CN102746383A - 一种戈舍瑞林的合成方法 - Google Patents

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杨鹤
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沈玲
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Abstract

本发明涉及一种戈舍瑞林的固相合成方法，所述方法是以RinkAmide MBHA Resin先与羰基二咪唑(CDI)反应得到一个中间产物，随后再和Fmoc-NH-NH2反应获得Fmoc-NH-NH-CO-NH-Resin，然后进行程序反应，依次进行缩合反应连接相应氨基酸，得到戈舍瑞林树脂；用低浓度的三氟乙酸溶液切割得到粗肽溶液，经纯化得到所述的戈舍瑞林。本发明通过一种高活性的反应物羰基二咪唑与Fmoc-NH-NH2、Rink Amide MBHA Resin反应获得Fmoc-NH-NH-CO-NH-Resin，大大提高了反应效率，使得该反应能够快速高效完成，彻底解决了Fmoc-NH-NH-CO-NH-Resin合成难的问题，有效的提高了反应效率和收率。

Description

一种戈舍瑞林的合成方法
技术领域
本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种戈舍瑞林多肽的固相合成方法。 
背景技术
戈舍瑞林(goserelin)的化学名为Pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2，其游离碱基分子式为C59H84N18O14，分子量为1269.42，上市药物中戈舍瑞林以醋酸盐形式存在。戈舍瑞林化学结构式如下所示： 
Figure BDA0000056707330000011
戈舍瑞林是促黄体生成释放激素(LHRH)的高活性衍生物，它可以抑制性激素的分泌(睾丸酮和雌二醇)，从而使激素敏感性肿瘤萎缩。适应症主要为： 
(1)前列腺癌：适用于可用激素治疗的前列腺癌； 
(2)乳腺癌：适用于可用激素治疗的绝经前期及围绝经期妇女的乳腺癌； 
(3)子宫内膜异位症：缓解症状包括减轻疼痛并减少子宫内膜损伤的大小和数目。 
戈舍瑞林有两个明显的结构特征：第一是肽端有一个Azgly(NH2-NH-COOH)结构；第二是6位的D-Ser上有一个t-Bu保护基团。这两个特征使得它的合成方法与传统的固相合成方法不一样，也直接导致了戈舍瑞林的高难度合成。 
US5602231中有关于合成戈舍瑞林的报道。专利中的方法是首先合成Fmoc-Azgly-OSu的活性酯，通过该活性酯与Rink Amide MBHAResin反应，得到Fmoc-NH-NH-CO-NH-Resin，然后依次连接相应的氨基酸。裂解时，通过低浓度的三氟乙酸/二氯甲烷溶液将树脂裂解下来。最后在高效液相色谱上用C18柱将其纯化。该方法采用Fmoc-Azgly-OSu与Rink Amide MBHA Resin反应，巧妙地解决了NH-NH-COOH的连接问题，但值得注意的是Fmoc-Azgly-OSu的反应活性较差，这直接导致了该反应效率低下，以至于反应过程不够彻底，或者需要很长反应时间和很多反应次数才能满足要求，大大浪费了时间和原料。况且Fmoc-Azgly-OSu的稳定性差、纯度低，产物中残留的DSC(N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯)也会与Rink AmideMBHA Resin反应，导致终产物纯度较低，给随后的纯化带来了严重的消极影响。 
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种操作更为简化、连接效率更高和合成成本更低的戈舍瑞林多肽的固相合成方法。 
多肽的固相合成方法有叔丁氧羰基(Boc)和芴甲氧羰基(Fmoc)两种N端保护策略。在C-端羧基肽的合成中，第一个N-端保护氨基酸与树脂的结合率的多少直接影响最终合成目标肽的产量。两种保护策略中，Fmoc采用的是碱液脱保护，比较稳定，而BOC采用的是酸液脱保护，稳定性差。现有的戈舍瑞林合成是采用Fmoc策略，先合成Fmoc-Azgly-OSu活性酯，通过该活性酯与Rink Amide MBHA Resin反应，得到Fmoc-NH-NH-CO-NH-Resin。但是由于Fmoc-Azgly-OSu的反应活性较差，这直接影响了最终合成戈舍瑞林多肽的产量和收率。 
本发明通过引入一个反应中间体来提高Rink Amide MBHA Resin与Fmoc保护的氨基酸的酰化效率。该方法包括如下的反应步骤： 
(1)、将Rink Amide MBHA Resin与N，N’-羰基二咪唑反应生成式(I)所示的中间体； 
(2)、将式(I)所示的中间体与Fmoc-NH-NH2反应获得Fmoc-NH-NH-CO-NH-Resin； 
(3)、以Fmoc-NH-NH-CO-NH-Resin为起始物进行固相合成，按照戈舍瑞林C端至N端的氨基酸序列依次连接具有保护基团的相应氨基酸，得到戈舍瑞林树脂； 
(4)、切肽，使戈舍瑞林从树脂上脱落，经纯化制备得到戈舍瑞林。 
本发明的创新之处在于引入N，N’-羰基二咪唑(N，N’-Carbonyldiimidazole；CDI)作为反应中间体，其结构如下所示： 
Figure BDA0000056707330000041
由于N，N’-羰基二咪唑的反应活性非常高，与Rink Amide MBHAResin反应生成的中间体反应活性也很高，能快速与Fmoc-NH-NH2反应获得Fmoc-NH-NH-CO-NH-resin，从而使整个反应过程能够快速、彻底完成，提高了反应的总体效率和收率。 
本发明以Rink Amide MBHA Resin为起始原料制备得到Fmoc-NH-NH-CO-NH-Resin，再按照固相合成的方法依次连接相应氨基酸，获得戈舍瑞林九肽树脂，期间依次脱去Fmoc-保护基团，然后切肽，获得粗品，粗品经C18柱分离纯化，制得戈舍瑞林三氟乙酸盐，然后经阴离子交换树脂换盐得到戈舍瑞林醋酸盐。 
所述的固相合成步骤为加入脱帽试剂脱去前一中间态树脂上的Fmoc-保护基团，然后加入用接肽试剂溶解的带Fmoc保护基团的氨基酸，经连接反应获得带有Fmoc保护基团的中间态树脂，最后连接上Glp即得戈舍瑞林树脂。其中，带保护基团的氨基酸的摩尔数为中间态树脂的2～6倍，所述的脱帽试剂优选为PIP∶DMF＝1∶2～5，所述的接肽试剂优选为DIC∶DMF＝1∶3～20，中间态树脂的重量与 脱帽试剂的加入体积的比例为1∶5～1∶20。 
合成戈舍瑞林时，丝氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸的支链基团都没有进行保护，完全裸露，最后通过裂解后的粗肽与水合肼的反应除去丝氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸的支链在反应过程中可能连接上的基团。 
具体地，按照本发明依次连接具有保护基团的氨基酸，获得戈舍瑞林九肽树脂，期间依次脱去Fmoc-保护基团的方法包括如下步骤： 
1)、Fmoc-NH-NH-CO-NH-Resin的制备 
将Rink Amide MBHA Resin放于多肽合成反应器中，二氯甲烷溶胀。加入脱帽试剂，20～30℃反应5～60分钟，抽干，DMF洗涤，抽干。加入羰基二咪唑，室温反应0.5～3小时，抽干，DMF洗涤，抽干。加入Fmoc-NH-NH2，室温反应0.5～3小时，抽干，DMF洗涤，抽干。 
所说的Rink Amide MBHA Resin取代度为：0.5～1.1mmol/g； 
所说的脱帽试剂为：PIP∶DMF＝1∶2～5，下同； 
其中： 
Rink Amide MBHA Resin的重量与二氯甲烷的加入体积的比例为1∶5～1∶20； 
羰基二咪唑、Fmoc-NH-NH2的摩尔数为树脂的1～5倍； 
Rink Amide MBHA树脂的重量与脱帽试剂的加入体积的比例为1∶5～1∶20。 
2)、制备Fmoc-Pro-NH-NH-CO-NH-resin 
在步骤(1)的Fmoc-NH-NH-CO-NH-resin中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，抽干，DMF洗涤，抽干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Pro的混合物，20～30℃反应0.5～2小时，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Pro-NH-NH-CO-NH-resin； 
所说的接肽试剂为：DIC∶DMF＝1∶3～20，下同； 
混合物中： 
Fmoc-NH-NH-CO-NH-resin的重量与DMF的加入体积的比例为1∶5～1∶20； 
Fmoc-Pro的摩尔数为树脂的2～6倍； 
Fmoc-NH-NH-CO-NH-resin的重量与脱帽试剂的加入体积的比例为1∶5～1∶20。 
其余操作以及工艺条件同上； 
3)、制备Fmoc-Arg·HCl-NH-NH-CO-NH-resin 
在步骤(2)的Fmoc-Pro-NH-NH-CO-NH-resin中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，抽干，DMF洗涤，抽干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Arg·HCl的混合物，20～30℃反应0.5～3小时，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Arg·HCl-NH-NH-CO-NH-resin； 
混合物中： 
Fmoc-Pro-NH-NH-CO-NH-resin与DMF的加入体积的比例为1∶5～1∶20； 
Fmoc-Arg·HCl的摩尔数为树脂的3～10倍； 
Fmoc-Pro-NH-NH-CO-NH-resin的重量与脱帽试剂的加入体积的 比例为1∶5～1∶20。 
其余操作以及工艺条件同上； 
在上述的Fmoc-Arg·HCl-NH-NH-CO-NH-resin中，加入酸化试剂，20～30℃反应1～10分钟，抽干，DMF洗涤，抽干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Arg·HCl的混合物，20～30℃反应0.5～3小时，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Arg·HCl-NH-NH-CO-NH-resin； 
所说的酸化试剂为：HOBt∶DMF＝1∶10～100，下同； 
混合物中： 
Fmoc-Arg·HCl-NH-NH-CO-NH-resin的与DMF的加入体积的比例为1∶5～1∶20； 
Fmoc-Arg·HCl的摩尔数为树脂的2～10倍； 
Fmoc-Arg·HCl-NH-NH-CO-NH-resin的重量与脱帽试剂的加入体积的比例为1∶5～1∶20。 
其余操作以及工艺条件同上； 
4)、制备Fmoc-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin 
在步骤(3)的Fmoc-Arg·HCl-NH-NH-CO-NH-resin中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，抽干，DMF洗涤，抽干。加入酸化试剂，20～30℃反应1～10分钟，抽干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Leu的混合物，20～30℃反应0.5～2小时，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin； 
混合物中： 
Fmoc-Arg·HCl-NH-NH-CO-NH-resin与DMF的加入体积的比例 为1∶5～1∶20； 
Fmoc-Leu的摩尔数为树脂的2～6倍； 
Fmoc-Arg·HCl-NH-NH-CO-NH-resin的重量与脱帽试剂的加入体积的比例为1∶5～1∶20。 
其余操作以及工艺条件同上； 
5)、制备Fmoc-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin 
在步骤(4)的Fmoc-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，抽干，DMF洗涤，抽干。加入酸化试剂，20～30℃反应1～10分钟，抽干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Ser(t-Bu)的混合物，20～30℃反应0.5～2小时，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin； 
混合物中： 
Fmoc-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin与DMF的加入体积的比例为1∶5～1∶20； 
Fmoc-Ser(t-Bu)的摩尔数为树脂的2～6倍； 
Fmoc-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin的重量与脱帽试剂的加入体积的比例为1∶5～1∶20。 
其余操作以及工艺条件同上； 
6)、制备Fmoc-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin 
在步骤(5)的Fmoc-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，抽干，DMF洗涤，抽干。 加入酸化试剂，20～30℃反应1～10分钟，抽干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Tyr的混合物，20～30℃反应0.5～2小时，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin； 
混合物中： 
Fmoc-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin与DMF的加入体积的比例为1∶5～1∶20； 
Fmoc-Tyr的摩尔数为树脂的2～6倍； 
Fmoc-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin的重量与脱帽试剂的加入体积的比例为1∶5～1∶20。 
其余操作以及工艺条件同上； 
7)、制备Fmoc-Ser-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin 
在步骤(6)的Fmoc-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，抽干，DMF洗涤，抽干。加入酸化试剂，20～30℃反应1～10分钟，抽干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Tyr的混合物，20～30℃反应0.5～2小时，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Ser-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin； 
混合物中： 
Fmoc-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin的与DMF的加入体积的比例为1∶5～1∶20； 
Fmoc-Ser的摩尔数为树脂的2～6倍； 
Fmoc-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin的重量与脱帽试剂的加入体积的比例为1∶5～1∶20。。 
其余操作以及工艺条件同上； 
8)、制备Fmoc-Trp-Ser-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin 
在步骤(7)的Fmoc-Ser-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，抽干，DMF洗涤，抽干。加入酸化试剂，20～30℃反应1～10分钟，抽干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Tyr的混合物，20～30℃反应0.5～2小时，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Trp-Ser-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin； 
混合物中： 
Fmoc-Ser-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin与DMF的加入体积的比例为1∶5～1∶20； 
Fmoc-Trp的摩尔数为树脂的2～6倍； 
Fmoc-Ser-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin的重量与脱帽试剂的加入体积的比例为1∶5～1∶20。。 
其余操作以及工艺条件同上； 
9)、制备Fmoc-His(Fmoc)-Trp-Ser-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin 
在步骤(8)的Fmoc-Trp-Ser-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO -NH-resin中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，抽干，DMF洗涤，抽干。加入酸化试剂，20～30℃反应1～10分钟，抽干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Tyr的混合物，20～30℃反应0.5～2小时，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-His(Fmoc)-Trp-Ser-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin； 
混合物中： 
Fmoc-Trp-Ser-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin与DMF的加入体积的比例为1∶5～1∶20； 
Fmoc-His(Fmoc)的摩尔数为树脂的2～6倍； 
Fmoc-Trp-Ser-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg·HCl-NH-NH-CO-NH-resin的重量与脱帽试剂的加入体积的比例为1∶5～1∶20。 
其余操作以及工艺条件同上； 
10)、制备Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin 
在步骤(9)的Fmoc-His(Fmoc)-Trp-Ser-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，抽干，DMF洗涤，抽干。加入酸化试剂，20～30℃反应1～10分钟，抽干。加入用接肽试剂溶解的Glp的混合物，20～30℃反应0.5～2小时，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin； 
混合物中： 
Fmoc-His(Fmoc)-Trp-Ser-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin与DMF的加入体积的比例为1∶5～1∶20； 
Glp的摩尔数为树脂的2～6倍； 
Fmoc-His(Fmoc)-Trp-Ser-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin的重量与脱帽试剂的加入体积的比例为1∶5～1∶20。 
其余操作以及工艺条件同上； 
按照本发明，所说的切肽包括如下步骤：将上述步骤(10)所获得的Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin用低浓度的三氟乙酸/二氯甲烷溶液切割，使戈舍瑞林从树脂上脱落。低浓度三氟乙酸/二氯甲烷溶液浓度可为0.1-10％，优选为0.1-3％。切割次数可为1-5次，每次5-10min。将切割液合并，旋转蒸发至干。加入少量的水合肼，20～30℃反应1-3小时，得到戈舍瑞林粗品。 
按照本发明，粗品纯化的方法包括如下步骤： 
将切割液过滤，滤液经C18柱纯化即可得戈舍瑞林。进一步的，可再进行阴离子交换树脂换盐，样品溶液冻干，获得戈舍瑞林醋酸盐，总收率为20％，纯度在95％以上。 
本发明提供了一种反应活性很高的中间体，并且该活性中间体合成简单、反应活性高，它能与Rink Amide MBHA树脂快速、高效反应，完全能够解决Azgly的连接难题。 
附图说明
图1为经C18柱纯化并换盐后的戈舍瑞林醋酸盐的HPLC检测图谱，样品纯度为98.5％。 
具体实施方式
实施例1制备Fmoc-NH-NH-CO-NH-Resin 
实施例中以及前述过程中所采用原材料的简称和全称如下： 
  Arg   arginine
  Azgly   NH-NH-COOH(azaglycine)
  D-Ser   D-serine
  Glp   pyroglutamic acid
  His   histidine
  Leu   leucine
  Pro   proline
  Ser   serine
  Trp   tryptophan
  Tyr   tyrosine
  DIC   di-isopropylcarbodi-imide
  DMF   N，N-dimethylformamide
  t-Bu   tert-butyl
  DSC   diduccinimido carbonate
  Su   succinimido
[0112] 
  Pip   piperidine
  HOBt   N-Hydroxybenzotrizole
实施例中： 
所说的接肽试剂如下：DIC∶DMF＝1∶10，体积比； 
所说的脱帽试剂如下：PIP∶DMF＝1∶4，体积比； 
所说的酸化试剂为：HOBt∶DMF＝1∶20，下同； 
1)取1g Rink Amide MBHA(0.5mmol/g，0.5mmol)树脂放于多肽合成反应器中，用10ml二氯甲烷浸泡，使树脂充分溶胀溶胀，抽干。 
2)加5ml脱帽试剂，25℃反应15分钟，抽干，用DMF洗涤五次，抽干。 
3)加入羰基二咪唑，5ml DMF，25℃反应60分钟。 
4)抽干，用DMF洗涤三次，抽干。 
5)加入Fmoc-NH-NH2，5ml DMF，25℃反应60分钟。 
6)抽干，用DMF洗涤三次，抽干。 
实施例2制备Fmoc-Pro-NH-NH-CO-NH-resin 
1)加10ml脱帽试剂，25℃反应15分钟，抽干，用DMF洗涤五次，抽干。 
2)加Fmoc-Pro，加3ml接肽试剂，25℃反应60分钟。 
3)抽干，用DMF洗涤三次，抽干。 
实施例3制备Fmoc-Arg·HCl-NH-NH-CO-NH-resin 
1)加10ml脱帽试剂，25℃反应15分钟，抽干，用DMF洗涤五次，抽干。 
2)加Fmoc-Arg·HCl，加3ml接肽试剂，25℃反应90分钟。 
3)抽干，用DMF洗涤三次，抽干。 
4)加10ml脱帽试剂，25℃反应15分钟，抽干，用DMF洗涤五次，抽干。 
5)加5ml酸化试剂，反应5分钟。 
6)加Fmoc-Arg·HCl，加3ml接肽试剂，25℃反应90分钟。 
7)抽干，用DMF洗涤三次，抽干。 
实施例4制备Fmoc-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin 
1)加10ml脱帽试剂，25℃反应15分钟，抽干，用DMF洗涤五次，抽干。 
2)加5ml酸化试剂，反应5分钟。 
3)加Fmoc-Leu，加3ml接肽试剂，25℃反应60分钟。 
4)抽干，用DMF洗涤三次，抽干。 
实施例5制备Fmoc-D-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin 
1)加10ml脱帽试剂，25℃反应15分钟，抽干，用DMF洗涤五次，抽干。 
2)加5ml酸化试剂，反应5分钟。 
3)加Fmoc-D-Ser(t-Bu)，加3ml接肽试剂，25℃反应60分钟。 
4)抽干，用DMF洗涤三次，抽干。 
实施例6制备Fmoc-Tyr-D-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin 
1)加10ml脱帽试剂，25℃反应15分钟，抽干，用DMF洗涤五次，抽干。 
2)加5ml酸化试剂，反应5分钟。 
3)加Fmoc-Tyr，加3ml接肽试剂，25℃反应60分钟。 
4)抽干，用DMF洗涤三次，抽干。 
实施例7制备Fmoc-Ser-Tyr-D-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin 
1)加10ml脱帽试剂，25℃反应15分钟，抽干，用DMF洗涤五次，抽干。 
2)加5ml酸化试剂，反应5分钟。 
3)加Fmoc-Ser，加3ml接肽试剂，25℃反应60分钟。 
4)抽干，用DMF洗涤三次，抽干。 
实施例8制备Fmoc-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin 
1)加10ml脱帽试剂，25℃反应15分钟，抽干，用DMF洗涤五次，抽干。 
2)加5ml酸化试剂，反应5分钟。 
3)加Fmoc-Trp，加3ml接肽试剂，25℃反应60分钟。 
4)抽干，用DMF洗涤三次，抽干。 
实施例9制备Fmoc-His(Fmoc)-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin 
1)加10ml脱帽试剂，25℃反应15分钟，抽干，用DMF洗涤五次，抽干。 
2)加5ml酸化试剂，反应5分钟。 
3)加Fmoc-His(Fmoc)-OH，加3ml接肽试剂，25℃反应60分钟。 
4)抽干，用DMF洗涤三次，抽干。 
实施例10制备Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(t-Bu)-Leu-Arg-NH-NH-CO-NH-resin 
1)加10ml脱帽试剂，25℃反应15分钟，抽干，用DMF洗涤五次，抽干。 
2)加5ml酸化试剂，反应5分钟。 
3)加Glp-OH，加3ml接肽试剂，25℃反应60分钟。 
实施例11切肽 
将树脂加入50ml圆底烧瓶中，加入200μl三氟乙酸和10ml二氯甲烷，室温反应三分钟，过滤，滤液接收瓶中提前加入800μl三 乙胺，重复三次。树脂用二氯甲烷、甲醇依次洗涤，洗涤液和滤液混合，并将其蒸干。将蒸干物用甲醇溶解，再次蒸干。最后，将蒸干物溶于20ml水中，加入水合肼100μl，室温反应2小时。 
实施例12分离纯化 
1.样品处理：肽树脂用2％三氟乙酸/二氯甲烷裂解，Φ＝0.45μm滤膜过滤，收集滤液备用。 
2.纯化条件：以C18为色谱柱，柱子直径和长度为：5cm×25cm。流动相：A相：0.05％三氟乙酸水溶液；B相：乙腈。流速：50-60ml/min。检测波长：240nm。梯度：B％：25％-45％(40min)。进样量为1.5-2.0g。 
纯化过程：将色谱柱用80％乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为35-45ml样品溶液。线性梯度洗脱40min，收集目标峰，将收集的目标肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约55-65mg/ml后备用。 
3.转盐：色谱柱填料为阴离子交换树脂：Amberlite IRA-400，柱子直径和长度为：5cm×25cm。流动相：0.03-0.1％醋酸水溶液。流速：50-60ml/min。检测波长：240nm。进样量为1.5-2.0g。 
转盐过程：将色谱柱用去离子水平衡后上样，上样量为30-40ml样品溶液。0.03-0.1％醋酸水溶液洗脱60min，收集目标峰，将收集的目标肽溶液合并，于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约90-100mg/ml。冷冻干燥后即可得到戈舍瑞林醋酸盐，纯化收率45.1％。经HPLC分析(图1)，纯度为98.5％。 

Claims (10)

1.一种戈舍瑞林的固相合成方法，包括如下的反应步骤：
(1)、将Rink Amide MBHA Resin与N，N’-羰基二咪唑反应生成式(I)所示的中间体；
Figure FDA0000056707320000011
(2)、将式(I)所示的中间体与Fmoc-NH-NH2反应获得Fmoc-NH-NH-CO-NH-Resin；
(3)、以Fmoc-NH-NH-CO-NH-Resin为起始物进行固相合成，按照戈舍瑞林C端至N端的氨基酸序列依次连接具有保护基团的相应氨基酸，得到戈舍瑞林树脂；
(4)、切肽，使戈舍瑞林从树脂上脱落，经纯化制备得到戈舍瑞林。
2.根据权利要求1所述的固相合成方法，其特征在于：所述方法步骤(1)中，Rink Amide MBHA Resin和N，N’-羰基二咪唑在室温下反应0.5～3小时，N，N’-羰基二咪唑的摩尔数为Rink Amide MBHA Resin的1～5倍。
3.根据权利要求1所述的固相合成方法，其特征在于：所述方法步骤(2)中，式(I)所示的中间体和Fmoc-NH-NH2在室温下反应0.5～3小时，Fmoc-NH-NH2的摩尔数为式(I)所示的中间体1～5倍。
4.根据权利要求1所述的固相合成方法，其特征在于：所述方法步骤(3)中，所述的固相合成步骤为加入脱帽试剂脱去前一中间态树脂上的Fmoc-保护基团，然后加入用接肽试剂溶解的带Fmoc保护基团的氨基酸，经连接反应获得带有Fmoc保护基团的中间态树脂，最后连接上Glp即得戈舍瑞林树脂。
5.根据权利要求4所述的固相合成方法，其特征在于：所述方法步骤(3)中，带保护基团的氨基酸的摩尔数为中间态树脂的2～6倍。
6.根据权利要求4所述的固相合成方法，其特征在于：所述方法步骤(3)中，，所述的脱帽试剂为PIP∶DMF＝1∶2～5。
7.根据权利要求4所述的固相合成方法，其特征在于：所述方法步骤(3)中，中间态树脂的重量与脱帽试剂的加入体积的比例为1∶5～1∶20。
8.根据权利要求4所述的固相合成方法，其特征在于：所述方法步骤(3)中，所述的接肽试剂为DIC∶DMF＝1∶3～20。
9.根据权利要求1所述的固相合成方法，其特征在于：所述方法步骤(4)中，切肽过程为将戈舍瑞林树脂用低浓度的三氟乙酸/二氯甲烷溶液切割，使戈舍瑞林从树脂上脱落。
10.根据权利要求1所述的固相合成方法，其特征在于：所述方法步骤(4)中，纯化过程将切割后的戈舍瑞林粗品经C18柱分离获得戈舍瑞林。
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