CN104693301A - 一种艾塞那肽衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种艾塞那肽衍生物。本发明还公开了上述艾塞那肽衍生物的制备方法和应用，所述衍生物为在相对于序列艾塞那肽第i和i+4的位置上的氨基酸用Cys替换，其中i的取值为10，12，13，14，16，20，24，然后通过连接臂成环后形成的化合物。本发明制备的艾塞那肽衍生物具有长于艾塞那肽的体内降糖时间，特别适于在制备治疗糖尿病和肥胖症的药物中作为该药物的活性成分。
Description
技术领域
本发明涉及治疗性多肽领域，具体涉及新型长效艾塞那肽衍生物及其制备方法，同时还涉及这些衍生物的医疗用途。
背景技术
艾塞那肽是一种从美洲希拉巨蜥(Heloderma suspectum)唾液中分离得到的含有39个氨基酸的天然多肽激素，序列结构为：
HGEGT5FTSDL10SKQME15EEAVR20LFIEW25LKNGG30PSSGA35PPPS，与GLP-1有53％的序列同源性，不但具有类似GLP-1促胰岛素分泌的功能，而且其体内稳定性也远高于GLP-1。根据艾塞那肽的这一特点，美国Amylin公司和Eli Lilly公司联合开发了化学合成药物艾塞那肽，又称Exenatide，商品名Byetta。Byetta是世界上首个肠促胰岛素类似物药物。于2005年4月经美国FDA比准上市。研究表明，艾塞那肽不仅能很好的控制血糖，还可促进胰岛细胞的新生和增值，减少β细胞凋亡，改善β细胞功能，具有非常明显的临床应用优势。此外，临床研究中发现艾塞那肽还能够减慢胃肠排空的速度，使人没有饥饿感而减少摄入食物，从而减轻体重。
艾塞那肽需要每天注射两次，在临床使用中非常不方便。为了解决这一问题，目前已有许多研究，通过对艾塞那肽进行结构修饰，来延长其在体内的药效作用时间。比如，通过其氨基酸侧链进行聚乙二醇化修饰，或与长链脂肪酸偶联，来延长其半衰期；或者开发艾塞那肽缓释微球制剂等。这些方法虽然能够延长药效作用时间，但是改造后分子往往存在药效降低、副作用增加等问题，因而需要开发能够有效延长药效时间，同时具有更好的活性与疗效的新的艾塞那肽衍生物。
通过对艾塞那肽与其受体蛋白GLP-1R的结合方式与结合位点的研究表明，艾塞那肽序列从Leu10到Asn28形成一段两亲性α-螺旋结构，位于疏水面的Val19Phe22、Ile23、Leu26与GLP-1R的疏水空腔相互作用，位于亲水面的Arg20、Lys27通过氢键与GLP-1R相互作用，这些氨基酸残基是重要的活性位点。艾塞那肽这种α-螺旋结构对于保持其生物活性极为重要。然而化学合成的多肽通常都是一段无序的结构，很难保持其在生理条件下的二级结构。因此，通过发展合适的化学修饰方法，来稳定合成多肽的α-螺旋结构，一方面可以增强其与受体的亲和力，另一方面，还能大幅提升多肽的抗蛋白水解能力，这种方法在多肽药物改造方面具有重要的潜在应用价值。通常可以通过在多肽序列合适的位置侧链成环的方式来稳定多肽的α-螺旋结构，侧链一般在多肽α-螺旋的同一面上，侧链氨基酸的 位置一般为i/i+3，i/i+4，i/i+7，i/i+11等，其中应用较多的是i/i+4和i/i+7。
本发明以艾塞那肽为模板，通过用Cys替换i/i+4位置上的氨基酸，然后通过连接臂侧链成环的策略，来稳定艾塞那肽的α-螺旋结构。通过这种方法得到的艾塞那肽衍生物，在保留良好的体内降糖活性的同时，解决了天然艾塞那肽体内半衰期短的问题，这种艾塞那肽衍生物在治疗和预防糖尿病的药物中具有更大的应用潜力。
发明内容
本发明的一个目的是针对临床上艾塞那肽在体内半衰期短，需要频繁注射给药的缺陷，提供一种作用时间更长、疗效更好的艾塞那肽衍生物。
本发明的另一个目的是提供该艾塞那肽衍生物的制备方法。
本发明的又一个目的是提供该艾塞那肽衍生物在治疗/预防糖尿病的药物中的应用。
用于实现上述目的的技术方案如下：
本发明提出了一种艾塞那肽衍生物，所述衍生物为在相对于序列艾塞那肽第i和i+4的位置上的氨基酸用Cys替换，然后通过连接臂(linker)成环后形成的化合物，其中i的取值为10，12，13，14，16，20，24，所述连接臂(linker)选自化学式1-4：
化学式1：
化学式2：
化学式3：
化学式4：
当i＝10时，艾塞那肽衍生物的结构如式(I)所示：
式(I)
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的艾塞那肽衍生物记为Ia；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为Ib；当连接臂(1inker)的结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为Ic；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的艾塞那肽衍生物记为Id；
当i＝12时，艾塞那肽衍生物的结构如式(II)所示：
式(II)
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的艾塞那肽衍生物记为IIa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为IIb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为IIc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的艾塞那肽衍生物记为IId；
当i＝13时，艾塞那肽衍生物的结构如式(III)所示：
式(III)
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的艾塞那肽衍生物记为IIIa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为IIIb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为IIIc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的艾塞那肽衍生物记为IIId；
当i＝14时，艾塞那肽衍生物的结构如式(IV)所示：
式(IV)
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的艾塞那肽衍生物记为IVa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为IVb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为IVc当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的艾塞那肽衍生物记为IVd；
当i＝16时，艾塞那肽衍生物的结构如式(V)所示：
式(V)
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的艾塞那肽衍生物记为Va；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为Vb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为Vc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的艾塞那肽衍生物记为Vd；
当i＝20时，艾塞那肽衍生物的结构如式(VI)所示：
式(VI)
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的艾塞那肽衍生物记为VIa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为VIb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为VIc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的艾塞那肽衍生物记为VId；
当i＝24时，艾塞那肽衍生物的结构如式(VII)所示：
式(VII)
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的艾塞那肽衍生物记为VIIa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为VIIb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为VIIc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的艾塞那肽衍生物记为VIId；
本发明也提出了上述艾塞那肽衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)相对于序列艾塞那肽第i和i+4的位置上的氨基酸用Cys替换的线性多肽的固相合成；
(2)步骤(1)得到的Cys替换的线性多肽与连接臂反应成环，经HPLC纯化、冷冻干燥得到所述的艾塞那肽衍生物。
步骤(1)中，先将用于多肽合成的树脂置于固相反应器，再将带保护的氨基酸单体按照序列，从C端到N端依次偶联，合成带侧链保护基的线性多肽树脂，再经脱除保护基、切断树脂、HPLC纯化，得到第i和i+4的位置上的氨基酸用Cys替换的艾塞那肽线性多肽衍生物；所述的带保护的氨基酸单体选自于：Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-His(Trt)-OH；
步骤(2)中，将步骤(1)中得到的第i和i+4的位置上的氨基酸用Cys替换的艾塞那肽线性多肽衍生物溶解于体积比为(0.1～10)∶1的乙腈-水的混合溶液中，调节pH值至7.5～8.5，然后加入5～10摩尔当量的连接臂，室温下反应0.5～4小时，经HPLC纯化、冷冻干燥得到艾塞那肽衍生物。
本发明还提出了上述艾塞那肽衍生物在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
附图说明
图1艾塞那肽衍生物的体外活性实验
图2MIN6细胞胰岛素分泌。(A：空白对照组，B：艾塞那肽，C：艾塞那肽衍生物IIIa，D：艾塞那肽衍生物IIIb，E：艾塞那肽衍生物IIIc，F：艾塞那肽衍生物IIId.*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.)
图3B6小鼠血浆中胰岛素分泌(n＝6/组，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。(A：空白对照组，B：艾塞那肽，C：艾塞那肽衍生物IIIa，D：艾塞那肽衍生物IIIb，E：艾塞那肽衍生物IIIc，F：艾塞那肽衍生物IIId。
图4B6小鼠IPTGG(***p＜0.0050.5-8h各时间点检测值；在12h检测值，##p＜0.01：艾塞那肽衍生物IIIa，IIIc，IIId，###p＜0.005：艾塞那肽衍生物IIIb；在24h检测值，#p＜0.05：艾塞那肽衍生物IIIa**p＜0.01：艾塞那肽衍生物IIId。
图5db/db鼠IPTGG.(n＝5/组，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。
图6Ex-1和Ex-2在SD大鼠体内的药动参数汇总表
具体实施方式
本发明包含但不局限于以下实施例。
试剂名称缩写：
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
DCM：二氯甲烷
NMP：N-甲基吡咯烷酮
DIC：N，N’-二异丙基碳二亚胺
TFA：三氟乙酸
DIPEA：N，N’二异丙基乙胺
NMM：N-甲基吗啉
HOBt：1-羟基苯并三唑
HOAt：N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑
HOOBt：3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮
Cl-HOBt：6-氯-1-羟基苯并三氮唑
HBTU：苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯
HATU：2-7(偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯
PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
PyAOP：(3H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基磷六氟磷酸盐
PPTS：对甲苯磺酸吡啶盐
DMP：2，2-二甲氧基丙烷
EDT：1，2-乙二硫醇
PIP：哌啶
TIS：三异丙基硅烷
本发明中艾塞那肽衍生物的制备方法采用通常的Fmoc固相合成法合成：
实施例1：艾塞那肽衍生物Ia的合成
(1)合成Cys替换的线性多肽
称取2g替代度为0.6mmol/g的RinkAmide树脂于固相反应器中，加入DCM溶胀20min，随后加入20％PIP/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干。向固相反应器中加入Fmoc-Ser(tBu)-OH(4mmol)、HOBt(0.648g，4.8mmol)、DIC(0.7mL，4.8mmol)、DMF(10mL)，20℃反应1h。将树脂洗涤抽干，即得Fmoc-Ser(tBu)-RinkAmide树脂，测得树脂替代度为0.46mmol/g。向树脂中加入封闭试剂8mL(醋酸酐(mmol)∶DIPEA (mmol)＝1∶1)，反应2.5h，封闭剩余的氨基，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤。加入20％PIP/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤，得H-Ser(tBu)-Rink Amide树脂；
取2g上一步得到的H-Ser(tBu)-Rink Amide树脂于固相反应器中，加入Fmoc-Pro-OH(2.76mmol)、HOBt(0.448g，3.3mmol)、DIC(0.5mL，3.3mmol)、DMF(10mL)，30℃反应2h。偶联完成度可以使用Kaiser测试检测；检测通过后，用20％PIP/DMF溶液脱除Fmoc保护基5+15min，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤。以此方法依次偶联剩余的氨基酸，得到侧链全保护多肽树脂6.87g。
将此侧链全保护多肽树脂用20％PIP/DMF溶液5mL反应5min，DMF洗涤一次，再加入20％PIP/DMF溶液5mL反应15min，抽干，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤，抽干；配置裂解液，其各组分体积比为TFA∶EDT∶苯甲醚∶苯甲硫醚∶水＝90∶2.5∶2.5∶2.5∶2.5；将裂解液加入固相反应器中，与脱除了N端保护基产物在室温下震荡反应2h后，将反应液注入乙醚中，沉淀，离心后收集白色固体沉淀，经HPLC纯化、冷冻干燥，即得Cys替换的线性多肽。
(2)合成艾塞那肽衍生物Ia
称取0.1g步骤(1)中得到的Cys替换的线性多肽，置于50mL圆底烧瓶中，加入5mL乙腈水溶液(乙腈∶水＝4∶1)溶解，用碳酸氢铵饱和溶液调节pH至8-9；将200mg溶解于3mL乙腈中的4，4’-二(溴甲基)二苯醚加入圆底烧瓶中，搅拌反应1h，加入0.3mL醋酸淬灭反应，得到的产物经HPLC分离纯化、冷冻干燥，得到艾塞那肽衍生物Ia。
实施例2：艾塞那肽衍生物IIIb的合成
(1)合成Cys替换的线性多肽
同实施例1步骤(1)，不同之处仅在于Cys替换的位置和氨基酸为Asn13和Glu17。
(2)合成艾塞那肽衍生物IIIb
称取0.1g步骤(1)中得到的Cys替换的线性多肽，置于50mL圆底烧瓶中，加入8mL乙腈水溶液(乙腈∶水＝2∶1)溶解，用碳酸氢铵饱和溶液调节pH至 8-9；将150mg溶解于3mL乙腈中的N，N′-benzene-1，4-diylbis(2-bromoacetamide)加入圆底烧瓶中，搅拌反应1h，加入0.3mL醋酸淬灭反应，得到的产物经HPLC分离纯化、冷冻干燥，得到艾塞那肽衍生物IIIb。
实施例3：艾塞那肽衍生物IVc的合成
(1)合成Cys替换的线性多肽
同实施例1步骤(1)，不同之处仅在于Cys替换的位置和氨基酸为Met14和Ala18。
(2)合成艾塞那肽衍生物IVc
称取0.1g步骤(1)中得到的Cys替换的线性多肽，置于50mL圆底烧瓶中，加入8mL乙腈水溶液(乙腈∶水＝2∶1)溶解，用碳酸氢铵饱和溶液调节pH至8-9；将120mg溶解于3mL乙腈中的1，3-二碘丙烷加入圆底烧瓶中，搅拌反应0.5h，加入0.3mL醋酸淬灭反应，得到的产物经HPLC分离纯化、冷冻干燥，得到艾塞那肽衍生物IVc。
实施例4：艾塞那肽衍生物VId的合成
(1)合成Cys替换的线性多肽
同实施例1步骤(1)，不同之处仅在于Cys替换的位置和氨基酸为Arg20和Glu24。
(2)合成艾塞那肽衍生物VId
称取0.1g步骤(1)中得到的Cys替换的线性多肽，置于50mL圆底烧瓶中，加入8mL乙腈水溶液(乙腈∶水＝2∶1)溶解，用碳酸氢铵饱和溶液调节pH至8-9；将150mg溶解于3mL乙腈中的1，5-二碘戊烷加入圆底烧瓶中，搅拌反应0.5h，加入0.3mL醋酸淬灭反应，得到的产物经HPLC分离纯化、冷冻干燥，得到艾塞那肽衍生物VId。
实施例5：艾塞那肽衍生物的体外活性实验
通过使用Perkin-Elmer的FlashPlateTM cAMP试剂盒，在由艾塞那肽及本发明艾塞那肽衍生物刺激GLP-1R后测量cAMP的诱导来评估本发明艾塞那肽衍生物的体外活性。简要地说，将表达人GLP-1R(通过转染GLP-1R的cDNA和选择稳定克隆而产生的稳定细胞系)的CHO细胞以每孔4000个细胞接种于96孔微量滴定板，并在生长培养基中培育48h。移除生长培养基并用缓冲液(含有20mM HEPES，0.1％BSA，pH 7.4)洗涤细胞一次，在室温下，将细胞在含有浓度递增的测试化合物(浓度10-12到10-6M)、0.33mM IBMX和0.67mM R020-1724的缓冲液中孵育1h，然后细胞用1％的Triton X-100处理，产生的cAMP用Perkin-Elmer的FlashPlateTM cAMP试剂盒测量，EC50值用XLfit软件进行计算得到，结果如图1所示。
图1结果表明：环化修饰的艾塞那肽衍生物显示出与未修饰的艾塞那肽非常接近的体外活性，其中在13/17位和14/18环化修饰后的衍生物显示出更好的活性水平。
实施例6
以艾塞那肽衍生物IIIa，IIIb，IIIc，IIId为受试药物，测试其刺激MIN6细胞胰岛素分泌。
MIN6细胞接种在24孔板中(50w细胞/孔)，24小时后移除上清。每孔用HEPES-balanced Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer(119mmol/l NaCl，4.74mmol/l KCl，2.54mmol/l CaCl2，1.19mmol/lKH2PO4，25mmol/l NaHCO3，and 10mmol/l HEPES，pH 7.4and 0.5％BSA)预处理1小时后，再用含有16.7mM葡萄糖的KRBH溶液配置艾塞那肽衍生物IIIa，IIIb，IIIc，IIId及艾塞那肽(10nmol/l)的工 作液处理1小时。上清中的胰岛素通过小鼠insulin ELISA kit测定。结果如图2所示。
结论：艾塞那肽衍生物IIIa，IIIb，IIIc，IIId可以有效刺激MIN6细胞胰岛素分泌。
实施例7
以艾塞那肽衍生物IIIa，IIIb，IIIc，IIId为受试药物，测试其刺激B6小鼠血浆胰岛素分泌。
取8周龄雄性B6小鼠腹腔注射葡萄糖(2g/kg小鼠体重)和艾塞那肽衍生物IIIa，IIIb，IIIc，IIId(10nmol/kg小鼠体重)及艾塞那肽(10nmol/kg小鼠体重)。在第20min时摘眼球取血，血浆中胰岛素水平通过ELISA法测定，结果如图3所示。
结论：艾塞那肽衍生物IIIa，IIIb，IIIc，IIId可以有效刺激B6小鼠体内胰岛素分泌。
实施例8：艾塞那肽衍生物在B6小鼠体内降糖实验
雄性B6小鼠(7-8周)用来测量药物对禁食后小鼠血糖的影响。腹腔内葡萄糖耐量测试之前小鼠过夜禁食12h，葡萄糖(2g/kg小鼠体重)、PBS、艾塞那肽衍生物IIIa、IIIb、IIIc、IIId(10nmol/kg小鼠体重)、艾塞那肽(10nmol/kg小鼠体重)分别通过腹腔注射到小鼠体内。样品注射后，在0-24h内通过尾静脉取血，血糖水平通过一键式血糖仪(one-touch blood glucose meter)ACCU-CHEK Active(Roche Diagnostics，Germany)测得，在每次测量之前0.5h，重新注射一次葡萄糖(2g/kg小鼠体重)，结果如图4所示。
结论：在B6小鼠体内，艾塞那肽衍生物IIIa，IIIb，IIIc，IIId在12h仍可起到有效降低血糖的作用，而未经修饰的艾塞那肽在12h时失去降低血糖的作用。
实施例9：艾塞那肽衍生物在db/db小鼠体内降糖实验
雄性db/db小鼠(9-10周)用来测量药物对随机血糖的影响。在非禁食状态下，小鼠腹腔注射PBS、艾塞那肽衍生物IIId(10nmol/kg小鼠体重)、艾塞那肽(10nmol/kg小鼠体重)。在0-24h内通过尾静脉取血，测量血糖水平，结果如图5所示。
结论：在db/db小鼠体内，每天注射两次艾塞那肽和每天注射一次艾塞那肽衍生物IIId，在第2h、4h、6h都可起到有效降低血糖的作用；在第8h，艾塞那肽衍生物IIId仍可起到有效降低血糖的作用，而未经修饰的艾塞那肽在第8h失去降低血糖的作用。
实施例10：艾塞那肽衍生物的体内药代动力学实验
雄性SD大鼠两组，分别皮下注射给予0.418mg/kg的艾塞那肽(Ex-1)以及0.420mg/kg的艾塞那肽衍生物IIId(Ex-2)，均未见任何异常，提示动物对该皮下注射剂量的艾塞那肽(Ex-1)和艾塞那肽衍生物IIId(Ex-2)均耐受；于不同时间点采集全血样品，低温离心分离血浆，经有机溶剂处理后采用液相色谱-串联质谱法测定了大鼠血浆中艾塞那肽(Ex-1)和艾塞那肽衍生物IIId(Ex-2)的浓度。艾塞那肽(Ex-1)和艾塞那肽衍生物IIId(Ex-2)的定量范围为10-2000ng/mL。药代动力学参数使用Winonlin(V6.3)按照非房室模型计算得出，见图6。
结论：修饰后的艾塞那肽衍生物IIId在SD大鼠体内的半衰期较未经修饰的艾塞那肽延长一倍。
Claims (7)
1.一种艾塞那肽衍生物，所述衍生物为在相对于序列艾塞那肽第i和i+4的位置上的氨基酸用Cys替换，然后通过连接臂(linker)成环后形成的化合物，其中i的取值为10，12，13，14，16，20，24，所述连接臂(linker)选自化学式1-4：
化学式1：
化学式2：
化学式3：
化学式4：
2.根据权利要求1所述的艾塞那肽衍生物，其特征在于：
当i＝10时，艾塞那肽衍生物的结构如式(I)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的艾塞那肽衍生物记为Ia；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为Ib；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为Ic；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的艾塞那肽衍生物记为Id；
当i＝12时，艾塞那肽衍生物的结构如式(II)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的艾塞那肽衍生物记为IIa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为IIb； 当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为IIc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的艾塞那肽衍生物记为IId；
当i＝13时，艾塞那肽衍生物的结构如式(III)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的艾塞那肽衍生物记为IIIa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为IIIb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为IIIc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的艾塞那肽衍生物记为IIId；
当i＝14时，艾塞那肽衍生物的结构如式(IV)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的艾塞那肽衍生物记为IVa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为IVb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为IVc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的艾塞那肽衍生物记为IVd；
当i＝16时，艾塞那肽衍生物的结构如式(V)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的艾塞那肽衍生物记为 Va；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为Vb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为Vc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的艾塞那肽衍生物记为Vd；
当i＝20时，艾塞那肽衍生物的结构如式(VI)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的艾塞那肽衍生物记为VIa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为VIb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为VIc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的艾塞那肽衍生物记为VId；
当i＝24时，艾塞那肽衍生物的结构如式(VII)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的艾塞那肽衍生物记为VIIa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为VIIb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为VIIc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的艾塞那肽衍生物记为VIId。
3.根据权利要求1所述的艾塞那肽衍生物的合成方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)相对于序列艾塞那肽第i和i+4的位置上的氨基酸用Cys替换的线性多肽的固相合成；
(2)步骤(1)得到的Cys替换的线性多肽与连接臂反应成环，经HPLC纯化、冷冻干燥得到所述的艾塞那肽衍生物。
4.根据权利要求2所述的艾塞那肽衍生物的合成方法，其特征在于，步骤(1) 中，先将用于多肽合成的树脂置于固相反应器，再将带保护的氨基酸单体按照权利要求1或2所述序列，从C端到N端依次偶联，合成带侧链保护基的线性多肽树脂，再经脱除保护基、切断树脂、HPLC纯化，得到第i和i+4的位置上的氨基酸用Cys替换的艾塞那肽线性多肽衍生物。
5.根据权利要求2所述的艾塞那肽衍生物的合成方法，其特征在于，步骤(2)中，将步骤(1)中得到的第i和i+4的位置上的氨基酸用Cys替换的艾塞那肽(7-37)线性多肽衍生物溶解于体积比为(0.1～10)∶1的乙腈-水的混合溶液中，调节pH值至7.5～8.5，然后加入5～10摩尔当量的连接臂，室温下反应0.5～4小时，经HPLC纯化、冷冻干燥得到艾塞那肽衍生物。
6.根据权利要求2所述的艾塞那肽衍生物的合成方法，所述的带保护的氨基酸单体选自于：Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-His(Trt)-OH。
7.如权利要求1所述的艾塞那肽衍生物在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
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Application publication date: 20150610 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |