JP6009678B2 - 新規なil−17a結合分子およびその医療用途 - Google Patents
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Description
Schlatter et al.(Schlatter et al.(2012)mAbs、4(4)、497〜50頁)中に記載されたフィノマーファージライブラリーを使用し、IL−17Aに特異的なFyn−SH3由来結合タンパク質を、抗原として組換えIL−17A(R&D Systems)、および選択技術として標準ファージディスプレイ(Grabulovski D.et al.、(2007)J Biol Chem282、3196〜3204頁、Viti、F.et al.(2000)Methods Enzymol.326、480〜505頁)を使用して単離した。n−src−ループ配列「STHEYE」(配列番号2)を有する本発明のFynSH3由来ポリペプチド1L3−B09(配列番号3)は選択プロセス中に増大した。1L3−B09(配列番号3)はIL−17Aと結合し(実施例2参照)、驚くことに非グリコシル化IL−17Aと同程度にグリコシル化IL−17Aを阻害することが分かった(実施例3参照)。高いアフィニティーを有するFynSH3由来IL−17A結合物質を得るため、1L3−B09(配列番号3)はアフィニティー成熟の鋳型として使用した。n−src−ループ配列「STHEYE」(配列番号2)は一定に保ち、ランダムRT−ループレパートリー(配列番号1において(X1)(X2)(X3)(X4)(X5)(X6)として表す6アミノ酸残基)と組み合わせた。アフィニティー成熟ライブラリー作製のプロセスは、ランダムRT−ループを有する原型ライブラリー(Schlatter et al.(2012)mAbs、4(4)、497〜50頁中の「ライブラリー0」)のクローニングに関して記載されたものとほぼ同じであった。
IL−17Aと結合したELISA陽性FynSH3由来ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列表中に添付したように配列番号3〜9で表す。
a)FynSH3由来IL−17A結合ポリペプチドの発現収量
Grabulovski et al.(Grabulovski et al.、(2007)JBC、282、3196〜3204頁)中に記載されたように、FynSH3由来IL−17A結合ポリペプチドをTG1大腸菌のサイトゾルにおいて発現させ精製した。
親FynSH3由来IL−17A結合ポリペプチド1L3−B09(配列番号3)に関して、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を、Superdex75ショートカラム(5/150)(GE Healthcare)を使用してAKTA FPLCシステムで実施した。アフィニティー成熟クローン11L0−C6(配列番号4)、11L5−B06(配列番号5)、11L6−F03(配列番号6)、11L9−C09(配列番号7)、11L10−A05(配列番号8)および11L11−A09(配列番号9)のSECは、SEC−3カラム(Agilent)を使用し、Agilent Technologies1200 Infinity Series HPLC装置で実施した。
アフィニティー測定はBIAcoreT200装置(GE Healthcare)を使用して実施した。グリコシル化IL−17A(研究室内で、HEKEBNA細胞で生成)とモノマーFynSH3由来IL−17A結合ポリペプチドの間の相互作用分析用に、Series S CM5チップ(GE Healthcare)を、アミンカップリングキット(GE Healthcare)を使用し2000RUIL−17Aを固定して使用した。ランニングバッファーは、0.05%のTween20を含有するPBSであった。30μl/分の流量および異なる濃度のFynSH3由来IL−17A結合ポリペプチドの注入で相互作用を測定した。相互作用の全てのキネティックデータは、BIAcoreT200評価ソフトウエアを使用して評価した。
a)発現収量
本発明のモノマーFynSH3由来IL−17A結合ポリペプチドに関する発現収量は、振とうフラスコ内の非最適条件下での細菌培養物の14〜57mg/Lの範囲であった(表1)。
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)プロファイルは、全ての構築物は主に単一モノマーピークとして溶出したことを実証した(図1)。
結合性をBIAcoreチップでのリアルタイム相互作用分析によって分析し、選択したIL−17A結合ポリペプチドに関する以下の解離定数(KD)が明らかになった。
エンドトキシン除去のため、タンパク質溶液をAcrodisc Mustang E膜(VWR)で3回濾過した。濾過後、本発明の阻害性FynSH3由来IL−17A結合ポリペプチドを含有するタンパク質溶液のエンドトキシンレベルは、Limulus amebocyte lysate(LAL)試験(PYROGENT Single Test Gel Clot LALアッセイ(Lonza))により測定して0.1EU/ml未満であった。
阻害率(%)=100−{(A450-650nm(サンプル)−A450-650nm(TNFα対照))/(A450-650nm(陽性対照)−A450-650nm(TNFα対照))×100}
正常ヒト皮膚線維芽細胞をIL−17A/TNFα、および異なる濃度の示した本発明のFynSH3由来IL−17A結合ポリペプチドとインキュベートした。本発明のFynSH3由来ポリペプチドが、グリコシル化IL−17Aを阻害したことを観察した。IC50値を表3中に示す。図2は、グリコシル化IL−17Aと非グリコシル化IL−17A両方を阻害する、本発明の示したFynSH3由来IL−17A結合ポリペプチドの用量依存的阻害曲線を示す。驚くことに、本発明中に記載するFynSH3由来IL−17A結合ポリペプチドは、非グリコシル化IL−17Aと比較して同等の効能でグリコシル化IL−17Aを完全に阻害することができることが分かった。これは、以前に発明された(WO2011/023685)FynSH3由来IL−17A結合ポリペプチドと比較して有利な特性である。図3は、高濃度でさえグリコシル化IL−17Aを完全に阻害せず、および/またはグリコシル化IL−17Aと非グリコシル化IL−17Aの間で阻害効能(IC50値)の大きな違いを示す、3例のWO2011/023685中に記載されたFynSH3由来IL−17A結合ポリペプチド(FynSH3由来IL−17結合物質2C1(WO2011/023685中に記載された配列番号107)、FynSH3由来IL−17結合物質A1_2(WO2011/023685中に記載された配列番号53)およびFynSH3由来IL−17結合物質B1_2(「B1」)(WO2011/023685中に記載された配列番号39)を示す(図3参照)。
LC11L5−B06またはLC11L9−C09を、アッセイ培地(10%FBSを補充したMaCoy´s 5A培地(GIBCO))に希釈した。それぞれ示した濃度の50μlを、それぞれ400pMと200pMの最終濃度でIL−17A(研究室内、HEKEBNA細胞で生成)およびTNFα(Thermo Fisher Scientific)を含有する50μlのアッセイ培地と混合した。対照として、阻害剤を含まない培地を調製した。さらに、一種サイトカインのみを含む培地またはサイトカインを含まない培地を調製した。1時間のインキュベーション後、約20,000のHT−29細胞(ATCC、#HTB−38)を含有する100μlの細胞懸濁液を溶液に加え、ウエル毎に分配し(96ウエルプレート、TPPまたはCorning)、37℃および5%CO2で48時間培養した。37℃で48時間のインキュベーション後、上清を除去し、製造者の説明書に従いELISAによりGro−α濃度を測定した(Gro−αELISAキット、R&D Systems)。
図5は、IL−17A、TNFα、およびこれらの組合せで刺激した後のHT−29細胞上清中の(ELISAシグナルとして示す)Gro−α濃度を示す。図5中に示すように、二重特異性構築物LC11L5−B06およびLC11L9−C09は、IL−17AとTNFαを用量依存的および同時に阻害することができた。得られた見かけのIC50値(表7)は、本発明の二重特異性化合物が、高い効能でIL−17AとTNFαを阻害することができることを実証する。
マウス(C57BL/6、Charles River)に、無エンドトキシンPBSに希釈した阻害剤LC11L5−B06(2mg/kg)、LC11L9−C09(2mg/kg)、またはTNF阻害の対照として市販の抗TNFα抗体(2mg/kg)(アダリムマブ(HUMIRA(登録商標))を静脈内注射した(群当たり5マウス)。阻害剤の静脈内注射後3.5時間で、(マウス当たり3μgのIL−17Aおよびマウス当たり0.25μgのTNFαの)皮下注射によりヒトIL−17AまたはヒトTNFαでKC発現を刺激した。2時間後、血清サンプリング用に血液を回収し、製造者の説明書に従い市販のKC ELISAキットを使用してKC濃度を測定した(QuantikineマウスKCイムノアッセイ、R&D Systems)。
マウスにヒトIL−17AまたはTNFαを皮下注射した後、動物はKCと呼ばれるケモカインを過剰発現する。マウス血清中の高いKCレベルはELISAにより測定することができる。本発明のFynSH3由来ポリペプチド融合体(LC11L5−B06およびLC11L9−C09)ならびに対照抗TNFα抗体(図6.Bおよび6.D)の事前の静脈内注射は、in vivoでKCの増加を妨げた。図6は、(「LC−B06」で表す)LC11L5−B06および(「LC−B09」で表す)LC11L9−C09の強力な阻害性を示す。
LC11L5−B06およびLC11L9−C09を5匹のマウス(C57BL/6、Charles River)に10mg/kgの用量で静脈内注射した。10分、6、24、48、96、120、144および168時間後、約20μlの血液をキャピラリーMicrovetteCB300(Sarstedt)を用いて伏在静脈から採取した。血液サンプルは9500×gで10分間遠心分離し、ELISA分析を実施するまで血清は−20℃で保存した。既知の濃度で希釈系を使用して、LC11L5−B06およびLC11L9−C09の血清中濃度を、捕捉剤としてTNFαとIL−17Aの両方を使用するELISAにより決定した:50μlのビオチン化IL−17A(120nM)(R&D Systems、製造者の説明書に従いEZ−リンクNHS−PGE4−ビオチン(Pierce)を使用してビオチン化)または50μlのビオチン化TNFα(10nM)(Thermo Scientific、製造者の説明書に従いEZ−リンクNHS−PGE4−ビオチン(Pierce)を使用してビオチン化)をストレプトアビジンコーティングウエル(Reactibind Pierce)に加え、200μlのPBS、4%ミルク(Rapilait、Migros、スイス)でブロッキングした後、50μlの希釈血清サンプル(PBS、4%ミルク中)を加えた。1時間のインキュベーションおよびPBSでの洗浄後、結合した抗体フィノマー融合タンパク質はプロテインA−HRPコンジュゲート(Sigma)で検出した。ペルオキシダーゼ活性はQuantaRed化学蛍光増大HRP基質(Pierce)の添加により検出した。蛍光強度は544nm(励起)および590nm(発光)で1〜5分後に測定した。異なる時間地点において血清で測定したLC11L5−B06およびLC11L9−C09の濃度、および(片対数スケールでプロットした)消失相の、結果として得られた勾配kから、式t1/2=ln2/−kを使用して半減期を計算した。
LC11L5−B06およびLC11L9−C09の血清中濃度を図7中に示す。消失相(β相、時間地点24時間〜168時間)から測定した半減期は、両融合タンパク質に関して4.9日〜9.6日の範囲であり(表8参照)、これはマウスに注射する標準抗体治療剤に関して報告された半減期の値と同じ範囲内にある。これらのデータは、LC11L5−B06およびLC11L9−C09が、IgG様in vivoPK特性を有することを示している。
実験条件は、本発明の他のFyn−SH3由来ポリペプチド(配列番号3〜8)に関して実施例3中に記載したのと同じである。
正常ヒト皮膚線維芽細胞をIL−17A/TNFα、および異なる濃度の本発明のFyn−SH3由来ポリペプチド11L11−A09(配列番号9)とインキュベートした。11L11−A09(配列番号9)が、66nMのIC50値でグリコシル化IL−17Aを阻害したことを観察した(表9)。図9は、同等な効能および有効性でグリコシル化IL−17Aと非グリコシル化IL−17Aの両方を阻害する、本発明のFyn−SH3由来ポリペプチド11L11−A09(配列番号9)の用量依存的阻害曲線を示す。
約3900の正常ヒト皮膚線維芽細胞(PromoCell、NHDF−c、C12300)を含有する細胞懸濁液100μlをウエル毎に分配し(96ウエルプレート、TPP)、37℃/5%CO2で24時間培養した(培地:線維芽細胞増殖培地C−23010、PromoCell)。上清を吸引し、(図10中に示す最終濃度の)異なる濃度のLC11L5−B06またはLC11L9−C09とIL−17AおよびIL−1β含有培地(最終濃度IL−17A:64pM、IL−1β:10fM)を混合した後、対応する溶液100μlを細胞に加えた(三連)。対照実験では、PBSをIL−17A/IL−1β含有培地(「IL−17A/IL−1β」、)および一種サイトカイン「IL−17A」または「IL−1β」のみを含む培地と混合した(後者は「IL−17A」および「IL−1β」対照ウエルである)。陰性対照として、PBSを培地のみと混合した(「培地」)。37℃/5%CO2で16〜24時間のインキュベーション後、製造者の説明書に従いIL−6ELISAキットを使用し(IL−6ELISAキット、R&D Systems)、上清中のIL−6濃度を測定した。IC50値の計算用に阻害率を決定し、IC50値はソフトウエアPrism5を使用して計算した。
阻害率(%)=100−{((A450-650nm(サンプル)−A450-650nm(IL−1β))/(A450-650nm(IL−17A/IL−1β)−A450-650nm(IL−1β)))×100}
図10は、NHDF細胞の上清におけるIL−6濃度の測定に関して得たELISA値(吸光度)を示す。図10中に示すように、二重特異性構築物LC11L5−B06およびLC11L9−C09は用量依存的にIL−17A媒介性IL−6生成を阻害することができ、それらがグリコシル化IL−17Aを特異的に阻害することができたことを実証した。予想通り、IL−1β誘導型IL−6放出を阻害することはできなかった。IL−17A阻害に関して得たIC50値(表10)は、本発明の二重特異性化合物が高い効能でIL−17Aを阻害することができることを示す。
二重特異性抗IL−17A/TNFα構築物、LC11L5−B06(それぞれ配列番号12と16の配列からなる重鎖と軽鎖を有する(本発明による)二重特異性構築物)、およびLC11L9−C09(それぞれ配列番号12と17の配列からなる重鎖と軽鎖を有する(本発明による)二重特異性構築物)を、実施例4中に記載したように発現させ精製した。LC11L5−B06およびLC11L9−C09を、3mg/kgの用量で3匹のオスのカニクイザルに静脈内注射した。投与終了後示した時間地点で末梢静脈から血液を採取した(サンプル当たり0.6mlの回収容積)。EDTA溶液(7.5%)を抗凝血薬として使用した。血液回収後、サンプルは1200gで10分間4℃において遠心分離し、血漿はELISAにより分析するまで−80℃で保存した。
LC11L5−B06およびLC11L9−C09の血漿中濃度は図12中に示す。両化合物は、標準モノクローナル抗体治療剤に関して典型的に報告された、血液からの低いクリアランスおよび数日間の消失半減期をカニクイザルにおいて示した。重要なことに、2つの異なるELISA法を使用して得た血漿中濃度は非常に類似しており、LC11L5−B06およびLC11L9−C09がin vivoでは少なくとも220時間安定状態であること、およびFynSH3由来ポリペプチドがカニクイザルでは抗体から切断されないことが証明される(図13)。
Claims (15)
- グリコシル化IL−17Aの活性を阻害するポリペプチドであって、
(a)GVTLFVALYDY(X1)(X2)(X3)(X4)(X5)(X6)DLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ(配列番号1)、ここで
(X 1 )がA、K、S、DまたはEであり、
(X 2 )がN、Q、A、K、SまたはRであり、
(X 3 )がH、K、R、LまたはVであり、
(X 4 )がGまたはSであり、
(X 5 )がH、Q、A、W、VまたはNであり、
(X 6 )がR、LまたはSであり、
前記ポリペプチドが配列番号3〜9のいずれか一つからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、および
(b)(a)のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列、ここで、同一性決定はアミノ酸位置(X1)〜(X6)を除外しており、配列番号1におけるアミノ酸位置31〜36中のアミノ酸配列STHEYE(配列番号2)は保存されている、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなるポリペプチド。 - 配列番号3〜9のいずれか1つからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、請求項1に記載のポリペプチド。
- さらなる化合物と融合した請求項1または2に記載のポリペプチドを含む融合構築物。
- 前記さらなる化合物が、薬学的に活性がある化合物、プロドラッグ、薬学的に許容される担体、診断的に活性がある化合物、細胞浸透促進剤、および/または血清中半減期を調節する化合物である、請求項3に記載の融合構築物。
- 前記さらなる化合物が、
(a)蛍光色素、
(b)感光剤、
(c)放射性核種、
(d)医療イメージング用造影剤、
(e)サイトカイン、
(f)毒性化合物、
(g)ケモカイン、
(h)凝血促進因子、
(i)プロドラッグ活性化用酵素、
(j)アルブミン結合物質、
(k)アルブミン、
(l)IgG結合物質、または
(m)ポリエチレングリコール
からなる群から選択される、請求項3に記載の融合構築物。 - 前記さらなる化合物が、抗体軽鎖、抗体重鎖、抗体のFCドメイン、抗体、またはそれらの組合せからなるか、またはそれらを含む、請求項3に記載の融合構築物。
- 請求項1または2に記載のポリペプチドが、前記さらなる化合物のC末端の下流に位置する、請求項6に記載の融合構築物。
- 前記さらなる化合物が、配列番号11を含むかまたはそれからなる抗体軽鎖を含むか、またはそれからなる、請求項6または7に記載の融合構築物。
- 請求項8に記載の融合構築物の少なくとも1コピー、および配列番号12の抗体重鎖の少なくとも1コピーを含むか、またはそれらからなる構築物。
- 配列番号16もしくは17を含むかまたはそれからなる融合構築物の少なくとも1コピー、および配列番号12の抗体重鎖の少なくとも1コピーを含むか、またはそれらからなる、請求項9に記載の構築物。
- 配列番号16もしくは17を含むかまたはそれからなる融合構築物の2コピー、および配列番号12の抗体重鎖の2コピーを含むかまたはそれらからなる、請求項10に記載の構築物。
- 請求項1または2に記載のポリペプチドをコードする核酸分子、または請求項6から8のいずれか一項に記載の融合構築物、または請求項9から11のいずれか一項に記載の構築物をコードする1つまたは複数の核酸分子。
- 請求項1または2に記載のポリペプチド、請求項3から8のいずれか一項に記載の融合構築物、請求項9から11のいずれか一項に記載の構築物、請求項12に記載の核酸分子、またはそれらの任意の組合せを含む、医薬または診断用組成物。
- 炎症性の、自己免疫性のおよび/または骨量減少関連の疾患の治療において使用するための、請求項13に記載の医薬組成物。
- 前記疾患が、関節炎、関節リウマチ、慢性進行性関節炎、反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、変形性関節炎、リウマチ性疾患、脊椎関節症、強直性脊椎炎、ライター症候群、過敏症(気道過敏症と皮膚過敏症の両方含む)、アレルギー、全身性エリテマトーデス、炎症性筋肉障害、多発性軟骨炎、強皮症、ヴェグナー肉芽腫、皮膚筋炎、スティーブンジョンソン症候群、慢性活性化肝炎、重症筋無力症、乾癬、特発性スプルー、自己免疫性炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性大腸症候群、内分泌性眼病、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年型糖尿病(I型糖尿病)、自己免疫性血液障害、溶血性貧血、無形成性貧血、真正赤血球性貧血、特発性血小板減少、ブドウ膜炎(前房および後房)、乾性角結膜炎、角結膜炎春季カタル、間質性肺線維症、糸球体腎炎(ネフローゼ症候群有りおよび無し)、特発性ネフローゼ症候群、微小変化型ネフロパシー、腫瘍、皮膚の炎症性疾患、角膜炎、筋炎、骨部インプラントの弛緩、代謝障害、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、脂質異常症、骨量減少、骨関節炎、骨粗しょう症、歯周疾患、閉塞性または炎症性気道疾患喘息、気管支炎、塵肺症、肺気腫、急性および超急性炎症反応、急性感染、敗血症性ショック、エンドトキシンショック、成人型呼吸窮迫症候群、髄膜炎、肺炎、重度の火傷、カヘキシー消耗性症候群、脳血管発作、ヘルペス性間質性角膜炎およびドライアイ疾患からなる群から選択される、請求項14に記載の使用のための医薬組成物。
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