DE2252157A1 - Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten - Google Patents

Description

FARBWERKE HOECHST AG vormals Heistor Lucius & Brüninß

Aktenzeichen: HOE.72/F 326
Datum: 23. Oktober 1972 Dr. Hg/sti

Verfahren zur Herstellung von Insulin, Insulin-Analogen und -.Derivaten *

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Insulin, Insulin-Analogen und -Derivaten, das.dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel. I

	SX	GIy	SX Γ	-R	CO	Ly s
			SX
	A-Kette
O=C-	B-Xette	SX Γ
Y-

in der X V/asserstoff oder eine S-Schutzgruppe und Y Wasserstoff, einen Alkanoylrest mit Ibis 4 C-Atomen, einen Phenyl-ajkanoy Irrest mit 1 bis 3 C-Atomen im Alkanoylteil, Benzoyl oder einen Alkyl-oxycarbonyl- bzw. Aralky1-oxycarbonyIrest, wobei der Alkylteil 1 bis h C-Atome enthält, einen Amino-acylrest, der sich von den natürlich vorkommenden ⁰C - oder ß-Aminosäuren'oder gegebenenfalls deren D-Enantiomeren ableitet, oder Acyl-aminoacylrest bedeutet und R einen Rest der allgemeinen Formel II

-CH-W-CH-i 1 NH NH I I Ac Ac

II

darstellt, in der Ac eine protonensolvolytisch abspaltbare N-Schutgruppe ist und W für (CH₃J₂ bis (CH₂)^₃ CH₂-S-CH₂, CHp-S-CH-CHp und für deren Sulfone steht, durch Abspaltung von

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Ac und X und dehydrierung in eine Verbindung der allgemeinen Formel III

	. η ι	Ϊ-	B-Kette	pn	Ly s
	It
	γ1 γ
	• A-Kette
	A Q k i I
O=C- I GIy

III

überführt, in der Y die obengenannte Bedeutung besitzt und R' für

-CH-W-CH
NII₀ NH₀

de. '

steht und W die obengenannte Bedeutung besitzt, und aus dieser Verbindung die -CO-R'-CO- Brücke durch Edman-Abbau herausspaltet.

Gegenstand der Erfindung sind ferner Verbindungen der allgemeinen Formeln I und III, in denen R, R¹, X und Y die oben angegebene Bedeutung besitzen.

Die intramolekulare Vernetzung des Insulins über die beiden Aminogruppen ff^A1 und N ^ß29 ist schon aus Z. Makromol, Chem. 26 (1958), Seiten 153 bis 166, bekannt. Mit der Aufklärung der Tertiärstruktur des Insulins wurde der kurze, durch bifunktionelle Reagentien überbrückbare Abstand der beiden Aminogruppen bestätigt. Es gelang seither auch, die beiden Aminogruppen durch eine Succinoyl- bzw. Adipinoylbrücke zu verbinden.

Man erhielt dadurch neue Insulinderivate, die jedoch nicht mehr in Insulin zurückverwandelt werden können.

!Demgegenüber bietet das erfindungsgemäße Verfahren die Möglichkeit, Insulin aus einem solchermaßen intramolekular vernetzten Molekül

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zu regenerieren, da die Brücke -CO-R¹-CO- durch beiderseitigen Edman-Abbau leicht zu eliminieren ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen Insulin-Derivate der allgemeinen Formel III erhalten ihren Wert dadurch, daß sie in guter Ausbeute aus getrennt synthetisierten A- und B-Ketten hergestellt werden können. Sie übernehmen bei der Kombination der beiden Ketten in hoher Verdünnung die Funktion, die bei der Biosynthese des Insulins das C-Peptid hat, nämlich, eine forme!gerechte Kombination herbeizuführen.

Das gelingt zwar nicht in dem Maße und mit derselben Ökonomie, mit der bei der Biosynthese des Insulinsdie beiden Ketten kombiniert werden, doch ist die Ausbeute merklich höher als dies bei den bisherigen Verfahren der Kettenkombination der Fall ist.

Die heute fast ausschließlich angewandte Methode der Kettenkombination nach Scientia Sinica K) (196I), Seite 84, liefert unter günstigen Umständen etwa 10 % Ausbeute. Hiervon können etwa 40 % in kristalliner Form erhalten werden. Gelegentliche Angaben über höhere Ausbeuten waren nie reproduzierbar Die Kombinationsausbeute konnte bisher nur gesteigert werden, wenn die Α-Kette in etwa 5-fächern molarem Überschuß eingesetzt wurde. Diese Reaktionsbedingungen sind aber nicht mehr wirtschaftlich (Advances Anzymology 32 (1970), Seite 455)» und die Ausbeute an kristallisierbarem Material bleibt auch hier noch gering. * - •

Demgegenüber liefert "das erfindungsgemäße Verfahren Ausbeuten von mehr als 25 % bei einem Kettenverhältnis 1:1. Darüber hinaus lassen sich falsch kombinierte Produkte nach Reduktion erneut der Kombination unterwerfen, da hier A- und B-Kette zunächst unverändert über die erfindungsgemäße Brücke miteinander verbunden bleiben.

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit einen auch technisch gangbaren Weg zur Synthese von Insulin dar. Außer Insulin selbst können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch Insulin-Analoga und -Derivate hergefcellt werden. Unter

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Insulin-Ana]oga werden Verbindungen verstanden,· in denen eine oder mehrere Aminosäuren gegen andere, vorzugsweise einfachere Aminosäuren ausgetauscht sind, ferner Insuline mit veränderter, vorzugsweise verkürzter Kettenlänge.

So können, wie bereits aus der Literatur bekannt ist, z.B. in der

Α-Kette GIn⁵ und GIn¹⁵ durch GIu, Ser¹², Tyr¹¹, Asn und Asn^?1

j 0
durch Ala, VaI' durch Leu oder eine andere hydrophobe Aminosäure,

19
ferner Tyr durch Phe ersetzt sein.

In der B-Kette ist der Ersatz von Phe , VaI , Asn , GIn , His ,

O Λ (Λ Ο 7 Oft

Ser , His , Thr und Pro durch einfachere Aminosäuren, vorzugsweise Alanin, möglich. Die Aminosäuren 1 bis 3 und 30 können auch eliminiert se:
durch AIa möglich.

auch eliminiert sein. Selbst der Ersatz von Cys und Cys ist

Als Aminosäure-Derivate gelten Verbindungen, die substituierte funktioneile Gruppen tragen. So kann z.B. dievC-Aminogruppe der B-Kette durch einen Acylrest analog DOS 2 0^2 299 substituiert sein. Dasselbe gilt für die oben definierten Insulin-Analoga.

Voraussetzung ist stets, daß durch Austausch oder Substitution die biologische Wirkung der Insuline nicht oder nicht wesentlich verringert wird.

Die für die bifunktionelle Brücke verwendeten Ausgangsverbindu"hgen

HOOC-R¹-COOH mit R' = -CH-W-CH-

I t

und W = (CH₂)₂ bis (CH₂)^, CH₂-S-CH₂ oder CH₂-S-CH₂-CH₂ sind bekannt. Die Sulfone werden vorteilhaft aus den M-acylierten Verbindungen in bekannter Weise mit H₂O₂ oder z.B. Benzoepersäure hergestellt. Da diese Verbindungen 2 Asymmetriezentren besitzen, treten mehrere Stereoisomere auf, die aber hinsichtlich des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht kritisch sind. Die Kette bleibt beweglich genug.

409819/1099 ^BAD

ί> -

Zur vorübergehenden Maskierung der KH-Gruppen werden A.cylreste Ac verwendet. Ac kann eine in der Peptidchernie gebräuchliche Aminoschutzgruppe sein; bevorzugt verwendet man protonensolvolytisch abspaltbare Reste, bevorzugt den tert.-P3uty loxy carb ony lrest (Boc),

Wenn die B-Kette mit N-terininalem Phenylalanin endet (Y=H), so erhält man im Zuge der Eliminierung der Brücke -CO-R'-C0- durch Edrnan-Abbau (vgl. z.B, Aeta Chem. Scand. (1950), Seiten 283 bis 293) unter gleichzeitiger Abspaltung des N-terminalen Phe Des-Phe¹ -Insulin. Soll Phe erhalten bleiben, so stellt man eine B-Kette her, in der Y für einen Aminoacylrest, z.B. GIy, steht, der beim Edman-Abbau eliminiert wird. Y kann auch ein leicht abspaltbarer Acylrest wie z.B. der Trifluoracetylrest (TPA) sein, der nach beendete Insulinsynthese durch verd. NaOH entfernt wird, ferner ein anderer Acylrest analog DOS 2 0^2 299* der nach der Synthese erhalten bleibt und ein entsprechendes Insulin-Derivat liefert.

Als S-Schutzgruppe X dienen die bereits bekannten Reste wie z.B. der Trityl-, Diphenylmethyl-, Acetamidomethyl- oder Tetrahydro- . pyranyl-rest, ferner Alky!mercaptogruppen wie Äthyl-, Isopropyl- oder tert. Butylmercaptoreste und Aminoäthylcarbamoyl-schutzgruppen analog DOS 1 930. 330, ferner der Äthylcarbamoyl-rest. Auch die Sulfogruppe kann vorübergehend zum Schutz der SH-Gruppen dienen; sie wird bekanntlich durch Einwirkung überschüs-siger Mercaptoverbindungen entfernt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geht man beispielsweise so vor_s daß man ein nach bekannten ,Methoden hergestelltes Insulin-A-Ketten-Sulfonat mit überschüssigem Aktivester, z.B. 4-Nitropheny!ester der nachstehenden Formel umsetzt

NpO-CO-CH-CH₂-S-CH -CH-COONp

NH	NH
I	I
Boc	Boc

Geeignete Lösungsmittel sind Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid. Man fällt das Reaktionsprodukt mit einem organischen Lösungsmittel wie Äther oder Essigester aus und erhält als Zwischenprodukt

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BAD

IJt)O-CO-CH-CH -.S-Cii -Cl!-CO-A-KcttcrioUlfonat NH Nil

Boc Boc

Nun löst r.ian wieder, bevorzugt in Dimethylformamid, Phosphorsäuret ri s-dime thy land d oder· Dirnethy Isulfoxid, und bringt mit einer etv?-n äquimolaren Menge B-Ketten SuIfonat in Anwesenheit von einer für die Neutralisation der sauren Gruppen hinreichenden Menge IJ-Äthylmorpholin oder Triäthylamin bei etwa pH 8 bis 10 und von etwa Äquivalent 1-Hydroxybenzotriazol zur Reaktion. Die c -Arninogruppe in Lys der eingesetzten B-Kette ist frei, die °^ -Aminogruppe von Phe kann z.B. durch einen Boc-Gly-Rest geschützt sein. Die Herstellung einer solchen Kette ist in Beispiel 1 b beschrieben.

Man erhält nach etwa 30 bis 120 Minuten bei Raumtemperatur als Reaktionsprodukt eine schwerlösliche Verbindung der Formel I

mit X = SO ~ R = -CH-CH„-S-CH -CH-3 ' ι 2 2 ι

HH NH

t J

Boc Boc

und Y = Boc-Gly.

Die beschriebene Verknüpfung von A- und B-Ketten kann auch in umgekehrter Reihenfolge vorgenommen v/erden.

Nun spaltet man durch 30 bis 60 Minuten Behandeln mit Trifluoressigsäure die Boc-Gruppen ab, fällt das Reaktionsprodukt mit Äther und nimmt die getrocknete Substanz in soviel V/asser von pH 5 bis 8 auf, daß eine etwa 0.1 bis 0.5-proz. Lösung entsteht. Man versetzt unter Stickstoff bei 0 bis 60°C mit einem 10 bis 200-fachen Überschuß an Thioglycol, extrahiert nach 5 bis 100 Minuten Reaktionszeit bei Raumtemperatur mit Essigester, trennt ab und vertreibt restlichen Essigester mit Stickstoff. Dann stellt man das pH auf etwa 10.6 ein und rührt über Nacht bei 0 bis 20 C im langsamen Luftstrom. Anderntags stellt man mit 1 η HCl auf pH 5.5 und lyophilisiert oder dampft im Vakuum zur Trockene ein.

RAD 409819/1099 ^BAU

Zur Reinigung wird in 1 bis 2n Essigsäure über Sephadex-G 50 '

( K)

oder G 75 in einer Säule von 1 bus 2m Länge chromatographiert. Der "Insulinpeak" (^O %) wird wie folgt weiterverarbeitet, falsch kombiniertes Produkt (ca 30 %) nach Reduktion erneut der Rekombination zugeführt".

Das vernetzte Roh-Insulin der allgemeinen Formel III wird in der ca. 20-fachen Menge 95-proz. Pyridin aufgenommen. Nach Filtration setzt man mit 8 bis 16 Moll. Phenylisothiocyanat während 3 Stunden bei etwa 10 bis 30⁰C um, destilliert das Lösungsmittel teilweise im Vakuum ab, fällt mit Äther und läßt den Niederschlag etwa 2 Stunden mit- der 5 bis 10-fachen Menge Trifluoressigsäure bei etwa 25°C stehen. Das rohe Insulin wird mit Äther ausgefällt, in 1 bis 2n Essigsäure über eine Säule Sephadex G-50 oder G-75 von 1 bis 2m Länge chromatographiert und in üblicher Weise direkt aus der Lösung unter Zusatz von Zn-Ionen bei pH 5.¹I bis 5·5 kristallisiert. Ausbeute an kristallisiertem Material 15 bis 25 % der Theorie (erneut reduziertes, falsch kombiniertes Material nicht eingerechnet).

Das kristallisierte, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Insulin besitzt bei der Bestimmung der biologischen Wirkung durch Messen der Blutzuckersenkung am Kaninchen 23 I.E.7mg. Die Aminosäureanalyse ist korrekt. Es wird anstelle des aus Pankreas gewonnenen Materials zur Behandlung des Diabetes mellitus eingesetzt.

Anstelle der in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Synthesen von A- und B-Ketten mit Hilfe der Pestkörpertechnik können auch die bekannten Methoden der Pragmentkondensation, wie z.B. Carbodiimid-iiethode, gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxy-. succinimid, 1-Hydroxybenzotriazolen, 3"Hydrv_xy-3-oxo-3»^IJ~dihydro-1,2,3-benzotriazin oder der Azid-Methode zur Herstellung der • jeweils als Ausgangsmaterial benützten A- und B-Ketten herangezogen werden.

_BAD

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— ο —

Hinder- In:.;ulin

a) Λ-Kette --S-Tetrasulfonat (Rind)

Die Rinder-Insulin-A-Kette wird analog Iioppe Seyler's Z.Physiol. Chem. 352, (1971), SeJ ten 419 bis 429 nach der Festkörperniethcde, ausgehend von Polystyrolharz mit 1 % Vernetzung, hergestellt. Die erste Aminosäure, Asparagin, wird als Boc-Asn(Mbh)-OH (hergestellt aus H-Asn(iibh)-OH (Chem. Ber. JOj5 (1970), Seiten 2041 bis 2051 mit Boc-azifl) mit den Hydroxygruppen des Harzes in bekannter Weise vereestert.

Alle folgenden Aminosäuren werden als Boc-Aminosäure-4-nitrophenylester eingesetzt. Carboxylgruppen in den Seitenketten liegen als Benzyleiter vor, Hydroxygruppen von Serin und Tyrosin als Benzyläther. Die SH-Gruppe des Cysteins wird durch die S-tert.-Butylmercaptogruppe geschützt (Peptides 1969, North Holland Publishing Comp., Amsterdam 1971, Seite 30).

Jeder Kondensationsschritt wird in Anwesenheit von 1-Hydroxybenzotriazol analog dem Verfahren der älteren Deutschen Patentanmeldung P 22 02 613.7 (HOE 72/P 016) vorgenommen, um Reaktionsgeschwindigkeit und Spezifität zu steigern. .-- _y

Nach beendeter Synthese wird die Α-Kette in bekannter Weise mit Fluorwasserstoff vom Harz abgespalten und durch Sulfitoylse der asymmetrischen Disulfide analog Hoppe Seyler's Z-Physiol.Chem. 3'j2 (1971), Seiten 419 bis 429 in das S-Tetrasulfonat überführt und gereinigt. Das auf diese Weise hergestellte und gereinigte A-Ketten-Sulfonat (Ausbeute der Synthese 65 /»> Ausbeute der Sulfitolyse 28 %) ist von einer aus natürlichem Insulin hergestellten Verbindung elektrophoretisch nicht zu unterscheiden.

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b) N -Boc-Gly-B-Kette-S-disulfonat

Die Rinder-Insulin-B-Kette wird analog Hoppe Seyler's Z.Physiol. Chemie ßjtä (1967), Seite 1355 und ^5_2 (197D₅ Seite 419, nach Merrifield (Biochemistry 3. (1964), Seite 13^5)> ausgehend von .Polystyrolharz mit 1 % Vernetzung, hergestellt. Lysin wird als Boc-Lys(Pht)-ONp eingesetzt₃ alle weiteren Aminosäuren ebenfalls als Boc-Nitrophenyl*ester, weitere Carboxylgruppen in den Seitenketten liegen analog der Vorschrift von Merrifield als Benzylester vor, Hydroxygruppen von Serin und Tyrosin als Benzylather. Die SH-Gruppe des Cysteins wird durch die S-tert.-Butylmercaptogruppe geschützt (Peptides I969, North Holland Publishing Comp.₃ Amsterdam 1971, Seite 30).

Jeder Kondensationsschritt wird in Anwesenheit von 1-Hydroxybenzotriazol analog dem Verfahren der älteren Deutschen Patentanmeldung P 22 02 613.7 (HOE 72/P 016) vorgenommen, um Reaktionsgeschwindigkeit und Spezifität zu steigern»

Nach beendeter Synthese wird die B-Kette in bekannter Weise mit Fluorwasserstoff vom Harz abgespalten. Ausb„ 55 %» bezogen auf die erste Aminosäure AIa . 3,6 g (Im Mol) der noch S-geschützten N -Pht-B-Kett'e wird nun in 100 ml Dimethylformamid mit 370 mg (1.2 m Mol) Boc-Gly-ONp in Anwesenheit von 135 mg 1-Hydroxybenzo- ' triazol während 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt, liach Ab-*- destillieren des Lösungsmittels im Vakuum bis auf ein Restvolumen von 10 ml und Versetzen mit Essigester erhält man 3_S5 g Boc-Gly-

C
S-tert.-butylmercapto-N Pht-B-Kette. Zur Abspaltung der Phthaloylgruppe löst man die Verbindung in 100 ml 80-proz» Phenol und erwärmt nach Zusatz von 4 ml Hydrazinhydrat l6 Stunden auf ^iO C, Dann fällt man mit 1 1 Isopropanol-äther (1 + 5) 3.3 g der von der Phthaloylgruppe befreiten Verbindung aus„ Die Überführung in das Disulfonat erfolgt analog Beispiel 1 a), Ausbeute 3„0 g

c.) Herstellung von Brückenreagentien·

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Di-Boc-L-larithionin

3.5 g L-Lanthionin werden in 30 ml Wasser und 20 ml Dioxan ra.it 7 ml Boc-azid versetzt. Man stellt auf pH 10 ein und hält dieses pH mittels pll-stat während k Stunden bei 'j'} C. Nun extrahiert wan mit Essigester, kühlt auf ca Ί C, säuert mit konzentrierter Citronensäure an und extrahiert mit Essigester. Die Essigesterlösuru;·; wird gewaschen, über Na SO₁ getrocknet und im Vakuum eingedampft. Man löst den Rückstand in heißern Essigester, versetzt mit Petroläther bis zur beginnenden Trübung und kühlt langsam ab. Dabei fallen 2.3 g Bocg-L-Lanthionin aus. Schmp. rt2 bis 1M°C (Zers.)

ß) Di-Boc-L-Lanthionin-bis-^-nitrophenolester

1 g Di-Boc-Verbindung aus Beispiel 1 c) werden mit 0,8 g 4-Nitrophenol in 15 wl Tetrahydrofuran gelöst. Man gibt 1,1 g DCC zu, rührt Ί Stunden bei Raumtemperatur, filtriert ausgefallenen Harnstoff ab und engt das Lösungsmittel im Vakuum ein. Der F'Jckstand wird aus Isopropanol umkristallisiert, Ausbeute 1,2 g Schnp. l6l bis 163°C (Zers.)

J-) Di-Boc-L-Lanthionin-bis-N-hydroxysuccinimidester

Man erhält analog ß) aus 1 g Di-Boc-Aminosäure, 0.6l g N-Hydroxysuccinimid und 1.1 g DCC in Tetrahydrofuran nach Auskochen mit Isopropanol 1.01 g des Di-Aktivesters vom Schmp. I78 bis 179°C (Zers.)

0 ) Di-Boc- o£ »E. -diamino-meso-piinelinsäure-bis-ty-nitropheny!ester

O.95 g Di-Boc- ·£ ,Γ -diamino-meso-pimelinsüure, hergestellt nach Bull. Soc. chim. Prance 19,65 > Seite I8l3j wurden analog ß) mit 0.8g ^-Nitrophenol und 1.1 g DCC in Tetrahydrofuran 1.0 g Di-Aktivester vom Schmp. I60 bis 165 C (Zers.) erhalten.

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ei) Rinder-Insulin

2.8 g des nach a) hergestellten Λ-Ketten tetrasulfonats v/erden in It)O ml 90-proz. Dimethyl formamid unter Zugabe von N-Äthyl-morpholin auf pH 7.5 gebracht und mit 2.0 g des nach c,ß) hergestellten Nitro phonylester gerührt. Nach 20 Stunden wird mit Essigester gefällt. Man erhält 2.7 g Mono-A-Ketten-tetrasulfnat des Di-Boc-Lanthioninmononitrophenylesters (89 %)· Nun nimmt man wieder in 100 ml Dimethylformamid auf gibt 3.0 g des nach Beispiel Ib) hergestellten N^ -Boc-Gly-B-Kettendisulfonats, 120 mg 1-Hydroxybenzotriazol und etwas Triäthylamin (bis pH 9) zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute 5-5 g; Das rohe Reaktionsprodukt wird in 40 ml Trifluoressigsäure aufgenommen. Nach 40 Minuten fällt man mit 400 ml Äther 5·0 g Verbindung der allgemeinen Formel I mit R¹ = -CHp-S-CH - anstelle von R, X = SO " und Y = GIy.

Das Produkt wird in 0.5 Liter Wasser von pH 7·5 aufgenommen. Man setzt 50 ml Thioglykol zu, bewahrt 1 Stunde unter Stickstoff auf, erwärmt noch 1 Stunde auf ca. 40⁰C, kühlt wieder auf ca. 20°C ab und extrahiert zweimal mit je 300 ml Essigester. Der Essigester wird abgetrennt, der,Rest durch einen Stickstoffstrom vertrieben. Dann verdünnt _;man auf 5 Liter und stellt mit 1 η NaOH auf pH 10.6 rührt 18 Stunden im leichten Luftstrom bei 10°C, gibt 1 η HCl bis pH 5-5 zu und lypholisiert.

Der Rückstand wird in 50 ml 10-proz. Essigsäure gelöst und über eine Säule 4 χ 100 cm Sephadex G-75j fine, chromatographiert. Die Säule ist mit Insulin geeicht. Nach einem Vorpeak (1.6 g) erscheint der Insulinpeak (2.7 g). Der Vorpeak wird nach J. Am. Chem. Soc. 9.3 (197D, Seite 3080 mit 1,4-Dithiothreitol in fluss. Ammoniak reduziert und in 1.5 Liter Wasser .vie oben bei pH 10.6 oxydiert.

Die nach Chromatographie erhaltenen 2.6 g vernetztes Rohinsulin werden in 60 ml 95-proz. Pyridin 3 Stunden bei 26°C mit 0,7 ml Phenylsenföl gerührt. Das Pyridin wird auf 10 ml eingeengt. Durch Zusatz von Äther fallen 2.¹J g Pheny" thiocarb amoy !verbindung aus.

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RAD ORJGiNAL

1? -

Sie wird nach Trocknen 2 stunden in 20 ml Ti^fluoroosip^auro ]>(■·'} 25°C aufbewahrt. Man fällt mit 200 ml Äther 2.2 g Koh-IncuUn au.". Nach erneuter Reinigung durch Chromatographie über Seph?-;dex CJ-75 wie oben-erhält man eine Insulinfraktion, die in üblicher Weise nach Zugabe von ZnCl„ und Einstellen des pH auf 5.'-I amorph ausfüllt., aber im Verlauf von 1 bis 2 Tagen kristallin wird. -4an scnüeudert vorsichtig von nichtkristallisiertem Material ab, wiederholt die Kristallisation und erhält 1.15 g (19 %, bezogen auf e ingest? ta te Ä-Kette) mit 23 bis 2*4 I.E./mg.

Beispiel 2

Desr-(Phe-Val)^B1"²-de3-Ala^B3O-/lla^A12>i;4>l8'²i7 Insulin (Schwein)

a) Ala^{12> >l8>21}-Insulin-A-Kette-S-tetrasulfonat (Schwein)

Man stellt analog Beispiel 1 a) nach der Festkörpermethode die Schweine-Insulin-A-Kette her, wobei als erste Aminosäure (A21) Boc-Ala-OH mit den Hydroxygruppen des Harzes verestert wird. In den Positionen 18, I^ und 12 werden Boc-Ala ONp anstelle der in der natürlichen Kette hier stehenden Aminosäuren eingeführt. Der weitere Synthesegang und Aufarbeitung folgt Beispiel la). Ausbeute der Synthese 69 %> der Sulfitolyse 3¹* %·

b) N -Boc-des-Phe^B1-des-Ala^B'⁵⁰-Insulin-B-Kette-3-disulfonat (Schwein)

Die Rinder-Insulin-B-Kette wird analog Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chemie 3_M (1967), Seite 1355 und 352 (197D, Seite 419, nach Merrifield (Biochemistry 3_ (196¹I), Seite 1385), ausgehend von Polystyrolhar?; mit 1 % Vernetzung, hergestellt. Lysin wird als Boc-Lys(Pht)-ONp eingesetzt, alle weiteren Aminosäuren ebenfalls als Boc-Nitrophenylester, weitere Carboxylgruppen in den Seitenketten lagen analog der Vorschrift von Merrifield als Benzylester vor, Hydroxygruppen von Serin und Tyrosin als Benzylather. Die SH-Gruppe des Cysteins wurde durch die S-tert.-ButyImercartogrunne geschützt (Peptides I969, North Holland Publishing Comp., Amsterdam I97I, Seite 30). Die Synthese endet mit Boc-Val-0Np^^B2^.

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BAD ORIGINAL

Joder Kondensationsschritt v:ird in Anwesenheit von 1-Hydroxy-benzotriazol analog dem Verfahren der Deutschen Patentanmeldung P 22 02 613.7 (HOE 72/F OI6) vorgenommen, um Reaktionsgeschwindigkeit und opezifität zu steigern.

Nach beendeter Reaktion spaltet man die B-Kette in bekannter Weise" mit Fluorwasserstoff vom Harz ab. Ausbeute 55 %> bezogen auf die erste Aminosäure AIa . ■

3,6 g (1 m Mol) der noch S-geschützten N -Pht-B-Kette wird· nun in 100 ml Dimethylformamid mit 300 mg (1.2 m Mol) Boc-ONp in Anwesenheit von 135 mg 1-Hydroxybenzotriazol während'1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum bis auf ein Restvolumen von 10 ml und Versetzen mit Essigester erhält man 3·5 g der entsprechenden Boc-S-tert.-butylmercapto-N* -Pht-B-Kette.

Zur Abspaltung der Phthaloylgruppe löst man die Verbindung in 100 ml 80-proz. Phenol und erwärmt nach Zusatz von 4 ml Hydrazinhydrat 16 Stunden auf 40°C. Dann fällt man mit 1 Liter Isopropanoläther (1 + 5) 3.3 g der von der Phthaloylgruppe befreiten Verbindung aus. Die überführung ins Disulfonat erfolgt, analog Beispiel la). Ausbeute 3,1 g.

c) Des-(Phe-Val)^B1"²-des-Ala^B3O-/Ala^{A12>:Lilil8i2}i7-Insulin (Schwein).

2.8 g des nach a) hergestellten A-Ketten-tetrasulfonats werden in 100 ml 90-proz. Dimethylformamid unter Zugabe von N-Äthylmorpholin auf pH 7,5 gebracht und mit 2 g des nach lcß) hergestellten Nitrophenylesters gerührt. Nach 20 Stunden wird mit Essigester gefällt. Man erhält. 2.4 g Mono-A-Ketten-tetrasulfonat des Di-Boc-Lanthionin-mononitrophenylesters (80 %). Nun nimmt man wider in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 2.9 g des nach Beispiel 2b) hergestellten B-Kettendisulfonats, 120 mg 1-Hydroxybenzotriazol und etwas Triäthylamin (bis pH 9) zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute 5,0 g. Das rohe Reaktionsprodukt wird in 40 ml Trifluor-essigsäure aufgenommen. Nach 40 Minuten fällt man mit 400 ml Äther.·4.9 g Verbindung der

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allgemeinen Formel 1 mit R' = -CH-CH„-S-CIi„-CH-

f ' 2 2 ι

Nil- NH-

ti er.

anstelle von R, X = SO , Y = Ji und um B und B^ verkürzter B-Kette

Das Produkt wird in 0,5 Liter Wasser von pH 7>5 aufgenommen. Man setzt" 50 ml Thioglykol zu, bewahrt 1 Stunde unter Stickstoff auf, erwärmt noch 1 Stunde auf ca. ^;l0°C, kühlt wieder auf ca. 20°C ab, und extrahiert zweimal mit je 300 ml Essigester. Der Essigester wird abgetrennt, der Rest durch einen Stickstoffstrom vertrieben. Dann verdünnt man auf 5 Liter und stellt mit 1 η HaOH auf pH 10,6 rührt 18 Stunden im leichten Luftstrom bei 10^oC, gibt In HCl bis pH 5-5 zu und lyophilisiert.

Der Rückstand wird in 50 ml 10-proz, Essigsäure gelöst und über eine Säule k χ 100 cm Sephadex G-7 5j i'ine, chromatographiert. Die Säule ist mit Insulin geeicht. Nach einem Vorpeak (1.4 g, erscheint der Insulinpeak (2.4 g) Der Vorpeak wird nach J.An; Chem. Soc. 9_3 (1971), Seite 3O8O mit Dithiothreitol in flüssigem Ammoniak reduziert und in 1.5 Liter Wasser wie oben bei pH 10.6 oxydiert.

Die nach Chromatographie erhaltenen 2.4 g vernetztes Rohinsulinderivat werden in 60 ml 95-proz. Pyridin 3 Stunden bei 26°C mit 0.7 ml Phenylsenföl gerührt. Das Pyridin wird auf 10-ml eingeengt. Durch Zusatz von Äther fallen 2.4 g Phenylthiocarbamoylverbindung aus. Diese wird nach Trocknen 2 Stunden in 20 ml Trifluoressigsäure bei 25°C aufbewahrt. Man fällt mit 200 ml Äther 2.0 g Roh-"Insulin" aus. Nach erneuter Reinigung durch Chromatographie über Sephadex G-75 wie oben erhält man eine "Insulin"-fraktion von 1.4 g (17 %), bezogen auf eingesetzte A-Kette mit ca. 20 I.E./mg.

Beispiel 3

D i

Des-Pheny!alanin -Insulin (Rind)

a) A-Kette-S-tetrasulfonat (Rind)

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Die Verbindung -vn rd analog Z. Naturforschung 2{[h. (19f>9) > Seiten 1127 bis 1139₉ ι:ΐϊ ^t, den in Hoppe Seyler's Z.Phyaiol. Chen·. 352 (1971) j Seite 2, beschriebenen Verbesserungen hergestellt. Die Abspaltung der .Schutzgruppen, auch der S-Trity!gruppen _} erfolgt durch Lösen des Peptids in Trifluoressigsäure und Eingießen in Wasser nach 1 Stunde. Mach Filtration und Extraktion mit Äther wird gefriergetrocknet und analog Z. Naturforschung 2JVo_ (1969), Seite II38 ins S-Tetrasulfonat überführt.

<t ·

b) N -Boc-B-Kette-S-disulfonat (Rind)

Synthese der B-Kette erfolgt nach Beispiel Ib).

Nach beendeter Synthese spaltet man die B-Kette in bekannter Weise mit Flurowasserstoff vom Harz ab. Ausbeute 55 %> bezogen auf die erste Aminosäure AIa . 3,6 g (1 m Mol) der noch S-geschützten N^ -Pht-B-Kette wird nun in 100 ml Dimethylformamid 'mit 300 mg (1.2 m Mol) Boc-ONp in-Anwesenheit von 135 ^g 1-Hydroxybenzotriazol während 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum bis auf ein Restvolumen von 10 ml und Versetzen mit Essigester erhält man 3,5 g N -Boc-S-tert.-butyl-

mercapto-N -Pht-B-Kette.

Zur Abspaltung der Phthaloy!gruppe löst man die Verbindung in 100 ml 80-proz. Phenol und erwärmt nach Zusatz von 4 ml „Hydrazinhydrat 16 Stunden auf ^0⁰C. Dann fällt man mit 1 Liter.Isopropanol/ Äther (1 + 5) 3.3 g der von der Phthaloylgruppe befreiten Verbindung aus: Überführung ins Disulfonat analog Beispiel la). Ausbeute 3.0 g.

c) Des-Phe ^Insulin (Rind)

2.8 g des nach a) hergestellten A-Ketten-tetrasulfonats werden in 100 ml 90-proz. Dimethylformamid unter Zugabe von N-Äthylmorpholin auf pH 7,5 gebracht und mit 2 g des nach Beispiel Ic o) hergestellten Nitrophenylesters gerührt. Nach 20 Stunden wird mit Essigoster gefällt. Man erhält 2,65 g Mono-A-Ketten-tetrasulfonat des Di-BoC-⁰^₁ Σ -diamino-meso-pimelinsäure-mononitrophenylesters

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Nun nimmt riian wider in 1.00 ml Dimethylformamid auf, gibt 3.0 g doy nach Beispiel 1 b) hergestellten W '-Boc-B-Kettendiruilfonats, 120 mg 1 - Hy d ro xy b e nzot r i a ζ öl un d w e n'i g Ti¹ i a t hy 1 ami η (bis pll 9 ) zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute 5·5 G- Das rohe Reaktionsprodukt wird in 'ΊΟ ml Trifluoressigsäure aufgenommen. Wach 40 Minuten fällt nan mit ¹IOO ml Äther 5.0 g Verbindung der allgemeinen Formel I mit R' = (CH-(CH₂) -CH-)

anstelle von R, X = SO ~ und Y = H.

Das Produkt wird in 0,5 Liter Wasser von pH 7.5 aufgenommen. Man setzt 5.0 ml Thioglykol zu, bewahrt 1 Stunde unter Stickstoff auf, erwärmt noch 1 Stunde auf ca. 40°C, kühlt wieder auf ca. 20⁰C ab und extrahiert zweimal mit je 300 ml Essigester. Der Essigester wird abgetrennt, der Rest durch einen Stickstoffstrom vertrieben. Dann verdünnt man auf 5 Liter und stellt mit 1 η NaOH auf pH 10.6, rührt 18 Stunden im leichten Luftstrom bei 10 C, gibt 1 η HCl bis pH 5-5 zu und lyophilisiert.

Der Rückstand wird in 50 ml 10-proz. Essigsäure gelöst und über eine Säule 4 χ 100 cm Sephadex G-75» fine, chromatographiert. Die Säule ist mit Insulin geeicht. Nach einem Vorpeak {1.4 g) erscheint der Insulinpeak (2.5 g). Der Vorpeak wird nach J.Am.Chem. Soc. 9j5 (1971), Seite 3Ο8Ο mit Dithiothreitol in flüssigem Ammoniak reduziert und in 1,5 Liter Wasser wie oben bei pH 10.6 oxydiert. Die nach Chromatographie erhaltenen 2.5 g vernetztes Rohinsulin werden in 60 ml 95-proz. Pyridin 3 Stunden bei 26 C mit 0.7 ml Phenylsenföl gerührt. Das Pyridin wird auf 10 ml eingeengt. Durch Zusatz von Äther fallen 2.4 g Phenylthiocarbamoylverbindung aus. Sie wird nach Trocknen 2 Std. in 20 ml Trifluoressigsäure bei 25 C aufbewahrt. Man fällt mit 200 ml Äther 2.2 g Roh-"Insulin" aus. Nach erneuter Reinigung durch Chromatographie über Sephadex G-75 wie oben erhält man eine Insulinfraktion, die in üblicher Weise nach Zugabe von ZnCl₂ und Einstellen des pH auf 5.¹I amorph ausfällt, aber im Verlauf von 1 bis 2 Tagen kristallin wird. Man schleudert vorsichtig von nichtkristallisiertem Material ab, wiederholt die

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Kristallisation und erhält 1.21 g Des-Phe^B1-Insulin (Rind) (20.55, auf eingesetzte Α-Kette) mit 23 bis 2h I.E./mg.

Heispiel h

B1- Λ ce ty 1- Ins Uli η (S chwei η)

a) A-Kette-S-tetrasulfonat (Schwein)

Die Herstellung erfolgt analog Beispiel la) unter Berücksichtigung des Aminosäuresequenz der Schweine-Insulin-A-Kette. Ausbeute der Synthese 68 %, der Sulfitolyse 32 %. ' .

bO Bl-Acetyl-B-Kette-S-disulfonat

analog
Die Synthese der Kette erfolgt Beispiel Ib), man setzt jedoch

Lys als Z-(Cl)
Boc-Lys-ONp
und Phe als N-Acetyl-Phe-ONp ein.

Nach beendeter Synthese spaltet man die B-Kette in bekannter Weise mit Fluorwasserstoff vom Harz ab. Ausbeute 59 %» bezogen auf die erste Aminosäure Ala ^ . Die überführung ins Disulfonat erfolgt analog Beispiel la).

c) Bl-Acetyl-Insulin (Schwein)

2.8 g des nach a) hergestellten A-Ketten-tetrasulfonats werden in 100 ml 90-proz. Dimethylformamid unter Zugabe von N-Äthylmorpholin auf pH 7.5 gebracht und mit 2.h g des nach lcß) hergestellten Nitrophenylesters gerührt. Nach 20 Stunden wird mit Essigester gefällt. Man erhält 2,65 g Mono-A-Ketten-tetrasulfonat des Di-Boc-Lanthionin-mononitrophenylesters. Nun nimmt man wieder in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 3.0 g des. nach b) hergestellten N-Acetyl-B-Ketten-disulfonats, 120 mg l-Hydroxybenzotriasol und wenig Triäthylamin (bis pH 9) zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute'5.38 g. Das rohe Reaktionsprodukt wird in *J0 ml Trifluoressigsäure aufgenommen.

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Nach 'IO Minuten HtIIt man mit ^00 ml Äther 5.06 g Verbindung der allgemeinen Formel I r.rit R*

(-CiI-CJI₀-S-CH_n-CiI-)
I 2 2 T

anstelle von R, X = SO " und Y = Acetyl.

Da» Produkt wird in 0.5 Liter Wasser von pH 7.5 aufgenommen. Man setzt 50 ml Thioglykol zu, bewahrt 1 Stunde unter Stickstoff auf, erwärmt noch 1 Stunde auf ca. 'K)⁰C, kühlt wieder auf ca. 20⁰C ab und extrahiert zweimal mit je 300 ml Essigester. Der Essigester wird abgetrennt, der Rest durch einen Stickstoffstrom vertrieben. Dann verdünnt man auf 5 Liter und stellt mit 1 η NaOH auf pH 10,6, rührt l8 Stunden im leichten Luftstrom bei 10°C, gibt 1 η HCl bis pH 5.5 zu und lyophilisiert.

Der Rückstand wird in 50 ml 10-proz. Essigsäure gelöet und über eine Säule *J χ 100 cm Sephadex G-75> fine, chromatographiert. Die Säule ist mit Insulin geeicht. Nach einem Vorpeak (1.55 g) erscheint der Insulinpeak (2.75 ß). Der Vorpeak wird nach J.Ärcer. Chem. Soc. 93 (197D, Seite 3O8O mit Dithiothreitol in flüssigem

ι ——

Ammoniak reduziert und in 1.5 Liter Wasser wie oben bei pH 10.6 oxydiert.

Die nach Chromatographie erhaltenen 2.7 g vernetztes Rohinsulin werden in 60 ml 95-proz. Pyridin 3 Stunden bei 26 C mit,0.7 ml' Phenylsenföl gerührt. Das Pyridin wird auf 10 ml eingeengt. Durch Zusatz von Äther fallen 2.k g Phenylthiocarbamoylverbindung aus. Sie wird nach Trocknen 2 Stunden in 20 ml Trifluoressigsäure bei 25°C aufbewahrt. Man fällt mit 200 ml Äther 2.2 g Ron-Insulin aus. Nach erneuter Reinigung durch Chromatographie über Sephadex G-75 wie oben erhält man eine Insulinfraktion, die in üblicher Weise nach Zugabe von ZnCl„ und Einstellen des pH auf 5·Ί amorph ausfällt, aber im Verlauf von einigen Tagen kristallin wird. Man schleudert vorsichtig von nichtkristallisiertem !aterial ab, wiederholt die Kristallisation und erhält 1.1 ¹\ g (19 %), bezogen auf eingesetzte Α-Kette mit 22 bis 24 I.E./mg.

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Beispiel 5 .

Human- Insulin

a) A-Kette-S-tetrasulfonat (human)

Herstellung analog den Beispielen 1 a und H a. Ausbeute der Synthese 55 %, der Sulfitolyse 33 %.

b) N -Boc-Gly-B-Kette-S-disulfonat (human)

Synthese analog Beispiel 1 b). Als erste Aminosäure wird jedoch Boc-Thr-OH mit den Hydroxygruppen des Harzes verestert. Ausbeute 62 55. ·

Nach beendeter Reaktion spaltet man die B-Kette in bekannter Weise mit Pluorviasserstoff vom Harz ab. Ausbeute 58 %_t bezogen auf die erste Aminosäure Thr . 3.6 g (1 m Mol) der noch S-gescnützten N -Pht-B-Kette wurde nun in 100 ml Dimethylformamid mit 370 mg (1.2 m Mol) Boc-Gly-ONp in Anwesenheit von 135 mg 1-Hydroxybenzotriazol während 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum bis auf ein Restvolumen von 10 ml und Versetzen mit Essigester erhält man 3>5 g Boc-Gly-S-tert.-butylmercapto-N -Pht-B-Kette.

Zur Abspaltung der Phthaloylgruppe löste man die Verbindung in_. 100 ml 80-proz. Phenol und erwärmt nach Zusatz von M,ml Hydrazinhydrat 16 Stunden auf ^0°C. Dann fällt man mit 1 Liter Isopropanol/ Äther (1 + 5) 3.3 g der von der Phthaloylgruppe befreiten Verbindung aus: überführung ins Disulfonat analog Beispiel 1 a) Ausbeute 3.0 g

c) Human-Insuliη

2.8 g des nach a) hergesteilen A-Ketten-tetrasulfonats werden in 100 ml 90-proz. Dimethylformamid unter Zugabe von N-Äthylmorpholin auf pH 7.5 gebracht und mit 2.8 g des nach Beispiel 1 cÄ) hergestellen Nitropheny!esters gerührt. Nach 20 Stunden wird mit Essigester gefällt. Man erhält 2.63 g Mono-A-Ketten-tetrasulfonat des Di-Boc-Lanthionin-mononitropheny!esters. Nun nimmt man

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wieder in 100 ml Dimethylformamid auf ;.»:ibt 3.0 g dos nach i-.ss.ir> nie."} Ib) hergestullon N -Hoc-Gly-JJ-Ketten-disulfonata, 120 mg 1-Hydroxvbenzotriazol und etwas Triäthy lainiri (bis pH 9) zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute '3,^3 g. Das rohe Reaktionsprodukt wird in ^J10 ml Trifluoressigsuure aufgenommen. Nach ^)O Minuten fällt man mit ¹IOO ml Äther 5.0 c "Verbindung der allgemeinen Formel I mit R' = (-CH-CH₂-S-CH₂-CH-)

NH₂ " NH₂
anstelle von R, X =■■ SO und Y = GIy.

Das Produkt wird in 0.5 Liter V/asser von pH 7.5 aufgenommen. Man setzt 50 ml Thioglykol zu, bewahrt 1 Stunde unter Stickstoff auf, erwärmt noch 1 Stunde auf ca. ^li0 C, kühlt wieder auf ca. 20⁰C ab und extrahiert zweimal mit je 300 ml Essigester. Der Essigester wird abgetrennt, der Rest durch einen Stickstoffstrom vertrieben. Dann verdünnt man auf 5 Liter und stellt mit 1 η NaOH auf pH 10.6, rührt 18 Stunden im leichten Luftstrom bei 10⁰C, gibt 1 η HCl bis pH 5·5 zu und lyophilisiert.

Der Rückstand wird in 50 ml 10-proz. Essigsäure gelöst und über eine Säule 4 χ 100 cm Sephadex G-75> fine, chromatographiert. Die Säule ist mit Insulin geeicht. Nach einem Vorpeak (1.53 g) erscheint der Insulinpeak (2.62 g) nach Eindampfen im Vakuum. Der Vorpeak wird nach J. Amer. Chem. Soc. 9J5 (1971), Seife 3080 mit Dithiothreitol in flüssigem Ammoniak reduziert und in 1.5 Liter Wasser wie oben bei pH 10.6 oxydiert.

Die nach Chromatographie erhaltenen 2.6 g Rohinsulin-Derivat werden in 60 ml 95-proz. Pyridin 3 Std. bei 26⁰C mit 0.7 ml Phenylsenföl gerührt. Das Pyridin wird auf 10 ml eingeengt. Durch Zusatz von Äther fallen 2.5 g Phenylthiocarbamoylverbindung aus. Sie wird nach Trocknen 2 Stunden in 20 ml Trifluoressigsäure bei 25°C aufbewahrt. Man fällt mit 200 ml Äther 2.2 g Ron-Insulin aus. Nach erneuter Reinigung durch Chromatographie über Sephadex G-75 wie oben erhält man eine Insulinfraktion, die in üblicher Weise nach Zugabe von ZnCl„ und Einstellen des pH auf 5·'' amorph ausfällt, aber im Verlauf von 1 bis 2 Tagen kristallin wird. Man schleudert

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vorsichtig von nichtkriatallisiertejTi Material ab, wiederholt die Kristallisation und eiiri.lt 1.28 g (2I₅ ¹J %) bezogen auf eingesetzte Λ-Kette mit 23 bis 2^JI I.E. /mg.

Beispiel 6 · ·

Bl-Acety1-Human-Insulin

a) S-Tetra-tert.-butylmercapto-A—Kette (human)

Herstellung der geschützten Α-Kette analog Beispiel la). Die S-Schutzgruppen v/erden jedoch nicht abgespalten. Ausbeute 62 %,

b) N-Acetyl-S-di-tert.-butylmercapto-B-Kette (human)

Herstellung der B-Kette analog Beispiel Hb) unter Berücksichtigung der Aminosäuresequenz wie bei Beispiel 5b). Die Überführung ins Sulfonat entfällt (Ausbeute 6Ά %).

c) Bl-Acetyl~Huinan-Insulin

2.7 g des nach a) hergestellten A-Ketten-d'erivats v/erden in 100 ml 90-proz. Dimethylformamid unter Zugabe von N-Äthylmorpholin auf pH 7.5 gebracht und mit 1.8 g des nach Beispiel 1 cß) hergestellten Nitrophenylesters gerührt. Nach 20 Stunden wird mit Essigester gefällt. Man erhält 2.6 g Mono-A-Ketten-tetrasulfonat des Di-Boc-Lanthionin-mononitrophenylesters. Nun nimmt man wieder in 100 ml' Dimethylformamid auf, gibt 2.9 g des nach b) hergestellten N Acetyl-B-Ketten-derivats, 120 mg 1-Hydroxybenzotriazol und etwas Triäthylamin (bis pH 9) zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute 5AO g. Das rohe Reaktionsprodukt wird in kO ml Trifluoressigsäure aufgenommen. Nach ^O Minuten fällt man mit 400 ml Äther 5·Ό g Verbindung der allgemeinen Formel I mit R¹ = -CH-CH-S-CH-CII-

I 2 2 /

NH₂ NH₂

anstelle von R, X = S-tert.-Buty!mercapto .und Y = Acetyl.

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Das Produkt wird analog J. Amer. Chem. Son. 9J> (197U, .Seite 30ß0, in 1 Liter flüssigem Ammoniak gelöst. Man ,",Ibt 15 L> Ditniothreitol zu und rührt 1 Stunde bei -33 C. Dann wird Ai;:Moniak verdampft, der Rückstand mit Essigester extrahiert. Nun löst man ein:¹ Rückstand in 5 Liter V/a:3scr und stellt mit 1 η NaOH auf pH 10.6, rührt l8 Stunden im leichten Luftstrom bei 10 C₃ gibt 1 η HCl bis pH 5. zu und lyophilisiert.

Der Rückstand wird in 50 ml 10-proz. Essigsäure gelöst und über eine Säule 4 χ 100 cm Sephadex G-75> fine, chror.atographiert. Die Säule ist mit Insulin geeicht. Mach einem Vorpeak (1.28 g) erscheint der Insulinpeak (2.81 g). Der Vorpeak wird viie oben mit Dithiothreitol in flüssigem Ammoniak reduziert und in 1.5 Liter Wasser bei pH 10.6 oxydiert.

Die nach Chromatographie erhaltenen 2.8l g Rohinsulin-Derivat werden in 60 ml 95 Proz. Pyridin 3 Stunden bei 26⁰C mit 0.7 ml Phenylsenföl gerührt. Das Pyridin wird auf 10 ml eingeengt. Durch Zusatz von Äther fallen 2.4 g Phenylthiocarbamoylverbindung aus. Sie wird nach Trocknen 2 Stunden in 20 ml Trifluoressigsäure bei 25°C aufbewahrt. .Man fällt mit 200 ml Äther 2.2 g Rohinsulin aus. Nach erneuter Reinigung durch Chromatographie über Sephadex G-75 wie oben erhält man eine Insulinfraktion, die in üblicher Weise nach Zugabe von ZnCl und Einstellen des pH auf 5·^ amorph 'ausfällt, aber im Verlauf von 1 bis 2 Tagen kristallin wird. Man schleudert vorsichtig von nichtkristallisiertem Material ab, wiederholt die Kristallisation und erhält 1.31 g (22 %), bezogen auf eingesetzte Α-Kette, Bl-Acetyl-Human-Insulin mit 23 bis 2*1 I.E./mg.

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Claims (3)

Patent?!: !Sprüche

1. Vorfahren zur- Herstellung von Insulin, Insulin-Analogen und -Derivaten, dadurch gekennzeichnet, daß r,:an eine Verbindung der allgemeinen Formel I

-R-

-CO-

SX

GIy Α-Kette

ST

SX

-ys

B-Kette

in der X Wasserstoff oder eine S-Schutzgruppe und Y Wasserstoff, einen Alkanoylrest mit 1 bis H C-Atomen, einen Phenyl-alkanoylrest mit 1 bis 3 C-Atomen im Alkanoylteil, Benzoyl oder einen Alkyl-oxycarbonyl- bzw. Aralky 1-oxycarb'onylrest, wobei der Alkylteil 1 bis H C-Atome enthält, einen Amino-acylrest, der sich von den natürlich vorkommendenoc - oder. ß-Aminosäuren oder gegebenenfalls deren D-Enantiomeren ableitet,-oder Acyl-aminoacylrest bedeutet und R einen Rest der allgemeinen Formel II

H-W-CH-I

NH NH

II

Ac

Ac

darstellt, in der Ac eine protonensolvolytisch abspaltbare N-Schutzgruppe ist und W für (CH₂)₂ bis (CH^, CH₂-S-CH₃, CH₂-S-CH₂-CH₂ und für deren Sulfone steht, durch Abspaltung von Ac und X und Dehydrierung in eine'Verbindung der allgemeinen Formel ΪΙΙ

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2 H --

-R¹

y s

G-Iy

Λ-Kette

B-Kette

III

überführt, in der Y die obengenannte Bedeutung besitzt und R¹ für

-CH-W-CH
NH

steht und W die obengenannte Bedeutung besitzt, und aus dieser Verbindung die -CO-R'-CO- Brücke durch Edman-Abbau herausspaltet.

2. Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der R, X und Y die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben.

3. Verbindungen der allgemeinen Formel III, in der R', X und Y die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben. .

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