CN102127146B - 一种制备醋酸阿托西班的方法 - Google Patents

一种制备醋酸阿托西班的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种制备醋酸阿托西班的方法，包括以下步骤：合成获得线性阿托西班；将线性阿托西班溶于乙腈水溶液中，用氨水调节pH，加入H2O2氧化，过滤,纯化，转盐，得到醋酸阿托西班。本发明提出了一条较适当的路线，使用固相法合成线性阿托西班，且通过液相氧化得到阿托西班，该方法解决了线性阿托西班难溶问题,最大可能的缩小了反应体积及减少了反应时间,该方法收率高,易工业化。

Description

一种制备醋酸阿托西班的方法
技术领域
本发明涉及一种多肽药物的制备方法，尤其涉及醋酸阿托西班的制备方法。
背景技术
阿托西班，英文名:Atosiban, 阿托西班是一个九肽，肽链中包含三个非天然氨基酸D-Tyr(Et),Mpa和Orn及一对在Mpa与Cys之间成环的二硫键,其结构式:
c[Mpa-D-Tyr(Et)-IIe-Thr-Asn-Cys]-Pro-Orn-Gly-NH2。
阿托西班是一种可以直接与催产素竞争催产素受体，抑制催产素和催产素受体结合，从而直接抑制催产素作用于子宫，抑制子宫收缩; 也可以抑制磷脂酰肌醇的水解作用，阻断第二信使的生成以及Ca2+的活动，从而间接抑制子宫对催产素的反应，使子宫收缩得到抑制。
目前国内外均有报道关于阿托西班合成工艺方法；国内最近也用相关报道,采用固相氧化,简化了工艺,但所得粗品纯度低,收率不高, 应用价值不高。国外关于阿托西班合成工艺的报道，大多是采用Boc固相合成路线,液氨切肽，再采用液相氧化,纯化得醋酸阿托西班,其操作复杂，产生大量三废,不利于工业生产,见专利US4504469。
发明内容
本发明提出了一条较适当的路线，使用合成线性阿托西班，且通过液相氧化得到阿托西班，该方法解决了线性阿托西班难溶问题,最大可能的缩小了反应体积及减少了反应时间 ,该方法收率高,易工业化。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种制备醋酸阿托西班的方法，包括以下步骤：
合成获得线性阿托西班；
将线性阿托西班溶于乙腈水溶液中,用氨水调节pH,加入H2O2氧化，过滤,纯化，转盐,得到醋酸阿托西班。
所述的“合成获得”，是指液相合成法或固相合成法获得线性阿托西班。优选固相合成法，由Fmoc-Gly -OH和合适替代度的氨基树脂出发，然后采用逐一偶联的方式合成得到线性阿托西班- 树脂；然后用TFA和H2O混合的裂解液将线性阿托西班- 树脂加入进行裂解切割, 沉淀得到线性阿托西班；其中，氨基树脂优选Rink amide 树脂,其替代度优选为0.4mmol/g —1.0mmol/g。所述固相合成法采用的偶联剂包括DIC/HOBt、PyBOP/HOBt、HATU/HOBt或HBTU/HOBt，优选DIC/HOBt。实验发现，本发明的偶联剂能够明显提高反应速率,同时DIC/HOBt偶联体系极大的降低生产成本。其中“/”表示“和”的含义。所述裂解切割线性阿托西班- 树脂是由线性阿托西班- 树脂经过体积比为TFA:H2O=95:5的混合裂解液切割。裂解液用量是每克线性阿托西班-树脂用10-15ml的裂解液。
线性肽氧化可采用液相氧化或固相氧化，传统的液相反应体积大,时间长,不易操作; 固相氧化一般采用碘氧化,固相法可以操作方便，但易产生三废。
本发明采用了H2O2为氧化剂的液相氧化，本发明直接简化了生产工艺，最大可能的减少了反应体积及氧化时间。
将得到的线性阿托西班溶于乙腈水溶液中,用氨水调节PH值,加入H2O2氧化后过滤,再经过纯化、转盐，冻干得到醋酸阿托西班。
液相氧化采用乙腈的水溶液, 乙腈占的体积的 5%-15%,优选10%。线性阿托西班不易溶于水中,采用水为溶剂时反应体积大,本发明采用乙腈的水溶液极大的提高了线性阿托西班的溶解度,可以使反应体积减半。
液相氧化采用线性阿托西班浓度为0.01-0.03g/ml,优选0.02g/ml。线性阿托西班浓度直接影响氧化时多聚体的产生,浓度小于0.01g/ml给工业化带了操作上的不方便,浓度大于0.03g/ml时,发现性肽分子间发生聚合,并且不易过滤。
液相氧化采用H2O2为氧化剂, H2O2 用量与线性阿托西班的摩尔比为2-8，即氧化剂H2O2 用量是线性阿托西班摩尔数的2至8倍,优选5倍。实验证明适量的H2O2可以加快氧化速度,并减少聚合物的产生。
液相氧化采用H2O2为氧化剂，反应时间在5-60分钟，优选30分钟。实验发现,在氧化时间小于5分钟,线性肽还有大量未氧化成环肽,而氧化时间大于60分钟,则发现部分线性肽之间成环,形成聚合物。本发明的氧化时间优选30分钟,粗品纯度大于85%。
液相氧化采用H2O2为氧化剂，反应温度在10℃—40℃。优选25℃。实验发现反应温度低于10℃时,氧化反应收率不及50%,而反应温度大于40℃时,发现氨基酸极易发生消旋,产生难以分离的杂质肽。本发明的氧化反应温度优选为25℃,在减少了氨基酸消旋的同时,还提高了氧化收率及反应速率。
液相氧化采用30%的氨水调节溶液PH,PH值范围在8-9。
液相氧化完毕后直接后硅藻土过滤后再经滤液膜过滤,滤液用制备型反相HPLC(C18或C8柱)进行纯化,转盐,冻干得醋酸阿托西班。                                                                              
本发明采用了H2O2液相氧化线性阿托西班,避免了传统的液相氧化带来操作上的繁琐,并提高20%-30%的氧化收率。本发明工艺具有反应操作简单、原料投入少、成本低、收率较高等特点并且大幅度的减少了粗品不溶物的产生，反应的合成收率可达68%，具有可观的经济实用价值。
本发明中涉及的缩写具有以下含义:
Fmoc-:芴甲氧羰基
Gly: 甘氨酸
Orn:鸟氨酸 
Pro:脯氨酸,
    Cys:半胱氨酸
Asn:天冬酰胺
Thr:苏氨酸
IIe:异亮氨酸 
Tyr:酪氨酸
Mpa:巯基丙酸
Boc:叔丁氧羰基
Trt:三苯甲基
tBu:叔丁基
Et:乙基
HOBt: 1-羟基苯并三氮唑
DIC: 二异丙基碳二亚胺
TFA:三氟乙酸
PyBOP:六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三吡咯烷基磷
HBTU: 苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲脲六氟磷酸酯
H2O2: 双氧水
DMF:N,N-二甲基甲酰胺
DCM:二氯甲烷
具体实施方式
实施例1、线性阿托西班肽树脂制备
①将6.25g Rink Amide 树脂（替代度=0.8mmol/g）于反应瓶中，加入DMF洗涤两次，再用DMF溶胀30分钟。用30-40ml 20%DBLK脱除Rink Amide 树脂的Fmoc保护基，脱除完毕用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，并用茚三酮检测法进行检测，树脂呈红褐色。
②称取4.46g Fmoc-Gly-OH和2.43g HOBt，加入适量DMF 和3.05ml DIC，溶解，加入反应瓶中，反应2h，并用茚三酮检测法进行检测树脂呈阴性,结束反应，DMF洗涤4次,DCM洗涤2次,假若树脂呈阳性则重复上面缩合反应直到反应呈阴性。
③依次偶联Fmoc-Orn(Boc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-IIe-OH, Fmoc-D-Tyr(ET)-OH, Mpa(Trt)-OH。
实施例2、线性阿托西班肽树脂的切割
将实施例1中得到的线性阿托西班肽树脂,用30ml甲醇洗涤3次,干燥, 将得到的干燥树脂加入到150ml的体积比为TFA:H20=95:5的混合液中,在25℃下反应2小时, 过滤，树脂用少量三氟乙酸洗涤3次，合并滤液，将滤液倒入1500ml冰乙醚中，静置2小时，离心分离出线性阿托西班，洗涤3次，置于真空干燥器干燥得线性阿托西班5.15g,MS:995.3, HPLC:91.5%,含量65.5%,合成收率68%。
实施例3、线性阿托西班肽树脂的氧化
将实施例2中得到的线性阿托西班溶解在250ml的5%乙腈的水溶液中，用30%的氨水调节pH在8-9,滴加0.60g H2O2,在25℃下反应10分钟,用HPLC监测, HPLC:75.6%，反应结束后过滤,滤液用制备型反相HPLC(C18或C8柱)进行纯化,转盐,冻干得醋酸阿托西班,得2.85g,MS:994.5,HPLC:99.4%。
实施例4、线性阿托西班肽树脂的氧化
将实施例2中得到的线性阿托西班溶解在250ml的10%乙腈的水溶液中，用30%的氨水调节pH在8-9,滴加0.85g H2O2,在25℃下反应30分钟,用HPLC监测, HPLC:89.5%，反应结束后过滤,滤液用制备型反相HPLC(C18或C8柱)进行纯化,转盐,冻干得醋酸阿托西班,得3.01g,MS:994.5,HPLC:99.6%。
实施例5、线性阿托西班肽树脂的氧化
将上述实施例2中得到的线性阿托西班溶解在250ml的10%乙腈的水溶液中，用30%的氨水调节pH在8-9,滴加0.85g H2O2,在25℃下反应60分钟,用HPLC监测, HPLC:83.5%，反应结束后过滤,滤液用制备型反相HPLC(C18或C8柱)进行纯化,转盐,冻干得醋酸阿托西班,得2.95g,MS:994.5,HPLC:99.4%。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。。

Claims (1)

1.一种制备醋酸阿托西班的方法，包括以下步骤：
1）合成获得线性阿托西班；
2）将线性阿托西班溶于乙腈水溶液中，用氨水调节pH值为8-9，加入H2O2氧化，经硅藻土过滤后再经滤膜过滤，滤液用反相HPLC进行纯化，转盐，冻干得醋酸阿托西班；所述的线性阿托西班的浓度为0.01-0.03g/ml；H2O2 用量与线性阿托西班用量的摩尔比为2至8；所述的乙腈水溶液，其中乙腈的体积浓度为5%-15%；所述H2O2氧化，氧化时间为5-60分钟；反应温度为10-40℃。
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