CN110054690A - 用于治疗的抗adm抗体或抗adm抗体片段 - Google Patents

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Abstract

本发明的主题是抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或所述片段分别是非中和抗体或抗体片段。本发明的主题是还有用于治疗慢性病或急性病的抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段是：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的t1/2半滞留时间增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选100％的ADM稳定抗体或肾上腺髓质素稳定抗体片段，和/或其中所述抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。

Description

用于治疗的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段
发明领域
本发明的主题是抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架是非中和抗体。
本发明的主题是抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架是
·使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的半哀期(t1/2半滞留时间)增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选100％的ADM稳定抗体或ADM稳定抗体片段或ADM稳定非Ig骨架，和/或
·其中所述ADM稳定抗体或肾上腺髓质素稳定抗体片段或ADM稳定非Ig骨架封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
上文所述的含义是分别封闭不超过80％或不超过50％的ADM生物活性，并且因此应当被理解为，通过各自的ADM结合剂(其为ADM稳定抗体或抗体片段或非Ig骨架)有限地封闭ADM生物活性或降低ADM生物活性。隐含地说，这意味着ADM生物活性是有剩余的。例如，假设封闭不超过80％的ADM生物活性，即存在约20％的残余ADM生物活性。假设封闭不超过50％的ADM生物活性，即存在约50％的残余ADM生物活性。
本发明的主题是抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架结合人肾上腺髓质素的N端部分(aa1-21)。
在优选的实施方案中，本发明的主题是抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架结合人肾上腺髓质素的N末端(aa1)。
发明背景
肽肾上腺髓质素(ADM)于1993年(Kitamura，K.，et al.，″Adrenomedullin：ANovel Hypotensive Peptide Isolated From Human Pheochromocytoma″，Biochemicaland Biophysical Research Communications，Vol.192(2)，pp.553-560(1993))首次被描述为一种新的包含52个氨基酸的降压肽，其分离自人嗜铬细胞瘤，序列为SEQ ID No.：21。在同一年，还描述了编码包含185个氨基酸的前体肽的cDNA和该前体肽的全部氨基酸序列。前体肽(其在N-末端包含21个氨基酸的信号序列及其他序列)被称为″肾上腺髓质素前体原″(pre-proADM)。在本说明书中，指定的所有氨基酸位置通常都涉及包含185个氨基酸的pre-proADM。肽肾上腺髓质素(ADM)是包含52个氨基酸的肽(SEQ ID NO：21)，其包含 pre-proADM的氨基酸95至146，通过蛋白水解切割而形成。迄今为止，实质上在pre-proADM 切割所形成的肽片段中仅有少数几个片段得到更为精确的表征，具体为生理活性的肽肾上腺髓质素(ADM)和″PAMP″，其为包含20个氨基酸(22-41)的肽，其在pre-proADM的21个氨基酸的信号肽之后。1993年ADM的发现和表征引发了集中的科研活动，其结果在多篇综述文章中概述，在本说明书的背景下，具体参照致力于ADM的″肽类″出版物中出现的文章，尤其是(Editorial，Takahashi，K.，″Adrenomedullin：from a pheochromocytoma to the eyes″，Peptides，Vol.22，p.1691(2001))和(Eto，T.，″A review of the biological propertiesand clinical implications of Adrenomedullin and proAdrenomedullin N-terminal20peptide(PAMP)，hypotensive and vasodilating peptides″，Peptide s，Vol.22，pp.1693-1711(2001))。其他综述是(Hinson，et al.，″Adrenomedullin，aMultifunctional Regulatory Peptide″，Endocrine Reviews，Vol.21(2)，pp.138-16 7(2000))。在迄今为止的科学研究中，除其他方面以外，已经发现ADM可以视为多功能的调节肽。其以甘氨酸延伸的非活性形式释放至循环中(Kitamura，K.，et al.，″Theintermediate form of glycine-extended adrenomedullin is the maj或circulatingmolecular form in human plasma″，Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.244(2)，pp.551-555(1998).仅摘要)。还有一种结合蛋白(Pio，R.，et al.，″Complement Factor H is aSerum-binding Protein f或adrenomedullin，and the Resulting Complex Modulatesthe Bioactivities of Both Partners″，The Journal of Biological Chemistry，Vol.27 6(15)，pp.12292-12300(2001))，其对ADM是特异性的，并且可能同样调节ADM的效应。ADM 以及PAMP的那些生理效应(其是迄今为止研究中的主要关注点)是影响血压的效应。
因此，ADM是有效的血管舒张药，因此，将降压效应与ADM的C-端部分中的特定肽区段关联起来是可能的。此外，已经发现，上文提到的由pre-proADM形成的另一种生理活性肽PAMP同样表现出降压效应，即使其似乎具有不同于ADM的作用机制(除了上文提到的综述文章之外还参见(Eto，T.，″A review of the biological properties and clinicalimplications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal20peptide(PAMP)，hypotensive and vasodilating peptides″，Peptides，V ol.22，pp.1693-1711(2001))和(Hinson，et al.，″adrenomedullin，a Multifunctional RegulatoryPeptide″，Endocrine Reviews，Vol.21(2)，pp.138-167(2000))，还有 (Kuwasako，K.，etal.，″Purification and characterization of PAMP-12(PAMP-20)in porcine adrenalmedulla as a major endogenous biologically active peptide″，FEBS Lett，Vol.414(1)，pp.105-110(1997).仅摘要)、(Kuwasaki，K.，et al.，″Increased plasmaproadrenomedullin N-terminal20peptide in patients with essentialhypertension″，Ann.Clin.Biochem.，Vol.36(Pt.5)，pp.622-628(1999).仅摘要)或(Tsuruda，T.，et al.，″Secretion of proadrenomedullin N-terminal20peptide fromcultured neonatal rat cardiac cells″，Life Sci.，Vol.69(2)，pp.239-245(2001). 仅摘要)以及EP-A20622458)。此外已经发现，在多种病理状态下，循环以及其他生物液体中可以测量到的ADM的浓度显著高于健康对照个体中所存在的浓度。因此，充血性心力衰竭、心肌梗死、肾病、高血压病、糖尿病、急性期休克以及败血症和败血性休克患者中的ADM水平显著增加，尽管程度不同。PAMP浓度在所述病理状态的一些当中也增加，但是血浆水平相对于ADM较低((Eto，T.，″A review of the biological properties and clinicalimplications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal20pe ptide(PAMP)，hypotensive and vasodilating peptides″，Peptides，Vol.22，pp.1693-1 711(2001))；1702页)。此外，已知在败血症中观察到不寻常的高浓度的ADM，并且在败血性休克中观察到最高的浓度(参见(Eto，T.，″A review of the biological properties andclinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-termina120peptide(PAMP)，hypotensive and vasodilating peptides″，Peptides，Vol.22，pp.1693-1711(2001))、(Hirata，et al.，″Increased Circulating adrenomedullin，aNovel Vasodilatory Peptide，in Sepsis″，Journal of Clinical Endocrinology andMetabolism，Vol.81(4)，pp.1449-1453(1996))、(Ehlenz，K.，et al.，″High levels ofcirculating adrenomedullin in severe illness：Correlation with C-reactiveprotein and evidence against the adrenal medulla as site of origin″.Exp ClinEndocrinol Diabetes，Vol.105，pp.156-162(1997))、(Tomoda，Y.，et al.，″Regulationof adrenomedullin secretion from cultured cells″，Peptides，Vol.22，pp.1783-1794(2001))、(Ueda，S.，et al.，″Increased Plasma Levels of adrenomedullin inPatients with Systemic Inflammatory Response Syndrome″，Am.J.Respir.Crit.CareMed.，Vol.160，pp.132-136(1999))以及(Wang，P.，″adrenomedullin and cardiovascularresponses in sepsis″，Peptides，Vol.22，pp.1835-1840(2001))。
本领域内还已知用于诊断目的的、并且具体而言在败血症诊断、心脏诊断和癌症诊断范围内的鉴定生物液体中肾上腺髓质素免疫反应性的方法。根据本发明，肾上腺髓质素前体的中央区部分肽，其包含整个肾上腺髓质素前体原的氨基酸(45-92)，具体而言用免疫测定来测量，所述免疫测定利用至少一种特异性识别mid-proADM序列的标记抗体进行(W02004/090546)。
WO-A12004/097423描述了针对肾上腺髓质素的抗体用于心血管病的诊断、预后和治疗的用途。通过阻断ADM受体来治疗疾病在本领域内也有描述，(例如 WO-A12006/027147，PCT/EP2005/012844)，所述疾病可以是败血症、败血性休克、心血管疾病、感染、皮肤病、内分泌疾病、代谢疾病、胃肠道疾病、癌症、炎症、血液学疾病、呼吸道疾病、肌肉骨骼疾病、神经疾病、泌尿系统疾病。
据报道，对于早期败血症，ADM改善心脏功能以及肝脏、脾脏、肾脏和小肠中的血液供应。ADM中和抗体在早期败血症中中和以前提到的效应(Wang，P.，″Adrenomedullin andcardiovascular responses in sepsis″，Peptides，Vol.22，pp.1835-1840(2001)。
在晚期败血症中，即败血症的低动力阶段，ADM构成与败血性休克中患者的死亡率密切相关的风险因子(Schütz et al.，“Circulating Precurs或levels of endothelin-land adrenomedullin，two endothelium-derived，counteracting substances，insepsis”，Endothelium，14：345-351，(2007))。危重患者(例如在败血症的极晚期)的诊断和治疗方法，以及具有血管收缩活性的内皮素和内皮素激动剂在制备用于治疗危重患者的药物中的用途描述于WO-Al2007/062676中。WO-Al2007/062676中还描述了使用肾上腺髓质素拮抗剂代替内皮素和/或内皮素激动剂或将其联合，所述肾上腺髓质素拮抗剂即例如通过阻断其相关的受体来阻止或减弱肾上腺髓质素的血管舒张活性的分子，或者阻止肾上腺髓质素与其受体结合的物质(例如，特异性的结合剂，如结合肾上腺髓质素并阻断其受体结合位点的抗体，“免疫学中和“)。这样使用或联合使用，包括随后或之前的单独使用，在某些情况下已被描述为适于例如提高治疗成功率，或者避免不良的生理应力或副作用。因此，据报道，中和ADM的抗体可用于治疗处于晚期败血症的败血症。
本领域内描述给予ADM和ADM结合蛋白1来治疗败血症和败血性休克。据推测，用ADM和ADM结合蛋白1治疗败血症动物阻止了向晚期败血症的转变。应当注意，在活的生物体中，ADM结合蛋白(补体因子H)以高浓度存在于所述生物体的循环中(Pio et al.：Identification，characterization，and physiological actions of factor H as anAdrenomedullin binding Protein present in Human Plasma； Microscopy Res.andTechnique，55：23-27(2002)和Martinez et al.；Mapping of the Adrenomedullin-Binding domains in Human Complement factor H；Hypertens Res Vol.26，Suppl(2003)，S56-59)。
根据本发明，ADM结合蛋白1还可以被称为ADM结合蛋白1(补体因子H)。
因而，给予ADM在早期疾病例如像败血症中可能是有利的，但是在晚期败血症中可能是有害的。对立面可能就是给予抗ADM抗体的情况。此外，当施加ADM或抗ADM抗体时，剂量可能是关键。
对于其他疾病，在一定程度上封闭ADM可能是有利的。然而，如果ADM被完全中和也可能是有害的，因为一定量的ADM可能是一些生理功能所必需的。在很多报道中均强调，给予ADM在某些疾病中可能是有利的。与此相反，在其他报道中，当在某些疾病状态中给予时，ADM被报道为会威胁生命。现有技术的不足可以用本发明提供的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig骨架克服。
发明概述
本发明的主题是用作药物的抗肾上腺髓质素抗体或结合肾上腺髓质素的抗ADM抗体片段或结合肾上腺髓质素的抗ADM非Ig骨架，其中所述抗体或所述片段或所述骨架是非中和抗体或片段或骨架.
在整篇说明书中，本发明的“抗体”或“抗体片段”或“非Ig骨架”能够结合ADM，因此针对ADM，并因此可被称为“抗ADM抗体”、“抗ADM抗体片段”或“抗ADM非Ig骨架”。
在本发明的另一个实施方案中，本发明提供的抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig骨架能够结合循环的ADM，因此是针对循环ADM的。
在具体的实施方案中，所述抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig骨架是非中和抗体、片段或非Ig骨架。中和抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig骨架封闭接近100％、至少90％以上、优选至少95％以上的ADM生物活性。
相比之下，非中和抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig骨架封闭100％以下的ADM生物活性，优选95％以下、优选90％以下、更优选80％以下、且更优选50％(基线值)以下。这意味着与非中和抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig骨架结合的ADM 的残余生物活性为0％以上、优选5％以上、优选10％以上、更优选20％以上、更优选50％以上。其含义是分别封闭不超过80％或不超过50％的ADM生物活性，并且因此应当被理解为，通过各自的ADM结合剂(其为抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig骨架)有限的封闭ADM生物活性。
应当理解，所述有限地封闭ADM生物活性甚至在所述抗体、抗体片段或非Ig骨架的浓度过量(即所述抗体、片段或骨架相对于ADM过量)时也发生。所述有限的封闭是ADM 结合剂自身的固有性质。这表示，所述抗体抗体、片段或骨架分别具有80％或50％的最大抑制。在优选的实施方案中，所述抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig骨架封闭至少5％的ADM生物活性。这意味着-隐含地说-存在约95％的残余ADM生物活性。
本发明的主题是用于治疗慢性病或急性病的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段是
·使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的t1/2半滞留时间增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选100％的ADM稳定抗体或肾上腺髓质素抗体片段，和/或
·其中所述抗体或所述肾上腺髓质素抗体片段封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
本发明的主题是用于治疗慢性病或急性病的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段结合人肾上腺髓质素的N-端部分(aa1-21)。
在优选的实施方案中，本发明的主题是用于治疗慢性病或急性病的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段结合人肾上腺髓质素的N-末端。
在这种背景下，出于简化的目的，统称为“非中和”抗ADM抗体、抗体片段或非Ig骨架(其例如封闭80％以下的ADM生物活性)的具有“非中和抗ADM活性”的抗体或抗体片段或非Ig骨架的分子被定义为
·结合ADM的一种或多种分子，在添加至真核细胞系培养物之后，通过平行添加的合成的人ADM肽的作用降低所述细胞系所产生的cAMP的量，所述细胞系表达由CRLR(降钙素受体样受体)和RAMP3(受体活性修饰蛋白3)组成的功能性人重组ADM受体，其中所述添加的合成的人ADM以这样的量添加：在不存在待分析的非中和抗体的情况下，导致cAMP 合成的半最大刺激，其中所述分子结合ADM导致cAMP降低的程度不超过80％，甚至当待分析的能与ADM结合的所述非中和分子以所述量(用待分析的非中和抗体能得到的获得cAMP 的最大降低所需的)10倍以上的量添加时也如此。
相同的定义适用于其他范围：95％、90％、50％等。
生物活性被定义为这样的作用：一种物质在其相互作用后在体内或体外(例如，在测定中)呈现为活的生物体或组织或器官或功能单元。就ADM生物活性而言，这可以是 ADM在人重组肾上腺髓质素受体cAMP功能测定中的作用。因此，根据本发明，生物活性通过肾上腺髓质素受体cAMP功能测定来定义。为了在这样的测定中测定ADM生物活性，可以进行以下步骤：
·在所述人重组肾上腺髓质素受体cAMP功能测定中用ADM进行剂量反应曲线。
·可以计算半最大cAMP刺激的ADM浓度。
·在恒定的半最大cAMP刺激时，分别通过ADM稳定抗体或肾上腺髓质素稳定抗体片段或肾上腺髓质素稳定非Ig骨架进行ADM浓度剂量反应曲线(高达100μg/ml的终浓度)。
所述ADM生物测定中50％的最大抑制表示，所述抗ADM抗体或所述抗肾上腺髓质素抗体片段或所述抗肾上腺髓质素非Ig骨架分别封闭基线值50％的生物活性。所述ADM 生物测定中80％的最大抑制表示，所述抗ADM抗体或所述抗肾上腺髓质素抗体片段或所述抗肾上腺髓质素非Ig骨架分别封闭80％的ADM生物活性。其含义是封闭不超过80％的 ADM生物活性。这意味着仍存在约20％的残余ADM生物活性。
然而，通过本说明书以及在上述背景下，结合本文公开的抗ADM抗体、抗ADM抗体片段和抗ADM非Ig骨架而言，表述“封闭ADM的生物活性”应当被理解为仅降低ADM的生物活性，优选最大时将循环的ADM生物活性从100％降低至20％的剩余ADM生物活性，优选将ADM生物活性从100％降低至50％的剩余ADM生物活性，但是在任何情况下，仍有可以如上所述测定的ADM生物活性。
可以根据实施例2在人重组肾上腺髓质素受体cAMP功能测定(肾上腺髓质素生物测定)中测定ADM生物活性。
抗肾上腺髓质素(ADM)抗体是能特异性结合ADM的抗体，抗肾上腺髓质素抗体片段是ADM抗体的片段，其中所述片段能特异性结合ADM。抗ADM非Ig骨架是能特异性结合 ADM的非Ig骨架。特异性结合ADM也允许结合其他抗原。这意味着，该特异性不排除该抗体可以与激发该抗体的多肽之外的多肽交叉反应。这也适合本发明的抗ADM抗体片段或抗 ADM非Ig骨架的特异性。
出人意料的是，已经证明，非中和抗ADM抗体或非中和抗ADM抗体片段或非中和抗ADM非Ig骨架提供显著超越中和抗ADM抗体或中和抗ADM抗体片段或中和抗ADM非Ig骨架的治疗优势。
在一具体的实施方案中，优选使用本发明的抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架，其中所述抗肾上腺髓质素抗体或所述抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架是使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的半衰期(半滞留时间)增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选＞100％的ADM稳定抗体或肾上腺髓质素稳定抗体片段或肾上腺髓质素稳定非Ig骨架。
可以分别在不存在和存在ADM稳定抗体或肾上腺髓质素稳定抗体片段或肾上腺髓质素稳定非Ig骨架的条件下，使用定量ADM的免疫测定在人血浆中测定ADM的半衰期 (半滞留时间)。
可以进行以下步骤：
·可以分别在不存在和存在ADM稳定抗体或肾上腺髓质素稳定抗体片段或肾上腺髓质素稳定非Ig骨架的情况下，将ADM稀释于人柠檬酸血浆中，并且可以于24℃下孵育。
·在选择的时间点(例如24小时以内)采集等分式样，并且可以于-20℃冷冻来终止所述等分式样中ADM的降解。
·如果所选的测定不受稳定抗体影响，则直接通过hADM免疫测定来测定ADM的量。可选择地，可以用变性剂(像HCl)处理等分式样，在样品澄清(例如，通过离心)之后，使 pH处于中性并通过ADM免疫测定来定量ADM。可选择地，非免疫测定技术(例如rpHPLC) 可用于ADM定量。
·对于分别在不存在和存在ADM稳定抗体或肾上腺髓质素稳定抗体片段或肾上腺髓质素稳定非Ig骨架条件下孵育的ADM，计算ADM的半衰期。
·与不存在ADM稳定抗体或肾上腺髓质素稳定抗体片段或肾上腺髓质素稳定非Ig骨架条件下孵育的ADM相比，计算稳定ADM的半衰期增加。
ADM半衰期增加两倍为半衰期100％增加。
半衰期(半滞留时间)被定义为指定的化学品或药物的浓度在指定的液体或血液中降低至其基线浓度的一半所用的时间。
可以用于测定肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的半衰期(半滞留时间)的测定在实施例3中描述。
本发明的抗体是蛋白，包括实质上由免疫球蛋白基因编码的能特异性结合抗原的一种或多种多肽。公认的免疫球蛋白基因包括K、λ、α(IgA)、γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)、δ(IgD)、ε(IgE)和μ(IgM)恒定区基因以及无数的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白轻链长度通常为约25Kd或214个氨基酸。全长免疫球蛋白重链的长度通常为约50Kd 或446个氨基酸。轻链由位于NH2-端的可变区基因(长度约110个氨基酸)和位于COOH-端的κ或λ恒定区基因编码。重链同样由可变区基因(长度约116个氨基酸)和其他恒定区基因之一编码。
抗体的基本结构单元通常是由两对相同的免疫球蛋白链组成的四聚体，每一对都具有一条轻链和一条重链。在每对中，轻链和重链可变区结合抗原，而恒定区介导效应或功能。免疫球蛋白还以多种其他形式存在，包括例如，Fv、Fab和F(ab’)2以及双功能杂合抗体和单链抗体(例如，Lanzavecchia et al.，Eur.J.Immunol.17：105，1987； Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：5879-5883，1988；Bird et al.，Science242：423-426，1988；Hood et al.，Immunology，Benjamin，N.Y.，2nd ed.，1984；Hunkapiller and Hood，Nature323：15-16，1986)。免疫球蛋白轻链或重链可变区包括由三个高变区中断的框架区，所述高变区也称为互补决定区(CDR’s)(参见 Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，E.Kabat et al.，U.S.Department of Health and Human Services，1983)。如上文所指出的，CDR主要负责结合抗原的表位。免疫复合物是抗体如单克隆抗体、嵌合抗体人源化抗体或人抗体或功能性抗体片段特异性结合抗原。
嵌合抗体是这样的抗体：通过基因工程从属于不同物种的免疫球蛋白可变区和恒定区基因构建其轻链和重链基因。例如，可以将来自小鼠单克隆抗体基因的可变节段连接至人恒定节段如κ和γ1或γ3。在一个实例中，治疗性嵌合抗体因而是由来自小鼠抗体的可变结构域或抗原结合结构域和来自人抗体的恒定或效应结构域组成的杂合蛋白，尽管可以使用其他哺乳动物物种或通过分子技术产生可变区。制备嵌合抗体的方法是本领域内公知的，例如参见美国专利第5,807,715号。″人源化″免疫球蛋白是包括人框架区和非人 (诸如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为″供体″，提供框架的人免疫球蛋白称为″受体″。在一个实施方案中，人源化免疫球蛋白中的所有CDR都来自供体免疫球蛋白。不需要存在恒定区，但是如果存在，它们必须与人免疫球蛋白恒定区基本一致，即至少约85-90％，诸如约95％一致或更加一致。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分，可能除了CDR，都与天然人免疫球蛋白序列的对应部分基本一致。″人源化抗体″是包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体能与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体框架可以具有有限数量的来自供体框架的氨基酸的取代。人源化或其他单克隆抗体可以具有其他保守的氨基酸取代，其对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本上没有影响。示例性的保守取代是这样的取代，如gly，ala；val，ile，leu；asp，glu；asn，gln；ser，thr；lys，arg；以及phe，tyr。人源化免疫球蛋白可以通过基因工程的手段来构建(参见，例如美国专利第 5,585,089号)。人抗体是这样的抗体：其中轻链和重链基因来自人。人抗体可以利用本领域内已知的方法产生。人抗体可以通过使分泌目的抗体的人B细胞永生化来产生。永生化可以例如通过EBV感染或通过将人B细胞与骨髓瘤或杂交瘤细胞融合以产生三源杂交瘤细胞来实现。人抗体还可以通过噬菌体展示方法产生(参见例如，Dower et al.，PCT公开第 WO91/17271号；McCafferty etal.，PCT公开第WO92/001047号；以及Winter，PCT公开第WO92/20791号)，或从人组合单克隆抗体文库选择(参见Morphosys网站)。人抗体还可以利用携带人免疫球蛋白基因的转基因动物来制备(例如，参见Lonberg et al.，PCT公开第 WO93/12227号；以及Kucherlapati，PCT公开第WO91/10741号)。
因此，抗ADM抗体可以具有本领域内已知的形式。实例为人抗体、单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体。在优选的实施方案中，本发明的抗体是重组产生的抗体例如IgG(典型的全长免疫球蛋白)，或至少含有重链和/或轻链的F-可变结构域的抗体片段例如化学偶联的抗体(片段抗原结合)，其包括但不限于Fab-片段包括Fab微型抗体；单链Fab抗体；具有表位标签的单价Fab抗体如Fab-V5Sx2；与CH3结构域二聚化的二价Fab(微型抗体)；二价Fab或多价Fab，例如通过异源结构域的辅助多聚形成的，例如通过dHLX结构域的二聚化，例如Fab-dHLX-FSx2；F(ab‘)2-片段；scFv-片段；多聚的多价或/和多特异性scFv-片段；二价和/或双特异双体；(双特异T-细胞衔接器 (bispecific T-cellengager))；三功能抗体；多价抗体，例如来自不同于G的类别；单域抗体，例如来源于骆驼科动物或鱼免疫球蛋白等的纳米抗体。
除了抗ADM抗体之外，其他生物聚合物骨架在本领域内已知结合靶分子并且用于产生高靶标特异性的生物聚合物。实例为适体、镜像异构体(spiegelmer)、抗转运蛋白(anticalin)和芋螺毒素。为了示例抗体形式，请参见图1a、1b和1c。
在优选的实施方案中，抗ADM抗体形式选自Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab 片段、F(ab)2片段和scFv-Fc融合蛋白。在另一优选的实施方案中，抗体形式选自scFab片段、Fab片段、scFv片段及以上的生物利用率得到优化的缀合物，例如PEG化的片段。最优选的形式之一为scFab形式。
非Ig骨架可以是蛋白骨架并且可以用作抗体模拟物，因为它们能够结合配体或抗原。非Ig骨架可以选自基于四连接素的非Ig骨架(例如US2010/0028995中所描述的)、纤连蛋白骨架(例如EP1266025中所描述的)、基于脂质运载蛋白的骨架(例如 WO2011/154420中所描述的)、泛素骨架(例如WO2011/073214中所描述的)、转移骨架(例如US2004/0023334中所描述的)、蛋白A骨架(例如EP2231860中所描述的)、基于锚蛋白重复的骨架(例如WO2010/060748中所描述的)、微蛋白(优选形成胱氨酸结的微蛋白)骨架(例如EP2314308中所描述的)、基于Fyn SH3结构域的骨架(例如W02011/023685中所描述的)、基于EGFR-A结构域的骨架(例如WO2005/040229中所描述的)和基于Kunitz 结构域的骨架(例如EP1941867中所描述的)。
在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的抗体可以如下产生：
在第0天和第14天用100μg ADM-肽-BSA-缀合物(在100μl弗氏完全佐剂中乳化)并且在第21天和第28天用50μg ADM-肽-BSA-缀合物(在100μl弗氏不完全佐剂中)免疫Balb/c小鼠。在进行融合实验前的三天，动物接受溶解于100μl盐水中的 50μg缀合物，以一次腹膜内注射和一次静脉内注射给予。
在37℃下用1ml50％聚乙二醇使来自免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞融合30s。洗涤后，将细胞接种在96孔细胞培养板中。通过在HAT培养基[补充了20％胎牛血清和HAT补充物的RPMI1640培养基]中培养来选择杂交克隆。两周后，用HT培养基替换HAT培养基持续三代，然后恢复至正常的细胞培养基。
在融合后三周，主要筛查细胞培养上清液的抗原特异性IgG抗体。将测试为阳性的微培养物转移至24孔板用于增殖。在重新测试后，使用有限稀释技术使选择的培养物克隆和亚克隆，并确定亚型(还参见Lane，R.D.(1985).A short-duration polyethyleneglycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas.J.Immunol.Meth.81：223-228；Ziegler，B. et al.(1996)Glutamate decarboxylase(GAD)is not detectable on the surface of rat isletcells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediatedcytotoxicity of monoclonal GAD antibodies，Horm.Metab. Res.28：11-15)。
可以按以下方案通过噬菌体展示方式产生抗体：
人天然抗体基因文库HAL7/8用于针对肾上腺髓质素肽的重组单链F-可变结构域(scFv)的分离。用淘选策略(panning strategy)筛选抗体基因文库，包括使用这样的肽：其含有通过两个不同的间隔区连接至肾上腺髓质素肽序列的生物素标签。利用非特异性结合的抗原和链霉亲和素结合的抗原的混合淘选循环来使非特异性结合物的背景最低。将从第三轮淘选洗脱的噬菌体用于表达单克隆scFv的大肠杆菌菌株的生成。来自这些克隆菌株培养物的上清液直接用于抗原ELISA检测。(还参见Hust，M.，Meyer，T.，Voedisch，B.，Rülker，T.，Thie，H.，El-Ghezal，A.，Kirsch，M.I.，Schütte，M.，Helmsing，S.，Meier，D.，Schirrmann，T.，Dübel，S.，2011.A human scFv antibody generation pipeline forproteome research.Journal of Biotechnology152，159-170；Schütte，M.，Thullier，P.，Pelat，T .，Wezler，X.，Rosenstock，P.，Hinz，D.，Kirsch，M.I.，Hasenberg，M.，Frank，R.，Schirrma nn，T.，Gunzer，M.，Hust，M.，Dübel，S.，2009.Identification of a putativeCrf splice variant and generation of recombinant antibodies for the specificdetection of Aspergillus fumigatus.PLoS One4，e6625)。
鼠抗体的人源化可以根据以下方案进行：
对于鼠源抗体的人源化，分析抗体序列中框架区(FR)和互补决定区(CDR)与抗原的结构相互作用。基于结构建模，选择人源的合适的FR，并将鼠CDR序列移植入人FR中。可以在CDR或FR的氨基酸序列中引入变异以恢复结构相互作用，这种结构相互作用通过 FR序列的物种转换而被破坏。这种结构相互作用的恢复可以利用噬菌体展示文库通过随机方法实现，或者通过分子建模指导的指定方法来实现(Almagro JC，Fransson J.，2008.Humanization of antibodies.Front Biosci.2008Jan1；13：1619-33.)。
在优选的实施方案中，ADM抗体形式选自Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab片段、F(ab)2片段和scFv-Fc融合蛋白。在另一优选的实施方案中，抗体形式选自scFab片段、Fab片段、scFv片段及以上的生物利用率得到优化的缀合物，例如PEG化的片段。最优选的形式之一为scFab形式。
在另一优选的实施方案中，抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig骨架是全长抗体、抗体片段或非Ig骨架。
在优选的实施方案中，抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗肾上腺髓质素非Ig骨架针对ADM中所含的长度为至少5个氨基酸的表位并能够与其结合。
在具体的实施方案中，抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗肾上腺髓质素非Ig骨架针对ADM中所含的长度为至少4个氨基酸的表位并能够与其结合。
在本发明的一具体的实施方案中，抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或结合肾上腺髓质素的抗ADM抗体片段或结合肾上腺髓质素的抗ADM非Ig骨架被作为药物提供，其中所述抗体或片段或骨架不是ADM结合蛋白1(补体因子H)。
在本发明的一具体的实施方案中，抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或结合肾上腺髓质素的抗ADM抗体片段或结合肾上腺髓质素的抗ADM非Ig骨架被作为药物提供，其中所述抗体或抗体片段或非Ig骨架结合成熟人ADM的aa1-42序列内的优选至少4个或至少5个氨基酸的区域：
SEQ ID No.：24
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA。
在本发明的一具体的实施方案中，抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或结合肾上腺髓质素的抗ADM抗体片段或结合肾上腺髓质素的抗ADM非Ig骨架被作为药物提供，其中所述抗体或片段或骨架结合成熟人ADM的aa1-21序列内的优选至少4个或至少5个氨基酸的区域：
SEQ ID No.：23
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC.
因此，在本发明的具体的实施方案中，所述抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架结合ADM的位于肾上腺髓质素N-端部分(aa1-21)的区域(参见图 2)。
在另一优选的实施方案中，所述抗抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架识别并结合肾上腺髓质素的N-末端(aal)。N-末端意味着氨基酸1，即SEQ ID No.21 或23的“Y”；是抗体结合所必须的。所述抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig骨架既不结合N-端延长的肾上腺髓质素也不结合N-端修饰的肾上腺髓质素以及N-端降解的肾上腺髓质素。
使用本发明的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段也是优选的，其中所述抗体或肾上腺髓质素抗体片段是使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的t1/2半滞留时间增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选100％的ADM稳定抗体或ADM稳定肾上腺髓质素抗体片段。可用于测定肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的半滞留时间的分析描述于实施例3中。
使用本发明的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段也是优选的，其中所述抗体或所述肾上腺髓质素稳定抗体片段封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
在优选的实施方案中，调节抗体或调节肾上腺髓质素抗体片段用于败血症的治疗中。调节抗体或肾上腺髓质素抗体片段增加早期败血症中的ADM生物活性，但降低晚期败血症中ADM的破坏作用。“调节”抗体或调节肾上腺髓质素抗体片段是这样的抗体或肾上腺髓质素抗体片段：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的t1/2半滞留时间增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选100％且封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
在本发明的另一具体的实施方案中，本文提供的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig骨架不结合ADM的C-端部分，即ADM的aa43-52
PRSKISPQGY-NH2
(SEQ ID NO：25).
在具体的实施方案中，本发明的调节抗ADM抗体或调节抗肾上腺髓质素抗体片段或调节抗肾上腺髓质素非Ig骨架用于治疗个体以预防或治疗疾病或病症，例如用于预防或治疗个体的慢性病或急性病或急性病症。
这样的调节抗ADM抗体或调节抗肾上腺髓质素抗体片段或调节抗肾上腺髓质素非Ig骨架尤其可用于治疗败血症。调节抗ADM抗体或调节抗肾上腺髓质素抗体片段或调节抗肾上腺髓质素非Ig骨架增加早期败血症中的ADM生物活性但降低晚期败血症中ADM 的作用。
“调节”抗体或调节肾上腺髓质素抗体片段或调节肾上腺髓质素非Ig骨架是这样的抗体或抗体片段或非Ig骨架：其使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的半衰期(t1/2半滞留时间)增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选＞100％，并且封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性，其中ADM生物活性被封闭至少5％。这些与半衰期和生物活性封闭有关的数值应当被理解为与为确定这些数值的上分析相关。应当理解，所述调节抗体或调节肾上腺髓质素抗体片段或调节肾上腺髓质素非Ig骨架是结合ADM的抗体或抗体片段或非Ig骨架。
应当强调，封闭ADM生物活性意思是，封闭不超过80％，因而有20％的残余ADM生物活性。同样适用于封闭不超过50％的ADM生物活性，因而残余50％的ADM生物活性。
本发明的主题是抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架是
·ADM稳定抗体或肾上腺髓质素稳定抗体片段或ADM稳定非Ig骨架，其使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的t1/2半滞留时间增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选100％，和/或
·其中所述抗肾上腺髓质素抗体或所述抗肾上腺髓质素抗体片段或所述抗ADM非Ig骨架封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
上文所述的含义是分别封闭不超过80％或不超过50％的ADM生物活性，并且因此应当被理解为，通过各自的ADM结合剂(其为ADM稳定抗体或抗体片段或非Ig骨架)有限的封闭ADM生物活性。
这样的调节抗体或调节肾上腺髓质素抗体片段或调节肾上腺髓质素非Ig骨架提供这样的优势：促进定量给药。部分封闭或部分降低肾上腺髓质素生物活性以及增加体内半衰期(增加肾上腺髓质素生物活性)的组合，导致有利地简化抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗肾上腺髓质素非Ig骨架的定量给予。在内源肾上腺髓质素过量的情况下(最大刺激、晚期败血症、休克、衰弱期)，降低活性的作用是所述抗体或片段或骨架的主要影响，这限制了肾上腺髓质素的(负)作用。在低或正常的内源肾上腺髓质素浓度的情况下，抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架的生物效应是降低(通过部分封闭)增加(通过增加肾上腺髓质素半衰期)的组合。如果半衰期效应比封闭效应强，则内源肾上腺髓质素的净生物活性是在早期败血症(低肾上腺髓质素、高动力期)中有利地增加。因此，非中和和调节抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗肾上腺髓质素非Ig骨架像ADM生物活性缓冲剂一样起作用，以便使ADM生物活性维持在某生理范围内。
因此，抗体/片段/骨架在例如败血症中的定量给予可以选自过量的浓度，因为就调节作用而言，两个败血症阶段(早期和晚期)都从过量抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架治疗中受益。过量意味着：抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架浓度高于例如败血症晚期(休克)过程的肾上腺髓质素。这意味着，就调节抗体或调节抗体片段或调节非Ig骨架而言，败血症中的定量给予可以如下：
败血性休克中肾上腺髓质素的浓度是226+/-66fmol/ml(Nishio et a1.，″Increased plasma concentrations of adrenomedullin correlate with relaxationof vascular tone in patients with septic shock.″.Crit Care Med.1997，25(6)：953-7)，等摩尔浓度的抗体或片段或骨架是42.5μg/l血液，(基于6l血液体积/80kg体重)3.2μg/kg体重。过量意味着是败血性休克肾上腺髓质素浓度的至少二倍(平均)、至少＞3μg抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig 骨架/kg体重、优选至少6.4μg抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM 非Ig骨架/kg体重。优选＞10μg/kg、更优选＞20μg/kg、最优选＞100μg抗肾上腺髓质素抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗DM非Ig骨架/kg体重。
这也可以应用于败血性休克之外的其他重度和急性病症。
此外，在本发明的一个实施方案中，抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架是单一特异性的。单一特异性抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或单一特异性抗肾上腺髓质素抗体片段或单一特异性抗ADM非Ig骨架表示，所述抗体或抗体片段或非Ig骨架结合一个特异性区域，其包括靶ADM内的优选至少4个或至少5个氨基酸。单一特异性抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或单一特异性抗肾上腺髓质素抗体片段或单一特异性抗ADM非Ig骨架是具有对同一表位的亲和力的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架。在另一具体的实施方案中，结合ADM的抗ADM抗体或抗体片段是单一特异性抗体。单一特异性表示，所述抗体或抗体片段结合一个特异性区域，其包括靶ADM内的优选至少4个或至少5个氨基酸。单一特异性抗体或片段是具有对同一表位的亲和力的抗体或片段。单克隆抗体是单一特异性的，但是单一特异性抗体还可以由从同一生殖细胞产生它们之外的方法产生。
在本发明的具体的实施方案中，抗体是单克隆抗体或其片段。子啊本发明的一个实施方案中，抗ADM抗体或抗ADM抗体片段是人抗体或人源化抗体或从其产生的抗体。在一具体的实施方案中，一个或多个(鼠)CDR’s被移植入人抗体或抗体片段中。
在一方面，本发明的主题是结合ADM的人CDR移植抗体或其抗体片段，其中所述人CDR移植抗体或其抗体片段包含抗体重链(H链)，其包括：
SEQ ID NO：1
GYTFSRYW
SEQ ID NO：2
ILPGSGST
和/或
SEQ ID NO：3
TEGYEYDGFDY
和/或还包含抗体轻链(L链)，其包括：
SEQ ID NO：4
QSIVYSNGNTY
SEQ ID NO：5
RVS
和/或
SEQ ID NO：6
FQGSHIPYT。
在本发明的一具体实施方案中，本发明的主题是结合ADM的人单克隆抗体或其抗体片段，其中重链包含选自以下的至少一个CDR：
SEQ ID NO：1
GYTFSRYW
SEQ ID NO：2
ILPGSGST
SEQ ID NO：3
TEGYEYDGFDY
并且其中轻链包含选自以下的至少一个CDR：
SEQ ID No：4
QSIVYSNGNTY
SEQ ID NO：5
RVS
SEQ ID NO：6
FQGSHIPYT。
在本发明的一更具体的实施方案中，本发明的主题是是结合ADM的人单克隆抗体或其抗体片段，其中重链包含以下序列
SEQ ID NO：1
GYTFSRYW
SEQ ID NO：2
ILPGSGST
SEQ ID NO：3
TEGYEYDGFDY
并且其中轻链包含以下序列
SEQ ID NO：4
QSIVYSNGNTY
SEQ ID NO：5
RVS
SEQ ID NO：6
FQGSHIPYT。
在一非常具体的实施方案中，ADM抗体具有选自以下的序列：SEQ ID NO7、8、9、10、11、12、13和14。
本发明的抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架展现出对人ADM的亲和力，使得亲和常数大于10-7M，优选10-8M，优选的亲和力大于10-9M，最优选高于10-10M。本领域技术人员了解，通过施加更高剂量的化合物可以视为能补偿较低的亲和力，并且该措施不会超出本发明的范围。亲和常数可以根据实施例1中所述的方法测定。
本发明的抗体或片段可以与其它试剂组合使用，例如与所谓的ADM结合蛋白组合使用，用于其中所述的用途。
应当强调，术语“ADM结合蛋白”包括ADM结合蛋白1(补体因子H)，但是其并不表现为本发明的非中和和/或调节抗ADM抗体、抗体片段或非Ig骨架。
在优选的实施方案中，抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig骨架用于在患者的慢性病或急性病或急性病症中降低死亡风险。
本发明的慢性病或急性病或急性病症可以是选自重度感染的疾病或病症，例如脑膜炎、全身炎症反应综合征(SIRS)、败血症；其它疾病如糖尿病、癌症、急性和慢性血管疾病如心力衰竭、心肌梗死、卒中、动脉粥样硬化；休克如败血性休克和器官功能障碍如肾功能障碍、肝功能障碍、烧伤、手术、外伤、中毒、化疗损伤。特别有用的是，本发明的抗体或片段或骨架用于降低败血症和败血性休克即晚期败血症中的死亡风险。
在一实施方案中，抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架根据本发明用于患者的慢性病或急性病或急性病症的治疗或预防，其中所述患者是ICU患者。在另一实施方案中，抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架根据本发明用于患者的慢性病或急性病的治疗或预防，其中所述患者危重。危重意味着患者患有可能死亡或即将死亡的疾病或处于可能死亡或即将死亡的状态。
本发明的抗体、抗体片段和非Ig骨架可用于治疗个体以预防或治疗疾病或病症，例如用于预防或治疗个体的慢性病或急性病或急性病症。这样的疾病可以选自重度感染，如脑膜炎、全身炎症反应综合征(SIRS)、败血症；其它疾病如糖尿病、癌症、急性和慢性血管疾病如心力衰竭、心肌梗死、卒中、动脉粥样硬化；休克如败血性休克和器官功能障碍如肾功能障碍、肝功能障碍、烧伤、手术、外伤。特别有用的是，本发明的抗体或片段或骨架用于降低败血症和败血性休克即晚期败血症中的死亡风险。
以下将定义SIRS、败血症、重度败血症、败血性休克的临床标准。
1)特征为以下症状的至少两种的全身炎症反应综合征(SIRS)
·患者表现出低血压(平均动脉压＜65mm Hg)
·血清乳酸水平升高，＞4mmol/L
·血糖＞7.7mmol/L(无糖尿病的情况下)
·中央静脉压不在8-12mm Hg的范围内
·排尿量＜0.5mL×kg-1×hr-1
·中央静脉(上腔静脉)氧饱和度＜70％或混合静脉＜65％
·心率＞90下/分钟
·温度＜36℃或＞38℃
·呼吸率＞20/分钟
·白细胞计数＜4×109/L或＞12×109/L(白血球)；＞10％不成熟中
性粒细胞
2)败血症
具有1)中提到的至少两种症状之后，新感染的其它临床嫌疑是：
·咳嗽/痰/胸痛
·腹痛/肿胀/腹泻
·血行感染
·心内膜炎
·排尿困难
·头痛伴有颈强直
·蜂窝组织炎/受伤/关节感染
·任何感染的阳性微生物
3)重度败血症
倘若患者表现为败血症，任何器官功能障碍的其它临床嫌疑是：
·收缩压＜90/平均；＜65mmHG
·乳酸＞2mmol/L
·胆红素＞34μmol/L
·2h排尿量＜0.5mL/kg/h
·肌酸酐＞177μmol/L
·血小板＜100×109/L
·SpO2＞90％除非给O2
4)败血性休克
表现出3)中提到的终末器官功能障碍中的至少一种迹象。如果有对治疗没有响应的顽固性低血压，并且单独给予静脉注射液不足以使患者血压保持降低降压，还需要给予本发明的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig骨架，则表明为败血性休克。
在本发明的一实施方案中，患者患有SIRS、重度感染、败血症、休克如败血性休克。所述重度感染表示例如脑膜炎、全身炎症反应综合征(SIRS)、败血症、重度败血症和休克如败血性休克。于此，重度败血症特征在于所述患者表现为败血症，并且存在任何器官功能障碍的其它临床嫌疑，其为：
·收缩压＜90/平均；＜65mmHG
·乳酸＞2mmol/L
·胆红素＞34μmol/L
·2h排尿量＜0.5mL/kg/h
·肌酸酐＞177μmol/L
·血小板＜100×109/L
·SpO2＞90％除非给O2
在另一个具体的实施方案中，所述急性病或急性病症不是败血症、重度败血症或不是SIRS或不是休克或败血性休克.
在另一实施方案中，所述急性病或急性病症不是败血症。
本发明的抗体或片段或骨架可以与其它试剂组合使用，例如与所谓的ADM结合蛋白组合使用，用于其中所述的用途。ADM结合蛋白也天然存在于所述患者的循环中。
应当强调，术语“ADM结合蛋白”包括ADM结合蛋白1(补体因子H)，但是其并不表现为本发明的非中和和/或调节抗ADM抗体、抗体片段或非Ig骨架。
本发明的主题还有根据本发明用于治疗或预防患者的慢性病或急性病或急性病症的抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架与其它活性成分组合使用。
本发明的主题还有与另一种(例如用作主要药物的)活性药物组合使用的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架，其中所述组合用于稳定所述患者的循环，尤其是所述患者的全身循环，用于治疗或预防患者的慢性病或急性病或急性病症。
主要药物表示针对所述疾病或病症的主要病因起作用的药物。在感染的情况下，所述主要药物可以是抗生素。
在前述组合的具体实施方案中，所述组合与血管加压药如儿茶酚胺组合使用，其中所述组合用于治疗或预防患者的慢性病或急性病或急性病症。
在本发明的一实施方案中，所述患有慢性病或急性病或慢性病症的患者特征为，患者需要被给予血管加压药，例如给予儿茶酚胺。
因而，在一具体的实施方案中，本发明的主题是与ADM结合蛋白和/或其它活性成分组合使用，以治疗或预防需要血管加压药治疗例如儿茶酚胺治疗的患者的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架。
在上述组合的具体实施方案中，所述组合与静脉给予的液体组合使用，其中所述组合用于稳定循环，尤其是全身循环、用于治疗或预防患者的慢性病或急性病或急性病症。
在本发明的一实施方案中，所述患有慢性病或急性病或急性病症、需要稳定循环的患者特征为，患者需要得到静脉注射液。
因而，在一具体的实施方案中，本发明的主题是与ADM结合蛋白和/或其它活性成分组合，用于治疗或预防需要静脉注射液的患者的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架。从患者的角度来说，这是需要静脉注射液来调节全身体液平衡。
应当强调，术语ADM结合蛋白还指ADM结合蛋白1(补体因子H)，但是其并非为本发明的非中和和/或调节抗ADM抗体、抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig骨架。
根据本发明，ADM结合蛋白1还可以被称为ADM结合蛋白1(补体因子H)。
所述抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架或其与ADM结合蛋白和/或其它活性成分的组合可以与血管加压药如儿茶酚胺和/或静脉给予的液体组合使用，以稳定循环，尤其是稳定全身循环、用于患者的慢性病或急性病或急性病症。
本发明的主题还有与TNF-d-抗体组合使用的抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非-Ig。用于治疗患者的TNF-d-抗体是商购的。
在优选的实施方案中，抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig骨架用于降低患者的所述慢性病或急性病中的死亡风险，其中所述疾病选自败血症、糖尿病、癌症、急性和慢性血管疾病如心力衰竭、休克如败血性休克和器官功能障碍如肾功能障碍。特别有用的是，本发明的抗体或片段或骨架用于降低败血症和败血性休克即晚期败血症中的死亡风险。
本发明的抗体、抗体片段、骨架和组合可用于治疗或预防患者的以下慢性病或急性病：
·用于预防器官功能障碍或器官衰竭，尤其是肾功能障碍或肾衰竭，和/或
·用于稳定循环，例如用于降低所述患者的血管加压药需求，例如儿茶酚胺的需求，和/或
·用于调节所述患者的体液平衡。
·用于降低所述患者的死亡风险。
在一实施方案中，抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架根据本发明用于治疗或预防患者的慢性病或急性病，其中所述患者是ICU患者。在另一实施方案中，抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架根据本发明用于治疗或预防患者的慢性病或急性病或急性病症，其中所述患者危重。危重意味着患者患有可能死亡或即将死亡的疾病或处于可能死亡或即将死亡的状态。
本发明的主题还有根据本发明用于治疗或预防患者的慢性病或急性病或急性病症的抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架与ADM结合蛋白组合使用。
本发明的主题还有包含本发明的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig骨架的药物制剂。
本发明的主题还有本发明的药物制剂，其中所述药物制剂是溶液，优选即用型溶液。
所述药物制剂可以经肌肉内给予。所述药物制剂可以经血管内给予。所述药物制剂可以经输注给予。
在另一实施方案中，本发明的主题还有本发明的药物制剂，其中所述药物制剂处于干燥的状态，以便在使用前复原。
在另一实施方案中，本发明的主题还有本发明的药物制剂，其中所述药物制剂处于冷冻干燥的状态。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的药物制剂可以经肌肉内、经血管给予，或者优选通过输注给予患者全身。
因此，在本发明的另一实施方案中，本发明的药物制剂可以给予患者全身。
本发明范围内的其他实施方案在下文示出：
1.肾上腺髓质素ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其用于治疗患者的慢性病或急性病、用于调节体液平衡。
2.根据权利要求1所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中抗体形式选自Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab片段、(Fab)2片段和scFv-Fc融合蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段结合肾上腺髓质素的N-端部分(aa1-21)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段能识别并结合肾上腺髓质素的N-末端(aa1)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段是这样的ADM稳定抗体或ADM稳定抗体片段：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的t1/2半滞留时间增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选＞100％。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述疾病选自败血症、糖尿病、癌症、心力衰竭、休克和肾功能障碍。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述患者是ICU患者。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段是这样的调节抗体或片段：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的t1/2半滞留时间增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选＞100％，并封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
10.药物制剂，其包含权利要求1至9中任一项所述的抗体或片段。
11.根据权利要求10所述的药物制剂，其中所述药物制剂是溶液，优选即用型溶液。
12.根据权利要求10所述的药物制剂，其中所述药物制剂处于冷冻干燥的状态。
13.根据权利要求10至11中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂经肌肉内给予。
14.根据权利要求10至11中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂经血管内给予。
15.根据权利要求14所述的药物制剂，其中所述药物制剂经输注给予。
本发明范围内的其他实施方案在下文示出：：
1.肾上腺髓质素ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其用于治疗患者的慢性病或急性病、用于调节体液平衡。
2.根据权利要求1所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架是非中和ADM抗体或非中和肾上腺髓质素抗体片段或非中和ADM非Ig骨架。
3.根据权利要求1或2所述的用于治疗慢性病或急性病或急性病症的肾上腺髓质素ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其用于预防或减轻所述患者的水肿。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM 非Ig骨架，其中抗体形式选自Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab片段、(Fab)2片段和 scFv-Fc融合蛋白。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM 非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架结合肾上腺髓质素的N-端部分(aa1-21)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或 ADM非Ig骨架，其中所述抗体或片段骨架能识别能识别并结合肾上腺髓质素的N-端部分 (aa1)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM 非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架是这样的ADM稳定抗体或ADM稳定抗体片段或ADM 稳定非Ig骨架：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的半衰期(t1/2半滞留时间)增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选＞100％。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM 非Ig骨架，其中所述抗体或片段封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述疾病选自SIRS、败血症、糖尿病、癌症、心力衰竭、休克和肾功能障碍。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段是结合ADM的人单克隆抗体或片段或其抗体片段，其中重链包含以下序列：
SEQ ID NO：1
GYTFSRYW
SEQ ID NO：2
ILPGSGST
SEQ ID NO：3
TEGYEYDGFDY
并且其中轻链包含以下序列：
SEQ ID NO：4
QSIVYSNGNTY
SEQ ID NO：5
RVS
SEQ ID NO：6
FQGSHIPYT。
11.根据权利要求10所述的结合ADM的人单克隆抗体或片段或其抗体片段，其中所述抗体或片段包含选自以下的序列：
SEQ ID NO：7(AM-VH-C)
SEQ ID NO：8(AM-VH1)
SEQ ID NO：9(AM-VH2-E40)
SEQ ID NO：10(AM-VH3-T26-E55)
SEQ ID NO：11(AM-VH4-T26-E40-E55)
SEQ ID NO：12(AM-VL-C)
SEQ ID NO：13(AM-VL1)
SEQ ID NO：14(AM-VL2-E40)
12.根据权利要求1至9中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM 抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述患者是ICU患者。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架是这样的调节抗体或片段或骨架：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的半衰期(t1/2半滞留时间)增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选＞100％，并封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其与儿茶酚胺和/或静脉给予的液体组合使用。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，或根据权利要求12所述的组合，其与ADM 结合蛋白和/或其它活性成分组合使用。
16.药物制剂，其包含权利要求1至15中任一项所述的抗体或片段或骨架。
17.根据权利要求16所述的药物制剂，其中所述药物制剂是溶液，优选即用型溶液。
18.根据权利要求16所述的药物制剂，其中所述药物制剂处于冷冻干燥的状态。
19.根据权利要求16至17中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂经肌肉内给予.
20.根据权利要求16至17中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂经血管内给予。
21.根据权利要求20所述的药物制剂，其中所述药物制剂经输注给予。
本发明范围内的其他实施方案在下文示出：：
1.肾上腺髓质素(ADM)抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其用于治疗患者的慢性病或急性病、用于稳定循环。
2.根据权利要求1所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段降低所述患者的儿茶酚胺需求。
3.根据权利要求1或2所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中抗体形式选自Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab片段、(Fab)2片段和scFv-Fc融合蛋白。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段结合肾上腺髓质素的N-端部分(aa1-21)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段能识别并结合肾上腺髓质素的N-端部分(aa1)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段是这样的ADM稳定抗体：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的t1/2半滞留时间增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选＞100％。。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段是这样的调节ADM抗体或调节肾上腺髓质素抗体片段：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的t1/2半滞留时间增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选＞100％，并封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述疾病选自败血症、糖尿病、癌症、急性和慢性血管疾病如心力衰竭、休克如败血性休克和器官功能障碍如肾功能障碍。
10.药物制剂，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的抗体。
11.根据权利要求10所述的药物制剂，其中所述药物制剂是溶液，优选即用型溶液。
12.根据权利要求10所述的药物制剂，其中所述药物制剂处于冷冻干燥的状态。
13.根据权利要求10至11中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂经肌肉内给予。
14.根据权利要求10至11中任一项所述的药物制剂，，其中所述药物制剂经血管内给予。
15.根据权利要求14所述的药物制剂，其中所述药物制剂经输注给予。
本发明范围内的其他实施方案在下文示出：：
1.肾上腺髓质素(ADM)抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其用于治疗患者的慢性病或急性病症、用于稳定循环。
2.根据权利要求1所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架降低所述患者的血管加压药需求，例如儿茶酚胺需求。
3.根据权利要求1或2所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架是非中和ADM抗体或非中和肾上腺髓质素抗体片段或非中和ADM非Ig骨架。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中抗体形式选自Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab片段、(Fab)2片段和scFv-Fc融合蛋白。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM 非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架结合肾上腺髓质素的N-端部分(aa1-21).
6.根据权利要求1至5中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM 非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架能识别并结合肾上腺髓质素的N-端部分(aa1)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM 非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架是这样的ADM稳定抗体或片段或骨架：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的半衰期(t1/2半滞留时间)增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选＞100％。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM 非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM 非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架是这样的调节ADM抗体或调节肾上腺髓质素抗体片段或骨架：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的半衰期(t1/2半滞留时间)增加至少 10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选＞100％，并封闭80％以下，优选50％以下的ADM 生物活性。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段是结合ADM的人单克隆抗体或片段或其抗体片段，其中重链包含以下序列：
SEQ ID NO：1
GYTFSRYW
SEQ ID NO：2
ILPGSGST
SEQ ID NO：3
TEGYEYDGFDY
并且其中轻链包含以下序列
SEQ ID NO：4
QSIVYSNGNTY
SEQ ID NO：5
RVS
SEQ ID NO：6
FQGSHIPYT。
11.根据权利要求10所述的结合ADM的人单克隆抗体或片段或其抗体片段，其中所述抗体或片段包含选自以下的序列：
SEQ ID NO：7(AM-VH-C)
SEQ ID NO：8(AM-VH1)
SEQ ID NO：9(AM-VH2-E40)
SEQ ID NO：10(AM-VH3-T26-E55)
SEQ ID NO：11(AM-VH4-T26-E40-E55)
SEQ ID NO：12(AM-VL-C)
SEQ ID NO：13(AM-VL1)
SEQ ID NO：14(AM-VL2-E40)
12.根据权利要求1至11中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述疾病选自SIRS、败血症、糖尿病、癌症、急性和慢性血管疾病如心力衰竭、休克如败血性休克和器官功能障碍如肾功能障碍。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其与儿茶酚胺和/或静脉给予的液体组合使用。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，或根据权利要求13所述的组合，其与ADM结合蛋白和/或其它活性成分组合使用。
15.药物制剂，其包含权利要求1至14中任一项所述的抗体或片段或非Ig骨架
16.根据权利要求15所述的药物制剂，其中所述药物制剂是溶液，优选即用型溶液。
17.根据权利要求15所述的药物制剂，其中所述药物制剂处于冷冻干燥的状态。
18.根据权利要求15至16中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂经肌肉内给予。
19.根据权利要求14至16中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂经血管内给予。
20.根据权利要求16所述的药物制剂，其中所述药物制剂经输注给予。
本发明范围内的其他实施方案在下文示出：：
1.用于治疗慢性病或急性病的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或所述片段是这样的ADM稳定抗体或片段：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的t1/2半滞留时间增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选＞100％，和/或其中所述抗体封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
2.用于治疗慢性病或急性病的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或所述片段是这样的调节ADM抗体或片段：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的t1/2半滞留时间增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选＞100％，并封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
3.根据权利要求1或2所述的用于治疗慢性病或急性病的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段结合肾上腺髓质素的N-端部分(aa1-21)。
4.用于治疗慢性病或急性病的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中根据权利要求3所述抗体或所述片段结合肾上腺髓质素的N-末端。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用于治疗慢性病或急性病的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或所述片段是这样的ADM稳定抗体或片段：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的t1/2半滞留时间增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选100％。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用于治疗慢性病或急性病的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或所述片段封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用于治疗慢性病或急性病的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述所述疾病选自SIRS、败血症、败血性休克、糖尿病、癌症、心力衰竭、休克、器官衰竭、肾功能障碍、急性体液失衡和低血压。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用于治疗慢性病或急性病的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述疾病是败血性休克或败血症。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用于治疗慢性病或急性病的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段调节所述患者的体液平衡。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的用于治疗慢性病或急性病的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片用于预防器官功能障碍或器官衰竭。
11.根据权利要求10所述的用于治疗慢性病或急性病的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段用于预防肾功能障碍或肾衰竭。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的用于治疗慢性病或急性病的肾上腺髓质素(ADM)抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段用于稳定循环。
13.根据权利要求12所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段降低所述患者的儿茶酚胺需求。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其用于降低所述缓和的死亡风险。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段可以以至少3μg/Kg体重的剂量给予。
16.药物组合物，其包含权利要求1至15中任一项所述的抗体或片段。
本发明范围内的其他实施方案在下文示出：：
1.肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述抗体或所述片段或骨架是非中和抗体。
2.肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述抗体或所述片段或骨架是这样的ADM稳定抗体或片段或骨架：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的半衰期(t1/2半滞留时间)增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选100％，和/或其中所述抗体或片段或骨架封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
3.肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述抗体或所述片段是这样的调节ADM抗体或片段或骨架：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的半衰期(t1/2半滞留时间)增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选100％，并封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
4.根据权利要求1或2所述的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架结合上腺髓质素的N-端部分(aa1-21)。
5.肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中根据权利要求3所述抗体或所述片段或骨架结合肾上腺髓质素的N-末端。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段ADM非Ig骨架，其中所述抗体或所述片段或所述骨架是这样的ADM稳定抗体或片段：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的t1/2半滞留时间增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选100％。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其用作活性药物物质。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用于治疗慢性病或急性病或急性病症的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段ADM非Ig骨架，其中所述疾病或病症选自重度感染如脑膜炎、全身炎症反应综合征(SIRS)、败血症；其它疾病如糖尿病、癌症、急性和慢性血管疾病如心力衰竭、心肌梗死、卒中、动脉粥样硬化；休克如败血性休克何器官功能障碍如肾功能障碍、肝功能障碍、烧伤、手术、外伤。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用于治疗慢性病或急性病或急性病症的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述疾病是败血性休克或败血症。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段是结合ADM的人单克隆抗体或片段或其抗体片段，其中包含以下序列之一：
SEQ ID NO：1
GYTFSRYW
SEQ ID NO：2
ILPGSGST
SEQ ID NO：3
TEGYEYDGFDY
和/或其中轻链包含以下序列之一：
SEQ ID NO：4
QSIVYSNGNTY
SEQ ID NO：5
RVS
SEQ ID NO：6
FQGSHIPYT。
11.根据权利要求10所述的结合ADM的人单克隆抗体或片段或其抗体片段，其中所述抗体或片段包含选自以下的序列：
SEQ ID NO：7(AM-VH-C)
SEQ ID NO：8(AM-VH1)
SEQ ID NO：9(AM-VH2-E40)
SEQ ID NO：10(AM-VH3-T26-E55)
SEQ ID NO：11(AM-VH4-T26-E40-E55)
SEQ ID NO：12(AM-VL-C)
SEQ ID NO：13(AM-VL1)
SEQ ID NO：14(AM-VL2-E40)
12.根据权利要求1至11中任一项所述的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其用于调节患有慢性病或急性病或急性病症的患者的体液平衡。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其用于预防或减轻患有慢性病或急性病或急性病症的患者的器官功能障碍或器官衰竭。
14.根据权利要求10所述的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述器官是肾或肝。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的肾上腺髓质素(ADM)抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其用于稳定患有慢性病或急性病或急性病症的患者的循环。
16.根据权利要求15所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述抗体或片段减低所述患者的儿茶酚胺需求。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其与血管加压药如儿茶酚胺组合使用。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其与静脉注射液给予组合使用。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的肾上腺髓质素抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其与TNF-d-抗体组合使用。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或非-Ig-骨架，其用于治疗有需要的患者，其中所述抗体或片段可以以至少3μg/Kg体重的剂量给予。
21.药物组合物，其包含权利要求1至20中任一项所述的抗体或片段或骨架。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或非-Ig-骨架，其用于治疗慢性病或急性病或慢性病症。
23.根据权利要求22所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或非-Ig-骨架，其中所述疾病是败血症。
本发明范围内的其他实施方案在下文示出：：
1.肾上腺髓质素ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其用于治疗患者的重度慢性病或急性病、用于降低所述患者的死亡风险。
2.根据权利要求1所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中抗体形式选自Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab片段、(Fab)2片段和scFv-Fc融合蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段结合肾上腺髓质素的N-端部分(aa1-21)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段能识别并结合肾上腺髓质素的N-端部分(aa1)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段是这样的ADM稳定抗体或片段：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的 t1/2半滞留时间增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选＞100％。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述急性选自败血症、糖尿病、癌症、心力衰竭、休克和肾功能障碍。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述患者是ICU患者.
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中通过预防不利事件降低所述死亡风险，其中所述不利事件选自SIRS、败血症、败血性休克、器官衰竭、肾衰竭、体液失衡和低血压。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM 抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段与ADM结合蛋白组合使用。
11.药物制剂，其包含权利要求1至10中任一项所述的抗体或片段。
12.根据权利要求11所述的药物制剂，其中所述药物制剂是溶液，优选即用型溶液。
13.根据权利要求11所述的药物制剂，其中所述药物制剂处于冷冻干燥的状态。
14.根据权利要求11至12中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂经肌肉内给予。
15.根据权利要求11至12中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂经血管内给予。
16.根据权利要求15所述的药物制剂，其中所述药物制剂经输注给予。
本发明范围内的其他实施方案在下文示出：：
1.肾上腺髓质素(ADM)抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其用于治疗患者的重度慢性病或急性病或急性病症、用于降低所述患者的死亡风险，其中所述抗体或片段或骨架是非中和ADM抗体或非中和肾上腺髓质素抗体片段或非中和ADM非Ig骨架。
2.根据权利要求1所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中抗体形式选自Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab片段、(Fab)2片段和scFv-Fc融合蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架结合肾上腺髓质素的N-端部分(aa1-21)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM 非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架能识别并结合肾上腺髓质素的N-端部分(aa1)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM 非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架是这样的ADM稳定抗体或片段或骨架：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的半衰期(t1/2半滞留时间)增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选＞100％，并封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM 非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述疾病选自重度感染如脑膜炎、全身炎症反应综合征(SIRS)、败血症；其它疾病如糖尿病、癌症、急性和慢性血管疾病如心力衰竭、心肌梗死、卒中、动脉粥样硬化；休克如败血性休克和器官功能障碍如肾功能障碍、肝功能障碍；烧伤、手术、外伤。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述疾病选自SLRS、重度感染、败血症、休克如败血性休克。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述患者是ICU患者。
根据权利要求1至9中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病或急性病症的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中通过预防不利事件降低所述死亡风险，其中所述不利事件选自SLRS、败血症、休克如败血性休克、急性和慢性血管疾病如急性心力衰竭、心肌梗死、卒中、器官衰竭如肾衰竭、肝衰竭、体液失衡和低血压。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段是结合ADM的人单克隆抗体或片段或其抗体片段，其中重链包含以下序列：
SEQ ID NO：1
GYTFSRYW
SEQ ID NO：2
ILPGSGST
SEQ ID NO：3
TEGYEYDGFDY
并且其中轻链包含以下序列：
SEQ ID NO：4
QSIVYSNGNTY
SEQ ID NO：5
RVS
SEQ ID NO：6
FQGSHIPYT。
12.根据权利要求10所述的结合ADM的人单克隆抗体抗体或片段或其抗体片段，其中所述抗体或片段包含选自以下的序列：
SEQ ID NO：7(AM-VH-C)
SEQ ID NO：8(AM-VH1)
SEQ ID NO：9(AM-VH2-E40)
SEQ ID NO：10(AM-VH3-T26-E55)
SEQ ID NO：11(AM-VH4-T26-E40-E55)
SEQ ID NO：12(AM-VL-C)
SEQ ID NO：13(AM-VL1)
SEQ ID NO：14(AM-VL2-E40)
13.根据权利要求1至12中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其与血管加压药如儿茶酚胺和/或静脉给予的液体组合使用。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架或根据权利要求10所述的组合，其与ADM 结合蛋白和/或其它活性成分组合使用
15.药物制剂，其包含权利要求1至14中任一项所述的抗体或片段或骨架。
16.根据权利要求15所述的药物制剂，其中所述药物制剂是溶液，优选即用型溶液。
17.根据权利要求15所述的药物制剂，其中所述药物制剂处于冷冻干燥的状态。
18.根据权利要求15至16中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂经肌肉内给予。
19.根据权利要求15至16中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂经血管内给予。
20.根据权利要求19所述的药物制剂，其中所述药物制剂经输注给予。
21.ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或AM非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架结合肾上腺髓质素的N-端部分(aa1-21)，优选人ADM内的肾上腺髓质素的N-端部分 (aa1-21)。
22.根据权利要求2所述的抗体或片段或骨架，其中所述抗体或片段或骨架能识别并结合结合肾上腺髓质素的N-末端(aa1)。
本发明范围内的其他实施方案在下文示出：：
1.肾上腺髓质素(ADM)抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其用于治疗患者的慢性病或急性病、用于预防器官功能障碍或器官衰竭。
2.根据权利要求1所述的用于治疗慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述器官是肾。
3.根据权利要求1所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中抗体形式选自Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab片段、(Fab)2片段和scFv-Fc融合蛋白。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段结合肾上腺髓质素的N-端部分(aa1-21)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段能识别并结合肾上腺髓质素的N-端部分(aa1)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或所述片段是这样的ADM稳定抗体或片段：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的t1/2半滞留时间增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选＞100％。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述疾病选自败血症、糖尿病、癌症、心力衰竭和休克。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述患者是ICU患者。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM 抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段是这样的调节抗体或片段：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的t1/2半滞留时间增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选＞100％，并封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
11.药物制剂，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或片段。
12.根据权利要求11所述的药物制剂，其中所述药物制剂是溶液，优选即用型溶液。
13.根据权利要求11所述的药物制剂，其中所述药物制剂处于冷冻干燥的状态。
14.根据权利要求11至12中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂经肌肉内给予。
15.根据权利要求11至12中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂经血管内给予。
16.根据权利要求15所述的药物制剂，其中所述药物制剂经输注给予。
本发明范围内的其他实施方案在下文示出：：
1.肾上腺髓质素(ADM)抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其用于治疗患者的慢性病或急性病或急性病症、用于在所述患者中预防或减轻器官功能障碍或预防器官衰竭。
2.根据权利要求1所述的用于治疗慢性病或急性病或急性病症的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述器官是肾或肝。
3.根据权利要求1或2所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架是非中和ADM抗体或非中和肾上腺髓质素抗体片段或非中和ADM非Ig骨架。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM 非Ig骨架，其中抗体形式选自Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab片段、(Fab)2片段和 scFv-Fc融合蛋白。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM 非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架结合肾上腺髓质素的N-端部分(aa1-21)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM 非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架能识别并结合肾上腺髓质素的N-端部分(aa1)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM 非Ig骨架，其中所述抗体或所述片段或骨架是这样的ADM稳定抗体或片段或骨架：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的t1/2半滞留时间增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选＞100％。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM 非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病或急性病症的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述疾病选自败血症、糖尿病、癌症、心力衰竭和休克。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段，其中所述抗体或片段是结合ADM的人单克隆抗体或片段或其抗体片段，其中重链包含以下序列：
SEQ ID NO：1
GYTFSRYW
SEQ ID NO：2
ILPGSGST
SEQ ID NO：3
TEGYEYDGFDY
并且其中轻链包含以下序列：
SEQ ID NO：4
QSIVYSNGNTY
SEQ ID NO：5
RVS
SEQ ID NO：6
FQGSHIPYT。
11.根据权利要求10所述的结合ADM的人单克隆抗体或片段或其抗体片段，其中所述抗体或片段包含选自以下的序列：
SEQ ID NO：7(AM-VH-C)
SEQ ID NO：8(AM-VH1)
SEQ ID NO：9(AM-VH2-E40)
SEQ ID NO：10(AM-VH3-T26-E55)
SEQ ID NO：11(AM-VH4-T26-E40-E55)
SEQ ID NO：12(AM-VL-C)
SEQ ID NO：13(AM-VLl)
SEQ ID NO：14(AM-VL2-E40)
12.根据权利要求1至11中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其中所述抗体或片段或骨架是这样的调节抗体或片段或骨架：使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的半衰期(t1/2半滞留时间)增加至少10％、优选至少50％、更优选＞50％、最优选＞100％，并封闭80％以下，优选50％以下的ADM生物活性。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病或急性病症的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或ADM非Ig骨架，其与血管加压药如儿茶酚胺和/或静脉给予的液体组合使用。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的用于治疗患者的慢性病或急性病或急性病症的ADM抗体或肾上腺髓质素抗体片段或AD非Ig骨架，或根据权利要求13所述的组合，其与ADM结合蛋白和/或其它活性成分组合使用。
15.药物制剂，其包含权利要求1至13中任一项所述的抗体或片段。
16.根据权利要求14所述的药物制剂，其中所述药物制剂是溶液，优选即用型溶液。
17.根据权利要求14所述的药物制剂，其中所述药物制剂处于冷冻干燥的状态。
18.根据权利要求14至15中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂经肌肉内给予。
19.根据权利要求14至15中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂经血管内给予。
20.根据权利要求18所述的药物制剂，其中所述药物制剂经输注给予。
实施例
应当强调，根据本发明，实施例部分中的抗体、抗体片段和非Ig骨架结合ADM，因而应当被认为是抗ADM抗体/抗体片段/非Ig骨架。
实施例1
抗体的产生及其亲和常数的测定
产生了几种人抗体和鼠抗体，并测定其亲和常数(参见表1和2)。
用于免疫的肽/缀合物：
合成了用于免疫的肽，参见表1(JPT Technologies，Berlin，Germany)，用一个额外的N-端半胱氨酸(如果在所选的ADM序列中没有半胱氨酸的话)残基将该肽缀合至牛血清白蛋白(BSA)。通过使用Sulfolink耦合凝胶(Perbio-science，Bonn，Germany)将肽连接至BSA。耦合方案根据Perbio手册进行。
按照以下方法产生鼠抗体：
在第0天和第14天用100μg肽-BSA-缀合物(在100μl弗氏完全佐剂中乳化) 以及在第21天和第28天时用50μg肽-BSA-缀合物(在100μl弗氏不完全佐剂中)免疫Balb/c小鼠。在进行融合实验前的三天，动物接受溶解于100μl盐水中的50μg缀合物，以一次腹膜内注射和一次静脉内注射给予。
在37℃下用lml50％聚乙二醇使来自免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞融合30s。洗涤后，将细胞接种在96孔细胞培养板中。通过在HAT培养基[补充了20％胎牛血清和HAT补充物的RPMI1640培养基]中培养来选择杂交克隆。两周后，用HT培养基替换HAT培养基持续三代，然后恢复至正常的细胞培养基。
在融合后三周，主要筛查细胞培养上清液的抗原特异性IgG抗体。将测试为阳性的微培养物转移至24孔板用于增殖。在重新测试后，使用有限稀释技术使选择的培养物克隆和亚克隆，并确定亚型(还参见Lane，R.D.“A short-duration polyethylone glycolfusion technique f或increasing production of monoclonal antibody-secretinghybridomas”，J.Immunol.Meth.81：223-228；(1985)，Ziegler，B.et al.“Glutamatedecarboxylase(GAD)is not detectable on the surface of rat islet cellsexamined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediatedcytotoxicity of monoclonal GAD antibody”，Horm.Metab.Res.28：11-15，(1996))。
小鼠单克隆抗体产生：
通过标准抗体产生方法来产生抗体(Marx et al，Monoclonal AntibodyProduction，ATLA25，121，1997，)，并通过蛋白A纯化。基于SDS凝胶电泳分析，抗体纯度＞95％。
人抗体
根据以下方案通过噬菌体展示方法产生人抗体。
人天然抗体基因文库HAL7/8用于针对肾上腺髓质素肽的重组单链F-可变结构域(scFv)的分离。用淘选策略筛选抗体基因文库，包括使用这样的肽：其含有通过两个不同的间隔区连接至肾上腺髓质素肽序列的生物素标签。利用非特异性结合的抗原和链霉亲和素结合的抗原的混合淘选循环来使非特异性结合物的背景最低。将从第三轮淘选洗脱的噬菌体用于表达单克隆scFv的大肠杆菌菌株的生成。来自这些克隆菌株培养物的上清液直接用于抗原ELISA检测(还参见Hust，M.，Meyer，T.，Voedisch，B.，Rülker，T.，Thi e，H.，El-Ghezal，A.，Kirsch，M.I.，Schutte，M.，Helmsing，S.，Meier，D.，Schirrmann，T.，D übel，S.，2011.A human scFv antibody generation pipeline for proteome research.Journal of Biotechnology152，159-170；Schütte，M.，Thullier，P.，Pelat，T.，Wezler，X.，Rosenstock，P.，Hinz，D.，Kirsch，M.I.，Hasenberg，M.，Frank，R.，Schirrmann，T.，Gunzer，M.，Hust，M.，Dübel，S.，2009.Identification of a putative Crf splice variantand generation of recombinant antibodies for the specific detection ofAspergillus fumigatus.PLoS One4，e6625)。
基于对抗原为阳性ELISA信号并对于链霉亲和素包被的微量低定板为阴性来选择阳性克隆。为了进一步表征，将scFv开放阅读框克隆入表达质粒pOPE107(Hust et al.，J.Biotechn.2011)中，通过固定的金属离子亲和层析从培养物上清液捕获，并通过尺寸排阻层析来纯化。
亲和常数
为了测定抗体对肾上腺髓质素的亲和力，利用Biacore2000系统(GE HealthcareEurope GmbH，Freiburg，Germany)通过无标记的表面等离子体共振测定肾上腺髓质素与固定抗体的动力学。利用以高密度共价偶联至CM5感应器表面的抗小鼠Fc抗体，根据生产商的指示进行抗体的可逆固定(小鼠抗体捕获试剂盒；GE Healthcare)。(Lorenz et al.，“Functional Antibodies Targeting IsaA of Staphylococcus aureus Aμgment HostImmune Response and Open New Perspectives for Antibacterial Therapy”；Antimicrob Agents Chemother.2011年1月；55(1)：165-173.)
分别针对人和鼠ADM的以下所述的ADM区域激发单克隆抗体。下表表示了其他实验中所用的获得抗体的选择。选择基于以下靶区域：
表1：
以下是获得的其他单克隆抗体的列表：
抗ADM抗体的列表
表2：
抗体片段通过酶促消化的产生：
通过鼠全长抗体NT-M的酶促消化来进行Fab和F(ab)2片段的生成。抗体NT-M用a)基于胃蛋白酶的F(ab)2制备试剂盒(Pierce44988)和b)基于木瓜蛋白酶的Fab制备试剂盒(Pierce44985)消化。片段化方案根据供应商提供的说明书进行。就F(ab)2-片段化而言，消化在37℃下进行8h。Fab-片段化消化各自进行16h。
Fab生成和纯化方案：
通过用0.5ml消化缓冲液洗涤树脂并使柱于5000×g下离心1分钟来平衡固定的木瓜蛋白酶。然后丢弃缓冲液。通过去除储存缓冲液并用消化缓冲液洗涤，然后每次以 1000×g离心2分钟来制备脱盐的柱。将0.5ml制备好的IgG样品添加到含有平衡的固定木瓜蛋白酶的离心柱管中。于37℃下在桌面振荡器上使消化反应进行16h的孵育时间。使柱于5000×g下离心1分钟以从固定的木瓜蛋白酶分离消化液。此后，将树脂用0.5ml PBS洗涤，并于5000×g下离心1分钟。将洗涤部分添加到消化的抗体，使得总样品体积为 1.0ml。在室温下用PBS和IgG洗脱缓冲液平衡NAb蛋白A柱。将柱离心1分钟以去除储存缓冲液(含有0.02％叠氮化钠)，并通过添加2ml PBS来平衡，再次离心1分钟并丢弃通过物。将样品施加到柱上，并倒置以重悬。在室温下通过翻滚式混合10分钟来进行孵育。将柱离心1分钟，留下具有Fab片段的通过物。
(参考文献：Coulter，A.and Harris，R.(1983).J.Immunol.Meth.59，199-203.；Lindner I.et al.(2010){alpha}2-Macroglobulin inhibits the malignantproperties of astrocytoma cells by impeding{beta}-catenin signaling.CancerRes.70，277-87.；Kaufmann B.et al.(2010)Neutralization of West Nile virus bycross-linking of its surface proteins with Fab fragments of the humanmonoclonal antibody CR4354.PNAS.107，18950-5.；Chen X.et al.(2010)Requirementof open headpiece conformation for activation of leukocyte integrinαxβ2.PNAS.107，14727-32.；Uysal H.et al.(2009)Structure and pathogenicity ofantibodies specific for citrullinated collagen type II in experimentalarthitis.J.Exp.Med.206，449-62.；Thomas G.M.et al.(2009)Cancer cell-derivedmicroparticles bearing P-selectin glycoprotein ligandlaccelerate thrombusformation in vivo.J.Exp.Med.206，1913-27.；Kong F.et al.(2009)Demonstration ofcatch bonds between an integrin and its ligand.J.Cell Biol.185，1275-84.)
F(ab′)2片段生成和纯化方案：
通过用0.5ml消化缓冲液洗涤树脂并使柱于5000×g下离心1分钟来平衡固定的胃蛋白酶。然后丢弃缓冲液。通过去除储存缓冲液并用消化缓冲液洗涤，然后每次以 1000×g离心2分钟来制备脱盐的柱。将0.5ml制备好的IgG样品添加到含有平衡的固定胃蛋白酶的离心柱管中。于37℃下在桌面振荡器上使消化反应进行16h的孵育时间。使柱于5000×g下离心1分钟以从固定的胃蛋白酶分离消化液。此后，将树脂用0.5ml PBS洗涤，并于5000×g下离心1分钟。将洗涤部分添加到消化的抗体，使得总样品体积为1.0ml。在室温下用PBS和IgG洗脱缓冲液平衡NAb蛋白A柱。将柱离心1分钟以去除储存缓冲液 (含有0.02％叠氮化钠)，并通过添加2ml PBS来平衡，再次离心1分钟并丢弃通过物。将样品施加到柱上，并倒置以重悬。在室温下通过翻滚式混合10分钟来进行孵育。将柱离心 1分钟，留下具有Fab片段的通过物。
(参考文献：Mariani，M.，et al.(1991).A new enzymatic method to obtainhigh-yield F(ab′)2suitable for clinical use from mouse IgG1.Mol. Immunol.28：69-77.；Beale，D.(1987).Molecular fragmentation：Some applications inimmunology.Exp Comp Immunol11：287-96.；Ellerson，J.R.，et al.(1972).A fragmentcorresponding to the CH2region of immunoglobulin G(IgG)with complement fixingactivity.FEBS Letters24(3)：318-22.；Kerbel，R.S.and Elliot，B.E.(1983).Detection of Fc receptors.Meth Enzymol 93：113-147.；Kulkarni，P.N.，et al.(1985). Conjμgation of methotrexate to IgG antibodies and their F(ab′)2fragments and the effect of conjμgated methotrexate on tumor growth invivo.Cancer Immunol Immunotherapy 19：211-4.；Lamoyi，E.(1986).Preparation of F(ab′)2Fragments from mouse IgG of various subclasses.Meth Enzymol121：652-663.；Parham，P.，et al.(1982).Monoclonal antibodies：purification，fragmentationand application to structural and functional studies of class I MHCantigens.J Immunol Meth 53：133-73.；Raychaudhuri，G.，et al.(1985).Human IgGlandits Fc fragment bind with different affinities to the Fc receptors on thehuman U937，HL-60and ML-1cell lines.Mol Immunol22(9)：1009-19.；Rousseaux，J.，etal.(1980).The differential enzyme sensitivity of rat immunoglobulin Gsubclasses to papain an pepsin.Mol Immunol17：469-82.；Rousseaux，J.，et al.(1983).Optimal condition for the preparation of Fab and F(ab′)2fragments frommonoclonal IgG of different rat IgG subclasses.J Immunol Meth 64：141-6.；Wilson，K.M.，et al.(1991).Rapid whole blood assay for HIV-1seropositivityusing an Fab-peptide conjμgate.J Immunol Meth138：111-9.)
NT-H-抗体片段人源化
通过CDR移植方法使抗体片段人源化(Jones，P.T.，Dear，P. H.，Foote，J.，Neuberger，M.S.，and Winter，G.(1986)Replacing the complementarity-determiningregions in a human antibody with those from a mouse.Nature321，522-525)。
进行以下步骤来实现人源化序列：
总RNA提取：利用Qiagen试剂盒从NT-H杂交瘤提取总RNA。
第一轮RT-PCR：使用 OneStep RT-PCR试剂盒(Cat No.210210)。用重链和轻链特异的引物进行RT-PCR。对于每份RNA样品，利用简并的正向引物混合物(其覆盖可变区的前导序列)建立12个单独的重链和11个轻链RT-PCR反应。反向引物位于重链和轻链的恒定区。没有在引物中设计限制位点。
反应组成： OneStep RT-PCR缓冲液5.0μl、dNTP Mix(含有每种dNTP10mM)0.8μl、引物组0.5μl、 OneStep RT-PCR Enzyme Mix0.8μl、模板RNA2.0μl、无RNase的水至20.0μl，总体积20.0μl。
PCR条件：逆转录：50℃，30min；初始PCR激活：95℃，15min
循环：94℃，25sec；54℃，30sec；72℃，30sec；共20个循环，最终延伸： 72℃，10min
第二轮半巢式PCR：在第二轮PCR中进一步扩增来自第一轮反应的RT-PCR产物。用抗体可变区特异的半巢式引物组建立12个单独的重链和11个轻链RT-PCR反应。
反应组成：2×PCR mix10μl；引物组2μl；第一轮PCR产物8μl；总体积20μl；杂交瘤抗体克隆报告
PCR条件：于95℃初始变性5min；95℃25sec、57℃30sec、68℃30sec共25个循环；于68℃下进行最终延伸10min。
完成PCR之后，使PCR反应样品在琼脂糖凝胶上运行，以显现扩增的DNA片段。在对通过巢式RT-PCR扩增的超过15种克隆的DNA片段测序之后，已经克隆出了几种小鼠抗体重链和轻链，并且看起来是合适的。蛋白序列比对和CDR分析鉴定了一种重链和一种轻链。在与同源的人框架序列比对之后，得到的可变重链的人源化序列为以下：参见图 6(由于可变重链的26位、第40位和第55位的氨基酸以及可变轻链的第40位的氨基酸对于结合性质至关重要，它们可以被回复至鼠源的。得到的候选者如下文描述)(Padlan，E. A.(1991)Apossible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variabledomains while preserving their ligand-binding properties.Mol. Immunol.28，489-498.；Harris，L.and Bajorath，J.(1995)Profiles for the analysis ofimmunoglobulin sequences：Comparison of V gene subgroups.Protein Sci.4，306-310.)。
抗体片段序列(SEQ ID NO：7-14)的注解：粗体且带下划线的为按顺序排列的CDR1，2，3；斜体为恒定区；铰链区用粗体字母突显，组氨酸标签用粗体和斜体字母表示；框架点突变有灰色的字母背景。
SEQ ID NO：7(AM-VH-C)
SEQ ID NO：8(AM-VH1)
SEQ ID NO：9(AM-VH2-E40)
SEQ ID NO：10(AM-VH3-T26-E55)
SEQ ID NO：11(AM-VH4-T26-E40-E55)
SEQ ID NO：12(AM-VL-C)
SEQ ID NO：13(AM-VL1)
SEQ ID NO：14(AM-VL2-E40)
实施例2
所选的抗ADM抗体对抗ADM生物活性的影响
在人重组肾上腺髓质素受体cAMP功能测定(肾上腺髓质素生物测定)中检测所选的抗ADM抗体对ADM生物活性的影响。
在人重组肾上腺髓质素受体cAMP功能测定(肾上腺髓质素生物测定)中对靶向人或小鼠肾上腺髓质素的抗体的测试
材料：
细胞系：CHO-K1
受体：肾上腺髓质素(CRLR+RAMP3)
受体登录号细胞系：CRLR：U17473；RAMP3：AJ001016
测试之前，通过用PBS-EDTA(5mM EDTA)轻轻冲洗，来分离生长于无抗生素的培养基中的表达人重组肾上腺髓质素受体的CHO-K1细胞(FAST-027C)，通过离心回收，并重悬于测定缓冲液(KRH：5mM KCl，1.25mM MgSO4，124mM NaCl，25mM HEPES，13.3mM葡萄糖，1.25mMKH2PO4，1.45mM CaCl2，0.5g/l BSA)中。
用参照激动剂(hADM或mADM)平行地进行剂量反应曲线。
拮抗剂测试(96孔)：
对于拮抗剂测试，将6μl参照激动剂(人(5,63nM)或小鼠(0,67nM)肾上腺髓质素)与不同拮抗剂稀释的6μl测试样品混合；或与6μl缓冲液混合。在室温孵育60min 之后，添加12μl细胞(2，500个细胞/孔)。在室温下孵育平板30min。在添加裂解缓冲液之后，用来自Cis-Bio International的HTRF试剂盒(cat n°62AM2PEB)，根据厂商说明书估算DeltaF的百分比。hADM22-52用作参照拮抗剂。
测试抗体的cAMP-HTRF测定
在人重组肾上腺髓质素受体(FAST-027C)cAMP功能测定中，在存在5.63nM 人ADM1-52以及以下最终抗体浓度的情况下：100μg/ml，20μg/ml，4μg/ml，0.8μg/ ml，0.16μg/ml，测试抗-h-ADM抗体(NT-H，MR-H，CT-H)的拮抗剂活性。
在人重组肾上腺髓质素受体(FAST-027C)cAMP功能测定中，在存在0.67nM小鼠ADM1-50以及以下最终抗体浓度的情况下：100μg/ml，20μg/ml，4μg/ml，0.8μg/ ml，0.16μg/ml，测试抗-m-ADM抗体(NT-M，MR-M，CT-M)的拮抗剂活性。将数据绘制为相对抑制对拮抗剂浓度(参见图3a至3l)。单独抗体的最大抑制显示在表3中。
表3：
抗体 ADM生物活性的最大抑制(ADM-生物测定)(％)
NT-H 38
MR-H 73
CT-H 100
NT-M FAB 26
NT-M FAB2 28
NT-M 45
MR-M 66
CT-M 100
非特异性小鼠IgG 0
实施例3
通过抗ADM抗体稳定hADM的数据
利用hADM免疫测定测试人ADM抗体对人ADM的稳定作用。
定量人肾上腺髓质素的免疫测定
所使用的技术是基于吖啶酯标记的夹心包被管的发光免疫测定。
标记的化合物(示踪物)：将100μg(100ul)CT-H(1mg/ml于PBS 中，pH7.4，AdrenoMed AGGermany)与10μl吖啶NHS-酯(Acridinium NHS-ester)(1mg/ml 于乙腈中，InVent GmbH，Germany)(EP0353971)混合，并于室温下孵育20min。在 SEC400-5(Bio-Rad Laboratories，Inc.，USA)上通过凝胶过滤HPLC纯化标记的CT-H。将纯化的CT-H稀释于(300mmol/L磷酸钾、100mmol/L NaCl、10mmol/L Na-EDTA、5g/L牛血清白蛋白，pH7.0)。终浓度为每200μL约800.000相对光单位(RLU)的标记化合物(约20ng 标记抗体)。通过使用AutoLumat LB953(Berthold Technologies GmbH&Co.KG)来测量吖啶酯化学荧光。
固相：聚苯乙烯管(Greinet Bio-One International AG，Austria)包被上(室温下18h)MR-H(AdrenoMed AG，Germany)(1.5μg MR-H/0.3mL100mmol/L NaCl，50mmol/LTRIS/HCl，pH7.8)。在用5％牛血清白蛋白封闭之后，将管用pH7.4的PBS洗涤，并真空干燥。
校准：
测定利用hADM(BACHEM AG，Switzerland)在250mmol/L NaCl，2g/L Triton X-100，50g/L牛血清白蛋白，20tabs/L Protease Inhibitor Cocktail(Roche DiagnosticsAG，Switzerland))中的稀释物来校准。
hADM免疫测定：
在添加标记的CT-H(200μl)之后，将50μl样品(或校准物)用移液管移入包被的管中，并将管于4℃孵育4h。通过用洗涤溶液(20mM PBS，pH7.4，0.1％Triton X-100)洗涤5次(每次1ml)来去除未结合的示踪物。
利用LB953测量管结合的化学荧光
图4显示典型的hADM剂量/信号曲线和在存在100μg/mL抗体NT-H情况下的 hADM剂量信号曲线。
NT-H不影响所述的hADM免疫测定。
人肾上腺髓质素的稳定性：
将人ADM稀释于人柠檬酸血浆中(终浓度10nM)并于24℃下孵育。在选择的时间点，通过在-20℃下冷冻来终止hADM的降解。在存在和不存在NT-H(100μg/ml)的情况下进行孵育。残余的hADM利用上文所述的hADM免疫测定来定量。
图5显示了在不存在和存在NT-H抗体的情况下，hADM在人血浆(柠檬酸)中的稳定性。单独hADM的半衰期为7.8h，并且在存在NT-H的情况下，半衰期为18.3h(稳定性高了2.3倍)。
实施例4
败血症死亡率(早期治疗)
动物模型
12-15周龄雄性C57B1/6小鼠(Charles River Laboratories，Germany)用于研究。在轻度异氟醚麻醉下经手术诱导腹膜炎。在腹腔左上部(通常为盲肠的位置)产生切口。暴露盲肠，在盲肠周围放置缠紧的结扎线，使线位于小肠入口的远端。用24-尺寸的针在盲肠内产生一个穿刺伤，并使少量的盲肠内容物通过伤口流出。将盲肠重新放回腹腔，并缝合剖腹的位置。最后，将动物送回笼子中，自由接触食物和水。经皮下给予500μl盐水，作为液体替代物。
化合物(NT-M，MR-M，CT-M)的施加和剂量
CLP之后立即对小鼠进行治疗(早期治疗)。CLP是盲肠结扎和穿刺(CLP)的缩写。
研究组
三种化合物是测试物、介质和对照化合物处理。每组有5只小鼠，在BUN(血清血尿素氮测试)测定1天之后抽血。在4天的时间内随访每组另外的10只小鼠。
组处理(10μl/g体重)剂量/随访：
1NT-M，0.2mg/ml，4天内存活
2MR-M，0.2mg/ml，4天内存活
3CT-M，0.2mg/ml，4天内存活
4非特异性小鼠IgG，0.2mg/ml，4天内存活
5对照-PBS10μl/g体重，4天内存活
临床化学
测量基线和CLP后第1天的肾功能血尿素氮(BUN)浓度。在轻度乙醚麻醉下用毛细管从海绵窦获得血液样品。通过利用AU40001ympus Multianalyser来进行测量。4天死亡率提供在表4中。平均BUN浓度提供在表5中。
表4：
4天死亡率 存活(％)
PBS 0
非特异性小鼠IgG 0
CT-M 10
MR-M 30
NT-M 70
表5：
5只动物的平均数 CLP前的BUN(mM) 第1天的BUN(mM)
PBS 8.0 23.2
非特异性小鼠IgG 7.9 15.5
CT-M 7.8 13.5
MR-M 8.1 24.9
NT-M 8.8 8.2
从表4可以看出，NT-M抗体显著降低了死亡率。用NT-M抗体处理4天之后，70％的小鼠存活。4天之后，用MR-M抗体处理时，30％的动物存活，用CT-M抗体处理时，10％的动物存活。与其相比，当用非特异性小鼠IgG处理4天之后，所有的小鼠都死亡。在给予小鼠PBS(磷酸缓冲盐水)的对照组中获得同样的结果。
血尿素氮或BUN测试用于评估肾功能，以辅助诊断肾病，并监测患有急性或慢性肾功能障碍或衰竭的患者。
S-BUN测试结果揭示，NT-M抗体对于保护肾是最有效的。
败血症死亡率(晚期治疗)
动物模型
12-15周龄雄性C57B1/6小鼠(Charles River Laboratories，Germany)用于研究。在轻度异氟醚麻醉下经手术诱导腹膜炎。在腹腔左上部(通常为盲肠的位置)产生切口。暴露盲肠，在盲肠周围放置缠紧的结扎线，使线位于小肠入口的远端。用24-尺寸的针在盲肠内产生一个穿刺伤，并使少量的盲肠内容物通过伤口流出。将盲肠重新放回腹腔，并缝合剖腹的位置。最后，将动物送回笼子中，自由接触食物和水。经皮下给予500μl盐水，作为液体替代物。
化合物(NT-M FAB2)的施加和剂量
NT-M FAB2是测试物、介质和对照化合物处理。CLP6小时之后，完全发展成败血症之后进行治疗(晚期治疗)。每组有4只小鼠，并在4天的时间内随访
组处理(10μl/g体重)剂量/随访：
研究组
1NT-M，FAB20.2mg/ml，4天内存活
2对照：非特异性小鼠IgG，0.2mg/ml，4天内存活
3介质-PBS10μl/g体重，4天内存活
表6：
4天死亡率 存活(％)
PBS 0
非特异性小鼠IgG 0
NT-M FAB2 75
从表6可以看出，NT-M FAB2抗体显著降低了死亡率。用NT-M FAB2抗体处理4天之后，75％的小鼠存活。与其相比，当用非特异性小鼠IgG处理4天之后，所有的小鼠都死亡。在给予小鼠PBS(磷酸缓冲盐水)的对照组中获得同样的结果。
实施例5
抗ADM抗体在抗生素处理和通过儿茶酚胺稳定循环以及体液平衡调节之后的CLP小鼠中的递增效应
动物模型
在本研究中使用雄性C57B1/6小鼠(8-12周，22-30g)。通过盲肠结扎和穿刺 (CLP)诱导的多微生物性败血症用作研究败血性休克的模型((Albuszies G，et al：Effect ofincreased cardiac output on hepatic and intestinal microcirculatory bloodflow，oxygenation，and metabolism in hyperdynamic murine septic shock. CritCare Med2005；33：2332-8)，(Albuszies G，et al：The effect of iNOS deletion onhepatic gluconeogenesis in hyperdynamic murine septic shock.Intensive CareMed2007；33：1094-101)，(Barth E，et al：Role of iNOS in the reducedresponsiveness of the myocardium to catecholamines in a hyperdynamic.murinemodel of septic shock.Crit Care Med2006；34：307-13)，(Baumgart K，et al：Effectof SOD-lover-expression on myocardial function during resuscitated murineseptic shock.Intensive Care Med2009；35：344-9)，(Baumgart K，et al：Cardiac andmetabolic effects of hypothermia and inhaled H2S in anesthetized andventilated mice.Crit Care Med2010；38：588-95)，(Simkova V，et al：The effect ofSOD-lover-expression on hepatic gluconeogenesis and whole-body glucoseoxidation during resuscitated，normotensive murine septic shock.Shock2008； 30：578-84)，(Wagner F，et al.：Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2Sduring resuscitated，hyperdynamic murine septic shock.Shock，im Druck)，(WagnerF，et al：Effects of intravenous H2S after murine blunt chest trauma：aprospective，randomized controlled trial.Crit Care2011，submittes forpublication)).
称重之后，通过腹腔内注射120μg/g氯胺酮、1.25μg/g咪唑安定和0.25μg/g芬太尼麻醉小鼠。在手术操作过程中，体温维持在37-38℃。在中心线处产生一个1cm的腹部切口，以接近盲肠。然后用3-0丝线在基部附近将盲肠系住，并用18-尺寸的针进行一次穿刺。将盲肠重新放回，并再次缝合(4-0线)切口。为了补偿围手术期的液体损失，在背部真皮中皮下注射0.5ml乳酸林格氏液，其中含有1μg/g的丁丙诺啡作为止痛剂。对于抗生作用，小鼠经下肢皮下接受头孢曲松30μg/g和克林霉素30μg/g。
CLP手术之后，将动物维持在足够热量的环境下，水和食物随意。
在用异氟醚短期麻醉之后，通过背部皮下注射具有4μg/g葡萄糖和1μg/g丁丙诺啡的0.5ml乳酸林格氏液来确保液体需求，其以8小时的周期施加。此外，经下肢皮下注射头孢曲松30μg/g和克林霉30μg/g来维持抗生作用。
测试物质的给药
早期治疗
CLP手术并缝合切口之后，立即通过阴茎静脉注射来施加磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的浓度为500μg/ml的测试物质抗体NT-M，剂量为2mg/kg体重(剂量体积88-120μl) (5只动物)。
晚期治疗
在发展成完全败血症之后，即CLP手术15.5h之后，如上所述来麻醉动物，并通过阴茎静脉注射来施加磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的浓度为500μg/ml的NT-M，剂量为2mg/kg 体重(剂量体积88-120μl)(3只动物)。
对照组(6只动物)在CLP手术之后立即接受对应量的介质PBS溶液，而非抗体 (4μl/g，88-120μl)。
研究组和实验设置
重症护理监测下的鼠败血性休克：
监测具有3、5和6只动物的三组。1组(5只动物)在CLP15.5h之后接受抗体 NT-M，2组在CLP手术之后立即接受抗体NT-M，3组接受相当量的PBS(4μl/g)。CLP后孵育16小时(以允许出现多微生物性败血症)，在与重症医疗护理方案相当的监测和干预下继续实验。因此，在称重之后，如在CLP手术部分所述对动物进行麻醉(除了晚期治疗的动物，其在治疗之前麻醉)。对于剩下的实验，体温维持在37-38℃。在气管切开术和插管之后，通过实验动物肺呼吸机(Emka Technologies，Fi020，5，PEEP10H20，VT8μ l/g，I：E1：1，5，AF70-140，取决于体温)监测并维持呼吸。
通过在插管的右侧颈外静脉连续输注氯胺酮30μg/gxh和芬太尼0.3μg/gxh在整个实验中保持麻醉。此外，在右颈动脉插管用于连续监测心率和平均动脉压(MAP)。通过静脉内(颈静脉)输注胶体(80μL/gxh，)，并且如果需要的话输注溶解于胶体中的去甲肾上腺素作为血管加压药，使平均动脉压维持在MAP＞65mmHg。在0和4小时时通过插管的颈动脉采集血液样品(120μl)用于测定肌酸酐。膀胱穿刺并通过膀胱导管收集尿液。实验在6小时后终止，或者如果MAP＞65mmHg(颈静脉)不能用血管加压药给药维持则提前终止。
测量的参数
测量并分析以下参数：去甲肾上腺素的总消耗(μg NA/g)、去甲肾上腺素的消耗率(μg NA/g/h)、实验过程中收集的尿液总体积、实验结束时的肌酸酐浓度(μg/mL)和平均肌酸酐清除率(μL/min)。
表7：
在向作为对照组的共6只小鼠给予非特异性小鼠IgG、CLP后立即给予5只小鼠的组于NT-鼠抗体(早期治疗)或CLP15.5h之后给予3只小鼠的组于NT-鼠抗体(晚期治疗)之后，测量儿茶酚胺需求。
儿茶酚胺需求的降低是循环稳定的度量。因此，数据表明，ADM抗体，尤其是NT-M抗体，导致循环得到大幅稳定，并导致儿茶酚胺需求大幅降低。在早期治疗(CLP之后立即)和发展成完全败血症之后的治疗(晚期治疗)中均产生了循环稳定效应(参见图7)。
体液平衡调节
复苏早期和4天内累积的更绝对的体液平衡与败血性休克中增加的死亡风险相关。体液平衡的控制对于败血症患者的疾病过程中是极度重要的(s.Boyd et al，2011)。控制危重患者的体液平衡在重症监护医疗中仍然是一项巨大的挑战。从表8中可以看出，在CLP后用NT-M抗体处理小鼠(实验方案参见“动物模型”)导致排出的尿液总体积增加。 NT-M处理的动物中排出的尿液比未处理的动物高约三倍。在早期和晚期治疗中均产生阳性治疗效应。也是在早期和晚期治疗中，体液平衡改善约20-30％。因此，数据表明，使用ADM 抗体，尤其是使用NT ADM抗体，对于调节患者的体液平衡是有利的(参见表8以及图8和 9)。
表8
尿液平均体积/g体重 体液平衡平均体积/g体重
对照(小鼠IgG)(N＝6) 0.042ml/g 0,23ml/g
NT-M早期(N＝5) 0.12ml 0,18ml/g
相对变化，早期治疗 +186％ -21.7％％
NT-M晚期(N＝3) 0.125ml 0,16ml/g
相对变化，晚期治疗 +198％ -30,5％
肾功能的改善
急性肾衰竭和败血症的组合70％的死亡率相关，如与单独的急性肾衰竭患者的45％的死亡率相比(Schrier and Wang，“Mechanisms of Disease Acute Renal Failureand Sepsis”；The New England Journal of Medicine；351：159-69；2004)。肌酸酐浓度和肌酸酐清除率是监测肾功能或肾功能障碍的标准实验室参数(Jacob，“Acute RenalFailure”，Indian J.Anaesth.；47(5)：367-372；2003)。来自上述动物实验(早期治疗) 的肌酸酐和肌酸酐清除率数据提供在表9中。
表9
肾功能
与对照败血症动物相比，由于NT-M处理，肌酸酐浓度降低了42％，肌酸酐清除率增加了100％以上(表9)。数据表明，给予ADM抗体，尤其是NT-M，导致肾功能改善。
肝炎症状态的改善
将对照和早期治疗动物的肝组织匀浆，并在裂解缓冲液中裂解。为了制备细胞提取物，将细胞重悬，在冰上裂解并离心。将上清液(蛋白提取物)储存于-80℃。如前文所述，利用电泳迁移率改变分析(EMSA)1，2测定B细胞中核因子κ-轻链基因增强子的激活 (NF-κB)。将细胞提取物(10μg)在冰上与聚脱氧次黄嘌呤-核苷脱氧胞苷酸(聚-dI-dC， poly-doxy-inosinic-deoxy-cytidylic acid)和含有NF-κB(HIVκBsite)的32P-标记的双链寡核苷酸(Biomers，Ulm，Germany)(5’-GGATCCTCAACAGAGGGGACTTTCCGAGGCCA-3’) 一起孵育。在非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离复合物，干燥并暴露于X-射线胶片。使用感光成像仪和图像分析软件(AIDA Image Analyzer；Raytest)通过光密度法来定量放射性标记的NF-κB。对于各个凝胶之间的比较，每个条带的强度是相对于同时加载的对照动物(其未经历手术器械和CLP)的强度。因此，EMSA数据表示为相对于对照值的倍数增加。统计学：所有数据都表示为中值(范围)，除非另有说明，两组之间的差异用非配对样品的 Mann-Whitney秩和检验分析。结果：用NT-M处理的动物(2.27(1.97-2.53))与介质动物相比，呈现显著减弱的肝组织NF-κB激活(2.92(2.50-3.81))(p＜0.001)(参见图10)。
参考文献
1.Wagner F，Wagner K，Weber S，Stahl B， MW，Huber-Lang M，SeitzDH，Asfar P，Calzia E，Senftleben U，Gebhard F，Georgieff M，Radermacher P，Hysa V：Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated，hyperdynamic murine septic shock.Shock2011；35(4)：396-402。
2.Wagner F，Scheuerle A，Weber S，Stahl B，McCook O， MW.Huber-Lang M，Seitz DH，Thomas J，Asfar P，SzabóC， P，Gebhard F，Georgieff M，Calzia E，Radermacher P，Wagner K：Cardiopulmonary，histologic，and inflammatoryeffects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusionin mice.J Trauma2011；71(6)：1659-67。
实施例6
抗体NT-M的体内副作用测定
12-15周龄雄性C57B1/6小鼠(Charles River Laboratories，Germany)用于研究。6只小鼠用剂量为(10ul/g体重)的0.2mg/ml的NT-M处理。作为对照，6只小鼠用 (10μl/g体重)PBS处理。监测存活和身体状况持续14天。两组中的死亡数为0，NT-M和对照组在身体状况上没有差异。
实施例7
庆大霉素诱导的肾毒性
已经建立了非败血症急性肾损伤模型，其利用庆大霉素诱导的肾毒性(Chiu PJS.Models used to assess renal functions.Drμg Develop Res32：247-255，1994.)。该模型用于评价用抗肾上腺髓质素抗体处理是否能够改善肾功能。
如下进行实验。
使用重量为250±20g的8只雄性斯普拉-道来氏大鼠的组。动物用120mg/kg的庆大霉素经肌肉内注射激发，连续7天(1组和2组)。在第0天庆大霉素前5min，随后在第2天、第4天和第6天静脉内注射测试化合物(抗肾上腺髓质素抗体NT-M)和介质(磷酸盐缓冲盐水)。每天监测体重和临床症状。在第0天、第2天和第6天进行在冰上的二十四 (24)小时尿液收集。测定尿液样本中Na+、K+和肌酸酐的浓度。在第1天(庆大霉素前)。第3天(庆大霉素前)和第7天收集血液样品用于临床化学。血清电解质(Na+和K+)、肌酸酐和BUN是监测用于评价肾功能的主要分析物。将血浆样品收集进EDTA管(第1天和第3天：100μl；第7天：120μl)中。计算肌酸酐清除率。尿液体积、尿电解质和肌酸酐表示为每100g动物体重排出的量。在第7天处死所有动物。对肾称重。
尿液收集将动物放在单独的笼子中，其中在第0天、第2天和第6天收集尿液持续24h。测量尿液体积、尿Na+、K+和肌酸酐。
内源肌酸酐清除率按如下计算：
CCr(ml/24h)＝[UCr(mg/ml)×V(ml/24h)]/SCr(mg/ml)
24-hr尿排泄的钠(Na+)按如下计算：
UNaV(μEq/24h)＝UNa(μEq/ml)×V(ml/24h)
类似地计算24-hr尿排泄的NAG和NGAL。
Na+的排泄分数(FENa)或排泄入最终尿液中的过滤纳的百分比为肾小管Na+再吸收功能的度量。其按如下计算：
FENa(％)＝100×[UNa(μ Eq/ml)×V(ml/24h)]/PNa(μEq/ml)×CCr(ml/24h)
与介质相比，用抗肾上腺髓质素抗体处理在第7天改善了肾功能的几个度量：血清肌酸酐1.01mg/dL(NT-M)相对于1.55mg/dL(介质)(图11)、BUN32.08mg/dL(NT-M) 相对于52.41mg/dL(介质)(图12)、内源肌酸酐清除率934.43mL/24h(NT-M)相对于 613.34mL/24h(介质)(图13)、Na+的排泄分数为0.98％(NT-M)相对于1.75％(介质) (图14)。
实施例8
在上述的小鼠CLP模型中，研究了用抗肾上腺髓质素抗体NT-M处理对肾功能的几个参数的影响。
NT-M分别导致利尿和肌酸酐清除率升高两倍和三倍，最终在实验结束时导致肌酸酐、尿素和NGAL血浓度降低(参见表10)。而且，用NT-M处理显著降低了肾中角化细胞来源的趋化因子(KC)浓度(图15)。
表10：介质处理的(n＝11)和NT-M处理的(n＝9)动物中肾功能参数。在实验结束时采集的样品中测量血液浓度。NGAL＝中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。所有数据为中值(四分位数)。
介质 NT-M p-值
排尿量[μL·g<sup>-1</sup>·h<sup>-1</sup>] 4.4(3.5；16.5) 15.2(13.9；22.5) 0.033
肌酸酐清除率[μL·min<sup>-1</sup>] 197(110；301) 400(316；509) 0.006
肌酸酐[μg·mL<sup>-1</sup>] 1.83(1.52；3.04) 1.28(1.20；1.52) 0.010
尿素[μg·mL<sup>-1</sup>] 378(268；513) 175(101；184) 0.004
NGAL[μg·mL<sup>-1</sup>] 16(15；20) 11(10；13) 0.008
按如下进行实验。
肌酸酐、尿素和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)
利用商业ELISA(小鼠NGAL，RUO042，BioPorto Diagnostics A/ S，Denmark，Gentofte)测量血液NGAL浓度。用毛细管柱(Optima-5MS，Macherey-Nagel，Dür en，Germany)气相色谱/质谱系统(Agilent5890/5970，Germany)，使用2H3-肌酸酐(CDN同位素，Pointe-Claire，QU，Canada)和甲基尿素(FlukaChemikalien，Buchs，Switzerland)作为内参来测量尿素和肌酸酐浓度。在用乙腈脱蛋白之后，离心并蒸发至干燥，上清液在甲酸中复原，并在弱阴离子交换柱(WCX，Phenomenex，Aschaffenburg，Germany)上提取。乙腈加N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和N-(叔丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺允许分别形成尿素叔丁基-二甲基硅烷基衍生物和肌酸酐三甲基硅烷基衍生物。对于尿素和肌酸酐分析物以及内参分别监测离子m/z231和245以及m/z329和332。利用标准公式从排尿量以及血浆和尿液肌酸酐浓度来计算肌酸酐清除率。
样品制备
用匀浆器将储存于-80℃的肾在PBS中打碎，对于全细胞裂解物用2倍浓度的缓冲液裂解(100mM Tris pH7，6；500mM NaCl；6mM EDTA；6mM EGTA；1％Triton-X-100； 0,5％NP40；10％丙三醇；蛋白酶抑制性(β-甘油磷酸酯2mM；DTT4mM；Leupeptine20μM；Natriumorthovanadate0，2mM))，随后离心。从上清液获得全细胞裂解物；弃去由细胞残留物组成的沉淀。用商购的蛋白分析(Bio-Rad，Hercules，CA)通过光度学测定蛋白的量，将样品调整至终蛋白浓度为4μg/μl。将用于Multiplex和EMSA分析的样品与EMSA缓冲液 (10mMHepes；50mM KCl；10％丙三醇；0,1mM EDTA；1mM DTT)1∶1稀释，将用于免疫印迹的样品与2倍样品缓冲液(2％SDS；125mM Tris-HCL(pH6，8，25℃)；10％丙三醇；50mM DTT； 0,01％溴酚蓝)1∶1稀释。
利用小鼠多样细胞因子试剂盒(Bio-Plex Pro Cytokine Assay，Bio-Rad，Hercules，CA)测定角化细胞来源的趋化因子(KC)浓度水平，通过利用 Bio-plex悬浮阵列系统按照生产商的说明书进行测定(还参见Wagner F，Wagner K，Weber S，Stahl B， MW，Huber-Lang M，Seitz DH，Asfar P，Calzia E，Senftleben U，Gebhard F，Georgieff M，Radermacher P，Hysa V.Inflammatory effects of hypothermia andinhaled H2S during resuscitated，hyperdynamic murine septic shock.Shock2011；35：396-402；and Wagner F，Scheuerle A，Weber S，Stabl B，McCook O， MW，Huber-Lang M，Seitz DH，Thomas J，Asfar P，SzabóC， P，Gebhard F，GeorgieffM，Calzia E，Radermacher P，Wagner K.Cardiopulmonary，histologic，and inflammatoryeffects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusionin mice.J Trauma2011；71：1659-1667)。简而言之，将合适的细胞因子标准品和样品添加至过滤板。将样品与化学连接至荧光标记微珠上的抗体一起孵育。此后，将预混的检测抗体添加至每孔，随后添加链霉亲和素-藻红蛋白。然后将微珠重悬，利用Bio-Plex 蛋白阵列读数器定量细胞因子反应混合物。利用从重组细胞因子标准品生成的标准曲线，通过Bio-Plex Manager Software4.1对数据自动处理和分析。测定的检测限以下的水平被设置至零，用于统计学目的。
实施例9
在上述的小鼠CLP模型中，研究了用抗肾上腺髓质素抗体NT-M处理对肝脏的影响。
NT-M导致肝脏中角化细胞来源的趋化因子(KC)浓度显著降低(图16)。
与实施例8(肾)类似地进行角化细胞来源的趋化因子(KC)的测量。
实施例10
在上述的小鼠CLP模型中，研究了用抗肾上腺髓质素抗体NT-M处理对血液循环(血浆)中的几种细胞因子和趋化因子的影响。
细胞因子和趋化因子浓度
利用小鼠多样细胞因子试剂盒(Bio-Plex Pro Cytokine Assay，Bio-Rad，Hercules，CA)测定肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1和角化细胞来源的趋化因子(KC)浓度的血浆水平，通过利用Bio-plex悬浮阵列系统按照生产商的说明书进行测定(还参见Wagner F，Wagner K，Weber S，Stahl B， MW，Huber-Lang M，Seitz DH，Asfar P，Calzia E，Senftleben U，Gebhard F，Georgieff M，Radermacher P，Hysa V.Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2Sduring resuscitated，hyperdynamic murine septic shock.Shock2011； 35：396-402；and Wagner F，Scheuerle A，Weber S，Stahl B，McCook O， MW，Huber-Lang M，Seitz DH，Thomas J，Asfar P，SzabóC， P，Gebhard F，Georgieff M，Calzia E，Radermacher P，Wagner K.Cardiopulmonary，histologic，and inflammatory effects ofintravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice.JTrauma2011；71：1659-1667)。简而言之，将合适的细胞因子标准品和样品添加至过滤板。将样品与化学连接至荧光标记微珠上的抗体一起孵育。此后，将预混的检测抗体添加至每孔，随后添加链霉亲和素-藻红蛋白。然后将微珠重悬，利用Bio-Plex蛋白阵列读数器定量细胞因子反应混合物。利用从重组细胞因子标准品生成的标准曲线，通过Bio-Plex ManagerSoftware4.1对数据自动处理和分析。测定的检测限以下的水平被设置至零，用于统计学目的。
利用商购的“多样细胞因子试剂盒”(Bio-Plex Pro Precision Pro CytokineAssay，Bio-Rad，Hercules，CA)测定肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6和IL-10、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1和角化细胞来源的趋化因子(KC)的血浆水平和肾组织浓度，所述试剂盒允许从一份单独的样品收集几个参数。测定的单独工作步骤按照生产商的说明书进行(还参见Wagner F，Wagner K，Weber S，Stahl B， MW，Huber-Lang M，Seitz DH，Asfar P，Calzia E，Senftleben U，Gebhard F，Georgieff M，Radermacher P，HysaV.Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated，hyperdynamic murine septic shock.Shock2011；35：396-402；and Wagner F，ScheuerleA，Weber S，Stahl B，McCook O， MW，Huber-Lang M，Seitz DH，Thomas J，AsfarP，SzabóC， P，Gebhard F，Georgieff M，Calzia E，Radermacher P，WagnerK.Cardiopulmonary，histologic，and inflammatory effects of intravenous Na2Safter blunt chest trauma-induced lung contusion in mice.J Trauma2011； 71：1659-1667)。
简而言之，将荧光标记微球(“珠子”)添加至96孔板，随后进行两个洗涤步骤，添加内参并添加血浆和肾匀浆样品。在随后的孵育过程中，一种细胞因子结合连接至聚苯乙烯珠子的抗体。在添加细胞因子特异的生物素标记抗体(其用于检测一种细胞因子)和额外的孵育时间之后，随后添加藻红蛋白标记的链霉亲和素。在额外的孵育时间之后，然后将珠子重悬，并且板可以用特定的流式细胞仪(Bio-Plex suspension array system，Bio-Rad，Hercules，CA)测量。利用从重组细胞因子标准品生成的标准曲线，通过 Bio-Plex ManagerSoftware4.1对数据自动处理和分析。对于血浆水平，以pg*mL-1提供浓度，肾匀浆的浓度被转化成合适的蛋白浓度并以pg*mg-1蛋白提供。
NT-M导致IL-6(图17)、IL-10(图18)、角化细胞来源的趋化因子(KC)(图19)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)(图20)、TNF-α(图21)血浆浓度的显著降低。
实施例11
局部缺血/再灌注诱导的急性肾损伤
建立了另一种非败血症急性肾损伤模型，其中急性肾损伤由局部缺血/再灌注诱导(Nakamoto M，Shapiro JI，Shanley PF，Chan L，and Schrier RW.In vitro and invivo protective effect of atriopeptin III on ischemic acute renal failure.JClinIn vest80：698-705，1987.，Chintala MS，Bernardino V，and Chiu PJS.Cyclic GMPbut not cyclic AMP prevents renal platelet accumulation following ischemia-reperfusion in anesthetized rats.J PharmacolExpTher271：1203-1208，1994)。该模型用于评估用抗肾上腺髓质素抗体处理是否能够改善肾功能。
实验如下进行：
NT-M对大鼠中局部缺血/再灌注诱导的急性肾损伤的影响
研究设计
a介质：在第0天再灌注之前5min静脉内(i.v.)注射，随后在第1天和第2天注射。
b在第0天再灌注之前5min静脉内(i.v.)注射4mg/kg的NT-M，随后在第1天和第2天每天静脉内注射2mg/kg。
c在第-1天、第0天、第1天和第2天的尿液收集，分别在第0天、第1天和第2天和第3天进行血液化学和尿液分析。将血浆样品收集进EDTA管中(第0天(就在手术前)，第1天、第2天：100μl，介质或TA前；第3天：120μl。
临床观察：手术前每日，随后手术并在整个治疗过程中。
使用重量为250至280g的8只雄性斯普拉-道来氏大鼠的组。动物维持在12-hr 光照/黑暗循环下，并接受标准饮食，蒸馏水随意。动物在手术前30min(第0天)接收液体补充物(0.9％NaCl和5％葡萄糖/1∶1，10ml/kg p.o.)。用戊巴比妥(50mg/kg，i.p.)使大鼠麻醉。通过中心线切口暴露腹腔，随后静脉内给予肝素(100U/kg，i.v.)，并通过使用血管钳使两个肾动脉鼻塞45min。移除肾夹子之后，立即观察肾脏1min以确保指示血液再灌注的颜色变化。在再灌注前5min通过静脉注射测试化合物(NT-M)和介质(磷酸盐缓冲盐水)，随后在第1天和第2天每日注射。
尿液收集：在局部缺血/再灌注前24h即第-1天(-24h至0h)和第0天(0-24h)、再灌注后第1天(24-48h)和第2天(48-72h)开始进行在冰上的24h尿液收集。
血液收集：在0h(I RI手术前)、24h(介质或TA前)、48h(介质或TA前)和72h 时，通过尾静脉将0.4ml血液收集进EDTA管，用于测定血浆肌酸酐/Na+/K+和BUN；通过腔静脉收集2ml血液。
将动物放在单独的笼子中，在24h即第-1天(-24h-0h)、第0天(0-24h)、第0天再灌注后的第1天(24-48h)和第2天(48-72h)时收集尿液。测量尿液体积、尿Na+、K+和肌酸酐。
肌酸酐清除率(CCr)如下计算：
CCr(ml/24h)＝[UCr(mg/ml)×V(ml/24h)]/PCr(mg/ml)
24-hr尿排泄的钠(Na+)按如下计算：
UNaV(μEq/24h)＝UNa(μEq/ml)×V(ml/24h)
Na+的排泄分数(FENa)或排泄入最终尿液中的过滤纳的百分比为肾小管Na+再吸收功能的度量。其按如下计算：
FENa(％)＝100×[UNa(μEq/m1)×V(ml/24h)]/PNa(μEq/ml)×CCr(ml/24h)
用抗肾上腺髓质素抗体处理改善了肾功能的几个度量：
介质组中的血尿素氮(BUN)表现出强烈增加(0h：17.49mg/dL，24h：98.85mg/ dL，48h：109.84mg/dL，72h：91.88mg/dL)，其用NT-M处理较不明显(0h：16.33mg/ dL，24h：84.2mg/dL，48h：82.61mg/dL，72h：64.54mg/dL)(图22)。
血清肌酸酐表现类似：介质组(0h：0.61mg/dL，24h：3.3mg/dL，48h：3.16mg/ dL，72h：2.31mg/dL)，NT-M组：(0h：0.59mg/dL，24h：2.96mg/dL，48h：2.31mg/dL，72h：1.8mg/dL)(图23)。
内源肌酸酐清除率在第1天时显著下降，此后在NT-M组中的改善优于介质组。介质组：(0h：65.17mL/h，24h：3.5mL/h，48h：12.61mL/h，72h：20.88mL/h)，NT-M组： (0h：70.11mL/h，24h：5.84mL/h，48h：21.23mL/h，72h：26.61mL/h)(图24)。
附图说明
图1a：抗体形式-Fv和scFv-变体的图示
图1b：抗体形式-异源融合和双功能抗体的图示
图1c：抗体形式-二价抗体和双特异性抗体的图示
图2：
hADM1-52(SEQ ID No.21)
mADM1-50(SEQ ID No.22)
人ADM的aa1-21(SEQ ID No.23)
人ADM的aa1-42(SEQ ID No.24)
人ADM的aa43-52(SEQ ID No.25)
人ADM的aal-14(SEQ ID NO：26)
人ADM的aa1-10(SEQ ID NO：27)
人ADM的aa1-6(SEQ ID NO：28)
成熟人ADM的aa1-32(SEQ ID NO：29)
成熟鼠ADM的aa1-40(SEQ ID NO：30)
成熟鼠ADM的aa1-31(SEQ ID NO：31)
图3：
a：人ADM的剂量反应曲线。最大cAMP刺激被调整至100％激活。
b：人ADM22-52(ADM-受体拮抗剂)在存在5.63nM hADM的情况下的剂量/抑制曲线。
c：CT-H在存在5.63nM hADM的情况下的剂量/抑制曲线。
d：MR-H在存在5.63nM hADM的情况下的剂量/抑制曲线。
e：NT-H在存在5.63nM hADM的情况下的剂量/抑制曲线。
f：小鼠ADM的剂量反应曲线。最大cAMP刺激被调整至100％激活。
g：人ADM22-52(ADM-受体拮抗剂)在存在0.67nM mADM的情况下的剂量/抑制曲线。
h：CT-M在存在0.67nM mADM的情况下的剂量/抑制曲线。
i：MR-M在存在0.67nM mADM的情况下的剂量/抑制曲线。
j：NT-M在存在0.67nM mADM的情况下的剂量/抑制曲线。
k：显示了F(ab)2NT-M和Fab NT-M对ADM的抑制。
l：显示了F(ab)2NT-M和Fab NT-M对ADM的抑制。
图4：该图显示了典型的hADM剂量/信号曲线和在存在100μg/mL抗体NT-H的情况下的hADM剂量信号曲线。
图5：该图显示了在不存在和存在NT-H抗体的情况下，hADM在人血浆(柠檬酸) 中的稳定性。
图6：Fab与同源人框架序列的比对
图7：该图显示了用NT-M早期治疗和晚期治疗的去甲肾上腺素需求。
图8：该图显示了用NT-M早期治疗和晚期治疗后的尿产生。
图9：该图显示了用NT-M早期治疗和晚期治疗后的体液平衡。
图10：通过电泳迁移率改变分析(EMSA)来分析核因子κ-轻链基因增强子在B细胞(NF-κB)中的肝组织激活。#描绘了相对于介质p＜0.001。
图11：血清肌酸酐随时间的发展。显示了平均值+/-标准误。
图12：血尿素氮(BUN)随时间的发展。显示了平均值+/-标准误。
图13：内源肌酸酐清除率随时间的发展。显示了平均值+/-标准误。
图14：Na+的排泄分数随时间的发展。显示了平均值+/-标准误。
图15：相对于所提取的总肾蛋白测定的角化细胞来源的趋化因子(KC)水平。白框图显示了用介质获得的结果，灰框图显示了用NT-M处理后获得的结果。
图16：相对于所提取的总肝蛋白测定的角化细胞来源的趋化因子(KC)水平。白框图显示了用介质获得的结果，灰框图显示了用NT-M处理后获得的结果。
图17：血浆IL-6水平。白框图显示了用介质获得的结果，灰框图显示了用NT-M处理后获得的结果。
图18：血浆IL-10水平。白框图显示了用介质获得的结果，灰框图显示了用NT-M 处理后获得的结果。
图19：血浆角化细胞来源的趋化因子(KC)水平。白框图显示了用介质获得的结果，灰框图显示了用NT-M处理后获得的结果。
图20：血浆单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)水平。白框图显示了用介质获得的结果，灰框图显示了用NT-M处理后获得的结果。
图21：血浆TNF-α水平。白框图显示了用介质获得的结果，灰框图显示了用NT-M 处理后获得的结果。
图22：血尿素氮(BUN)随时间的发展。显示了平均值+/-标准误。
图23：血清肌酸酐随时间的发展。显示了平均值+/-标准误。
图24：内源肌酸酐清除率随时间的发展。显示了平均值+/-标准误。

Claims (27)

1.抗肾上腺髓质素单克隆抗体或其结合抗肾上腺髓质素的片段，其中所述单克隆抗体或片段特异性结合成熟人肾上腺髓质素(ADM)的第1-42氨基酸序列内的至少4个氨基酸的区域，所述成熟人ADM的第1-42位氨基酸序列为：YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA(SEQ ID No：24)，并且，其中所述抗体或片段展现出对ADM至少10-7M的亲和力。
2.权利要求1的抗肾上腺髓质素单克隆抗体或其片段，其中：
(a)所述单克隆抗体的重链可变区包含以下CDR序列：
(i)GYTFSRYW(SEQ ID NO:1)，
(ii)ILPGSGST(SEQ ID NO:2)，
(iii)TEGYEYDGFDY(SEQ ID NO:3)，以及
(b)所述单克隆抗体的轻链可变区包含以下CDR序列：
(i)QSIVYSNGNTY(SEQ ID NO:4)，
(ii)RVS(SEQ ID NO:5)，
(iii)FQGSHIPYT(SEQ ID NO:6)。
3.权利要求1的抗肾上腺髓质素单克隆抗体或其片段，其是人单克隆抗体或人源化抗体，其中：
(a)所述单克隆抗体的重链可变区包含以下CDR序列：
(i)GYTFSRYW(SEQ ID NO:1)，
(ii)ILPGSGST(SEQ ID NO:2)，
(iii)TEGYEYDGFDY(SEQ ID NO:3)，以及
(b)所述单克隆抗体的轻链可变区包含以下CDR序列：
(i)QSIVYSNGNTY(SEQ ID NO:4)，
(ii)RVS(SEQ ID NO:5)，
(iii)FQGSHIPYT(SEQ ID NO:6)。
4.权利要求2或3的抗肾上腺髓质素单克隆抗体或其片段，其中，
(a)重链区包含选自SEQ ID NOs：7-11的氨基酸序列，或者包含其中所述重链区的非-CDR序列与SEQ ID NOs：7-11之一序列的非-CDR序列有至少85％同一性的序列，以及
(b)轻链区包含选自SEQ ID NOs：12-14的氨基酸序列，或者包含其中所述轻链区的非-CDR序列与SEQ ID NOs：12-14之一序列的非-CDR序列有至少85％同一性的序列。
5.抗肾上腺髓质素单克隆抗体或其结合抗肾上腺髓质素的片段，其中所述抗体或片段特异性结合如下由SEQ ID NO：23所示的成熟人肾上腺髓质素(ADM)的N-末端部分(第1-21位氨基酸)：YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC。
6.权利要求5的抗肾上腺髓质素单克隆抗体或其片段，其中：
(a)所述单克隆抗体的重链可变区包含以下CDR序列：
(i)GYTFSRYW(SEQ ID NO:1)，
(ii)ILPGSGST(SEQ ID NO:2)，
(iii)TEGYEYDGFDY(SEQ ID NO:3)，以及
(b)所述单克隆抗体的轻链可变区包含以下CDR序列：
(i)QSIVYSNGNTY(SEQ ID NO:4)，
(ii)RVS(SEQ ID NO:5)，
(iii)FQGSHIPYT(SEQ ID NO:6)。
7.权利要求5的抗肾上腺髓质素单克隆抗体或其片段，其是人单克隆抗体或人源化抗体，其中：
(a)所述单克隆抗体的重链可变区包含以下CDR序列：
(i)GYTFSRYW(SEQ ID NO:1)，
(ii)ILPGSGST(SEQ ID NO:2)，
(iii)TEGYEYDGFDY(SEQ ID NO:3)，以及
(b)所述单克隆抗体的轻链可变区包含以下CDR序列：
(i)QSIVYSNGNTY(SEQ ID NO:4)，
(ii)RVS(SEQ ID NO:5)，
(iii)FQGSHIPYT(SEQ ID NO:6)。
8.权利要求6或7的抗肾上腺髓质素单克隆抗体或其片段，其中，
(a)重链区包含选自SEQ ID NOs：7-11的氨基酸序列，或者包含其中所述重链区的非-CDR序列与SEQ ID NOs：7-11之一序列的非-CDR序列有至少85％同一性的序列，以及
(b)轻链区包含选自SEQ ID NOs：12-14的氨基酸序列，或者包含其中所述轻链区的非-CDR序列与SEQ ID NOs：12-14之一序列的非-CDR序列有至少85％同一性的序列。
9.权利要求5-8任一项的抗肾上腺髓质素单克隆抗体或其片段，其中，所述抗体或片段既不结合N-末端延长的或N-末端修饰的肾上腺髓质素，也不结合N-末端降解的肾上腺髓质素。
10.抗肾上腺髓质素单克隆抗体或其结合抗肾上腺髓质素的片段，其中所述单克隆抗体或片段特异性结合成熟人肾上腺髓质素(ADM)的N-末端部分(第1-19位氨基酸)。
11.权利要求1-10任一项的抗肾上腺髓质素单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或所述片段结合含有肾上腺髓质素N-末端(第1位氨基酸)的表位。
12.权利要求1-11任一项的抗肾上腺髓质素单克隆抗体或其片段，其特征在于所述抗体或所述片段不结合ADM的C-末端部分，所述ADM的C-末端部分为ADM的第43-52位氨基酸：PRSKISPQGY-NH2
(SEQ ID NO:25)。
13.权利要求1-12任一项的抗肾上腺髓质素单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或所述片段是满足如下条件的ADM稳定抗体或片段：其使肾上腺髓质素在血清、血液、血浆中的半衰期(t1/2半滞留时间)增加至少10％，或至少50％，或>50％，或100％，和/或其中所述抗体或片段封闭不超过80％，或不超过50％的循环ADM生物活性。
14.权利要求13的抗肾上腺髓质素单克隆抗体或其片段，其中所述抗体或片段结合ADM，其中所述抗体或片段包含选自以下的序列：
SEQ ID NO:7(AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH；
SEQ ID NO:8(AM-VH1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH；
SEQ ID NO:9(AM-VH2-E40)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH；
SEQ ID NO:10(AM-VH3-T26-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH；
SEQ ID NO:11(AM-VH4-T26-E40-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH；
SEQ ID NO:12(AM-VL-C)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；
SEQ ID NO:13(AM-VL1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；
SEQ ID NO:14(AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
15.权利要求1至14任一项的抗肾上腺髓质素单克隆抗体或其结合肾上腺髓质素的片段在制备用于治疗或预防脓毒性休克或创伤性损伤，尤其是脓毒症晚期的药物中的应用。
16.权利要求1至14任一项的抗肾上腺髓质素单克隆抗体或其结合肾上腺髓质素的片段在制备用于降低患者的慢性或者急性病或急性病症的死亡风险的药物中的应用，所述慢性或者急性病或急性病症选自重度感染，如脑膜炎、全身炎症反应综合征(SIRS)、败血症；其它疾病如糖尿病、癌症、急性和慢性血管疾病如心力衰竭、心肌梗死、卒中、动脉粥样硬化，水肿；休克如败血性休克和器官功能障碍如肾功能障碍、肝功能障碍、烧伤、手术、外伤、中毒。
17.权利要求1至14任一项的抗肾上腺髓质素单克隆抗体或其结合肾上腺髓质素的片段在制备用于稳定患者循环尤其是全身循环的药物中的应用，所述患者患有慢性或者急性病或急性病症，所述慢性或者急性病或急性病症选自自重度感染，如脑膜炎、全身炎症反应综合征(SIRS)、败血症；其它疾病如糖尿病、癌症、急性和慢性血管疾病如心力衰竭、心肌梗死、卒中、动脉粥样硬化，水肿；休克如败血性休克和器官功能障碍如肾功能障碍、肝功能障碍、烧伤、手术、外伤、中毒。
18.权利要求17的应用，其中所述药物可用于降低所述患者的血管加压药需求，例如降低儿茶酚胺的需求。
19.权利要求1至14任一项的抗肾上腺髓质素单克隆抗体或其结合肾上腺髓质素的片段与另一种药剂组合在制备用于治疗或预防脓毒性休克或创伤性损伤，尤其是脓毒症晚期的药物中的应用。
20.权利要求19的应用，其中所述药剂选自血管加压药，静脉注射液，TNF-α-抗体和抗生素。
21.权利要求1至14任一项的抗肾上腺髓质素单克隆抗体或其结合肾上腺髓质素的片段与另一种药剂组合在制备用于降低患者的慢性或者急性病或急性病症的死亡风险的药物中的应用，所述慢性或者急性病或急性病症选自自重度感染，如脑膜炎、全身炎症反应综合征(SIRS)、败血症；其它疾病如糖尿病、癌症、急性和慢性血管疾病如心力衰竭、心肌梗死、卒中、动脉粥样硬化，水肿；休克如败血性休克和器官功能障碍如肾功能障碍、肝功能障碍、烧伤、手术、外伤、中毒。
22.权利要求21的应用，其中所述药剂选自血管加压药，静脉注射液，TNF-α-抗体和抗生素。
23.权利要求1至14任一项的抗肾上腺髓质素单克隆抗体或其结合肾上腺髓质素的片段与另一种药剂组合在制备用于稳定患者循环尤其是全身循环的药物中的应用，所述患者患有慢性或者急性病或急性病症，所述慢性或者急性病或急性病症选自自重度感染，如脑膜炎、全身炎症反应综合征(SIRS)、败血症；其它疾病如糖尿病、癌症、急性和慢性血管疾病如心力衰竭、心肌梗死、卒中、动脉粥样硬化，水肿；休克如败血性休克和器官功能障碍如肾功能障碍、肝功能障碍、烧伤、手术、外伤、中毒。
24.权利要求23的应用，其中所述药物可用于降低所述患者的血管加压药需求，例如降低儿茶酚胺的需求。
25.权利要求23或24的应用，其中所述药剂选自血管加压药，静脉注射液，TNF-α-抗体和抗生素。
26.权利要求15-25任一项的应用，其中所述药物能配制成溶液或冷冻干燥状态的药物制剂。
27.权利要求15-25的应用，其中所述药物能配制成经肌内、经血管内、经输注给予或配制成经患者全身给予的剂型。
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