JP4016104B2 - 新規セレニルリンカー及びその用途 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なセレニルリンカー、並びに該リンカーを用いたデヒドロアミノ酸及びデヒドロペプチドの製造方法に関する。また本発明は、上記リンカーを用いた二重結合を有する化合物の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
デヒドロペプチド類は、αβ間に二重結合を有するアミノ酸を構成要素として含む異常ペプチドの総称である。デヒドロペプチドは、ペプチド結合と二重結合に共役した剛直かつ反応性の高いπ電子系を有する、最も簡単なペプチドのアナログである。構造化学的には、高い平面性に由来するβターン構造の誘導因子として知られており、長鎖のペプチドの配座を固定する性質がある。また有機化学的には強く分極したαβ不飽和アミドであり、生体内のアミノ基・チオール基などに対する高い反応性を有している。一方、合成化学的見地からはアシル化されたエナミンであり、酸及びアルカリに対して不安定である。
【０００３】
デヒドロペプチドは生理活性天然物として数多く見出されている。こうした天然物では、植物毒性・抗腫瘍性・抗カビ活性など多彩な生理活性が認められているが、これは前述の化学的性質に由来するものと考えられる。例えば、このような化合物としては、ＡＭ−ｔｏｘｉｎ、ｋａｈａｌａｌｉｄｅ Ｆ及びＳｃｈ２０５６１が知られている。なおこれら天然物は、リン酸化又はグリコシル化されたセリンないしトレオニンから生合成されると考えられている。
【０００４】
このように多彩な生理活性を有するデヒドロペプチドは、その反応性の高さ故に有機合成化学的に調製することは困難とされてきた。これは、通常のペプチド固相合成法で用いる酸や塩基による脱保護条件に対しデヒドロアミノ酸が不安定であるために、最終段階での二重結合の導入が要求されることや、前駆体においてすらも不安定であって種々の化学処理に制約を受けるためである。
【０００５】
上記の問題を解決するため、デヒドロペプチドの１種であるＡＭ−ｔｏｘｉｎを合成するためのリンカーが開発されている（非特許文献１参照）。このリンカーを用いることにより、Ｃ末端におけるペプチド鎖の伸長を行い、環状デヒドロペプチドを合成することが可能である。しかしこの方法では、ニトロ基からカルボキシル基を誘導するのに複数のステップが必要であり、またカルボキシル基の活性化時に副反応して環状イミドが形成されることもあり、簡便性及び効率の点でさらに改良の余地がある。
以上のように、当該技術分野では、デヒドロペプチドなどの不安定な物質を簡便かつ高効率に合成するための手段及び方法が望まれていた。
【０００６】
【非特許文献１】
Horikawa, E. et al., Tetrahedron Letters（英国），第42巻，p. 8337-8339，2001年
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、デヒドロアミノ酸及びデヒドロペプチドのように不安定な化合物を簡便かつ高効率に合成するための手段及び方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために、第４周期１６族のカルコゲン元素であるセレン（Ｓｅ）を含むリンカーを開発することを目的として鋭意検討を行った結果、保護されたカルボン酸とセレノシアナート基を分子内に有するリンカーを合成することに成功し、またこのリンカーを利用することにより二重結合を有する不安定な化合物を簡便にかつ効率よく固相合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、下記式（Ｉ）で表されるリンカーである。
【０００９】
【化７】
（式中、Ｒ1は、複素原子を有していてもよい二価の有機基を表し、Ｒ2は、ＯＲ3又はＮＨＲ3を表し、Ｒ3は、水素原子、又はｔｅｒｔ−ブチル、エステルメチル、エチル、ベンジル、アリル、トリフェニルメチル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ−カルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、及びその他の保護基からなる群より選択される保護基を表す）。
上記リンカーとしては、例えば下記式（ＩＩ）で表されるリンカーが挙げられ、特に下記式（ＩＩＩ）で表されるリンカーが好ましい。
【００１０】
【化８】
（Ｒ2は、ＯＲ3又はＮＨＲ3を表し、Ｒ3は、水素原子、又はｔｅｒｔ−ブチル、エステルメチル、エチル、ベンジル、アリル、トリフェニルメチル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ−カルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、及びその他の保護基からなる群より選択される保護基を表す）。
【００１１】
また本発明は、上記リンカーを用いることを特徴とする、二重結合を有する化合物の合成方法である。上記合成方法において、二重結合を有する化合物は、例えば下記式（ＩＶ）で表すことができ、下記式（Ｖ）で表される中間体を経て該二重結合を有する化合物が合成されることが好ましい。
【００１２】
【化９】
（式中、Ｒ1は、複素原子を有していてもよい二価の有機基を表し、Ｒ2は、ＯＲ3又はＮＨＲ3を表し、Ｒ3は、水素原子、又はｔｅｒｔ−ブチル、エステルメチル、エチル、ベンジル、アリル、トリフェニルメチル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ−カルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、及びその他の保護基からなる群より選択される保護基を表し、Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して複素原子を有していてもよい二価の有機基を表す）。
【００１３】
また上記合成方法においては、上記リンカーを下記式（ＶＩ）で表される出発物質と反応させることを含んでいてもよいが、出発物質はこれに限定されるものではない。
【００１４】
【化１０】
（式中、Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して複素原子を有していてもよい二価の有機基を表し、Ｒ6は、水酸基、水素原子又はハロゲン原子を表す）。
上記合成方法において、式（ＩＶ）で表される化合物としては例えばデヒドロアミノ酸が挙げられる。
【００１５】
さらに本発明は、上記リンカーを用いることを特徴とするデヒドロアミノ酸の合成方法であって、例えば以下のステップを含むものである：
（ａ）上記リンカーのセレノエート基と保護アミノ酸とを連結するステップ；
（ｂ）上記リンカー固相支持体に固定するステップ；及び
（ｃ）上記固定化リンカーに結合した保護アミノ酸を酸化反応に付すことにより該固定化リンカーを除去するステップ。
【００１６】
またさらに本発明は、上記リンカーを用いることを特徴とするデヒドロペプチドの合成方法である。ここで、該合成方法は、例えば以下のステップを含むものである：
（ａ）上記リンカーのセレノエート基と保護アミノ酸とを連結するステップ；
（ｂ）上記リンカーを固相支持体に固定するステップ；
（ｃ）以下のステップ（ｃ−１）及び／又は（ｃ−２）を行うステップ；
（ｃ−１）上記固定化リンカーに結合した保護アミノ酸のカルボキシル基を脱保護し、該カルボキシル基に所望のアミノ酸又はペプチドを導入するステップ；
（ｃ−２）上記固定化リンカーに結合した保護アミノ酸のアミノ基を脱保護し、該アミノ基に所望の保護アミノ酸を導入して固定化リンカーに結合したペプチドを生成するステップであって、任意によりさらに該ペプチドのアミノ基を脱保護して該アミノ基に第２の保護アミノ酸を導入し、任意により上記脱保護及び保護アミノ酸の導入の工程を繰り返し行う、上記ステップ；並びに
（ｄ）ステップ（ｃ）により生成された、固定化リンカーに結合したペプチドを酸化反応に付すことにより上記固定化リンカーを除去するステップ。
【００１７】
本明細書において用いる略語を以下に記載する：
Ａｃ2Ｏ：無水酢酸
Ａｌｌｏｃ：アリルオキシカルボニル
Ａｌｌｙｌ：アリル
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート
Ｂｕ3Ｐ又はＰＢｕ3：トリブチルホスフィン
ＣＢｚ：ベンジルオキシカルボニル
２−ＣｌＺ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＩＣ：１，３−ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＨＡＴＵ：Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾリル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵ：Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオローホスフェート
Ｈ2Ｏ2：過酸化水素
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物
Ｍｅ：メチル
Ｐｂｆ：２，２，４，６，７−ペンタメチル−ジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
Ｐｄ（ＰＰｈ3）4：テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）
ＴＢＴＵ：２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート
ｔＢｕ：ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＦＭＳＡ：トリフルオロメチルスルホン酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＭＳＯＴｆ：トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート
その他、原子及びアミノ酸記号は、化学分野で一般的に用いられている略字を使用する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．リンカーの合成
本発明のリンカーは、保護カルボン酸とセレノシアナートが適当な基により連結されたものであって、下記式（Ｉ）により表されるものである：
【００１９】
【化１１】
（式中、Ｒ1は、複素原子を有していてもよい二価の有機基を表し、Ｒ2は、ＯＲ3又はＮＨＲ3を表し、Ｒ3は、水素原子、又はｔｅｒｔ−ブチル、エステルメチル、エチル、ベンジル、アリル、トリフェニルメチル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ−カルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、及びその他の保護基からなる群より選択される保護基を表す）。
【００２０】
本発明において「リンカー」とは、固相から目的とする反応を伴いながら合成生成物の穏和な切断を可能とする化学的部分を指す。
本発明において、Ｒ1は、その化学的構造が特に限定されるものではなく、複素原子を有していてもよい二価の有機基を示す。ここで複素原子としては、Ｎ、Ｏ及びＳなどが挙げられる。有機基としては、例えば置換基を有していてもよい脂肪族基、芳香族基若しくは複素芳香族基、又はこれらの組合せが挙げられる。具体的には、Ｒ1としては、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１２、より好ましくは炭素数１〜８の置換基を有していてもよい直鎖状又は分枝鎖状のアルキレン基、アルケニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルキリデン基、アリーレン基、ベンジリデン基などが挙げられる。
【００２１】
アルキレン基としては、直鎖状又は分枝鎖状のＣ1〜Ｃ20−アルキレン基、例えばメチレン、メチルメチレン、エチルメチレン、ジメチルメチレン、エチルメチルメチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、プロピレン、ブチレン、イソブチレンなどが挙げられる。
アルケニレン基としては、直鎖状又は分枝鎖状のＣ1〜Ｃ20−アルケニレン連鎖、例えばプロペニレンなどが挙げられる。
【００２２】
シクロアルキレン基としては、複素原子、例えばＳ、Ｎ又はＯを有していてもよい環中に炭素数１〜２０の直鎖状又は分枝鎖状のＣ1〜Ｃ20−シクロアルキレン、例えば１，３−シクロペンチレン、１，２−シクロヘキシレン、１，３−シクロヘキシレン、１，４−シクロヘキシレンなどが挙げられる。
【００２３】
シクロアルキリデン基としては、複素原子、例えばＳ、Ｎ又はＯを有していてもよい環中に炭素数１〜２０の直鎖状又は分枝鎖状のＣ1〜Ｃ20−シクロアルキリデン、例えばシクロプロピレン、シクロペンチリデン、シクロヘキシリデンなどが挙げられる。
アリーレン基としては、複素原子、例えばＳ、Ｎ又はＯを有していてもよい芳香族環又は環系、例えばフェニレンなどが挙げられる。
【００２４】
ここで、置換基としては、特に限定されないが、ハロゲン原子、アルキル基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、エポキシ基、メルカプト基、ビニル基、スチリル基、ホルミル基、イミド基、シアノ基、イソシアネート基などが挙げられる。
Ｒ1としては、限定するものではないが、１，２−（ｏ−）フェニレン基、１，３−（ｍ−）フェニレン基、及び１，４−（ｐ−）フェニレン基が好ましい。
【００２５】
また、式（Ｉ）において、Ｒ2は、ＯＲ3又はＮＨＲ3を表す。ここで、Ｒ3は、水素原子又は任意の保護基を表す。すなわち、式（Ｉ）に示す化合物の右側の構造は、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）若しくはアミノ基（−ＮＨ2）、又は保護基を有するカルボキシル基若しくはアミノ基となる。本明細書中、「保護基」とは、特定の部位における化学反応を行う際に、該特定の部位以外の部位が該化学反応による影響を受けないように導入する基を指し、保護基が導入された部位の他の部位に有害な影響を及ぼさない条件下で該保護基を容易に除去することが可能なことが好ましい。また本発明において「保護」とは、上記特性を満たす保護基を有することをいう。従って、本発明において、Ｒ3で表される保護基としては、保護された官能基を不活性化させ、他の反応条件下において安定であり、かつ他の官能基又は化合物の構造を変化させない条件下で容易に除去されるものであればよく、当技術分野で公知の保護基であれば特に限定されない。例えば、カルボキシル基の保護基としては、エステルメチル［ＯＨ-、Ｈ+］、エチル［ＯＨ-、Ｈ+］、ｔｅｒｔ−ブチル［ＴＦＡ］、ベンジル［ＯＨ-、Ｈ2／Ｐｄ／Ｃ］、アリル［Ｐｄ（０）、モルホリン］が挙げられ、アミノ基の保護基としては、トリフェニルメチル（トリチル）［ＴＦＡ］；ｔｅｒｔ−ブチルオキシ−カルボニル（Ｂｏｃ）、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、及び４−メトキシベンジルオキシカルボニル［ＴＦＡ、ＨＣｌ］；ベンジルオキシカルボニル（ＣＢｚ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−ＣｌＺ）［Ｈ2−Ｐｄ又はＨＢｒ、ＨＦ］、シクロアルキルオキシカルボニル、及びイソプロピルオキシカルボニル［ＨＦ、ＨＢｒ］；９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）［２０％ピペリジン／ＤＭＦ、ジエチルアミン／ＴＨＦ］；並びにアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）［Ｐｄ（０）、モルホリン、ジメドン、トリブチル水素化スズ、Ｎ−メチルアニリン］が挙げられる（四角括弧内にそれぞれの保護基の開裂手段を示すが、開裂手段はこれに限定されることはない）。上記例示した以外にも当技術分野において公知の保護基があり、そのような保護基のなかで同様の反応性を示す保護基も本発明において用いることができる。
【００２６】
本発明において、式（Ｉ）で表されるリンカーとしては、Ｒ1がフェニレンであるものが好ましく、下記式（ＩＩ）で表される：
【化１２】
【００２７】
また本発明において、式（Ｉ）で表されるリンカーとしては、Ｒ1が１，３−（ｍ−）フェニレンであり、Ｒ2がＯＲ3であり、Ｒ3がｔｅｒｔ−ブチル保護基であるものが特に好ましく、下記式（ＩＩＩ）で表される：
【００２８】
【化１３】
【００２９】
特に好ましい上記式（ＩＩＩ）で表されるリンカー、すなわち３−セレノシアナト安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルは、当業者であれば公知の化学合成法に従って容易に得ることができる。例えば、以下のスキーム１に示す反応により合成することができる。
【００３０】
【化１４】
【００３１】
最初に、ニトロ安息香酸Ａを対応するｔｅｒｔ−ブチルエステルに誘導する（反応ａ）。このアリールニトロエステルを還元することにより、アニリンＢを得る（反応ｂ）。続いて、水溶液中のセレノシアン酸カリウムを用いるサンドマイヤー反応（反応ｃ）を行って、セレノシアン酸アリールＣ、すなわち所望のリンカーである３−セレノシアナト安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルが得られる。
上述した３−セレノシアナト安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル以外のリンカーもまた、当業者であれば公知の化学合成法に従って合成することが可能である。
【００３２】
２．セレノエーテルから誘導可能な二重結合を有する化合物の合成
本発明のリンカーを利用することにより、セレノエーテルから誘導可能な二重結合を有する化合物を合成することができる。本発明において「二重結合を有する化合物」とは、少なくとも１つの二重結合（例えば共役二重結合など）を有している化合物であれば特に限定されるものではないが、例えば、共役鎖を有するビタミンＡ、ステロイド骨格を有するコレステロール、不飽和脂肪酸類などが挙げられる。この二重結合を有する化合物は、例えば下記式（ＩＶ）で表すことができる。
【００３３】
【化１５】
（式中、Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して二価の有機基を表す）。
【００３４】
上記式（ＩＶ）において、Ｒ4及びＲ5は、その化学的構造が特に限定されるものではなく、複素原子を有していてもよい二価の有機基を示す。複素原子及び二価の有機基は、上述した通りである。
【００３５】
本発明において、式（ＩＶ）で表される化合物としては、限定するものではないが、デヒドロアミノ酸（詳細については「３．デヒドロアミノ酸及びデヒドロペプチドの合成」を参照されたい）、Ｎｉｃｏｌａｏｕらの文献（Nicolaou, K.C. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39(4):734-739）に記載の化合物（例えばセセリン、キサンチレチン、アクロニシン等の２，２−ジメチルベンゾピラン部分を含む化合物）などが挙げられる。
上記のような二重結合を有する化合物の合成方法を以下に記載する。
【００３６】
（ａ）リンカーと出発物質との結合
二重結合を有する化合物の合成において、出発物質は特に限定されない。本発明においては、リンカーと出発物質とが連結し、下記式（Ｖ）で表されるセレノエーテル誘導体を得ることが重要である。
【００３７】
【化１６】
（式中、Ｒ1は、複素原子を有していてもよい二価の有機基を表し、Ｒ2は、ＯＲ3又はＮＨＲ3を表し、Ｒ3は、水素原子、又はｔｅｒｔ−ブチル、エステルメチル、エチル、ベンジル、アリル、トリフェニルメチル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ−カルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、及びその他の保護基からなる群より選択される保護基を表し、Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して複素原子を有していてもよい二価の有機基を表す）。
【００３８】
従って、出発物質は、本発明のリンカーと連結した後、種々の化学反応を行って、上記式（Ｖ）で表されるセレノエーテル誘導体を生成できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、最も簡単な出発物質としては、リンカーと出発物質を連結することのみにより式（Ｖ）のセレノエーテル誘導体を生成可能である、下記式（ＶＩ）で表される化合物が挙げられる。
【００３９】
【化１７】
（式中、Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して複素原子を有していてもよい二価の有機基を表し、Ｒ6は、水酸基、水素原子又はハロゲン原子を表す）。
【００４０】
式（ＶＩ）中、Ｒ4及びＲ5は上述した通りであり、目的とする中間体及び最終生成物、すなわち式（ＩＶ）及び（Ｖ）の化合物に応じて変化する。また、本発明のリンカーと連結した後、種々の化学反応により上述した中間体を生成可能である出発物質の例として、下記式（ＶＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
【００４１】
【化１８】
（式中、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して複素原子を有していてもよい二価の有機基を表す）。
【００４２】
式（ＶＩＩ）の化合物は、本発明のリンカーと連結した後、適当な化学反応を行って、式（Ｖ）の中間体を生成することができる。従って、式（ＶＩＩ）で表される二重結合を有する化合物のＲ7及びＲ8の基を直接化学修飾して式（ＩＶ）で表される目的の二重結合を有する化合物を合成することが二重結合の不安定性により困難である場合には、本発明のリンカーを利用することが特に好ましい。
【００４３】
以上のような出発物質は、当技術分野で公知の化学合成法により合成してもよいし、又は市販品を利用することも可能である。さらに出発物質は、その構造式が知られている場合には、天然から単離されたものであってもよい。
【００４４】
出発物質と本発明のリンカーとの連結は、当業者に公知の化学的方法に従って行うことができる。出発物質中に、リンカーと反応する基以外の官能基が存在する場合には、その官能基を保護基で保護してもよい。
【００４５】
リンカーと連結させた後、目的とする最終生成物に導くことが可能な、式（Ｖ）のセレノエーテル誘導体を中間体として生成するために、種々の化学反応を行ってもよい。そのような化学反応は、当業者であれば容易に理解することができる。
以上の反応により、式（Ｖ）で表されるセレノエーテル誘導体が中間体として得られる。
【００４６】
（ｂ）リンカーの固定化
本発明のリンカーを固相支持体に固定する。ここで、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の前に行ってもよいし、ステップ（ａ）の後に行ってもよい。好ましくは、ステップ（ａ）の反応を液相において行った後、ステップ（ｂ）の固定化を行う。ステップ（ａ）の反応を液相で行う場合には、化学反応の種類の制限がなく、多種多様な反応を行うことができるという利点があり、その結果、種々の化学構造をもつ二重結合を有する化合物を生成することが可能となる。
【００４７】
最初に、リンカー中の固定化反応に使用される基が保護されている場合には、リンカーの保護基を脱保護する。脱保護は、保護基の種類によって異なり、当業者であれば保護基の種類に応じて適当な脱保護反応を行うことができる。例えば、上記「１．リンカーの合成」の項目に記載した保護基に関しては、脱保護のための開裂手段を記載している。
【００４８】
リンカーを脱保護した後、該リンカーのカルボキシル基又はアミノ基と固相支持体とを連結させ、リンカーを固相支持体に固定する。本発明において「固相支持体」とは、酸、塩基又は他の試薬の存在下において安定な材料から作製され、化学合成の操作を行いやすくし、かつ目的の生成物の収量を高めるために化学分野で一般的に用いられている任意の形態のビーズ又は樹脂を指し、「固相支持体」及び「樹脂」という用語は互換的に用いられる。固相支持体としては、限定されるものではないが、架橋ポリスチロール、架橋ポリアクリルアミド及びその他の樹脂；セラミック；ガラス；ラテックス；天然ポリマー；金及びコロイド金属粒子；シリカゲルなどが挙げられる。架橋ポリスチロール、架橋ポリアクリルアミド及びその他の樹脂としては、例えばポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアミドなどが含まれる。また、天然ポリマーとしては、例えばアガロース、セルロース、ペクチン、アルギン酸塩などが含まれる。また「固定」又は「固定化」とは、固相支持体と結合させることを指す。
【００４９】
リンカーは、固相支持体の種類に応じて、エステル結合、アミド結合、ホスファート結合などを介して固相支持体に結合させる。固相支持体への結合は、当技術分野で公知の方法で行われる。
【００５０】
具体的には、溶剤中で例えばジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を用いてリンカーのカルボキシル基をアミド結合により固相支持体に結合させることができる。溶剤としては、非極性又は極性の溶剤、例えばＤＭＦ、塩化メチレン、ＤＭＳＯ、ＴＨＦなどが適している。また、ＤＩＣの代わりに、ＨＡＴＵ、ＤＩＥＡ、ＴＢＴＵ、ＨＢＴＳ、ＢＯＰ又はＰＹＢＯＰなどのカップリング試薬を用いることも可能である。
以上の反応から、固定されたセレノエーテル誘導体が生成される。
【００５１】
（ｃ）固定化リンカーの除去
固定されたセレノエーテル誘導体の固定化リンカー部分を除去し、目的とする二重結合を有する化合物を生成する。固定化リンカーの除去は、固定化されたセレノエーテル誘導体を穏和な酸化反応に付すことにより簡便に行うことができる。例えば、酸化反応は、適当な有機溶媒又は水中で酸化剤を作用させることにより行うことができる。有機溶媒としては、例えば限定されるものではないが、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ジオキサンなどのエーテル系溶媒；ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどの極性溶媒；メタノール、エタノールなどのアルコール系溶媒；酢酸などの低級カルボン酸；塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン系溶媒などが挙げられ、溶解させる目的物が良好に溶解する溶媒を選択することが好ましい。また酸化剤としては、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、過酢酸などの過酸化物；金属触媒と酵素；過ヨウ素酸及びその金属塩などから自由に選択可能であるが、特にその穏和な酸化作用の点から過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）が好ましい。
【００５２】
以上の反応により、固定化リンカーが除去され、二重結合を有する化合物が得られる。本発明は特定の機構に限定するものではないが、このリンカーの除去（酸化反応）により、光延反応による反応機構を経て二重結合を有する化合物が生成されると推測される。
【００５３】
３．デヒドロアミノ酸及びデヒドロペプチドの合成
本発明のリンカーを利用することにより、デヒドロアミノ酸、さらにはデヒドロペプチドを合成することができる。
【００５４】
（ａ）リンカーと保護アミノ酸との結合
本発明においては、リンカーのセレノエート基と保護アミノ酸とを連結させる。ここで、保護アミノ酸は、セレノエート基との反応のために、アミノ酸内又は側鎖に水酸基（ＯＨ）又はハロゲン原子が存在することが好ましい。
【００５５】
本発明において「アミノ酸」とは、Ｄ−又はＬ−立体異性体の天然又は非天然アミノ酸を指し、天然アミノ酸としては、例えばアラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）などが含まれ、非天然アミノ酸としては、例えばアゼチジンカルボン酸、２−若しくは３−アミノアジピン酸、β−アラニン、アミノプロピオン酸、２−若しくは４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−若しくは３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、ノルバリン、オルニチンなどが含まれるがこれに限定されない。また本発明において、「アミノ酸」には、アミノ酸類似体などのアミノ酸と同様にペプチド結合によって連結可能な分子も含まれる。「アミノ酸類似体」とは、Ｎ末端アミノ基若しくは側鎖基が化学的にブロッキングされた又は修飾された天然及び非天然アミノ酸を指し、例えば、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システイン、５−（カルボキシメチル）−システインスルホキシド、アスパラギン酸−（βメチルエステル）、Ｎ−エチルグリシン、アラニンカルボキサミドなどが含まれるがこれに限定されない。
【００５６】
保護アミノ酸の保護基は、保護された側鎖官能基を不活性にさせ、アミノ末端又はカルボキシル末端保護基の除去において安定であり、ペプチド鎖の構造を変化させずに容易に除去することが可能なものとする。例えば、アミノ基の保護基は、「１．リンカーの合成」の項に記載した通りである。また、グアニジノ基の保護基としては、ニトロ［Ｈ2／Ｐｄ／Ｃ、ＨＦ］、及びＣＢｚ［ＨＦ、ＴＦＭＳＡ、ＴＭＳＯＴｆ、Ｈ2／Ｐｄ／Ｃ］、Ｂｏｃ［ＴＦＡ］などが挙げられる。水酸基の保護基としては、例えば、トリチル［ＴＦＡ］、ｔｅｒｔ−ブチル［ＴＦＡ］、ベンジル及び置換ベンジル基［ＨＦ、ＴＦＭＳＡ、Ｈ2／Ｐｄ／Ｃ］などが挙げられる。フェノール基の保護基としては、ｔｅｒｔ−ブチル［ＴＦＡ］、トリチル［ＴＦＡ］、ベンジル［ＨＦ、ＴＦＭＳＡ、Ｈ2／Ｐｄ／Ｃ］などが挙げられる。側鎖カルボキシ基の保護基としては、メチル［ＯＨ-、Ｈ+］、エチル［ＯＨ-、Ｈ+］、ｔｅｒｔ−ブチル［ＴＦＡ］、アリル［Ｐｄ（０）、モルホリン］、シクロヘキシル［Ｈｆ、ＴＭＳＯＴｆ］、ベンジル［ＨＦ、ＴＦＭＳＡ、Ｈ2／Ｐｄ／Ｃ］などが挙げられる。アスパラギン及びグルタミン側鎖の保護基としては、トリチル［ＴＦＡ］、キサンチル［ＴＦＡ］などが挙げられる。イミダゾール基の保護基としては、２，４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）［チオフェノール］、トリチル［ＴＦＡ］、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）［ＨＦ、ＴＦＭＳＡ、ＴＭＳＯＴｆ、Ｈ2／Ｐｄ／Ｃ］、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）［ＨＦ、ＴＦＭＳＡ］、Ｃｂｚ［ＨＦ、Ｈ2／Ｐｄ／Ｃ］が挙げられる。スルフヒドリル基の保護基としては、トリチル［ＴＦＡ］、４−メチルベンジル［ＨＦ、ＴＦＭＳＡ］などが挙げられる。インドール基の保護基としては、ホルミル［ＤＭＦ中１０％ピペリジン、その後ＨＦ］、Ｂｏｃ［ＴＦＡ］などが挙げられる。四角括弧内にそれぞれの保護基の開裂手段を記載したが、開裂手段はこれに限定されることはない。また、上記例示した以外にも当技術分野において公知の保護基があり、そのような保護基のなかで同様の反応性を示す保護基も本発明において用いることができる。
【００５７】
リンカーのセレノエート基と保護アミノ酸との連結は、当業者に公知の化学的方法に従って行うことができる。
特に好ましい実施形態として、上記式（ＩＩ）で表されるリンカーと保護アミノ酸との反応を以下のスキーム２に示す：
【００５８】
【化１９】
【００５９】
リンカーＡと、Ｎ末端及びＣ末端をそれぞれＦｍｏｃ及びＡｌｌｙｌで保護したアミノ酸Ｂを、ＣＨ2Ｃｌ2中でトリブチルホスフィンと共に約０℃にて約０．５〜２時間にわたり反応させることにより、リンカーと保護アミノ酸が連結したセレノエーテル誘導体Ｃが得られる。
【００６０】
（ｂ）固相支持体への固定化
本発明のリンカーを固相支持体に固定する。ここで、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の前に行ってもよいし、ステップ（ａ）の後に行ってもよい。好ましくは、ステップ（ａ）の反応を液相において行った後、ステップ（ｂ）の固定化を行う。
【００６１】
リンカーにおける固相支持体に結合する基が保護されている場合には、その保護基を脱保護する。脱保護は、保護基の種類によって異なり、当業者であれば保護基の種類に応じて適当な脱保護反応を行うことができる。例えば、上記「１．リンカーの合成」の項目に記載した保護基に関しては、脱保護のための開裂手段を記載している。
【００６２】
リンカーを脱保護した後、該リンカーのカルボキシル基又はアミノ基と固相支持体とを連結させ、リンカーを固相支持体に固定する。固相支持体としては、上記「２．セレノエーテルから誘導可能な二重結合を有する化合物の合成」の項に記載したものが挙げられる。デヒドロアミノ酸又はデヒドロペプチドの合成においては、ペプチドの固相合成に用いられる固相支持体が特に好ましく、例えば、Ｎｏｖａｓｙｎ(登録商標)ＴＧアミノ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、クロロベンジル樹脂、Ｒｉｎｋ−Ｈａｒｚ樹脂（Ｎａｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｓｉｅｂｅｒ−Ｈａｒｚ樹脂（Ｎａｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｗａｎｇ−Ｈａｒｚ樹脂（Ｎａｖａｂｉｏｃｈｅｍ）などが挙げられる。
【００６３】
リンカーは、固相支持体の種類に応じて、エステル結合、アミド結合、ホスファート結合などを介して固相に結合させる。固相への結合は、当技術分野で公知の方法で行われる（例えば、「２．セレノエーテルから誘導可能な二重結合を有する化合物の合成」の項目を参照されたい）。
【００６４】
（ｃ）ペプチドの生成
（ｃ−１）カルボキシル基側のペプチド伸長
デヒドロペプチドを合成する場合、合成されるペプチドにおいて、デヒドロアミノ酸のカルボキシル末端側にアミノ酸又はペプチドが付加されているペプチドを合成する場合には、上記固定化リンカーに結合した保護アミノ酸のカルボキシル基を脱保護し、所望のアミノ酸又はペプチドを導入する。
【００６５】
カルボキシル基の脱保護に関しては、上述した通りである。固定化リンカーに結合した保護アミノ酸のカルボキシル基と所望のアミノ酸又はペプチドのアミノ基とをアミド結合（ペプチド）により結合させる。導入されるアミノ酸又はペプチドは特に限定されるものではないが、反応させる基以外の基は保護しておくことが好ましい。アミド結合反応は当技術分野で周知であり、当業者であれば適切な手段及び方法を採用して行うことができる。
上記ステップ（ｃ−１）は、合成されるペプチドにおいて、デヒドロアミノ酸がカルボキシル末端に存在するペプチドを合成する場合には行わなくてよい。
【００６６】
（ｃ−２）アミノ基側へのペプチド伸長
合成されるペプチドにおいて、デヒドロアミノ酸のアミノ末端側にアミノ酸が付加されているペプチドを合成する場合には、上記固定化リンカーに結合した保護アミノ酸のアミノ基を脱保護し、所望の保護アミノ酸を導入する。
【００６７】
アミノ基の脱保護と所望の保護アミノ酸の導入は、通常のペプチド固相合成法と同様に行うことができる。これにより、固定化リンカーに結合したペプチドが生成される。
【００６８】
続いて、合成されるペプチドにおいて、デヒドロアミノ酸のアミノ末端側にペプチドが付加されているペプチドを合成する場合には、上記の保護アミノ酸の導入後、固定化リンカーに結合している合成中のペプチドのアミノ末端を脱保護し、第２のアミノ酸を導入する。合成中のペプチドのアミノ末端の脱保護及びアミノ酸の導入を繰り返し行うことによって、固定化リンカーに結合したペプチドが伸長され、所望の長さを有する所望の配列のペプチドを合成することができる。
【００６９】
このステップ（ｃ−２）は、合成されるペプチドにおいて、デヒドロアミノ酸がアミノ末端に存在するペプチドを合成する場合には行わなくてよい。しかし、ペプチド合成において、ステップ（ｃ−１）及び（ｃ−２）のいずれかのステップは必須に行うものとする。
【００７０】
以上のアミノ基の脱保護及び保護アミノ酸の導入は、ペプチド固相合成法において般的に用いられているペプチド合成機を利用して行うことも可能である。そのようなペプチド合成機としては、限定するものではないが、ＰｉｏｎｅｅｒTMペプチド合成装置、ペプチド合成装置ＰＳＳＭ−８（ＳＨＩＭＡＤＺＵ）、ペプチドシンセサイザモデル４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などが挙げられる。
【００７１】
（ｄ）固定化リンカーの除去
以上のようにして、ステップ（ｂ）で得られる固定化リンカーに結合した保護アミノ酸、又はステップ（ｃ）で得られる固定化リンカーに結合したペプチドは、酸化反応に付すことにより固定化リンカーを除去し、目的とするデヒドロアミノ酸又はデヒドロペプチドを生成することができる。
【００７２】
固定化リンカーの除去は、固定化リンカーが結合した保護アミノ酸又はペプチドを穏和な酸化反応に付すことにより簡便に行うことができる。例えば、酸化反応は、適当な有機溶媒又は水中で酸化剤を作用させることにより行うことができる。有機溶媒としては、例えば限定されるものではないが、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ジオキサンなどのエーテル系溶媒；ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどの極性溶媒；メタノール、エタノールなどのアルコール系溶媒；酢酸などの低級カルボン酸；塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン系溶媒などが挙げられ、溶解させる目的物が良好に溶解する溶媒を選択することが好ましい。また酸化剤としては、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、過酢酸などの過酸化物；金属触媒と酵素；過ヨウ素酸及びその金属塩などから自由に選択可能であるが、特にその穏和な酸化作用の点から過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）が好ましい。
【００７３】
以上の反応により、固定化リンカーが除去され、所望のデヒドロアミノ酸又はデヒドロペプチドが得られる。また、得られるデヒドロアミノ酸又はデヒドロペプチドが保護基を有する場合には、適当な脱保護反応を行ってもよい。
【００７４】
本発明のリンカーは、第１の特長として、通常の固相合成で用いられるリンカーとは異なり、最初の反応において固相支持体に結合させる必要がなく、最初に液相において出発物質と結合させ、さらに種々の化学反応を適用した後、固相支持体に結合させることが可能である。このため、出発物質に結合させる反応を有機化学的に許容される範囲で自由に選択することができ、豊富な知見がある液相反応で官能基の変換や保護基の脱着が可能である。しかる後に、活性化反応によって固相支持体と結合させる官能基を再生し、固相合成では周知の簡便な固相導入反応（アミド化反応など）で固定することが可能である。このとき、使用する固相支持体は、デヒドロペプチドなどの特殊な目的物質に合わせて新たに調製する必要はなく、市販の反応性既知な固相支持体から自由に選択することができる。
【００７５】
本発明のリンカーは、その第２の特長として、デヒドロアミノ酸などに含まれる二重結合という不安定な官能基を、合成の最終段階である固相からの切出し反応により調製できる。しかもこの切出し反応は従来の酸による切出し反応とは異なり、穏和な酸化反応によるものであり、目的とする最終生成物のみならず他の不安定な官能基を損なうことがない。
【００７６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は下記実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００７７】
〔実施例１〕リンカーの合成
本実施例においては、上記スキーム１に示す反応に従ってリンカーを合成した。
（１）３−アミノ安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルの生成
３−ニトロ安息香酸（２．５０ｇ，１５ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブタノール（２７．５ｍｌ）溶液にジメチルアミノピリジン（５４９ｍｇ，４．５ｍｍｏｌ）と二炭酸ｔｅｒｔ−ブチル（７．０ｍｌ，３０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間反応させた。反応液を減圧で濃縮して、得られた残渣をシリカゲル（１０ｇ）を重積したカラムを通じて濾過し、ヘキサン／酢酸エチル（１：１）で洗浄した。濾液を濃縮し、３−ニトロ安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルを約３．４ｇ得た。得られた化合物の性質を以下に示す：
IR（film）：1720, 1599, 1533 1369, 1352, 1300, 1271, 1171, 1136, 846, 719 cm-1.
1H-NMR（CDCl3）δ 8.79 (1H, s), 8.38 (1H, d, J=8.0 Hz), 8.32 (1H, d, J=8.0 Hz), 7.63 (1H, t, J=8.0 Hz), 1.63 (9H, s).
【００７８】
得られたｔｅｒｔ−ブチル３−ニトロ安息香酸（約３．４ｇ）をエタノール（８０ｍｌ）に溶解し、５％パラジウム炭素（５００ｍｇ）を加えて、水素気流下、室温で２時間反応させた。不溶物を濾別し、濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５〜２０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、得られた固形物をヘキサン−酢酸エチルから再結晶し、３−アミノ安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルを２．６ｇ（９０％，２ステップ）得た。得られた化合物の性質を以下に示す：
融点８２．５〜８３．０℃（ヘキサン−ＥｔＯＡｃ）
IR（film）：1694, 1606, 1460, 1368, 1320, 1245, 1161, 1108, 757 cm-1.
1H-NMR（CDCl3）δ 7.37 (1H, d, J=8.0, 1.0 Hz), 7.30 (1H, s), 7.18 (1H, t, J=8.0 Hz), 6.82 (1H, dd, J=8.0, 1.5 Hz), 3.77 (2H, br s), 1.58 (9H, s).
【００７９】
（２）３−セレノシアナト 安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル
３−アミノ安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル（２．０ｇ，１０．３ｍｍｏｌ）を希塩酸（３Ｍ，３．５ｍｌ）とジオキサン（１０ｍｌ）の混合溶媒に溶解し、０℃で亜硝酸ナトリウム（７２５ｍｇ，１０．５ｍｍｏｌ）の水（２ｍｌ）溶液を滴下した。０℃で１０分間撹拌した後、酢酸ナトリウム（１．４５ｇ）の水（３ｍｌ）溶液を加えて、ｐＨがおよそ６になるように調整した。セレノシアン酸カリウム（２．２５ｇ，１５．６ｍｍｏｌ）の水（６ｍｌ）溶液を０℃で滴下し、さらに１時間反応させた。得られた反応液を、酢酸エチルと炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液で希釈し、セライトの層を通して濾過した。有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄し、濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエンの後、５％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、３−セレノシアナト 安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル（図１中（ａ）の化合物）を褐色油状物質として１．４６ｇ（５０％）得た。分析用サンプルを沸点（ｂｐ）１８０〜２００℃（０．５ｔｏｒｒ）の画分から蒸留して精製したところ固化した。得られた化合物の性質を以下に示す：
融点３７〜３８℃
IR（film）：1714, 1569, 1369, 1302, 1163, 1127, 1012, 848, 748 cm-1.
1H-NMR（CDCl3）δ 8.23 (1H, s), 8.05 (1H, d, J=8.0 Hz), 7.82 (1H, d, J=8.0 Hz), 7.48 (1H, t, J=8.0 Hz), 1.61 (9H, s).
【００８０】
〔実施例２〕デヒドロアミノ酸前駆体（セレノエーテル誘導体）の合成
本実施例においては、上記スキーム２の反応に従ってリンカーと保護アミノ酸とを反応させてセレノエーテルを合成した。使用したリンカーは、図２に示す実施例１で得られた３−セレノシアナト 安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル、４−セレノシアナト 安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル、及び４−セレノシアナトフェノキシ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルである。４−セレノシアナト 安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル、及び４−セレノシアナトフェノキシ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルは、実施例１と同様に対応するカルボン酸を分子内に有するニトロベンゼン誘導体を保護及び還元して得られる、アニリン誘導体に対するサンドマイヤー反応によって合成した。
【００８１】
Ｎ，Ｃ−保護セリン又はトレオニンを、塩化メチレン中０℃にてリンカー及びトリブチルホスフィンと反応させ、対応するセレノエーテル誘導体を得た。使用したリンカーと導入した保護アミノ酸、及び得られたセレノエーテル誘導体の収率を図２に示す。
【００８２】
〔実施例３〕保護アミノ酸へのリンカーへの導入
本実施例では、図１に示すリンカーの導入反応を行った。
（１）Ｎα−Ｆｍｏｃ−（ｍ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）フェニルセレニル）アラニン アリルエステルの合成（反応Ａ）
実施例１で得られた３−セレノシアナト 安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル（ａ：３４５ｍｇ，１．２３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２．５ｍｌ）に溶解し、０℃でトリブチルホスフィン（２９４μｌ，１．２３ｍｍｏｌ）を加えて１０分間反応させた。得られた淡黄色の溶液にＦｍｏｃセリンアリルエステル（ｂ：３００ｍｇ，０．８２ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（２．５ｍｌ）溶液を滴下し、３０分間反応させた。反応液を酢酸エチル−１０％硫酸水素カリウムで分配した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し乾燥後、濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル４：１）で精製し、Ｎα−Ｆｍｏｃ−（ｍ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）フェニルセレニル）アラニンアリルエステル（ｃ）を淡黄色油状物質として３６８ｍｇ（７４％）得た。得られた化合物（ｃ）の性質を以下に示す：
[α]D 23 25.2°（c=1.00, CHCl3）
IR（film）：3342, 1713br, 1507, 1450, 1413, 1368, 1300, 1126, 989, 936, 848, 743 cm-1.
1H-NMR（CDCl3）δ 1.57 (9H, s), 3.40 (1H, dd, J= 4.9, 13.6 Hz), 3.47 (1H, dd, J= 4.6, 13.6 Hz), 4.20 (1H, t, J= 7.0 Hz), 4.33 (3H, complex), 4.53 (1H, dd, J= 5.5, 12.8 Hz), 4.77 (1H, dist. dt, J= 4.6, 7.9 Hz), 5.22 (1H, br. d, J= 10.3 Hz), 5.27 (1H, br. d, J= 19.0 Hz), 5.63 (1H, br. d, J= 7.9 Hz), 5.80 (1H, complex), 7.25-7.35 (3H, arom.), 7.40 (2H, arom.), 7.56 (2H arom.), 7.70 (1H. arom.), 7.70 (2H, arom.), 7.86 (1H, arom.), 8.17 (1H, s, arom.).
【００８３】
（２）Ｎα−Ｆｍｏｃ−（ｍ−カルボキシフェニルセレニル）アラニン アリルエステルの合成（反応Ｂ）
上記（１）で得られたＮα−Ｆｍｏｃ−（ｍ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）フェニルセレニル）アラニン アリルエステル（ｃ：３３１ｍｇ，０．５４５ｍｍｏｌ）を９５％ ＴＦＡに溶解し、室温で１時間反応させた。得られた反応液をトルエンで希釈し濃縮して得られた残渣を酢酸エチルに溶解して、１０％硫酸水素カリウム、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を減圧濃縮し、セレノエーテルカルボン酸（ｄ）を２９８ｍｇ（９９％）得た。
【００８４】
〔実施例３〕ペプチドの合成
本実施例では、リンカーの固定化とペプチド合成を行った。
（１）アミノ酸の固定化（反応Ｃ）
実施例２で得られたＮα−Ｆｍｏｃ−（ｍ−カルボキシフェニルセレニル）アラニン アリルエステル（ｄ：２８９ｍｇ，５２４ｍｍｏｌ）とアミノエチル化樹脂（スイスＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製ＮｏｖａＳｙｎTMＴＧアミノ樹脂：０．２９ｍｍｏｌ／ｇ、９０４ｍｇ、２６２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６ｍｌ）に懸濁・膨潤させた。ついでＨＡＴＵ（１９９ｍｇ，０．５２４ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１８２μｌ，０．５２４ｍｍｏｌ）を加え、室温で振盪下一晩反応させた。得られた樹脂を濾別し、ＤＭＦ・メタノール・ジエチルエーテルで順次洗浄し真空乾燥させ、アミノ酸固定化樹脂（ｅ）９７７ｍｇを得た。この樹脂は、ニンヒドリン反応に陰性だった。
【００８５】
このようにして得られた樹脂（６．３ｍｇ）をピペリジン（０．４ｍｌ）と塩化メチレン（０．４ｍｌ）の混合液中、室温・振盪下で３０分反応後、メタノール（１．６ｍｌ）と塩化メチレン（７．６ｍｌ）で希釈し、３０１ｎｍでの吸光度を測定したところ、０．６９０であった。ジベンゾフルベンのピペリジン付加物の３０１ｎｍの分子吸光係数（ε＝７８００）より計算される、Ｆｍｏｃアミノ酸の導入率は０．１４ｍｍｏｌ／ｇであった。
【００８６】
（２）Ｃ−末端脱保護（反応Ｄ）
上記（１）で得られたＣ−末端にアリル基を有するアミノ酸固定化樹脂（ｅ：２１４ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）を無水脱酸素ＴＨＦ（５ｍｌ）に懸濁し、アルゴン気流下、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（１２ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）とジメドン（１２６ｍｇ，０．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間振盪して反応させた。樹脂を濾別し、ＴＨＦ・メタノール・ジエチルエーテルで順次洗浄した後、真空乾燥させ、カルボン酸樹脂（ｆ）を２１４ｍｇ得た。
【００８７】
（３）Ｃ−末端縮合によるＣ末端へのペプチド付加（反応Ｅ）
Ｃ−末端を脱保護したアミノ酸固定化樹脂（ｆ：２１４ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に懸濁・膨潤し、ＨＡＴＵ（３４ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（３１μｌ，０．１８ｍｍｏｌ）及びフェニルアラニル アラニンメチルエステル塩酸塩（ＨＣｌ・Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｏｍｅ：２１ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１晩振盪して反応させた。樹脂を濾別し、ＤＭＦ・メタノール・ジエチルエーテルで順次洗浄した後、真空乾燥させ、トリペプチド樹脂（ｇ）を２１８ｍｇ得た。
【００８８】
（４）Ｎ−末端順次伸長（反応Ｆ）
上記（３）で得られたトリペプチド樹脂（ｇ：２１８ｍｍｏｌ，０．０３ｍｍｏｌ）をＰｉｏｎｅｅｒTMペプチド合成装置（モデル９０３０）にセットし、ＨＡＴＵ法（Carpino, L.A. et al., J. Am. Chem. Soc. 115:4397, 1993）に従ってＧｌｙ−ＯＨ（５９ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）、及びＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（１３０ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）を用いて内蔵Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｃｙｃｌｅプログラム（脱保護時間５分、カップリング時間６０分）により反応させた。最終段階は無水酢酸によるアセチルキャッピング反応を施した。プログラム終了後、反応器から樹脂を回収しメタノール・エーテルで順次洗浄した後、真空乾燥してヘキサペプチド樹脂（ｈ）を２２９ｍｇ得た。
【００８９】
（５）切出し反応（反応Ｇ）
ヘキサペプチド樹脂固定化樹脂（ｈ：２２９ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍｌ）に懸濁し、３０％過酸化水素水（０．２０ｍｌ）を加え、室温で１晩振盪して反応させた。樹脂を濾別し、濾液を半量まで濃縮した後、酢酸エチル−希亜硫酸水素ナトリウム水溶液で分配し、有機層を飽和食塩水で洗浄・乾燥後、濃縮して得られた残渣をＢｉｏｂｅａｄｓTM ＳＸ−３（米国Ｂｉｏｒａｄ社製）を充填したカラム（移動相トルエン−酢酸エチル１：１）で精製し、Ａｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−ΔＡｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｏｍｅ（ｉ）を２３ｍｇ（７７％）得た。得られた化合物（ｉ）の性質を以下に示す：
[α]D 22 -14.3°(c=1.00, CHCl3)
1H-NMR（CDCl3, selected） δ（H, s), 1.41 (3H, d, overlapped), 1.41 (3H, s), 1.42 (3H, s), 1.45 (9H, s), 2.08 (3H, s), 2.49 (3H, s), 2.56 (3H, s), 2.94 (3H, s), 3.69 (3H, s), 5.24 (1H, br.s), 6.33 (1H, br.s), 7.15-7.25 (5H, arom.).
上述したように、本発明のリンカーを用いてデヒドロペプチドを合成することができた。
【００９０】
【発明の効果】
本発明により、二重結合を有する化合物などの不安定な化合物を合成するためのリンカー及び該化合物の合成方法が提供される。本発明のリンカーは、特にデヒドロアミノ酸及びデヒドロペプチドの合成に好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のリンカーを用いた保護アミノ酸へのリンカー導入とペプチド合成の反応を示す図である。球はアミノエチル化樹脂を表す。
【図２】本発明のリンカーと保護アミノ酸との反応により得られるセレノエーテル及びデヒドロアミノ酸の収率を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なセレニルリンカー、並びに該リンカーを用いたデヒドロアミノ酸及びデヒドロペプチドの製造方法に関する。また本発明は、上記リンカーを用いた二重結合を有する化合物の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
デヒドロペプチド類は、αβ間に二重結合を有するアミノ酸を構成要素として含む異常ペプチドの総称である。デヒドロペプチドは、ペプチド結合と二重結合に共役した剛直かつ反応性の高いπ電子系を有する、最も簡単なペプチドのアナログである。構造化学的には、高い平面性に由来するβターン構造の誘導因子として知られており、長鎖のペプチドの配座を固定する性質がある。また有機化学的には強く分極したαβ不飽和アミドであり、生体内のアミノ基・チオール基などに対する高い反応性を有している。一方、合成化学的見地からはアシル化されたエナミンであり、酸及びアルカリに対して不安定である。
【０００３】
デヒドロペプチドは生理活性天然物として数多く見出されている。こうした天然物では、植物毒性・抗腫瘍性・抗カビ活性など多彩な生理活性が認められているが、これは前述の化学的性質に由来するものと考えられる。例えば、このような化合物としては、ＡＭ−ｔｏｘｉｎ、ｋａｈａｌａｌｉｄｅ Ｆ及びＳｃｈ２０５６１が知られている。なおこれら天然物は、リン酸化又はグリコシル化されたセリンないしトレオニンから生合成されると考えられている。
【０００４】
このように多彩な生理活性を有するデヒドロペプチドは、その反応性の高さ故に有機合成化学的に調製することは困難とされてきた。これは、通常のペプチド固相合成法で用いる酸や塩基による脱保護条件に対しデヒドロアミノ酸が不安定であるために、最終段階での二重結合の導入が要求されることや、前駆体においてすらも不安定であって種々の化学処理に制約を受けるためである。
【０００５】
上記の問題を解決するため、デヒドロペプチドの１種であるＡＭ−ｔｏｘｉｎを合成するためのリンカーが開発されている（非特許文献１参照）。このリンカーを用いることにより、Ｃ末端におけるペプチド鎖の伸長を行い、環状デヒドロペプチドを合成することが可能である。しかしこの方法では、ニトロ基からカルボキシル基を誘導するのに複数のステップが必要であり、またカルボキシル基の活性化時に副反応して環状イミドが形成されることもあり、簡便性及び効率の点でさらに改良の余地がある。
以上のように、当該技術分野では、デヒドロペプチドなどの不安定な物質を簡便かつ高効率に合成するための手段及び方法が望まれていた。
【０００６】
【非特許文献１】
Horikawa, E. et al., Tetrahedron Letters（英国），第42巻，p. 8337-8339，2001年
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、デヒドロアミノ酸及びデヒドロペプチドのように不安定な化合物を簡便かつ高効率に合成するための手段及び方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために、第４周期１６族のカルコゲン元素であるセレン（Ｓｅ）を含むリンカーを開発することを目的として鋭意検討を行った結果、保護されたカルボン酸とセレノシアナート基を分子内に有するリンカーを合成することに成功し、またこのリンカーを利用することにより二重結合を有する不安定な化合物を簡便にかつ効率よく固相合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、下記式（Ｉ）で表されるリンカーである。
【０００９】
【化７】
上記リンカーとしては、例えば下記式（ＩＩ）で表されるリンカーが挙げられ、特に下記式（ＩＩＩ）で表されるリンカーが好ましい。
【００１０】
【化８】
【００１１】
また本発明は、上記リンカーを用いることを特徴とする、二重結合を有する化合物の合成方法である。上記合成方法において、二重結合を有する化合物は、例えば下記式（ＩＶ）で表すことができ、下記式（Ｖ）で表される中間体を経て該二重結合を有する化合物が合成されることが好ましい。
【００１２】
【化９】
【００１３】
また上記合成方法においては、上記リンカーを下記式（ＶＩ）で表される出発物質と反応させることを含んでいてもよいが、出発物質はこれに限定されるものではない。
【００１４】
【化１０】
上記合成方法において、式（ＩＶ）で表される化合物としては例えばデヒドロアミノ酸が挙げられる。
【００１５】
さらに本発明は、上記リンカーを用いることを特徴とするデヒドロアミノ酸の合成方法であって、例えば以下のステップを含むものである：
（ａ）上記リンカーのセレノエート基と保護アミノ酸とを連結するステップ；
（ｂ）上記リンカー固相支持体に固定するステップ；及び
（ｃ）上記固定化リンカーに結合した保護アミノ酸を酸化反応に付すことにより該固定化リンカーを除去するステップ。
【００１６】
またさらに本発明は、上記リンカーを用いることを特徴とするデヒドロペプチドの合成方法である。ここで、該合成方法は、例えば以下のステップを含むものである：
（ａ）上記リンカーのセレノエート基と保護アミノ酸とを連結するステップ；
（ｂ）上記リンカーを固相支持体に固定するステップ；
（ｃ）以下のステップ（ｃ−１）及び／又は（ｃ−２）を行うステップ；
（ｃ−１）上記固定化リンカーに結合した保護アミノ酸のカルボキシル基を脱保護し、該カルボキシル基に所望のアミノ酸又はペプチドを導入するステップ；
（ｃ−２）上記固定化リンカーに結合した保護アミノ酸のアミノ基を脱保護し、該アミノ基に所望の保護アミノ酸を導入して固定化リンカーに結合したペプチドを生成するステップであって、任意によりさらに該ペプチドのアミノ基を脱保護して該アミノ基に第２の保護アミノ酸を導入し、任意により上記脱保護及び保護アミノ酸の導入の工程を繰り返し行う、上記ステップ；並びに
（ｄ）ステップ（ｃ）により生成された、固定化リンカーに結合したペプチドを酸化反応に付すことにより上記固定化リンカーを除去するステップ。
【００１７】
本明細書において用いる略語を以下に記載する：
Ａｃ2Ｏ：無水酢酸
Ａｌｌｏｃ：アリルオキシカルボニル
Ａｌｌｙｌ：アリル
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート
Ｂｕ3Ｐ又はＰＢｕ3：トリブチルホスフィン
ＣＢｚ：ベンジルオキシカルボニル
２−ＣｌＺ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＩＣ：１，３−ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＨＡＴＵ：Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾリル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵ：Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオローホスフェート
Ｈ2Ｏ2：過酸化水素
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物
Ｍｅ：メチル
Ｐｂｆ：２，２，４，６，７−ペンタメチル−ジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
Ｐｄ（ＰＰｈ3）4：テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）
ＴＢＴＵ：２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート
ｔＢｕ：ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＦＭＳＡ：トリフルオロメチルスルホン酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＭＳＯＴｆ：トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート
その他、原子及びアミノ酸記号は、化学分野で一般的に用いられている略字を使用する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．リンカーの合成
本発明のリンカーは、保護カルボン酸とセレノシアナートが適当な基により連結されたものであって、下記式（Ｉ）により表されるものである：
【００１９】
【化１１】
【００２０】
本発明において「リンカー」とは、固相から目的とする反応を伴いながら合成生成物の穏和な切断を可能とする化学的部分を指す。
本発明において、Ｒ1は、その化学的構造が特に限定されるものではなく、複素原子を有していてもよい二価の有機基を示す。ここで複素原子としては、Ｎ、Ｏ及びＳなどが挙げられる。有機基としては、例えば置換基を有していてもよい脂肪族基、芳香族基若しくは複素芳香族基、又はこれらの組合せが挙げられる。具体的には、Ｒ1としては、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１２、より好ましくは炭素数１〜８の置換基を有していてもよい直鎖状又は分枝鎖状のアルキレン基、アルケニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルキリデン基、アリーレン基、ベンジリデン基などが挙げられる。
【００２１】
アルキレン基としては、直鎖状又は分枝鎖状のＣ1〜Ｃ20−アルキレン基、例えばメチレン、メチルメチレン、エチルメチレン、ジメチルメチレン、エチルメチルメチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、プロピレン、ブチレン、イソブチレンなどが挙げられる。
アルケニレン基としては、直鎖状又は分枝鎖状のＣ1〜Ｃ20−アルケニレン連鎖、例えばプロペニレンなどが挙げられる。
【００２２】
シクロアルキレン基としては、複素原子、例えばＳ、Ｎ又はＯを有していてもよい環中に炭素数１〜２０の直鎖状又は分枝鎖状のＣ1〜Ｃ20−シクロアルキレン、例えば１，３−シクロペンチレン、１，２−シクロヘキシレン、１，３−シクロヘキシレン、１，４−シクロヘキシレンなどが挙げられる。
【００２３】
シクロアルキリデン基としては、複素原子、例えばＳ、Ｎ又はＯを有していてもよい環中に炭素数１〜２０の直鎖状又は分枝鎖状のＣ1〜Ｃ20−シクロアルキリデン、例えばシクロプロピレン、シクロペンチリデン、シクロヘキシリデンなどが挙げられる。
アリーレン基としては、複素原子、例えばＳ、Ｎ又はＯを有していてもよい芳香族環又は環系、例えばフェニレンなどが挙げられる。
【００２４】
ここで、置換基としては、特に限定されないが、ハロゲン原子、アルキル基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、エポキシ基、メルカプト基、ビニル基、スチリル基、ホルミル基、イミド基、シアノ基、イソシアネート基などが挙げられる。
Ｒ1としては、限定するものではないが、１，２−（ｏ−）フェニレン基、１，３−（ｍ−）フェニレン基、及び１，４−（ｐ−）フェニレン基が好ましい。
【００２５】
また、式（Ｉ）において、Ｒ2は、ＯＲ3又はＮＨＲ3を表す。ここで、Ｒ3は、水素原子又は任意の保護基を表す。すなわち、式（Ｉ）に示す化合物の右側の構造は、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）若しくはアミノ基（−ＮＨ2）、又は保護基を有するカルボキシル基若しくはアミノ基となる。本明細書中、「保護基」とは、特定の部位における化学反応を行う際に、該特定の部位以外の部位が該化学反応による影響を受けないように導入する基を指し、保護基が導入された部位の他の部位に有害な影響を及ぼさない条件下で該保護基を容易に除去することが可能なことが好ましい。また本発明において「保護」とは、上記特性を満たす保護基を有することをいう。従って、本発明において、Ｒ3で表される保護基としては、保護された官能基を不活性化させ、他の反応条件下において安定であり、かつ他の官能基又は化合物の構造を変化させない条件下で容易に除去されるものであればよく、当技術分野で公知の保護基であれば特に限定されない。例えば、カルボキシル基の保護基としては、エステルメチル［ＯＨ-、Ｈ+］、エチル［ＯＨ-、Ｈ+］、ｔｅｒｔ−ブチル［ＴＦＡ］、ベンジル［ＯＨ-、Ｈ2／Ｐｄ／Ｃ］、アリル［Ｐｄ（０）、モルホリン］が挙げられ、アミノ基の保護基としては、トリフェニルメチル（トリチル）［ＴＦＡ］；ｔｅｒｔ−ブチルオキシ−カルボニル（Ｂｏｃ）、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、及び４−メトキシベンジルオキシカルボニル［ＴＦＡ、ＨＣｌ］；ベンジルオキシカルボニル（ＣＢｚ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−ＣｌＺ）［Ｈ2−Ｐｄ又はＨＢｒ、ＨＦ］、シクロアルキルオキシカルボニル、及びイソプロピルオキシカルボニル［ＨＦ、ＨＢｒ］；９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）［２０％ピペリジン／ＤＭＦ、ジエチルアミン／ＴＨＦ］；並びにアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）［Ｐｄ（０）、モルホリン、ジメドン、トリブチル水素化スズ、Ｎ−メチルアニリン］が挙げられる（四角括弧内にそれぞれの保護基の開裂手段を示すが、開裂手段はこれに限定されることはない）。上記例示した以外にも当技術分野において公知の保護基があり、そのような保護基のなかで同様の反応性を示す保護基も本発明において用いることができる。
【００２６】
本発明において、式（Ｉ）で表されるリンカーとしては、Ｒ1がフェニレンであるものが好ましく、下記式（ＩＩ）で表される：
【化１２】
また本発明において、式（Ｉ）で表されるリンカーとしては、Ｒ1が１，３−（ｍ−）フェニレンであり、Ｒ2がＯＲ3であり、Ｒ3がｔｅｒｔ−ブチル保護基であるものが特に好ましく、下記式（ＩＩＩ）で表される：
【００２８】
【化１３】
特に好ましい上記式（ＩＩＩ）で表されるリンカー、すなわち３−セレノシアナト安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルは、当業者であれば公知の化学合成法に従って容易に得ることができる。例えば、以下のスキーム１に示す反応により合成することができる。
【００３０】
【化１４】
最初に、ニトロ安息香酸Ａを対応するｔｅｒｔ−ブチルエステルに誘導する（反応ａ）。このアリールニトロエステルを還元することにより、アニリンＢを得る（反応ｂ）。続いて、水溶液中のセレノシアン酸カリウムを用いるサンドマイヤー反応（反応ｃ）を行って、セレノシアン酸アリールＣ、すなわち所望のリンカーである３−セレノシアナト安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルが得られる。
上述した３−セレノシアナト安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル以外のリンカーもまた、当業者であれば公知の化学合成法に従って合成することが可能である。
【００３２】
２．セレノエーテルから誘導可能な二重結合を有する化合物の合成
本発明のリンカーを利用することにより、セレノエーテルから誘導可能な二重結合を有する化合物を合成することができる。本発明において「二重結合を有する化合物」とは、少なくとも１つの二重結合（例えば共役二重結合など）を有している化合物であれば特に限定されるものではないが、例えば、共役鎖を有するビタミンＡ、ステロイド骨格を有するコレステロール、不飽和脂肪酸類などが挙げられる。この二重結合を有する化合物は、例えば下記式（ＩＶ）で表すことができる。
【００３３】
【化１５】
【００３４】
上記式（ＩＶ）において、Ｒ4及びＲ5は、その化学的構造が特に限定されるものではなく、複素原子を有していてもよい二価の有機基を示す。複素原子及び二価の有機基は、上述した通りである。
【００３５】
本発明において、式（ＩＶ）で表される化合物としては、限定するものではないが、デヒドロアミノ酸（詳細については「３．デヒドロアミノ酸及びデヒドロペプチドの合成」を参照されたい）、Ｎｉｃｏｌａｏｕらの文献（Nicolaou, K.C. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39(4):734-739）に記載の化合物（例えばセセリン、キサンチレチン、アクロニシン等の２，２−ジメチルベンゾピラン部分を含む化合物）などが挙げられる。
上記のような二重結合を有する化合物の合成方法を以下に記載する。
【００３６】
（ａ）リンカーと出発物質との結合
二重結合を有する化合物の合成において、出発物質は特に限定されない。本発明においては、リンカーと出発物質とが連結し、下記式（Ｖ）で表されるセレノエーテル誘導体を得ることが重要である。
【００３７】
【化１６】
【００３８】
従って、出発物質は、本発明のリンカーと連結した後、種々の化学反応を行って、上記式（Ｖ）で表されるセレノエーテル誘導体を生成できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、最も簡単な出発物質としては、リンカーと出発物質を連結することのみにより式（Ｖ）のセレノエーテル誘導体を生成可能である、下記式（ＶＩ）で表される化合物が挙げられる。
【００３９】
【化１７】
【００４０】
式（ＶＩ）中、Ｒ4及びＲ5は上述した通りであり、目的とする中間体及び最終生成物、すなわち式（ＩＶ）及び（Ｖ）の化合物に応じて変化する。また、本発明のリンカーと連結した後、種々の化学反応により上述した中間体を生成可能である出発物質の例として、下記式（ＶＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
【００４１】
【化１８】
【００４２】
式（ＶＩＩ）の化合物は、本発明のリンカーと連結した後、適当な化学反応を行って、式（Ｖ）の中間体を生成することができる。従って、式（ＶＩＩ）で表される二重結合を有する化合物のＲ7及びＲ8の基を直接化学修飾して式（ＩＶ）で表される目的の二重結合を有する化合物を合成することが二重結合の不安定性により困難である場合には、本発明のリンカーを利用することが特に好ましい。
【００４３】
以上のような出発物質は、当技術分野で公知の化学合成法により合成してもよいし、又は市販品を利用することも可能である。さらに出発物質は、その構造式が知られている場合には、天然から単離されたものであってもよい。
【００４４】
出発物質と本発明のリンカーとの連結は、当業者に公知の化学的方法に従って行うことができる。出発物質中に、リンカーと反応する基以外の官能基が存在する場合には、その官能基を保護基で保護してもよい。
【００４５】
リンカーと連結させた後、目的とする最終生成物に導くことが可能な、式（Ｖ）のセレノエーテル誘導体を中間体として生成するために、種々の化学反応を行ってもよい。そのような化学反応は、当業者であれば容易に理解することができる。
以上の反応により、式（Ｖ）で表されるセレノエーテル誘導体が中間体として得られる。
【００４６】
（ｂ）リンカーの固定化
本発明のリンカーを固相支持体に固定する。ここで、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の前に行ってもよいし、ステップ（ａ）の後に行ってもよい。好ましくは、ステップ（ａ）の反応を液相において行った後、ステップ（ｂ）の固定化を行う。ステップ（ａ）の反応を液相で行う場合には、化学反応の種類の制限がなく、多種多様な反応を行うことができるという利点があり、その結果、種々の化学構造をもつ二重結合を有する化合物を生成することが可能となる。
【００４７】
最初に、リンカー中の固定化反応に使用される基が保護されている場合には、リンカーの保護基を脱保護する。脱保護は、保護基の種類によって異なり、当業者であれば保護基の種類に応じて適当な脱保護反応を行うことができる。例えば、上記「１．リンカーの合成」の項目に記載した保護基に関しては、脱保護のための開裂手段を記載している。
【００４８】
リンカーを脱保護した後、該リンカーのカルボキシル基又はアミノ基と固相支持体とを連結させ、リンカーを固相支持体に固定する。本発明において「固相支持体」とは、酸、塩基又は他の試薬の存在下において安定な材料から作製され、化学合成の操作を行いやすくし、かつ目的の生成物の収量を高めるために化学分野で一般的に用いられている任意の形態のビーズ又は樹脂を指し、「固相支持体」及び「樹脂」という用語は互換的に用いられる。固相支持体としては、限定されるものではないが、架橋ポリスチロール、架橋ポリアクリルアミド及びその他の樹脂；セラミック；ガラス；ラテックス；天然ポリマー；金及びコロイド金属粒子；シリカゲルなどが挙げられる。架橋ポリスチロール、架橋ポリアクリルアミド及びその他の樹脂としては、例えばポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアミドなどが含まれる。また、天然ポリマーとしては、例えばアガロース、セルロース、ペクチン、アルギン酸塩などが含まれる。また「固定」又は「固定化」とは、固相支持体と結合させることを指す。
【００４９】
リンカーは、固相支持体の種類に応じて、エステル結合、アミド結合、ホスファート結合などを介して固相支持体に結合させる。固相支持体への結合は、当技術分野で公知の方法で行われる。
【００５０】
具体的には、溶剤中で例えばジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を用いてリンカーのカルボキシル基をアミド結合により固相支持体に結合させることができる。溶剤としては、非極性又は極性の溶剤、例えばＤＭＦ、塩化メチレン、ＤＭＳＯ、ＴＨＦなどが適している。また、ＤＩＣの代わりに、ＨＡＴＵ、ＤＩＥＡ、ＴＢＴＵ、ＨＢＴＳ、ＢＯＰ又はＰＹＢＯＰなどのカップリング試薬を用いることも可能である。
以上の反応から、固定されたセレノエーテル誘導体が生成される。
【００５１】
（ｃ）固定化リンカーの除去
固定されたセレノエーテル誘導体の固定化リンカー部分を除去し、目的とする二重結合を有する化合物を生成する。固定化リンカーの除去は、固定化されたセレノエーテル誘導体を穏和な酸化反応に付すことにより簡便に行うことができる。例えば、酸化反応は、適当な有機溶媒又は水中で酸化剤を作用させることにより行うことができる。有機溶媒としては、例えば限定されるものではないが、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ジオキサンなどのエーテル系溶媒；ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどの極性溶媒；メタノール、エタノールなどのアルコール系溶媒；酢酸などの低級カルボン酸；塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン系溶媒などが挙げられ、溶解させる目的物が良好に溶解する溶媒を選択することが好ましい。また酸化剤としては、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、過酢酸などの過酸化物；金属触媒と酵素；過ヨウ素酸及びその金属塩などから自由に選択可能であるが、特にその穏和な酸化作用の点から過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）が好ましい。
【００５２】
以上の反応により、固定化リンカーが除去され、二重結合を有する化合物が得られる。本発明は特定の機構に限定するものではないが、このリンカーの除去（酸化反応）により、光延反応による反応機構を経て二重結合を有する化合物が生成されると推測される。
【００５３】
３．デヒドロアミノ酸及びデヒドロペプチドの合成
本発明のリンカーを利用することにより、デヒドロアミノ酸、さらにはデヒドロペプチドを合成することができる。
【００５４】
（ａ）リンカーと保護アミノ酸との結合
本発明においては、リンカーのセレノエート基と保護アミノ酸とを連結させる。ここで、保護アミノ酸は、セレノエート基との反応のために、アミノ酸内又は側鎖に水酸基（ＯＨ）又はハロゲン原子が存在することが好ましい。
【００５５】
本発明において「アミノ酸」とは、Ｄ−又はＬ−立体異性体の天然又は非天然アミノ酸を指し、天然アミノ酸としては、例えばアラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）などが含まれ、非天然アミノ酸としては、例えばアゼチジンカルボン酸、２−若しくは３−アミノアジピン酸、β−アラニン、アミノプロピオン酸、２−若しくは４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−若しくは３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、ノルバリン、オルニチンなどが含まれるがこれに限定されない。また本発明において、「アミノ酸」には、アミノ酸類似体などのアミノ酸と同様にペプチド結合によって連結可能な分子も含まれる。「アミノ酸類似体」とは、Ｎ末端アミノ基若しくは側鎖基が化学的にブロッキングされた又は修飾された天然及び非天然アミノ酸を指し、例えば、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システイン、５−（カルボキシメチル）−システインスルホキシド、アスパラギン酸−（βメチルエステル）、Ｎ−エチルグリシン、アラニンカルボキサミドなどが含まれるがこれに限定されない。
【００５６】
保護アミノ酸の保護基は、保護された側鎖官能基を不活性にさせ、アミノ末端又はカルボキシル末端保護基の除去において安定であり、ペプチド鎖の構造を変化させずに容易に除去することが可能なものとする。例えば、アミノ基の保護基は、「１．リンカーの合成」の項に記載した通りである。また、グアニジノ基の保護基としては、ニトロ［Ｈ2／Ｐｄ／Ｃ、ＨＦ］、及びＣＢｚ［ＨＦ、ＴＦＭＳＡ、ＴＭＳＯＴｆ、Ｈ2／Ｐｄ／Ｃ］、Ｂｏｃ［ＴＦＡ］などが挙げられる。水酸基の保護基としては、例えば、トリチル［ＴＦＡ］、ｔｅｒｔ−ブチル［ＴＦＡ］、ベンジル及び置換ベンジル基［ＨＦ、ＴＦＭＳＡ、Ｈ2／Ｐｄ／Ｃ］などが挙げられる。フェノール基の保護基としては、ｔｅｒｔ−ブチル［ＴＦＡ］、トリチル［ＴＦＡ］、ベンジル［ＨＦ、ＴＦＭＳＡ、Ｈ2／Ｐｄ／Ｃ］などが挙げられる。側鎖カルボキシ基の保護基としては、メチル［ＯＨ-、Ｈ+］、エチル［ＯＨ-、Ｈ+］、ｔｅｒｔ−ブチル［ＴＦＡ］、アリル［Ｐｄ（０）、モルホリン］、シクロヘキシル［Ｈｆ、ＴＭＳＯＴｆ］、ベンジル［ＨＦ、ＴＦＭＳＡ、Ｈ2／Ｐｄ／Ｃ］などが挙げられる。アスパラギン及びグルタミン側鎖の保護基としては、トリチル［ＴＦＡ］、キサンチル［ＴＦＡ］などが挙げられる。イミダゾール基の保護基としては、２，４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）［チオフェノール］、トリチル［ＴＦＡ］、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）［ＨＦ、ＴＦＭＳＡ、ＴＭＳＯＴｆ、Ｈ2／Ｐｄ／Ｃ］、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）［ＨＦ、ＴＦＭＳＡ］、Ｃｂｚ［ＨＦ、Ｈ2／Ｐｄ／Ｃ］が挙げられる。スルフヒドリル基の保護基としては、トリチル［ＴＦＡ］、４−メチルベンジル［ＨＦ、ＴＦＭＳＡ］などが挙げられる。インドール基の保護基としては、ホルミル［ＤＭＦ中１０％ピペリジン、その後ＨＦ］、Ｂｏｃ［ＴＦＡ］などが挙げられる。四角括弧内にそれぞれの保護基の開裂手段を記載したが、開裂手段はこれに限定されることはない。また、上記例示した以外にも当技術分野において公知の保護基があり、そのような保護基のなかで同様の反応性を示す保護基も本発明において用いることができる。
【００５７】
リンカーのセレノエート基と保護アミノ酸との連結は、当業者に公知の化学的方法に従って行うことができる。
特に好ましい実施形態として、上記式（ＩＩ）で表されるリンカーと保護アミノ酸との反応を以下のスキーム２に示す：
【００５８】
【化１９】
リンカーＡと、Ｎ末端及びＣ末端をそれぞれＦｍｏｃ及びＡｌｌｙｌで保護したアミノ酸Ｂを、ＣＨ2Ｃｌ2中でトリブチルホスフィンと共に約０℃にて約０．５〜２時間にわたり反応させることにより、リンカーと保護アミノ酸が連結したセレノエーテル誘導体Ｃが得られる。
【００６０】
（ｂ）固相支持体への固定化
本発明のリンカーを固相支持体に固定する。ここで、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の前に行ってもよいし、ステップ（ａ）の後に行ってもよい。好ましくは、ステップ（ａ）の反応を液相において行った後、ステップ（ｂ）の固定化を行う。
【００６１】
リンカーにおける固相支持体に結合する基が保護されている場合には、その保護基を脱保護する。脱保護は、保護基の種類によって異なり、当業者であれば保護基の種類に応じて適当な脱保護反応を行うことができる。例えば、上記「１．リンカーの合成」の項目に記載した保護基に関しては、脱保護のための開裂手段を記載している。
【００６２】
リンカーを脱保護した後、該リンカーのカルボキシル基又はアミノ基と固相支持体とを連結させ、リンカーを固相支持体に固定する。固相支持体としては、上記「２．セレノエーテルから誘導可能な二重結合を有する化合物の合成」の項に記載したものが挙げられる。デヒドロアミノ酸又はデヒドロペプチドの合成においては、ペプチドの固相合成に用いられる固相支持体が特に好ましく、例えば、Ｎｏｖａｓｙｎ(登録商標)ＴＧアミノ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、クロロベンジル樹脂、Ｒｉｎｋ−Ｈａｒｚ樹脂（Ｎａｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｓｉｅｂｅｒ−Ｈａｒｚ樹脂（Ｎａｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｗａｎｇ−Ｈａｒｚ樹脂（Ｎａｖａｂｉｏｃｈｅｍ）などが挙げられる。
【００６３】
リンカーは、固相支持体の種類に応じて、エステル結合、アミド結合、ホスファート結合などを介して固相に結合させる。固相への結合は、当技術分野で公知の方法で行われる（例えば、「２．セレノエーテルから誘導可能な二重結合を有する化合物の合成」の項目を参照されたい）。
【００６４】
（ｃ）ペプチドの生成
（ｃ−１）カルボキシル基側のペプチド伸長
デヒドロペプチドを合成する場合、合成されるペプチドにおいて、デヒドロアミノ酸のカルボキシル末端側にアミノ酸又はペプチドが付加されているペプチドを合成する場合には、上記固定化リンカーに結合した保護アミノ酸のカルボキシル基を脱保護し、所望のアミノ酸又はペプチドを導入する。
【００６５】
カルボキシル基の脱保護に関しては、上述した通りである。固定化リンカーに結合した保護アミノ酸のカルボキシル基と所望のアミノ酸又はペプチドのアミノ基とをアミド結合（ペプチド）により結合させる。導入されるアミノ酸又はペプチドは特に限定されるものではないが、反応させる基以外の基は保護しておくことが好ましい。アミド結合反応は当技術分野で周知であり、当業者であれば適切な手段及び方法を採用して行うことができる。
上記ステップ（ｃ−１）は、合成されるペプチドにおいて、デヒドロアミノ酸がカルボキシル末端に存在するペプチドを合成する場合には行わなくてよい。
【００６６】
（ｃ−２）アミノ基側へのペプチド伸長
合成されるペプチドにおいて、デヒドロアミノ酸のアミノ末端側にアミノ酸が付加されているペプチドを合成する場合には、上記固定化リンカーに結合した保護アミノ酸のアミノ基を脱保護し、所望の保護アミノ酸を導入する。
【００６７】
アミノ基の脱保護と所望の保護アミノ酸の導入は、通常のペプチド固相合成法と同様に行うことができる。これにより、固定化リンカーに結合したペプチドが生成される。
【００６８】
続いて、合成されるペプチドにおいて、デヒドロアミノ酸のアミノ末端側にペプチドが付加されているペプチドを合成する場合には、上記の保護アミノ酸の導入後、固定化リンカーに結合している合成中のペプチドのアミノ末端を脱保護し、第２のアミノ酸を導入する。合成中のペプチドのアミノ末端の脱保護及びアミノ酸の導入を繰り返し行うことによって、固定化リンカーに結合したペプチドが伸長され、所望の長さを有する所望の配列のペプチドを合成することができる。
【００６９】
このステップ（ｃ−２）は、合成されるペプチドにおいて、デヒドロアミノ酸がアミノ末端に存在するペプチドを合成する場合には行わなくてよい。しかし、ペプチド合成において、ステップ（ｃ−１）及び（ｃ−２）のいずれかのステップは必須に行うものとする。
【００７０】
以上のアミノ基の脱保護及び保護アミノ酸の導入は、ペプチド固相合成法において般的に用いられているペプチド合成機を利用して行うことも可能である。そのようなペプチド合成機としては、限定するものではないが、ＰｉｏｎｅｅｒTMペプチド合成装置、ペプチド合成装置ＰＳＳＭ−８（ＳＨＩＭＡＤＺＵ）、ペプチドシンセサイザモデル４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などが挙げられる。
【００７１】
（ｄ）固定化リンカーの除去
以上のようにして、ステップ（ｂ）で得られる固定化リンカーに結合した保護アミノ酸、又はステップ（ｃ）で得られる固定化リンカーに結合したペプチドは、酸化反応に付すことにより固定化リンカーを除去し、目的とするデヒドロアミノ酸又はデヒドロペプチドを生成することができる。
【００７２】
固定化リンカーの除去は、固定化リンカーが結合した保護アミノ酸又はペプチドを穏和な酸化反応に付すことにより簡便に行うことができる。例えば、酸化反応は、適当な有機溶媒又は水中で酸化剤を作用させることにより行うことができる。有機溶媒としては、例えば限定されるものではないが、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ジオキサンなどのエーテル系溶媒；ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどの極性溶媒；メタノール、エタノールなどのアルコール系溶媒；酢酸などの低級カルボン酸；塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン系溶媒などが挙げられ、溶解させる目的物が良好に溶解する溶媒を選択することが好ましい。また酸化剤としては、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、過酢酸などの過酸化物；金属触媒と酵素；過ヨウ素酸及びその金属塩などから自由に選択可能であるが、特にその穏和な酸化作用の点から過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）が好ましい。
【００７３】
以上の反応により、固定化リンカーが除去され、所望のデヒドロアミノ酸又はデヒドロペプチドが得られる。また、得られるデヒドロアミノ酸又はデヒドロペプチドが保護基を有する場合には、適当な脱保護反応を行ってもよい。
【００７４】
本発明のリンカーは、第１の特長として、通常の固相合成で用いられるリンカーとは異なり、最初の反応において固相支持体に結合させる必要がなく、最初に液相において出発物質と結合させ、さらに種々の化学反応を適用した後、固相支持体に結合させることが可能である。このため、出発物質に結合させる反応を有機化学的に許容される範囲で自由に選択することができ、豊富な知見がある液相反応で官能基の変換や保護基の脱着が可能である。しかる後に、活性化反応によって固相支持体と結合させる官能基を再生し、固相合成では周知の簡便な固相導入反応（アミド化反応など）で固定することが可能である。このとき、使用する固相支持体は、デヒドロペプチドなどの特殊な目的物質に合わせて新たに調製する必要はなく、市販の反応性既知な固相支持体から自由に選択することができる。
【００７５】
本発明のリンカーは、その第２の特長として、デヒドロアミノ酸などに含まれる二重結合という不安定な官能基を、合成の最終段階である固相からの切出し反応により調製できる。しかもこの切出し反応は従来の酸による切出し反応とは異なり、穏和な酸化反応によるものであり、目的とする最終生成物のみならず他の不安定な官能基を損なうことがない。
【００７６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は下記実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００７７】
〔実施例１〕リンカーの合成
本実施例においては、上記スキーム１に示す反応に従ってリンカーを合成した。
（１）３−アミノ安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルの生成
３−ニトロ安息香酸（２．５０ｇ，１５ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブタノール（２７．５ｍｌ）溶液にジメチルアミノピリジン（５４９ｍｇ，４．５ｍｍｏｌ）と二炭酸ｔｅｒｔ−ブチル（７．０ｍｌ，３０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間反応させた。反応液を減圧で濃縮して、得られた残渣をシリカゲル（１０ｇ）を重積したカラムを通じて濾過し、ヘキサン／酢酸エチル（１：１）で洗浄した。濾液を濃縮し、３−ニトロ安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルを約３．４ｇ得た。得られた化合物の性質を以下に示す：
IR（film）：1720, 1599, 1533 1369, 1352, 1300, 1271, 1171, 1136, 846, 719 cm-1.
1H-NMR（CDCl3）δ 8.79 (1H, s), 8.38 (1H, d, J=8.0 Hz), 8.32 (1H, d, J=8.0 Hz), 7.63 (1H, t, J=8.0 Hz), 1.63 (9H, s).
【００７８】
得られたｔｅｒｔ−ブチル３−ニトロ安息香酸（約３．４ｇ）をエタノール（８０ｍｌ）に溶解し、５％パラジウム炭素（５００ｍｇ）を加えて、水素気流下、室温で２時間反応させた。不溶物を濾別し、濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５〜２０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、得られた固形物をヘキサン−酢酸エチルから再結晶し、３−アミノ安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルを２．６ｇ（９０％，２ステップ）得た。得られた化合物の性質を以下に示す：
融点８２．５〜８３．０℃（ヘキサン−ＥｔＯＡｃ）
IR（film）：1694, 1606, 1460, 1368, 1320, 1245, 1161, 1108, 757 cm-1.
1H-NMR（CDCl3）δ 7.37 (1H, d, J=8.0, 1.0 Hz), 7.30 (1H, s), 7.18 (1H, t, J=8.0 Hz), 6.82 (1H, dd, J=8.0, 1.5 Hz), 3.77 (2H, br s), 1.58 (9H, s).
【００７９】
（２）３−セレノシアナト 安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル
３−アミノ安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル（２．０ｇ，１０．３ｍｍｏｌ）を希塩酸（３Ｍ，３．５ｍｌ）とジオキサン（１０ｍｌ）の混合溶媒に溶解し、０℃で亜硝酸ナトリウム（７２５ｍｇ，１０．５ｍｍｏｌ）の水（２ｍｌ）溶液を滴下した。０℃で１０分間撹拌した後、酢酸ナトリウム（１．４５ｇ）の水（３ｍｌ）溶液を加えて、ｐＨがおよそ６になるように調整した。セレノシアン酸カリウム（２．２５ｇ，１５．６ｍｍｏｌ）の水（６ｍｌ）溶液を０℃で滴下し、さらに１時間反応させた。得られた反応液を、酢酸エチルと炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液で希釈し、セライトの層を通して濾過した。有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄し、濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエンの後、５％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、３−セレノシアナト 安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル（図１中（ａ）の化合物）を褐色油状物質として１．４６ｇ（５０％）得た。分析用サンプルを沸点（ｂｐ）１８０〜２００℃（０．５ｔｏｒｒ）の画分から蒸留して精製したところ固化した。得られた化合物の性質を以下に示す：
融点３７〜３８℃
IR（film）：1714, 1569, 1369, 1302, 1163, 1127, 1012, 848, 748 cm-1.
1H-NMR（CDCl3）δ 8.23 (1H, s), 8.05 (1H, d, J=8.0 Hz), 7.82 (1H, d, J=8.0 Hz), 7.48 (1H, t, J=8.0 Hz), 1.61 (9H, s).
【００８０】
〔実施例２〕デヒドロアミノ酸前駆体（セレノエーテル誘導体）の合成
本実施例においては、上記スキーム２の反応に従ってリンカーと保護アミノ酸とを反応させてセレノエーテルを合成した。使用したリンカーは、図２に示す実施例１で得られた３−セレノシアナト 安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル、４−セレノシアナト 安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル、及び４−セレノシアナトフェノキシ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルである。４−セレノシアナト 安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル、及び４−セレノシアナトフェノキシ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルは、実施例１と同様に対応するカルボン酸を分子内に有するニトロベンゼン誘導体を保護及び還元して得られる、アニリン誘導体に対するサンドマイヤー反応によって合成した。
【００８１】
Ｎ，Ｃ−保護セリン又はトレオニンを、塩化メチレン中０℃にてリンカー及びトリブチルホスフィンと反応させ、対応するセレノエーテル誘導体を得た。使用したリンカーと導入した保護アミノ酸、及び得られたセレノエーテル誘導体の収率を図２に示す。
【００８２】
〔実施例３〕保護アミノ酸へのリンカーへの導入
本実施例では、図１に示すリンカーの導入反応を行った。
（１）Ｎα−Ｆｍｏｃ−（ｍ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）フェニルセレニル）アラニン アリルエステルの合成（反応Ａ）
実施例１で得られた３−セレノシアナト 安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル（ａ：３４５ｍｇ，１．２３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２．５ｍｌ）に溶解し、０℃でトリブチルホスフィン（２９４μｌ，１．２３ｍｍｏｌ）を加えて１０分間反応させた。得られた淡黄色の溶液にＦｍｏｃセリンアリルエステル（ｂ：３００ｍｇ，０．８２ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（２．５ｍｌ）溶液を滴下し、３０分間反応させた。反応液を酢酸エチル−１０％硫酸水素カリウムで分配した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し乾燥後、濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル４：１）で精製し、Ｎα−Ｆｍｏｃ−（ｍ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）フェニルセレニル）アラニンアリルエステル（ｃ）を淡黄色油状物質として３６８ｍｇ（７４％）得た。得られた化合物（ｃ）の性質を以下に示す：
[α]D 23 25.2°（c=1.00, CHCl3）
IR（film）：3342, 1713br, 1507, 1450, 1413, 1368, 1300, 1126, 989, 936, 848, 743 cm-1.
1H-NMR（CDCl3）δ 1.57 (9H, s), 3.40 (1H, dd, J= 4.9, 13.6 Hz), 3.47 (1H, dd, J= 4.6, 13.6 Hz), 4.20 (1H, t, J= 7.0 Hz), 4.33 (3H, complex), 4.53 (1H, dd, J= 5.5, 12.8 Hz), 4.77 (1H, dist. dt, J= 4.6, 7.9 Hz), 5.22 (1H, br. d, J= 10.3 Hz), 5.27 (1H, br. d, J= 19.0 Hz), 5.63 (1H, br. d, J= 7.9 Hz), 5.80 (1H, complex), 7.25-7.35 (3H, arom.), 7.40 (2H, arom.), 7.56 (2H arom.), 7.70 (1H. arom.), 7.70 (2H, arom.), 7.86 (1H, arom.), 8.17 (1H, s, arom.).
【００８３】
（２）Ｎα−Ｆｍｏｃ−（ｍ−カルボキシフェニルセレニル）アラニン アリルエステルの合成（反応Ｂ）
上記（１）で得られたＮα−Ｆｍｏｃ−（ｍ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）フェニルセレニル）アラニン アリルエステル（ｃ：３３１ｍｇ，０．５４５ｍｍｏｌ）を９５％ ＴＦＡに溶解し、室温で１時間反応させた。得られた反応液をトルエンで希釈し濃縮して得られた残渣を酢酸エチルに溶解して、１０％硫酸水素カリウム、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を減圧濃縮し、セレノエーテルカルボン酸（ｄ）を２９８ｍｇ（９９％）得た。
【００８４】
〔実施例３〕ペプチドの合成
本実施例では、リンカーの固定化とペプチド合成を行った。
（１）アミノ酸の固定化（反応Ｃ）
実施例２で得られたＮα−Ｆｍｏｃ−（ｍ−カルボキシフェニルセレニル）アラニン アリルエステル（ｄ：２８９ｍｇ，５２４ｍｍｏｌ）とアミノエチル化樹脂（スイスＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製ＮｏｖａＳｙｎTMＴＧアミノ樹脂：０．２９ｍｍｏｌ／ｇ、９０４ｍｇ、２６２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６ｍｌ）に懸濁・膨潤させた。ついでＨＡＴＵ（１９９ｍｇ，０．５２４ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１８２μｌ，０．５２４ｍｍｏｌ）を加え、室温で振盪下一晩反応させた。得られた樹脂を濾別し、ＤＭＦ・メタノール・ジエチルエーテルで順次洗浄し真空乾燥させ、アミノ酸固定化樹脂（ｅ）９７７ｍｇを得た。この樹脂は、ニンヒドリン反応に陰性だった。
【００８５】
このようにして得られた樹脂（６．３ｍｇ）をピペリジン（０．４ｍｌ）と塩化メチレン（０．４ｍｌ）の混合液中、室温・振盪下で３０分反応後、メタノール（１．６ｍｌ）と塩化メチレン（７．６ｍｌ）で希釈し、３０１ｎｍでの吸光度を測定したところ、０．６９０であった。ジベンゾフルベンのピペリジン付加物の３０１ｎｍの分子吸光係数（ε＝７８００）より計算される、Ｆｍｏｃアミノ酸の導入率は０．１４ｍｍｏｌ／ｇであった。
【００８６】
（２）Ｃ−末端脱保護（反応Ｄ）
上記（１）で得られたＣ−末端にアリル基を有するアミノ酸固定化樹脂（ｅ：２１４ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）を無水脱酸素ＴＨＦ（５ｍｌ）に懸濁し、アルゴン気流下、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（１２ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）とジメドン（１２６ｍｇ，０．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間振盪して反応させた。樹脂を濾別し、ＴＨＦ・メタノール・ジエチルエーテルで順次洗浄した後、真空乾燥させ、カルボン酸樹脂（ｆ）を２１４ｍｇ得た。
【００８７】
（３）Ｃ−末端縮合によるＣ末端へのペプチド付加（反応Ｅ）
Ｃ−末端を脱保護したアミノ酸固定化樹脂（ｆ：２１４ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に懸濁・膨潤し、ＨＡＴＵ（３４ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（３１μｌ，０．１８ｍｍｏｌ）及びフェニルアラニル アラニンメチルエステル塩酸塩（ＨＣｌ・Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｏｍｅ：２１ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１晩振盪して反応させた。樹脂を濾別し、ＤＭＦ・メタノール・ジエチルエーテルで順次洗浄した後、真空乾燥させ、トリペプチド樹脂（ｇ）を２１８ｍｇ得た。
【００８８】
（４）Ｎ−末端順次伸長（反応Ｆ）
上記（３）で得られたトリペプチド樹脂（ｇ：２１８ｍｍｏｌ，０．０３ｍｍｏｌ）をＰｉｏｎｅｅｒTMペプチド合成装置（モデル９０３０）にセットし、ＨＡＴＵ法（Carpino, L.A. et al., J. Am. Chem. Soc. 115:4397, 1993）に従ってＧｌｙ−ＯＨ（５９ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）、及びＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（１３０ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）を用いて内蔵Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｃｙｃｌｅプログラム（脱保護時間５分、カップリング時間６０分）により反応させた。最終段階は無水酢酸によるアセチルキャッピング反応を施した。プログラム終了後、反応器から樹脂を回収しメタノール・エーテルで順次洗浄した後、真空乾燥してヘキサペプチド樹脂（ｈ）を２２９ｍｇ得た。
【００８９】
（５）切出し反応（反応Ｇ）
ヘキサペプチド樹脂固定化樹脂（ｈ：２２９ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍｌ）に懸濁し、３０％過酸化水素水（０．２０ｍｌ）を加え、室温で１晩振盪して反応させた。樹脂を濾別し、濾液を半量まで濃縮した後、酢酸エチル−希亜硫酸水素ナトリウム水溶液で分配し、有機層を飽和食塩水で洗浄・乾燥後、濃縮して得られた残渣をＢｉｏｂｅａｄｓTM ＳＸ−３（米国Ｂｉｏｒａｄ社製）を充填したカラム（移動相トルエン−酢酸エチル１：１）で精製し、Ａｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−ΔＡｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｏｍｅ（ｉ）を２３ｍｇ（７７％）得た。得られた化合物（ｉ）の性質を以下に示す：
[α]D 22 -14.3°(c=1.00, CHCl3)
1H-NMR（CDCl3, selected） δ（H, s), 1.41 (3H, d, overlapped), 1.41 (3H, s), 1.42 (3H, s), 1.45 (9H, s), 2.08 (3H, s), 2.49 (3H, s), 2.56 (3H, s), 2.94 (3H, s), 3.69 (3H, s), 5.24 (1H, br.s), 6.33 (1H, br.s), 7.15-7.25 (5H, arom.).
上述したように、本発明のリンカーを用いてデヒドロペプチドを合成することができた。
【００９０】
【発明の効果】
本発明により、二重結合を有する化合物などの不安定な化合物を合成するためのリンカー及び該化合物の合成方法が提供される。本発明のリンカーは、特にデヒドロアミノ酸及びデヒドロペプチドの合成に好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のリンカーを用いた保護アミノ酸へのリンカー導入とペプチド合成の反応を示す図である。球はアミノエチル化樹脂を表す。
【図２】本発明のリンカーと保護アミノ酸との反応により得られるセレノエーテル及びデヒドロアミノ酸の収率を示す図である。
Claims (7)
- 以下のステップ：
（ａ）リンカーのセレノエート基と下記式（ＶＩ）：
で表される出発物質を反応させるステップであって、
ここでリンカーは、
下記式（ＩＩ）：
で表されるリンカーである、上記ステップ；
（ｂ）（ａ）に続いて、（ａ）における反応により得られた下記式：
で表される中間体の上記リンカー部分を固相支持体に固定するステップ；及び
（ｃ）上記中間体を酸化反応に付すことにより該固定化リンカーを除去するステップ；
を含む、下記式（ＩＶ）：
で表される二重結合を有する化合物の合成方法。 - リンカーが下記式（ＩＩＩ）：
で表される、請求項１記載の合成方法。 - 以下のステップ：
（ａ）リンカーのセレノエート基と保護アミノ酸とを連結するステップであって、
ここでリンカーは、
下記式（ＩＩ）：
で表されるリンカーである、上記ステップ；
（ｂ）（ａ）に続いて、（ａ）により得られた生成物の上記リンカー部分を固相支持体に固定するステップ；及び
（ｃ）（ｂ）に続いて、上記固定化リンカーに結合した保護アミノ酸を酸化反応に付すことにより該固定化リンカーを除去するステップ；
を含む、二重結合を有する化合物の合成方法。 - リンカーが下記式（ＩＩＩ）：
- 二重結合を有する化合物がデヒドロアミノ酸である、請求項３または４記載の合成方法。
- 以下のステップ：
（ａ）リンカーのセレノエート基と保護アミノ酸とを連結するステップであって、
ここでリンカーは、
下記式（ＩＩ）：
で表されるリンカーである、上記ステップ、
（ｂ）（ａ）に続いて、（ａ）により得られた生成物の上記リンカー部分を固相支持体に固定するステップ；
（ｃ）（ｂ）に続いて、以下のステップ（ｃ−１）及び／又は（ｃ−２）を行うステップ；
（ｃ−１）上記固定化リンカーに結合した保護アミノ酸のカルボキシル基を脱保護し、該 カルボキシル基に所望のアミノ酸又はペプチドを導入するステップ；
（ｃ−２）上記固定化リンカーに結合した保護アミノ酸のアミノ基を脱保護し、該アミノ基に所望の保護アミノ酸を導入して固定化リンカーに結合したペプチドを生成するステップであって、任意によりさらに該ペプチドのアミノ基を脱保護して該アミノ基に第２の保護アミノ酸を導入し、任意により上記脱保護及び保護アミノ酸の導入の工程を繰り返し行う、上記ステップ；並びに
（ｄ）（ｃ）に続いて、（ｃ）により生成された、固定化リンカーに結合したペプチドを酸化反応に付すことにより上記固定化リンカーを除去するステップ；
を含む、デヒドロペプチドの合成方法。 - リンカーが下記式（ＩＩＩ）：
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