CN104684571B - 新的il‑17a结合分子及其医学应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抑制糖基化IL‑17A的活性的多肽,其中所述多肽包含选自如下的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成:(a)GVTLFVALYDY(X1)(X2)(X3)(X4)(X5)(X6)DLSFHKGEKFQILSTHEYEDWW EARSLTTGETGYIPSNY VAPVDSIQ(SEQ ID NO:1),其中氨基酸位置(X1)至(X6)可以是任意氨基酸序列;及(b)与(a)的氨基酸序列有至少85%相同性的氨基酸序列,其中所述相同性的确定不考虑氨基酸位置(X1)至(X6),并且条件是SEQ ID NO:1的氨基酸位置31至36的氨基酸序列STHEYE(SEQ ID NO:2)是保守的。本发明还涉及包含所述多肽的融合构建体、组合物及医学应用。
Description
本发明涉及抑制糖基化IL-17A的活性的多肽,其中所述多肽包含选自如下的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成:(a)GVTLFVALYDY(X1)(X2)(X3)(X4)(X5)(X6)DLSFHKGEKFQILSTHEYEDWW EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ(SEQ ID NO:1),其中氨基酸位置(X1)至(X6)可以是任意氨基酸序列;及(b)与(a)的氨基酸序列有至少85%相同性的氨基酸序列,其中所述相同性的确定不考虑氨基酸位置(X1)至(X6),并且条件是SEQ ID NO:1的氨基酸位置31至36的氨基酸序列STHEYE(SEQ ID NO:2)是保守的。本发明还涉及包含所述多肽的融合构建体、组合物及医学应用。
在本说明书中,引用了一些文件,包括专利申请和厂商手册。这些文件的公开尽管不认为与本发明专利性相关,但在此通过引用将其全部内容并入本申请。更具体地,即使个别文件特别及单独地指明以参考方式,所有引用的文件通过引用以相同的程度并入本申请。
CD4+T细胞通过辅助获得性或先天免疫系统的其它细胞而在协调免疫应答中起中心作用。在早期研究中鉴定了两类CD4+T细胞(Th1和Th2)。最近,鉴定了CD4+T细胞一个新亚集,Th17谱系。Th17细胞看起来作为获得性免疫系统的一个分支而进化,专门用于针对未被Th1或Th2免疫良好覆盖的胞外细菌及一些真菌和微生物的增强的宿主保护。
Th17细胞在发现新的细胞因子家族,IL-17家族,的背景下被鉴定,IL-17家族目前已知包括6个成员(IL-17A-F)。IL-17(先前称为CTLA-8)主要由Th17细胞表达并且被称为IL-17A以表明其是这个细胞因子家族的创始成员。人类白介素-17A(IL-17)是多效性促炎性细胞因子,其对于CD4+T辅助17(TH17)细胞谱系的定义是关键的,如上所述(MiossecP.et al.(2009)N.Engl.J.Med.361,p.888-898)。IL-17A是同源二聚体分子,在裂解23个氨基酸的信号肽之后,其作为糖基化共价结合的同源二聚体而分泌(NCBI ReferenceSequence:NP_002181.1;UniProtK identifier:Q16552;SEQ ID:10)。F-糖内切酶消化使得由哺乳动物细胞表达的人IL-17A在还原性SDS-PAGE上的表观分子量从22变为15kDa,由此证实该细胞因子是糖基化的(Fossiez F.et al.(1998)Int Rev Immunol.16(5-6);p.541-551)。
作为慢性炎症过程中的中心介导物及先前认为是Th1介导的一些类型的自身免疫病症中的主要病原效应物,Th17细胞的鉴定预示了新治疗途径(Weaver T.et al.(2008)Annu.Rev.Immunol.,25,p.821-852)。事实上,促炎性细胞因子IL-17主要由Th17细胞表达,并且以升高水平存在于患类风湿性关节炎(RA)的患者的关节滑液中,并且已经示出参与早期RA发展。另外,IL-17是TNF-α和IL-1的强诱导物,后者主要导致骨侵蚀及受累患者的非常疼痛的结局(Lubberts E.(2008)Cytokine,41,p.84-91)。另外IL-17的不适当或过量产生与各种其它疾病和失调的病理学相关,例如骨关节炎、骨植入物松动、急性移植排斥(Antonysamy et al.,(1999)J.Immunol,162,p.577-584;van Kooten et al.(1998)J.Am.Soc.Nephrol.,9,p.1526-1534)、败血症、脓毒性或内毒性休克、过敏、哮喘(Molet etal.(2001)J.Allergy Clin.Immunol.,108,p.430-438)、骨质流失、银屑病(Teunissen etal.(1998)J.Invest.Dermatol,111,p.645-649)、局部缺血、系统性硬化(Kurasawa et al.(2000)Arthritis Rheum.,43,p.2455-2463)、中风及其它炎性疾病。
因此,抗IL-17化合物具有潜力作为抗炎药,与一些体内研究符合的治疗方法证实IL-17中和降低炎性过程如关节炎。例如,在关节炎初始阶段免疫期间的接种方案后开始的由IL-17受体-IgG1-Fc融合蛋白对内源性IL-17的早期中和抑制实验性关节炎的发作(Lubberts et al.(2001)J.Immunol.,167,p.1004-1013)。另外,在胶原蛋白诱导的关节炎发作后在动物模型中用中和性抗IL-17抗体治疗降低了关节炎症、软骨破坏及骨侵蚀(Lubberts et al.(2004)Arthritis and Rheumatism,50;650-659)。组织学分析证实关节炎症的抑制,并且在用抗IL-17抗体治疗后全身性IL-6水平显著降低。相反,使用表达鼠IL-17的腺病毒载体进行的全身性及局部IL-17过表达加速了胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)的发作及在该部位的加重的滑膜炎症(Lubberts et al.(2001)J.Immunol.,167,p.1004-1013 and Lubberts et al.(2002),Inflamm.Res.51,p102–104)。近来,可以证实使用抗IL-17抗体改善了银屑病、类风湿性关节炎和非感染性眼色素层炎的临床症状(LeonardiC.et al.(2012)N.Engl.J.Med.366,p.1190-1199;Hueber W.et al.(2010)Sci TranslMed.2(52):52ra72)。
单特异性药物广泛用于治疗各种不同疾病。大多数市售生物药均是单特异性的,因此能与单个靶相互作用及对其进行干扰。但是,复杂疾病本质上经常是多因素的,涉及疾病介导物的冗余或协同作用。因此,阻断多个不同病理学因子和途径可导致改善的疗效(Konterman R.E.(2012)mAbs,4:2,p.182-197)。
除了IL-17A,参与炎性疾病、自身免疫和骨质流失相关的疾病,特别是各种形式关节炎包括类风湿性关节炎的病因学的另一个关键分子是肿瘤坏死因子(TNF)。一些抗TNF疗法已被批准用于治疗类风湿性关节炎、银屑病、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎和克隆氏症,并且正在临床中测试用于其他炎症。目前有5类生物药可用于治疗炎性关节炎,每一类抑制免疫驱动的炎性途径的不同方面(综述在Scott D.L.(2012)Clin Pharmacol Ther.,91(1),p.31-43):(i)TNF抑制剂(阿达木单抗、依那西普、英利昔单抗、赛妥珠单抗、高利单抗),(ii)白介素-1受体拮抗剂(阿那白滞素),(iii)B细胞抑制(利妥昔单抗),(iv)T细胞共刺激抑制(阿巴西普)和(v)白介素-6抑制(塔西单抗)。其它用于治疗炎症的批准生物药包括康纳单抗(抗IL-1β)和优特克单抗(抗IL-12/23)(Reichert J.M.(2012)mAbs,4:3,p.413-415)。设计用于治疗应用的TNF结合分子也描述于Tak和Kalden(2011)(ArthritisResearch and Therapy,13;1-14)。
Koenders等(2011)(Arthritis and Rheumatism,63;2329-2339)描述了TNF和IL-17之间的相互作用触发导致关节炎动物模型中不可逆软骨破坏的分子机制。另外,作者发现可溶性白介素-17受体和TNF结合蛋白的组合在治疗关节炎中比两者中任一种抗细胞因子单独治疗更有效。Koenders等(2011)的出版物中描述的TNF结合分子是二聚化连接的PEG化的可溶性p55TNF受体I。WO 2010/102251描述了包含第一和第二多肽链的结合蛋白,其中所述结合蛋白能结合人IL-17和TNF。两个多肽链都具有由抗体可变结构域和恒定结构域形成的分子结构。一些其它双特异性和/或多特异性融合蛋白已在文献中描述(见综述Konterman R.E.(2012)mAbs,4:2,p.182-197)。
Fyn SH3衍生的多肽是本领域熟知的,已描述于例如Grabulovski等(2007)JBC,282,p.3196-3204;WO 2008/022759;Bertschinger等(2007)Protein Eng Des Sel 20(2):57-68;和Gebauer与Skerra(2009)Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255。术语“Fyn SH3衍生的多肽”在本文与术语“Fynomer”可互换使用,是指衍生自人Fyn SH3结构域的非免疫球蛋白衍生的结合(多)肽(例如,所谓的支架,如Gebauer and Skerra(2009)CurrOpinion in Chemical Biology 13:245-255所述)。人Fyn激酶的SH3结构域成功用作支架以工程化蛋白质(Fyn SH3衍生的结合蛋白,命名为Fynomers),所述蛋白质以高亲和性和特异性结合不同靶蛋白(WO 2008/022759,WO 2011/023685,Grabulovski D.等(2007)J BiolChem 282,p.3196-3204,Bertschinger J.et al.(2007)Protein Eng Des Sel,20,p.57-68,and Schlatter等(2012)mAbs,4(4)p.497-50)。
WO 2011/023685描述了IL-17抑制多肽(“Fynomers”),相应的融合蛋白、组合物和其医学应用。本发明根本的技术问题是提供进一步的IL-17A抑制多肽,特别是技术上改良的这种IL-17A抑制多肽。这个技术问题由权利要求书中表征的实施方案解决。
因此,本发明在第一个实施方案中涉及抑制糖基化IL-17A的活性的多肽,其中所述多肽包含选自如下的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成:(a)GVTLFVALYDY(X1)(X2)(X3)(X4)(X5)(X6)DLSFHKGEKFQILSTHE YEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ(SEQ ID NO:1),其中氨基酸位置(X1)至(X6)可以是任意氨基酸序列;及(b)与(a)的氨基酸序列有至少85%相同性的氨基酸序列,其中所述相同性的确定不考虑氨基酸位置(X1)至(X6),并且条件是SEQ ID NO:1的氨基酸位置31至36的氨基酸序列STHEYE(SEQ ID NO:2)是保守的。本发明还涉及包含所述多肽的融合构建体、组合物及医学应用。
本发明在第二个实施方案中涉及结合糖基化IL-17A并且优选抑制其活性的多肽,其中所述多肽包含选自如下的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成:(a)GVTLFVALYDY(X1)(X2)(X3)(X4)(X5)(X6)DLSFHKGEKFQILST HEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ(SEQ ID NO:1),其中氨基酸位置(X1)至(X6)可以是任意氨基酸序列;及(b)与(a)的氨基酸序列有至少85%相同性的氨基酸序列,其中所述相同性的确定不考虑氨基酸位置(X1)至(X6),并且条件是SEQ ID NO:1的氨基酸位置31至36的氨基酸序列S THEYE(SEQ ID NO:2)是保守的。本发明还涉及包含所述多肽的融合构建体、组合物及医学应用。
下述定义、实施例、优选和独立的实施方案涉及本发明的第一个和第二个实施方案。
本文所用术语“多肽”描述氨基酸的线性分子链,包括单链蛋白质或它们的片段,含有大于大约50个氨基酸。多肽可以进一步形成多聚体,例如寡聚体,由至少两个相同或不同分子组成。这种多聚体的相应的更高级结构相应地被命名为同源或异源二聚体,同源或异源三聚体等。另外,本发明还包括这种多肽的肽模拟物,其中氨基酸和/或肽键被功能类似物置换。这种功能类似物包括除20种基因编码氨基酸之外的所有已知氨基酸,例如硒代半胱氨酸。术语“多肽”还指天然修饰的多肽,其中所述修饰通过例如糖基化、乙酰化、磷酸化及本领域熟知的类似修饰而实现。
本发明还包括本发明多肽的片段,其基本上保留与糖基化IL-17A的结合。在此方面,优选的是(优选性越来越增加)所述片段包含至少30个氨基酸,至少40个氨基酸,或者至少45个氨基酸,只要片段含有少于大约55个氨基酸。更优选的是在片段中,相应于本文如下定义的RT-和src-环的氨基酸位置被保留。
本文所用术语“抑制糖基化IL-17A活性的多肽”定义了多肽具有降低或完全消除糖基化IL-17A的活性的能力,所述活性在本文以上内容详细描述。在此方面,优选的是抑制糖基化IL-17A活性是指抑制糖基化IL-17A结合称为IL-17R(白介素17受体)的I型细胞表面受体。现有技术中已知至少3种IL-17R变体,即IL17RA、IL17RB和IL17RC。在此方面,更优选的是(优选性越来越增加)多肽抑制糖基化IL-17A的活性至少10%、10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。还优选的是(优选性越来越增加)本发明多肽抑制糖基化IL-17A的IC50值是1000nM或更小、500nM或更小、400nM或更小、300nM或更小、200nM或更小、100nM或更小或者75nM或更小。在此方面,优选的是本发明的多肽特异性抑制糖基化IL-17A活性,及因此不抑制其它相关蛋白质如糖基化IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E或IL-17F。本发明的多肽抑制糖基化IL-17A的活性。优选的是本发明的多肽抑制糖基化和非糖基化IL-17A的活性。因此,上述定义加以必要变更适用于非糖基化IL-17A的抑制。
应理解抑制糖基化IL-17A活性还涉及与糖基化IL-17A结合。在此方面优选的是结合糖基化IL-17A还导致糖基化IL-17A活性的抑制。术语“结合糖基化IL-17A”需要本发明的多肽或片段与糖基化IL-17A形成结合相互作用(体内和/或体外)。优选地,本发明多肽结合糖基化IL-17A的KD是10-7至10-12M,更优选10-8至10-12M,最优选10-9至10-12M。在此方面,优选的是本发明多肽特异性结合IL-17A,因此不结合其他相关蛋白质如IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E或IL-17F。本发明的多肽结合糖基化IL-17A的活性。优选的是本发明的多肽抑制糖基化和非糖基化IL-17A的活性。因此,上述定义加以必要变更适用于非糖基化IL-17A的抑制。
本文如上所述SEQ ID NO:1衍生自人Fyn激酶的SH3结构域的氨基酸序列(SEQ IDNO:20;如Kawakami等和Semba等1986报道的Fyn激酶的aa 83-145)。SEQ ID NO:20为:GVTLFVALYDYEARTEDDLSFHKGEK FQILGDWWEARSLTTGETGYIP SNYVAPVDSIQ(SEQ IDNO:20)。在上述SEQ ID NO:20中,RT和src环序列分别以下划线和双下划线示出。Grabulovski等(2007)JBC,282,p.3196-3204研究了Fyn SH3结构域的RT和src环中的突变的影响,并且证实在两个环中相邻于疏水性表面的突变可以决定这个结构域参与分子间缔合的能力。另外,EP 2054432示出在RT和/或src环中的突变或者相邻于其的突变决定SH3结构域的结合特异性。Fyn SH3的氨基酸序列在人类、小鼠、大鼠和猴(长臂猿)中是完全保守的。鸡Fyn SH3与相应的人结构域有一个氨基酸位置不同,非洲爪蟾(Xe nopus laevis)的Fyn SH3与相应的人结构域有两个氨基酸位置不同。与其它SH3结构域一样,Fyn SH3由两个反平行的β-折叠组成并且含有两个柔性环(称为RT环和src环)以与其它蛋白质相互作用。
更详细地,SEQ ID NO:1是产生自SEQ ID NO:3-9的序列比对的序列(参见图8)。如图8所证明的,SEQ ID NO:1的位置(X1)至(X6)相应于SEQ ID NO:20的Fyn激酶SH3结构域的RT环。在此方面,优选的是本发明多肽的氨基酸位置(X1)至(X6)不具有序列EARTED(SEQ IDNO:19)。如图8所进一步证明的,相应于SEQ ID NO:20的Fyn激酶SH3结构域的src环的位置,即序列“STHEYE”(在SEQ ID NO:1中以下划线标记,如上所述),在SEQ ID NO:3-9中是保守的。RT和src环中的氨基酸位置决定对糖基化IL-17A的结合特异性。
根据本发明,术语“序列相同性百分比(%)”描述了两个或更多个比对的核酸或氨基酸序列中与组成全长模板核酸或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸残基数目相比相同的核苷酸/氨基酸匹配数(“hit”)。在其它术语中,当所述(亚)序列在如使用本领域已知的序列比较算法测量的比较窗或指定区域上进行最大相应性比较和比对时,或者当手工比对和目视检查时,对于两个或更多个序列或亚序列,使用比对可以确定相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比(例如,85%、90%或95%相同性)。进行比较以确定序列相同性的序列可以因此由于核苷酸或氨基酸的取代、添加或缺失而不同。这个定义也适用于测试序列的互补序列。
本领域技术人员还了解对比核酸序列的合适程序。多肽序列的序列相同性百分比可以用例如上述解释的程序CLUSTLAW、FASTA和BLAST确定。优选地,使用BLAST程序,即NCBIBLAST算法(Stephen F.Altschul,Thomas L.Madden,Alejandro A.JinghuiZhang,Zheng Zhang,Webb Miller,and David J.Lipman(1997),"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs",Nucleic AcidsRes.25:3389-3402)。
对于本文上述项目(b)中所述的序列相同性,优选(优选性增加)序列相同性是至少90%、至少95%或至少98%。
本文所用短语“相同性的确定不考虑氨基酸位置(X1)至(X6)”是指相对于SEQ IDNO:1的序列相同性的计算不考虑氨基酸位置(X1)至(X6),而是限于SEQ ID NO:1的其余58个氨基酸位置。本文所用条件“条件是SEQ ID NO:1的氨基酸位置31-36中的氨基酸序列STHEYE(SEQ ID NO:2)是保守的”是指在SEQ ID NO:1的氨基酸位置31至36中不引入氨基酸变化。换言之,在落入本发明的第一个实施方案及其优选实施例的范围内的所有多肽中,相应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置31-36的氨基酸位置具有序列STHEYE(SEQ ID NO:2)。
在此方面,优选的是在落入本发明的第一个实施方案及其优选实施例的范围内的所有多肽中相应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置31-37的氨基酸位置具有序列STHEYED(SEQID NO:18)。换句话说,对于本发明的第一个实施方案及其优选实施例,优选的是满足如下条件,即SEQ ID NO:1的氨基酸位置31-37中的氨基酸序列STHEYED(SEQ ID NO:18)是保守的。
SEQ ID NO:1中的任何氨基酸取代优选是保守氨基酸取代。保守取代是指用具有类似于被置换氨基酸的化学性质的另一个氨基酸置换一个氨基酸。优选地,本文所指保守取代是选自下组的取代:(i)碱性氨基酸用不同的碱性氨基酸取代;(ii)酸性氨基酸用不同的酸性氨基酸取代;(iii)芳族氨基酸用不同的芳族氨基酸取代;(iv)非极性脂肪族氨基酸用不同的非极性脂肪族氨基酸取代;及(v)极性不带电荷氨基酸用不同的极性不带电荷氨基酸取代。碱性氨基酸是精氨酸、组氨酸和赖氨酸。酸性氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。芳族氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。非极性脂肪族氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸和脯氨酸。极性不带电荷氨基酸是丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。与保守氨基酸取代相反,非保守氨基酸取代是一个氨基酸用任何不落入上述保守取代(i)至(v)的氨基酸交换。
术语“IL-17A”或“白介素17A”(先前命名为CTLA-8,在本文和现有技术中也简单称为“IL-17”或“白介素-17”,因为其是IL17家族的创始成员)是指由激活的记忆T细胞产生的强促炎性细胞因子(Gurney and Aggarwal(2002),"IL-17:prototype member of anemerging cytokine family",J.Leukoc.Biol.71(1):1-8)。更详细地,IL-17A是在延迟型反应中作为强介导物的细胞因子,其通过增加各种组织中趋化因子的产生募集单核细胞和嗜中性粒细胞到炎症部位而起作用,与干扰素γ类似。IL-17A由T辅助细胞产生并且由导致在延迟型反应中破坏性组织损伤的IL-23诱导。白介素17A作为一个家族,功能是促炎性细胞因子,应答细胞外病原体对免疫系统的侵袭,及诱导病原体细胞基质的破坏。白介素17A与肿瘤坏死因子和白介素-1协同作用。人IL-17A是155个氨基酸的蛋白质,优选包含SEQ IDNO:10或由SEQ ID NO:10组成,其是二硫键连接的同源二聚体的分泌性糖蛋白,分子质量为35kDa。同源二聚体的每个亚基大约15-20kDa。IL-17A的结构由23个氨基酸(aa)的信号肽及后接的132-aa的IL-17家族特征性链区组成。蛋白质上的N-连接糖基化位点首先被鉴定,在蛋白质纯化后揭示2条带,一条在15kDa,另一条在20kDa。如所述,最初鉴定的IL-17被命名为IL-17A,以指示其是这个细胞因子家族的创始成员。除了IL-17A,IL-17家族成员包括IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(也称为IL-25)和IL-17F。IL-17家族被认为代表独特的信号系统,所述系统似乎在脊椎动物进化中高度保守。所有IL-17家族成员均具有相似蛋白质结构,具有对其3维形状关键的4个高保守半胱氨酸残基,但是它们与任何其它已知细胞因子不具有序列相似性。
本文公开的IL-17A抑制多肽令人惊奇地具有对非糖基化IL-17A及糖基化IL-17A的高特异性和高亲和性。特别地,本发明的SEQ ID NO:3-9能完全抑制糖基化IL-17A,具有与非糖基化IL-17A相比相似的效力(见实施例3)。与WO2011/023685的Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽相比这是有利性质。WO 2011/023685所述的Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽甚至在高浓度也不完全抑制糖基化IL-17A和/或显示在糖基化和非糖基化IL-17A之间抑制效力(IC50值)的大差异(见实施例3和图3)。如本文上述讨论,IL-17A在体内作为糖基化共价结合的同源二聚体而分泌。本文公开的具有结合和抑制糖基化IL-17A的优势的新IL-17A结合分子因此特别适合需要体内检测或结合IL-17A的应用,其中在体内IL-17A主要以糖基化蛋白存在。这种应用是例如诊断和医学治疗,优选地配制药物用于治疗和/或预防IL-17A介导的疾病。
本文下述实施例显示,所列举的氨基酸位置(X1)至(X6)的氨基酸赋予对糖基化IL-17A的结合特异性,特别是对于具有SEQ ID NO:10的糖基化IL-17A的结合特异性。更详细地,图8中本发明的SEQ ID NO:3-9的序列比对显示,在SEQ ID NO:3-9中氨基酸位置(X1)至(X6)选自:(X1)是A、K、S、D或E;(X2)是N、Q、A、K、S或R;(X3)是H、K、R、L或V;(X4)是G或S;(X5)是H、Q、A、W、V或N;及(X6)是R、L或S。因此,可以预期除了在SEQ ID NO:3-9中存在的(X1)至(X6)的特异性氨基酸组合之外的选自上述定义的(X1)至(X6)的其它氨基酸序列也赋予对糖基化IL-17A的结合特异性。
因此,在本发明的一个优选实施方案中,本发明多肽的氨基酸位置(X1)至(X6)选自:(X1)是A、K、S、D或E;(X2)是N、Q、A、K、S或R;(X3)是H、K、R、L或V;(X4)是G或S;(X5)是H、Q、A、W、V或N;及(X6)是R、L或S(见SEQ ID NO:21)。
本发明还涵盖(X1)是A、K、S、D或E;(X2)是N、Q、A、K、S或R;(X3)是H、K、R、L或V;(X4)是G或S;(X5)是H、Q、A、W、V或N;及(X6)是R、L或S的保守氨基酸取代。
特别优选的是本发明多肽的氨基酸位置(X1)至(X6)选自:(X1)是S或E;(X2)是A或S;(X3)是R或V;(X4)是G或S;(X5)是Q或V;及(X6)是L或S。这些氨基酸分别相应于SEQ ID NO:5和7中的位置(X1)至(X6)。最优选的是本发明多肽的氨基酸位置(X1)至(X6)是:(X1)是S;(X2)是A;(X3)是R;(X4)是G;(X5)是Q;及(X6)是L。这些氨基酸相应于SEQ ID NO:5中的位置(X1)至(X6)。
根据第一个多肽的(b)项的多肽,不仅氨基酸位置(X1)至(X6)可在SEQ ID NO:1(或者SEQ ID NO:3-9)的氨基酸序列之间不同,不在Fyn激酶的SH3结构域(SEQ ID NO:20)的RT环和/或src环(根据本发明具有序列STHEYE(SEQ ID NO:2))内的额外氨基酸位置也可以不同。据信这些位置中的氨基酸差异对于SEQ ID NO:3-9的结合特异性不是关键的。因此,这些氨基酸位置可以交换或缺失,或者可以添加进一步的氨基酸,基本上不干扰对糖基化IL-17A的结合特异性。如果氨基酸被交换,优选保守交换。
在更优选的实施方案中,本发明多肽包含SEQ ID NO:3-9任一的氨基酸序列或由选自所述氨基酸序列组成。
如本文以下实施例所示,发现SEQ ID NO:3-9结合并抑制具有SEQ ID NO:10的非糖基化及糖基化IL-17A。更详细地,令人惊奇地发现SEQ ID NO:3-9的Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽能够完全抑制糖基化IL-17A,与非糖基化IL-17A相比效力相似。与WO2011/023685所述的Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽相比这是有利性质(见实施例3中的比较数据)。
在SEQ ID NO:3-9中,优选SEQ ID NO:5和7。SEQ ID NO:5和7已用于产生实施例4所述的融合构建体和构建体。所获得的融合构建体和构建体特别有用,因为它们稳定,是单体,可溶并且展示优异的生物物理和药物样性质。另外,SEQ ID NO:5和7与进一步化合物的融合不影响对于糖基化IL-17A的优异结合。
如熟知的,氨基酸序列中的小变化如一个、几个或甚至一些氨基酸的缺失、添加或取代可导致具有基本上相同性质的原始蛋白质的突变体形式。因此,关于SEQ ID NO:3-9,本发明还包括这样的多肽,其氨基酸序列与SEQ ID NO:3-9任一序列具有至少85%、优选至少90%、更优选至少95%、最优选至少98%相同性,条件是SEQ ID NO:1的氨基酸位置31-36中的氨基酸序列STHEYE(SEQ ID NO:2)是保守的。如果氨基酸被交换,则优选保守交换。
本发明进一步优选的是IL-17A包含或由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成。
如本文下述实施例所证实,具有SEQ ID NO:10的人IL-17A已被用作靶蛋白质以鉴定具有SEQ ID NO:3-9的多肽。SEQ ID NO:10的前23个氨基酸是信号肽。因此特别优选的是本发明多肽在SEQ ID NO:10的氨基酸位置24-155与糖基化IL-17A结合。
在另一个实施方案中,本发明涉及融合构建体,其包含与进一步化合物融合的本发明多肽。
本文所用“融合构建体”限定了本发明多肽与进一步化合物的融合体。所述化合物可以是蛋白质化合物或者非蛋白质化合物。在化合物是蛋白质化合物(例如本文下述的细胞因子或趋化因子)的情况中,融合构建体也可以称为融合蛋白。本文所用术语“融合蛋白”一般而言是指通过结合和表达编码独立多肽的两个或更多个基因而产生的多肽构建体。换句话说,这个融合基因的翻译产生单一多肽,其具有衍生自每个原始多肽的功能性质。多肽可以直接融合或者经接头即短肽序列融合。通常,融合蛋白通过本领域技术人员熟知的重组DNA技术人工产生(例如,Alberts et al.,Molecular Biology of the Cell,4thed.Garland Science,p.518-519)。但是本发明的多肽和融合蛋白可以通过许多常规和熟知技术的任一种制备,例如普通有机合成策略、固相辅助合成技术或者通过市售自动化合成仪合成。融合蛋白可以用于生物学研究或治疗剂中。作为所述进一步化合物的非蛋白质化合物的例子是,例如,有机小分子如聚乙二醇(PEG)或者Alexa Fluor,或者放射性核素。非蛋白质进一步化合物的进一步具体例子在下文讨论。
根据优选的实施方案,所述进一步的化合物是药物学活性化合物、前药、药物学可接受载体、诊断活性化合物、细胞穿透增强剂和/或调节血清半衰期的化合物。
药物学活性化合物是当给对象施用时具有生物学活性的化合物,其给对象带来有益效果。前药是一种化合物,其以无活性(或者小于完全活性)形式给对象施用,随后通过对象中的代谢过程转化为药物学活性或药物学完全活性化合物。药物学(完全)活性化合物优选是适合治疗或预防本文下述任何具体疾病的化合物。
诊断活性化合物是当给对象施用时具有活性的化合物,其使得能确定或鉴定可能的疾病和病症。诊断活性化合物的例子包括可检测标记如荧光染料、放射性核素或医学成像用造影剂。荧光染料、放射性核素或医学成像用造影剂的例子见下述。与本发明多肽融合的诊断活性化合物可以特别用于确定或鉴定本文下述的任何具体疾病,其共同的一点是它们的起源和/或症状是IL-17A和/或Th-17相关的。这种疾病的这些方面可以通过与本发明的诊断活性化合物融合的本发明多肽检测或鉴定。
细胞穿透增强剂是促进本发明多肽输送进(体外、离体或体内)细胞的化合物。
调节血清半衰期的化合物是特别在血液循环系统中延长本发明多肽的体内半衰期的化合物。调节血清半衰期的成分优选是聚乙二醇(PEG)。
药物学可接受载体是当给对象施用时改善本发明的多肽的输送和/或有效性的化合物。合适的药物学可接受载体是本领域熟知的并且包括例如稳定剂、抗氧化剂、pH调节物质等。
根据另一个优选的实施方案,本发明的进一步的化合物选自(a)荧光染料,(b)光敏剂,(c)放射性核素,(d)医学成像用造影剂,(e)细胞因子,(f)毒性化合物,(g)趋化因子,(h)促凝因子,(i)用于前药激活的酶,(k)白蛋白结合剂,(l)白蛋白,(m)IgG结合剂,或(n)聚乙二醇。
荧光染料优选是选自Alexa Fluor或Cy染料的成分。
光敏剂优选是光毒性红色荧光蛋白KillerRed或血卟啉。
放射性核素优选选自γ发射同位素,更优选99mTc、123I、111In,和/或选自阳离子发射体,更优选18F、64Cu、68Ga、86Y、124I,和/或选自β-发射体,更优选131I、90Y、177Lu、67Cu,或者选自α-发射体,优选213Bi、211At。
本文所用造影剂是在医学成像中用于增强体内结构或液体对比度的物质。常用造影剂基于X-射线衰减和磁共振信号增强而起作用。
细胞因子优选选自IL-2、IL-12、TNF-α、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-10、IL-15、IL-24、GM-CSF、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、LIF、CD80、B70、TNFβ、LT-β、CD-40配体、Fas配体、TGF-β、IL-1α和IL-1β。如本领域熟知的,细胞因子可有利于免疫系统的促炎性或抗炎性应答。因此,根据待治疗疾病,具有促炎性或抗炎性细胞因子的融合构建体是有利的。例如,为治疗炎性疾病,通常包含抗炎细胞因子的融合构建体是优选的,而用于治疗癌症通常包含促炎性细胞因子的融合构建体是优选的。
毒性化合物优选是小有机化合物或多肽,更优选是选自卡奇霉素、美登木素生物碱(maytansinoid)、新制癌菌素、埃斯佩拉霉素(esperamicin)、dynemicin、可达菌素(kedarcidin)、maduropeptin、多柔比星、柔红霉素、阿里他汀、蓖麻蛋白-A链、蒴莲根毒素、截短的假单胞菌外毒素A、白喉毒素和重组白树毒素的毒性化合物。
趋化因子优选选自IL-8、GROα、GROβ、GROγ、ENA-78、LDGF-PBP、GCP-2、PF4、Mig、IP-10、SDF-1α/β、BUNZO/STRC33、I-TAC、BLC/BCA-1、MIP-1α、MIP-1β、MDC、TECK、TARC、RANTES、HCC-1、HCC-4、DC-CK1、MIP-3α、MIP-3β、MCP-1-5、嗜酸性粒细胞活化趋化因子、嗜酸性粒细胞活化趋化因子-2、I-309、MPIF-1、6Ckine、CTACK、MEC、淋巴细胞趋化因子和分形趋化因子。
促凝因子优选是组织因子(TF)或癌症促凝剂(CP)。
用于前药激活的酶优选是选自羧基肽酶、葡糖醛酸糖苷酶和葡糖苷酶的酶。
白蛋白结合剂及IgG结合剂的例子描述于Gebauer and Skerra(2009),13:245-255。因此,白蛋白结合剂和IgG结合剂的优选例子是人单Ig结构域(dubbled AlbuminDab)、纳米抗体、衍生自链球菌蛋白G的天然发生的白蛋白结合结构域(ABD)及结合IgG的结构域。当给患者施用时,这种融合构建体例如增加本发明多肽的半衰期,特别是在血液循环系统中。
根据另一个优选实施方案,本发明的进一步化合物由抗体轻链、抗体重链、抗体的Fc结构域、抗体或其组合组成或包含抗体轻链、抗体重链、抗体的Fc结构域、抗体或其组合。
术语“抗体”包括特异性结合所述肽或多肽的单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体或其片段,还包括双特异性抗体、合成抗体、除重链和轻链之外的抗体片段如Fab、F(ab2)’、Fv或scFv片段等,或者任何这些抗体的化学修饰的衍生物。单克隆抗体可以通过例如最初在and Milstein,Nature 256(1975),495,and Galfré,Meth.Enzymol.73(1981),3中描述的技术(其包括将小鼠骨髓瘤细胞与衍生自免疫哺乳动物的脾细胞融合)经现有技术开发的修改而制备。另外,上述肽的抗体或其片段可以用在例如Harlow and Lane"Antibodies,A Laboratory Manual",CSH Press,Cold Spring Harbor,1988中描述的方法获得。当所述抗体的衍生物通过噬菌体展示技术获得时,可以使用在BIAcore系统中采用的表面等离子体共振以增加结合本发明的肽或多肽的表位的噬菌体抗体的效率(Schier,Human Antibodies Hybridomas 7(1996),97-105;Malmborg,J.Immunol.Methods 183(1995),7-13)。嵌合抗体的产生在例如WO89/09622中描述。根据本发明使用的抗体的另一个来源是所谓的异种抗体。在小鼠中产生异种抗体如人抗体的一般原理描述于例如WO 91/10741,WO 94/02602,WO 96/34096和WO 96/33735中。根据本发明采用的抗体或其相应的免疫球蛋白链可以进一步用本领域已知的常规技术修饰,例如使用氨基酸缺失、插入、取代、添加和/或重组和/或本领域已知的任何其它修饰,单独使用或者组合使用。在免疫球蛋白链氨基酸序列的DNA序列中引入这种修饰的方法是本领域技术人员熟知的,见例如Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,1989。
术语“单克隆”或“多克隆抗体”(见Harlow and Lane,(1988),loc.cit.)还涉及所述抗体的保留或基本上保留它们的结合特异性的衍生物。所述衍生物的特别优选的实施方案进一步在下文描述,这种抗体的其它优选衍生物是嵌合抗体,其包含例如小鼠或大鼠可变区和人恒定区。
术语“scFv片段”(单链Fv片段)是本领域熟知的并且因为其小尺寸及能重组产生这种片段的可能性而是优选的。
抗体可以是人源化抗体。术语“人源化抗体”根据本发明是指非人来源的抗体,其蛋白质序列已被修饰以增加其与人类中天然产生的抗体变体的相似性。人源化抗体的产生可以例如通过将合适CDR编码区段(负责希望的结合性质)如CDR3及优选地所有6个CDR插入人抗体“骨架”中而实现。产生人源化抗体的方法描述于例如EP-A1 0 239 400和WO 90/07861。
术语“抗体轻链”是指抗体的小多肽亚基,而术语“抗体重链”是指抗体的大多肽亚基。典型抗体由两个免疫球蛋白(Ig)重链和两个Ig轻链组成。每个轻链由两个串联免疫球蛋白结构域组成,一个恒定(CL)结构域和一个对结合抗原重要的可变(VL)结构域。重链决定抗体的类别或同种型。每个重链具有两个区域,即恒定区(其对于相同类别的所有免疫球蛋白均是相同的,但是在类别之间不同)和可变区,所述可变区在不同B细胞间是不同的,但是对于由相同B细胞或B细胞克隆产生的所有免疫球蛋白均是相同的。任何重链可变结构域由单个免疫球蛋白结构域组成。
抗体的“功能性Fc结构域”是本领域技术人员熟知的术语,是基于抗体的木瓜蛋白酶裂解而定义。根据它们重链恒定区的氨基酸序列,免疫球蛋白分成如下类别:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中一些可以进一步分成亚类(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1和IgA2。根据重链恒定区,免疫球蛋白的不同类别分别被称为[α]、[β]、[ε]、[γ]和[μ]。基于补体活化、C1q结合和Fc受体结合,抗体的功能性Fc结构域直接参与ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(补体依赖性细胞毒性)。4种人IgG同种型以不同亲和性结合不同受体,如新生Fc受体、激活性Fcγ受体、FcγRI、FcγRIIa和FcγRIIIa、抑制性受体FcγRIIb和C1q,产生非常不同的活性。已知对人抗体的Fc结构域的激活性和抑制性受体的亲和性可以被工程化和修饰(见Strohl W.(2009)Curr Opin Biotechnol,20,p.685-691)。
优选地,Fc结构域是一或多个人功能性Fc结构域,其允许延长本发明多肽的体内半衰期,其中一些哺乳动物的免疫应答指向融合蛋白的本发明多肽成分的特异性靶结合位点,例如在下述治疗、预防和/或诊断应用中。更优选地,这种人功能性Fc结构域是IgG1抗体的。本发明多肽可以融合到一或多个功能性Fc结构域的N-末端或C-末端,或者融合到一或多个功能性Fc结构域的N-末端和C-末端。优选地,本发明的融合蛋白包含融合于一或多个、优选一个Fc结构域的至少一侧、优选N-末端的本发明多肽的多聚体,优选四聚体、三聚体,或者最优选二聚体。
在本发明更优选的实施方案中,Fc结构域是具有激活或沉默效应子功能的IgG1的一或多个工程化人功能性Fc结构域,优选具有沉默效应子功能的IgG1一或多个具有在L234和L235的突变的的工程化人功能性Fc结构域,所述编号根据Kabat的EU索引(见JohnsonG.and Wu T.T.(2000)Nucleic Acids Res.28,p.214-218),最优选具有突变L234A和L235A。
本发明的融合构建体中的抗体优选特异性结合TNFα。术语“特异性结合”是指其中结合TNFα的结合平衡常数KD与本发明的融合构建体结合不相关蛋白质的结合平衡常数相比小2倍、优选小5倍或小10倍,所述不相关蛋白质不是TNF家族成员或者是TNF家族不同成员如TNFβ。
根据本发明融合构建体的另一个优选的实施方案,本发明多肽位于所述进一步化合物的C-末端的下游,所述进一步化合物由抗体轻链、抗体重链、抗体Fc结构域或其组合组成或包含抗体轻链、抗体重链、抗体Fc结构域或其组合。
这种进一步的化合物可以直接融合多肽或经接头融合。因此,融合构建体可以(直接)融合于所述进一步化合物的C-末端,更具体地通过在C末端氨基酸的羧基和N-末端氨基酸的氨基之间形成肽键而融合,或者可以经接头连接于所述进一步化合物的C-末端。
合适的接头属于本领域技术人员支配范畴。本发明的接头优选选自具有1-30个碳原子的烷基、具有1-20个乙烯部分的聚乙二醇、具有1-20个残基的聚丙氨酸、己酸、取代或未取代的聚-p-亚苯和triazol。优选是肽接头,更特别是具有2-30个氨基酸长度的寡肽。有意地,也设想使用单个氨基酸。优选的长度范围是从5到15个氨基酸。其它优选长度是3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19或20个氨基酸。
特别优选的是这样的接头,所述接头是由至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100%的小氨基酸如甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸组成的肽。特别优选的是仅由甘氨酸和丝氨酸组成的接头。最优选的是SEQ ID NO:13-15的接头,特殊优选的接头是由SEQ ID NO:15的序列组成的肽。
根据本发明融合构建体的另一个优选实施方案,所述进一步化合物包含抗体轻链或由抗体轻链组成,所述抗体轻链包含SEQ ID NO:11或由SEQ ID NO:11组成。
SEQ ID NO:11是抗TNFα抗体的轻链。应理解SEQ ID NO:11也可以直接融合本发明多肽或者经接头连接。因此,融合构建体可以(直接)融合于所述进一步化合物的C-末端,更具体地通过在C末端氨基酸的羧基和N-末端氨基酸的氨基之间形成肽键而融合,或者可以经接头连接于所述进一步化合物的C-末端。优选的接头包含选自SEQ ID NO:13-15的序列或由选自SEQ ID NO:13-15的序列组成,其中SEQ ID NO:15是最优选的。本实施方案融合构建体的特别优选的例子包含SEQ ID NO:16或17或由SEQ ID NO:16或17组成,其中SEQ IDNO:16是最优选的。
在进一步实施方案中,本发明涉及构建体,其包含至少一个拷贝、优选两个拷贝的融合构建体和至少一个拷贝、优选两个拷贝的SEQ ID NO:12的抗体重链或由至少一个拷贝、优选两个拷贝的融合构建体和至少一个拷贝、优选两个拷贝的SEQ ID NO:12的抗体重链组成,所述融合构建体包含抗体轻链或由抗体轻链组成,所述抗体轻链包含SEQ ID NO:11或由SEQ ID NO:11组成。
SEQ ID NO:12是抗TNFα抗体的重链。因此,本实施方案的构建体至少包含本发明的结合糖基化IL-17A的多肽、抗TNFα抗体的轻链(SEQ ID NO:11)和抗TNFα抗体的重链(SEQID NO:12),其中本发明的结合糖基化IL-17A的多肽和抗TNFα抗体的轻链形成融合体。优选的是本发明构建体中的轻链和重链拷贝数相同。抗体的轻链成分当与抗体的重链成分一起时提供了识别TNFα的抗原结合位点的形成。在构建体包含各2个拷贝的抗TNFα抗体的轻链(SEQ ID NO:11)和抗TNFα抗体的重链(SEQ ID NO:12)的情况中,所述构建体优选包含完整的抗TNFα抗体,其中所述抗体每个轻链与本发明多肽直接融合或经接头融合。这种构建体的优选实例描述于下述实施例4及示于表4。
根据一个优选的实施方案,本发明涉及构建体,所述构建体包含至少一个拷贝、优选两个拷贝的融合构建体和至少一个拷贝、优选两个拷贝的SEQ ID NO:12的抗体重链或由至少一个拷贝、优选两个拷贝的融合构建体和至少一个拷贝、优选两个拷贝的SEQ ID NO:12的抗体重链组成,所述融合构建体包含SEQ ID NO:16或17或由SEQ ID NO:16或17组成(其中优选SEQ ID NO:16)。
优选的是这个构建体包含两个拷贝的融合构建体和两个拷贝的SEQ ID NO:12的抗体重链或由两个拷贝的的融合构建体和两个拷贝的SEQ ID NO:12的抗体重链组成,所述融合构建体包含SEQ ID NO:16或17或由SEQ ID NO:16或17组成(其中优选SEQ ID NO:16)。这种构建体可以因此包含完整抗TNFα抗体。
在本发明构建体中,优选的是本发明多肽位于包含SEQ ID NO:11或由SEQ ID NO:11组成的轻链的C末端下游。
本发明的构建体能同时结合两个靶分子,即一方面糖基化白介素-17A和另一方面TNFα。所述构建体包含由于本发明多肽存在所带来的功能性糖基化IL-17A结合位点。
本发明的构建体可以通过在合适条件下将所述融合蛋白与所述抗体重链组合在一起而获得。本领域技术人员了解合适条件。这种在合适条件下组合在一起提供了由包含在上述融合蛋白中的抗体轻链和所述抗体重链之间的相互作用触发的非共价组合。优选地,在本发明构建体中存在在抗体中常见的二硫键。二硫键典型存在于铰链区附近,连接两个重链和/或一个轻链和一个重链。
本发明进一步涉及编码本发明多肽或本发明的融合构建体的核酸分子或者编码本发明构建体的一或多个核酸分子。
编码本发明的构建体的一或多个核酸分子可以例如是两个核酸分子,其中一个核酸分子编码本发明的融合构建体,另一个核酸分子编码抗体重链。
本发明的核酸分子包括DNA如cDNA,和mRNA。进一步包括本领域已知的核酸模拟分子如DNA或RNA的合成或半合成衍生物及混合的聚合物,正义链和反义链均是如此。它们可以含有额外的非天然或衍生的核苷酸碱基,本领域技术人员对此容易理解。在优选的实施方案中,多核苷酸或核酸分子是DNA。本发明的这种核酸模拟分子或核酸衍生物包括硫代磷酸核酸、氨基磷酸酯核酸、2’-O-甲氧乙基核糖核酸、吗啉代核酸、己糖醇核酸(HNA)和锁核酸(LNA)(参见例如,Braasch and Corey,Chemistry&Biology 8,1-7(2001))。LNA是RNA衍生物,其中核糖环由2’-氧和4’-碳之间的亚甲基连接形成(contrained)。
为本发明目的,肽核酸(PNA)是聚酰胺型DNA类似物。腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的相应衍生物的单体单元是商业可获得的(例如来自Perceptive Biosystems)。PNA是合成的DNA模拟物,由酰胺骨架代替DNA或RNA的糖-磷酸骨架。结果是,DNA的一些成分如磷、磷氧化物或脱氧核糖衍生物在PNA中不存在。
本发明的PNA嵌合体是包含一或多个PNA部分的分子。嵌合分子的其余部分可以包含一或多个DNA部分(PNA-DNA嵌合体)或者一或多个(多)肽部分(肽-PNA嵌合体)。本发明的肽-DNA嵌合体是包含一或多个(多)肽部分和一或多个DNA部分的分子。本发明还涵盖包含PNA、肽和DNA部分的分子。嵌合分子的部分的长度可以从1至n-1个碱基、其等价物或氨基酸,其中“n”是整个分子的碱基、其等价物和氨基酸的总数目。
与上述PNA、(多)肽、PNA嵌合体及肽-DNA嵌合体相关的术语“衍生物”涉及分子,其中这些分子包含一或多个进一步的不同于PNA、(多)肽和DNA的基团或取代基。本领域已知并且用于合成这些分子的所有基团或取代基如保护基团和/或用于涉及这些分子的应用的所有基团或取代基如标记和(可裂解)接头均包括在本发明中。
在核酸分子包含(而非具有)所列举的序列的实施方案中,在具体序列的5’末端或者3’末端或者两个末端上延伸额外的核苷酸。这些额外序列可以是异源或同源性质的,并且可以包含大约50-500个核苷酸序列段,但是不排除更高或更低的值。在同源序列情况中,这些实施方案不包括完整基因组并且通常限于在5’和/或3’末端有大约1500个额外核苷酸。
额外的异源序列可以包括异源启动子,其与上述分子的编码序列可操纵地连接。因此,优选地所述核酸分子可操纵地与启动子连接,更优选地与选自T5启动子/lac操纵子元件、T7启动子/lac操纵子元件的原核启动子或者选自hEF1-HTLV、CMV enh/hFerL启动子的真核启动子的启动子可操纵地连接。
本发明还涉及包含一或多个本发明的核酸分子的一或多个载体以及包含一或多个本发明的核酸分子或者一或多个本发明的载体的一或多个宿主细胞。
载体和分离的细胞特别是宿主细胞可以是适合目的例如产生本发明的多肽、融合构建体和/或构建体的任何常规类型,和/或治疗有用的载体和宿主细胞,例如用于基因治疗。本领域技术人员能够从丰富现有技术中选择核酸分子、载体和宿主细胞并且用常规方法不需过度负担地证实它们用于希望目的的具体适合性。
还优选的是本发明的一或多个载体包含本发明的一或多个核酸,并且优选能产生本发明的多肽或融合蛋白。优选地这样的载体选自pQE载体、pET载体、pFUSE载体、pUC载体、YAC载体、噬菌粒载体、噬菌体载体、用于基因治疗的载体如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒。对于载体修饰技术,参见Sambrook and Russel(2001),loc.Cit。通常,载体可以含有一或多个用于克隆或表达的复制起点(ori)和遗传系统,一或多个标记用于在宿主中选择例如抗生素抗性,及一或多个表达盒。合适的复制起点(ori)包括例如Col E1复制起点、SV40病毒复制起点及M 13复制起点。
本发明的一或多个核酸分子也可以插入一或多个载体中,由此产生与另一种核酸分子的翻译融合体。所述其它核酸分子优选编码抗TNFα抗体的轻链和/或重链和/或接头,优选的例子在上面描述。
所述一或多个宿主细胞可以通过将本发明的一或多个核酸分子或者一或多个载体导入一或多个宿主细胞(其存在介导由所述核酸分子或载体编码的多肽的表达)而产生。宿主细胞优选是分离的宿主细胞,即细胞不是在活生物体中。宿主可以是任何原核或真核细胞。合适的真核宿主可以是哺乳动物细胞、两栖类细胞、鱼细胞、昆虫细胞、真菌细胞或植物细胞。真核细胞可以是昆虫细胞如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞,酵母细胞如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞,真菌细胞如曲霉细胞或者脊椎动物细胞。在后种情况中,优选所述细胞是哺乳动物细胞如人细胞。细胞可以是细胞系的一部分。
合适的原核生物/细菌是通常用于克隆的那些,如大肠杆菌(E.coli)(例如,Ecoli菌株HB101、DH5a、XL1Blue、Y1090和JM101)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、荚壳布克氏菌(Burkholderiaglumae)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、变青链霉菌(Streptomyceslividans)、乳酸乳杆菌(Lactococcus lactis)、耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。用本发明的核酸分子或载体基因工程化的宿主细胞的优选例子是大肠杆菌。
本发明还涉及药物或诊断组合物,其包含本发明的多肽、本发明的融合构建体、本发明的构建体、一或多个本发明的核酸分子、一或多个本发明的载体、一或多个本发明的宿主细胞或其任何组合。
如本文上述更详细的讨论,IL-17A参与许多疾病。因此,本发明的多肽、融合构建体、构建体、核酸分子、载体、宿主细胞或其任何组合可用作药物。优选的是在所述药物组合物中本发明的多肽、融合构建体、构建体、核酸分子、载体、宿主细胞或其任何组合是唯一活性剂。药物组合物优选给哺乳动物如家畜和宠物动物施用。最优选给人类施用。本文描述的药物组合物以合适剂量给对象施用。
本发明应用的药物组合物可以根据本领域的方法以常规方式配制,使用一或多种生理学载体或赋形剂,见例如Ansel et al.,“Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems”,7th edition,Lippincott Williams&Wilkins Publishers,1999。因此,药物组合物可以在剂量单元配制品中口服、肠胃外施用,如皮下、静脉内、肌内、腹膜内、鞘内、经皮、经粘膜、硬膜下、经离子导入而局部或体表(topically)、舌下、经吸入喷雾、气溶胶或直肠等施用,所述配制品任选地包含常规药物学可接受赋形剂。另外本发明的诊断组合物可以以任何常规方式制造。
本发明的药物组合物可以作为单一活性成分施用或者与其它药物共同施用(例如作为其它药物的佐剂或与其它药物组合),例如,用于治疗或预防上述疾病,所述其它药物例如免疫抑制剂或免疫调节剂或其它抗炎药。例如,本发明的多肽、融合构建体和构建体可以与下述物质联合使用:免疫抑制单克隆抗体,例如具有对白细胞受体或其配体的亲和性的单克隆抗体,所述白细胞受体例如为MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86;其它免疫调节化合物,例如具有至少一部分CTLA4或其突变体的胞外结构域的重组结合分子,例如与非CTLA4蛋白质序列连接的CTLA4或其突变体的至少胞外部分,例如CTLA4Ig(例如,ATCC 68629)或其突变体,例如LEA29Y;粘附分子抑制剂,例如LFA-I拮抗剂、ICAM-1或ICAM-3拮抗剂、VCAM-4拮抗剂或VLA-4拮抗剂。另外,本发明的多肽、融合构建体和构建体可以联合如下物质使用:DMARD(疾病修饰的抗风湿药)、金盐、柳氮磺吡啶、抗疟疾药、甲氨蝶呤、D-青霉胺、硫唑嘌呤、霉酚酸、环孢素A、他克莫司、西罗莫司、米诺环素、来氟米特、糖皮质激素;钙神经素抑制剂,例如环孢菌素A或FK 506;淋巴细胞再循环调节剂,例如FTY720和FTY720类似物;mTOR抑制剂,例如雷帕霉素、40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素、CCI779、ABT578、AP23573或TAFA-93;具有免疫抑制性质的子囊霉素,例如ABT-281、ASM981等;皮质类固醇;环磷酰胺;咪唑硫嘌呤;甲氨蝶呤;来氟米特;咪唑立宾;霉酚酸;吗替麦考酚酯;15-deoxyspergualine或其免疫抑制同系物、类似物或衍生物;或化疗剂,例如紫杉醇、吉西他滨、顺铂、多柔比星或5-氟尿嘧啶;(其它)抗-TNFα剂,例如TNFα的单克隆抗体(优选包含SEQ ID NO:11和/或12),例如英夫利昔单抗、阿达木单抗、CDP870或者TNF-RI或TNF-RII的受体构建体,例如依那西普、PEG-TNF-RI;促炎性细胞因子阻断剂、IL-1阻断剂,例如阿那白滞素或IL-1陷阱(trap)、AAL160、ACZ 885、IL-6阻断剂;蛋白酶抑制剂或激活物,例如金属蛋白酶、抗IL-15抗体、抗IL-6抗体、抗IL-23抗体、抗IL-22抗体、抗IL-21抗体、抗IL-12抗体、抗IFN-γ抗体、抗IFN-α抗体、抗CD20抗体、抗IL-17抗体、抗-IgGE抗体、NSAID如阿司匹林或者抗感染剂。其它合适药物可包括ACE抑制剂、肾素抑制剂、ADH抑制剂、醛固酮抑制剂和血管抑素受体阻断剂。自然地,这些列举的共施用药物不是限制性的也不是全部的。
一般而言,本发明的药物组合物用于治疗或预防IL-17A介导的疾病。
本发明的药物组合物优选包含药物学可接受载体或赋形剂。“药物学可接受载体或赋形剂”是指非毒性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包囊材料或任何类型的配制辅料。药物学可接受载体或赋形剂的例子在例如Ansel et al.,“Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems”,7th edition,Lippincott Williams&WilkinsPublishers,1999中描述。
本发明的诊断组合物用于检测例如在不同细胞、组织或另一种合适样品中的不希望的生理学糖基化IL-17A水平、特别是SEQ ID NO:10的糖基化IL-17A。所述检测典型地包括将样品与本发明的多肽、融合构建体、构建体、核酸分子、载体、宿主细胞或其任意组合接触,及检测样品中糖基化IL-17A、特别是SEQ ID NO:10的糖基化IL-17A的存在。因此,本发明的诊断组合物可用于评估疾病发作或疾病状态,特别是下文进一步定义的疾病状态。
在本文上述的本发明的一个实施方案中,本发明多肽与荧光染料、光敏剂、放射性核素或用于医学成像的造影剂连接。这种融合构建体特别适合诊断应用。
如果诊断组合物例如用于鉴定对象中不希望的生理学糖基化IL-17A水平的位点,本发明的诊断组合物可以作为单一活性剂施用或者可以与其它试剂组合施用。在一般术语中,本发明的诊断组合物用于诊断IL-17A介导的疾病。
本发明的诊断和药物组合物的剂量当然根据如下因素而变化:本发明的特定多肽、融合构建体、构建体、一或多个核酸分子、一或多个载体、一或多个宿主细胞或其任何组合、个体患者组或患者、进一步的诊断或医学活性化合物的任选存在以及待诊断或治疗的疾病性质和严重性。但是,目前优选的是诊断或药物组合物在大约0.01mg至大约20mg/kg体重的剂量使用,优选大约0.1mg至大约5mg/kg体重。诊断或药物组合物可以施用一次以上,例如在诊断组合物情况中用以监测病程,或者在药物组合物情况中用以延长治疗。优选地,诊断或药物组合物的施用频率是每日至大约每3个月一次的范围,优选地大约每2周一次至大约每10周一次,更优选地每4-8周一次。优选的剂量方案涉及每月一次至每2-3个月一次或更低频率施用本发明的诊断或药物组合物。
在本发明一个优选实施方案中,所述药物组合物用于治疗炎性、自身免疫性和/或骨质流失相关的疾病。
在本发明一个更优选实施方案中,所述疾病选自下组:关节炎、风湿性疾病、脊椎关节病、强直性脊柱炎、Reiter综合征、过敏症(包括呼吸道过敏症和皮肤过敏症)、变态反应、系统性红斑狼疮、炎性肌肉疾病、多软骨炎、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、皮肌炎、Steven-Johnson综合征、慢性活动型肝炎、重症肌无力、银屑病、特发性口炎性腹泻、自身免疫炎性肠病、溃疡性结肠炎、克隆氏病、肠激惹综合征、内分泌性眼病、Graves病、结节病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、青少年糖尿病(I型糖尿病)、自身免疫性血液病、溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血、特发性血小板减少症、眼色素层炎(前和后)、干燥性角结膜炎、春季角结膜炎、肺间质纤维化、肾小球肾炎(具有或不具有肾病综合征)、特发性肾病综合征或微小病变肾病、肿瘤、皮肤炎性疾病、角膜炎症、肌炎、骨植入物松动、代谢疾病、动脉粥样硬化、糖尿病,以及血脂异常、骨质流失、骨关节炎、骨质疏松症、牙周病、梗阻性或炎性呼吸道疾病、哮喘、支气管炎、尘肺病、肺气肿、急性和超急性炎症反应、急性感染、败血症休克、内毒素性休克、成人呼吸窘迫综合征、脑膜炎、肺炎、重度烧伤、恶病质消耗综合征、中风、疱疹性间质角膜炎和干眼病,所述关节炎优选类风湿性关节炎、慢性进展性关节炎(arthritis chronica progrediente)、反应性关节炎、牛皮癣关节炎、肠病性关节炎和变形性关节炎。.
所有上述疾病的共同之处是它们的起源和/或症状是IL-17A和/或Th-17相关的。
附图说明
图1显示本发明的IL-17A结合多肽的大小排阻层析图(SEC):(A)1L3-B09(SEQ IDNO:3),(B)11L0-C6(SEQ ID NO:4),(C)11L5-B06(SEQ ID NO:5),(D)11L6-F03(SEQ ID NO:6),(E)11L9-C09(SEQ ID NO:7),(F)11L10-A05(SEQ ID NO:8),(G)11L11-A09(SEQ ID NO:9)。
图2示出本发明的Fyn SH3衍生多肽对糖基化和非糖基化IL-17A的剂量依赖性体外抑制结果。A)1L3-B09(SEQ ID NO:3),(B)11L0-C6(SEQ ID NO:4),(C)11L5-B06(SEQ IDNO:5),(D)11L6-F03(SEQ ID NO:6),(E)11L9-C09(SEQ ID NO:7),(F)11L10-A05(SEQ IDNO:8)。
图3示出WO2011/023685中描述的Fyn SH3衍生的结合剂对糖基化和非糖基化IL-17A的剂量依赖性体外抑制结果:(A)Fyn SH3衍生的IL-17结合剂2C1(WO2011/023685中描述的SEQ ID NO:107);(B)Fyn SH3衍生的IL-17结合剂A1_2(“A1”)(WO2011/023685中描述的SEQ ID NO:53);(C)Fyn衍生的IL-17结合剂B1_2(“B1”)(WO2011/023685中描述的SEQ IDNO:39)。
图4示出本发明的双特异性IL-17A/TNFα的大小排阻层析图(SEC):(A)LC11L5-B06(具有分别由SEQ ID NO:12和16的序列组成的重链和轻链的双特异性构建体(根据本发明))和(B)LC11L9-C09(具有分别由SEQ ID NO:12和17的序列组成的重链和轻链的双特异性构建体(根据本发明))。
图5显示双特异性抗IL-17A/TNFα融合蛋白对IL-17A和TNFα的同时抑制。示出用200pM TNFα和400pM IL-17A刺激HT-29细胞后上清中的Gro-αELISA水平。在加入指示浓度的LC11L5-B06(SEQ ID NO:12(重链)和16(轻链融合体))(图5.A)或LC11L9-C09(SEQ IDNO:12(重链)和17(轻链融合体))(图5.B)后,可以观察到IL-17A和TNFα的剂量依赖性抑制,因为Gro-α水平随着更高抑制剂浓度而下降。作为对照,细胞用单一细胞因子(IL-17A或TNFα)或用仅培养基处理。示出一式三份的平均值,误差杆代表标准偏差(SD)。
图6示出人IL-17A和TNFα的体内抑制。(A)和(B):小鼠用LC11L5-B06(称为“LC-B06”)(SEQ ID NO:12(重链)和16(轻链融合体))静脉内(i.v.)注射,随后皮下注射人IL-17A(hIL-17A)(A)或人TNFα(hTNFα)(B)。施用指定细胞因子后2小时,从小鼠取血样,经ELISA检测KC水平。还显示了接受抗TNFα抗体(图6.B)(“aTNFαmAb”)或PBS静脉内注射的小鼠。作为对照,示出基础KC水平(仅用PBS(i.v.)处理无细胞因子刺激的小鼠)。(C)和(D):LC11L9-C09(称为“LC-C09”)(SEQ ID NO:12(重链)和17(轻链融合体))静脉内(i.v.)注射进小鼠,随后皮下注射IL-17A(C)或TNFα(D)。施用指示的细胞因子后2小时,从小鼠取血样并经ELISA检测KC水平。还示出接受静脉内注射抗TNFα抗体(图6.D)(“aTNFαmAb”)或PBS的小鼠。作为对照,示出基础KC水平(用仅PBS处理(i.v.)无细胞因子刺激的小鼠)。每组5只小鼠的平均KC水平被示出(±SEM)。
图7示出在单次静脉内注射进C57BL/6小鼠中之后不同时间点的血清浓度(A)LC11L5-B06(SEQ ID NO:12(重链)和16(轻链融合体))及(B)LC11L9-C09(SEQ ID NO:12(重链)和17(轻链融合体))。使用TNFα和IL-17A作为捕获剂(在括号中示出)经ELISA确定血清浓度。使用最后时间点(24h-168h)计算末端半衰期。5只小鼠的平均血清浓度对时间作图,误差杆表示标准偏差(SD)。
图8示出SEQ ID NO:3-9及20的序列对比。SEQ ID NO:3-9相应于本申请实施例中的内部命名,如图8所示。
图9示出本发明的Fyn SH3衍生多肽11L11-A09(SEQ ID NO:9)对糖基化和非糖基化IL-17A的剂量依赖性体外抑制的结果。
图10示出双特异性抗-IL-17A/TNFα融合蛋白LC11L5-B06和LC11L9-C09对IL-17A的抑制。在用IL-17A和IL-1β(“IL-17A/IL-1β”)刺激NHDF细胞后示出细胞培养物上清中的IL-6ELISA水平。在加入指示浓度的LC11L5-B06(SEQ ID NO:12(重链)和16(轻链融合体))或LC11L9-C09(SEQ ID NO:12(重链)和17(轻链融合体))后,观察到IL-17A介导的IL-6释放的剂量依赖性抑制。在对照实验中,细胞用单一细胞因子(“IL-17A”或“IL-1β”)处理或者仅用细胞培养基(“培养基”)处理。示出一式三份的平均值,误差杆表示标准偏差(SD)。
图11示出夹心ELISA和直接ELISA方法。(左侧)进行夹心ELISA以检测完整的LC11L5-B06和LC11L9-C09分子。生物素化TNF固定化在亲和素(neutravidin)包被的微滴定96孔板的孔中。将含有LC11L5-B06或LC11L9-C09的血浆加入到孔中。为进行检测,使用地高辛标记的IL-17A,随后是抗地高辛抗体-HRP缀合物以用于底物加工和显色。(右侧)进行直接ELISA以检测特异性TNF结合。生物素化TNF固定化在亲和素包被的微滴定96孔板的孔中。将含有LC11L5-B06或LC11L9-C09的血浆加入到孔中。结合的LC11L5-B06或LC11L9-C09用用于底物加工和显色的抗人IgG抗体-HRP缀合物检测。
图12示出在单次i.v.注射进食蟹猴中之后不同时间点的(A)LC11L5-B06(SEQ IDNO:12(重链)和16(轻链融合体))和(B)LC11L9-C09(SEQ ID NO:12(重链)和17(轻链融合体))的血浆浓度。血浆浓度经夹心ELISA确定,使用作为捕获剂的TNFα及地高辛标记的IL-17A,随后抗地高辛抗体-HRP缀合物用作底物加工及显色。3只食蟹猴的平均血浆浓度对时间作图,误差杆代表标准偏差(SD)。
图13示出用夹心ELISA和直接ELISA确定的食蟹猴中的LC11L5-B06(A)或LC11L9-C09(B)的血浆浓度。两种蛋白质的血浆浓度是相当的,表明LC11L5-B06和LC11L9-C09在食蟹猴中稳定至少220小时。
实施例举例示出本发明。
实施例1:通过单克隆裂解物ELISA确定本发明的Fyn SH3衍生的多肽结合IL-17A
方法
使用Schlatter et al.(Schlatter et al.(2012)mAbs,4(4)p.497-50)所述的Fynomer噬菌体文库,用重组IL-17A(R&D Systems)作为抗原及标准噬菌体展示作为选择技术(Grabulovski D.et al.,(2007)J Biol Chem 282,p.3196-3204,Viti,F.et al.(2000)Methods Enzymol.326,480-505),分离了特异于IL-17A的Fyn-SH3衍生的结合蛋白。本发明的Fyn SH3衍生的多肽1L3-B09(SEQ ID NO:3)携带n-src-环序列“STHEYE”(SEQ ID NO:2),其在选择过程中被富集。1L3-B09(SEQ ID NO:3)结合IL-17A(见实施例2)并且令人惊奇地发现抑制糖基化IL-17A与非糖基化IL-17A一样好(见实施例3)。为了获得具有更高亲和性的Fyn SH3衍生的IL-17A结合剂,使用1L3-B09(SEQ ID NO:3)作为模板进行亲和性成熟。n-src-环序列“STHEYE”(SEQ ID NO:2)保持恒定并且与随机化RT-环集合(SEQ ID NO:1中命名为(X1)(X2)(X3)(X4)(X5)(X6)的6个氨基酸残基)组合。亲和性成熟文库产生方法基本上与用随机化RT-环克隆文库所述一样(“library 0”在Schlatter et al.(2012)mAbs,4(4)p.497-50中的“文库0”)。
在和亲和性成熟选择之后,通过裂解物ELISA筛选富集的FynSH3衍生的结合IL-17A的多肽。编码Fyn SH3衍生的结合蛋白的DNA克隆到细菌表达载体pQE12(Qiagen)中,这样所得构建体携带如Grabulovski等(Grabulovski et al.(2007)JBC,282,p.3196-3204)所述的C-末端myc-六组氨酸标记。在96孔形式中在大肠杆菌细胞溶胶中表达多肽,如Bertschinger等(Bertschinger et al.(2007)Protein Eng Des Sel 20(2):p.57-68)所述制备每孔200μl澄清裂解物。简而言之,从琼脂平板挑取转化细菌菌落,在200μl含有100μg/ml氨苄青霉素和0.1%(w/v)葡萄糖的2xYT培养基中生长于圆底96孔板(Nunc,cat.no.163320)中。在37℃和200r.p.m.生长3小时后,通过加入1mM IPTG(Applichem,Germany)而诱导蛋白质表达。在摇床(200r.p.m.,30℃)中过夜表达蛋白质。随后,在1800g离心96孔板10分钟,弃上清。细菌沉淀重悬于200μl含有1mg/ml溶菌酶的裂解缓冲液(50mMNaH2PO4,300mM NaCl,10mM咪唑,pH 8.0)在,置于冰上30分钟。之后,在水浴中经超声裂解细菌细胞(6次脉冲,10秒),然后在1800g离心10分钟。单克隆细菌裂解物用于ELISA:生物素化IL-17A(在HEK EBNA细胞中产生,生物素化根据厂商指导用NHS-PEO4-生物素(Pierce)进行)固定化在链霉抗生物素蛋白包被孔(StreptaWells,High Bind,Roche)中,用PBS,2%牛奶(Rapilait,Migros,Switzerland)封闭后,加入50μl含有6μg/ml抗myc抗体9E10(终浓度3μg/ml)的PBS,4%牛奶和50μl细菌裂解物。在保温1小时和洗涤后,用抗小鼠HRP抗体缀合物(Sigma)检测结合的Fyn SH3衍生的多肽。过氧化物酶活性检测通过加入BM blue POD底物(Roche)进行,通过加入1M H2SO4终止反应。特异性结合剂的DNA序列通过DNA测序验证。
结果
结合IL-17A的ELISA阳性Fyn SH3衍生多肽的氨基酸序列示于序列表中的SEQ IDNO:3-9。
实施例2:本发明的Fyn SH3衍生多肽以高亲和性结合糖基化人IL-17A
本实施例示出Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽的表达产量及通过大小排阻色谱和表面等离子体共振实验对这些多肽的鉴定。
方法
a)Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽的表达产量
如Grabulovski等(Grabulovski et al.(2007)JBC,282,p.3196-3204)所述,FynSH3衍生的IL-17A结合多肽在TG1E.coli的细胞溶胶中表达及纯化。
b)大小排阻层析(SEC)
对于亲代Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽1L3-B9(SEQ ID NO:3),在FPLC系统上用Superdex 75 Short Column(5/150)(GE Healthcare)进行大小排阻层析(SEC)。亲和性成熟的克隆11L0-C06(SEQ ID NO:4)、11L5-B06(SEQ ID NO:5)、11L6-F03(SEQ IDNO:6)、11L9-C09(SEQ ID NO:7)、11L10-A05(SEQ ID NO:8)和11L11-A09(SEQ ID NO:9)的SEC在Agilent Technologies 1200Infinity Series HPLC仪上用SEC-3柱(Agilent)进行。
c)亲和性测量
用BIAcore T200仪器(GE Healthcare)进行亲和性测量。对于糖基化IL-17A(在HEK EBNA细胞中产生)和单体Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽之间的相互作用分析,使用Series S CM5芯片(GE Healthcare)与用Amine偶联试剂盒(GE Healthcare)固定化的2000RU IL-17A。运行缓冲液是含有0.05%Tween 20的PBS。在30μl/min流速及注射不同浓度Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽测量相互作用。所有相互作用的动力学数据用BIAcoreT200评估软件进行评估。
结果
a)表达产量
在非优化条件下在摇瓶中,本发明的单体Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽的表达产量范围为14-57mg/升细菌培养物(表1)。
表1.在TG1大肠杆菌细菌中产生的Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽的表达产量
b)大小排阻层析(SEC)
大小排阻层析(SEC)谱证实所有构建体主要作为单一单体峰洗脱(图1)。
c)亲和性测量
在BIAcore芯片上经实时相互作用分析结合性质,揭示了对于选择的IL-17A结合多肽的下述解离常数(KD)。
表2.Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽结合重组人糖基化IL-17A(在HEK EBNA细胞中产生的)的动力学常数
实施例3:本发明的Fyn SH3衍生多肽抑制糖基化IL-17A
测试了亲代克隆1L3-B09和本发明的5个具有对IL-17A的最高亲和性的亲和性成熟的Fyn SH3衍生多肽(11L0-C06(SEQ ID NO:4)、11L5-B06(SEQ ID NO:5)、11L6-F03(SEQID NO:6)、11L9-C09(SEQ ID NO:7)、11L10-A05(SEQ ID NO:8))抑制IL-17A的能力:IL-17A和TNFα在成纤维细胞中以剂量依赖方式诱导IL-6的产生。在各种浓度的本发明的Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽的存在和不存在下,通过用重组糖基化IL-17A(在HEK EBNA细胞中产生)和重组TNFα(Thermo Fisher Scientific)刺激人真皮成纤维细胞,测试了指示的FynSH3衍生的IL-17A结合多肽的抑制活性。在刺激24小时后取细胞培养物上清,经ELISA确定上清中的IL-6浓度。结果显示IL-17A结合多肽能特异性抑制糖基化IL-17A。
方法
为除去内毒素,用Acrodisc Mustang E膜(VWR)过滤蛋白质溶液3次。过滤后,根据鲎变形细胞溶解(LAL)测试(PYROGENT Single test Gel Clot LAL Assay(Lonza))确定,含有本发明的抑制性Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽的蛋白质溶液的内毒素水平小于0.1EU/ml。.
每孔(96孔板,TPP或Corning)分配100μl含有大约3900个正常人真皮成纤维细胞(PromoCell,NHDF-c,C12300)的细胞悬液,在37℃培养24小时(培养基:Fibroblast GrowthMedium C-23010,PromoCell)。吸取上清,将不同浓度的本发明的Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽与含有IL-17A和TNFα的培养基混合后(终浓度分别为1ng/ml和50pg/ml),每孔加入100μl相应的溶液。作为对照,PBS与含有IL-17A/TNFα的培养基混合(阳性对照=“无抑制剂”),及与仅具有单细胞因子IL-17A或TNFα的培养基混合(后者是“TNFα对照”孔)。作为阴性对照,PBS仅与培养基混合。为了比较,测定还使用相同条件用非糖基化IL-17A(R&DSystems)进行。在37℃保温24小时后,根据厂商指导用IL-6ELISA试剂盒(IL-6ELISA kit,R&D Systems)在ELISA中测试上清以确定IL-6浓度。绘图抑制百分比,用Prism 5软件计算IC50值。
IL-17A抑制百分比用如下公式确定:
结果
正常人真皮成纤维细胞与IL-17A/TNFα和指定的不同浓度的本发明的Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽温育。观察到本发明的Fyn SH3衍生的多肽抑制糖基化IL-17A。IC50值示于表3。图2显示指定的本发明的Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽抑制糖基化和非糖基化IL-17A的剂量依赖性抑制曲线。令人惊奇地发现本发明的Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽能够以相比于非糖基化IL-17A相似的强度完全抑制糖基化IL-17A。与先前发明的Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽(WO2011/023685)相比,这是有利的性质。图3显示WO2011/023685中描述的Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽的3个例子(Fyn SH3衍生的IL-17结合剂2C1(WO2011/023685所述的SEQ ID NO:107)、Fyn SH3衍生的IL-17结合剂A1_2(WO2011/023685中所述的SEQ ID NO:53)和Fyn SH3衍生的IL-17结合剂B1_2(“B1”)(WO2011/023685中所述的SEQ ID NO:39),它们甚至在高浓度也不完全抑制糖基化IL-17A,和/或显示出在糖基化和非糖基化IL-17A之间抑制强度(IC50值)的大差异(见图3)。
表3.所获得的Fyn SH3-衍生的IL-17A结合多肽抑制糖基化IL-17A的IC50值
实施例4:双特异性抗IL-17A/TNFα抗体-Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽融合体的表达和纯化产量
Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽(11L5-B06(SEQ ID NO:5)和11L9-C09(SEQ IDNO:7))经15个氨基酸的接头(接头:SEQ ID NO:15)遗传融合至抗TNFα抗体(SEQ ID NO:11)轻链的C-末端。所得双特异性抗IL-17A/TNFα构建体,命名为LC11L5-B06(具有分别由SEQID NO:12和16的序列组成的重链和轻链的双特异性构建体(根据本发明))和LC11L9-C09(具有分别由SEQ ID NO:12和17的序列组成的重链和轻链的双特异性构建体(根据本发明)),瞬时转染进FreeStyle CHO-S细胞,在无血清/无动物成分的培养基中表达6-10天。在Purifier仪器(GE Healthcare)上,经蛋白A亲和性层析(Mab Select Sure column;GE Healthcare)和大小排阻层析(SEC;Superdex G200,30/100GL column;GE Healthcare)从上清纯化蛋白质。通过在280nm吸光度测量确定浓度。产量列于表4。
表4.在瞬时转染的CHO-S细胞中双特异性抗体-Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽融合体的纯化产量
在纯化后,用FPLC系统和Superdex G200,30/100GL柱(GE Healthcare)进行大小排阻层析。纯化后的大小排阻层析(SEC)谱证实两种融合蛋白作为单一单体峰洗脱,显示融合蛋白具有优异的生物物理性质(图4)。
实施例5:抗体-Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽融合体对人和猕猴IL-17A和TNFα的亲和性测量
LC11L5-B06和LC11L9-C09对IL-17A(人和猕猴)及对TNFα(人和猕猴)的亲和性用BIAcore T200仪器(GE Healthcare)测量。Series S CM5芯片(GE Healthcare)用8000RU山羊抗人IgG Fc特异性抗体(Jackson Immunoresearch)包被。运行缓冲液是含有0.05%Tween 20的PBS。通过以30μl/min流速捕获大约400-500RU LC11L5-B06或LC11L9-C09,随后以30μl/min流速注射不同浓度的抗原测量相互作用。用BIAcore T200评估软件评估所有相互作用动力学数据。对人抗原的亲和性列于表5,对猕猴抗原的亲和性列于表6。
表5.抗体-Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽融合体结合重组人糖基化IL-17A和人TNFα的解离常数
表6.抗体-Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽融合体结合重组猕猴糖基化IL-17A和猕猴TNFα的解离常数.
实施例6:LC11L5-B06和LC11L9-C09同时抑制IL-17A和TNFα
IL-17A和TNFα在HT-29细胞(人结肠直肠腺癌细胞系)中以剂量依赖方式诱导Gro-α的产生。通过在各种浓度的LC11L5-B06和LC11L9-C09的存在和不存在下,用糖基化IL-17A和TNFα刺激HT-29细胞(人结肠直肠腺癌细胞系),测试指定构建体(LC11L5-B06和LC11L9-C09)的抑制活性。刺激48小时后取上清并且用ELISA测定Gro-α。
方法
LC11L5-B06或LC11L9-C09稀释进测定培养基(McCoy’s 5A培养基(GIBCO),补加10%FBS)。50μl每种指定浓度与50μl含有IL-17A(在HEK EBNA细胞中产生)和TNFα(ThermoFisher Scientific)的测定培养基混合,终浓度分别为400pM和200pM。作为对照,制备不含抑制剂的培养基。另外,制备具有仅单一细胞因子或不具有细胞因子的培养基。1小时保温后,将100μl含有大约20000个HT-29细胞(ATCC,#HTB-38)的细胞悬液加入溶液中并分配到每个孔(96孔板,TPP或Corning)中,在37℃和5%CO2培养48小时。在37℃温育48小时后,取上清,根据厂商指导经ELISA确定Gro-α浓度(Gro-αELISA kit,R&D Systems)。
结果
图5显示在用IL-17A、TNFα及其组合刺激后HT-29细胞上清中的Gro-α浓度(作为ELISA信号)。如图5所示,双特异性构建体LC11L5-B06和LC11L9-C09能同时以剂量依赖方式抑制IL-17A和TNFα。获得的表观IC50值(表7)证实本发明的双特异性化合物能够以高强度抑制IL-17A和TNFα。
表7.双特异性抗体-Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽融合体所获得的同时抑制IL-17A和TNFα的表观IC50值
实施例7:LC11L5-B06和LC11L9-C09在体内抑制IL-17A和TNFα
LC11L5-B06和LC11L9-C09在体内抑制IL-17A和TNFα的能力用在C57BL/6小鼠中的急性炎症模型确定。人IL-17A结合并刺激小鼠IL-17受体。当注射进小鼠时,IL-17A触发趋化因子KC(CXCL1)的大量增加,其在1-4小时内在所注射的小鼠的血清和灌洗液中可检测到。可对人TNFα进行类似观察,当注射进小鼠时其也导致KC血清水平的显著增加。
方法
小鼠(C57BL/6,Charles River)用在无内毒素的PBS中稀释的抑制剂LC11L5-B06(2mg/kg)、LC11L9-C09(2mg/kg)或者作为TNF抑制对照的商业可获得的抗TNFα抗体(2mg/kg)(阿达木单抗())静脉内注射(每组5只小鼠)。静脉内注射抑制剂3.5小时后,用人IL-17A或人TNFα经皮下施用(每个小鼠3μg IL-17A或者每个小鼠0.25μg TNFα)刺激KC表达。2小时后,取血液进行血清取样,用商业可获得的KC ELISA试剂盒根据厂商指导确定KC浓度(Quantikine mouse KC immunoassay,R&D Systems)。
结果
在将人IL-17A或TNFα皮下注射进小鼠后,动物过表达称为KC的趋化因子。小鼠血清中升高的KC水平可以通过ELISA测定。先前静脉内注射本发明的Fyn SH3衍生多肽融合体(LC11L5-B06和LC11L9-C09)和对照抗TNFα抗体(图6B和6D)防止了体内KC上调。图6显示LC11L5-B06(称为“LC-B06”)和LC11L9-C09(称为“LC-C09”)的强抑制性质。
实施例8:LC11L5-B06和LC11L9-C09在体内展示抗体样PK谱
本发明的融合蛋白LC11L5-B06和LC11L9-C09的体内药动学性质通过ELISA测量在单次静脉内注射后不同时间点采集的小鼠血清中的浓度而确定。
方法
LC11L5-B06和LC11L9-C09以10mg/kg的剂量静脉内注射进5只小鼠(C57BL/6,Charles River)中。10分钟、6、24、48、96、120、144和168小时后,用毛细Microvette CB 300(Sarstedt)从隐静脉取大约20μl血液。血样在9500x g离心10分钟,血清储存在-20℃直至进行ELISA分析。用具有已知浓度的LC11L5-B06和LC11L9-C09稀释系列,使用TNFα和IL-17A作为捕获剂经ELISA确定血清中的浓度:50μl生物素化IL-17A(120nM)(R&D Systems,用EZ-link NHS-PGE4-生物素(Pierce)根据厂商指导生物素化)或50μl生物素化TNFα(10nM)(Thermo Scientific,用EZ-link NHS-PGE4-生物素(Pierce)根据厂商指导生物素化)加入到链霉抗生物素蛋白包被的孔(Reactibind,Pierce)中,用200μl PBS、4%牛奶(Rapilait,Migros,Switzerland)封闭后,加入50μl稀释的血清样品(于PBS,4%牛奶)。在温育1小时及用PBS洗涤后,结合的抗体Fynomer融合蛋白用蛋白A-HRP缀合物(Sigma)检测。过氧化物酶活性通过加入QuantaRed增强的化学发光HRP底物(Pierce)检测。荧光强度在1-5分钟后在544nm(激发)和590nm(发射)测量。从在不同时间点血清中确定的LC11L5-B06和LC11L9-C09浓度和所得的清除期斜率k(以半对数规格作图),用公式t1/2=ln2/-k计算半衰期。
结果
LC11L5-B06和LC11L9-C09的血清浓度示于图7。两种融合蛋白的从清除期(β期,时间点24h-168h)确定的半衰期范围在4.9天和9.6天之间(见表8),其在小鼠中注射的标准抗体治疗剂的报道半衰期值的相同范围内。这些数据证实LC11L5-B06和LC11L9-C09具有IgG样体内PK性质。
表8.双特异性抗体-Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽融合体的末端半衰期值.
实施例9:本发明的Fyn-SH3衍生多肽11L11-A09抑制糖基化IL-17A
测试了Fynomer 11L11-A09(SEQ ID NO:9)抑制IL-17A的能力。
方法
实验条件与实施例3所述针对本发明其它Fyn SH3衍生多肽(SEQ ID NO:3-8)的相同。
结果
正常人真皮成纤维细胞与IL-17A/TNFα和不同浓度的本发明的Fyn-SH3衍生多肽11L11-A09(SEQ ID NO:9)温育。观察到11L11-A09(SEQ ID NO:9)抑制糖基化IL-17A,IC50值为66nM(表9)。图9显示本发明的Fyn-SH3衍生多肽11L11-A09(SEQ ID NO:9)的剂量依赖性抑制曲线,以相当的效力和功效抑制糖基化和非糖基化IL-17A。
表9.针对Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽11L11-A09(SEQ ID NO:9)获得的抑制糖基化IL-17A的IC50值.
实施例10:LC11L5-B06和LC11L9-C09以高效力抑制糖基化IL-17A
本实施例进一步证实本发明的Fyn SH3衍生多肽特异性抑制糖基化IL-17A的能力。双特异性抗IL-17A/TNFα构建体LC11L5-B06(具有分别由SEQ ID NO:12和16的序列组成的重链和轻链的双特异性构建体(根据本发明))和LC11L9-C09(具有分别由SEQ ID NO:12和17的序列组成的的重链和轻链的双特异性构建体(根据本发明))如实施例4所述表达及纯化。通过在各种浓度的LC11L5-B06或LC11L9-C09的存在或不存在下用重组糖基化IL-17A(在HEK EBNA细胞中产生)和重组IL-1β(R&D Systems)刺激产生IL-6而测试了LC11L5-B06和LC11L9-C09的抑制活性。在刺激16-24小时后取细胞培养物上清,经ELISA确定上清中的IL-6浓度。结果显示包含本发明的IL-17A结合多肽的融合蛋白能够特异性抑制糖基化IL-17A。
方法
每孔(96孔板,TPP)分配100μl含有3900个正常人真皮成纤维细胞(PromoCell,NHDF-c,C12300)的细胞悬液,在37℃/5%CO2培养24小时(培养基:Fibroblast GrowthMedium C-23010,PromoCell)。吸取上清,在将不同浓度的LC11L5-B06或LC11L9-C09(图10所示终浓度)与含有IL-17A和IL-1β的培养基(终浓度:IL-17A,64pM;IL-1β,10fM)混合后,将100μl相应溶液加入到细胞(一式三份)。在对照实验中,PBS与含有IL-17A/IL-1β的培养基(“IL-17A/IL-1β”)和仅具有单一细胞因子“IL-17A”或“IL-1β”的培养基(后者是”IL-17A”和“IL-1β”对照孔)混合。作为阴性对照,PBS仅与培养基混合(“培养基”)。在37℃/5%CO2温育16-24小时后,用IL-6ELISA试剂盒根据厂商指导(IL-6ELISA kit,R&D Systems)确定上清中的IL-6浓度。为计算IC50值,确定抑制百分比并且用Prism 5软件计算IC50值。
用下式确定IL-17A抑制百分比:
结果
图10显示为确定NHDF细胞上清中IL-6浓度所获得的ELISA值(吸光度)。如图10所示,双特异性构建体LC11L5-B06和LC11L9-C09能以剂量依赖性方式抑制IL-17A介导的IL-6产生,证实它们能特异性抑制糖基化IL-17A。如所预期的,IL-1β诱导的IL-6释放不能被抑制。获得的IL-17A抑制的IC50值(表10)显示本发明的双特异性化合物能以高效力抑制IL-17A。
表10.针对双特异性抗体-Fyn SH3衍生的IL-17A结合多肽融合体获得的IL-17A抑制的IC50值
实施例11:LC11L5-B06和LC11L9-C09在体内是稳定的并且在食蟹猴中显示长半衰期
本发明的融合蛋白LC11L5-B06和LC11L9-C09的药动学性质通过在单次静脉内注射后不同时间点测量它们在食蟹猴中的浓度而确定。使用具有已知浓度的LC11L5-B06和LC11L9-C09的稀释系列,用“夹心ELISA”确定血浆中的浓度,以保证测量仅完全功能性的完整双特异性分子LC11L5-B06和LC11L9-C09。为进一步证实LC11L5-B06和LC11L9-C09保持完整及本发明的Fyn SH3衍生多肽在体内(在食蟹猴中)不从抗体裂解,开发额外的ELISA,其仅检测融合蛋白中的抗体成分(“直接ELISA”)。两个ELISA检测方法示于图11中。
方法
如实施例4所述表达及纯化双特异性抗-IL-17A/TNFα构建体LC11L5-B06(具有分别由SEQ ID NO:12和16的序列组成的重链和轻链的双特异性构建体(根据本发明))和LC11L9-C09(具有分别由SEQ ID NO:12和17的序列组成的重链和轻链的双特异性构建体(根据本发明))。LC11L5-B06和LC11L9-C09以3mg/kg的剂量静脉内注射到3个雄性食蟹猴中。在结束给药后在指示的时间点从外周静脉取血(每个样品0.6ml采集体积)。使用EDTA溶液(7.5%)作为抗凝剂。采血后,样品在1200g、4℃离心10分钟,血浆在-80℃储存,直至ELISA分析。
“夹心ELISA”:亲和素包被的孔(Biomat MCP44-11)用150μl/孔封闭缓冲液(1XPBS–5%BSA)在300rpm的温和roto-orbital振荡装置中在室温(RT)封闭60分钟。用200μl/孔洗涤缓冲液(1X PBS–0.1%Tween 20)洗涤孔,然后在温和振荡下在RT用含有在测定缓冲液(1X PBS–1%BSA)中稀释的0.2μg/ml生物素化TNF-α(PeproTech,用来自ANPTechnologies的生物素标记试剂盒根据厂商指导生物素化)的100μl/孔溶液温育。用200μl/孔洗涤缓冲液洗涤3次后,将在测定缓冲液中1:4稀释的样品分配到孔中(100μl/孔)并在温和振荡下温育1小时。平板用洗涤缓冲液洗涤3次(200μl/孔),之后加入含有在测定缓冲液中稀释的64ng/ml地高辛化IL-17A(PeproTech,用购自Solulink的地高辛标记试剂盒根据厂商推荐方案用地高辛标记)的100μl/孔溶液。然后在RT温和振荡下进一步保温1小时。用洗涤缓冲液洗涤3次后(200μl/孔),平板与100μl/孔在测定缓冲液中1:10000稀释的抗地高辛HRP-缀合的抗体(Roche)保温。保温在300rpm、室温下进行60分钟。平板用洗涤缓冲液洗涤3次(200μl/孔),立即加入100μl/孔的TMB(Sigma),在黑暗中室温保温5-10分钟。最后向每孔中加入终止溶液(100μl/孔)以终止酶反应。用Victor2V(Wallac Perkin Elmer)微滴板分析仪在450nm测量光密度。
“直接ELISA”:抗生物素蛋白包被的96孔(Biomat MCP44-11)用150μl/孔封闭缓冲液(1X PBS–5%BSA)在300rpm的温和roto-orbital振荡装置中在室温封闭60分钟。用200μl/孔洗涤缓冲液(1X PBS–0.1%Tween 20)洗涤孔,然后在温和振荡下在RT用100μl/孔在测定缓冲液(1X PBS–1%BSA)中稀释的0.2μg/ml生物素化TNF-alpha的溶液温育。用200μl/孔洗涤缓冲液洗涤3次后,将在测定缓冲液中1:4稀释的样品分配到孔中(100μl/孔)并在温和振荡下温育1小时。平板用洗涤合成洗涤3次(200μl/孔),之后加入100μl/孔在测定缓冲液中稀释的44ng/ml HRP-缀合的抗人IgG猴吸附抗体(ABCam)的溶液。然后在温和振荡下在RT进一步温育1小时。平板用洗涤缓冲液洗涤3次(200μl/孔),立即加入100μl/孔TMB(Sigma),在黑暗中在室温温育5-10分钟。最后向每孔中加入终止溶液(100μl/孔)以终止酶反应。用Victor2V(Wallac Perkin Elmer)微滴板分析仪在450nm测量光密度。
LC11L5-B06和LC11L9-C09的药动学分析使用Watson包(v.7.4,Thermo FisherScientific,Waltham,MA,USA)使用经ELISA方法确定的血浆浓度进行。
结果
LC11L5-B06和LC11L9-C09的血浆浓度示于图12。两个化合物均显示低血液清除率,及在食蟹猴中终端半衰期为几天,与典型报道的标准单克隆抗体治疗剂一样。重要地,用两种不同ELISA方法获得的血浆浓度非常相似,证明LC11L5-B06和LC11L9-C09在体内稳定至少220小时,并且Fyn SH3衍生多肽在食蟹猴中不从抗体裂解(图13)。
Claims (15)
1.抑制糖基化IL-17A的活性的多肽,其中所述多肽由选自SEQ ID NO:3-9中的任一氨基酸序列组成。
2.融合构建体,其由与抗体融合的权利要求1的多肽组成,其中所述抗体直接与所述多肽融合或通过接头与所述多肽融合。
3.权利要求2的融合构建体,其中所述接头是肽接头或单个氨基酸。
4.权利要求3的融合构建体,其中所述肽接头是具有2-30个氨基酸长度的寡肽。
5.构建体,其由两个拷贝的融合构建体及两个拷贝的SEQ ID NO:12的抗体重链组成,所述融合构建体由与SEQ ID NO:11的抗体轻链融合的权利要求1的多肽组成。
6.权利要求5的构建体,其中所述构建体由两个拷贝的融合构建体及两个拷贝的SEQID NO:12的抗体重链组成,所述融合构建体由SEQ ID NO:16组成。
7.权利要求5的构建体,其中所述构建体由两个拷贝的融合构建体及两个拷贝的SEQID NO:12的抗体重链组成,所述融合构建体由SEQ ID NO:17组成。
8.编码权利要求1的多肽、或者权利要求2-4任一项的融合构建体的核酸分子,或者一或多个编码权利要求5-7任一项的构建体的核酸分子。
9.药物或诊断组合物,其包含权利要求1的多肽、权利要求2-4任一项的融合构建体、权利要求5-7任一项的构建体、权利要求8的核酸分子或其任何组合。
10.权利要求9的药物组合物,用于治疗炎性、自身免疫和/或骨质流失相关的疾病。
11.权利要求10的用于所述用途的药物组合物,其中所述疾病选自:关节炎、风湿性疾病、脊椎关节病、强直性脊柱炎、Reiter综合征、变态反应、系统性红斑狼疮、炎性肌肉疾病、多软骨炎、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、皮肌炎、Steven-Johnson综合征、慢性活动型肝炎、重症肌无力、银屑病、特发性口炎性腹泻、自身免疫炎性肠病、溃疡性结肠炎、克隆氏病、肠激惹综合征、内分泌性眼病、Graves病、结节病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性血液病、溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血、特发性血小板减少症、眼色素层炎、干燥性角结膜炎、春季角结膜炎、肺间质纤维化、肾小球肾炎、特发性肾病综合征或微小病变肾病、肿瘤、皮肤炎性疾病、角膜炎症、骨植入物松动、动脉粥样硬化、糖尿病、骨质流失、骨质疏松症、牙周病、梗阻性或炎性呼吸道疾病、哮喘、尘肺病、肺气肿、急性和超急性炎症反应、急性感染、脑膜炎、恶病质消耗综合征和干眼病。
12.权利要求11的用于所述用途的药物组合物,其中所述疾病选自:肌炎、骨关节炎、支气管炎、肺炎和疱疹性间质角膜炎。
13.权利要求11的用于所述用途的药物组合物,其中所述关节炎是类风湿性关节炎、慢性进展性关节炎(arthritis chronica progrediente)、反应性关节炎、牛皮癣关节炎、肠病性关节炎或变形性关节炎。
14.权利要求11的用于所述用途的药物组合物,其中所述变态反应是过敏症。
15.权利要求11的用于所述用途的药物组合物,其中所述糖尿病是青少年糖尿病。
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