CN109879935A - 一种多肽的液相合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多肽的液相合成方法，将Boc‑Aib‑OH与H‑His(Trt)‑OMe、Z‑D‑Nal‑OH与H‑D‑Phe‑OMe分别偶联得到两个二肽片段，再将Boc‑Aib‑His(Trt)‑OMe皂化、Z‑D‑Nal‑D‑Phe‑OMe脱Z后，偶联得到Boc‑Aib‑His(Trt)‑D‑Nal‑D‑Phe‑OMe四肽片段，经皂化后与H‑Lys(Boc)‑NH2偶联得到五肽全保护片段，脱除保护经纯化得到五肽H‑Aib‑His‑D‑Nal‑D‑Phe‑Lys‑NH2，该五肽可进一步制成药学上可接受的盐类；该方法采用液相合成方式，原料和设备成本低，产率高，可适合大规模生产。

Description

一种多肽的液相合成方法
技术领域
本发明涉及一种多肽的合成方法，具体涉及一种多肽的液相合成方法。
背景技术
依帕瑞林(ipamorelin)是一种生长激素释放肽，是一种人工合成的生长激素释放肽类似物，其肽序列结构含有五个氨基酸：Aib-His-D-2-Nal-D-Phe-Lys-NH2。依帕瑞林最初由Novo Nordisk公司研发，可用于治疗消化道肿瘤。生长激素释放肽可与位于下丘脑的生长激素促分泌素受体结合后，产生一系列生物学效应，刺激垂体前叶释放生长激素(GH)，调节机体生长发育与能量平衡。此外，生长激素释放肽在心血管系统、消化系统、碳水化合物代谢等方面也起到重要作用。
依帕瑞林通过增强生长激素释放信号，诱导机体以一种缓慢的脉冲方式持续释放天然生长激素水平，不会引起体内生长激素水平的突然升高，与注射人工合成的生长激素相比，副作用很小。
国际专利(WO2016191865)描述了依帕瑞林及其衍生物作为成像剂可用于心脏病、前列腺癌或其他癌症的检测诊断。但在发明人了解的范围内，并未发现该五肽的液相合成方法报道。
依帕瑞林结构式见(Ⅰ)
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种多肽I的液相合成方法，该方法采用人工合成方式，原料和设备成本低，可适合大规模生产。
发明人在研究五肽的液相合成过程中，尝试了很多种可能的方法，例如用Boc-Aib-OH与侧链不保护的H-His-OMe偶联得到二肽，H-Lys(Boc)-NH2依次往后偶联得到D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2三肽，再将二肽与三肽片段连接；或者以H-D-Phe-OMe为起始，依次偶联得到Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OMe四肽，再经皂化与H-Lys(Boc)-NH2偶联得到五肽或者以Lys→Phe→Dal→His→Aib的顺序依次往后偶联，但发现均存在反应产物溶解度差，产率较低，脱Z困难等问题。经过大量的实验和探索，发明人发现，依如下技术方案合成此五肽效果最为理想。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种多肽的液相合成方法，包括以下步骤：
(1)将Boc-Aib-OH与H-His(Trt)-OMe偶联，得到二肽Boc-Aib-His(Trt)-OMe；
(2)Boc-Aib-His(Trt)-OMe经皂化后得到Boc-Aib-His(Trt)-OH；
(3)将Z-D-Nal-OH与H-D-Phe-OMe偶联，得到二肽Z-D-Nal-D-Phe-OMe；
(4)将二肽Z-D-Nal-D-Phe-OMe脱Z后得到H-D-Nal-D-Phe-OMe；
(5)将Boc-Aib-His(Trt)-OH与H-D-Nal-D-Phe-OMe偶联得到四肽片段Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OMe；
(6)将Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OMe经皂化后得到Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OH；
(7)将Z-Lys(Boc)-OH与氨水反应得到Z-Lys(Boc)-NH2；
(8)Z-Lys(Boc)-NH2经脱Z后得到H-Lys(Boc)-NH2；
(9)将四肽Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OH与H-Lys(Boc)-NH2偶联得到五肽Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2；
(10)将Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2脱去保护后得到五肽H-Aib-His-D-Nal-D-Phe-Lys-NH2。
上述液相合成方法，更优选包括以下合成步骤：
(1)以Boc-Aib-OH为原料，在有机溶剂、缩合试剂和有机胺作用下，与H-His(Trt)-OMe进行偶联反应，反应产物经含洗涤、酸化、干燥处理得到二肽Boc-Aib-His(Trt)-OMe；
(2)将Boc-Aib-His(Trt)-OMe在碱溶液中反应，脱除二肽上的甲基，得到Boc-Aib-His(Trt)-OH；
(3)以Z-D-Nal-OH为原料，在有机溶剂、缩合试剂和有机胺作用下，与H-D-Phe-OMe进行偶联反应，反应产物经含洗涤、干燥处理得到二肽Z-D-Nal-D-Phe-OMe；
(4)采用还原试剂，将Z-D-Nal-D-Phe-OMe二肽上的N-苄氧羰基(Cbz)脱去，反应产物经抽滤旋干处理得到H-D-Nal-D-Phe-OMe；
(5)在有机溶剂、缩合试剂和有机胺作用下，将Boc-Aib-His(Trt)-OH与H-D-Nal-D-Phe-OMe进行偶联反应，反应产物经含洗涤、干燥处理得到四肽Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OMe；
(6)将Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OMe在碱溶液中反应，脱除四肽上的甲基，反应产物经含洗涤、酸化、干燥处理得到Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OH；
(7)将Z-Lys(Boc)-OH在有机溶剂、缩合试剂作用下，与氨水进行反应，反应产物经洗涤、干燥处理得到Z-Lys(Boc)-NH2；
(8)采用还原试剂，将Z-Lys(Boc)-NH2上的N-苄氧羰基脱(Cbz)去，反应产物经抽滤、干燥处理得到H-Lys(Boc)-NH2；
(9)在有机溶剂、缩合试剂和有机胺作用下，将Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OH与H-Lys(Boc)-NH2进行偶联反应，反应产物经洗涤、干燥处理得到Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2；
(10)将固体Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2上的保护基Boc、Trt脱除，并纯化得到五肽H-Aib-His-D-Nal-D-Phe-Lys-NH2。
步骤(1)、(3)、(5)、(7)、(9)中的所述的有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯、乙腈、DMF、二氯乙烷中的任意一种或几种任意比例的混合物。优选为乙酸乙酯或二氯甲烷。
步骤(1)、(3)、(5)、(7)、(9)中，所述的缩合试剂为1-羟基苯并三氮唑(HOBt)N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBop)或苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)中的任意一种或几种的组合。更优选的为EDC·HCl，HOBt，DIC中的一种或几种，当HOBt和EDC·HCl混用时，优选的HOBt与EDC·HCl的摩尔比为1：0.5-2，更优选为1：0.9-1.1，最佳为1：1。
步骤(1)中，所述的有机胺优选为N-N二异丙基乙胺(DIEA)。
步骤(1)、(3)、(5)、(7)、(9)中，偶联反应温度为0-60℃，优选为10-40℃，最佳为30℃，偶联反应时间为2.5-5h。
步骤(4)、(8)中，N-苄氧羰基(Cbz)脱去方法是，将N-苄氧羰基保护的肽片段溶于溶剂A中，加入钯碳，并在氢气条件下反应。其中，所述的溶剂A包括甲醇、乙醇、丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯、乙腈、二甲基甲酰胺、碳酸二甲酯中的一种或几种，其中溶剂A优选为甲醇和/或乙酸乙酯，更佳为乙酸乙酯；所述的钯碳，其中的钯的质量百分含量占钯碳总质量的5％，钯的用量占所需还原的肽的摩尔量的1％-20％，优选为1％-15％，最佳为10％。
步骤(2)、(6)中，甲基的脱除方法是：将含甲基的肽片段加入到溶剂B中，并加入碱水溶液，室温下反应0.5-3h，然后分液除去碱水，用体积含量0.5％-2％的盐酸酸化并用食盐水洗涤至中性，减压蒸馏除去溶剂B；其中，所述的碱为NaOH或KOH，优选为NaOH，浓度为2-4M，更优选为3M，碱水溶液的用量为碱液体积占碱液有机溶剂总体积的40％-80％，更优选为75％；其中，所述的溶剂B包括甲苯、乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸丁酯、N-N二甲基甲酰胺中的一种或几种，优选为四氢呋喃或乙腈，最佳为乙腈。
步骤(10)中，取三异丙基硅烷、水加入到酸中，混合后倒入盛有的Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2的容器中室温下反应2-5h，用甲基叔丁基醚和正己烷的混合液沉降、洗涤，蒸去溶剂，得到H-Aib-His-D-Nal-D-Phe-Lys-NH2。其中，所述的酸可以是硫酸、盐酸、乙酸、甲酸、三氟乙酸，优选为盐酸或三氟乙酸，最佳为三氟乙酸；三异丙基硅烷、水与三氟乙酸体积比例优选为2.5％：2.5％：95％，切割液(三异丙基硅烷、水和酸的组合)体积与Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe--Lys(Boc)-NH2五肽的质量比例优选为10(mL)：1(g)，沉降液甲基叔丁基醚与正己烷的比例优选为体积比5：1。
步骤(10)中，所述的纯化，是将的H-Aib-His-D-Nal-D-Phe-Lys-NH2五肽粗产品采用高效液相色谱纯化得到纯度高于99％的H-Aib-His-D-Nal-D-Phe-Lys-NH2五肽。具体过程为：将H-Aib-His-D-Nal-D-Phe--Lys-NH2五肽溶于甲醇水溶液，采用高效液相色谱进行纯化，收集含H-Aib-His-D-Nal-D-Phe--Lys-NH2五肽的溶液，进行冷冻干燥，得到含纯度高于99％的H-Aib-His-D-Nal-D-Phe--Lys-NH2五肽，其中高效液相色谱进行纯化时优选为采用C18色谱柱，甲醇水溶液中，甲醇和水的体积比例优选为1：2，流动相中还可以含有体积百分含量为1％的醋酸。
本发明最终制备获得H-Aib-His-D-Nal-D-Phe--Lys-NH2五肽，可以加入酸或碱的方式得到药理上允许的H-Aib-His-D-Nal-D-Phe--Lys-NH2五肽的各式盐，如在任选的适宜溶剂中与三氟乙酸、乙酸进行反应，分别得到H-Aib-His-D-Nal-D-Phe--Lys-NH2五肽的三氟乙酸盐、乙酸盐。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明在整个生产过程中所用的试剂价格低廉；
(2)本发明在整个生产过程中可以采用玻璃设备，可以不用依赖大型设备，其生产费用较低；
(3)本发明生产工艺简单，反应过程易于控制，生产工艺的可重复性强；
(4)本发明综合生产周期短，降低了生产成本，提高了生产效率；
(5)本发明合成规模可大幅提高，容易实现工业化的大规模生产；
(6)本发明合成方法过程可行、可控、成本低、产率高，适合于大规模生产。
本发明采用的部分缩略语相对应的化学名称如下：
Aib：2-氨基异丁酸
His：组氨酸
Nal：萘氨酸
Phe：苯丙氨酸
Lys：赖氨酸
Boc：叔丁氧羰基
Trt：三苯甲基
HOBt：1-羟基苯并三氮唑
EDC·HCl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐
DIC：N，N’-二异丙基碳二亚胺
DCC:N，N’-二环己基碳二亚胺
PyBopP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
BOP：苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐
DIEA:N-N二异丙基乙胺
附图说明
图1为Boc-Aib-His(Trt)-OH的Mass图。
图2为Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OMe四肽的MS图谱。
图3为五肽Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2的Mass谱图。
图4为五肽H-Aib-His-D-Nal-D-Phe-Lys-NH2的液相谱图。
图5为五肽H-Aib-His-D-Nal-D-Phe-Lys-NH2的Mass谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
a.Boc-Aib-His(Trt)-OMe的制备过程
将Boc-Aib-OH(2.03g，10mmol)和H-His(Trt)-OMe·HCl(4.48g，10mmol)溶于200mL有机溶剂乙酸乙酯中，加入缩合剂HOBt(1.485g，11mmol)，EDC·HCl(2.108g，11mmol)和4.076g，31.5mmol有机胺DIEA，30℃下反应3小时。反应结束后，将反应液倒入500mL分液漏斗，用5％的碳酸钾溶液洗涤3遍，饱和氯化钠洗涤2遍，干燥旋干后得.Boc-Aib-His(Trt)-OMe 5.72g，收率98.3％。
b.脱除Boc-Aib-His(Trt)-OMe的过程：
将5.72g Boc-Aib-His(Trt)-OMe溶于100mL乙腈溶液中，加入3M的NaOH溶液300mL，室温下搅拌30min，倒入500mL的分液漏斗中将碱水相分离，用饱和食盐水洗涤3遍后再用0.5％的HCl溶液洗涤一遍，干燥旋干得Boc-Aib-His(Trt)-OH 5.275g，收率92.2％。
所得的Boc-Aib-His(Trt)-OH的Mass图谱见图1，583.29为其[M+H]1+峰。
c.Z-D-Nal-D-Phe-OMe的制备过程：
将Z-D-Nal-OH(0.699g，2mmoL)与H-D-Phe-OMe·HCl(0.517g，2.4mmoL)溶于乙酸乙酯30mL中，加入缩合试剂HOBt(0.324g，2.4mmoL)，EDC·HCL(0.46g，2.4mmoL)和有机碱DIEA(0.646g，2.5mmoL)，30℃下反应2.5小时，反应结束后倒入150mL分液漏斗，用5％的HCL溶液洗去多余的H-Phe-OMe，而后用5％的碳酸钾溶液洗涤3遍，饱和氯化钠洗涤2遍，干燥旋干后得.Z-D-Nal-D-Phe-OMe 0.99g，收率96.9％。
d.将Z-D-Nal-D-Phe-OMe0.99g溶于50mL乙酸乙酯中，加入10％的钯碳0.47g，氢气氛围下反应3小时，抽滤除去钯碳，浓缩旋干得H-D-Nal-D-Phe-OMe 0.74g，收率98.6％
e.Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OMe的制备过程
将0.74g H-D-Nal-D-Phe-OMe(1.97mmoL)与1.15g Boc-Aib-His(Trt)-OH溶于100mL乙酸乙酯中，加入缩合试剂HOBt(0.319g，2.364mmoL)，EDC·HCl(0.453g，2.364mmoL)，30℃反应3小时，反应完全后倒入250mL分液漏斗中，用5％的碳酸钾溶液洗涤3遍，饱和氯化钠洗涤2遍，干燥旋干后得Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OMe 1.752g收率94.6％。
所得Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OMe四肽的MS图谱见图2，941.46为其[M+H]1+的峰。
f.Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OH的制备过程
将1.752g Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OMe(1.86mmoL)加入100mL乙腈溶液中，再加入3M的NaOH溶液300mL，室温下搅拌30min，倒入500mL的分液漏斗中将碱水相分离，用饱和食盐水洗涤3遍后再用0.5％的HCl溶液洗涤一遍，干燥旋干得Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OH 1.6g，收率92.7％。
g.将Z-Lys(Boc)-OH(0.76g，2mmoL)溶于40mL四氢呋喃中，加入0.84g 25％的氨水(6mmoL)，缩合试剂EDC·HCL(0.458，2.4mmoL)，HOBt(0.324，2.4mmoL)室温下反应3小时，反应结束后先旋干四氢呋喃，加入50mL的乙酸乙酯溶解，用5％的碳酸钾溶液洗涤3遍，饱和氯化钠洗涤2遍，干燥旋干后得Z-Lys-(Boc)-NH2 0.64g，收率84.2％
f.H-Lys-(Boc)-NH2的制备过程
将Z-Lys-(Boc)-NH2(0.64g，1.68mmoL)溶于50mL乙酸乙酯中，加入10％的钯碳212.8mg，氢气氛围下反应3小时，抽滤除去钯碳，浓缩旋干得H-Lys-(Boc)-NH2 0.58g，收率90％
Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2五肽的制备过程
将H-Lys-(Boc)-NH2(418mg，1.7mmoL)与Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OH(1.576g，1.7mmoL)加入100mL乙酸乙酯中，加入缩合试剂HOBt(275mg，2.04mmoL)，EDC·HCl(391mg，2.04mmoL)，30℃反应3小时，反应完全后倒入250mL分液漏斗，用5％的碳酸钾溶液洗涤3遍，饱和氯化钠洗涤2遍，干燥旋干后得Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2五肽1.8g，收率91.8％
所得全保护五肽Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2的Mass谱图见图3，1154.59为其[M+H]1+的峰。
全保护五肽Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2的脱除保护基
将0.75mL的三异丙基硅烷，0.75mL水加入到28.5mL的三氟乙酸中，搅拌均匀后倒入盛有1.8g全保护五肽Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2的容器内，室温下反应2小时，而后将反应溶液缓慢倒入甲基叔丁基醚：正己烷＝5：1的混合溶液200mL中，滤去溶液，继续用此比例混合液洗涤3遍，抽干得白色五肽H-Aib-His-D-Nal-D-Phe-Lys-NH2固体1.3g，再用高效液相色谱进行纯化，得99％纯的五肽H-Aib-His-D-Nal-D-Phe-Lys-NH2300mg。
最终所得五肽H-Aib-His-D-Nal-D-Phe-Lys-NH2的液相谱图见图4。
最终所得五肽H-Aib-His-D-Nal-D-Phe-Lys-NH2的Mass谱图见图5，712.38为其[M+H]+的峰，356.7为其[M+2H]2+的峰。
实施例2
a.Boc-Aib-His(Trt)-OMe的制备过程
将Boc-Aib-OH(10.162g，50mmol)和H-His(Trt)-OMe·HCl(22.848g，51mmol)溶于700mL有机溶剂二氯甲烷中，加入缩合剂HOBt(7.425g，55mmol)，EDC·HCl(10.543g，55mmol)和21.351g，165mmol有机胺DIEA，25℃下反应5小时。反应结束后，将反应液倒入2L分液漏斗，用5％的碳酸钾溶液洗涤5遍，饱和氯化钠洗涤2遍，干燥旋干后得.Boc-Aib-His(Trt)-OMe 27g，收率92.67％。
b.脱除Boc-Aib-His(Trt)-OMe的过程：
将27g Boc-Aib-His(Trt)-OMe溶于300mL四氢呋喃溶液中，加入3M的NaOH溶液900mL，室温下搅拌30min，倒入2L的分液漏斗中将碱水相分离，用饱和食盐水洗涤至中性后再用0.5％的HCl溶液洗涤两遍，饱和食盐水洗涤一遍，干燥旋干得Boc-Aib-His(Trt)-OH20g，收率76％。
c.Z-D-Nal-D-Phe-OMe的制备过程：
将Z-D-Nal-OH(87.345g，250mmoL)与H-D-Phe-OMe·HCl(59.32g，275mmoL)溶于乙酸乙酯1600mL中，加入缩合试剂HOBt(40.53g，300mmoL)，EDC·HCL(57.51g，300mmoL)和有机碱DIEA(80.775g，625mmoL)，25℃下反应5小时，反应结束后倒入5L分液漏斗，用5％的碳酸钾溶液洗涤5遍，再用5％的HCL洗涤，TLC点板监测是否洗去多余的H-Phe-OMe，而后饱和氯化钠洗涤3遍，干燥旋干后得.Z-D-Nal-D-Phe-OMe 140g，收率94％。
d.将Z-D-Nal-D-Phe-OMe(50g，83.8mmoL)溶于50mL乙酸乙酯中，加入10％的钯碳19.8g，氢气氛围下室温反应8小时，抽滤除去钯碳，浓缩旋干得H-D-Nal-D-Phe-OMe29.96g，收率95％
e.Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OMe的制备过程
将10g H-D-Nal-D-Phe-OMe(26.56mmoL)与Boc-Aib-His(Trt)-OH(15.477g，26.56mmoL)溶于700mL二氯甲烷中，加入缩合试剂HOBt(4.3g，31.87mmoL)，EDC·HCl(6.1g，31.87mmoL)，40℃反应3小时，反应完全后用5％的碳酸钾溶液洗涤3遍，饱和氯化钠洗涤2遍，干燥旋干后得Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OMe 22g收率88％。
f.Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OH的制备过程
将22g Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OMe(23.372mmoL)加入300mL四氢呋喃溶液中，再加入4M的NaOH溶液500mL，30℃下搅拌30min，将碱水相分离，用饱和食盐水洗涤至弱碱性后，再用0.5％的HCl溶液洗涤一遍，干燥旋干得Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OH18.85g，收率87％。
g.将Z-Lys(Boc)-OH(19g，50mmoL)溶于500mL乙酸乙酯中，加入42g 25％的氨水(300mmoL)，缩合试剂EDC·HCL(11.5，60mmoL)，HOBt(8.1g，60mmoL)室温下反应3小时，反应结束后，用5％的碳酸钾溶液洗涤3遍，饱和氯化钠洗涤2遍，干燥旋干后得Z-Lys-(Boc)-NH212.332g，收率65％
f.H-Lys-(Boc)-NH2的制备过程
将Z-Lys-(Boc)-NH2(12.332g，32.5mmoL)溶于500mL甲醇中，加入10％的钯碳6.917g，30℃氢气氛围下反应5小时，抽滤除去钯碳，浓缩旋干得H-Lys-(Boc)-NH26.776g，收率85％
Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2五肽的制备过程
将H-Lys-(Boc)-NH2(6.776g，27.625mmoL)与Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OH(25.608g，27.625mmoL)加入500mL乙酸乙酯中，加入缩合试剂HOBt(4.478mg，33.15mmoL)，EDC·HCl(6.354mg，33.15mmoL)，25℃反应4.5小时，反应完全后用5％的碳酸钾溶液洗涤3遍，饱和氯化钠洗涤2遍，干燥旋干后得Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2五肽28g，收率88％
全保护五肽Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2的脱除保护基
将7.5mL的三异丙基硅烷，7.5mL水加入到285mL的三氟乙酸中，搅拌均匀后倒入盛有20g全保护五肽Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2的容器内，室温下反应3小时，而后将反应溶液缓慢倒入甲基叔丁基醚：正己烷＝5：1的混合溶液1000mL中，滤去溶液，继续用此比例混合液洗涤3遍，抽干得白色五肽H-Aib-His-D-Nal-D-Phe-Lys-NH2固体1.3g，再用高效液相色谱进行纯化，得99％纯的五肽H-Aib-His-D-Nal-D-Phe-Lys-NH2 5g。
所述纯化采用高效液相色谱进行纯化，具体过程为：将H-Aib-His-D-Nal-D-Phe--Lys-NH2五肽溶于甲醇：水＝1：2的混合溶液中，采用高效液相色谱进行纯化，收集含H-Aib-His-D-Nal-D-Phe--Lys-NH2五肽的溶液，进行冷冻干燥，得到含纯度高于99％的H-Aib-His-D-Nal-D-Phe--Lys-NH2五肽，其中高效液相色谱进行纯化时优选为采用C18色谱柱，流动相中加入了体积百分含量为1％的醋酸。
以上详细描述了本发明的较佳具体实例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆因在权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种多肽的液相合成方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将Boc-Aib-OH与H-His(Trt)-OMe偶联，得到二肽Boc-Aib-His(Trt)-OMe；
(2)Boc-Aib-His(Trt)-OMe经皂化后得到Boc-Aib-His(Trt)-OH；
(3)将Z-D-Nal-OH与H-D-Phe-OMe偶联，得到二肽Z-D-Nal-D-Phe-OMe；
(4)将二肽Z-D-Nal-D-Phe-OMe脱Z后得到H-D-Nal-D-Phe-OMe；
(5)将Boc-Aib-His(Trt)-OH与H-D-Nal-D-Phe-OMe偶联得到四肽片段Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OMe；
(6)将Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OMe经皂化后得到Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OH；
(7)将Z-Lys(Boc)-OH与氨水反应得到Z-Lys(Boc)-NH2；
(8)Z-Lys(Boc)-NH2经脱Z后得到H-Lys(Boc)-NH2；
(9)将四肽Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OH与H-Lys(Boc)-NH2偶联得到五肽Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2；
(10)将Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2脱去保护后得到五肽H-Aib-His-D-Nal-D-Phe-Lys-NH2。
2.根据权利要求1所述的液相合成方法，其特征在于包括以下合成步骤：
(1)以Boc-Aib-OH为原料，在有机溶剂、缩合试剂和有机胺作用下，与H-His(Trt)-OMe进行偶联反应，反应产物经含洗涤、酸化、干燥处理得到二肽Boc-Aib-His(Trt)-OMe；
(2)将Boc-Aib-His(Trt)-OMe在碱溶液中反应，脱除二肽上的甲基，得到Boc-Aib-His(Trt)-OH；
(3)以Z-D-Nal-OH为原料，在有机溶剂、缩合试剂和有机胺作用下，与H-D-Phe-OMe进行偶联反应，反应产物经含洗涤、干燥处理得到二肽Z-D-Nal-D-Phe-OMe；
(4)采用还原试剂，将Z-D-Nal-D-Phe-OMe二肽上的N-苄氧羰基脱去，反应产物经抽滤旋干处理得到H-D-Nal-D-Phe-OMe；
(5)在有机溶剂、缩合试剂和有机胺作用下，将Boc-Aib-His(Trt)-OH与H-D-Nal-D-Phe-OMe进行偶联反应，反应产物经含洗涤、干燥处理得到四肽Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OMe；
(6)将Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OMe在碱溶液中反应，脱除四肽上的甲基，反应产物经含洗涤、酸化、干燥处理得到Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OH；
(7)将Z-Lys(Boc)-OH在有机溶剂、缩合试剂作用下，与氨水进行反应，反应产物经洗涤、干燥处理得到Z-Lys(Boc)-NH2；
(8)采用还原试剂，将Z-Lys(Boc)-NH2上的N-苄氧羰基脱去，反应产物经抽滤、干燥处理得到H-Lys(Boc)-NH2；
(9)在有机溶剂、缩合试剂和有机胺作用下，将Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-OH与H-Lys(Boc)-NH2进行偶联反应，反应产物经洗涤、干燥处理得到Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2；
(10)将固体Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2上的保护基Boc、Trt脱除，并纯化得到五肽H-Aib-His-D-Nal-D-Phe-Lys-NH2。
3.根据权利要求2所述的多肽液相合成方法，其特征在于，步骤(1)、(3)、(5)、(7)、(9)中的所述的有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯、乙腈、DMF、二氯乙烷中的任意一种或几种任意比例的混合物。
4.根据权利要求2所述的多肽液相合成方法，其特征在于，步骤(1)、(3)、(5)、(7)、(9)中，所述的缩合试剂为HOBt、EDC·HCl、DIC、DCC、PyBop或BOP中的任意一种或几种的组合。
5.根据权利要求2所述的多肽液相合成方法，其特征在于，步骤(1)、(3)、(5)、(7)、(9)中，偶联反应温度为0-60℃，偶联反应时间为2.5-5h。
6.根据权利要求2所述的多肽液相合成方法，其特征在于，步骤(4)、(8)中，N-苄氧羰基脱去方法是，将N-苄氧羰基保护的肽片段溶于溶剂中，加入钯碳，并在氢气条件下反应。
7.根据权利要求2所述的多肽液相合成方法，其特征在于，步骤(2)、(6)中，甲基的脱除方法是：将含甲基的肽片段加入到溶剂中，并加入碱水溶液，室温下反应0.5-3h，然后分液除去碱水，用体积含量1％的盐酸酸化并用食盐水洗涤至中性，减压蒸馏除去溶剂；其中，所述的碱为NaOH或KOH，浓度为2-4M，碱水溶液的用量为碱液体积占碱液有机溶剂总体积的40％-80％，更优选为75％。
8.根据权利要求2所述的多肽液相合成方法，其特征在于，步骤(10)中，取三异丙基硅烷、水加入到酸中，混合后倒入盛有的Boc-Aib-His(Trt)-D-Nal-D-Phe-Lys(Boc)-NH2的容器中室温下反应2-5h，用甲基叔丁基醚和正己烷的混合液沉降、洗涤，蒸去溶剂，得到H-Aib-His-D-Nal-D-Phe-Lys-NH2。
9.根据权利要求2所述的多肽液相合成方法，其特征在于，步骤(10)中，所述的纯化，是将的H-Aib-His-D-Nal-D-Phe-Lys-NH2五肽粗产品采用高效液相色谱纯化得到纯度高于99％的H-Aib-His-D-Nal-D-Phe-Lys-NH2五肽。
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