CN104098650B - 阿托西班的中间体的合成与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种阿托西班关键中间体的液相合成方法，即H‑Ile‑Thr（Bzl）‑Asn‑Cys（Bzl）‑Pro‑OH的制备方法。采用此液相接肽合成方法，反应易监测，较固相合成法成本低，更适合大规模工业化生产。主要合成步骤：采用BSA保护脯氨酸，通过N‑羟基琥珀酰亚胺酯法在脯氨酸N端逐个连接S‑苄基半胱氨酸、天冬酰胺、苄基保护的苏氨酸和异亮氨酸，得到五肽中间体。

Description

阿托西班的中间体的合成与应用
技术领域
本发明涉及一种合成阿托西班五肽中间体的液相合成方法，以及该关键中间体在制备阿托西班中的应用。
背景技术
阿托西班是由辉凌公司（Ferring AB）研制，其结构如下（Ⅱ），是子宫内及蜕膜、胎膜上受体的环状催产素抑制剂，于2000年3月首次在奥地利上市。使用后可剂量相关性地抑制宫缩，并使环状肽催产素介导的前列腺素分泌减少，达到保胎目的。
目前阿托西班的合成多采用固相合成方法，例如使用Rink Amide树脂为载体，脱Fmoc-保护后得到H2N-Rink Amide树脂，以HOBt、DIPCI等为缩合剂，将Fmoc-Gly-OH的羧基与树脂氨基相连，得到Fmoc-Gly。再采用Fmoc策略依次固相合成序列剩余氨基酸。用裂解试剂切割得到阿托西班。相似固相合成方法见专利EP0710243、CN101357937A、CN101696236A。固相合成方法存在这样几个问题：制备量少、设备复杂、需要使用大量的树脂和洗涤溶剂等。
本发明使用液相合成法制备阿托西班的关键中间体：H-Ile-Thr（Bzl）-Asn-Cys（Bzl）-Pro-OH（结构I），可用于阿托西班的制备。进而解决了阿托西班通过液相合成法生产的技术问题。其中使用BSA作为脯氨酸羧基部分的保护基，使得氨基酸在依次接肽过程中，产率高，易处理，利于大规模工业生产。
发明内容
本发明的目的在于提供阿托西班五肽中间体的一种液相合成方法，进而实现阿托西班的液相合成，解决目前采用固相合成法成本高，反应不易监测，不适宜大规模化生产等问题。
本发明的技术解决方案是：
1、阿托西班五肽中间体的液相合成方法：
a.以脯氨酸为原料，使用BSA保护其羧基,再与N端保护的S-苄基半胱氨酸的活性酯连接,制得N-叔丁氧羰酰基-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸,再于酸性条件下脱去N端保护基得到S-苄基半胱酰氨-脯氨酸；
b.以S-苄基半胱酰氨-脯氨酸为原料，使用BSA保护脯氨酰的羧基部分，再与N端保护的天冬酰胺的活性酯连接，制得N-叔丁氧羰酰基-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸，再于酸性条件下脱去N端保护基得到天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸；
c.以天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸为原料，使用BSA保护脯氨酰的羧基部分，再与N端保护的O-苄基苏氨酸的活性酯连接，制得N-叔丁氧羰酰基-O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸，再于酸性条件下脱去N端保护基得到O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸；
d.以O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸为原料，使用BSA保护脯氨酰的羧基部分，再与N端保护的异亮氨酸的活性酯连接，制得N-叔丁氧羰酰基-异亮氨酰-O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸，再于酸性条件下脱去N端保护基得到异亮氨酰-O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸，即H-Ile-Thr（Bzl）-Asn-Cys（Bzl）-Pro-OH。
合成路线如下：
其中R1=Boc、Cbz、Trt、Mz
R2=OSu、ONb、OBt、OOBt、OAt。
步骤a、c、d中所述的N端保护基团优选的选自叔丁氧羰基（BOC）、苄氧羰基（Cbz）、三苯甲基（Trt）、对甲氧苄氧羰基（Mz）。
用酸脱除N端保护基时优选的酸选自包括三氟乙酸、盐酸、氢氟酸；所用溶剂包括：二氯甲烷、四氢呋喃、1,4-二氧六环。
步骤a、b、c、d中所述的氨基酸的相应活性酯优选的选自N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺酯、1-羟基苯骈三氮唑酯、3-羟基-4-氧-3，4-二氢-1，2，3-苯骈三氮唑酯、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑酯。
2、本发明优选的制备方法，其步骤如下：
（1）制备S-苄基半胱酰氨-脯氨酸
将BSA和L-脯氨酸加到无水二氯甲烷中，10～35℃下搅拌2～4h，滴入N-叔丁氧羰酰基-S-苄基半胱氨酸-（N-羟基）琥珀酰亚胺酯的二氯甲烷溶液，10～35℃下反应5～8h，减压蒸除溶剂，加乙醚，用5%的碳酸氢钠水溶液萃取；合并水相，加入柠檬酸调至PH5～7，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得淡黄色油状物，加入无水乙醚析出白色固体；将白色固体加至无水二氯甲烷中，0～15℃下搅拌滴加三氟乙酸至VCH2Cl2：VCF3COOH=1～5：1，搅拌反应2～5h，减压浓缩至干，得到淡黄色油状物，用乙酸乙酯/乙醚重结晶，得到白色固体；
（2）制备天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸
将S-苄基半胱酰氨-脯氨酸和BSA加到无水二氯甲烷中，10～35℃下搅拌3～4h，滴入N-叔丁氧羰酰基-天冬酰胺-（N-羟基）琥珀酰亚胺酯的二氯甲烷溶液，10～35℃下搅拌8～10h，减压蒸除溶剂，加乙醚，用5%的碳酸氢钠水溶液萃取；合并水相，加入柠檬酸调至PH5～7，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得淡黄色油状物，乙酸乙酯重结晶，得到的固体加至无水二氯甲烷中，0～15℃下搅拌滴加三氟乙酸至VCH2Cl2：VCF3COOH=1～5：1，10～35℃下搅拌反应2～5h，减压浓缩至干，得到淡黄色油状物，用乙酸乙酯/乙醚重结晶，得到白色固体；
（3）制备O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸
将天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸和BSA加到无水二氯甲烷中，10～35℃下搅拌3～4h，滴入N-叔丁氧羰酰基-O-苄基-苏氨酸-（N-羟基）琥珀酰亚胺酯的二氯甲烷溶液，10～35℃下搅拌6～8h，减压蒸除溶剂，加乙醚，用5%的碳酸氢钠水溶液萃取；合并水相，加入柠檬酸调至PH5～8，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得淡黄色油状物，乙酸乙酯重结晶，得到的固体加至无水二氯甲烷中，0～15℃下搅拌滴加三氟乙酸至VCH2Cl2：VCF3COOH=1～5：1，10～35℃下搅拌反应2～5h，减压浓缩至干，用甲醇/乙醚重结晶，得到白色固体；
（4）制备异亮氨酰-O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸
将O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸和BSA加到无水二氯甲烷中，10～35℃下搅拌3～4h，滴入N-叔丁氧羰酰基-异亮氨酸-（N-羟基）琥珀酰亚胺酯的二氯甲烷溶液，10～35℃下搅拌6～8h，减压蒸除溶剂，加乙醚，用5%的碳酸氢钠水溶液萃取；合并水相，加入柠檬酸调至PH5～8，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，得到的白色固体加至无水二氯甲烷中，0～15℃下搅拌滴加三氟乙酸至VCH2Cl2：VCF3COOH=1～5：1，10～35℃下搅拌反应2～5h，减压浓缩至干，用甲醇/乙醚重结晶，得到白色固体。
3、采用BSA作为脯氨酸羧基的保护基，与氨基酸反应迅速且完全，由于是中性硅烷化试剂，故不改变反应体系中的酸碱性；同时此保护基易于脱去，加入水即可分解且副产物溶于水，易与主产物进行分离；另外BSA来源广泛，价格便宜，常用于工业生产。
4、五肽中间体在制备阿托西班中的应用：五肽中间体在BSA的保护下与Mpa（Bzl）-D-Tyr（Et）-N3连接，再与H-Orn(z)-Gly-NH2在缩合剂DCC、添加剂HOBt作用下进行反应，得到的产物经液氨\钠脱去苄基，最后通过I2氧化，形成二硫键得到阿托西班。
有益技术效果：
本发明采用液相合成法，使用BSA作为脯氨酸保护基，从而制得阿托西班五肽中间体，所需设备简单，与固相合成法相比，具有很多优点：（1）不需要树脂和大大过量的保护氨基酸及缩合剂；（2）不需要大量的洗涤溶剂；（3）反应易于监测；（4）选取BSA作为保护基，其来源广，反应选择性好且易于脱除；（5）易于实现规模化生产，大大降低生产成本。
术语和简称：
Boc：叔丁氧羰基
Cbz：苄氧羰基
Trt：三苯甲基
Mz：对甲氧苄氧羰基
BSA：N，O-双（三甲基硅基）乙酰胺
IBCF：氯甲酸异丙酯
NMM：N-甲基吗啉
DCC：N,N’-二环己基碳二亚胺
EDCI：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
DIAD:偶氮二甲酸二异丙酯
TPP:三苯基膦
DIPCI:N，N′-二异丙基碳二亚胺
Mpa（Bzl）-D-Tyr（Et）-N3:N-[3-(苄巯基)丙酰]-O-乙基-D-酪氨酸酰叠氮
H-Orn(z)-Gly-NH2:N-苄氧羰基-鸟氨酰-甘氨酰胺
H-Ile-Thr（Bzl）-Asn-Cys（Bzl）-Pro-OH：异亮氨酰-O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
HOBt：1-羟基苯并三唑
HOSu：N-羟基琥珀酰亚胺
HONb：N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺
HOOBt：3-羟基-4-氧-3，4-二氢-1，2，3-苯骈三氮唑
HOAt：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
DIPEA：N，N’-二异丙基乙胺
TFA：三氟乙酸
THF:四氢呋喃
具体实施方式
下面结合具体的实施例来对本发明进行阐述。
制备例
制备例1 N-叔丁氧羰酰基-S-苄基半胱氨酸-（N-羟基）琥珀酰亚胺酯（a）
N-叔丁氧羰酰基-S-苄基半胱氨酸（20.0g，64.2mmol）和N-羟基琥珀酰亚胺（7.3g，64.2mmol）加至1,4-二氧六环（300ml）内，室温搅拌。控温于5℃左右，缓慢滴入DCC（14.5g，70.6mmol）的二氯甲烷（50ml）溶液,。室温搅拌2.5h，过滤，滤液减压浓缩至干。所得黄色油状物，用异丙醇重结晶，得类白色固体20.2g，收率77.0%。1H NMR(CDCl3)δ：1.49(s,9H);2.81(s,4H);
2.9(m,2H);3.80(s,2H);4.80(m,1H);5.24(d,1H,J=6.7Hz);7.32(m,5H)
制备例2 N-叔丁氧羰酰基-天冬酰胺-（N-羟基）琥珀酰亚胺酯（b）
N-叔丁氧羰酰基-天冬酰胺（10.0g，43.1mmol）和N-羟基琥珀酰亚胺（5.0g，43.1mmol）加至1,4-二氧六环（100ml）内。控温于10℃左右搅拌，缓慢滴入DCC（8.9g，43.16mmol）的二氯甲烷（10ml）溶液,室温搅拌12h，过滤，滤液减压浓缩至干。所得油状物，用异丙醇重结晶，得类白色固体10.4g，收率73.3%。1H NMR（DMSO-d6）δ:1.36(s,9H);2.64(m,2H);2.77(s,4H);4.72(m,1H);7.01(s,1H);7.47(s,1H)；7.51(d,1H,J=8.8Hz)
制备例3 N-叔丁氧羰酰基-O-苄基-苏氨酸-（N-羟基）琥珀酰亚胺酯（c）
N-叔丁氧羰酰基-O-苄基-苏氨酸（14.6g，47.3mmol）和N-羟基琥珀酰亚胺（5.4g，47.3mmol）加至1,4-二氧六环（130ml）内。控温于10℃左右搅拌，缓慢滴入DCC（9.8g，47.3mmol）的二氯甲烷（20ml）溶液,。室温搅拌4h，过滤，滤液减压浓缩至干。所得油状物，用乙酸乙酯-石油醚（4：1）重结晶，得类白色固体16.3g，收率84.8%。1H NMR（CDCl3）δ:1.31（d，3H，J=6.4Hz）；1.45(s,9H);2.85(s,4H);4.30（q,1H,J=6.8Hz）4.56(dd,2H,J=5.8Hz,12.8Hz);
4.71(d,1H，J=8.7Hz);5.35(d,1H,J=8.6Hz);7.30(m,5H)
制备例4 N-叔丁氧羰酰基-异亮氨酸-（N-羟基）琥珀酰亚胺酯（d）
N-叔丁氧羰酰基-异亮氨酸（9.6g，41.6mol）和N-羟基琥珀酰亚胺（4.8g，41.6mmol）加至1,4-二氧六环（100ml）内，搅拌至全溶。控温于10℃左右，缓慢滴入DCC（8.8g，42.5mmol）的二氯甲烷（10ml）溶液,。室温搅拌6h，过滤，滤液减压浓缩至干。所得油状物，用异丙醇重结晶，得类白色固体8.7g，收率63.7%。1H NMR（CDCl3）δ:0.97（t，3H,J=7.4Hz）;1.04(d,3H,J=6.7Hz);1.26～1.33(m,1H);1.57(s,9H);1.59(m,1H);1.92(m,1H);2.90(s,4H);4.63（m,1H）;5.01(d,1H,J=8.6Hz)
实施例
实施例1 S-苄基半胱酰氨-脯氨酸三氟乙酸盐（2）
步骤1 N-叔丁氧羰酰基-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸（1）
BSA（18.7ml，76.4mmol）和L-脯氨酸（3.7g，31.8mmol）加到无水二氯甲烷（200ml）中，室温搅拌2h，滴入化合物a（13.0g，31.8mmol）的二氯甲烷（30ml）溶液，室温搅拌，反应6h，减压蒸除溶剂，加乙醚（50ml），用5%的碳酸氢钠（50ml×3）水溶液萃取。合并水相，加入5%柠檬酸水溶液调至PH6，用乙酸乙酯（100ml×3）萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得淡黄色油状物，加入无水乙醚（20ml）析出白色固体7.0g，收率54.2%。ESI-MS(m/z):409.3[M+H]+;1H NMR(CDCl3)δ:1.45(s,9H);2.01(m,2H);2.16(m,2H);2.61～2.82(m,2H);3.42(m,1H);3.63(m,1H);3.72(s,2H);4.54(m,2H);5.39(d,1H,J=6Hz);7.32(m,5H)
步骤2 S-苄基半胱酰氨-脯氨酸三氟乙酸盐（2）
化合物1（7.0g，17.1mmol）加至无水二氯甲烷（25ml）中，搅拌下滴加三氟乙酸（12ml），控温于25℃下。减压浓缩至干，加入无水乙醚（20ml），析出类白色固体8.3g，收率92.9%。ESI-MS(m/z):309.3[M+H-CF3COOH]+;1H NMR(DMSO-d6)δ:1.86(m,3H);2.19(m,1H);2.72(m,1H);2.83(m,1H);3.43(m,1H);3.66(m,1H);3.83(s,2H);4.28(m,2H);7.33(m,5H);8.25(br,2H)。
实施例2 天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸三氟乙酸盐（4）
步骤1 N-叔丁氧羰酰基-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸（3）
化合物2（7.3g，22.4mmol）和BSA（11.9ml，48.8mmol）加到无水二氯甲烷（100ml）中，室温搅拌3h，滴入化合物b（8.6g，20.4mmol）的二氯甲烷（10ml）溶液，室温搅拌6h，减压蒸除溶剂，加乙醚（50ml），用5%的碳酸氢钠（50ml×3）水溶液萃取。合并水相，加入5%柠檬酸水溶液调至PH6，用乙酸乙酯（100ml×3）萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得淡黄色油状物，加入无水乙醚（10ml）析出类白色固体5.6g，收率52.6%。ESI-MS(m/z):523.5[M+H]+;1H NMR(DMSO-d6)δ:1.39(s,9H);1.86(m,3H);2.10(m,1H);2.34～2.47(m,2H);2.53(m,1H);2.71(m,1H);3.38(m,1H);3.52(m,1H);3.75(s,2H);4.02(m,1H);4.18～4.26(m,2H);4.68(m,1H);6.82(m,1H);7.23(m,1H);7.33(m,5H);7.96(d,1H,J=8Hz)
步骤2 天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸三氟乙酸盐（4）
化合物3（5.0g，9.6mmol）加至无水二氯甲烷（20ml）中，搅拌下滴加三氟乙酸（9ml），控温于25℃下。减压浓缩至干，加入无水乙醚（20ml），析出浅黄色固体5.4g，收率88.5%。ESI-MS(m/z):423.3[M+H-CF3COOH]+;1H NMR(DMSO-d6)δ:1.86(m,3H);2.10(m,1H);2.34～2.47(m,2H);2.53(m,1H);2.71(m,1H);3.38(m,1H);3.52(m,1H);3.75(s,2H);4.02(m,1H);4.18～4.26(m,2H);4.68(m,1H);6.82(m,1H);7.23(m,1H);7.33(m,5H);8.13(br,2H)。
实施例3 O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸三氟乙酸盐（6）
步骤1 N-叔丁氧羰酰基-O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸（5）
化合物4（4.1g，7.6mmol）和BSA（4.5ml，1.84mmol）加到无水二氯甲烷（40ml）中，室温搅拌3h，滴入化合物c（3.4g，8.4mmol）的二氯甲烷（10ml）溶液，室温搅拌5h，减压蒸除溶剂，加乙醚（40ml），用5%的碳酸氢钠（30ml×3）水溶液萃取。合并水相，加入5%柠檬酸水溶液调至PH6，用乙酸乙酯（60ml×3）萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得淡黄色油状物，加入无水乙醚（20ml）析出浅黄色固体2.3g，收率42.4%。ESI-MS(m/z):714.5[M+H]+;
步骤2 O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸三氟乙酸盐（6）
化合物5（2.0g，2.8mmol）加至无水二氯甲烷（10ml）中，搅拌下滴加三氟乙酸（5ml），控温于25℃下。减压浓缩至干，加入无水乙醚（10ml），析出浅黄色固体2.1g，收率90.9%。ESI-MS(m/z):614.3[M+H-CF3COOH]+。
实施例4 异亮氨酰-O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸三氟乙酸盐（8）
步骤1 N-叔丁氧羰酰基-异亮氨酰-O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸（7）
化合物6（2.0g，2.8mmol）和BSA（1.5ml，6.2mmol）加到无水二氯甲烷（20ml）中，室温搅拌3h，滴入化合物物d（0.8g，3.6mmol）的二氯甲烷（5ml）溶液，搅拌至全溶，反应6h，减压蒸除溶剂，加乙醚（20ml）和5%的碳酸氢钠（20ml×3）水溶液，析出白色固体，过滤，得黄褐色固体1.3g，收率56.3%。ESI-MS（m/z）:827.4[M+1]+；
步骤2 异亮氨酰-O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸三氟乙酸盐（8）
化合物7（1.0g，1.2mmol）加至无水二氯甲烷（10ml）中，搅拌下滴加三氟乙酸（5ml），控温于25℃下。减压浓缩至干，加入无水乙醚（10ml），析出黄褐色固体10.9g，收率87.2%。ESI-MS(m/z):727.1[M+H-CF3COOH]+。
应用实例
应用实例1 N-[3-(苄巯基)丙酰]-O-乙基-D-酪氨酸酰肼(vi)
步骤1 3-(苄巯基)丙酸(i)
巯基丙酸（10.0ml，114.6mmol）加至1M NaOH（250ml）和EtOH（200ml）中，降温至0℃，缓慢滴加溴苄（14.3ml，120.5mmol），搅拌10min，自然升温，室温搅拌3h。用1M HCl调节PH=1，析出大量白色固体，二氯甲烷CH2Cl2萃取（200ml×3），弃去水相。用1M NaOH调节有机相至PH=12，析出白色固体，水萃取。再用1M HCl调节水相PH=1，过滤得到大量白色结晶，干燥，得到白色晶体14.3g，收率63.6%。ESI-MS(m/z):197.11[M+H]+;1H NMR（CDCl3）δ:2.59（t,2H,J=6.8Hz）;2.67(t,2H,J=6.8Hz);3.74(s,2H);7.29(m,5H)
步骤2 3-(苄巯基)丙酰氯(ii)
化合物i（10.0g，51.0mmol）加至甲苯（300ml）内，滴加SOCl2（8.6ml，118.8mmol），加热至80℃，搅拌2h（TLC检测），减压浓缩，得到黄色油状物10.0g，收率91%。
步骤3 D-酪氨酸甲酯盐酸盐(iii)
D-酪氨酸（10.0g，55.0mmol）加至无水甲醇（200ml）内，通入干燥的HCl气体1h，室温搅拌3h(TLC检测)，减压浓缩，得类白色固体11.0g，收率86.6%。ESI-MS(m/z):196.20[M+H]+;1H NMR(DMSO-d6)δ:1.85（br，2H）;2.71(m,2H);3.48(m,1H);3.56(s,3H);6.82(dd,4H,J=8.6Hz,7.2Hz);9.17(s,1H)。
步骤4 N-[3-(苄巯基)丙酰]-D-酪氨酸甲酯(iv)
化合物iii（9.0g，38.7mmol）加至CH2Cl2(250ml)中，室温搅拌下，加入吡啶（9.2g，116.1mmol）和TMSCl（6.4ml，50.4mmol）。降温至0℃，滴加化合物ii（9.0g，41.8mmol）室温搅拌4h，减压浓缩，得黄色油状物，加入乙酸乙酯（100ml），用0.5M HCl调节PH=7，弃去水层。有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得黄色油状物，硅胶柱层析纯化（VPE：VEA=2：1）得到白色结晶8.4g，收率58.6%。ESI-MS(m/z):374.28[M+H]+;1H NMR（CDCl3）δ:2.36(t,2H,J=6.8Hz);2.68(t,2H,J=6.8Hz);3.05(m,2H);3.71(s,2H);3.74(s,3H);4.84(dd,1H,J=5.9Hz,13.5Hz);6.12(d,1H,J=7.8Hz);6.83(dd,4H,J=8.6Hz,7.2Hz);7.30(m,5H).
步骤5 N-[3-(苄巯基)丙酰]-O-乙基-D-酪氨酸甲酯(v)
化合物iv（3.0g，8.0mmol）加至无水DMF（30ml）和K2CO3（2.2g，16.0mmol）中，氮气保护下，再加入碘乙烷（1.28ml，16.0mmol），室温搅拌20h，加入乙酸乙酯（100ml）和水（80ml×3）萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得到白色结晶2.6g，收率78.1%。ESI-MS(m/z):402.16[M+H]+;1H NMR（CDCl3）δ:1.34（t，3H,J=8Hz）;2.41(t,2H,J=6.8Hz);2.55(t,2H,J=6.8Hz);2.91(m,2H);3.70(s,2H);3.72(s,3H);
3.98(q,2H,J=8Hz);4.82(dd,1H,J=5.9Hz,13.5Hz);6.23(d,1H,J=7.8Hz);6.84(dd,4H,J=J=8.6Hz,7.2Hz);7.32(m,5H).
步骤6 N-[3-(苄巯基)丙酰]-O-乙基-D-酪氨酸酰肼(vi)
化合物v（4.0g，10.0mmol）加至MeOH（24.5ml）内，滴加85%的水合肼（8.23ml），室温搅拌，5min后产生大量白色沉淀，继续搅拌1h，放入冰箱冷藏过夜。过滤，滤饼用水洗涤三次，得到白色固体3.5g，收率87.5%。
ESI-MS(m/z):402.54[M+H]+;1H NMR(DMSO-d6)δ:1.27（t，3H,J=8Hz）;
2.33(t,2H,J=6.8Hz);2.43(t,2H,J=6.8Hz);2.65(m,1H);2.81(m,1H);3.66(s,2H);
3.93(q,2H,J=8Hz);4.23(br,1H);4.36(m,1H);6.23(d,1H,J=7.8Hz);6.87(dd,4H,
J=8.6Hz,7.2Hz);7.32(m,5H);8.14(d,1H,J=8.7Hz);9.14(s,1H)
应用实例2 N-苄氧羰基-鸟氨酰-甘氨酰胺盐酸盐（x）
步骤1 N-叔丁氧羰基-N’-苄氧羰基-鸟氨酸(viii)
N-苄氧羰基-鸟氨酸（5.3g，20.0mmol）与碳酸钾（3.0g，22.0mmol）加入溶液H2O（60ml）与1,4-二氧六环（25ml）中，冰浴冷却至0℃后。将Boc2O(4.6g，21.0mmol)溶于1,4-二氧六环（50ml）中，再将其缓慢滴加至上述含cbz的混合溶液中，滴毕后撤去冰浴，室温下搅拌过夜。减压蒸除1,4-二氧六环。再加入H2O（10ml），用1mol/L盐酸调至pH=2～3。用乙酸乙酯萃取（80ml×3），合并有机相，再分别用10mmol/L盐酸（24ml），饱和氯化铵溶液（50ml）和H2O（30ml）洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤旋干透明粘状物6.9g，收率94.5%。ESI-MS(m/z):367.25。1H-NMR(300MHz,DMSO)δ：12.37(br,1H),7.32(s,4H),7.21(s,1H),7.03(d,1H,J=7.7Hz),4.98(s,2H),3.81(s,1H),3.31(s,1H),2.95(d,2H,J=5.4Hz),1.63(m,1H),1.44(m,3H),1.35(s,9H)。
步骤2 N-叔丁氧羰基-N’-苄氧羰基-鸟氨酰-甘氨酰胺(ix)
化合物viii(3.9g，10.6mmol)溶于无水THF（40ml）中，再加入NMM(1.1g，10.6mmol)，N2保护，降温至-18℃搅拌，30min后升温至-15℃再缓慢滴加IBCF(1.15g,10.6mmol)的无水THF（15ml）溶液，保持此温度搅拌30min，再加入甘氨酰胺盐酸盐(1.2g,10.6mmol)和NMM(1.1g，10.6mmol)后,自然升温至室温，搅拌反应18h。减压蒸除溶剂后加入乙酸乙酯（40ml），再分别用5%NaHCO3溶液（50ml×3），H2O（50ml）和5%柠檬酸溶液（50ml×3）洗涤。用无水MgSO4干燥，过滤，将滤液减压旋干，得到淡黄色固体，用少量乙酸乙酯洗去杂质，抽滤，得到白色固体2.3g，收率52.4%。ESI-MS(m/z):423.33,1H-NMR(300MHz,DMSO)δ：8.04(s,1H),7.34(d,5H,J=5.0Hz),7.20(d,2H,J=16.7Hz),7.10(s,1H),7.02(d,1H,J=7.3Hz),5.00(s,2H),3.85(s,1H),3.62(d,2H,J=6.0Hz),2.97(d,2H,J=5.4Hz),1.60(s,1H),1.42(s,2H),1.38(s,9H)。
步骤3 N-苄氧羰基-鸟氨酰-甘氨酰胺盐酸盐（x）
化合物ix(0.42g，1.0mmol)加入到4mol/L HCl的1，4-二氧六环溶液（12.5ml）中，室温搅拌，约6min后有大量白色固体析出，反应约3.5h（TCL检测），抽滤，烘干得白色固体0.3g，收率84.4%。ESI-MS(m/z):323.16,1H-NMR(300MHz,DMSO)δ：8.79(m,1H),8.32(s,3H),7.48(s,1H),7.36(dd,6H,J=11.9Hz,6.9Hz),7.14(s,1H),5.01(s,2H),3.92–3.54(m,3H),3.00(d,2H,J=6.0Hz),1.70(s,2H),1.48(s,2H)。
应用实例3 阿托西班(atosiban)
步骤1 N-[3-(苄巯基)丙酰]-O-乙基-D-酪氨酰-异亮氨酰-O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸(vii)
化合物8（6.3ml,7.5mmol）加至无水DMF（6ml）中，再加入BSA（4.39ml），室温搅拌4h，备用。化合物vi（3.0g，7.5mmol）加至无水DMF（6ml）中，降温至-15℃搅拌至全溶。再加入4M HCl的THF溶液(9.4ml)，缓慢滴加亚硝酸叔丁酯（0.9ml，0.9mmol），在-10℃下搅拌3h。加入三乙胺（5.2ml），溶液变浑浊后再加入备用的化合1与BSA的混合液。温度保持在-10℃下，搅拌过夜，过滤，弃去滤饼。将滤液减压浓缩，加入乙醚，有大量固体析出。过滤得到白色固体5.3g，收率64.7%。ESI-MS(m/z):1096.98[M+H]+
步骤2 N-[3-(苄巯基)丙酰]-O-乙基-D-酪氨酰-异亮氨酰-O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酰-N-苄氧羰基-鸟氨酰-甘氨酰胺(xi)
化合物x（1.7g，4.7mmol）加至DMF（10ml）中，室温搅拌，加入HOBt（0.7g，5.5mmol），EDCI(1.0g，5.5mmol)和DIPEA(1.4ml,8.0mmol)，反应4h后，再加入化合物vii（4.0g，3.6mmol），搅拌过夜。减压蒸除溶剂，加入乙醚（30ml）和H2O（30ml），析出大量固体，过滤，烘干得白色固体2.4g，收率47.2%，ESI-MS(m/z):1041.09[M+H]+。
步骤3 阿托西班(atosiban)
Na(46mg,2.00mmol)加至液氨（15ml）中，温度控制在-78℃以下，溶液变蓝，加入化合物xi（250mg，0.18mmol），温度保持在-78℃下搅拌4h，加入氯化铵，用氮气吹干液氨。加入0.5M HCl（20ml）和THF（20ml）萃取，弃去水层，在有机层中加入碘（22.8mg，0.18mmol），室温搅拌3h，用硫代硫酸钠水溶液萃取（15ml×3），合并有机相，减压浓缩，得到黄色油壮物，通过反相制备HPLC纯化得到atosiban，ESI-MS(m/z):994.65[M+H]+。

Claims (5)

1.阿托西班五肽中间体的液相合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.以脯氨酸为原料，使用BSA保护其羧基,再与N端保护的S-苄基半胱氨酸的活性酯连接,制得N-叔丁氧羰酰基-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸,再于酸性条件下脱去N端保护基得到S-苄基半胱酰氨-脯氨酸；
b.以S-苄基半胱酰氨-脯氨酸为原料，使用BSA保护脯氨酰的羧基部分，再与N端保护的天冬酰胺的活性酯连接，制得N-叔丁氧羰酰基-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸，再于酸性条件下脱去N端保护基得到天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸；
c.以天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸为原料，使用BSA保护脯氨酰的羧基部分，再与N端保护的O-苄基苏氨酸的活性酯连接，制得N-叔丁氧羰酰基-O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸，再于酸性条件下脱去N端保护基得到O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸；
d.以O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸为原料，使用BSA保护脯氨酰的羧基部分，再与N端保护的异亮氨酸的活性酯连接，制得N-叔丁氧羰酰基-异亮氨酰-O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸，再于酸性条件下脱去N端保护基得到异亮氨酰-O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸，即H-Ile-Thr（Bzl）-Asn-Cys（Bzl）-Pro-OH，其结构（Ⅰ）如下
e.具体合成路线如下：
其中R1=Boc、Cbz、Trt、Mz
R2=OSu、ONb、OBt、OOBt、OAt。
2.根据权利要求1所述的阿托西班五肽中间体的液相合成方法，其特征在于：步骤a、c、d中所述的N端保护基团选自叔丁氧羰基（BOC）、苄氧羰基（Cbz）、三苯甲基（Trt）、对甲氧苄氧羰基（Mz）。
3.根据权利要求1所述的阿托西班五肽中间体的液相合成方法，其特征在于：用酸脱除N端保护基时所述的酸选自包括三氟乙酸、盐酸、氢氟酸；所用溶剂包括：二氯甲烷、四氢呋喃、1,4-二氧六环。
4.根据权利要求1所述的阿托西班五肽中间体的液相合成方法，其特征在于：步骤a、b、c、d中所述的氨基酸的相应活性酯选自N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺酯、1-羟基苯骈三氮唑酯、3-羟基-4-氧-3，4-二氢-1，2，3-苯骈三氮唑酯、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑酯。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的合成方法，其特征在于：包括如下步骤：
（a）制备S-苄基半胱酰氨-脯氨酸
将BSA和L-脯氨酸加到无水二氯甲烷中，10～35℃下搅拌2～4h，滴入N-叔丁氧羰酰基-S-苄基半胱氨酸-（N-羟基）琥珀酰亚胺酯的二氯甲烷溶液，10～35℃下反应5～8h，减压蒸除溶剂，加乙醚，用5%的碳酸氢钠水溶液萃取；合并水相，加入柠檬酸调至PH5～7，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得淡黄色油状物，加入无水乙醚析出白色固体；将白色固体加至无水二氯甲烷中，0～15℃下搅拌滴加三氟乙酸至VCH2Cl2：VCF3COOH=1～5：1，搅拌反应2～5h，减压浓缩至干，得到淡黄色油状物，用乙酸乙酯/乙醚重结晶，得到白色固体；
（b）制备天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸
将S-苄基半胱酰氨-脯氨酸和BSA加到无水二氯甲烷中，10～35℃下搅拌3～4h，滴入N-叔丁氧羰酰基-天冬酰胺-（N-羟基）琥珀酰亚胺酯的二氯甲烷溶液，10～35℃下搅拌8～10h，减压蒸除溶剂，加乙醚，用5%的碳酸氢钠水溶液萃取；合并水相，加入柠檬酸调至PH5～7，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得淡黄色油状物，乙酸乙酯重结晶，得到的固体加至无水二氯甲烷中，0～15℃下搅拌滴加三氟乙酸至VCH2Cl2：VCF3COOH=1～5：1，10～35℃下搅拌反应2～5h，减压浓缩至干，得到淡黄色油状物，用乙酸乙酯/乙醚重结晶，得到白色固体；
（c）制备O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸
将天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸和BSA加到无水二氯甲烷中，10～35℃下搅拌3～4h，滴入N-叔丁氧羰酰基-O-苄基-苏氨酸-（N-羟基）琥珀酰亚胺酯的二氯甲烷溶液，10～35℃下搅拌6～8h，减压蒸除溶剂，加乙醚，用5%的碳酸氢钠水溶液萃取；合并水相，加入柠檬酸调至PH5～8，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得淡黄色油状物，乙酸乙酯重结晶，得到的固体加至无水二氯甲烷中，0～15℃下搅拌滴加三氟乙酸至VCH2Cl2：VCF3COOH=1～5：1，10～35℃下搅拌反应2～5h，减压浓缩至干，用甲醇/乙醚重结晶，得到白色固体；
（d）制备异亮氨酰-O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸
将O-苄基-苏氨酰-天冬酰胺-S-苄基半胱氨酰-脯氨酸和BSA加到无水二氯甲烷中，10～35℃下搅拌3～4h，滴入N-叔丁氧羰酰基-异亮氨酸-（N-羟基）琥珀酰亚胺酯的二氯甲烷溶液，10～35℃下搅拌6～8h，减压蒸除溶剂，加乙醚，用5%的碳酸氢钠水溶液萃取；合并水相，加入柠檬酸调至PH5～8，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤后经无水硫酸钠干燥，过滤，得到的白色固体加至无水二氯甲烷中，0～15℃下搅拌滴加三氟乙酸至VCH2Cl2：VCF3COOH=1～5：1，10～35℃下搅拌反应2～5h，减压浓缩至干，用甲醇/乙醚重结晶，得到白色固体。
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