KR20150065677A - 신규한 il-17a 결합 분자 및 이의 의학적 용도 - Google Patents

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Abstract

본원은 글리코실화 IL-17A의 활성을 억제하는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 (a) GVTLFVALYDY(X1)(X2)(X3)(X4)(X5)(X6)DLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARS LTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 1), 여기서 아미노산 위치 (X1) 내지 (X6)는 임의의 아미노산 서열일 수 있고; 그리고 (b) (a)의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열로서, 동일성 판단에서 아미노산 위치 (X1) 내지 (X6) 는 제외하고 그리고 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 31 내지 36의 아미노산 서열 STHEYE (SEQ ID NO: 2)은 보존된 아미노산 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 또는 이로 구성되는 폴리펩티드에 대한 것이다. 본원은 또한 상기 폴리펩티드를 포함하는 융합 구조체, 조성물 및 의학적 용도에 대한 것이다.

Description

신규한 IL-17A 결합 분자 및 이의 의학적 용도{Novel IL-17A binding molecules and medical uses thereof}
본원은 글리코실화 IL-17A의 활성을 억제하는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 (a) GVTLFVALYDY(X1)(X2)(X3)(X4)(X5)(X6)DLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARS LTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 1), 여기서 아미노산 위치 (X1) 내지 (X6)는 임의의 아미노산 서열일 수 있고; 그리고 (b) (a)의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열로서, 동일성 판단에서 아미노산 위치 (X1) 내지 (X6) 는 제외하고 그리고 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 31 내지 36의 아미노산 서열 STHEYE (SEQ ID NO: 2)은 보존된 아미노산 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 또는 이로 구성되는 폴리펩티드에 대한 것이다. 본원은 또한 상기 폴리펩티드를 포함하는 융합 구조체, 조성물 및 의학적 용도에 대한 것이다.
이 명세서에서, 특허 출원 및 제조사 매뉴얼을 포함하는 많은 문서들이 인용된다. 이러한 문서들의 개시는, 본원의 특허성과 관련된 것으로 고려되지 않는 한, 전체로서 인용되어 여기에 포함된다. 더욱 구체적으로는, 모든 인용 문서들은 각각의 문서들이 구체적이고 개별적으로 인용문헌으로 포함되어 개시된 것과 같은 정도로 인용문헌으로 포함된다.
CD4+ T 세포는 적응성 또는 내재성 면역계의 다른 세포들을 보조함으로써 면역반응을 조절하는 데 중심적인 역할을 한다. 연구 초기에는 두 종류의 CD4+ T 세포(Th1 및 Th2)가 확인되었다. 더욱 최근에는, CD4+ T 세포의 새로운 하위 집합인, Th17 계통이 확인되었다. Th17 세포는 Th1 또는 Th2 면역에 의해 잘 보호되지 않는 몇몇 곰팡이 및 세균, 및 세포외 박테리아에 대한 모체의 방어를 강화하는 데에 전문화된 적응성 면역계의 분파(branch)로서 발달된 것으로 보인다.
Th17 세포는, 현재는 여섯 멤버를 포함하는 것으로 알려진(IL-17A-F) 새로운 사이토카인 패밀리인 IL-17 패밀리의 발견과 함께 확인되었다. IL-17 (기존에는 CTLA-8로 불림)는 Th17 세포에 의해 주로 발현되며 이러한 사이토카인 패밀리의 창립 멤버임을 나타내기 위해 IL-17A라고 지정되었다. 인간 인터루킨-17A(IL-17)은 상기 언급한 바와 같이 (Miossec P. et al. (2009) N. Engl. J. Med. 361, p.888-898) CD4+ 헬퍼 17(TH17) 세포 계통을 정의하는데 중요한 역할을 하는, 다면 발현성(pleiotropic), 염증 유발 사이토카인이다. IL-17A는 동형이량체 분자이며, 23 아미노산의 신호 펩티드를 절단한 후에, 글리코실화된, 공유-결합된 동형이량체로 분비된다 (NCBI Reference Sequence: NP_002181.1; UniProtK identifier: Q16552; SEQ ID: 10). F-엔도글리코시데이즈(F-endoglycosidase)에 의한 분해는 포유류 세포에서 발현되는 인간 IL-17A의 분자량을 환원 SDS-PAGE 상에서 22 에서 15 kDa로 명백하게 변화시키며, 이는 상기 사이토카인이 글리코실화되었음을 보여주는 것이다(Fossiez F. et al. (1998) Int Rev Immunol. 16(5-6); p. 541-551).
만성 염증 기전의 핵심 매개자(central mediator) 및 몇 종류의 자가면역 질환의 주된 발병 영향인자(effector)로서의 Th17의 발견은 새로운 치료적 접근을 가능하게 하는 Th-1 매개로 생각되었다(Weaver T. et al. (2008) Annu. Rev. Immunol., 25, p. 821-852). 사실, 염증 유발 사이토카인 IL-17은 Th17 세포에서 주로 발현되고 류머티스 관절염(RA)을 앓는 환자의 관절 활액 내에서 높은 수준으로 존재하며 초기 RA 발생에 관련되는 것으로 보인다. 게다가, IL-17은 TNF-알파 및 IL-1의 잠재적인 유발자(inducer)로서, 후자는 발병한 환자들의 뼈 침식(bone erosion) 및 이에 따른 심한 고통의 주된 원인이 된다(Lubberts E. (2008) Cytokine, 41, p. 84-91). 더욱이, IL-17의 부적절한 또는 과도한 생산은 골관절염, 뼈 임플란트의 풀림, 급성 이식 거부반응(Antonysamy et al., (1999) J. Immunol, 162, p. 577-584; van Kooten et al. (1998) J. Am. Soc. Nephrol., 9, p.1526-1534), 패혈증, 패혈성 또는 내독소성 쇼크, 알러지, 천식(Molet et al. (2001) J. Allergy Clin. Immunol., 108, p. 430-438), 뼈 손실, 건선 (Teunissen et al. (1998) J. Invest. Dermatol, 111, p. 645-649), 허혈(ischemia), 전신성 경화증(Kurasawa et al. (2000) Arthritis Rheum., 43, p. 2455-2463), 뇌졸중, 및 다른 염증성 장애와 같은 다양한 다른 질병 및 장애의 발병원과 연관된다.
결과적으로, 항-IL-17 화합물들은 항-염증제, IL-17의 중화가 관절염과 같은 염증성 기전을 감소시킨다는 것을 보여주는 많은 인 비보 연구와 일치하는 치료적 접근으로서의 가능성을 가지고 있다. 예를 들어, 관절염 초기 동안의 면역 프로토콜 이후에 시작되는 IL-17 수용체-IgG1-Fc 융합 단백질에 의한 내인성 IL-17의 초기 중화는 실험적인 관절염의 발병을 억제한다(Lubberts et al. (2001) J. Immunol., 167, p. 1004-1013). 게다가, 콜라겐-유발 관절염의 발병 후에 동물 모델에서 중화 항- IL-17 항체 치료는 관절염(joint inflammation), 연골 파괴 및 뼈 침식을 감소시킨다(Lubberts et al. (2004) Arthritis and Rheumatism, 50; 650-659). 조직학적 분석은 관절염의 억제를 확인하였으며, 전신(systemic) IL-6 수준은 항-IL-17 항체를 이용한 치료 이후에 확연하게 감소되었다. 반면, 생쥐 IL-17를 발현하는 아데노바이러스 벡터를 이용한 전신 및 부분적인 IL-17 과발현은 콜라겐-유발 관절염(CIA)의 발병을 가속화하였으며 부위(site)의 활액 염증을 악화시켰다(Lubberts et al. (2001) J. Immunol.,167, p. 1004-1013 and Lubberts et al. (2002), Inflamm. Res. 51, p102-104). 더욱 최근에는 항-IL-17의 사용이 건선, 류머티스 관절염 및 비감염성 포도막염의 임상 증상을 개선시키는 것으로 입증될 수 있었다(Leonardi C. et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366, p. 1190-1199; Hueber W. et al. (2010) Sci Transl Med. 2(52):52ra72).
단특이적 약제(Monospecific agents)는 다양한 상이한 질병들의 치료에 광범위하게 쓰인다. 상업화된 생물 제제의 대부분이 단특이적이고 따라서 하나의 목표에만 반응하고 간섭할 수 있다. 그러나, 복잡한 질병들은 종종 원래 다원적(multifactorial)이며, 질병 매개자들의 과도한 또는 상승 작용과 관련된다. 따라서, 복수의, 상이한 발병 인자 및 경로들을 차단하여야 치료적 효과의 개선을 가져올 수 있다 (Konterman R.E. (2012) mAbs, 4:2, p. 182-197).
IL-17A 외에도, 염증성 질병, 자가면역 및 골-손실 관련 질병, 특히 류머티스 관절염을 포함하는 관절염의 다양한 형태의 병인(etiology)과 관련된 추가적인 핵심 분자는 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)이다. 몇몇 항-TNF 치료가 류머티스 관절염, 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염 및 크론병의 치료를 위해 승인되었으며, 다른 염증성 질환에서 임상적으로 시험되고 있다. 염증성 관절염의 치료를 위해 현재 다섯 분류의 생물 제제가 사용 가능하며, 각각은 상이한 면역-주도 염증 경로의 양상을 억제한다(reviewed in Scott D.L. (2012) Clin Pharmacol Ther., 91(1), p. 31-43): (i) TNF 억제제 (애덜리뮤맵(adalimumab), 이태널셉트(etanercept), 인플릭시맵(infliximab), 세톨리주맵(certolizumab), 골리뮤맵(golimumab)), (ii) 인터루킨 1 수용체 길항제 (아나킨라(anakinra)), (iii) B-세포 억제제 (리툭시맵(rituximab)), (iv) T-세포 공동자극 억제 (아바타셉트(abatacept)) 및 (v) 인터루킨-6 억제 (토실리주맵(tocilizumab)). 염증성 질환의 치료를 위한 다른 승인된 생물 제제들은 카나키누맵(canakinumab, 항-IL-1베타) 및 우스테키누맵(ustekinumab, 항-IL-12/23)을 포함한다 (Reichert J.M. (2012) mAbs, 4:3, p. 413-415).
Koenders 등 (2011) (Arthritis and Rheumatism, 63; 2329-2339)은 TNF와 IL-17 간의 상호작용이 관절염 동물 모델에서 비가역적인 연골 파괴를 유도하는 분자적 기전을 유발시킨다고 기술하였다. 더욱이, 가용성 인터루킨-17 수용체와 TNF 결합 단백질의 조합은 항-사이토카인 치료를 단독으로 하는 것 보다 관절염의 치료에 더욱 효과적이라는 것이 저자들에 의해 밝혀졌다. Koenders 등 (2011)의 논문에 기술되어 있는 TNF 결합 분자는 이량체적으로(dimerically) 연결된 페길화된(PEGylated) 가용성 p55 TNF 수용체 I이다. WO 2010/102251는 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬을 포함하고 인간 IL-17 및 TNF에 결합할 수 있는 결합 단백질에 대해 기술하고 있다. 두 폴리펩티드 사슬 모두는 항체의 가변 및 불변 도메인에 의해 형성된 분자 구조를 가진다. 다른 이특이적(bispecific) 및/또는 다특이적(multispecific) 융합 단백질들이 문헌에 개시되어 있다(review Konterman R.E. (2012) mAbs, 4:2, p. 182-197 참조).
Fyn SH3-유래 폴리펩티드들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Grabulovski 등 (2007) JBC, 282, p. 3196-3204; WO　2008/022759; Bertschinger 등 (2007) Protein Eng Des Sel 20(2):57-68; 및 Gebauer 및 Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255에 기술되어 있다. 용어 "Fyn SH-3 유래 폴리펩티드"는 여기에서 인간 Fyn SH3 도메인으로부터 유래된 비-면역글로불린-유래 결합 (폴리)펩티드를 의미하는 (예를 들어, Gebauer 및 Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255에서 기술된 소위 스캐폴드(scaffold)) 용어 "Fynomer"로 교체하여 사용된다. 인간 Fyn 인산화효소(kinase)의 SH-3 도메인은 상이한 목적 단백질에 높은 친화성으로 결합하고 특이성을 가지는 엔지니어 단백질(engineer protein)에 스캐폴드로서 성공적으로 사용된다(WO 2008/022759, WO 2011/023685, Grabulovski D. 등., (2007) J Biol Chem 282, p. 3196-3204, Bertschinger J. 등 (2007) Protein Eng Des Sel, 20, p.57-68, 및 Schlatter 등 (2012) mAbs, 4(4) p. 497-50).
WO 2011/023685는 융합 단백질에 해당하는 IL-17 억제 폴리펩티드("Fynomers"), 조성물 및 그의 의학적 용도에 대해 기술하고 있다. 이러한 IL-17 억제 폴리펩티드들은 IL-17A에 높은 특이성과 높은 친화성을 가진다. 본원의 기저가 된 기술적 문제는 추가적인 IL-17A 억제 폴리펩티드, 구체적으로는 기술적으로 향상된 IL-17A 억제 폴리펩티드의 제공이다. 이러한 기술적 문제는 청구항에 특정된 구현예에 의해서 해결된다.
따라서, 본원의 제 1 구현예는 글리코실화 IL-17A의 활성을 억제하는 폴리펩티드에 관한 것으로서, 상기 폴리펩티드는 (a) GVTLFVALYDY(X1)(X2)(X3)(X4)(X5)(X6)DLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 1), 여기서 아미노산 위치 (X1) 내지 (X6)는 임의의 아미노산 서열일 수 있고; 그리고 (b) (a)의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열로서, 동일성 판단에서 아미노산 위치 (X1) 내지 (X6)는 제외하고 그리고 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 31 내지 36의 아미노산 서열 STHEYE (SEQ ID NO: 2)은 보존된 아미노산 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 또는 이로 구성되는 것이다. 본원은 또한 상기 폴리펩티드를 포함하는 융합 구조체, 조성물, 및 의학적 용도에 관한 것이다.
본원의 제 2 구현예는 글리코실화 IL-17A에 결합하는 및 바람직하게는 이의 활성을 억제하는 폴리펩티드에 관한 것으로서, 상기 폴리펩티드는 (a) GVTLFVALYDY(X1)(X2)(X3)(X4)(X5)(X6)DLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 1), 여기서 아미노산 위치 (X1) 내지 (X6)는 임의의 아미노산 서열일 수 있고; 그리고 (b) (a)의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열로서, 동일성 판단에서 아미노산 위치 (X1) 내지 (X6)는 제외하고 그리고 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 31 내지 36의 아미노산 서열 STHEYE (SEQ ID NO: 2)은 보존된 아미노산 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 또는 이로 구성되는 것이다. 본원은 또한 상기 폴리펩티드를 포함하는 융합 구조체, 조성물, 및 의학적 용도에 관한 것이다.
아래의 정의, 예시, 바람직한 또는 독립된 구현예들은 본원의 제 1 및 제 2 구현예를 참조한다.
여기서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 단일 사슬 단백질 또는 이들의 절편을 포함하는 선형의 아미노산 분자 사슬로서, 50 개 이상의 아미노산을 포함한다. 폴리펩티드는 추가적으로, 예를 들어 올리고머와 같이 적어도 두 개의 동일한 또는 상이한 분자로 구성된 다량체(multimer)를 형성할 수 있다. 그러한 다량체에 해당하는 고차(higher order) 구조는, 이에 상응하도록, 동형- 또는 이형이량체, 동형- 또는 이형삼량체 등으로 정의된다. 추가적으로, 아미노산 및/또는 펩티드 결합이 기능적 유사체(analog)에 의해 대체된 그러한 폴리펩티드인 펩티도미메틱(peptidomimetics)이 또한 본원에 포함된다. 그러한 기능적 유사체는 유전자-인코딩되는 20 아미노산 외의 셀레노시스테인과 같은, 모든 공지된 아미노산들을 포함한다. 용어 "폴리펩티드"는 또한, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화 그리고 유사한 변형과 같이 당업계에 공지된 변형에 의해 자연적으로 변형된 폴리펩티드를 의미한다.
본원에는 또한 글리코실화 IL-17A에 대한 결합을 실질적으로 유지하는 본원의 폴리펩티드들의 절편(fragment)이 포함된다. 이와 관련하여 상기 절편은 약 55 미만의 아미노산을 포함하는 한 적어도 30 아미노산, 적어도 35 아미노산, 적어도 40 아미노산, 또는 적어도 45 아미노산을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 아래에서 정의되는 RT- 및 src-루프에 해당하는 아미노산 위치가 절편 내에 보유되는 것이 더더욱 바람직하다.
여기서 사용되는 용어 "글리코실화 IL-17A의 활성을 억제하는 폴리펩티드"는, 글리코실화 IL-17A의 활성을 감소시키거나 완전히 무효화할 수 있는 능력을 가지는 폴리펩티드로 정의되며, 상기 활성은 상기에 구체적으로 기술되어 있다. 이와 관련하여, 글리코실화 IL-17A 활성 억제는 글리코실화 IL-17A가 IL-17R(인터루킨 17 수용체)로 명명된 유형 I 세포 표면 수용체에 결합하는 것을 억제하는 것을 의미하는 것이 바람직하다. IL17RA, IL17RB, 및 IL17RC의 적어도 세 가지 IL-17R의 변이들이 당업계에 공지되어 있다. 이와 관련하여, 상기 폴리펩티드는 글리코실화 IL-17A의 활성을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 억제하는 것이 추가적으로 더욱 바람직하다. 본원의 폴리펩티드가 글리코실화 IL-17A를 억제하는 IC50 값은 1000 nM 이하, 500 nM 이하, 400 nM 이하, 300 nM 이하, 200 nM 이하, 100 nM 이하, 또는 75 nM 이하인 것이 또한 더욱 바람직하다. 이와 관련하여 본원의 폴리펩티드는 글리코실화 IL-17A를 특이적으로 억제함으로써 글리코실화 IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E 또는 IL-17F와 같은 다른 관련 단백질들은 억제하지 않는 것이 바람직하다. 본원의 폴리펩티드는 글리코실화 IL-17A의 활성을 억제한다. 상기 폴리펩티드는 글리코실화 및 비 글리코실화 IL-17A의 활성을 억제하는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 정의들은 비 글리코실화 IL-17A의 억제에도 준용하여(mutatis mutandis) 적용된다.
글리코실화 IL-17A의 활성을 억제하는 것은 또한 글리코실화 IL-17A에의 결합과 관련된 것으로 이해되어야 한다. 이와 관련하여 글리코실화 IL-17A에의 결합은 또한 글리코실화 IL-17A의 활성의 억제에 이르게 하는 것이 바람직하다. 용어 "글리코실화 IL-17A에의 결합"은 본원의 폴리펩티드 또는 절편이 글리코실화 IL-17A와 결합 작용을 형성(인 비보 및/또는 인 비트로에서)하는 것을 요구한다. 바람직하게는, 본원의 폴리펩티드는 10-7 to 10-12 M, 더욱 바람직하게는 10-8 to 10-12 M, 가장 바람직하게는 10-9 to 10-12 M의 KD 로 글리코실화 IL-17A에 결합한다. 이와 관련하여 본원의 폴리펩티드는 IL-17A에 특이적으로 결합하여 IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E 또는 IL-17F와 같은 다른 관련 단백질에는 결합하지 않는 것이 바람직하다. 본원의 폴리펩티드는 글리코실화 IL-17A에 결합한다. 상기 폴리펩티드는 글리코실화 또는 비 글리코실화 IL-17A에 결합하는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 정의들은 비 글리코실화 IL-17A에의 결합에도 준용하여(mutatis mutandis) 적용된다.
여기서 상기 인용된 SEQ ID NO: 1은 인간 Fyn 인산화효소(SEQ ID NO: 20; Kawakami 등 및 Semba 등, 1986 에서 보고된 Fyn 인산화효소의 아미노산 83-145)의 SH3 도메인의 아미노산 서열로부터 유래되었다. SEQ ID NO: 20은: GVTLFVALYDYEARTEDDLSFHKGEKFQILNSSEGDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 20) 이다. 상기 표시된 SEQ ID NO: 20에서 RT 및 src 루프 서열은 각각 밑줄 및 이중 밑줄되어 있다. Grabulovski 등 (2007, JBC, 282, p. 3196-3204)은 Fyn SH3 도메인의 RT 및 src 루프의 돌연변이의 영향에 대해 연구하였으며 소수성 표면에 근접한 두 루프들의 돌연변이는 분자간 결합(intermolecular associations)에 참여하는 이 도메인의 능력을 결정할 수 있다고 기술하였다. 더욱이, EP 2054432는 RT 및/또는 src 루프 내의 또는 인접한 돌연변이는 SH3 도메인의 결합 특이성을 결정한다는 것을 개시한다. Fyn SH3의 아미노산 서열은 인간, 생쥐, 들쥐 및 원숭이(긴팔원숭이)에서 완전히 보존된다. 상응하는 인간 도메인과 비교하여, 닭 Fyn SH3은 하나, Xenopus laevis의 일종은 두 개의 아미노산 위치가 상이하다. 다른 SH3 도메인과 같이, Fyn SH3은 두 개의 역평행 b-시트로 구성되어 있으며 다른 단백질과의 상호작용을 위한 두 개의 유연성 루프(RT 및 src 루프로 불림)를 포함한다.
더욱 구체적으로, SEQ ID NO: 1은 SEQ ID NO: 3 내지 9를 정렬(alignment)하여 도출된 서열이다 (도 8 참조). 도 8에서 증명되는 바와 같이, SEQ ID NO: 1의 (X1) 내지 (X6) 위치는 SEQ ID NO: 20의 Fyn 인산화효소 SH3 도메인의 RT-루프에 해당한다. 이와 관련하여, 본원의 폴리펩티드의 아미노산 위치 (X1) 내지 (X6)는 EARTED (SEQ ID NO: 19) 서열을 가지지 않는 것이 바람직하다. 도 8로부터 추가적으로 증명되는 바와 같이, SEQ ID NO: 20의 Fyn 인산화효소 SH3의 src-루프에 해당하는 위치, 즉 "STHEYE" (위에 보여지는 SEQ ID NO: 1의 밑줄 부분) 서열은 SEQ ID NO: 3 내지 9에서 보존되어 있다. RT 및 src-루프 내의 아미노산 위치는 글리코실화 IL-17A의 결합 특이성을 결정한다.
본원에 따르면, 용어 "백분율(%) 서열 동일성"은 둘 또는 그 이상의 정렬되는(aligned) 핵산 또는 아미노산 서열에서 주형 핵산 또는 아미노산 서열 전체 길이를 구성하는 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 갯수 대비 둘 또는 그 이상의 정렬되는 핵산 또는 아미노산 서열에서 동일한 뉴클레오티드/아미노산의 매치("hit") 개수를 말하는 것이다. 다시 말해서, 둘 이상의 서열 또는 부분열의 정렬을 이용하여, 서열(부분열)이 비교창(window of comparison) 상에서 또는 당업계에 알려진 서열 비교 알고리즘을 이용하여 측정된 지정된 구역 상에서 최대 관련성으로 비교 및 정렬되거나 또는 수동으로 정렬되고 육안으로 점검됨으로써, 동일한 아미노산 잔기들 또는 뉴클레오티드의 백분율(예를 들어, 85%, 90% 또는 95% 동일)이 결정될 수 있다. 서열 동일성을 결정하기 위해 비교되는 서열들은 뉴클레오티드 또는 아미노산의 치환(들), 부가(들) 또는 결실(들)에 의해 달라질 수 있다. 상기 정의는 테스트 서열들의 보완(complement)에 또한 적용될 수 있다.
당업자는 또한 핵산 서열들을 정렬하기 위한 적절한 프로그램들을 알고 있다. 폴리펩티드 서열의 백분율 서열 동일성은, 예를 들어, 상기 설명한 프로그램인 CLUSTLAW, FASTA 및 BLAST를 이용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는 NCBI BLAST 알고리즘인 BLAST 프로그램이 사용된다(Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, 및 David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402).
상기 인용된 항목 (b)의 서열 동일성과 관련하여, 서열 동일성은 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98%인 것이 더욱 바람직하다.
여기서 사용되는 "동일성 판단에서 아미노산 위치 (X1) 내지 (X6)는 제외하고"의 문구는 SEQ ID NO: 1과 관련된 서열 동일성의 계산에서 아미노산 위치 (X1) 내지 (X6)는 고려하지 않고 SEQ ID NO: 1의 나머지 58 아미노산 위치로 제한한다는 것을 명시한다. 여기서 사용되는 "SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 31 내지 36의 아미노산 서열 STHEYE (SEQ ID NO: 2)은 보존된 아미노산 서열"의 조건은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 31 내지 36에는 아미노산의 변화가 일어나지 않음을 명시한다. 다시 말해서, 본원의 제 1 구현예 및 이의 바람직한 실시예의 영역에 해당하는 모든 폴리펩티드들에서 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 31 내지 36에 해당하는 아미노산 위치는 STHEYE (SEQ ID NO: 2)의 서열을 가진다.
이와 관련하여 본원의 제 1 구현예 및 이의 바람직한 실시예의 영역에 해당하는 모든 폴리펩티드에서 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 31 내지 37에 해당하는 아미노산 위치는 STHEYED (SEQ ID NO: 18)의 서열을 가지는 것이 바람직하다. 다시 말해서, 본원의 제 1 구현예 및 이의 바람직한 실시예와 관련하여 본원의 제 1 구현예 및 이의 바람직한 실시예의 영역에 해당하는 모든 폴리펩티드에서SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 31 내지 37의 아미노산 서열 STHEYED (SEQ ID NO: 18)는 보존되어야 하는 것이 바람직하다.
SEQ ID NO: 1 내의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)이다. 보존적 치환은 아미노산이 유사한 화학적 특성을 가지는 다른 아미노산으로 대체되는 것이다. 바람직하게는, 여기서 언급되는 보존적 치환은 (i) 염기성 아미노산을 다른 염기성 아미노산으로 치환; (ii) 산성 아미노산을 다른 산성 아미노산으로 치환; (iii) 방향족 아미노산을 다른 방향족 아미노산으로 치환; (iv) 비극성, 지방족 아미노산을 다른 비극성, 지방족 아미노산으로 치환; 그리고 (v) 극성의, 전하를 띠지 않는 아미노산을 다른 극성의, 전하를 띠지 않는 아미노산으로 치환하는 것으로 구성되는 군으로부터 선택되는 치환이다. 염기성 아미노산은 아르기닌, 히스티딘, 및 리신이다. 산성 아미노산은 아스파라긴산 또는 글루탐산이다. 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이다. 비극성, 지방족 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 메티오닌, 이소류신 및 프롤린이다. 극성의, 전하를 띠지 않는 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴 및 글루타민이다. 보존적 아미노산 치환과 대조적으로, 비보존적 아미노산 치환은 상기 보존적 치환 (i) 내지 (v)에 서술된 것이 아닌, 아미노산의 다른 아미노산으로의 교환이다.
용어 "IL-17A" 또는 "인터루킨 17A"(종래에는 CTLA-8로 불렸으며, 여기에서 그리고 당업계에서는 간단하게 "IL-17" 또는 "인터루킨 17"로 언급된다. 이는 IL 17 패밀리의 창립 멤버(founding member)이기 때문이다)는 활성화된 기억 T 세포에 의해 생산되는 잠재적인 염증 유발 사이토카인을 지칭한다(Gurney 및 Aggarwal (2002), "IL-17: prototype member of an emerging cytokine family", J. Leukoc. Biol. 71(1):1-8). 더욱 구체적으로, IL-17A는 인터페론 감마와 같이 다양한 조직에서 염증 부위로 단핵구와 호중구를 모으기 위해 케모카인 생성을 증가시킴으로써 지연형 반응(delayed-type reactions)에서 잠재적 매개자로 작용하는 사이토카인이다. IL-17A는 T-헬퍼 세포에서 생성되며, 지연형 반응에서 파괴적 조직 손상을 유발하는 IL-23에 의해 유도된다. 인터루킨 17A 세포는 세포외 병원체 의해 면역계의 침입에 반응하고 병원체의 세포 기질의 파괴를 유발하는 염증 유발 사이토카인으로서의 패밀리 기능을 가진다. 인터루킨 17A는 종양 괴사 인자 및 인터루킨-1과 상승작용을 일으킨다. 인간 IL-17A는 155-아미노산 단백질이고 바람직하게는 SEQ ID NO 10을 포함하거나 이로 구성되며, 이황화-결합된, 동형이량체의, 35 kDa의 분자량을 가지는 분비된 당단백질이다. 동형이량체의 각각의 서브유닛은 대략 15-20 kDa이다. IL-17A의 구조는 IL-17 패밀리의 특징인 132-아미노산 사슬 부위가 따르는 23 아미노산의 신호 펩티드로 구성된다. 상기 단백질의 N-결합된 글리코실화 부위는, 정제된 단백질이 하나는 15 kDa에, 다른 하나는 20 kDa에 두 개의 밴드를 가지는 것으로 밝혀짐으로써 맨 처음 확인되었다. 언급한 바와 같이, 처음 확인된 IL17은 이와 같은 사이토카인 패밀리의 창립 멤버임을 뜻하는 IL-17A로 지정되었다. IL-17A에 더하여, IL-17 패밀리의 멤버는 IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (IL-25로도 불림), 및 IL-17F를 포함한다. IL-17 패밀리는 척추동물의 진화에 걸쳐 매우 보존되어온 것으로 나타난 독특한(distinct) 신호 시스템(signaling system)을 대표하는 것으로 생각된다. 모든 IL-17 패밀리 멤버들은 그들의 3-차원 구조에 중요한 고보존된 시스테인 잔기를 포함하는 유사한 단백질 구조를 가지나, 다른 알려진 사이토카인들과는 서열 유사성을 가지지 않는다.
여기에 개시된 IL-17A 억제 폴리펩티드는 놀랍게도 글리코실화 IL-17A는 물론이고 비글리코실화 IL-17A에도 높은 특이성과 높은 친화성을 가진다. 특히, 본원의 SEQ ID NO 3 내지 9는 비-글리코실화 IL-17A와 유사하게 글리코실화 IL-17A를 완전하게 억제할 수 있다 (실시예 3 참조). 이는 WO 2011/023685에서 알려진 Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드와 비교하여 우수한 특성이다. 2011/023685에 기술된 Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드는 높은 농도에서조차 글리코실화된 IL-17A를 완전히 억제하지 않았고 및/또는 글리코실화된 그리고 비글리코실화된 IL-17A 간에 큰 억제력의 차이(IC50 값)를 보였다 (실시예 3 및 도 3 참조). 상기 기술된 바와 같이, 인 비보에서 IL-17A는 글리코실화된, 공유결합된 동형이량체로서 분비된다. 여기에 개시된 신규 IL-17A 결합 분자 - 글리코실화 IL-17A에 결합하고 억제하는 데에 우수한 - 들은 따라서 글리코실화된 단백질로서 대부분 존재하는 인 비보에서 IL-17A를 탐지하거나 결합하는 것이 요구되는 응용에 특히 적합하다. 그러한 응용들은, 예를 들어, 진단 및 의학적 치료, 바람직하게는 IL-17A-매개 질병의 치료 및/또는 예방용 약제의 조제이다.
아래의 예시들은 글리코실화 IL-17A에, 특히 SEQ ID NO: 10의 글리코실화 IL-17A에 결합 특이성을 부여하기 위한 아미노산 위치 (X1) 내지 (X6)를 위한 아미노산 목록을 나타낸다. 더욱 구체적으로는, 도 9의 본원의 SEQ ID NO 3 내지 9의 서열 정렬은 아미노산 위치 (X1) 내지 (X6)가 SEQ ID NO 3 내지 9에서 (X1) 는 A, K, S, D 또는 E; (X2) 는 N, Q, A, K, S 또는 R; (X3) 는 H, K, R, L 또는 V; (X4) 는 G 또는 S; (X5) 는 H, Q, A, W, V 또는 N; 그리고 (X6) 는 R, L 또는 S임을 보여준다. 따라서, 상기 정의된 (X1) 내지 (X6)에서 선택되는 다른 아미노산 서열 또한SEQ ID NO 3 내지 9에 존재하는 (X1) 내지 (X6)의 특정 아미노산 조합보다 글리코실화 IL-17A에 대한 결합 특이성을 부여할 것으로 예측된다.
본원의 바람직한 구현예에서 본원의 폴리펩티드의 아미노산 위치 (X1) 내지 (X6)는 따라서 A, K, S, D 또는 E인 (X1); N, Q, A, K, S 또는 R인 (X2); H, K, R, L 또는 V인 (X3); G 또는 S인 (X4); H, Q, A, W, V 또는 N인 (X5); 그리고 R, L 또는 S인 (X6)(SEQ ID NO: 21 참조)로부터 선택된다.
본원에서 포함되는 것은 또한 A, K, S, D 또는 E인 (X1); N, Q, A, K, S 또는 R인 (X2); H, K, R, L 또는 V인 (X3); G 또는 S인 (X4); H, Q, A, W, V 또는 N인 (X5); 그리고 R, L 또는 S인 (X6)의 보존적 아미노산 치환이다.
본원의 폴리펩티드의 아미노산 위치 (X1) 내지 (X6)는 S 또는 E인 (X1); A 또는 S인 (X2); R 또는 V인 (X3); G 또는 S인 (X4); Q 또는 V인 (X5); 그리고 L 또는 S인 (X6)으로부터 선택되는 것이 특히 바람직하다. 이러한 아미노산들은 각각 SEQ ID NO 5 내지 7의 아미노산 위치 (X1) 내지 (X6)에 상응한다. 본원의 폴리펩티드의 아미노산 위치 (X1) 내지 (X6)는 S인 (X1); A인 (X2); R인 (X3); G인 (X4); Q인 (X5); 그리고 L인 (X6)인 것이 특히 바람직하다. 이러한 아미노산들은 SEQ ID NO: 5의 위치 (X1) 내지 (X6)에 상응한다.
제 1 폴리펩티드의 항목 (b)에 따른 폴리펩티드에 따르면, SEQ ID NO: 1(또는 SEQ ID NO 3 내지 9)의 아미노산 서열 사이의 아미노산 위치 (X1) 내지 (X6)만이 아니라, Fyn 인산화효소(SEQ ID NO: 20)의 SH3 도메인의 RT 및/또는 src-루프(본원에 따르면 STHEYE (SEQ ID NO: 2)의 서열을 가짐) 내에 있지 않은 추가적인 아미노산도 달라질 수 있다. 이러한 위치들 내의 아미노산들의 차이는 SEQ ID NO. 3 내지 9의 결합 특이성에 필수적이지 않은 것으로 보인다. 따라서, 이러한 아미노산 위치들은 글리코실화 IL-17A에 대한 결합 특이성을 실질적으로 방해하지 않으면서 교환되거나 또는 삭제되거나, 또는 추가적인 아미노산들이 부가될 수 있다. 만약 아미노산들이 교환된다면, 보존적 교환이 바람직하다.
본원의 폴리펩티드의 더욱 바람직한 구현예는 SEQ ID NO: 3 내지 9 중 어느 하나로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
아래의 예시에 나타나는 것과 같이, SEQ ID NO 3 내지 9는 SEQ ID NO: 10을 가지는 글리코실화 IL-17A 뿐만 아니라 비글리코실화 IL-17A에도 결합하여 억제하는 것으로 밝혀졌다. 더욱 구체적으로는, SEQ ID NO: 3 내지 9의 Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드는 비-글리코실화 IL-17A와 유사한 능력으로 글리코실화 IL-17A를 완전하게 억제할 수 있는 것으로 놀랍게도 밝혀졌다. 이는 WO 2011/023685에서 기술된 Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드와 비교하여 유리한 특성이다 (실시예 3의 비교 데이터 참조).
SEQ ID NO: 3 내지 9 중에서, SEQ ID NO: 5 내지 7이 바람직하다. SEQ ID NO: 5 및 7은 여기에 기술된 실시예 4에서 융합 구조체 및 구조체를 생성하는 데에 사용되었다. 수득된 융합 구조체 및 구조체는 안정하고, 단량체이고, 가용성이고 그리고 우수한 생물물리학적 그리고 약제-유사 특성을 보여주었기 때문에 특히 유용하다. 더욱이, SEQ ID NO: 5 및 7과 추가적인 화합물과의 융합은 글리코실화 IL-17A에 대한 우수한 결합 특성에 영향을 미치지 않았다.
널리 알려진 바와 같이, 하나, 약간의 또는 몇 개의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환과 같은 아미노산 서열의 사소한 변화가 실질적으로 동일한 특성을 가지는 원래 단백질의 돌연변이 형태를 유도할 수 있다. 따라서, 본원에 또한 포함되는 SEQ ID NO: 3 내지 9는SEQ ID NO: 3 내지 9 중 어느 하나와 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 98% 동일한 아미노산을 포함하는 폴리펩티드이며, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 31 내지 36의 아미노산 서열 STHEYE (SEQ ID NO: 2)은 보존된다. 아미노산이 교환된다면, 보존적 교환이 바람직하다.
본원에 따르면 IL-17A는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 것이 더욱 바람직하다.
아래의 예시에 의해 증명되는 것과 같이, SEQ ID NO: 10을 가지는 인간 IL-17A는 SEQ ID NO: 3 내지 9를 가지는 폴리펩티드를 식별하기 위한 목적 단백질로서 사용되어 왔다. SEQ ID NO: 10의 첫 23 아미노산은 신호 펩티드다. 따라서 본원의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 위치 24 내지 155 내의 글리코실화 IL-17A에 결합하는 것이 특히 바람직하다.
본원의 또다른 구현예는 추가적인 화합물이 융합된 본원의 폴리펩티드를 포함하는 융합 구조체에 대한 것이다.
여기서 사용되는 "융합 구조체"는 추가적인 화합물과 본원의 폴리펩티드의 융합을 정의한다. 상기 화합물은 단백질 화합물 또는 비-단백질 화합물 중 어느 하나일 수 있다. 화합물이 단백질 화합물(예를 들어, 아래에 기술된 사이토카인 또는 케모카인)인 경우, 융합 구조체는 융합 단백질로 명명될 수 있다. 여기서 사용되는 용어 "융합 단백질"은 상이한 폴리펩티드를 암호화하는 두 개 이상의 유전자의 연결 및 발현에 의하여 생성되는 폴리펩티드 구조체를 지칭하는 일반적인 용어이다. 다시 말하면, 상기 융합 유전자의 번역은 고유의 폴리펩티드 각각으로부터 유래되는 기능적 특성들을 가지는 단일 폴리펩티드를 만든다. 상기 폴리펩티드는 직접적으로 또는 링커, 즉 짧은 펩티드 서열에 의해 연결되어 있을 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질은 당업자에게 잘 알려진 재조합 DNA 기술에 의하여 인위적으로 생성된다 (예를 들어, Alberts 등, Molecular Biology of the Cell, 4th ed. Garland Science, p. 518-519). 그러나, 본원의 폴리펩티드 및 융합 단백질은 평범한 유기 합성 전략, 고상-보조 합성(solid phase-assisted synthesis) 기술 또는 상업적으로 이용가능한 자동화된 합성기와 같은 종래의 및 잘 알려진 기술들 중 어느 것에 의해서도 제조될 수 있다. 융합 단백질은 생물학 연구 또는 치료에 사용될 수 있다. 추가적인 화합물로서의 비-단백질 화합물의 예시는, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 Alexa Fluor와 같은 작은 유기 분자, 또는 방사성 핵종이다. 비-단백질 추가 화합물의 더욱 구체적인 예시는 아래에 기술되어 있다.
상기 추가적인 화합물의 바람직한 구현예는 약제학적 활성 화합물, 프로드러그, 약제학적으로-허용가능한 담체, 진단학적 활성 화합물(diagnostically active compound), 세포 통과 촉진제, 및/또는 혈장 반감기 조절 화합물이다.
약제학적 활성 화합물은 대상 내에 투여되었을 때 생물학적 활성을 가져 대상에게 이로운 효과를 가져오는 화합물이다. 프로드러그는 비활성(또는 완전한 활성을 가지지 않고) 형태로 대상에 투여되고 이어서 대상 내에서 대사 과정을 통하여 약제학적으로 활성 또는 약제학적으로 완전한 활성을 가진 화합물로 전환되는 것이다. 약제학적 (완전한) 활성 화합물은 바람직하게는 아래에 정의된 특정 질병 중 어느 하나의 치료 또는 예방에 적합한 화합물이다.
진단학적 활성 화합물은, 대상에 투여되어 활성을 가짐으로써 가능성 있는 질병 또는 장애를 판단 또는 식별하게 하는 화합물이다. 진단학적 활성 화합물의 예시는 형광 염료, 방사성 핵종 또는 의학 영상을 위한 조영제와 같은 탐지 마커를 포함한다. 형광 염료, 방사성 핵종 및 의학 영상을 위한 조영제의 구체적인 예시는 아래에 기술되어 있다. 본원의 폴리펩티드에 융합된 진단학적 활성 화합물은 특히, 그 유래 및/또는 증상이 IL-17A- 및/또는 Th-17-관련과 공통된 아래의 특정 질병 중 하나를 판단 또는 식별하는 데에 사용될 수 있다. 그러한 질병들의 측면(side)들은 본원의 진단학적 활성 화합물에 융합된 본원의 폴리펩티드에 의해 탐지 또는 식별될 수 있다.
세포 통과 촉진제(cell penetrating enhancer)는 (인 비트로, 익스 비보 또는 인 비보에서) 본원의 폴리펩티드의 세포 내로의 전달을 것을 용이하게 하는 화합물이다.
혈장 반감기 조절 화합물은, 특히 혈액 순환계에서의 본원의 폴리펩티드의 인 비보 반감기를 연장시켜 주는 화합물이다. 혈장 반감기 조절 화합물은 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다.
약제학적으로-허용가능한 담체는 대상에 투여되었을 때 본원의 화합물의 전달 및/또는 효과를 향상시켜 주는 화합물이다. 적합한 약제학적으로-허용가능한 담체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 안정제, 항산화제, pH-조절 물질 등을 포함한다.
본원의 추가적인 화합물의 또다른 바람직한 구현예는, (a) 형광 염료, (b) 광감응제, (c) 방사성 핵종, (d) 의료 영상용 조영제, (e) 사이토카인, (f) 독성 화합물, (g) 케모카인, (h) 응혈성 인자, (i) 프로-드러그 활성 효소, (k) 알부민 결합제, (l) 알부민, (m) IgG 결합제, 또는 (n) 폴리에틸렌 글리콜로 구성되는 군으로부터 선택된다.
형광 염료는 바람직하게는 Alexa Fluor 또는 Cy 염료로부터 선택된다.
광감응제는 바람직하게는 광독성(phototoxic) 적색 형광 단백질 KillerRed 또는 헤마토포르피린(haematoporphyrin)이다.
방사성 핵종은 바람직하게는 감마-방출 동위원소의 군으로부터 선택되고 더욱 바람직하게는 99mTc, 123I, 111In이고 및/또는 양전자 방출핵(positron emitter)의 군으로부터 선택되고 더욱 바람직하게는 18F, 64Cu, 68Ga, 86Y, 124I 이고, 및/또는 베타-방출핵(beta-emitter)으로부터 선택되고 더욱 바람직하게는 131I, 90Y, 177Lu, 67Cu이거나, 또는 알파-방출핵의 군으로부터 선택되고 더욱 바람직하게는 213Bi, 211At 중 어느 하나이다.
여기서 사용되는 조영제는 의학 영상에서 신체 내의 구조 또는 액체의 대비를 증대시키는 데에 사용되는 물질이다. 일반적인 조영제는 X-선 감쇠(attenuation) 및 자기 공명 신호 증대에 기반하여 작용한다.
사이토카인은 바람직하게는 IL-2, IL-12, TNF-알파, IFN 알파, IFN 베타, IFN 감마, IL-10, IL-15, IL-24, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, LIF, CD80, B70, TNF 베타, LT-베타, CD-40 리간드, Fas-리간드, TGF-베타, IL-1알파 및 IL-1베타로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 당업계에 널리 알려진 바와 같이, 사이토카인은 면역계에서 염증유발 또는 항-염증 반응에 도움을 줄 수 있다. 따라서, 치료되는 질병에 따라서 염증-유발 또는 항-염증 사이토카인을 가지는 융합 구조체 중 하나가 도움이 될 수 있다. 예를 들어,일반적인 염증성 질병의 치료에 있어서 항-염증성 사이토카인을 포함하는 융합 구조체가 바람직하며, 반면에 일반적인 암의 치료에 있어서는 염증-유발 사이토카인을 포함하는 융합 구조체가 바람직하다.
독성 화합물은 바람직하게는 저분자 유기 화합물(small organic compound) 또는 폴리펩티드이고, 더욱 바람직하게는 독성 화합물은 칼리케아미신(calicheamicin), 메이탄시노이드(maytansinoid), 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin), 에스퍼라미신(esperamicin), 다이네미신(dynemicin), 케다르시딘(kedarcidin), 마두로펩틴(maduropeptin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 아우리스타틴(auristatin), 리신-A 사슬(Ricin-A chain), 모데신(modeccin), 절단된 슈도모나스 외독소 A(truncated Pseudomonas exotoxin A), 디프테리아 독소(diphtheria toxin) 및 재조합 젤로닌(recombinant gelonin)으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
케모카인은 바람직하게는 IL-8, GRO 알파, GRO 베타, GRO 감마, ENA-78, LDGF-PBP, GCP-2, PF4, Mig, IP-10, SDF-1 알파/베타, BUNZO/STRC33, I-TAC, BLC/BCA-1, MIP-1 알파, MIP-1 베타, MDC, TECK, TARC, RANTES, HCC-1, HCC-4, DC-CK1, MIP-3 알파, MIP-3 베타, MCP-1-5, 에오탁신(eotaxin), 에오탁신-2(Eotaxin-2), I-309, MPIF-1, 6Ckine, CTACK, MEC, 림포택틴(lymphotactin) 및 프랙탈카인(fractalkine)으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
응혈성 인자(pro-coagulant factor)는 바람직하게는 조직 인자(tissue factor, TF) 또는 암 응혈인자(cancer procoagulant, CP)이다.
프로-드러그 활성 효소는 바람직하게는 카복시-펩티데이즈(carboxy-peptidases), 글루쿠로니데이즈(glucuronidases) 및 글루코시데이즈(glucosidases)로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
알부민 결합제(albumin binder) 및 IgG 결합제(binder)의 예시는 Gebauer 및 Skerra (2009, 13:245-255)에 기술되어 있다. 따라서, 알부민 결합제 및 IgG 결합제의 바람직한 예시는 인간 단일 Ig 도메인(이중 알부민 Dab, dubbled Albumin Dab), 나노바디, 연쇄상구균 단백질 G에서 유래한 자연적으로 발생한 알부민 결합 도메인(ABD), 및 IgG에 결합하는 도메인이다. 이러한 융합 구조체는, 예를 들어, 환자에 투여된 때, 특히 혈액 순환계 내에서 본원의 폴리펩티드의 반감기를 증가시킨다
본원의 추가적인 화합물의 또다른 바람직한 구현예는, 항체 경사슬, 항체 중사슬, 항체의 Fc 도메인, 항체, 또는 이들의 조합으로 구성되거나 또는 이들을 포함한다.
용어 "항체"는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드에 특이적을 결합하는 단일클론 항체, 폴리클론 항체, 단일 사슬 항체, 또는 이들의 절편을 포함하며, 또한 이특이성 항체, 합성 항체, Fab, F(ab2)', Fv 또는 scFv 절편 등과 같은 중사슬 또는 경사슬 외의 항체 절편, 또는 이들의 임의의 화학적으로 변형된 유도체를 포함한다. 단일클론 항체는, 예를 들어, Kohler 및 Milstein (Nature 256 (1975), 495, and Galfre, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3)에서 본디 유래된, 생쥐 미엘로마 세포와 면역화된 포유동물로부터 유래된 비장 세포를 융합하는 것을 포함하는 기술을 당업계에서 개발된 변형을 가하여 사용하여 제조될 수 있다. 게다가, 앞에서 언급된 펩티드의 그 항체 또는 절편은, 예를 들어 Harlow 및 Lane ("Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988)에 기술된 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 상기 항체의 유도체가 파지 디스플레이 방법(phage display technique)에 의해 수득되는 경우, 본원의 펩티드 또는 폴리펩티드의 에피토프에 결합하는 파지 항체의 효율을 증가시키기 위해 BIAcore 시스템에서 채용된 표면 플라즈몬 공명이 사용될 수 있다 (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). 예를 들어, WO89/09622에 키메릭 항체의 생산이 기술되어 있다. 본원에 따라 사용될 수 있는 추가적인 항체 소스(source)는 소위 이종 항체이다(xenogenic antibodies). 생쥐 내의 인간 항체와 같은 이종 항체의 제조를 위한 일반 원리는, 예를 들어 WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 및 WO 96/33735에 기술되어 있다. 본원에서 채용되는 항체 또는 이들에 상응하는 면역 글로불린 사슬(들)은, 예를 들어, 아미노산의 결실(들), 삽입(들), 치환(들), 부가(들), 및/또는 재조합(들) 및/또는 당업계에 알려진 변형(들)과 같은 당업계에 알려진 종래의 기술을 별개로 또는 조합하여 사용하여 추가적으로 변형될 수 있다. 면역글로불린 사슬의 아미노산 서열이 근거하는 DNA 서열 내에 이러한 변형을 도입하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다; 예를 들어, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989 참조.
용어 "단일클론" 또는 "폴리클론 항체" (Harlow and Lane, (1988), loc. cit. 참조)는 또한 항체의 결합 특이성을 유지하거나 또는 실질적으로 유지하고 있는 상기 항체의 유도체와 관련된다. 상기 유도체의 특히 바람직한 구현예가 아래에 추가로 특정되는 한편, 그러한 항체의 다른 바람직한 유도체는, 예를 들어, 생쥐 또는 들쥐 가변 부위 및 인간 불변 부위를 포함하는 키메릭 항체이다.
항체는 인간화 항체일 수 있다. 용어 "인간화 항체"는, 본원에 따르면, 인간에서 자연적으로 생산되는 항체 변이체(variants)와의 유사성이 증가되도록 그 단백질 서열을 변형시킨 비-인간 유래 항체를 의미한다. 인간화 항체의 생성은, 예를 들어, CDR 3 및 바람직하게는 모든 6 CDR들과 같은 적절한 CDR 코딩 절편(원하는 결합 특성과 관련된)들을 인간 항체 "스캐폴드" 내로 삽입함으로써 수행될 수 있다. 인간화 항체의 제조 방법은, 예를 들어 EP-A1 0 239 400 및 WO 90/07861에 기술되어 있다.
용어 "항체 경사슬"은 항체의 작은 폴리펩티드 서브유닛을 지칭하며, 용어 "항체 중사슬"은 항체의 큰 폴리펩티드 서브유닛을 지칭한다. 전형적인 항체는 두 개의 면역글로불린(Ig) 중사슬 및 두 개의 Ig 경사슬로 구성된다. 각각의 경사슬은 두 개의 탠덤(tandem) 면역글로불린 도메인; 하나의 불변(CL) 도메인 및 하나의 가변 도메인(VL)으로 구성되며, 이들은 결합 항원에 중요한 영향을 미친다. 중사슬은 항체의 유형(class) 또는 이소타입을 결정한다. 각각의 중사슬은 두 가지 부위, 소위 불변 부위(동일 유형의 모든 면역글로불린에서 동일하나, 유형들 간에는 상이함) 및, 상이한 B 세포 간에는 다르나, 동일한 B 세포 또는 B 세포 클론으로부터 생성되는 모든 면역글로불린들에서는 동일한 가변 부위를 가진다. 모든 중사슬의 가변 도메인은 단일 면역글로불린 도메인으로 구성된다.
항체의 "기능적 Fc 도메인"은 당업자에게 잘 알려진 용어이며 항체의 파파인(papain) 절단에 기초하여 정의된다. 그들의 중사슬의 불변 부위의 아미노산 서열에 기반하여, 면역글로불린들은 유형(class)이 나누어진다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 그리고 이들 중 몇몇은 하위 유형(subclass)으로 더 나누어지며 (이소타입), 이들은 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, IgA1, 및 IgA2이다. 상이한 면역글로불린 유형들은 중사슬의 불변 부위에 따라 각각 [알파], [델타], [엡실론], [감마], 및 [뮤]라고 불린다. 항체의 기능적 Fc 도메인은 보체 활성, C1q 결합 및 Fc 수용체 결합에 기초하여 ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 및 CDC (complement-dependent cytotoxicity)와 직접적으로 연관된다. 네 종류의 인간 IgG 이소타입은 신생아 Fc 수용체(neonatal Fc receptor), 활성 Fc 감마 수용체, FcgRI, FcgRIIa, 및 FcgRIIIa, 억제성 수용체 FcgRIIb, 및 C1q 와 같은 상이한 수용체에 상이한 친화성으로 결합한다. 인간 항체의 Fc 도메인의 활성 및 억제 수용체에 대한 친화성은 조작되거나 변경될 수 있다 (Strohl W. (2009) Curr Opin Biotechnol, 20, p. 685-691 참조).
바람직하게는, Fc 도메인은 본원의 폴리펩티드의 인 비보 반감기를 연장시켜주는 하나 이상의 인간 기능적 Fc 도메인이고, 이들 중 일부는, 예를 들어 아래에 기술하는 치료적, 예방적 및/또는 진단적 응용에서 융합 단백질의 독창적인 폴리펩티드 구성의 특이적 목표 결합 부위에서 포유동물의 면역 반응을 유도한다. 더욱 구체적으로는 그러한 인간 기능적 Fc 도메인은 IgG 1 항체의 하나이다. 본원의 폴리펩티드는 하나 이상의 기능적 Fc 도메인의 N- 또는 C- 말단 중 어느 하나 또는 하나 이상의 Fc 도메인의 C- 및 C- 말단 모두에 융합될 수 있다. 본원의 융합 단백질은, 본원의 폴리펩티드의 다량체, 바람직하게는 사량체, 삼량체 또는 가장 바람직하게는 이량체가 적어도 일측, 바람직하게는 하나 이상의 N- 말단, 바람직하게는 하나의 Fc 도메인에 융합된 것을 포함하는 것이 바람직하다.
본원의 더욱 바람직한 구현예에서, Fc 도메인은 활성화 또는 침묵(silenced) 이펙터(effector) 기능을 가지는 하나 이상의 조작된(engineered) IgG1의 인간 기능적 Fc 도메인이며, 바람직하게는 침묵 이펙터 기능을 가지는 하나 이상의 조작된 IgG1의 인간 기능적 Fc 도메인이며, 그리고 더더욱 바람직하게는 카밧 EU 인덱스에 따른 번호로서(Johnson G. and Wu T.T. (2000) Nucleic Acids Res. 28, p. 214-218 참조) L234 및 L235에 돌연변이를 가지는 침묵 이펙터 기능을 가지는 하나 이상의 조작된 IgG1의 인간 기능적 Fc 도메인이고, 그리고 가장 바람직하게는 돌연변이 L234A 및 L235A를 가진다.
본원의 융합 구조체의 항체는 바람직하게는 TNFα에 특이적으로 결합한다. 용어 "특이적으로 결합"은 본원의 융합 구조체가 관련 없는 단백질에 결합할 때 관찰되는 평형 결합 상수와 비교하여 2 팩터 작은, 바람직하게는 5 팩터 작은 또는 10 팩터 작은 평형 결합 상수 KD로 TNFα에 결합하는 경우를 말하며, 그러한 관련 없는 단백질은 TNF 패밀리의 멤버가 아니거나 TNFβ 와 같이 TNF 패밀리와 상이한 멤버이다.
본원의 융합 구조체의 또다른 바람직한 구현예에 따르면, 본원의 폴리펩티드는 항체 경사슬, 항체 중사슬, 항체의 Fc 도메인, 항체, 또는 이들의 조합으로 구성된 또는 이들을 포함하는 상기 추가적인 화합물의 C-말단의 하류에 위치한다.
이러한 추가적인 화합물은 폴리펩티드에 직접적으로 융합하거나 링커를 통할 수 있다. 따라서, 융합 구조체는 (직접적으로) 추가적인 화합물의 C-말단에 융합할 수 있으며, 더욱 구체적으로는 아미노산 C-말단의 카복시기와 아미노산 N-말단의 아미노기 간의 펩티드 결합에 의해, 또는 추가적인 화합물 사슬의 C-말단과 링커를 통하여 연결되어 융합될 수 있다.
적합한 링커는 당업자가 자유롭게 선택할 수 있다. 본원에 따른 링커는 바람직하게는 1 내지 30 탄소 원자를 가지는 알킬, 1 내지 20 에틸렌 모이에티를 가지는 폴리에틸렌 글리콜, 1 내지 20 잔기를 가지는 폴리알라닌, 카프로산, 치환 또는 비치환된 폴리-p-페닐렌 및 트리아졸로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 펩티드 링커, 더욱 구체적으로는 2 내지 30 아미노산의 길이를 가지는 올리고펩티드도 바람직하다. 단일 아미노산의 사용 또한 의도적으로 예상된다. 바람직한 길이 범위는 5 내지 15 아미노산이다. 다른 바람직한 길이는 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19 또는 20 아미노산이다.
특히 바람직한 것은 글리신, 세린 및 알라닌과 같은 작은 아미노산으로 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100%로 구성된 펩티드인 링커이다. 특히 바람직한 것은 글리신 및 세린만으로 이루어진 링커이다. 가장 바람직한 것은 SEQ NO: 13 내지 15의 링커이며 특히 바람직한 것은 SEQ ID NO: 15의 서열로 구성된 펩타이드인 링커이다.
본원의 융합 구조체의 또다른 바람직한 구현예에 따르면, 추가적인 화합물은 SEQ ID NO: 11로 구성되는 또는 이를 포함하는 항체 경사슬을 포함하거나 이로 구성된다.
SEQ ID NO: 11은 항-TNFα 항체의 경사슬이다. SEQ ID NO: 11은 또한 본원의 폴리펩티드에 직접적으로 융합되거나 링커를 통할 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 융합 구조체는 추가적인 화합물의 C-말단에 (직접적으로) 융합될 수 있고, 더욱 구체적으로는 아미노산 C-말단의 카복시기와 아미노산 N-말단 아미노기 간의 펩티드 결합에 의해, 또는 추가적인 화합물 사슬의 C-말단과 링커를 통하여 연결되어 융합될 수 있다. 바람직한 링커는 SEQ IN NO: 13 내지 15로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되며, 여기서 SEQ ID NO: 15가 가장 바람직하다. 이 구현예에 따른 특히 바람직한 융합 구조체의 예시는 SEQ ID NO: 16 또는 17을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 SEQ ID NO: 16이 가장 바람직하다.
본원의 추가적인 구현예는 SEQ ID NO: 11을 포함하거나 이로 구성되는 항체 경사슬을 포함하거나 이로 구성되는 융합 구조체 적어도 1 복제, 바람직하게는 2 복제와, SEQ ID NO: 12의 항체 중사슬을 적어도 1 복제, 바람직하게는 2 복제를 포함하거나 이로 구성되는 구조체에 대한 것이다.
SEQ NO: 12는 항-TNFα 항체의 중사슬이다. 따라서, 이 구현예에 따른 구조체는 본원의 글리코실화 IL-17A에 결합하는 폴리펩티드, 항-TNFα 항체의 경사슬(SEQ ID NO: 11) 및 항-TNFα 항체의 중사슬(SEQ ID NO: 12)를 적어도 포함하며, 여기서 본원의 글리코실화 IL-12A에 결합하는 폴리펩티드 및 항-TNFα 항체의 경사슬이 융합을 형성한다. 본원의 구조체 내의 경사슬과 중사슬의 복제의 수는 동일한 것이 바람직하다. 항체의 구성요소인 중사슬과 함께 있을 때, 항체의 구성요소인 경사슬은 TNFα를 인식하는 부위인 항원 결합 부위를 형성한다. 항-TNFα 항체의 경사슬(SEQ ID NO: 11) 및 항-TNFα 항체의 중사슬(SEQ ID NO: 12) 각각 두 복제를 포함하는 구조체의 경우, 상기 구조체는 바람직하게는 각각의 경사슬이 본원의 폴리펩티드와 직접적으로 또는 링커를 통해 융합하는 완전한 항-TNFα 항체를 포함한다. 그러한 구조체의 바람직한 예시는 아래의 실시예 4에 기술되어 있으며 표 4에 나타나 있다.
본원의 바람직한 구현예에는 SEQ ID NO: 16 또는 17(SEQ ID NO: 16이 바람직함)을 포함하거나 이로 구성되는 융합 구조체 적어도 1 복제, 바람직하게는 2 복제, 그리고 SEQ ID NO: 12의 항체 중사슬을 적어도 1 복제, 바람직하게는 2 복제를 포함하거나 이로 구성되는 구조체에 관한 것이다.
이 구조체는 SEQ ID NO: 16 또는 17(SEQ ID NO: 16이 바람직함)을 포함하거나 이로 구성되는 융합 구조체 두 복제, 및 SEQ ID NO: 12의 항체 중사슬 두 복제를 포함하거나 이로 구성되는 것이 바람직하다. 이러한 구조체는 따라서 완전한 항- TNFα 항체를 포함할 수 있다.
본원의 구조체 내에서 본원의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 11을 포함하거나 이로 구성되는 경사슬의 C-말단의 하류에 위치한다.
본원의 구조체는, 한편으로는 소위 글리코실화 인터루킨-17 그리고 다른 한편으로는 TNFα의 두 목적 분자에 수반하여 결합하는 것이 가능하다. 구조체는 본원의 폴리펩티드의 존재 때문에 기능적 글리코실화 IL-17A 결합 부위를 포함한다.
본원에 따른 구조체는, 상기 융합 단백질 및 상기 항체 중사슬을, 적절한 조건 하에서 접촉시킴으로써(bring together) 수득될 수 있다. 당업자는 적절한 조건에 대해 이미 알고 있다. 이와 같이 적절한 조건 하에서 접촉시키는 것은, 상기 융합 단백질 내에 포함된 항체 경사슬과 상기 항체 중사슬 간의 상호작용에 의해 유발되는 비-공유 어셈블리를 제공한다. 바람직하게는, 항체에서 통상적으로 발견되는 이황화 결합이 본원의 구조체 내에 존재한다. 이황화 결합은 통상적으로 힌지(hinge) 부위의 근처에 존재하며 두 중사슬 및/또는 경사슬과 중사슬을 연결한다.
본원은 추가적으로 본원의 폴리펩티드, 또는 본원의 융합 구조체를 인코딩하는 핵산 분자, 또는 본원의 구조체를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자에 대한 것이다.
본원의 구조체를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자는, 예를 들어, 본원의 구조체를 인코딩하는 하나의 핵산 분자 및 다른 항체의 중사슬 핵산 분자인 두 핵산 분자일 수 있다.
본원에 따르면, 핵산 분자는 cDNA와 같은 DNA 및 mRNA를 포함한다. 추가적으로 포함되는 것은 합성 또는 반합성 DNA 또는 RNA 유도체 및 혼합 고분자와 같은 당업계에 알려진 핵산 유사 분자(nucleic acid mimicking molecules)의 센스 및 안티센스 가닥이다. 이들은 추가적인 비-자연적 또는 유도된 뉴클레오티드 염기를 포함할 수 있으며, 당업자에 의해 즉시 평가될 수 있다. 바람직한 구현예에서 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자(들)은 DNA이다. 본원에 따른 이러한 핵산 유사 분자 또는 핵산 유도체는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 핵산, 포르포라미데이트(phosphoramidate) 핵산, 2'-O-메톡시에틸 리보핵산(2'-O-methoxyethyl ribonucleic acid), 모폴리노(morpholino) 핵산, 헥시톨 핵산(hexitol nucleic acid, HNA) 및 잠금 핵산(locked nucleic acid, LNA) (예를 들어, Braasch and Corey, Chemistry & Biology 8, 1-7 (2001) 참조)을 포함한다. LNA는 2'-산소 및 4'-탄소 사이의 메틸렌 연결에 의해 속박된(constrained) 리보오스 고리인 RNA 유도체이다.
본원의 목적을 위하여, 펩티드 핵산(PNA)는 DNA 유사체의 폴리아미드 형태이다. 아데닌, 구아닌, 티민 및 시토신의 상응하는 유도체들의 단량체 유닛들이 상업적으로 이용가능하다 (예를 들어, Perceptive Biosystems으로부터). PNA는 DNA나 RNA의 당-인산 골격의 위치에 아미드 골격을 가지는 합성 DNA-유사체이다. 따라서, 인, 인 산화물, 또는 디옥시리보오스 유도체와 같은 DNA의 특정 구성요소들은 PNA에 존재하지 않는다.
본원에 따른 PNA 키메라(chimera)는 하나 이상의 PNA 부분을 포함하는 분자이다. 키메릭 분자의 나머지는 하나 이상의 DNA 부분(PNA-DNA 키메라) 또는 하나 이상의 (폴리)펩티드 부분(펩티드-PNA 키메라)를 포함할 수 있다. 본원에 따른 펩티드-DNA 키메라는 하나 이상의 (폴리)펩티드 부분 및 하나 이상의 DNA 부분을 포함하는 분자이다. PNA, 펩티드 및 DNA 부분을 포함하는 분자는 용이하게 예측될 수 있다. 키메릭 분자의 부분의 길이는 1 내지 n-1 염기, 이와 동등한 것 또는 아미노산일 수 있으며, 여기서 "n"은 전체 분자의 염기, 이와 동등한 것 alc 아미노산의 총 개수이다.
위에서 기술한 PNA, (폴리)펩티드, PNA 키메라 및 펩티드-DNA 키메라와 함께 사용되는 용어"유도체"는, PNA, (폴리)펩티드 및 DNA와 상이한 하나 이상의 추가 작용기 또는 치환체를 포함하는 분자인 이들 분자에 대한 것이다. 보호기와 같이 당업계에 알려지고 이들 분자들의 합성에 사용되는 모든 작용기 또는 치환기, 및/또는 표지 및 (절단) 링커와 같은 이들 분자와 관련된 응용이 예측된다.
그러한 구현예에서 핵산 분자는 인용 서열, 5' 말단 또는 3' 말단 각각에 특정 서열로 연장되는 추가 서열 또는 둘 모두를 (가지는 것보다) 포함한다.이러한 추가 서열은 이형(heterologous) 또는 동형(homologous)에서 나온 것일 수 있으며 약 50 내지 500 뉴클레오티드까지 늘어나는 것을 포함하나 이보다 높거나 낮은 값을 제외하는 것은 아니다. 동형 서열의 경우에, 이들 구현예는 완전한 유전체를 포함하는 것은 아니며 5' 말단 및/또는 3'말단의 약 1500 추가 뉴클레오티드로 일반적으로 국한된다.
추가적인 이형 서열은 상기 분자의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 이형 프로모터를 포함할 수 있다. 따라서, 핵산 분자는 바람직하게는 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 그리고 더욱 바람직하게는 T5 프로모터/lac 작동자 요소, T7 프로모터/lac 작동자 요소로 구성된 원핵생물 프로모터 군으로부터 선택되는 프로모터, 또는 hEF1-HTLV, CMV enh/hFerL 프로모터로 구성되는 진핵생물 프로모터 군으로부터 선택된다.
벡터 및 분리된 세포, 특히 숙주세포는 예를 들어 본원의 폴리펩티드, 융합 구조체 및/또는 구조체의 생산, 및/또는 치료적으로 유용한 벡터와 같은 목적 및, 유전자 치료와 같은 숙주 세포에 적합한 임의의 종래의 유형일 수 있다. 당업자는 수많은 선행 기술로부터 그러한 핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포를 선택할 수 있으며 원하는 목적에 특히 적합한지를 일상적인 방법에 의해 과도한 실험 없이도 확인할 수 있다.
본원 i의 하나 이상의 벡터는 본원의 핵산을 하나 이상 포함하며 바람직하게는 본원의 폴리펩티드 또는 융합 단백질의 생산할 수 있는 것이 또한 바람직하다. 그러한 벡터는 바람직하게는 pQE 벡터, pET 벡터 , pFUSE 벡터, pUC 벡터, YAC 벡터, 파지미드 벡터, 파지벡터, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스와 같이 유전자 치료에 사용되는 벡터로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 벡터 조작 기술로서, Sambrook and Russel (2001), loc. cit를 참조하라. 일반적으로, 벡터는 하나 이상의 복제 기원(origin of replication, ori) 및 복제 또는 발현을 위한 유전 시스템(inheritance systems), 예를 들어 항생제 저항과 같이 숙주 내에서의 선별을 위한 하나 이상의 마커, 및 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 적합한 복제 기원(ori)은, 예를 들어 Col E1, SV40 바이러스 및 M 13 복제 기원을 포함한다.
본원의 하나 이상의 핵산 분자는 하나 이상의 벡터 내로 삽입될 수 있으며 따라서 또다른 핵산 분자와의 번역 융합체(translational fusion)가 생성된다. 또다른 핵산 분자는 바람직하게는 항-TNFα 항체의 경사슬 및/또는 중사슬 및/또는 링커이며, 이들의 바람직한 예시들은 위에 기술되어 있다.
하나 이상의 숙주세포는 본원의 하나 이상의 핵산 분자 또는 하나 이상의 벡터를, 상기 핵산 분자 또는 벡터에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 발현을 매개하도록 존재하는 하나 이상의 숙주 세포에 도입함으로써 제조될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 분리된 숙주세포이며, 이는 상기 세포가 살아있는 유기체 내에 있는 것이 아님을 의미한다. 숙주는 원핵 또는 진핵세포 중 임의의 것일 수 있다. 적합한 진핵 숙주는 포유동물 세포, 양서류 세포, 어류 세포, 곤충 세포, 곰팡이 세포 또는 식물 세포일 수 있다. 진핵 세포는 조밤나방(Spodoptera frugiperda)과 같은 곤충 세포, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포와 같은 효모 세포, 아스페르길루스(Aspergillus) 세포와 같은 곰팡이 세포 또는 척추동물 세포일 수 있다. 후자와 관련하여, 세포는 인간과 같은 포유동물 세포인 것이 바람직하다. 세포는 세포주의 일부일 수 있다.
적합한 원핵생물/박테리아는 대장균(E. coli, 예를 들어, 대장균 품종 HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 및 JM101), 살모넬라균(Salmonella typhimurium), 세라티아마르세센스(Serratia marcescens), 세균성벼알마름병균(Burkholderia glumae), 슈도모나스 퓨티타(Pseudomonas putida), 슈도모나스 플루오르센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 스투트제리(Pseudomonas stutzeri), 스트렙토마이세스 리비던스(Streptomyces lividans), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같이 클로닝에 일반적으로 사용되는 것이다. 본원의 핵산 또는 벡터에 의해 유전적으로 조작되기에 바람직한 숙주세포의 예는 대장균(E. coli)이다.
본원은 또한 본원의 폴리펩티드, 본원의 융합 구조체, 본원의 구조체, 본원의 하나 이상의 핵산 분자, 본원의 하나 이상의 벡터, 본원의 하나 이상의 숙주 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 약제학적 또는 진단학적 조성물에 대한 것이다.
위에서 더욱 상세히 기술한 것과 같이, IL-17A는 많은 질병과 연관되어있다. 따라서 본원의 폴리펩티드, 융합 구조체, 구조체, 핵산 문자, 벡터, 숙주 세포 또는 이들의 임의의 조합은 약제로서 유용하다. 상기 약제학적 조성물 내에서 본원의 폴리펩티드, 융합 구조체, 구조체, 핵산 분자, 벡터, 숙주세포 또는 이들의 임의의 조합은 유일한 활성제(active agent)인 것이 바람직하다. 약제학적 조성물은 가축 및 애완동물과 같은 포유동물에 투여되는 것이 바람직하다. 인간에 투여되는 것이 가장 바람직하다. 여기에 기술되는 약제학적 조성물은 대상에 적합한 용량으로 투여될 것이다.
본원에 따른 용도의 약제학적 조성물은 당업계에 알려진 방법에 따라 전형적인 방법으로 제조될 수 있으며, 예를 들어 Ansel 등("Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", 7th edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 1999)을 참조하여 하나 이상의 생리학적 담체 또는 부형제를 사용할 수 있다. 약제학적 조성물은 따라서, 경구적인, 피하를 통한, 정맥을 통한, 근육을 통한, 복강을 통한, 척추강을 통한, 경피의, 점막을 통한, 경막하의, 이온도입(iontopheresis)을 통한 부분적 또는 국소적인, 흡입 스프레이에 의한 설하의, 에어로졸 또는 직장 등을 통한 비경구적인 단위 투여 제형일 수 있으며, 임의적으로 종래의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 본원의 진단학적 조성물 또한 임의의 종래의 방법에 의해 제조될 수 있다.
본원의 약제학적 조성물은 단일 활성 성분으로서 또는 예를 들어 다른 약물의 보조약(adjuvant)으로 또는 복합으로 함께 투여될 수 있으며, 상기 다른 약물은 예를 들어 면역억제 또는 면역 조절제 또는, 예를 들어 위에서 언급된 질병의 치료 또는 예방을 위한 다른 항-염증제이다. 예를 들어, 본원의 폴리펩티드, 융합 구조체 및 구조체는 면역억제성 단일클론 항체, 예를 들어 백혈구 수용체, 예를 들어 MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40, CD45, CD58, CD80, CD86 또는 이들의 리간드에 친화성을 가지는 단일클론 항체; 다른 면역조절 화합물, 예를 들어 CTLA4의 세포외 도메인의 적어도 일부를 가지는 재조합 결합 분자 또는 이의 돌연변이; 예를 들어 비-CTLA4 단백질 서열과 결합된 CTLA4의 적어도 세포외 부분 또는 이의 돌연변이, 예를 들어 CTLA4Ig(예를 들어, ATCC 68629로 지정됨) 또는 이의 돌연변이, 예를 들어 LEA29Y; 부착 분자 억제제, 예를 들어 LFA-I 길항제, ICAM-1 또는 -3 길항제, VCAM-4 길항제 또는 VLA-4 길항제와 조합되어 사용될 수 있다. 추가적으로, 본원의 폴리펩티드, 융합 구조체 및 구조체가 DMARD (disease-modifying anti-rheumatic drugs), 금염(gold salts), 설파살라진(sulphasalazine), 항-말라리아(anti-malarias), 메토트렉세이트(methotrexate), D-페니실라민(D-penicillamine), 아자티오프린(azathioprine), 마이코페놀릭산(mycophenolic acid), 시클로스포린 A(cyclosporine A), 타크로리무스(tacrolimus), 시로리무스(sirolimus), 미노사이클린(minocycline), 레플루노마이드(leflunomide), 글루코코르티코이드류(glucocorticoids); 예를 들어 시클로스포린 A 또는 FK 506과 같은 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor); 예를 들어 FTY720 및 FTY720 유사체와 같은 림프구 재순환 조절제(modulator of lymphocyte recirculation); 예를 들어 라파마이신, 40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, CCI779, ABT578, AP23573 또는 TAFA-93과 같은 mTOR 억제제; 예를 들어 ABT-281, ASM981 등과 같은 면역 억제 특성을 가지는 아스코마이신; 코르티코스테로이드류(corticosteroids); 시클로포스파미드(cyclophosphamide); 아자티오프렌(azathioprene); 메토트렉세이트(methotrexate); 레플루노미드(leflunomide); 미조리빈(mizoribine); 마이코페놀릭산(mycophenolic acid); 마이코페노레이트 모페틸 (mycophenolate mofetil); 15-디옥시스페르구아린(15-deoxyspergualine) 또는 면역억제성 유사체, 이의 유사체 또는 유도체; 또는 예를 들어 파실택셀(paclitaxel), 젬시타바인(gemcitabine), 시스플래티넘(cisplatinum), 독소루비신(doxorubicin) 또는 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)과 같은 화학요법제(chemotherapeutic agent); 예를 들어 TNFα(바람직하게는 SEQ ID NO: 11 및/또는 12를 포함하는) 에 대한 단일클론 항체, 예를 들어 인플릭시맵(infliximab), 아달리무맵(adalimumab), CDP870, 또는 TNF-RI 또는 TNF-R에 대한 수용체 구조체, 예를 들어 에타네셉트(Etanercept), PEG-TNF-R와 같은 (다른) 항-TNFα 제제; 예를 들어 아나킨라 또는 IL-1 트랩, AAL160, ACZ 885, IL-6 차단제(blocker)와 같은 IL-1 차단제; 예를 들어 메탈로프로테아제, 항-IL-15 항체, 항-IL-6 항체, 항-IL23-항체, 항-IL-22 항체, 항-IL-21 항체, 항-IL-12 항체, 항-IFN-감마 항체, 항-IFN-알파 항체, 항-CD20 항체, 항 IL-17 항체, 항-IgGE 항체, 아스피린 또는 항-감염제와 같은 NSAIDs와 같은 프로테아제의 억제제 또는 활성제와 조합되어 사용될 수 있다.
일반적인 용어로서, 본원의 약제학적 조성물은 IL-17A-연관 질병의 치료 또는 예방에 사용된다.
본원의 약제학적 조성물은 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. "약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제"는 비-독성 고체, 반고체 또는 액체 필러(filler), 캡슐화된 물질 또는 임의의 유형의 제형 보조제(formulation auxiliary)를 의미한다. 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제의 예시는, 예를 들어 Ansel 등, "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", 7th edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 1999에 기술되어 있다.
본원의 진단학적 조성물은 원하지 않은 생리학적 글리코실화 IL-17A 수준, 특히 SEQ ID NO: 10의 글리코실화 IL-17A를 예를 들어 다른 세포, 조직 또는 다른 적합한 샘플 내에서 탐지하는 데에 유용하다. 상기 탐지는 일반적으로 샘플을 본원의 폴리펩티드, 융합 구조체, 구조체, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 또는 이들의 임의의 조합과 접촉시키고, 샘플 내의 글리코실화 IL-17A, 특히 SEQ ID NO: 10의 글리코실화 IL-17A를 탐지하는 것을 포함한다. 따라서, 본원의 진단학적 조성물은 질병의 발병 또는 질병 상태를 가늠하는 데에, 특히 아래에 추가로 정의되는 질병의 상태를 가늠하는 데에 사용될 수 있다.
여기에 기술된 본원의 일 구현예에서, 본원의 폴리펩티드는 형광 염료, 광감응제, 방사성 핵종, 또는 의학 영상을 위한 조영제에 연결되어 있다. 그러한 융합 구조체는 특히 진단학적 응용에 적합하다.
본원의 진단학적 조성물은, 상기 진단학적 조성물이 예를 들어 대상 내의 원하지 않은 생리학적 글리코실화 IL-17A 수준을 가지는 부분을 식별하기 위하여 사용되는 경우에, 단일 활성제(active agent)로서 투여되거나 또는 다른 약제(agent)와 병용하여 투여될 수 있다. 일반적인 용어로서, 본원의 진단학적 조성물은 모든 IL-17A 매개 질병의 진단에 사용된다.
본원의 진단학적 및 약제학적 조성물의 용량은, 물론, 본원의 특정 폴리펩티드, 융합 구조체, 구조체, 하나 이상의 핵산 분자, 하나 이상의 벡터, 하나 이상의 숙주 세포 또는 이들의 임의의 조합, 개별 환자군 또는 환자, 추가적인 진단학적 또는 의학적 활성 화합물의 임의적인 존재 및 진단되거나 치료되는 질병의 특성 및 심각도에 따라 달라질 것이다. 그러나, 현재 진단학적 또는 약제학적 조성물은 체중 킬로그램당 약 0.01 mg 내지 약 20 mg, 바람직하게는 체중 킬로그램당 약 0.1 mg 내지 약 5 mg의 용량이 사용되는 것이 바람직하다. 진단학적 또는 약제학적 조성물은, 예를 들어 진단학적 조성물인 경우 병의 경로를 모니터하기 위해 또는 약제학적 조성물의 경우 치료의 연장을 위해 한 번 이상 투여될 수 있다. 바람직하게는, 진단학적 또는 약제학적 조성물의 투여 빈도는 매일 내지 약 3 개월마다의 범위 내이며, 바람직하게는 약 2주마다 내지 약 10주마다, 더욱 바람직하게는 매 4 내지 8주마다 이다. 바람직한 투여 요법은 본원의 진단학적 또는 약제학적 조성물을 한 달에 한번 내지 매 2 내지 3개월에 한번 또는 더 적은 빈도로 투여하는 것에 관련된다.
본원의 바람직한 구현예에서, 상기 약제학적 조성물은 염증성, 자가면역 및/또는 뼈 손실-연관 질병의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다.
본원의 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 질병은 관절염(arthritis), 바람직하게는 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis), 만성 진행성 관절염(arthritis chronica progrediente), 반응성 관절염(reactive arthritis) , 건선 관절염(psoriatic arthritis), 장병성 관절염(enterophathic arthritis) 및 변형 관절염(arthritis deformans), 류머티스 질병(rheumatic diseases), 척추관절병증(spondyloarthropathies), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 라이터 증후군(Reiter syndrome), 과민반응(hypersensitivity, 기도 과민반응 및 피부 과민반응을 모두 포함함), 알러지(allergies), 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 염증성 근육 장애(inflammatory muscle disorders), 다발연골염(polychondritis), 피부 경화증(sclerodoma), 베게너 육아종증(Wegener granulomatosis), 피부근염(dermatomyositis), 스티븐스-존슨 증후군(Steven-Johnson syndrome), 만성활동간염(chronic active hepatitis), 중증근육무력증(myasthenia gravis), 건선(psoriasis), 특발 스프루(idiopathic sprue), 자가면역 염증성 장 질환(autoimmune inflammatory bowel disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(Crohn's disease), 과민성 대장 증후군(Irritable Bowel Syndrome), 내분비성 안질환(endocrine ophthalmopathy), 그레이브스병(Graves disease), 사르코이드증(sarcoidosis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 원발성 담즙성 간경변(primary biliary cirrhosis), 소아 당뇨병(juvenile diabetes, 제 1 형 당뇨병), 자가면역 혈액학적 장애(autoimmune haematological disorders), 용혈성 빈혈(hemolytic anaemia), 재생불량성 빈혈(aplastic anaemia), 순적혈구 빈혈(pure red cell anaemia), 특발성 혈소판감소증(idiopathic thrombocytopenia), 포도막염(uveitis, 앞포도막염 및 뒤포도막염), 건성 각결막염(keratoconjunctivitis sicca), 봄철 각결막염(vernal keratoconjunctivitis), 간질성 폐섬유증(interstitial lung fibrosis), 사구체신염(glomerulonephritis, 신증후군을 동반하거나 동반하지 않음), 특발성 콩팥증후군(idiopathic nephrotic syndrome) 또는 최소변화신증(minimal change nephropathy), 종양(tumors), 피부 염증 질환(inflammatory disease of skin), 각막염(cornea inflammation), 근육염(myositis), 뼈 임플란트의 풀림(loosening of bone implants), 대사장애(metabolic disorders), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 당뇨병(diabetes), 및 이상지질혈증(dislipidemia), 뼈손실(bone loss), 골관절염(osteoarthritis), 골다공증(osteoporosis), 폐쇄성 치주질환(periodontal disease of obstructive) 또는 염증성 기관지 질환 천식(inflammatory airways diseases asthma), 기관지염(bronchitis), 진폐증(pneumoconiosis), 폐기종(pulmonary emphysema), 급성 및 초급성 염증반응(acute and hyperacute inflammatory reactions), 급성 감염(acute infections), 패혈성 쇼크(septic shock), 내독소 쇼크(endotoxic shock), 성인성 호흡 곤란 증후군(adult respiratory distress syndrome), 수막염(meningitis), 폐렴(pneumonia), 중화상(severe burns), 악액질 소모 증후군(cachexia wasting syndrome), 뇌졸중(stroke), 헤르페스 기질각막염(herpetic stromal keratitis) 및 안구건조증(dry eye disease)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
상기의-특정 질병 모두는 그들의 기원 및/또는 증상이 IL-17A- 및 또는 Th-17-관련인 점에서 공통점을 가진다.
도 1은 본원의 IL-17A-결합 폴리펩티드의 크기 배제 크로마토그램(size exclusion chromatograms, SEC)이다: (A) 1L3-B09 (SEQ ID NO: 3), (B) 11L0-C6 (SEQ ID NO: 4), (C) 11L5-B06 (SEQ ID NO: 5), (D) 11L6-F03 (SEQ ID NO: 6), (E) 11L9-C09 (SEQ ID NO: 7), (F) 11L10-A05 (SEQ ID NO: 8), (G) 11L11-A09 (SEQ ID NO: 9).
도 2는 본원의 Fyn-SH3 유래 폴리펩티드에 의한 글리코실화 및 비-글리코실화 IL-17A의 용량-의존 인 비트로 억제의 결과를 도시한 것이다. A) 1L3-B09 (SEQ ID NO: 3), (B) 11L0-C6 (SEQ ID NO: 4), (C) 11L5-B06 (SEQ ID NO: 5), (D) 11L6-F03 (SEQ ID NO: 6), (E) 11L9-C09 (SEQ ID NO: 7), (F) 11L10-A05 (SEQ ID NO: 8)
도 3은 WO2011/023685에 기술된 Fyn-SH3 유래 결합제(binder)에 의한 글리코실화 및 비-글리코실화 IL-17A의 용량-의존 인 비트로 억제의 결과를 도시한 것이다. (A) Fyn SH3 유래 IL-17 결합제 2C1 (WO2011/023685에 기술된 SEQ ID NO: 107). (B) Fyn SH3 유래 IL-17 결합제 A1_2 ("A1")(WO2011/023685에 기술된 SEQ ID NO: 53). (C) Fyn SH3 유래 IL-17 결합제 B1_2 ("B1")(WO2011/023685에 기술된 SEQ ID NO: 39).
도 4는 본원의 이특이적 IL-17A/TNFα 결합 폴리펩티드의 크기 배제 크로마토그램(SEC)를 나타낸다: (A) LC11L5-B06 (각각 SEQ ID NO: 12 및 16의 서열로 구성된 중사슬 및 경사슬을 가지는 이특이적 구조 (본원에 따름)) 및 (B) LC11L9-C09 (각각 SEQ ID NO: 12 및 17의 서열로 구성된 중사슬 및 경사슬을 가지는 이특이적 구조 (본원에 따름)).
도 5는 이특이적 항-IL-17A/TNFα 융합단백질의 IL-17A 및 TNFα의 동시 억제를 보여준다. 200 pM TNFα 및 400 pM IL-17A에 의한 HT-29 세포의 자극 후에 상등액 내의 Gro-알파 ELISA 수준이 보여진다. 지정된 농도의 LC11L5-B06 (SEQ ID NO: 12 (중사슬) 및 16 (경사슬 융합)) (도 5a) 또는 LC11L9-C09 (SEQ ID NO: 12 (중사슬) 및 17 (경사슬 융합)) (도 5b)를 첨가한 후에, 더 높은 억제제(inhibitor) 농도와 함께 Gro-알파 수준이 감소하기 때문에 IL-17A 및 TNFα의 용량-의존 억제가 관찰되었다. 대조군으로서, 세포들은 단일 사이토카인(IL-17A 또는 TNFα) 또는 배지 단독으로 처리되었다. 3반복 실험의 평균값이 보여지며, 에러 바(error bar)는 표준편차(SD)를 나타낸다.
도 6은 인 비보에서 인간 IL-17A와 TNFα의 억제를 보여준다. (A) 및 (B) : 생쥐에 LC11L5-B06 ("LC-B06"로 명명됨) (SEQ ID NO: 12 (중사슬) 및 16 (경사슬 융합))이 정맥주사(i.v.)에 의해 주입되었고, 이어서 인간 IL-17A(hIL-17A)(A) 또는 인간 TNFα(h TNFα)(B)가 피하주사되었다. 지정된 사이토카인의 투여 2 시간 후에, 생쥐로부터 혈액 샘플이 채취되었고 ELISA에 의해 KC 수준이 탐지되었다. 항- TNFα 항체(도 6b) ("aTNFαmAb") 또는 PBS 각각이 정맥주사된 생쥐가 또한 보여진다. 대조군으로서, 기본 KC 수준이 보여진다 (사이토카인 자극 없이 PBS만이(정맥주사) 처리된 생쥐). (C) 및 (D): LC11L9-C09 ("LC-C09"로 명명됨) (SEQ ID NO: 12 (중사슬) 및 17 (경사슬))이 생쥐에 정맥주사(i.v.)로 투여되었고, 이어서 IL-17A(C) 또는 TNFα(D)가 피하주사되었다. 지정된 사이토카인의 투여 2 시간 후에, 생쥐로부터 혈액 샘플이 채취되었고 ELISA에 의해 KC 수준이 탐지되었다. 항- TNFα 항체(도 6d) ("aTNFαmAb") 또는 PBS 각각이 정맥주사된 생쥐가 또한 보여진다. 대조군으로서, 기본 KC 수준이 보여진다 (사이토카인 자극 없이 PBS만이(정맥주사) 처리된 생쥐). 그룹당 5 마리 생쥐의 평균 KC 수준이 보여진다(±SEM).
도 7은 C57BL/6 생쥐에 단일 정맥주사 후 상이한 시간 포인트에서 (A)LC11L5-B06 (SEQ ID NO: 12 (중사슬) 및 16 (경사슬 융합)) 및 (B) LC11L9-C09 (SEQ ID NO: 12 (중사슬) 및 17 (경사슬 융합))의 혈청 농도를 보여준다. 혈청 내의 농도는 ELISA를 이용하여 포획제(capturing agent)로서 TNFα와 IL-17A 모두를 사용하여 측정하였다 (괄호 내에 표시됨). 마지막 시간 포인트(24 시간-168 시간)은 최종 반감기를 산출하기 위해 사용되었다. 5 마리 생쥐의 평균 혈청 농도는 시간에 대하여 플롯되었으며, 에러 바는 표준편차(SD)를 나타낸다.
도 8은 SEQ ID NO: 3 내지 9 및 20의 서열 정렬(alignment)을 보여준다. SEQ ID NO: 3 내지 9는, 도 8로부터 증명되는 것과 같은 본원의 예시에 있는 내부 지정(internal designation)에 상응한다).
도 9는 본원의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드인 11L11-A09(SEQ ID NO: 9)에 의한 글리코실화 및 비-글리코실화 IL-17A의 용량-의존 인 비트로 억제의 결과를 나타낸다.
도 10은 이특이적 항-IL-17A/TNFα 융합단백질 LC11L5-B06 및 LC11L9-C09의 IL-17A억제를 보여준다. IL-17A 및 IL-1β("IL-17A/IL-1β")에 의한 NHDF 세포의 자극 후에 세포 배양 상등액 내의 IL-6 ELISA 수준이 보여진다. 지정된 농도의 LC11L5-B06 (SEQ ID NO: 12 (중사슬) 및 16 (경사슬 융합)) 또는 LC11L9-C09 (SEQ ID NO: 12 (중사슬) 및 17 (경사슬 융합)) 를 첨가한 후에, IL-17A 매개 IL-6 분비의 용량-의존 억제가 관찰되었다. 대조군으로서, 세포들은 단일 사이토카인("IL-17A" 또는 "IL-1β") 또는 세포 배양 배지 단독("Medium")으로 처리되었다. 3반복 실험의 평균값이 보여지며, 에러 바(error bar)는 표준편차(SD)를 나타낸다.
도 11은 샌드위치 ELISA 및 직접 ELISA 방법을 나타낸다. (왼쪽) 샌드위치 ELISA는 완전한(intact) LC11L5-B06 및 LC11L9-C09 분자들을 탐지하기 위해 수행되었다. 비오틴화(biotinylated)된 TNF는 뉴트라비딘(neutravidin)-코팅된 마이크로 타이터(micro titer) 96 웰 플레이트의 벽에 고정화되었다. LC11L5-B06 또는 LC11L9-C09를 함유하는 혈장이 웰에 첨가되었다. 탐지를 위하여, 디곡시제닌(digoxigenin)-표지된 IL-17A가 사용되었으며, 이어서 기질 프로세싱 및 발색을 위하여 항-디곡시제닌 항체-HRP 컨쥬게이트가 첨가되었다. (오른쪽) 직접 ELISA는 특정 TNF 결합을 탐지하기 위해 수행되었다. 비오틴화된 TNF가 뉴트라비딘-코팅된 마이크로 타이터 96 웰 플레이트의 벽에 고정화되었다. LC11L5-B06 또는 LC11L9-C09를 함유하는 혈장이 웰에 첨가되었다. 부착된 LC11L5-B06 또는 LC11L9-C09는 기질 프로세싱 및 발색을 위해 항-인간 IgG 항체-HRP 컨쥬게이트를 이용하여 탐지되었다.
도 12는 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkeys)에 단일 정맥주사 후 상이한 시간 포인트에서 (A) LC11L5-B06 (SEQ ID NO: 12 (중사슬) 및 16 (경사슬 융합)) 및 (B) LC11L9-C09 (SEQ ID NO: 12 (중사슬) 및 17 (경사슬 융합))의 혈장 농도를 보여준다. 포획제로서 TNFα 및 디곡시제닌-표지 IL-17A, 이어서 기질 프로세싱 및 발색을 위해 항-디곡시제닌 항체-HRP 컨쥬게이트를 사용하여 샌드위치 ELISA를 이용하여 혈장 농도가 측정되었다. 세 마리의 시노몰구스 원숭이의 평균 혈장 농도가 시간에 대하여 플롯되었으며, 에러 바는 표준편차를 나타낸다.
도 13은 샌드위치 ELISA 및 직접 ELISA에 의해 측정된 시노몰구스 원숭이의 LC11L5-B06 (A) 또는 LC11L9-C09 (B)의 혈장 농도를 보여준다. 혈장 농도는 두 단백질 모두 비슷하였으며, 이는 LC11L5-B06 및 LC11L9-C09가 시노몰구스 원숭이 내에서 적어도 220 시간 동안 안정하다는 것을 의미한다.
실시예들은 본원을 설명한다.
실시예 1: 본원의 Fyn SH3-유래 폴리펩티드의 IL-17A에 대한 결합의 단일클론 용출물(lysate) ELISA에 의한 확인
방법
Schlatter 등 (Schlatter et al. (2012) mAbs, 4(4) p. 497-50)에 기술된 Fynomer 파지 라이브러리를 사용하여 IL-17A에 특이적인 Fyn-SH3 유래 결합 단백질이 재조합 IL-17A(R&D Systems)를 항원으로 이용하고 표준 파지 디스플레이(standard phage display, Grabulovski D. 등, (2007) J Biol Chem 282, p. 3196-3204, Viti, F. et al. (2000) Methods Enzymol. 326, 480-505)를 선별 기술로서 이용하여 분리되었다. n-src-루프 서열인 "STHEYE"(SEQ ID NO: 2)를 가지고 있는 본원의 Fyn SH3-유래 폴리펩티드 1L3-B09 (SEQ ID NO: 3)가 선별 과정 동안 농축되었다. 1L3-B09 (SEQ ID NO: 3)는 IL-17A에 결합하였으며 (실시예 2 참조) 비-글리코실화 IL-17A와 비슷하게 높은 수준으로 글리코실화 IL-17A를 억제하는 것으로 놀랍게도 밝혀졌다 (실시예 3 참조). 높은 친화력을 가지는 Fyn-유래 IL-17A 결합제를 수득하기 위해서, 1L3-B09 (SEQ ID NO: 3)이 친화도 성숙(affinity maturation)을 위한 주형으로 사용되었다. n-src-루프 서열인 "STHEYE" (SEQ ID NO: 2)이 변함 없이 유지되었으며 무작위 RT-루프 레퍼토리와 결합되었다 (SEQ NO: 1의 (X1)(X2)(X3)(X4)(X5)(X6)로 명명된 6 개의 아미노산 잔기). 친화도 성숙 라이브러리 제조 과정은 무작위 RT-루프를 가지는 나이브 라이브러리(naive library)의 클로징에 기술된 방법과 본질적으로 동일하였다(Schlatter 등, (2012) mAbs, 4(4) p. 497-50의 "Library 0").
나이브 및 친화도 성숙 선별 후에, 용출물 ELISA(lysate ELISA)에 의해 농축된 Fyn SH3-유래 폴리펩티드가 IL-17A 결합을 위해 선별되었다. 제조된 구조체(construct)가 Grabulovski 등(Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204)에 기술된 C-말단 myc-헥사히스티딘(myc-hexahistidine) 태그를 가지도록 Fyn SH3-유래 결합 단백질을 인코딩하는 DNA가 박테리아 발현 벡터 pQE12 (Qiagen) 내로 클로닝되었다. 폴리펩티드는 96-웰 포맷의 대장균 박테리아의 세포질 내에서 발현되었으며 각 웰당 맑은 용출물의 200 ㎕가 Bertschinger 등(Bertschinger et al. (2007) Protein Eng Des Sel 20(2): p. 57-68)에 기술된 것과 같이 준비되었다. 요약하자면, 형질전환된 박테리아 콜로니들은 아가 플레이트로부터 채집되었으며, 둥근 바닥 96-웰 플레이트(Nunc, cat. no. 163320) 에서 100 ㎍/ml의 앰피실린 및 0.1%(w/v)의 글루코오스를 함유하는 200㎕의 2xYT 배지에서 배양되었다. 단백질 발현은 1 mM의 IPTG(Applichem, Germany)를 첨가하여 3 시간 동안 37℃에서 배양함으로써 유도되었다. 단백질은 회전식 진동기(200 r.p.m., 30℃) 내에서 밤새 발현되었다. 이어서, 96웰 플레이트는 1800 g에서 10 분 동안 원심분리되었으며 상등액은 폐기되었다. 박테리아 펠렛은 1 mg/ml의 리소자임을 함유하는 200 ㎕의 용해 버퍼(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, pH 8.0) 내에 재현탁되었으며 얼음 위에서 30분간 방치되었다. 그 후에, 박테리아 세포는 수조 내에서 초음파 처리에 의해 용균되었으며 (10 초 동안 여섯 번의 버스트(burst)) 이어서 1800 g에서 10 분 동안 원심분리되었다. 단일클론 박테리아 용출물은 ELISA에 사용되었다 : 비오틴화 IL-17A(HEK EBNA 세포 내에서 자체적으로 생산, 비오틴화는 제조자의 지시에 따라 NHS-PEO4-biotin (Pierce)에 의해 수행됨)가 스트렙타비딘-코팅된 벽(StreptaWells, High Bind, Roche)에 고정화되었으며, PBS, 2% 우유(Rapilait, Migros, Switzerland)로 블로킹한 후, 50 ㎕의 PBS, 6 ㎍/ml의 항-myc 항체 9E10(최종 농도 3㎍/ml)를 함유하는 4%의 우유, 및 50 ㎕의 박테리아 용출물이 적용되었다. 1 시간 동안 인큐베이션하고 세척한 후, 결합된 Fyn SH-3-유래 폴리펩티드가 항-생쥐-HRP 컨쥬게이트(Sigma)에 의해 탐지되었다. 페록시데이즈 활성의 탐지는 BM blue POD 기질 (Roche)을 첨가하여 수행되었으며 반응은 1 M H2SO4를 첨가하여 중단되었다. 특이적 결합제의 DNA 서열은 DNA 서열분석에 의해 확인되었다.
결과:
IL-17A에 결합하는 ELISA 양성 Fyn SH3-유래 폴리펩티드의 아미노산 서열이 첨부되는 서열 목록의 SEQ ID NO: 3 내지 9에 나타난다.
실시예 2: 글리코실화 인간 IL-17A에 높은 친화력으로 결합하는 본원의 Fyn SH3-유래 폴리펩티드
본 실시예는 Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드의 발현 수율(expression yields) 및 이러한 폴리펩티드를 크기 배제 크로마토그램 및 표면 플라즈몬 공명 실험에 의해 특성분석한 것을 보여준다.
방법
a) Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드의 발현 수율
Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드는 Grabulovski 등(Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204)에 기술된 것과 같이 TG1 대장균 박테리아의 세포질 내에서 발현되고 또한 정제되었다.
b) 크기 배제 크로마토그래피(SEC)
모체 Fyn SH3-유래 IL-17A 결합 폴리펩티드 1L3-B9 (SEQ ID NO: 3)을 위해 크기 배제 크로마토그래피(SEC)가 ?TA FPLC 시스템 상에서 Superdex 75 Short Column (5/150) (GE Healthcare)을 이용하여 수행되었다. 친화도 성숙된 클론 11L0-C06 (SEQ ID NO: 4), 11L5-B06 (SEQ ID NO: 5), 11L6-F03 (SEQ ID NO: 6), 11L9-C09 (SEQ ID NO: 7), 11L10-A05 (SEQ ID NO: 8) 및 11L11-A09 (SEQ ID NO: 9)의 SEC가 an Agilent Technologies 1200 Infinity Series HPLC instrument 상에서 SEC-3 컬럼 (Agilent)을 이용하여 수행되었다.
c) 친화도 측정
친화도 측정이 BIAcore T200 instrument (GE Healthcare)를 이용하여 수행되었다. 글리코실화 IL-17A(HEK EBNA 세포에서 자체 생산됨) 및 단량체 Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드 간의 상호작용 분석을 위하여, Series S CM5 chip (GE Healthcare)가 Amine coupling kit (GE healthcare)에 의해 고정화된 2000 RU IL-17A와 함께 사용되었다. 러닝(running) 완충액은 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS였다. 상호작용은 30 ㎕/분의 흐름에서 상이한 농도의 Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드를 주입하여 측정되었다. 본원의 모든 동역학 데이터는 BIAcore T200 evaluation software를 사용하여 평가되었다.
결과
a) 발현 수율
본원의 단량체 Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드의 발현 수율은 진동 플라스크(shake flask) 내에서 비-최적화 조건 하에서 박테리아 배양의 14 내지 57 mg/리터의 범위였다 (표 1).
TG1 대장균 박테리아 내에서 생성된 Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드의 발현 수율
Fynomer SEQ ID NO. 수율 (mg/l)
1L3-B09 3 57
11L0-C06 4 43
11L5-B06 5 36
11L6-F03 6 14
11L9-C09 7 14
11L10-A05 8 32
11L11-A09 9 35
b) 크기 배제 크로마토그래피(SEC)
크기 배제 크로마토그래피(SEC) 프로필은 모든 구조체(construct)가 주로 단일의, 단량체 피크로 용출되었음을 증명하였다 (도 1).
c) 친화도 측정
결합 특성이 BIAcore 칩 상에서 실-시간 상호작용 분석에 의해 분석되었으며 선택된 IL-17A-결합 폴리펩티드에서 아래와 같은 해리 상수(KD)를 나타내었다:
재조합 인간 글리코실화 IL-17A (HEK EBSA 세포에서 생산)에 대한 Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드 결합의 동역학적 상수
Fynomer SEQ ID NO. KD (nM)
1L3-B09 3 245
11L0-C06 4 7
11L5-B06 5 12
11L6-F03 6 11
11L9-C09 7 11
11L10-A05 8 7
11L11-A09 9 24
실시예 3: 본원의 Fyn SH3-유래 폴리펩티드의 글리코실화 IL-17A 억제
모체 클론 1L3-B09 및 IL-17A에 가장 높은 친화도를 가지는 다섯 종의 친화도 성숙된 본원의 Fyn SH3-유래 폴리펩티드(11L0-C06 (SEQ ID NO: 4), 11L5-B06 (SEQ ID NO: 5), 11L6-F03 (SEQ ID NO: 6), 11L9-C09 (SEQ ID NO: 7), 11L10-A05 (SEQ ID NO: 8))에서 그들의 IL-17A 억제 능력이 시험되었다: IL-17A와 TNFα는 섬유아세포 내에서 용량-의존적 방식으로 IL-6의 생성을 유도하였다. 지정된 Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드의 억제 활성은, 본원의 Fyn SH3-유래 IL-17A 결합 폴리펩티드의 다양한 농도의 존재 또는 부재 하에서 인간 피부 섬유아세포를 재조합 글리코실화 IL-17A(HEK EBNA 세포에서 자체적으로 생산) 및 재조합 TNFα( Thermo Fisher Scientific)로 자극함으로써 시험되었다. 세포 배양 상등액은 자극 24 시간 후에 채취되었으며 상등액 내의 IL-6 농도는 ELISA에 의해 측정되었다. 그 결과 IL-17A 결합 폴리펩티드가 글리코실화 IL-17A를 특이적으로 억제하였음을 보여준다.
방법
내독소 제거를 위해, 단백질 용액은 Acrodisc Mustang E membrane (VWR)을 이용하여 3 번 여과되었다. LAL(Limulus amebocyte lysate) 시험(PYROGENT Single test Gel Clot LAL Assay (Lonza))에 의해 측정된 바에 따르면, 여과 후 본원의 억제성 Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드를 함유하는 단백질 용액의 내독소 수준은 0.1 EU/ml 미만이었다.
웰(96 웰 플레이트, TPP 또는 Corning) 당 약 3900 일반 인간 피부 섬유아세포(Normal Human Dermal Fibroblasts, PromoCell, NHDF-c, C12300)를 함유하는 100 ㎕의 세포 현탁액이 분배되었으며 37℃에서 24 시간 동안 배양되었다(배지: 섬유아세포 성장 배지 C-23010, PromoCell). 상등액이 흡입되고 이어서 상이한 농도의 본원의 Fyn SH3 유래 IL-17A-결합 폴리펩티드와 IL-17A 및 TNFα 함유 배지(각각 최종 농도 1 ng/ml 및 50 pg/ml)와 혼합되고, 웰 당 해당 용액 100㎕가 첨가되었다. 대조군으로서 PBS가 IL-17A/TNFα 함유 배지 (양성 대조군 = "억제제 없음") 및 단일 사이토카인 IL-17A 또는 TNFα 단독을 포함하는 배지와 혼합되었다 (후자는 "TNFα 대조군" 웰). 음성 대조군으로서 PBS가 배지와 단독으로 혼합되었다. 비교를 위하여, 동일한 조건에서 비-글리코실화 IL-17A(R&D Systems)를 이용하여 분석이 수행되었다. 37℃에서 24시간 인큐베이션 후에 상등액은 IL-6 농도를 측정하기 위해 IL-6 ELISA 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 ELISA 분석되었다(IL-6 ELISA kit, R&D Systems). 억제 백분율이 플롯되었으며 IC50 값은 Prism 6 소프트웨어를 사용하여 계산되었다.
IL-17A 억제의 백분율은 하기 공식에 의해 결정되었다.
억제 (%)= 100 - ((A450-650nm (샘플) - A450-650 nm (TNFα 대조군)) x 100)
(A450-650 nm (양성 대조군) - A450-650 nm (TNFα 대조군))
결과
일반 인간 피부 섬유아세포가 IL-17A/TNFα 및 상이한 농도의 지정된 본원의 Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드와 함께 인큐베이션되었다. 본원의 Fyn SH3-유래 폴리펩티드가 글리코실화 IL-17A를 억제하는 것이 관찰되었다. IC50 값이 표 3에 나타나 있다. 도 2는 지정된 본원의 Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드가 글리코실화 및 비-글리코실화 IL-17A 모두를 억제하는 용량-의존 억제 커브를 보여준다. 본원에 기술된 Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드는 비-글리코실화 IL-17A와 유사한 능력으로 글리코실화 IL-17A를 완전하게 억제할 수 있다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. 이는 종전에 발명된 Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드(WO2011/023685)에 비해 우수한 특성이다. 도 3은 WO2011/023685에 기술된 Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드의 세 가지 예(Fyn SH3 유래 IL-17 결합제 2C12C1 (WO2011/023685에서 SEQ ID NO: 107로 기술됨), Fyn SH3 유래 IL-17 결합제 A1_2 (WO2011/023685에서 SEQ ID NO: 53로 기술됨) 및 Fyn SH3 유래 IL-17 결합제 B1_2 ("B1")(WO2011/023685에서 SEQ ID NO: 39로 기술됨)가 높은 농도에서도 글리코실화 IL-17A를 완전하게 억제하지 못하거나 및/또는 글리코실화 및 비-글리코실화 IL-17A 간에 억제 능력(IC50 값)이 큰 차이를 나타내는 것을 보여준다 (도 3 참조).
Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드에 대해 수득된 글리코실화 IL-17A 억제에 대한 IC50 값
Fynomer SEQ ID NO. IC50 값 (nM)
1L3-B09
(모체 클론)		 3 300
11L0-C06 4 35
11L5-B06 5 43
11L6-F03 6 63
11L9-C09 7 32
11L10-A05 8 28
실시예 4: 이특이적 항-IL-17A/TNFα 항체-Fyn SH3유래 IL-17A-결합 폴리펩티드 융합체의 발현 및 정제 수율
Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드 (11L5-B06 (SEQ ID NO: 5) 및 11L9-C09 (SEQ ID NO: 7))가 TNFα 항체의 경사슬(SEQ ID NO: 11)의 C-말단과 15 아미노산 링커(링커: SEQ ID NO: 15)를 통해 유전적으로 융합되었다. 제조된 이특이적 항-IL-17A/TNFα 구조체는 LC11L5-B06(각각 SEQ ID NO: 12 및 16으로 구성된 중사슬 및 경사슬을 가지는 이특이적 구조체(본원에 따른)) 및 LC11L9-C09(각각 SEQ ID NO: 12 및 17로 구성된 중사슬 및 경사슬을 가지는 이특이적 구조체(본원에 따른))로 명명된 제조된 이특이적 항-IL-17A/TNFα 구조체는 일시적으로 FreeStyle CHO-S 세포 내로 형질주입되었으며 무혈청/동물성분 없는 배지에서 6 내지 10 일 동안 발현되었다. Akta Purifier instrument (GE Healthcare) 상에서 단백질 A 친화성 크로마토그래피(Mab Select Sure 컬럼; GE Healthcare) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC; Superdex G200, 30/100 GL 컬럼; GE Healthcare) 에 의해 상등액으로부터 단백질이 정제되었다. 농도는 280 nm에서 흡광도를 측정하여 결정되었다. 수율은 표 4에 나열되어 있다.
일시적으로 형질주입된 CHO-S 세포 내에서 생성된 이특이적 항체-Fyn SH3 유래 IL-17A-결합 폴리펩티드 융합체의 정제 수율
SEQ ID NOs
(중사슬, 경사슬)		 수율 (mg/l)
LC11L5-B06 12, 16 110
LC11L9-C09 12, 17 110
정제 후에 ?TA FPLC 시스템 및 Superdex G200, 30/100 GL 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피가 수행되었다. 정제 후의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 프로필은 두 융합 단백질 모두가 우수한 생물물리학적 특성을 가진다는 것을 보여주는 단일의, 단량체 피크로 용출된다는 것을 입증한다 (도 4).
실시예 5: 인간 및 시노몰구스 IL-17A 및 TNFα에 대한 항체-Fyn SH3 유래 IL-17A-결합 폴리펩티드 융합체의 친화도 측정
IL-17A(인간 및 시노몰구스) 및 TNFα(인간 및 시노몰구스)에 대한 LC11L5-B06 및 LC11L9-C09의 친화도가 BIAcore T200 instrument (GE Healthcare)를 이용하여 측정되었다. Series S CM5 칩 (GE Healthcare)이 8000 RU의 염소 항-인간 IgG Fc-특이적 항체(Jackson Immunoresearch)에 의해 코팅되었다. 러닝 완충액은 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS였다. 상호작용은 유속 30 ㎕/분에서 400 내지 500 RU의 LC11L5-B06 또는 LC11L9-C09을 포획(capturing)하고, 이어서 유속 30 ㎕/분에서 상이한 농도의 항원을 주입하여 측정되었다. 상호작용의 모든 동역학적 데이터는 BIAcore T200 evaluation software를 사용하여 평가되었다. 친화도는 인간 항원에 대해서 표 5에 그리고 시노몰구스 항원에 대해서 표 6에 나열되었다.
재조합 인간 글리코실화 IL-17A, 및 인간 TNFα에 대한 항체-Fyn SH3 IL-17A-결합 폴리펩티드 융합체 결합의 해리상수
SEQ ID NOs
(중사슬, 경사슬)		 글리코실화 인간 IL-17A에 대한 KD 값 (pM) 인간 TNFα에 대한 KD 값 (pM)
LC11L5-B06 12, 16 44 144
LC11L9-C09 12, 17 48 89
재조합 시노몰구스 글리코실화 IL-17A, 및 시노몰구스 TNFα에 대한 항체-Fyn SH3 유래 IL-17A-결합 폴리펩티드 융합체 결합의 해리상수
SEQ ID NOs
(중사슬, 경사슬)		 글리코실화 시노몰구스 IL-17A에 대한 KD 값 (pM) 글리코실화 시노몰구스 TNFα에 대한 KD 값 (pM)
LC11L5-B06 12, 16 63 120
LC11L9-C09 12, 17 70 133
실시예 6: IL-17A 및 TNFα를 동시에 억제하는 LC11L5-B06 및 LC11L9-C09
IL-17A 및 TNFα는 HT-29 세포(인간 대장선암 세포주)에서 용량-의존적 방식으로 Gro-α의 생성을 유도한다. 지정된 구조체(LC11L5-B06 및 LC11L9-C09)의 억제 활성은, 다양한 농도의 LC11L5-B06 및 LC11L9-C09의 존재 또는 부재 하에 글리코실화 IL-17A 및 TNFα로 HT-29 세포(인간 대장선암 세포주)를 자극함으로써 시험되었다. 세포 배양 상등액은 자극 48 시간 후에 채취되었으며 ELISA로 Gro-α 분석되었다.
방법
LC11L5-B06 또는 LC11L9-C09는 분석 배지(10% FBS를 첨가한 McCoy? 5A 배지 (GIBCO)) 내에 희석되었다. 지정된 농도 각각 50 ㎕이 IL-17A(HEK EBNA 세포에서 자체적으로 생산) 및 TNFα(Thermo Fisher Scientific)을 함유하는 50 ㎕의 분석 배지와 최종 농도 각각 400 pM 및 200 pM로 혼합되었다. 대조군으로서, 억제제를 포함하지 않는 배지가 준비되었다. 추가로, 단일 사이토카인만을 가지는 또는 사이토카인을 가지지 않는 배지가 준비되었다. 1 시간 인큐베이션 후, 약 20,000 HT-29 세포 (ATCC, #HTB-38)를 포함하는 세포 현탁액이 용액에 첨가되고 웰(98 웰 플레이트, TPP 또는 Corning) 각각에 분산되었으며 48 시간 동안 37℃ 및 5%의 CO2에서 배양되었다. 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션 한 후 상등액이 제거되고 Gro-α 농도가 제조자의 지시에 따라 ELISA에 의해 측정되었다(Gro-a ELISA kit, R&D Systems).
결과
도 5는 IL-17A, TNFα 및 이들의 조합으로 HT-29 세포를 자극한 후의 상등액 내의 Gro-알파 농도를 보여준다(ELISA 신호로 표시됨). 도 5에 나타난 바와 같이, 이특이적 구조체 LC11L5-B06 및 LC11L9-C09는 IL-17A 및 TNFα를 동시에 용량-의존적 방식으로 억제할 수 있었다. 수득된 명백한 IC50 값(표 7)은 본원의 이특이적 화합물이 IL-17A와 TNFα를 높은 수준으로 억제할 수 있었음을 보여준다.
이특이적 항체-Fyn SH3 유래 IL-17A-결합 폴리펩티드 융합체에서 수득된 IL-17A 및 TNFα 동시 억제의 명백한 IC50 값
SEQ ID NOs
(중사슬 및 경사슬)		 IL-17A 및 TNFα 동시 억제의 명백한 IC50 값 (pM)
LC11L5-B06 12, 16 247
LC11L9-C09 12, 17 222
실시예 7: 인 비보에서 IL-17A 및 TNFα를 억제하는 LC11L5-B06 및 LC11L9-C09
인 비보에서 IL-17A 및 TNFα를 억제하는 LC11L5-B06 및 LC11L9-C09의 능력이 C57BL/6 생쥐의 급성 염증 모델을 이용해 측정되었다. 인간 IL-17A는 생쥐 IL-17 수용체에 결합하고 자극한다. 생쥐에 주입되면, IL-17A는 케모카인 KC(CXCL1)의 대규모 증가를 유발하며, 이는 1-4 시간 내에 주입된 생쥐의 혈청 내 및 세정액(lavage fluid)에서 탐지가능하다. 인간 TNFα도 생쥐에 주입되었을 때 KC-혈청 수준이 크게 증가하기 때문에 유사한 현상이 관찰된다.
방법
생쥐(C57BL/6, Charles River)에 억제제 LC11L5-B06 (2 mg/kg), LC11L9-C09 (2 mg/kg) 또는 TNF 억제의 대조군으로서 내독소-없는 PBS에 희석된 상업적으로 사용가능한 항-TNFα 항체(2 mg/kg) (adalimumab (HUMIRA®) 가 정맥주사되었다 (그룹당 생쥐 5 마리). 억제제를 정맥주사한 후 3.5 시간 뒤에, 인간 IL-17A 또는 인간 TNFα를 피하주사하여 KC 발현을 자극하였다 (생쥐당 3 μg IL-17A 또는 생쥐당 0.25 μg TNFα). 2 시간 후, 혈청 샘플링을 위해 혈액을 채취하고 상업적으로 이용가능한 KC ELISA 키트를 이용하여 제조자의 지시에 따라 KC 농도를 측정하였다 (Quantikine mouse KC immunoassay, R&D Systems).
결과
생쥐에 인간 IL-17A 및 TNFα를 피하주사한 후 동물들은 KC라고 불리는 케모카인을 과발현하였다. 생쥐 혈청 내에서 상승된 KC 수준은 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 이전의 본원의 Fyn SH3-유래 폴리펩티드 융합체(LC11L5-B06 및 LC11L9-C09) 및 대조군 항-TNFα 항체의 정맥주사(도 6b 및 6d)는 인 비보에서 KC의 발현 증가(up-regulation)를 방지하였다. 도 6은 LC11L5-B06 ("LC-B06"로 명명됨) 및 LC11L9-C09 ("LC-C09"로 명명됨)의 잠재적 억제 특성을 보여준다.
실시예 8: 인 비보에서 항체-유사 PK 프로필을 나타내는 LC11L5-B06 및 LC11L9-C09
단일 정맥주사 이후 상이한 시간 포인트에서 채취된 생쥐 혈청을 이용하여 ELISA에 의해 농도를 측정함으로써 본원의 융합 단백질인 LC11L5-B06 및 LC11L9-C09의 인 비보 약물동력학적 특성이 판단되었다.
방법
LC11L5-B06 및 LC11L9-C09가 10 mg/kg의 용량으로 5 마리의 생쥐(C57BL/6, Charles River)에 정맥주사되었다. 10 분, 6, 24, 48, 96, 120, 144 및 168 시간 후에 약 20 ㎕의 혈액이 복재정맥(vena saphena)으로부터 모세관 CB 300 (Sarstedt)를 이용하여 채취되었다. 혈액 샘플은 10 분 동안 9500 x g로 원심분리되었고 혈청은 ELISA 분석이 수행되기 전까지 -20℃에서 보관되었다. LC11L5-B06 및 LC11L9-C09의 알려진 농도의 희석 시리즈(dilution series)를 이용하여, 포획제로서 TNFα 및IL-17A를 모두 사용하여 ELISA에 의해 결정되었다: 비오틴화 IL-17A 50 ㎕(120 nM) (R&D Systems, 제조자의 지시에 따라 EZ-link NHS-PGE4-비오틴 (Pierce)을 이용하여 비오틴화) 또는 비오틴화 TNFα 50 ㎕ (10 nM) (Thermo Scientific, 제조자의 지시에 따라 EZ-link NHS-PGE4-비오틴 (Pierce)을 이용하여 비오틴화)가 스트렙타비딘-코팅된 웰(Reactibind, Pierce)에 첨가되었으며 200 ㎕의 PBS, 4% 우유(Rapilait, Migros, Switzerland)로 블로킹된 후 50 ㎕의 희석 혈청 샘플(PBS 내, 4% 우유)이 첨가되었다. 1 시간 동안 인큐베이션 한 후 PBS로 세척하고, 결합된 항체 Fynomer 융합 단백질이 단백질 A-HRP 컨쥬게이트(Sigma)에 의해 탐지되었다. 페록시데이즈 활성이 QuantaRed 강화된 화학형광(chemifluorescent) HRP 기질 (Pierce)의 첨가에 의해 탐지되었다. 형광 강도는 1 내지 5 분 후에 544 nm(여기) 및 590 nm(방출)에서 측정되었다. 혈청 내에서 상이한 시간 포인트에서 결정된 LC11L5-B06 및 LC11L9-C09의 농도 및 그리고 이로부터 도출된 제거 단계(elimination phase, 반 대수 척도(semi-logarithmic scale)로 플롯됨)의 기울기 k(slope k)로부터, 반감기가 식 t1/2 = ln2/-k를 이용하여 계산되었다.
결과
LC11L5-B06 및 LC11L9-C09의 혈청 농도가 도 7에 보여진다. 제거 단계(베타 단계, 시간 포인트 24 시간 - 168 시간)로부터 결정된 반감기는 두 융합 단백질 모두에서 4.9일 및 9.6 사이의 범위였으며 (표 8 참조), 이는 생쥐에 주입되는 표준 항체 치료에서의 반감기 값으로 보고된 것과 동일한 범위이다. 이들 데이터는 LC11L5-B06 및 LC11L9-C09가 IgG-유사 인 비보 PK 특성을 가진다는 것을 보여준다.
이특이적 항체-Fyn SH3 유래 IL-17A-결합 폴리펩티드 융합체의 최종 반감기 값
SEQ ID NOs
(중사슬, 경사슬)		 반감기 (일)
LC11L5-B06
(IL-17A 탐지)		 12, 16 6.2
LC11L5-B06
(TNFα 탐지)		 12, 16 9.6
LC11L9-C09
(IL-17A 탐지)		 12, 17 4.9
LC11L9-C09
(TNFα 탐지)		 12, 17 9.6
실시예 9: 본원의 Fyn-SH3 유래 폴리펩티드 11L11-A09의 글리코실화 IL-17A의 억제
Fynomer 11L11-A09 (SEQ ID NO: 9)의 IL-17A 억제활성이 시험되었다.
방법
실험 조건은 본원의 다른 Fyn SH3-유래 폴리펩티드(SEQ ID NO: 3 - 8)에 대한 실시예 3에 기술된 것과 동일하였다.
결과
일반 인간 피부 섬유아세포가 IL-17A/TNFα와 상이한 농도의 본원의 Fyn-SH3 유래 폴리펩티드 11L11-A09 (SEQ ID NO: 9)와 함께 인큐베이션되었다. 11L11-A09 (SEQ ID NO: 9)가 66 nM의 IC50 값으로 글리코실화 IL-17A를 억제하는 것이 관찰되었다 (표 9). 도 9는 본원의 Fyn-SH3 유래 폴리펩티드 11L11-A09 (SEQ ID NO: 9)의 용량-의존적 억제 커브를 보여주며, 글리코실화 및 비-글리코실화 IL-17A를 모두 유사한 효능과 효과로 억제하였다.
Fyn SH3-유래 IL-17A-결합 폴리펩티드 11L11-A09 (SEQ ID NO: 9)에 대해 수득된 글리코실화 IL-17A 억제에 대한 IC50 값.
Fynomer SEQ ID NO. IC50 값 (nM)
11L11-A09 9 66
실시예 10: 글리코실화 IL-17A를 높은 효능으로 억제하는 LC11L5-B06 및 LC11L9-C09
본 실시예는 본원의 Fyn SH3-유래 폴리펩티드의 글리코실화 IL-17A에 대한 특이적 억제 능력을 추가적으로 입증하는 것이다. 이특이적 항-IL-17A/TNFα 구조체 LC11L5-B06(각각 SEQ ID NO: 12 및 16의 서열로 구성된 중사슬 및 경사슬을 가지는 (본원에 따른) 이특이적 구조체) 및 LC11L9-C09 (각각 SEQ ID NO: 12 및 17의 서열로 구성된 중사슬 및 경사슬을 가지는 (본원에 따른) 이특이적 구조체)가 실시예 4에 기술된 것과 같이 발현 및 정제되었다. 일반 인간 피부 섬유아세포(NHDF 세포)를 다양한 농도의 LC11L5-B06 또는 LC11L9-C09의 존재 또는 부재 하에서 재조합 글리코실화 IL-17A (HEK EBNA 세포로부터 자체적으로 생산) 및 재조합 IL-1β(R&D Systems)으로 자극시킴으로써 LC11L5-B06 및 LC11L9-C09의 억제 활성이 시험되었다. 세포 배양 상등액은 자극 16 ~ 24 시간 후에 제거되었고 상등액 내의 IL-6 농도가 ELISA에 의해 측정되었다. 그 결과, 본원의 IL-17A 결합 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이 글리코실화 IL-17A를 특이적으로 억제할 수 있다는 것을 보여준다.
방법
3900 일반 인간 피부 섬유아세포(PromoCell, NHDF-c, C12300)를 함유하는 세포 현탁액 100 ㎕가 웰 당(96 웰 플레이트, TPP) 분산되었고, 24 시간 동안 37℃/5% CO2에서 배양되었다 (배지: Fibroblast Growth Medium C-23010, PromoCell). 상등액이 흡인되고 이어서 상이한 농도의 LC11L5-B06 또는 LC11L9-C09 (최종 농도는 도 10에 나타남)과 IL-17A 및 IL-1β 함유 배지(최종 농도: IL-17A: 64 pM, IL-1β: 10 fM)를 혼합하고, 해당하는 용액 100 ㎕를 세포에 첨가하였다 (3 반복). 대조 실험으로서, PBS가 IL-17A/IL-1β 함유 배지("IL-17A/IL-1β")및 단일 사이토카인 "IL-17A" 또는 "IL-1β" 단독을 포함하는 배지(후자는 "IL-17A" 및 "IL-1β" 대조군 웰(well)이 되었다)와 혼합되었다. 음성 대조군으로서, PBS와 배지 단독("배지")와 혼합되었다. 37℃/5% CO2에서 16~24 시간 동안 인큐베이션한 후 상등액의 IL-6 농도가 IL-6 ELISA 키트를 이용하여 제조자의 지시에 따라 측정되었다(IL-6 ELISA kit, R&D Systems). IC50 값의 계산을 위하여, 억제 백분율이 측정되었으며 소프트웨어 Prism 5를 이용하여 IC50 값이 계산되었다.
IL-17A 억제 백분율은 아래의 식에 의해 정해졌다:
억제 (%)= 100 - ((A450-650nm (샘플) - A450-650 nm (IL-1β)) x 100)
(A450-650 nm (IL-17A/IL-1β) - A450-650 nm (IL-1β))
결과
도 10은 NHDF 세포 상등액 내의 IL-6 농도를 측정하기 위해 수득한 ELISA 값(흡광도)를 나타낸다. 도 10에 나타난 바와 같이, 이특이적 구조체 LC11L5-B06 및 LC11L9-C09는 IL-17A 매개 IL-6 생성을 용량-의존적 방식으로 억제할 수 있었으며, 이는 이들이 글리코실화 IL-17A를 특이적으로 억제할 수 있었음을 증명한다. 예상하던 대로, IL-1β 유도 IL-6 방출은 억제되지 않았다. IL-17A 억제에 대해 수득된 IC50 값 (표 10)은 본원의 이특이적 화합물들이 IL-17A를 높은 효능으로 억제할 수 있었음을 보여준다.
이특이적 항체-Fyn SH3 유래 IL-17A 결합 폴리펩티드 융합체에 대해 수득된 IL-17A 억제에 대한 IC50 값.
SEQ ID NOs
(중사슬, 경사슬)		 IL-17A의 억제에 대한 IC50 값 (pM)
LC11L5-B06 12, 16 121
LC11L9-C09 12, 17 66
실시예 11: 인 비보에서 안정하고 시노몰구스 원숭이 내에서 긴 반감기를 나타내는 LC11L5-B06 및 LC11L9-C09
본원의 융합 단백질 LC11L5-B06 및 LC11L9-C09의 약물동력학적 특성이 시노몰구스 원숭이에서 단일 정맥주사 후 상이한 시간 포인트에서 이들의 농도를 측정함으로써 확인되었다. LC11L5-B06 및 LC11L9-C09를 알려진 농도로 단계희석하여, 완전히 기능적이고 온전한 이특이적 분자 LC11L5-B06 및 LC11L9-C09만을 측정하는 "샌드위치 ELISA"를 이용하여 혈장 내의 농도를 측정하였다. LC11L5-B06 및 LC11L9-C09가 온전하게 존재하고 본원의 Fyn SH3-유래 폴리펩티드가 인 비보(시노몰구스 원숭이 내)에서 항체로부터 절단되지 않았음을 추가적으로 증명하기 위해서, 융합 단백질의 항체 구성요소만을 탐지하는 추가적인 ELISA("직접 ELISA")가 개발되었다. 두 ELISA 탐지 방법이 도 11에 도시되어 있다.
방법
이특이적 항-IL-17A/TNFα 구조체 LC11L5-B06(각각 SEQ ID NO: 12 및 16의 서열로 구성된 중사슬 및 경사슬을 가지는 (본원에 따른) 이특이적 구조체) 및 LC11L9-C09 (각각 SEQ ID NO: 12 및 17의 서열로 구성된 중사슬 및 경사슬을 가지는 (본원에 따른) 이특이적 구조체)가 실시예 4에 기술된 바와 같이 발현 및 정제되었다. LC11L5-B06 및 LC11L9-C09는 3 mg/kg의 용량으로 3 마리의 수컷 시노몰구스 원숭이에 정맥주사되었다. 투여 후 지정된 시간-포인트에서 말초 정맥으로부터 혈액이 채취되었다 (샘플당 채집 부피 0.6 ml). 항응고제로서 EDTA 용액(7.5%)가 사용되었다. 혈액 채취 후, 샘플들은 4℃에서 10 분 동안 1200 g로 원심분리되었으며, 혈장은 ELISA에 의해 분석될 때 까지 -80℃에서 보관되었다.
"샌드위치 ELISA": 뉴트라비딘-코팅된 웰(Biomat MCP44-11)이 150㎕/웰의 블로킹 버퍼(1 x PBS - 5% BSA)로 60 분 동안 실온(RT)에서 300 rpm으로 가볍게 회전-궤도(roto-orbital) 진탕(shaking)하여 블로킹되었다. 웰은 200 ㎕/웰의 세척 버퍼(1 x PBS - 0.1% Tween 20)로 세척되었고 이어서 분석 버퍼(1 x PBS - 1% BSA)에 희석된 0.2㎍/ml의 비오티닐화 TNF-알파(PeproTech, ANP technologies의 비오틴 라벨링 키트를 이용하여 제조자의 지시에 따라 비오티닐화됨)를 함유하는 용액 100 ㎕/웰에서 가볍게 진탕하며 60 분 동안 실온에서 인큐베이션되었다. 세척 버퍼 200 ㎕/웰로 3 회 세척한 후, 분석 버퍼에 1 : 4로 희석된 샘플이 웰(100 ㎕/웰)로 제공되었고 1 시간 동안 가볍게 진탕하며 인큐베이션 되었다. 분석 버퍼에 희석된 디곡시제닌화 IL-17A(PrepoTech, Solulink 에서 구매한 Digoxigenin Labeling Kit를 이용하여 공급자가 추천하는 프로토콜에 따라 디곡시제닌 라벨링됨) 64 ng/ml을 함유하는 용액 100 ㎕/웰을 첨가하기 전에 플레이트는 세척 버퍼로 3 회(200 ㎕/웰) 세척되었다. 이어서 추가적으로 가볍게 진탕하며 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세척 버퍼로 3 회 세척(200 ㎕/웰)한 후, 플레이트는 분석 버퍼에 1 : 10000로 희석된 항-디곡시제닌 HRP-컨쥬게이트 항체 (Roche) 100 ㎕/웰과 함께 인큐베이션되었다. 인큐베이션은 300 rpm에서 60 분 동안 실온에서 수행되었다. 플레이트는 세척 버퍼로 3 회 세척(200 ㎕/웰)하고 100 ㎕/웰의 TMB (Sigma)가 즉시 첨가되어 실온에서 5~10 분 동안 어둠 속에서 인큐베이션 되었다. 중단 용액(Stop Solution)의 알리쿼트(aliquot, 100 ㎕/웰)이 효소 반응을 중단시키기 위해 각각의 웰에 최종적으로 첨가되었다. 흡광도(optical density)가 Victor2V (Wallac Perkin Elmer) 미세적정 플레이트 리더(microtiter plate reader)를 이용하여 450 nm에서 측정되었다.
"직접 ELISA": 뉴트라비딘-코팅된 웰(Biomat MCP44-11)이 150㎕/웰의 블로킹 버퍼(1 x PBS - 5% BSA)로 60 분 동안 실온(RT)에서 300 rpm으로 가볍게 회전-궤도(roto-orbital) 진탕(shaking)하여 블로킹되었다. 웰은 200 ㎕/웰의 세척 버퍼(1 x PBS - 0.1% Tween 20)로 세척되었고 이어서 분석 버퍼(1 x PBS - 1% BSA)에 희석된 0.2㎍/ml의 비오티닐화 TNF-알파를 함유하는 용액 100 ㎕/웰에서 가볍게 진탕하며 60 분 동안 실온에서 인큐베이션되었다. 세척 버퍼 200 ㎕/웰로 3 회 세척한 후, 분석 버퍼에 1 : 4로 희석된 샘플이 웰(100 ㎕/웰)로 제공되었고 1 시간 동안 가볍게 진탕하며 인큐베이션 되었다. 분석 버퍼에 희석된 44 ng/ml의 HRP-컨쥬게이트 항-인간 IgG 원숭이-흡착 항체(ABCam) 용액 100 ㎕/웰을 첨가하기 전에 플레이트는 세척 버퍼로 3 회(200 ㎕/웰) 세척되었다. 이어서 추가적으로 가볍게 진탕하며 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트는 세척 버퍼로 3 회 세척(200 ㎕/웰)하고 100 ㎕/웰의 TMB (Sigma)가 즉시 첨가되어 실온에서 5~10 분 동안 어둠 속에서 인큐베이션 되었다. 중단 용액(Stop Solution)의 알리쿼트(aliquot, 100 ㎕/웰)이 효소 반응을 중단시키기 위해 각각의 웰에 최종적으로 첨가되었다. 흡광도(optical density)가 Victor2V (Wallac Perkin Elmer) 미세적정 플레이트 리더(microtiter plate reader)를 이용하여 450 nm에서 측정되었다.
ELISA 방법에 의하여 측정된 혈장 농도를 이용하여 LC11L5-B06 및 LC11L9-C09의 약물동력학적 분석이 Watson package (v. 7.4, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 수행되었다.
방법
LC11L5-B06 및 LC11L9-C09의 혈장 농도가 도 12에 나타나 있다. 표준 단일클론 항체 치료에서 전형적으로 보고된 바와 같이, 두 화합물 모두는 혈액으로부터 그리고 시노몰구스 원숭이 내에서의 최종 반감기에서 적은 차이(low clearance)를 나타내었다. 중요하게는, 두 ELISA 방법을 사용하여 수득한 혈장 농도가 매우 유사하였으며, 이로부터 LC11L5-B06 및 LC11L9-C09가 인 비보에서 적어도 220 시간 동안 안정하며 Fyn SH3 유래 폴리펩티드가 시노몰구스 원숭이 내의 항체에 의해 절단되지 않음이 증명되었다 (도 13).
SEQUENCE LISTING <110> Covagen AG <120> Novel IL-17 binding molecules and medical uses thereof <130> U2194 PCT <150> EP 12185425.1 <151> 2012-09-21 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> /note="Description of artificial sequence: sequence alignment" <220> <221> variant <222> 12 <223> /replace="Cys" /replace="Asp" /replace="Glu" /replace="Phe" /replace="Gly" /replace="His" /replace="Ile" /replace="Lys" /replace="Leu" /replace="Met" /replace="Asn" /replace="Pro" /replace="Gln" /replace="Arg" /replace="Ser" /replace="Thr" /replace="Val" /replace="Trp" /replace="Tyr" <220> <221> variant <222> 13 <223> /replace="Cys" /replace="Asp" /replace="Glu" /replace="Phe" /replace="Gly" /replace="His" /replace="Ile" /replace="Lys" /replace="Leu" /replace="Met" /replace="Asn" /replace="Pro" /replace="Gln" /replace="Arg" /replace="Ser" /replace="Thr" /replace="Val" /replace="Trp" /replace="Tyr" <220> <221> variant <222> 14 <223> 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Claims (15)

  1. 글리코실화 IL-17A의 활성을 억제하는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는:
    (a) GVTLFVALYDY(X1)(X2)(X3)(X4)(X5)(X6)DLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARS LTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 1),
    여기서 아미노산 위치 (X1) 내지 (X6)는 임의의 아미노산 서열일 수 있고; 그리고
    (b) (a)의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열로서, 동일성 판단에서 아미노산 위치 (X1) 내지 (X6) 는 제외하고 그리고 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 31 내지 36의 아미노산 서열 STHEYE (SEQ ID NO: 2)은 보존된 아미노산 서열
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 또는 이로 구성되는, 폴리펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    (X1) 는 A, K, S, D 또는 E;
    (X2) 는 N, Q, A, K, S 또는 R;
    (X3) 는 H, K, R, L 또는 V;
    (X4) 는 G 또는 S;
    (X5) 는 H, Q, A, W, V 또는 N; 그리고
    (X6) 는 R, L 또는 S인, 폴리펩티드.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3 내지 SEQ ID NO: 9의 어느 하나로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 또는 이로 구성되는, 폴리펩티드.
  4. 추가 화합물과 융합된 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는, 융합 구조체(fusion construct).
  5. 제 4 항에 있어서, 추가 화합물은 약제학적 활성 화합물, 프로드러그, 약제학적으로-허용가능한 담체, 진단학적 활성 화합물, 세포 통과 촉진제, 및/또는 혈장 반감기 조절 화합물인 것인, 융합 구조체.
  6. 제 4 항에 있어서, 추가 화합물은
    (a) 형광 염료,
    (b) 광감응제,
    (c) 방사성 핵종,
    (d) 의료 영상용 조영제,
    (e) 사이토카인,
    (f) 독성 화합물,
    (g) 케모카인,
    (h) 응혈성 인자,
    (i) 프로-드러그 활성 효소,
    (k) 알부민 결합제,
    (l) 알부민,
    (m) IgG 결합제, 또는
    (n) 폴리에틸렌 글리콜
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 융합 구조체.
  7. 제 4 항에 있어서, 추가 화합물은 항체 경사슬, 항체 중사슬, 항체의 Fc 도메인, 항체, 또는 이들의 조합으로 구성되는 또는 이를 포함하는 것인, 융합 구조체.
  8. 제 7 항에 있어서, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드는 상기 추가 화합물의 C-말단의 하류에 위치하는 것인, 융합 구조체.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 화합물은 SEQ ID NO: 11을 포함하는 또는 이로 구성되는 항체 경사슬을 포함하는 또는 이로 구성되는 것인, 융합 구조체.
  10. 제 9 항의 융합 구조체를 적어도 1 복제, 바람직하게는 2 복제 및SEQ ID NO: 12의 항체 중사슬을 적어도 1 복제, 바람직하게는 2 복제 포함하는 또는 이로 구성되는, 구조체.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 구조체는 SEQ ID NO: 16 또는 17을 포함하는 또는 이로 구성되는 융합 구조체를 적어도 1 복제, 바람직하게는 2 복제 및 SEQ ID NO: 12의 항체 중사슬을 적어도 1 복제, 바람직하게는 2 복제를 포함하는 또는 이로 구성되는 것인, 구조체.
  12. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자, 또는 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 융합 구조체, 또는 제 10 항 또는 제 11 항에 따른 구조체를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자.
  13. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제 4 항 내지 제 9 항의 융합 구조체, 제 10 항 또는 제 11 항에 따른 구조체, 제 12 항의 핵산 분자, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 약제학적 또는 진단학적 조성물.
  14. 염증, 자가면역 및/또는 뼈 손실-관련 질병 치료에 사용되는, 제 13 항의 약제학적 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 질병은 관절염(arthritis), 바람직하게는 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis), 만성 진행성 관절염(arthritis chronica progrediente), 반응성 관절염(reactive arthritis) , 건선 관절염(psoriatic arthritis), 장병성 관절염(enterophathic arthritis) 및 변형 관절염(arthritis deformans), 류머티스 질병(rheumatic diseases), 척추관절병증(spondyloarthropathies), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 라이터 증후군(Reiter syndrome), 과민반응(hypersensitivity, 기도 과민반응 및 피부 과민반응을 모두 포함함), 알러지(allergies), 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 염증성 근육 장애(inflammatory muscle disorders), 다발연골염(polychondritis), 피부 경화증(sclerodoma), 베게너 육아종증(Wegener granulomatosis), 피부근염(dermatomyositis), 스티븐스-존슨 증후군(Steven-Johnson syndrome), 만성활동간염(chronic active hepatitis), 중증근육무력증(myasthenia gravis), 건선(psoriasis), 특발 스프루(idiopathic sprue), 자가면역 염증성 장 질환(autoimmune inflammatory bowel disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(Crohn's disease), 과민성 대장 증후군(Irritable Bowel Syndrome), 내분비성 안질환(endocrine ophthalmopathy), 그레이브스병(Graves disease), 사르코이드증(sarcoidosis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 원발성 담즙성 간경변(primary biliary cirrhosis), 소아 당뇨병(juvenile diabetes, 제 1 형 당뇨병), 자가면역 혈액학적 장애(autoimmune haematological disorders), 용혈성 빈혈(hemolytic anaemia), 재생불량성 빈혈(aplastic anaemia), 순적혈구 빈혈(pure red cell anaemia), 특발성 혈소판감소증(idiopathic thrombocytopenia), 포도막염(uveitis, 앞포도막염 및 뒤포도막염), 건성 각결막염(keratoconjunctivitis sicca), 봄철 각결막염(vernal keratoconjunctivitis), 간질성 폐섬유증(interstitial lung fibrosis), 사구체신염(glomerulonephritis, 신증후군을 동반하거나 동반하지 않음), 특발성 콩팥증후군(idiopathic nephrotic syndrome) 또는 최소변화신증(minimal change nephropathy), 종양(tumors), 피부 염증 질환(inflammatory disease of skin), 각막염(cornea inflammation), 근육염(myositis), 뼈 임플란트의 풀림(loosening of bone implants), 대사장애(metabolic disorders), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 당뇨병(diabetes), 및 이상지질혈증(dislipidemia), 뼈손실(bone loss), 골관절염(osteoarthritis), 골다공증(osteoporosis), 폐쇄성 치주질환(periodontal disease of obstructive) 또는 염증성 기관지 질환 천식(inflammatory airways diseases asthma), 기관지염(bronchitis), 진폐증(pneumoconiosis), 폐기종(pulmonary emphysema), 급성 및 초급성 염증반응(acute and hyperacute inflammatory reactions), 급성 감염(acute infections), 패혈성 쇼크(septic shock), 내독소 쇼크(endotoxic shock), 성인성 호흡 곤란 증후군(adult respiratory distress syndrome), 수막염(meningitis), 폐렴(pneumonia), 중화상(severe burns), 악액질 소모 증후군(cachexia wasting syndrome), 뇌졸중(stroke), 헤르페스 기질각막염(herpetic stromal keratitis) 및 안구건조증(dry eye disease)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 약제학적 조성물.

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