcOH/H2O 65:25:3:4 (v/v) (2) CHC13/MeOH/AcOH 55:5:1 (v/v) (3) CHC13/MeOH/AcOH/H2O 35:45:3:4 (v/v) (4) CHC13/MeOH/konz. NH3/H2O 65:35:3:4 (v/v) (5) CHC13/MeOH 95:5 (v/v) Geeignete Sprüh- bzw. Entwicklungsreagentien: a) Entwickeln in gesättigter Iodkammer b) Besprühen mit 0,02 % Bromkresolgrünlösung c) Chlor/4,4'-Bis(dimethylamino)diphenylmethan (TDM-Reagenz) d) Bar tons Reagenz auf freie Hydrazide e) Ninhydrin-Reagenz Der verwendete Petrolether hatte einen Siedebereich von 30 bis 500C.
Beispiel 1 Nh-Ter t.butyloxycarbonyl-ber nsteinsäure-mono-hydrazid (Boc-HSc-OH) 10 g (0,1 Mol) Bernsteinsäureanhydrid, gelöst in 350 ml trockenem Tetrahydrofuran, werden mit 13,86 g (0,105 Mol) tert.Butylcarbazat, gelöst in 25 ml Dichlormethan, tropfenweise während 5 Minuten unter Rühren versetzt. Bei Einsetzen der Reaktion steigt die Temperatur auf 40-500C. Man rührt 2 Stunden unter Feuchtigkeitsausschluß. Man entfernt das Lösungsmittel im Vakuum, bis eine farblose sirupöse Flüssigkeit übrigbleibt. Diese wird mit 30-40 ml Essigester und 10-15 ml Methanol gelöst. Unter starkem Rühren gibt man langsam Petrolether derart zu, daß es nicht zum Ausölen der Substanz kommt. Zwischen den Zugaben des Petrolethers ist es ratsam, einige Minuten zu warten. Haben sich schließlich feine Kristalle gebildet, gibt man nur noch wenig Petrolether zu und rührt ca. 30 Minuten, bis das Produkt langsam anfängt auszufallen. Man gibt nun im Wechsel Petrolether und Diethylether in 10 ml-Portionen zu bis zur quantitativen Füllung. Das Produkt ist gut löslich in Wasser, Dimethylformamid, Methanol, Tetrahydrofuran, Methylenchlorid und Dioxan.
Ausbeute: 21,1 g (91 % der Theorie); Reinheit: > 98 %; Schmelzpunkt: 1030C; RF(1) = 0,58; RF(2) = 0,38; RF(4) = 0,37.
C8H16N205 (232); Ber.: C 46,55 H 6,09 N 12,06 Gef.: 46,15 6,71 12,23 Ker nr esonanz-Spektren: 13C-NMR (D2O; # = ppm): Sc-COOH 177.4 Sc-CO-N2H2- 180.9 Boc - CO 166.2 Boc - Cquartär 85.5 Boc - CH3 30.1 Sc-CH2- 33.0 und 31.7 1H-NMR (D2O:#= ppm): Boc - CH3 1.36 (Singulett) Sc-CH2- 2.22 (Singulett) Hydrazid - NH 6.48 (Singulett) Beispiel 2 Nh-Benzyloxycarbonyl-bernsteinsäure-mono-hydrazid (Z-HSc-OH) 2 g (0,02 Mol) Bernsteinsäureanhydrid> gelöst in 30 ml trockenem Tetrahydrofuran, werden mit 3,48 g (0,021 Mol) Benzyloxycarbonylhydrazid, gelöst in 20 ml Dichlormethan, tropfenweise bei Raumtemperatur versetzt. Man rührt 30 Minuten und engt die Lösung im Vakuum ein, wobei sich das Produkt kristallin ausscheidet. Zur quantitativen Fällung versetzt man mit 40-50 ml Ether/Petrolether 1:2 (vjv). Das Produkt ist löslich in Tetrahydrofuran, Dimethylformamid und niederen Alkoholen.
Ausbeute: 4,65 g (93 % der Theorie); Schmelzpunkt: 135°C; RF(1) = 0,63; RF(4) = 0,28; RF(5) = 0,12.
C12H14N2°4 (250) Ber.: C 57,60 H 5,60 N 11,20 Gef.: 57,45 5,51 11,03 13C-NMR (CD30D; & = ppm): Sc-COOH 175.92 Sc-CO-N2H2- 174.19 Z-CO 158.44 Aromaten: C-1, C-3 129.4 C-2 129.1 C-4 128.9 Benzyl - CH2- 68.3 Sc-CH2 30.7 und 29.8 ¹H-NRM (CD3OD, # = ppm): Armoaten 7.32 (verbreitertes Signal) Benzyl - CH2- 5.12 (Singulett) Sc-CH2 2.54 (2 Tripletts, die zu einem Quartett zusammenfallen) Beispiel 3 Nh-Fluorenylmethoxycarbonyl-bernsteinsäure-mono-hydrazid (Fmoc-HSc-OH) 1 g (0,01 Mol) Bernsteinsäureanhyrid werden in 15-20 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst und tropfenweise bei Raumtemperatur mit Fluorenylmethoxycarbonyl-hydrazid (Fmoc-NHNH2 wird analog der Methode von Carpino hergestellt) in 60 ml Tetrahydrofuran/Dimethylformamid 3:1 (v/v) versetzt. Man rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur und zieht das Lösungsmittel im Vakuum ab. Der ölige Rückstand wird aus Dichlormethan/Petrolether umkristallisiert. Das Produkt ist löslich in Tetrahydrofuran, Dimethylformamid und niederen Alkoholen.
Ausbeute: 3,26 g (92 % der Theorie); Schmelzpunkt: 171°C; RF(1) = 0,62; RF(4) = 0,34; RF(2) = 0,36.
C19H18N205 (354) Ber.: C 64,40 H 5,08 N 7,90 Gef.: 64,29 5,19 7,80 13C-NMR (CD3OD; # = ppm): Sc-COOH i76.1 Sc-CO-N2H2- 174,2 Fmoc - CO 158.3 Fmoc-Aromaten-C-Atome: C 9a,b 144.7 C4a,b 142.1 C2,7 128.4 C3,6 127.8 C1,8 126.0 C4,5 120.7 Fmoc - CH2 - 68.57 Fmoc-CH 47.9 Sc-CH2- 29.8 und 29.4 ¹H-NMR: (DMSO-d6; #= ppm) ; Hydrazid - NH - 9.71 und 9.22 Fmoc-Aromaten-H-Atome 7.92 bis 7.21 (Multiplett) Fmoc - CH2 und CH 4.27 Sc-CH2 2.49 (Multiplett) Beispiel 4 Nh-tert.Butyloxycarbonyl-hydrazido-Na-succinyl-glycinbenzylester (Boc-HSc-Gly-OBzl) 2,56 g (11 mMol) Bernsteinsäure-mono-N'-tert.butyloxycarbonylhydrazid, 3,72 g (11,1 mMol) Glycinbenzylester-p-tosylat, 1,34 ml (11 mMol) N-Methyl-morpholin und 1,68 g (11 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst und bei 0°C mit 2,27 g (11 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Reaktionslösung läßt man unter Rühren auf Raumtemperatur kommen. Nach 12 Stunden wird der ausgefallene Harnstoff abfiltriert. Das Lösungsmittel wird im Hochvakuum entfernt und der ölige Rückstand in Essigester aufgenommen und nochmals vom ausqefallenen Harnstoff abfiltriert. Man extrahiert die Essigesterphase je 3 x mit 5 % KHC03- und 5 % KHSO4-Lösung, wäscht mit gesättigter NaCl-Lösung neutral und trocknet über Na2SO4. Man kristallisiert aus Essigester durch langsame Zugabe von Ether und Petrolether um.
Ausbeute: 3,1 g (75 % der Theorie); Reinheit: 96 % (enthält Spuren von Dicyclohexylharnstoff); RF(1) = 0,79; RF(2) = 0,52; RF(4) = 0,91.
C18H27N3°6 (379) 13C-NMR (CDC13; 8 = ppm): Sc-CO 172.2 Sc-CO-N2H2- 172.7 Gly - COOH 170.0 Boc - CO 155.6 Aromaten: Bzl-C-l 128.5 C-3 128.5 C-2 128.5 C-4 128.1 Boc-Cq 81.3 Benzyl-CH2 66.9 Gly - Ca 41.3 Sc-CH2- 30.8 und 29.2 Boc - CH3 28.1 Beispiel 5 Nh-tert. Butyloxycarbonyl-hydrazido-Nα-succinyl-glycin (Boc-HSc-Gly-OH) 3,1 g (8,2 mol) Boc-HSc-Gly-OBzl werden in 25 ml Methanol 3 Stunden mit Palladium/Aktivkohle im H2-Durchflußstrom hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Methanol im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wird aus Essigester durch langsame Zugabe von Petrolether umkristallisiert. Das Produkt ist löslich in Wasser, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid und niederen Alkoholen.
Ausbeute: 2,9 g (80 9s der Theorie); Schmelzpunkt: 1360C; RF(1) = 0,37; RF(2) = 0,06; RF(3) = 0,78.
11 18 O6 (289) 3C-NMR (D2O; 2 = ppm): Sc-CO 177.6 Sc-CO-N2H2 - 177.4 Gly - CO 176.3 Boc - CO 166.7 Boc Cq 85.6 Gly-Cα 43.7 Sc-CH2- 32.8 und 31.2 Boc-CH3 30.0 1H-NMR (D2O; i = ppm): Boc-CH3 1.32 (Singulett) Sc-CH2 - 2.49 (Singulett) Gly-NH 3.83 (Singulett) Gly-CH2- 1.12 (Singulett) beispiel 6 Nh-tert.-Butyloxycarbonyl-hydrazido-Nα-succinyl-glycin-N-hydroxy-succinimidester (Boc-HSc-Gly-OSu) 1,4 g (4,84 mMol) Boc-HSc-Gly-OH und 0,58 g (5,08 mMol) N-Hydroxysuccinimid werden in 15 ml Dimethylformamid/Dichlormethan (1:2; v/v) gelöst und bei 0°C mit 0,99 g (4,84 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Reaktionsgemisch läßt man auf Raumtemperatur erwärmen und rührt weitere 3 Stunden. Der ausgefallene Harnstoff wird abgesaugt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach Lösen des öliqen Rückstands in Essigester wird weiterer ausgefallener Harnstoff abqesaugt. Die Essiqesterphase wird auf 4-5 ml eingeengt und langsam unter Rühren in 100 ml kalten Diethylether einqetropft. Der flockiqe oder öliqe Niederschlag wird abzentrifugiert und restliches Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Man erhält ein farbloses, amorphes, hygroskopisches Produkt, welches sich gut in Wasser, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Chloroform und niederen Alkoholen löst. Das Produkt ist bei 40C über mehrere Wochen lagerfähig.
Ausbeute: 1,4 g (75 % der Theorie); Reinheit: ca. 95 % (DC); RF(1) = 0,62; RF(2) = 0,13.
C15H22N4O8 (386) Beispiel 7 Nh-benzyloxycarbonyl-hydrazido-Nα-succinyl-glycin tert.butylester (Z-HSc-Gly-OBu t) Herqestellt analoq Beispiel 4 aus Z-HSc-OH und H-Gly-OBut x HC1 in Dimethylformamid.
Ausbeute: 65 % der Theorie; Schmelzpunkt: 115°C (aus Essigester/Ether); RF(1) = 0,85; RF(2) = 0,54; RF(5) = 0,18; C18H25N3o6 (379) 13C-NMR(CD3OD; G = ppm): Sc-CO- 174.2 Sc-CO-N2H2- 174.7 Gly-CO 170.5 Phenyl-C-Atome: C-l, C-3 129.4 und 129.8 C-2 129.1 C-4 128.9 Boc-Cq 82.8 Gly-Cα 42.9 Sc-CH2- 31.5 und 30.0 Boc-CH3 28.3 Beispiel 8 Nh-Fluorenylmethoxycarbonyl-hydrazido-Nα-succinyl-glycintert.butylester (Fmoc-HSC-Gly-OEut) Hergestellt analog Beispiel 4 aus Fmoc-HSc-OH und t H-Gly-OBu x HC1 in Tetrahydrofuran.
Ausbeute: 67 % der Theorie; Schmelzpunkt: 105-1100C (aus Methanol/Essigester/Petrolether) RF(1) = 0,85; RF(2) = 0,54; RF(5) = 0,18; C24H29N3O6 (467) 13C-NMR (CD3OD; # = ppm): Sc-CO 174.2 Sc-CO-N2H2- 174.7 Gly-CO 170.6 Fmoc-CO 158.8 Fmoc-C-Atome (Aromaten): Cga,b 145.0 C4a,b 142.5 C2,7 128.8 C3,6 128.2 C1,8 126.2 c4,5 120.9 Fmoc-CH2 68.6 Fmoc-CH 48.5 BOc-Cq 82.7 Gly-Cα 42.9 Sc-CH2 - 31.5 und 30.0 Boc-CH3 28.7 Beispiel 9 Nh-Benzyloxycarbonyl-hydrazido-N -succinyl-glycin (Z-HSc-Gly-OH) 10 mMol Z-HSc-Gly-OBut werden unter Luftfeuchtigkeitsausschluß mit 15 ml trockener Trifluoressigsäure oder mit 1.2 N HCl/Eisessig gerührt. Nach 15 bis 30 Minuten engt man auf etwa 5 ml ein und tropft in ca. 100 ml kalten Ether ein. Das Produkt fällt flockig aus.
Ausbeute: 90 % der Theorie; Schmelzpunkt: 1680C; RF(1) = 0,29; RF(2) = 0,10; RF(3) = 0,60; C14H7N3O6 (323) Beispiel 10 Nh-Fluorenylmethoxycar bonyl-hydrazido-Na-succinyl-glycin (Fmoc-HSc-Gly-OH) Herqestellt analog Beispiel 9 aus 10 mMol Ausbeute: 88 % der Theorie; Schmelzpunkt: 175°C; RF(1) = 0,46; RF(2) = 0,10; RF(3) = 0,83.
C21H21H3°6 (411) Beispiel 11 N h -Benzyloxycarbonyl-hydrazido-Nα-succinyl-glycin-N-hy droxysuccinimidester (Z-HSc-Gly-OSu) Hergestellt analoq Beispiel 6 aus Z-HSc-Gly-OH und N-Hydroxy-succinimid in Dimethylformamid mittels Carbodiimid-Kunnlung .
Farbloses, zähes Ö1; Ausbeute: 85 96 der Theorie; Reinheit: mind. 90-95 % (DC); RF(1) = 0,62; RF(2) = 0,27; RF(3) = 0,77.
C18H20N408 (420) Beispiel 12 Nh-Fluorenylmethoxycarbonyl-hydrazido-N-succinyl-glycina N-hydroxysuccinimidester (Fmoc-HSc-Gly-OSu) Hergestellt analog Beispiel 6 aus Fmoc-HSc-Gly-OH und N-Hydroxy-succinimid in Tetrahydrofuran mittels Carbodiimid-Kupplung.
Farbloses Ö1; Ausbeute: 85 % der Theorie; Reinheit: (DC) mind. 90-95 %; RF(1) = 0,67; RF(2) = 0,31.
C25H24N4O8 (508) Analog den vorstehenden Beispielen werden folgende Verbindungen erhalten: Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-Ala-OH(-OSu,-Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, Oaoc-HSc-Tyr (But, Bzl, 2,6-Dichlor--benzyl)-OH(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-Glu (OBut, OBzl, OMe)-OH-(-OSu ,-/Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-Asp(OBut, OBzl, OMe)-OH-(OSu, -Su ) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-Arg(Mtr, NO2, Z)-OH-(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-α-Aib-OH,(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAox-HSc-γ-Abu-OH,(-OSU,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-Iva-OH,(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-Lys(Boc, Z)-OH(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-Met-OH,(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-Cys(SBut, SBzl, SIp)-OH-(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-Ser(But, Bzl)-OH(-OSu,-9(Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-Thr(But, Bzl)-OH(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-His-OH,(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-His[ (Dnp) (2,4-Dinitrophenyl)]-OH,(-OSU,-#Su) NhBoc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-His(Trt)-OH,(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-Aen-OH,(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-Aen-OH,(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-Aen-OH,(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-Leu-OH,(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-Aen-OH,(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-Phe-OH,(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-Phe-OH,(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HSc-Trp-OH,(-OSu,-Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr (Hydrazido-glutaryl)-Ala-OH(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-Tyr(But, Bzl, 2,6-Dichlor-benzyl)-OH(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-Glu(OBut, OBzl, OMe)-OH-(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-Asp(OBut, OBzl, OMe)-OH-(OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-Ary(Mtr, NO2, Z)-OH-(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-a-Aib-OH,(-OSu,-BSu) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HBlr-γ-Abu-OH,(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-Iva-OH,(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-Lys(Boc, Z)-OH(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-Met-OH,(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-Cys(SBut, SBzl, SIp)-OH-(-OSu , -/Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-Ser(But, Bzl)-OH-(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-Thr(But, Bzl)-OH-(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-His-Oh, (-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-His[(Dnp) (2,4-Dinitrophenyl)]-OH, (-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-His (Trt)-OH, (-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-Asn-OH, (-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-Gln-OH,(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-Val-OH,(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-Gln-OH,(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-Val-OH,(-OSu,-#Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-Phe-OH,(-OSu,-Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-Pro-OH, (-OSu,-Su) Nh-Boc, Fmoc-Z, Ddz, OAoc-HGlr-Trp-OH,(-OSu,-Su) Anwendungsbeispiele: Beispiel A Umsetzung von Boc-(Z, Fmoc)-HSc-OH mit C-terminal geschützten Aminosäuren, Peptiden oder anderen Stoffen mit freier Aminogruppe (allgemeine Vorschrift) 11 mMol Boc-(Z, Fmoc)-HSc-OH, 11 mMol l-Hydroxy-benzotriazol und 10 mMol N-terminal freies Peptid oder Aminosäure werden in frisch destilliertem Tetrahydrofuran (bzw. Dichlormethan oder Dimethylformamid) gelöst und bei OOC mit 11 mMol Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Man läßt auf Raumtemperatur kommen und rührt 3-4 Stunden. Durch Zugabe einiger Tropfen Eisessig wird die Reaktion gestoppt. Ausgefallener Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert, das Lösungsmittel eingedampft und der Rückstand in Essigester aufgenommen. Eventuell weiterer ausgefallener Harnstoff wird abgesaugt.
Die Isolierung und Reinigung kann auf zwei Wegen erfolgen: a) Ausschütteln mit 5 % KHCO3- und 5 % KHSO4-Lösung (je 3 x) Neutralwaschen mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung, Essigesterphase über Na2SO4 trocknen und umkristallisieren (z. B. aus Essigester/Petrolether).
b) Säulenchromatographische Reinigung an Kieselgel Si 60 (z. B. mit Chloroform/Methanol (9:1)) oder Sephadex LH-20 (bei polaren und empfindlichen Substanzen), z. B. mit Methanol oder Chloroform/Methanol (1:1) als Elutionsmittel.
Beispiel B Einsatz von Boc-(Z, Fmoc)-HSc-OH in der Festphasen-Peptidsynthese (Merrifield-Methode) Die HSc-OH-Derivate sollten bei der Peptidsynthese an Dolymeren Trägern wegen möglichen Nebenreaktionen nicht als symmetrische Anhydride gekuppelt werden. Es hat sich andererseits folgende Methode bewährt: Bei Anwendung z. B. der N,-Fmoc-Schutzgruppenstrategie wird nach der Fmoc-Abspaltung mittels 50 9s Piperidin in Dimethylformamid, mehrmaligen Waschvorgänqen, Boc- (Fmoc) -HSc-OH und l-Hydroxybenzotr iazol äquimolar (in 6-fachem molarem Überschuß zur Harzbeladung) in den Reaktor qegeben und mit der äquimolaren Menqe Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 3 bis 4 Stunden spült man abwechselnd mehrmals mit Dichlormethan und Dimethylformamid sowie Chloroform/Methanol (1:1; v/v).
Beispiel C Kupplunq von Boc- (Fmoc)-HSc-OH an Amino-Sepharose-4B (Pharmacia) In einer Schüttelente werden 3 g in 12 ml Dimethylformamid gequollener Aminosepharose (Beladung: 10 mol NH2-Gruppen pro Gramm lyophylisiertes Gel bzw. 2,8-3,1 cymol pro Gramm gequollenes Gel) mit 30 mol Boc-(Fmoc)-HSc-OH, 30 pmol l-Hydroxybenzotriazo1 und zuletzt mit 30 pmol Dicyclohexylcarbodiimid oder einem wasserlöslichem Carbodiimid versetzt.
Man läßt 3 Stunden bei Raumtemperatur reagieren und wäscht nach beendeter Reaktion mehrmals mit Dimethylformamid nach.
Aufbewahrung des Gels in 0,01 % NaN3-Lösung bei 4"C. Vor der Schutzqruppenabspaltung (siehe Beispiel D) muß das Gel unter Zusatz von Stabilisatoren (Dextrose, Lactose) gefrierqetrocknet werden.
Beispiel D SchutzqrunDenabspaltung an Boc(Fmoc,Z)-HSc-Derivaten bzw.
Konjugaten Die Boc-Schutzgruppe ist bei allen Derivaten innerhalb von 5-15 Minuten unter Feuchtigkeitsausschluß mit Trifluoressigsäure, Trifluoressigsäure/Dichlormethan (1:1) oder 1.2 N HCl/Eisessig abgespalten. Die Lösung der Säure wird dann auf ein Drittel des Volumens einqeengt und das Produkt mit Ether gefällt. Bei unlöslichen Polymeren (z. B. Polystyrol-Divinylbenzol-Copolymeren, Sepharose) wird einfach abqesaugt und gut mit Dimethylformamid und Dichlormethan im Wechsel nachgewaschen.
Die Benzyloxycarbonyl(Z)-Schutzgruppe läßt sich mittels Pd/Aktivkohle als Katalysator im H2-Durchflußstrom in organischen Lösungsmitteln (Methanol, Essigsäure, Dimethylformamid) abspalten. Die Hydrierdauer beträgt 1-3 Stunden.
Eine hydroqenolytische Abspaltung ist nicht möglich an unlöslichen Polymeren, wohl aber an löslichen Trägern wie z.
B. Polyoxyethylen, das z. B. bei der Polymer-Supported-Liquid-Phase-Peptidsynthese verwendet wird.
Die Fmoc-Schutzgruppe läßt sich leicht innerhalb von 5 Minuten in 50 % Piperidin/Dimethylformamid abspalten.
Länqere Abspaltunqszeiten sind unbedingt zu vermeiden. Nach Entfernung von Piperidin und Dimethylformamid im Vakuum wird sofort durch Zugabe von 1.2 N HCl/Ether oder 1.2 N HCl/Dioxan das Hydraziniumchlorid gebildet.
Beispiel E Umsetzung von N-terminal freien Aminosäuren, Peptiden etc.
mit Bocb Fmoc-, Z-HSc-Gly-OSu Boc-, Z-, Fmoc-HSc-Gly-ONSu reaqiert in ca. 1.2 fachem molaren Überschuß in Lösungsmitteln wie Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran innerhalb von 1 bis 3 Stunden quantitativ mit N-terminal freien Aminosäurederivaten oder Peptiden. Entstehendes N-Hydroxysuccinimid wird entweder aus der organischen Phase mit 5 % KHC03 extrahiert oder über Gelfiltration an Sephadex LH20, z. B. in Chloroform/ Methanol, abgetrennt.
Die Reaktion mit unlöslichen Polymeren (z. B. Merrifield-Harzen, Aminosepharose) wird in 6-10 fachem Überschuß an Boc-, Fmoc-, Z-HSc-Gly-ONSu in Dimethylformamid, Dimethylformamid/Methylenchlorid oder Tetrahydrofuran durchgeführt.
Reaktionszeit 3 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur.
Beispiel F Nh-Tert.Butyloxycarbonyl-hydrazido-N-succinyl-glyCylphenylalanin-tert.butylester (Boc-HSc-Gly-Phe-OBut) 1 g (2,6 mMol) Boc-HSc-Gly-ONSu, 0,53 g (2,07 mMol) Phenylalanin-tert.-butylester-hydrochlorid und 230 1ll (2,07 mMol) N-Methylmorpholin werden in Dimethylformamid bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird vollständig im Vakuum verdampft und 300 mg des öligen Rückstandes an Sephadex LH-20 (2,5 x 90 cm) mit Chloroform/Methanol (1:1) chromatographiert. Man erhält 180 mg farbloses Ö1, welches dünnschichtchromatographisch einheitlich ist.
RF(1) = 0,8; RF(2) = 0,37; RF(5) = 0,15; C24H36N4O7 (492) 13C-NMR (CDC13; = ppm): Sc-CO- 172.2 Sc-CO-N2H2- 172.7 Gly - CO 170.9 Phe - CO 189.0 Poc - CO 155.7 Phe-Aromaten-C-Atome: Phe - C-1,3 129.3 Phe - C-2 128.2 Phe - C-4 126.7 Boc - Cq 81.3 OBu - Cq 82.2 Phe - C 54.0 a Gly - Ca 43.1 Phe - Cß 37.9 Sc-CH2- 31.0 und 29.3 Boc - CH3 28.1 OButCH3 27.8 Beispiel G Nh-N-Benzyloxycarbonyl-hydrazido-Nα-succinyl-glycylt phenylalanin-tert.butylester (Z-HSc-Gly-Phe-OBu Hergestellt analog Beispiel F aus Z-HSc-Gly-OSu und H-Phe-OBut x HC1. Die weitere Reinigung erfolgt über eine Sephadex-LH20-Säule mit Chloroform/Methanol (1:1) als Elutionsmittel.
Ausbeute: 80 % der Theorie, Reinheit: > 98 % (DC); Schmelzpunkt: 600C RF(1) = 0,78; RF(2) = 0,46; RF(3) = 0,89; RF(4) = 0.85.
C27H34N4°7 (526) 13C-NMR (CDC13; = ppm): Sc-CO- 172.4 Sc-CO-N2H2- 172.8 Gly - CO 171.0 Phe - CO 169.0 Aromaten (Z, Phe) Phe - C-1,3 129.4 Z - C-1,3 128.7 Z - C-2 128.4 Phe - C-2 128.3 Z - C-4 128.0 Phe - C-4 126.8 But - Cq 82.4 Benzyl - CH2 67.5 Phe - Cα 54.0 Gly - Ca 43.0 Phe - Cß 37.9 Sc-CH2- 30.8 und 29.2 t Bu - CH3 27.8 Beispiel H Nh-N-Fluoroenylmethoxycarbonyl-hydrzido-Nα-Succinylglycyl-phenyl-alanin-tert.butylester (Fmoc-HSc-Gly-Phe-OBu t) Hergestellt analog Beispiel F aus Fmoc-HSc-Gly-OSu und H-Phe-OBut x HC1. Die weitere Reinigung erfolgt über eine Sephadex LH-20-Säule mit Chloroform/Methanol (1:1).
Ausbeute: 74 % der Theorie; Reinheit: > 96 %; Schmelzpunkt: 1050C; RF(1) = 0,85; RF(2) = 0,9; C34H38N4O7 (614) 13C-NMR (CDCl3) = ppm): Sc-CO- 172.5 Sc-CO-N2H2- 172.8 Phe - CO 169.0 Gly - CO 170.9 Fmoc - CO 156.5 Fmoc-C-Atome (Aromaten): C9a,b 143.5 C4a'b 141.1 C2,7 129.3 C316 128.2 C1 8 125.1 C4 5 119.8 Phe-Aromaten-C-Atome: C-1,3 127.6 C-2 127.0 C-4 126.7 But-Cq 82.1 Fmoc-CH2 67.6 Phe - C 53.9 a Fmoc-CH 46.7 Gly - Ca 42.7 Phe - Cß 37.7 Sc-CH2 31.3 und 29.1 But-CH3 27.8 Beispiel I Poly-L-Lysin (80000) - Succinyl-glycyl-prolyl-alanyl-threonin-Konjugat Polyl-L-(Lys)380-(Sc-Gly-Pro-Ala-Thr-OH)380 HSc-Gly-Pro-Ala-Thr-OH x CF3COOH wird nach Boc- und But-Abspaltung aus Boc-HSc-Gly-Pro-Ala-Thr- )-OBu erhalten, welches analog Beispiel A aus Boc-HSc-OH und H-Gly-Pro-Ala-Thr(But)-OBut mittels Carbodiimidkupplung erhalten wird.
Vorschrift: 122 mg (213 mMol) HSc-Gly-Pro-Ala-Thr-OH x CF3COOH werden in 1 ml Dimethylformamid bei -200C mit 146 µl konz. HCl versetzt. Bei -150C gibt man 244 pl 14 % NaN02-Lösung zu.
Nach 5 Minuten wird auf -250C gekühlt und mit ca. 200 pl N-Ethylpiperidin auf pH 8 gestellt. Nach Zugabe von 20 mg (95 pmol Aminogruppen) Poly-L-Lysin x HBr (MW = 80000) in 1 ml H20, vorher mit 0,1 n Natronlauge auf pH 10,5 eingestellt, wird 24 Stunden bei 40C gerührt. Die Lösung wird aufpH 1-2 eingestellt und 5 Tage gegen 0,1 M HC1 (51) dialysiert (2-maliger Wechsel der Dialyseflüssigkeit pro Tag).
Nach dem Gefriertrocknen erhält man 42 mg wasserlösliches farbloses Konjugat. Die Beladung wurde mit Aminosäurenanalyse bestimmt und entspricht einem Lys/Peptidverhältnis von ca. 1:1.
1 mg Konjugat enthält 0,77 mg Tetrapeptid.
Beispiel J Allgemeine Vorschrift zur Kopplung von Hydrazido-succinyl-(HSc)-Verbindungen an Polymere, z. B. Proteine, Polyaminosäuren etc., mittels Azidkupplung Zu einer Lösung von 0,18 mMol HSc-Konjugat in 1,5 ml Dimethylformamid wird bei -200C 90 iil (1,08 mMol = 6-facher Überschuß) konz. HC1 gegeben. Bei -150C wird nun 133 pl (0,27 mMol = 1.5-facher Überschuß zu HSc-Verbindung) 14 %ige NaNO2-Lösung zugegeben. Nach 5 Minuten senkt man die Badtemperatur auf -250C und stellt mit 1,25 Pl N-Ethylpiperidin auf pH 7-8. Zu dieser Mischung, welche die kopplungsfähige Azidverbindung enthält, gibt man die Aminkomponente (z. B.
Protein, Polyaminosäure, Aminosepharose etc.) in Wasser oder Dimethylformamid zu. Der pH-Wert wird mit 0,1 n Natronlauge zwischen 7.5 und 9.5 eingestellt. (Bei Kopplung an Polylysine ist das Azid je nach gewünschter Beladung in entsprechendem Überschuß, gemäß nachfolgender Tabelle eingesetzt, bei Kopplung an Aminosepharose-4B oder Protein ist es in 10-100-fachem Überschuß einzusetzen).
Nach 24 Stunden bei 40C wird mit 0,1 n Salzsäure auf pH 2 gestellt und bei löslichen Konjugaten 5 Tage gegen 0,1 M Essigsäure dialysiert (2-maliger Wechsel der Dialyseflüssigkeit). Bei unlöslichen Polymer-Konjugaten (z. B. Aminosepharose) wird mit 0,1 M NaHC03/0,5 M NaCl-Puffer (pH 8.6) und Dimethylformamid im Wechsel gewaschen.
TAbelle: Polylysin-Tetrapeptid-Konjugate mit dem Verbrückungsreagenz HSc a b c d e Konjugat Lys/TMV-4 Lys/TMV-4 Beladung Über schuß Prozentanteil (ASA) an TMV-4 an TMV-4 gekopp.Peptid [Poly-Lys(80 000)]380-[TMV-4]380 1:2.2 1:1 100 % 2.2 45 % [Poly-Lys(37 300)]380-[TMV-4]90 1:0.55 1:0.39 50 % 1.42 71 % [Poly-Lys(80 000)]380-[TMV-4]170 1:0.63 1:0.45 45 % 1.36 74 % [Poly-Lys(37 300)]380-[TMV-4]70 1:0.54 1:0.42 38 % 1.28 77 % [Poly-Lys(80 000)]380-[TMV-4]74 1:0.216 1:0.194 19.4 % 1.11 90.1 % [Poly-Lys(80 000)]380-[TMV-4]64 1:0.184 1:0.174 17.4 % 1.05 95.1 % [Poly-Lys(80 000)]380-[TMV-4]32 1:0.088 1:0.084 8.4 % 1.04 96.2 % HSc = Hydrazido-Succinyl; TMV = Tabak-Mosaic-Virus; a) eingesetztes molares Verhältnis von vorhandener Lys- #-aminogruppe zu Tetrapeptidhydrazid.
b) mittels Aminosäureanalyse (ASA) bestimmtes Verhältnis (Fehler # 5 %) von vorhandenem Lys-#-aminogruppen zu Tetrapeptid.
c) prozentuale Beladung der Polylysinaminogruppe d) molarer Überschuß am eingesetzten Peptid bezogen auf tatsächlich erhaltene Beladung.
e) prozentualer Anteil en eingesetztem Peptid, der gekoppelt vorliegt.

Claims

Patentansprüche 1. Neue N-geschützte Dicarbonsäure-monohydrazid-derivate der allgemeinen Formel X - NH - NH - CO - A - CO - B - Y ,(I) in der X einen Schutzrest für eine Aminogruppe, Y eine Hydroxygruppe oder eine in der Peptidchemie übliche Schutz- oder reaktive Austrittsqruppe, A eine qegebenenfalls durch 1 bis 4 AlkylgrupDen mit jeweils 1 bis 3 Kohlenstoffatomen substituierte geradkettige Alkylengruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, wobei in einer geqebenenfalls substituierten n-Propylengruppe die mittlere Methylengrunne durch ein Sauerstoffatom ersetzt sein kann, und B eine Bindung oder einen Aminosäurebaustein, bei dem gegebenenfalls vorhandene weitere funktionelle Gruppen frei oder geschützt sein können, bedeuten.
2. Neue Verbindungen der allqemeinen Formel I gemäß Anspruch 1, in der B wie im Anspruch 1 definiert ist, X eine hydrolytisch oder hydrogenolytisch abspaltbare Schutzgruppe wie die tert.Butyloxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl- oder Fluorenylmethoxycarbonylgruppe, Y die Hydroxyqruppe oder eine Estergruppe wie die Methoxy-, tert.Butoxy- oder Benzyloxygruppe oder eine aktive Estergruppe wie die N-Oxy-succinimid-, Nitrophenyloxy-, l-Imidazolo- oder N-Hydroxy-benzotriazolylgruppe und A eine gegebenenfalls durch eine oder zwei Methylgruppen substituierte geradkettige Alkylengruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine n-Propylengruppe, in der die mittlere Methylengruppe durch ein Sauerstoffatom ersetzt ist, bedeuten.
3. Neue Verbindungen der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 1, in der X wie im Anspruch 1 definiert ist, A eine Ethylen- oder n-Propylengruppe, B eine Bindunq und Y eine Hydroxygruppe oder B einen Aminosäurebaustein, bei dem qeqebenenfalls vorhandene funktionelle Gruppen frei oder geschützt sein können, darstellen und Y die im Anspruch 2 erwähnte Bedeutung besitzt.
4. Neue Verbindungen der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 1 in der X die tert. Butoxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl- oder Fluorenylmethoxycarbonylgrupe, A die Ethylengruppe und B eine Bindung und Y die Hydroxygruppe oder B den Glycinbaustein und Y die Hydroxy-, Benzyloxy-, tert.Butoxy- oder N-Oxy-succinimidgruppe darstellen.
5. Neue Verbindungen der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 1, in der X und A wie in den Ansprüchen 1 bis 4 definiert sind, B eine Bindung und Y eine Hydroxygruppe darstellen.
6. Verbindungen gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 als Kopplungskomponente für Aminogruppen enthaltende Verbindungen.
7. Verwendung der Verbindungen gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 als Kopplungskomponente für niedermolekulare Stoffe an biologisch aktive Proteine, Polyaminosäuren oder Trägerstoffe oder zur Verbindung biologisch aktiver Proteine aneinander und/oder an Trägerstoffe.
8. Verwendung der Verbindungen gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 zur Kopplung von Antigenen und Antikörper an Trägerstoffe,
9. Verwendung der Verbindungen gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 als Kopplungskomponente bei der Affinitätschromatographie.
10. Verfahren zur Herstellung der neuen N-geschützten Dicarbonsäure-monohydrazid-derivate gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß a) zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der Y eine Hydroxygruppe oder eine in der Peptidchemie übliche Esterschutzgruppe darstellt, ein Hydrazid der allgemeinen Formel X - NH - NH2 ,(in) in der X wie in den Ansprüchen 1 bis 5 definiert ist, mit einer gegebenenfalls im Reaktionsgemisch hergestellten Carbonsäure der allgemeinen Formel HOOC - A - CO - B - Y' ,(III) in der A und B wie in den Ansprüchen 1 bis 5 definiert sind und Y' eine in der Peptidchemie übliche Esterschutzgruppe darstellt, oder mit deren reaktionsfähigen Derivaten in einem Lösungsmittel umgesetzt und gegebenenfalls anschließend ein in B verwendeter Schutzrest und/oder der Schutzrest Y' abgespalten wird oder b) zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der B einen Aminosäurebaustein, bei dem gegebenenfalls vorhandene weitere funktionelle Gruppen frei oder geschützt sein können, und Y eine Hydroxygruppe oder eine in der Peptidchemie übliche Schutzgruppe darstellen, eine Verbindung der allgemeinen Formel X - NH - NH - CO - A - COOH ,(IV) in der A und X wie in den Ansprüchen 1 bis 5 definiert sind, oder deren reaktionsfähigen Derivaten mit einer Aminosäure der allgemeinen Formel H - B - , (V) in der B einen Aminosäurebaustein, bei dem gegebenenfalls weitere funktionelle Gruppen frei oder geschützt sein können, und Y" eine in der Peptidchemie übliche Schutzgruppe darstellen, in einem Lösungsmittel umgesetzt und gegebenenfalls anschließend ein in B verwendeter Schutzrest und/oder der verwendete Rest Y" abgespalten wird oder c) zur Herstellung von Verbindunqen der allgemeinen Formel I, in der Y eine in der Peptidchemie übliche reaktive Austrittsgruppe darstellt, eine Verbindung der allgemeinen Formel X - NH - NH - CO - A - CO - B - OH , (VI) in der A, B und X wie in den Ansprüchen 1 bis 5 definiert sind, oder deren reaktionsfähiqe Derivate mit einer Verbindung der allgemeinen Formel H - , (VII) in der Y¹" eine in der Peptidchemie übliche reaktive Austrittsgruppe darstellt, in einem Lösungsmittel umgesetzt wird.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung bei Temperaturen zwischen 0 und 80°C, vorzugsweise jedoch bei Temperaturen zwischen 10 und 50°C, durchgeführt wird.