ES2583832T3 - Nuevas moléculas de unión a IL-17A y usos médicos de las mismas - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que inhibe la actividad de IL-17A glucosilada, en el que el polipéptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) GVTLFVALYDY(X1)(X2)(X3)(X4)(X5)(X6)DLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGET QYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 1), en el que las posiciones de los aminoácidos (X1) a (X6) puede ser cualquier secuencia de aminoácidos; y (b) una secuencia de aminoácidos que es al menos 85 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de (a), en la que la determinación de la identidad excluye las posiciones de los aminoácidos (X1) a (X6) y siempre que la secuencia de aminoácidos STHEYE (SEQ ID NO: 2) en las posiciones de los aminoácidos 31 a 36 de la SEQ ID NO: 1 se conserve.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

15

25

35

45

55

65

respectivamente. Lo que más se prefiere es que las posiciones de los aminoácidos (X1) a (X6) del polipéptido de la invención sean (X1) que es S; (X2) que es A; (X3) que es R; (X4) que es G; (X5) que es Q; y (X6) que es L. Estos aminoácidos corresponden a las posiciones (X1) a (X6) en la SEQ ID NO: 5. De acuerdo con un polipéptido de acuerdo con el punto (b) del primer polipéptido, no solamente las posiciones de los aminoácidos (X1) a (X6) pueden diferir entre la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (o las SEQ ID NO 3 a 9), sino que también posiciones de aminoácidos adicionales que no están dentro del bucle RT y/o src (que tienen la secuencia STHEYE (SEQ ID NO: 2) de acuerdo con la invención) del dominio SH3 de la Fyn quinasa (SEQ ID NO: 20). Se cree que las diferencias de aminoácidos en estas posiciones no son esenciales para la especificidad de unión de las SEQ ID NO. 3 a 9. Por lo tanto, estas posiciones de aminoácidos pueden intercambiarse o delecionarse, o pueden añadirse aminoácidos adicionales, sin interferir sustancialmente en la especificidad de unión a IL17A glucosilada. Si se intercambian aminoácidos, se prefieren intercambios conservativos.

En una realización más preferida, el polipéptido de la invención comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una cualquiera de las SEQ ID NO 3 a 9.

Tal como se muestra en los ejemplos a continuación en el presente documento, se descubrió que las SEQ ID NO 3 a 9 se unen a e inhiben IL-17A no glucosilada así como glucosilada que tiene la SEQ ID NO: 10. En más detalle, se descubrió sorprendentemente que los polipéptidos de unión a IL-17A derivados del SH3 de Fyn de las SEQ ID NO 3 a 9 son capaces de inhibir completamente IL-17A glucosilada con potencias similares en comparación con IL-17A no glucosilada. Ésta es una propiedad ventajosa en comparación con los polipéptidos de unión a IL-17A derivados del SH3 de Fyn que se describen en el documento WO 20118023685 (véanse datos comparativos en el ejemplo 3).

Entre las SEQ ID NO 3 a 9 se da preferencia a las SEQ ID NO 5 y 7. Las SEQ ID NO 5 y 7 se han usado para generar las construcciones de fusión y construcciones descritas en el presente documento en el ejemplo 4. Las construcciones de fusión y construcciones obtenidas fueran particularmente útiles, dado que son estables, monoméricas, solubles y presentan excelentes propiedades biofísicas y similares a un fármaco. Además, la fusión de las SEQ ID NO 5 y 7 a compuestos adicionales no efectuaron la excelente unión a IL-17A glucosilada.

Tal como se conoce bien, cambios secundarios en una secuencia de aminoácidos tales como deleción, adición o sustitución de uno, unos pocos o incluso varios aminoácidos pueden conducir a una forma mutante de la proteína original que tiene propiedades sustancialmente idénticas. Por lo tanto, en lo que respecta a las SEQ ID NO 3 a 9 también abarcadas por la presente invención es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 85 %, preferentemente al menos el 90 %, más preferentemente al menos el 95 % y de la forma más preferida al menos el 98 % idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NO 3 a 9, siempre que la secuencia de aminoácidos STHEYE (SEQ ID NO: 2) en las posiciones de los aminoácidos 31 a 36 de la SEQ ID NO: 1 se conserve. Si se intercambian aminoácidos, se prefieren intercambios conservativos.

Se prefiere además, de acuerdo con la invención, que la IL-17A comprenda o consista en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.

Tal como es evidente a partir de los ejemplos a continuación en el presente documento, la IL-17A humana que tiene la SEQ ID NO: 10 se ha usado como proteína diana a fin de identificar los polipéptidos que tienen las SEQ ID NO 3 a

9. Los primeros 23 aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 son el péptido señal. Se prefiere particularmente, por lo tanto, que el polipéptido de la invención se una a IL-17A glucosilada dentro de las posiciones de los aminoácidos 24 a 155 de la SEQ ID NO: 10.

En otra realización, la presente invención se refiere a una construcción de fusión que comprende el polipéptido de la invención fusionado a un compuesto adicional.

Una “construcción de fusión”, tal como se usa en el presente documento, define la fusión del polipéptido de la invención a un compuesto adicional. El compuesto puede ser un compuesto proteínico o un compuesto no proteínico. En el caso en que el compuesto es un compuesto proteínico (por ejemplo una citoquina o quimioquina, tal como se describe a continuación en el presente documento), la construcción de fusión también puede designarse como proteína de fusión. La expresión “proteína de fusión”, tal como se usa en el presente documento, se refiere en términos generales a una construcción polipeptídica generada a través de la unión y expresión de dos o más genes que codifican polipéptidos diferentes. En otras palabras, la traducción de este gen de fusión da como resultado un único polipéptido con propiedades funcionales derivadas de cada uno de los polipéptidos originales. Los polipéptidos pueden estar fusionados directamente o mediante un enlazador, es decir una secuencia polipeptídica corta. En general, las proteínas de fusión se generan artificialmente mediante tecnología de ADN recombinante bien conocida por el experto en la materia (por ejemplo Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 4ª ed. Garland Science, p. 518519). Sin embargo, polipéptidos y proteínas de fusión de la invención pueden prepararse mediante cualquiera de las muchas técnicas convencionales y bien conocidas, tales como estrategias sintéticas orgánicas sencillas, técnicas de síntesis en fase sólida o mediante sintetizadores automatizados disponibles en el mercado. Las proteínas de fusión pueden usarse en investigación biológica o terapéutica. Los ejemplos de compuestos no proteínicos como compuesto adicional son, por ejemplo, pequeñas moléculas orgánicas, tales como polietilenglicol (PEG) o Alexa

15

25

35

45

55

65

Fluor, o radionúclidos. Ejemplos específicos adicionales de compuestos adicionales no proteínicos se describen a continuación en el presente documento.

De acuerdo con una realización preferida, el compuesto adicional es un compuesto farmacéuticamente activo, un profármaco, un transportador farmacéuticamente activo, un compuesto activo desde el punto de vista del diagnóstico, un potenciador de la penetración celular y/o un compuesto que modula la semivida sérica.

Un compuesto farmacéuticamente activo es un compuesto que tiene una actividad biológica tras la administración a un sujeto, que provoca un efecto beneficioso para el sujeto. Un profármaco es un compuesto que se administra en una forma inactiva (o menos que totalmente activa) a un sujeto, y se convierte posteriormente en un compuesto farmacéuticamente activo o farmacéuticamente totalmente activo a través de procesos metabólicos en el sujeto. El compuesto farmacéuticamente (totalmente) activo es, preferentemente, un compuesto adecuado para el tratamiento

o prevención de cualquiera de las enfermedades específicas definidas a continuación en el presente documento.

Un compuesto activo desde el punto de vista del diagnóstico es un compuesto que tiene una actividad tras la administración a un sujeto, lo que permite determinar o identificar una posible enfermedad o trastorno. Los ejemplos de compuestos activos desde el punto de vista del diagnóstico incluyen marcadores detectables, tales como colorantes fluorescentes, radionúclidos o agentes de contraste para imaginología médica. Ejemplos específicos de colorantes fluorescentes, radionúclidos y agentes de contraste para imaginología médica se describen a continuación en el presente documento. Un compuesto activo desde el punto de vista del diagnóstico fusionado a un polipéptido de la invención puede usarse en particular para determinar o identificar una cualquiera de las enfermedades específicas definidas a continuación en el presente documento que tienen en común que su origen y/o síntoma(s) están relacionados con IL-17A y/o Th-17. Las facetas de dicha enfermedad pueden detectarse o identificarse mediante el polipéptido de la invención fusionado al compuesto activo desde el punto de vista del diagnóstico de la invención.

Un potenciador de la penetración celular es un compuesto que facilita la administración del polipéptido de la invención en una célula (in vitro, ex vivo o in vivo).

Un compuesto que modula la semivida sérica es un compuesto que permite prolongar la semivida in vivo de los polipéptidos de la invención, en particular en el sistema de circulación sanguínea. El componente que modula la semivida sérica es preferentemente polietilenglicol (PEG).

Un transportador farmacéuticamente activo es un compuesto que mejora la administración y/o la eficacia del polipéptido de la invención tras la administración a un sujeto. En la técnica se conocen bien transportadores farmacéuticamente activos adecuados, e incluyen, por ejemplo, estabilizantes, antioxidantes, sustancias reguladoras del pH, etc.

De acuerdo con otra realización preferida, el compuesto adicional de la invención se selecciona entre el grupo que consiste en (a) un colorante fluorescente, (b) un fotosensibilizador, (c) un radionúclido, (d) un agente de contraste para imaginología médica, (e) una citoquina, (f) un compuesto tóxico, (g) una quimioquina, (h) un factor procoagulante, (i) una enzima para activación de profármacos, (k) un aglutinante de albúmina, (I) una albúmina, (m) un aglutinante de IgG o (n) polietilenglicol.

El colorante fluorescente es, preferentemente, un componente seleccionado entre colorantes Alexa Fluor o Cy.

El fotosensibilizador es, preferentemente, la proteína fluorescente roja fototóxica KillerRed o hematoporfirina. El radionúclido se selecciona, preferentemente, entre el grupo de isótopos que emiten radiación gamma, más preferentemente 99mTc, 123I, 111In, y/o entre el grupo de emisores de positrones, más preferentemente 18F, 64Cu,68Ga, 86Y, 124I, y/o entre el grupo de emisores beta, más preferentemente 131I, 90Y, 177Lu, 67Cu, o entre el grupo de emisores alfa, preferentemente 213Bi, 211At.

Un agente de contraste, tal como se usa en el presente documento, es una sustancia usada para mejorar el contraste de estructuras o fluidos dentro del cuerpo en imaginología médica. Los agentes de contraste comunes funcionan basándose en la atenuación de rayos X y la intensificación de la señal de resonancia magnética.

La citoquina se selecciona, preferentemente, entre el grupo que consiste en IL-2, IL-12, TNF-alfa, IFN alfa, IFN beta, IFN gamma, IL-10, IL-15, IL-24, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, LIF, CD80, B70, TNF beta, LTbeta, ligando CD-40, ligando Fas, TGF-beta, IL-1alfa e IL-1beta. Tal como se conoce bien en la técnica, las citoquinas pueden favorecer una respuesta proinflamatoria o antiinflamatoria del sistema inmunitario. Por lo tanto, dependiendo de la enfermedad a tratar, pueden favorecerse construcciones de fusión con una citoquina proinflamatoria o una antiinflamatoria. Por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, en general se prefieren construcciones de fusión que comprenden citoquinas antiinflamatorias, mientras que, para el tratamiento de cáncer en general, se prefieren construcciones de fusión que comprenden citoquinas proinflamatorias.

imagen6

15

25

35

45

55

65

CDR, en una “matriz de soporte” de anticuerpos humanos. Los métodos para la producción de anticuerpos humanizados se describen, por ejemplo, en los documentos EP-A1 0 239 400 y WO 90/07861.

La expresión “cadena ligera de anticuerpo” designa la subunidad polipeptídica pequeña de un anticuerpo, mientras que la expresión “cadena pesada de anticuerpo” designa la subunidad polipeptídica grande de un anticuerpo. Un anticuerpo típico está compuesto por dos cadenas pesadas de inmunoglobulina (Ig) y dos cadenas ligeras de Ig. Cada cadena ligera está compuesta por dos dominios de inmunoglobulina en tándem; un dominio constante (CL) y un dominio variable (VL) que es importante para unión al antígeno. La cadena pesada determina la clase o el isotipo de un anticuerpo. Cada cadena pesada tiene dos regiones, concretamente una región constante (que es la misma para todas las inmunoglobulinas de la misma clase pero difiere entre clases) y una región variable que difiere entre diferentes células B, pero es la misma para todas las inmunoglobulinas producidas por la misma célula B o clon de célula B. El dominio variable de cualquier cadena pesada está compuesto por un único dominio de inmunoglobulina.

Un “dominio de Fc funcional” de un anticuerpo es una expresión bien conocida por el experto en la materia y se define tomando como base la escisión de anticuerpos con papaína. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se dividen en las clases: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, IgA1 e IgA2. De acuerdo con las regiones constantes de cadena pesada, las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan [alfa], [delta], [épsilon], [gamma], y [mu], respectivamente. El dominio de Fc funcional de un anticuerpo está implicado directamente en ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo) y CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) basándose en activación del complemento, unión a C1q y unión al receptor de Fc. Los cuatro isotipos de IgG humana se unen a diferentes receptores, tales como el receptor de Fc neonatal, los receptores gamma de Fc activadores, FcRI, FcRIIa y FcRIIIa, el recepción inhibidor FcRIIb, y C1q con diferentes afinidades, produciendo actividades muy diferentes. Es conocido que las afinidades a receptores de activación e inhibición de un dominio Fc de un anticuerpo humano puede genomanipularse y modificarse (véase Strohl W. (2009) Curr Opin Biotechnol, 20, p. 685-691).

Preferentemente, el dominio Fc es uno o más dominios de Fc funcionales humanos que permiten prolongar la semivida in vivo de los polipéptidos de la invención y algunos de los cuales dirigen la respuesta inmunitaria de un mamífero a un sitio de unión a la diana específico del componente polipeptídico de la invención de la proteína de fusión, por ejemplo en aplicaciones terapéuticas, profilácticas y/o de diagnóstico tal como se describe a continuación en el presente documento. Más preferentemente, dicho dominio de Fc funcional humano es de un anticuerpo IgG1. Los polipéptidos de la invención pueden fusionarse al extremo N o C de uno o más dominios de Fc funcionales o tanto al extremo N como al C de uno o más dominios Fc. Se prefiere que las proteínas de fusión de la invención comprendan multímeros, preferentemente tetrámeros, trímeros o, de la forma más preferente, dímeros de los polipéptidos de la invención fusionados a al menos un lado, preferentemente al extremo N de uno o más, preferentemente un dominio Fc.

En una realización más preferida de la presente invención, el dominio Fc es uno o más dominios de Fc funcionales humanos genomanipulados de una IgG1 con funciones activación o efectoras de silenciadas, preferentemente uno o más dominios de Fc funcionales humanos genomanipulados de una IgG1 con funciones efectoras silenciadas, y aún más preferentemente uno o más dominios de Fc funcionales humanos genomanipulados de una IgG1 con funciones efectoras silenciadas con una mutación en L234 y L235, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat (véase Johnson G. y Wu T.T. (2000) Nucleic Acids Res. 28, p. 214-218), y de la forma más preferida con la mutación L234A y L235A.

El anticuerpo en la construcción de fusión de la invención preferentemente se une específicamente a TNF. La expresión “se une específicamente a” se refiere a aquellos casos donde TNF está unido con la constante de equilibrio de unión KD que es un factor 2 más pequeña, preferentemente un factor 5 o un factor 10 más a en comparación con la constante de equilibrio de unión observadas para la unión de la construcción de fusión de la invención a una proteína no relacionada, no siendo dicha proteína no relacionada un miembro de la familia de TNF o siendo un miembro diferente de la familia de TNF tal como TNF.

De acuerdo con otra realización preferida de la construcción de fusión de la invención, el polipéptido de la invención está ubicado cadena abajo del extremo C de dicho compuesto adicional que consiste en o que comprende una cadena ligera de anticuerpo, una cadena pesada de anticuerpo, un dominio Fc de un anticuerpo, un anticuerpo o una combinación de los mismos.

Dicho compuesto adicional puede estar fusionado directamente al polipéptido o mediante un enlazador. Por consiguiente, la construcción de fusión puede estar fusionada (directamente) al extremo C del compuesto adicional, más específicamente mediante la formación de un enlace peptídico entre el grupo carboxilo del aminoácido Cterminal y el grupo amino del aminoácido N-terminal, o puede estar conectada al extremo C de la cadena del compuesto adicional mediante un enlazador.

Los enlazadores adecuados están a disposición del experto en la materia. El enlazador de acuerdo con la invención se selecciona, preferentemente, entre el grupo que consiste en alquilo con de 1 a 30 átomos de carbono,

imagen7

imagen8

15

25

35

45

55

65

anterior abundante y confirmar su particular idoneidad para el fin deseado mediante métodos rutinarios y sin carga excesiva.

También se prefiere que los uno o más vectores de la invención comprendan uno o más ácidos nucleicos de la invención y sean, preferentemente, capaces de producir un polipéptido o proteína de fusión de la invención. Preferentemente, dichos vectores se seleccionan entre el grupo que consiste en vectores pQE, vectores pET, vectores pFUSE, vectores pUC, vectores YAC, vectores de fagémido, vectores de fago, vectores usados para terapia génica tales como retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados. Para técnicas de modificación de vectores, véase Sambrook y Russel (2001), loc. cit. En general, los vectores pueden contener uno o más orígenes de replicación (ori) y sistemas de herencia para clonación o expresión, uno o más marcadores para selección en el huésped, por ejemplo, resistencia a antibióticos, y una o más casetes de expresión. Los orígenes de replicación (ori) adecuados incluyen, por ejemplo, los orígenes de replicación Col E1, SV40 viral y M 13.

Las una o más moléculas de ácido nucleico de la presente invención también pueden insertarse en uno o más vectores, de modo que se genere una fusión traduccional con otra molécula de ácido nucleico. La otra molécula de ácido nucleico preferentemente codifica la cadena ligera y/o pesada de un anticuerpo anti-TNF y/o un enlazador, ejemplos preferidos de los cuales se han descrito anteriormente en el presente documento.

Las una o más células huésped pueden producirse introduciendo las una o más moléculas de ácido nucleico o uno o más vectores de la invención en las una o más células huésped que, tras su presencia, media en la expresión de los polipéptidos codificados por dichas moléculas de ácido nucleico o vectores. Las células huésped son preferentemente células huésped aisladas, lo que significa que las células no están dentro del contexto de un organismo vivo. El huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Un huésped eucariota adecuado puede ser una célula de mamífero, una célula de anfibio, una célula de pez, una célula de insecto, una célula fúngica

o una célula vegetal. Una célula eucariota puede ser una célula de insecto tal como una célula de Spodoptera frugiperda, una célula de levadura tal como una célula de Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris, una célula fúngica tal como una célula de Aspergillus o una célula de vertebrado. A este último respecto, se prefiere que la célula sea una célula de mamífero tal como una célula humana. La célula puede ser parte de una línea celular.

Procariotas/bacterias adecuadas son aquellas que se usan generalmente para clonación como E. coli (por ejemplo, las cepas de E coli HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 y JM101), Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Burkholderia glumae, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas stutzeri, Streptomyces lividans, Lactococcus lactis, Mycobacterium smegmatis o Bacillus subtilis. Un ejemplo preferido para una célula huésped que será manipulada genéticamente con la molécula de ácido nucleico o vector de la invención es E. coli.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende el polipéptido de la invención, la construcción de fusión de la invención, la construcción de la invención, una o más moléculas de ácido nucleico de la invención, uno o más vectores de la invención, una o más células huésped de la invención, o cualquier combinación de los mismos.

Tal como se ha descrito en más detalle anteriormente en el presente documento, IL-17A está implicada en muchas enfermedades. Por consiguiente, el polipéptido, construcción de fusión, construcción, moléculas de ácido nucleico, vectores, células huésped de la invención o cualquier combinación de los mismos son útiles como medicamento. Se prefiere que, dentro de dicha composición farmacéutica, el polipéptido, construcción de fusión, construcción, moléculas de ácido nucleico, vectores, células huésped de la invención o cualquier combinación de los mismos sean el único agente activo. La composición farmacéutica se administra, preferentemente, a mamíferos tales como animales domésticos y de compañía. De la forma más preferida, se administra a seres humanos. Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se administrarán al sujeto a una dosis adecuada.

La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención, puede formularse de manera convencional de acuerdo con métodos descubiertos en la técnica, usando uno o más transportadores o excipientes fisiológicos, véase, por ejemplo, Ansel et al., “Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems”, 7ª edición, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 1999. Por consiguiente, la composición farmacéutica puede administrarse por vía oral, por vía parenteral, tal como por vía subcutánea, por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía intratecal, por vía transdérmica, por vía transmucosal, por vía subdural, local o tópica mediante iontoforesis, por vía sublingual, mediante pulverización para inhalación, aerosol o por vía rectal y similares, en formulaciones de dosis unitaria que opcionalmente comprenden excipientes convencionales farmacéuticamente aceptables. También pueden fabricarse composiciones de diagnóstico de la invención de cualquier manera convencional.

La composición farmacéutica de la invención puede administrarse como el único principio activo o junto con, por ejemplo, como un adyuvante o en combinación con otros fármacos, por ejemplo, agentes inmunosupresores o inmunomoduladores u otros agentes antiinflamatorios, por ejemplo, para el tratamiento o la prevención de las enfermedades mencionadas anteriormente. Por ejemplo, los polipéptidos, construcciones de fusión y construcciones de la invención, pueden usarse en combinación con anticuerpos monoclonales inmunosupresores, por ejemplo, anticuerpos monoclonales con afinidad por receptores de leucocitos, por ejemplo MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8,

imagen9

15

25

35

45

55

65

intervalo de diariamente hasta aproximadamente una vez cada 3 meses, de forma preferente aproximadamente una vez cada 2 semanas hasta aproximadamente una vez cada 10 semanas, más preferentemente una vez cada 4 a 8 semanas. Un régimen posológico preferido implica la administración de las composiciones de diagnóstico o farmacéuticas de la invención de una vez al mes a una vez cada 2 a 3 meses o con menos frecuencia.

En una realización preferida de la invención, dicha composición farmacéutica es para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoria, autoinmunitaria y/o relacionada con la pérdida ósea.

En una realización más preferida de la invención, la enfermedad se selecciona entre el grupo que consiste en artritis, preferentemente artritis reumatoide, artritis crónica progresiva, artritis reactiva, artritis soriásica, artritis enteropática y artritis deformante, enfermedades reumáticas, espondiloartropatías, espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter, hipersensibilidad (incluyendo tanto hipersensibilidad de las vías respiratorias como hipersensibilidad dérmica), alergias, lupus eritematoso sistémico, trastornos musculares inflamatorios, policondritis, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, dermatomiositis, síndrome de Steven-Johnson, hepatitis activa crónica, miastenia grave, psoriasis, esprue idiopático, enfermedad intestinal inflamatoria autoinmunitaria, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, síndrome de intestino irritable, oftalmopatía endocrina, enfermedad de Graves, sarcoidosis, esclerosis múltiple, cirrosis biliar primaria, diabetes juvenil (diabetes mellitus tipo I), trastornos hematológicos autoinmunes, anemia hemolítica, anemia aplásica, anemia pura de glóbulos rojos, trombocitopenia idiopática, uveitis (anterior y posterior), queratoconjuntivitis seca, queratoconjuntivitis vernal, fibrosis pulmonar intersticial, glomerulonefritis (con y sin síndrome nefrótico), síndrome nefrótico idiopático o nefropatía de cambios mínimos, tumores, enfermedad inflamatoria de la piel, inflamación de la córnea, miositis , aflojamiento de implantes óseos, trastornos metabólicos, aterosclerosis, diabetes y dislipidemia, pérdida ósea, artrosis, osteoporosis, enfermedad periodontal, enfermedades obstructivas o inflamatorias de las vías respiratorias, asma, bronquitis, neumoconiosis, enfisema pulmonar, reacciones inflamatorias agudas e hiperagudas, infecciones agudas, choque séptico, choque endotóxico, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, meningitis, neumonía, quemaduras graves, síndrome debilitante de caquexia, ictus, queratitis estromal herpética y enfermedad del ojo seco.

Todas las enfermedades especificadas anteriormente tienen en común que su origen y/o síntomas están relacionados con IL-17A y/o Th-17.

Las figuras muestran

La figura 1 muestra cromatogramas de exclusión molecular (SEC) de polipéptidos de unión a IL-17A de la invención:

(A) 1L3-B09 (SEQ ID NO: 3), (B) 11L0-C6 (SEQ ID NO: 4), (C) 11L5-B06 (SEQ ID NO: 5), (D) 11L6-F03 (SEQ ID NO: 6), (E) 11L9-C09 (SEQ ID NO: 7), (F) 11L10-A05 (SEQ ID NO: 8), (G) 11L11-A09 (SEQ ID NO: 9).

La figura 2 representa los resultados de la inhibición in vitro dependiente de la dosis de IL-17A glucosilada y no glucosilada mediante polipéptidos de la invención derivados de SH3 de Fyn. A) 1L3-B09 (SEQ ID NO: 3), (B) 11L0-C6 (SEQ ID NO: 4), (C) 11L5-B06 (SEQ ID NO: 5), (D) 11L6-F03 (SEQ ID NO: 6), (E) 11L9-C09 (SEQ ID NO: 7), (F) 11L10-A05 (SEQ ID NO: 8)

La figura 3 representa los resultados de la inhibición in vitro dependiente de la dosis de IL-17A glucosilada y no glucosilada mediante aglutinantes derivados de SH3 de Fyn descritos en el documento WO2011/023685: (A) aglutinante de IL-17 derivado de SH3 de Fyn 2C1 (SEQ ID NO: 107 descrito en el documento WO2011/023685). (B) aglutinante de IL-17 derivado de SH3 de Fyn A1_2 (“A1”) (SEQ ID NO: 53 descrito en el documento WO2011/023685). (C) aglutinante de IL-17 derivado de SH3 de Fyn B1_2 (“B1”) (SEQ ID NO: 39 descrito en el documento WO2011/023685).

La figura 4 muestra los cromatogramas de exclusión molecular (SEC) de los polipéptidos de unión a IL-17A/TNF biespecíficos de la invención: (A) LC11L5-B06 (construcción biespecífica (de acuerdo con la invención) con cadena pesada y cadena ligera que consisten en las secuencia de las SEQ ID NO: 12 y 16, respectivamente) y (B) LC11L9-C09 (construcción biespecífica (de acuerdo con la invención) con cadena pesada y cadena ligera que consisten en las secuencias de las SEQ ID NO: 12 y 17, respectivamente).

La figura 5 muestra la inhibición simultánea de IL-17A y TNF por las proteínas de fusión anti-IL-17A/TNF biespecíficas. Los niveles en ELISA de Gro-alfa en los sobrenadantes se muestran después de la estimulación de células HT-29 con TNF 200 pM e IL-17A 400 pM. Después de la adición de las concentraciones indicadas de LC11L5-B06 (SEQ ID NO: 12 (cadena pesada) y 16 (fusión de cadena ligera)) (figura 5.A) o LC11L9-C09 (SEQ ID NO: 12 (cadena pesada) y 17 (fusión de cadena ligera)) (figura 5.B), puede observarse una inhibición dependiente de la dosis de IL-17A y TNF, dado que los niveles de Gro-alfa disminuyen con concentraciones más elevadas de los inhibidores. Como controles, las células se trataron con las citoquinas individuales (IL-17A o TNF) o con medio solamente. Se muestran valores medios de triplicados, las barras de error representan desviaciones típicas (SD).

La figura 6 representa la inhibición de IL-17A y TNF humanos in vivo. (A) y (B): a los ratones se les inyectó por vía intravenosa (i.v.) con LC11L5-B06 (designado como “LC-B06”) (SEQ ID NO: 12 (cadena pesada) y 16 (fusión de

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

cadena ligera)), seguido por inyección s.c. de IL-17A humana (hIL-17A) (A) o TNF humano (hTNF) (B). Dos horas después de la administración de la citoquina indicada, se tomaron muestras de sangre de los ratones y los niveles de KC se detectaron mediante ELISA. Los ratones que recibieron una inyección intravenosa del anticuerpo anti-TNF (figura 6.B) (“aTNFmAb”) o PBS también se muestran. Como control, se muestran niveles basales de KC (ratones tratados con PBS solamente (i.v.), sin estimulación con citoquinas). (C) y (D): LC11L9-C09 (designado como “LC-C09”) (SEQ ID NO: 12 (cadena pesada) y 17 (fusión de cadena ligera)) se inyectaron por vía intravenosa (i.v.) en ratones, seguidos por inyección s.c. de IL-17A (C) o TNF (D). Dos horas después de la administración de la citoquina indicada, se tomaron muestras de sangre de los ratones y los niveles de KC se detectaron mediante ELISA. Los ratones que recibieron una inyección intravenosa del anticuerpo anti-TNF (figura 6.D) (“aTNFmAb”) o PBS también se muestran. Como control, se muestran niveles basales de KC (ratones tratados con PBS solamente (i.v.), sin estimulación con citoquinas). Se muestran los niveles medios de KC de 5 ratones por grupo (± SEM).

La figura 7 muestra las concentraciones séricas de (A) LC11L5-B06 (SEQ ID NO: 12 (cadena pesada) y 16 (fusión de cadena ligera)) y (B) LC11L9-C09 (SEQ ID NO: 12 (cadena pesada) y 17 (fusión de cadena ligera)) en diferentes puntos temporales después de una única inyección i.v. en ratones C57BL/6. La concentración en suero se determinó mediante ELISA usando tanto TNF como IL-17A como agentes de captura (indicados entre paréntesis). Los últimos puntos temporales (24 h -168 h) se usaron para calcular las semi-vidas terminales. Concentraciones séricas medias de 5 ratones se representan gráficamente frente al tiempo, las barras de error representan desviaciones típicas (SD).

La figura 8 muestra un alineamiento de secuencia de las SEQ ID NO: 3 a 9 y 20. Las SEQ ID NO 3 a 9 corresponden a las designaciones internas también en los ejemplos de la solicitud, tal como es evidente a partir de la figura 8.

La figura 9 representa los resultados de la inhibición in vitro dependiente de la dosis de IL-17A glucosilada y no glucosilada mediante el polipéptido derivado de SH3 de Fyn de la invención 11L11-A09 (SEQ ID NO: 9).

La figura 10 muestra la inhibición de IL-17A por las proteínas de fusión anti-IL-17A/TNF biespecíficas LC11L5-B06 y LC11L9-C09. Los niveles en ELISA de IL-6 en los sobrenadantes del cultivo celular se muestran después de la estimulación de células NHDF con IL-17A e IL-1 (“IL-17A/IL-1”). Después de la adición de las concentraciones indicadas de LC11L5-B06 (SEQ ID NO: 12 (cadena pesada) y 16 (fusión de cadena ligera)) o LC11L9-C09 (SEQ ID NO: 12 (cadena pesada) y 17 (fusión de cadena ligera)), se observó una inhibición dependiente de la dosis de liberación de IL-6 mediada por IL-17A. En experimentos de control, las células se trataron con las citoquinas individuales (“IL-17A” o “IL-1”) o con medio de cultivo celular solamente (“Medio”). Se muestran valores medios de triplicados, las barras de error representan desviaciones típicas (SD).

La figura 11 muestra los métodos de ELISA en sándwich y ELISA directo. (izquierda) ELISA en sándwich se realizó para detectar moléculas de LC11L5-B06 y LC11L9-C09 intactas. TNF biotinilado se inmovilizó en los pocillos de placas de 96 pocillos de microvaloración recubiertas de neutravidina. Plasma que contenía LC11L5-B06 o LC11L9-C09 se añadió a las células. Para detección, se usó IL-17A marcada con digoxigenina, seguida por un conjugado de anticuerpo anti-digoxigenina-HRP para procesamiento del sustrato y desarrollo de color. (derecha) ELISA directo se realizó para detectar unión a TNF específica. TNF biotinilado se inmovilizó en los pocillos de placas de 96 pocillos de microvaloración recubiertas de neutravidina. Plasma que contenía LC11 L5-B06 o LC11 L9-C09 se añadió a las células. LC11L5-B06 o LC11L9-C09 unido se detectó usando un conjugado de anticuerpo anti-IgG humana-HRP para procesamiento del sustrato y desarrollo de color.

La figura 12 muestra las concentraciones plasmáticas de (A) LC11L5-B06 (SEQ ID NO: 12 (cadena pesada) y 16 (fusión de cadena ligera)) y (B) LC11L9-C09 (SEQ ID NO: 12 (cadena pesada) y 17 (fusión de cadena ligera)) en diferentes puntos temporales después de una única inyección i.v. en monos cinomolgo. La concentración en plasma se determinó mediante ELISA en sándwich usando TNF como agente de captura e IL-17A marcada con digoxigenina seguida por un conjugado de anticuerpo anti-digoxigenina-HRP para procesamiento del sustrato y desarrollo de color. Las concentraciones plasmáticas medias de 3 monos cinomolgo se representan gráficamente frente al tiempo, las barras de error representan desviaciones típicas (SD).

La figura 13 muestra las concentraciones plasmáticas de LC11L5-B06 (A) o LC11L9-C09 (B) en monos cinomolgo determinadas mediante ELISA en sándwich y ELISA directo. Las concentraciones plasmáticas son comparables para ambas proteínas, lo que indica que LC11L5-B06 y LC11L9-C09 son estables en monos cinomolgo durante al menos 220 horas.

Los ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1: polipéptidos derivados de SH3 de Fyn de la invención se unen a IL-17A según lo determinado mediante ELISA de lisado monoclonal.

15

25

35

45

55

65

Métodos

Usando las fagotecas de Fynomer descritas en Schlatter et al. (Schlatter et al. (2012) mAbs, 4(4) p. 497-50) Proteínas de unión derivadas de SH3 de Fyn específicas para IL-17A se aislaron usando IL-17A recombinante (R&D Systems) como antígeno y presentación en fagos estándar como tecnología de selección (Grabulovski D. et al., (2007) J Biol Chem 282, p. 3196-3204, Viti, F. et al. (2000) Methods Enzymol. 326, 480-505). El polipéptido derivado de SH3 de Fyn de la invención 1L3-B09 (SEQ ID NO: 3) que porta la secuencia de bucle n-src “STHEYE” (SEQ ID NO: 2) se enriqueció durante el proceso de selección. 1L3-B09 (SEQ ID NO: 3) se unía a IL-17A (véase el ejemplo 2) y se descubrió sorprendentemente que inhibía IL-17A glucosilada tan bien como IL-17A no glucosilada (véase el ejemplo 3). A fin de obtener aglutinantes de IL-17A derivados de SH3 de Fyn con afinidades más elevadas, se usó 1L3-B09 (SEQ ID NO: 3) como plantilla para maduración por afinidad. La secuencia del bucle n-src “STHEYE” (SEQ ID NO: 2) se mantuvo constante y se combinó con un repertorio de bucle RT aleatorizado (6 residuos de aminoácidos designados como (X1)(X2)(X3)(X4)(X5)(X6) en la SEQ ID NO: 1). El proceso de generación de bibliotecas de maduración por afinidad era esencialmente el mismo que el descrito para la clonación de la biblioteca sin exposición previa con un bucle RT aleatorizado (“biblioteca 0” en Schlatter et al. (2012) mAbs, 4(4) p. 497-50).

Después de las selecciones sin exposición previa y maduración por afinidad, polipéptidos derivados de SH3 de Fyn enriquecidos se cribaron para unión a IL-17A mediante ELISA del lisado. ADN que codifica las proteínas de unión derivadas de SH3 de Fyn se clonó en el vector de expresión bacteriana pQE12 (Qiagen) de modo que las construcciones resultantes portaban una marca myc-hexahistidina C-terminal tal como se describe en Grabulovski et al. (Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204). Los polipéptidos se expresaron en el citosol de bacterias E. coli en un formato de 96 pocillos y 200 l de lisado aclarado por pocillo se prepararon tal como se describe en Bertschinger et al. (Bertschinger et al. (2007) Protein Eng Des Sel 20(2): p. 57-68). En resumen, colonias bacterianas transformadas se tomaron de la placa de agar y se cultivaron en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (Nunc, n.º de cat. 163320) en 200 l de medio 2xYT que contenía 100 g/ml de ampicilina y el 0,1 % (p/v) de glucosa. La expresión de proteínas se indujo después del cultivo durante 3 h a 37 °C y 200 r.p.m. añadiendo IPTG 1 mM (Applichem, Alemania). Las proteínas se expresaron durante una noche en un agitador rotatorio (200 r.p.m., 30 °C). Posteriormente, la placa de 96 pocillos se centrifugó a 1800 g durante 10 min y el sobrenadante se desechó. Los sedimentos bacterianos se resuspendieron en 200 l de tampón de lisis (NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, pH 8,0) que contenía 1 mg/ml de lisozima y se dejó durante 30 min en hielo. Seguidamente, las células bacterianas se lisaron mediante sonicación en un baño de agua (seis estallidos durante 10 s) y a continuación se centrifugaron a 1800 g durante 10 min. Se usaron lisados bacterianos monoclonales para ELISA: IL17A biotinilada (producida en las instalaciones propias en células HEK EBNA, la biotinilación se realizó con NHSPEO4-biotina (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante) se inmovilizó sobre pocillos recubiertos de estreptavidina (StreptaWells, High Bind, Roche), y después de bloquear con PBS, se aplicaron leche al 2 % (Rapilait, Migros, Suiza), 50 l de PBS, leche al 4 % que contenía 6 g/ml de anticuerpo anti-myc 9E10 (concentración final 3 g/ml) y 50 l de lisado bacteriano. Después de incubar durante 1 h y lavar, se detectaron polipéptidos derivados de SH3 de Fyn unidos con conjugado de anticuerpo antirratón-HRP (Sigma). La detección de actividad peroxidasa se realizó añadiendo sustrato BM blue POD (Roche) y la reacción se detuvo añadiendo H2SO4 1 M. La secuencia de ADN de los aglutinantes específicos se verificó mediante secuenciación de ADN.

Resultados

Las secuencias de aminoácidos de polipéptidos derivados de SH3 de Fyn positivos en ELISA que se unen a IL-17A se presentan en las SEQ ID NO: 3 a 9, tal como se adjuntan en la lista de secuencias.

Ejemplo 2: polipéptidos derivados de SH3 de Fyn de la invención se unen a IL-17A humana glucosilada con afinidades elevadas.

Este ejemplo muestra los rendimientos de expresión de polipéptidos de unión a IL-17A derivados del SH3 de Fyn y la caracterización de estos polipéptidos mediante experimentos de cromatografía de exclusión molecular y resonancia del plasmón superficial.

Métodos

a) Rendimientos de expresión de polipéptidos de unión a IL-17A derivados del SH3 de Fyn

Polipéptidos de unión a IL-17A derivados del SH3 de Fyn se expresaron en el citosol de bacterias E. coli TG1, así como se purificaron tal como se describe en Grabulovski et al. (Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204).

b) Cromatografía de exclusión molecular (SEC)

Para el polipéptido de unión a IL-17A derivado de SH3 de Fyn parental 1L3-B9 (SEQ ID NO: 3) se realizó cromatografía de exclusión molecular (SEC) en un sistema ÄKTA FPLC usando una columna corta Superdex 75 (5/150) (GE Healthcare). Las SEC de los clones madurados por afinidad 11L0-C06 (SEQ ID NO: 4), 11L5-B06 (SEQ

imagen10

imagen11

15

25

35

45

LC11L9-C09 (construcción biespecífica (de acuerdo con la invención) con cadena pesada y cadena ligera que consisten en las secuencias de las SEQ ID NO: 12 y 17, respectivamente) se transfectaron transitoriamente en células FreeStyle CHO-S y se expresaron en medios libres de suero/libres de componente animal durante 6-10 días. Las proteínas se purificaron a partir de los sobrenadantes mediante cromatografía por afinidad con Proteína A (columna Mab Select Sure; GE Healthcare) y mediante cromatografía de exclusión molecular (SEC; columna Superdex G200, 30/100 GL; GE Healthcare) en un instrumento Akta Purifier (GE Healthcare). Las concentraciones se determinaron mediante mediciones de absorbancia a 280 nm. Los rendimientos se enumeran en la tabla 4.

Tabla 4. Rendimientos de purificación de fusiones de anticuerpo-polipéptidos de unión a IL-17A derivados de SH3 de Fyn biespecíficas producidas en células CHO-S transfectadas de forma transitoria. SEQ ID NO (cadena pesada, cadena ligera)

Rendimiento (mg/l) LC11L5-B06 12, 16 110

LC11L9-C09 12, 17 110

Después de la purificación, se ha realizado cromatografía de exclusión molecular usando un sistema ÄKTA FPLC y una columna Superdex G200, 30/100 GL (GE Healthcare). Los perfiles de cromatografía de exclusión molecular (SEC) después de la purificación demostraron que ambas proteínas de fusión se eluían como picos monoméricos individuales, mostrando que las proteínas de fusión tienen excelentes propiedades biofísicas (figura 4).

Ejemplo 5: mediciones de afinidad de fusiones de anticuerpo-polipéptidos de unión a IL-17A derivados de SH3 de Fyn a IL-17A y TNF humanos y de cinomolgo

Las afinidades de LC11L5-B06 y LC11L9-C09 por IL-17A (humana y de Cinomolgo) y por TNF (humano y de Cinomolgo) se midieron usando un instrumento BIAcore T200 (GE Healthcare). Un chip CM5 de la Serie S (GE Healthcare) se revistió con 8000 UR de anticuerpo específico de Fc de cabra anti-IgG humana (Jackson Immunoresearch). El tampón de migración era PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %. Las interacciones se midieron capturando aproximadamente de 400 a 500 UR de LC11L5-B06 o LC11L9-C09 a un caudal de 30 l/min, seguido por inyección de diferentes concentraciones de los antígenos a un caudal de 30 l/min. Todos los datos cinéticos de la interacción se evaluaron usando el software de evaluación BIAcore T200. Las afinidades se enumeran en la tabla 5 para los antígenos humanos y en la tabla 6 para los antígenos de Cinomolgo.

Tabla 5. Constantes de disociación de la unión de fusiones de anticuerpo-polipéptidos de unión a IL-17A derivados de SH3 de Fyn a IL-17A glucosilada humana recombinante, y TNF humano.

SEQ ID NO (cadena

Valores de KD para IL-17A Valores de KD para

pesada, cadena ligera)

humana glucosilada (pM) TNF humano (pM)

LC11L5-B06

12, 16 44 144

LC11 L9-C09 12, 17 48 89

Tabla 6. Constantes de disociación de la unión de fusiones de anticuerpo-polipéptidos de unión a IL-17A derivados de SH3 de Fyn a IL-17A glucosilada de Cinomolgo recombinante, y TNF de Cinomolgo. Valores de KD para IL-17A Valores de KD para

SEQ ID NO (cadena

de Cinomolgo glucosilada TNF de Cinomolgo

pesada, cadena ligera)

(pM)

glucosilado (pM) LC11L5-B06 12, 16 63 120

LC11L9-C09 12, 17 70 133

Ejemplo 6: LC11L5-B06 y LC11L9-C09 inhiben IL-17A y TNF simultáneamente

IL-17A y TNF inducen la producción de Gro- en células HT-29 (línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano) de manera dependiente de la dosis. Las actividades inhibidoras de las construcciones indicadas (LC11L5-B06 y LC11L9-C09) se ensayaron estimulando células HT-29 (línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano) con IL-17A glucosilada y TNF en ausencia o presencia de diversas concentraciones de LC11L5-B06 y LC11L9-C09. Los sobrenadantes de cultivo celular se recogieron después de 48 h de estimulación y se ensayaron para Gro con ELISA.

Métodos

LC11L5-B06 o LC11L9-C09 se diluyeron en medio de ensayo (medio 5A de McCoy (GIBCO) suplementado con FBS al 10 %). 50 l de cada concentración indicada se mezclaron con 50 l de medio de ensayo que contenía IL-17A (producida en las instalaciones propias en células HEK EBNA) y TNF (Thermo Fisher Scientific) a las concentraciones finales de 400 pM y 200 pM respectivamente. Como control, se preparó medio sin inhibidor. Además, se preparó medio con las citoquinas individuales solamente o sin citoquinas. Después de 1 hora de incubación, 100 l de una suspensión celular que contenía aproximadamente 20.000 células HT-29 (ATCC, #HTB38) se añadieron a las soluciones y se distribuyeron por pocillo (placa de 96 pocillos, TPP o Corning) y se cultivaron

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

durante 48 horas a 37 °C y el 5 % de CO2. Después de 48 horas de incubación a 37 °C el sobrenadante se retiró y la concentración de Gro- se determinó mediante ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Gro-α ELISA kit, R&D Systems).

Resultados

La figura 5 muestra la concentración de Gro-alfa (representada como la señal de ELISA) en el sobrenadante de células HT-29 después de estimulación con IL-17A, TNF y una combinación de los mismos. Tal como se muestra en la figura 5, las construcciones biespecíficas LC11L5-B06 y LC11L9-C09 fueron capaces de inhibir de manera dependiente de la dosis simultáneamente IL-17A y TNF. Los valores de CI50 aparentes obtenidos (tabla 7) demuestran que los compuestos biespecíficos de la invención son capaces de inhibir IL-17A y TNF con elevada potencia.

Tabla 7. Valores de CI50 aparentes para inhibición simultánea de IL-17A y TNF obtenidos para fusiones de anticuerpo-polipéptidos de unión a IL-17A derivados de SH3 de Fyn biespecíficas. Valor de CI50 aparente (pM) para

SEQ ID NO (cadena pesada,

inhibición simultánea de IL-17A ycadena ligera) TNF

LC11L5-B06 -12, 16 247

LC11L9-C09 12, 17 222

Ejemplo 7: LC11L5-B06 y LC11L9-C09 inhiben IL-17A y TNF in vivo

La capacidad de LC11L5-B06 y LC11L9-C09 para inhibir IL-17A y TNF in vivo se determinó usando un modelo de inflamación aguda en ratones C57BL/6. IL-17A humana se une a y estimula el receptor IL-17 de ratón. Cuando se inyecta en ratones, IL-17A desencadena un incremento masivo de quimioquina KC (CXCL1), que es detectable en el plazo de 1-4 horas en el suero y los fluidos de lavado de ratones inyectados. Pueden realizarse observaciones similares para TNF humana, lo que también causa un incremento significativo de los niveles de KC-suero cuando se inyecta en ratones.

Métodos

Ratones (C57BL/6, Charles River) se inyectaron por vía intravenosa con los inhibidores LC11L5-B06 (2 mg/kg), LC11L9-C09 (2 mg/kg) o como control para inhibición de TNF un anticuerpo anti-TNF disponible en el mercado (2 mg/kg) (adalimumab (HUMIRA®)) diluido en PBS libre de endotoxinas (5 ratones por grupo). 3,5 horas después de la inyección intravenosa de los inhibidores, la expresión de KC se estimuló con IL-17A humana o TNF humano mediante administración subcutánea (3 g de IL-17A por ratón o 0,25 g de TNF por ratón). Dos horas más tarde, se extrajo sangre para muestreo de suero y la concentración de KC se determinó usando un kit KC ELISA disponible en el mercado siguiendo las instrucciones del fabricante (Quantikine mouse KC immunoassay, R&D Systems).

Resultados

Después de la inyección s.c. de IL-17A o TNF humanos en ratones, los animales sobreexpresan una quimioquina llamada KC. Niveles de KC elevados en los sueros de ratones pueden medirse mediante ELISA. Inyección i.v. previa de fusiones del polipéptido derivado de SH3 de Fyn de la invención (LC11L5-B06 y LC11L9-C09) y el anticuerpo anti-TNF de control (figura 6.B y 6.D) impedía la regulación positiva de KC in vivo. La figura 6 muestra las potentes propiedades de inhibición de LC11L5-B06 (designada como “LC-B06”) y LC11L9-C09 (designada como “LC-C09”).

Ejemplo 8: LC11L5-B06 y LC11L9-C09 muestran un perfil PK similar a un anticuerpo in vivo

Las propiedades farmacocinéticas in vivo de las proteínas de fusión de la invención LC11L5-B06 y LC11L9-C09 se determinaron midiendo las concentraciones mediante ELISA en suero de ratón recogido en diferentes puntos temporales después de una única inyección i.v.

Métodos

LC11L5-B06 y LC11L9-C09 se inyectaron por vía intravenosa en 5 ratones (C57BL/6, Charles River) a una dosis de 10 mg/kg. Después de 10 minutos, 6, 24, 48, 96, 120, 144 y 168 horas, aproximadamente 20 l de sangre se extrajeron de la vena safena con el capilar Microvette CB 300 (Sarstedt). Las muestras de sangre se centrifugaron durante 10 min a 9500 x g y el suero se almacenó a -20 °C hasta que se realizó el análisis por ELISA. Usando series de dilución con concentraciones conocidas de LC11L5-B06 y LC11L9-C09, la concentración en suero se determinó mediante ELISA usando tanto TNF como IL-17A como agentes de captura: 50 l de IL-17A biotinilada (120 nM) (R&D Systems, biotinilada usando EZ-link NHS-PGE4-biotin (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante)

o 50 l de TNF biotilinado (10 nM) (Thermo Scientific, biotinilado usando EZ-link NHS-PGE4-biotin (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante) se añadieron a pocillos recubiertos con estreptavidina (Reactibind,

imagen12

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Métodos

100 l de una suspensión celular que contenía aproximadamente 3900 Fibroblastos dérmicos humanos normales (PromoCell, NHDF-c, C12300) se distribuyeron por pocillos (placa de 96 pocillos, TPP) y se cultivaron durante 24 horas a 37 °C/5 % de CO2 (medio: medio de cultivo de fibroblastos C-23010, PromoCell). El sobrenadante se aspiró y, después de mezclar diferentes concentraciones de LC11L5-B06 o LC11L9-C09 (concentraciones finales mostradas en la figura 10) con medio que contenía IL-17A e IL-1 (concentraciones finales: IL-17A: 64 pM; IL-1: 10 fM), 100 l de la solución correspondiente se añadieron a las células (triplicados). En experimentos de control, PBS se mezcló con el medio que contenía IL-17A/IL-1 (“IL-17A/IL-1”) y medio con las citoquinas individuales “IL-17ª” o “IL-1” solamente (siendo el último los pocillos de control de “IL-17ª” e “IL-1”). Como control negativo, PBS se mezcló con medio solamente (“Medio”). Después de 16 -24 horas de incubación a 37 °C / 5 % de CO2, la concentración de IL-6 en el sobrenadante se determinó usando un kit de ELISA de IL-6 siguiendo las instrucciones del fabricante (IL-6 ELISA kit, R&D Systems). Para el cálculo de los valores de CI50, los porcentajes de inhibición se determinaron y los valores de CI50 se calcularon usando el software Prism 5.

El porcentaje de inhibición de IL-17A se determinó con la siguiente fórmula:

% de inhibición (100) = 100

((A450-650 nm (muestra) -A450-650 nm (IL-I)) x 100)

(A450 -650 nm (IL-17A/IL-1) -A450 -650 nm (IL-1))

Resultados

La figura 10 muestra los valores de ELISA (absorbancia) obtenidos para la determinación de concentraciones de IL6 en los sobrenadantes de células NHDF. Tal como se muestra en la figura 10, las construcciones biespecíficas LC11L5-B06 y LC11L9-C09 fueron capaces de inhibir la producción de IL-6 mediada por IL-17A de manera dependiente de la dosis, demostrando que eran capaces de inhibir específicamente IL-17A glucosilada. Tal como se esperaba, la liberación de IL-6 inducida por IL-1 no se pudo inhibir. Los valores de CI50 obtenidos para la inhibición de IL-17A (tabla 10) muestran que los compuestos biespecíficos de la invención son capaces de inhibir IL-17A con elevada potencia.

Tabla 10. Valores de CI50 para la inhibición de IL-17A obtenidos para fusiones de anticuerpo-polipéptido de unión a IL-17A derivado de SH3 de Fyn biespecíficas. Valor de CI50 (pM) para la inhibición de IL-

SEQ ID NO (cadena pesada, cadena ligera) 17A

LC11L5-B06 12, 16 121

LC11L9-C09 12, 17 66

Ejemplo 11: LC11L5-B06 y LC11L9-C09 son estables in vivo y muestran una semivida larga en mono cinomolgo

Las propiedades farmacocinéticas de las proteínas de fusión de la invención LC11L5-B06 y LC11L9-C09 se determinaron midiendo sus concentraciones en mono cinomolgo en diferentes puntos temporales después de una única inyección i.v. Usando series de dilución con concentraciones conocidas de LC11L5-B06 y LC11L9-C09, la concentración en plasma se determinó usando un “ELISA en sándwich”, que garantiza la medición de solamente moléculas biespecíficas completamente funcionales e intactas LC11L5-B06 y LC11L9-C09. Para demostrar adicionalmente que LC11L5-B06 y LC11 L9-C09 permanecen intactas y los polipéptidos derivados de SH3 de Fyn de la invención no se escinden del anticuerpo in vivo (en monos cinomolgo) se desarrolló un ELISA adicional, que detecta solamente el componente de anticuerpo de las proteínas de fusión (“ELISA directo”). Los dos métodos de detección por ELISA se ilustran en la figura 11.

Métodos

Las construcciones anti-IL-17A/TNF biespecíficas LC11L5-B06 (construcción biespecífica (de acuerdo con la invención) con cadena pesada y cadena ligera que consiste en las secuencias de las SEQ ID NO: 12 y 16, respectivamente) y LC11L9-C09 (construcción biespecífica (de acuerdo con la invención) con cadena pesada y cadena ligera que consisten en las secuencias de las SEQ ID NO: 12 y 17, respectivamente) se expresaron y se purificaron tal como se describe en el ejemplo 4. LC11L5-B06 y LC11L9-C09 se inyectaron por vía intravenosa en 3 monos cinomolgo macho a una dosis de 3 mg/kg. Se extrajo sangre de venas periféricas en los puntos temporales indicados después del final de la administración de la dosis (0,6 ml de volumen de recogida por muestra). Se usó solución de EDTA (7,5 %) como anticoagulante. Después de la recogida de sangre, las muestras se centrifugaron a 4 °C durante 10 min a 1200 g, y el plasma se almacenó a -80 °C hasta análisis mediante ELISA. “ELISA en sándwich”: Pocillos recubiertos con neutravidina (Biomat MCP44-11) se bloquearon con 150 l/pocillo de tampón de bloqueo (1X PBS -BSA al 5 %) durante 60 minutos a temperatura ambiente (TA) con agitación rotoorbital suave ajustada a 300 rpm. Los pocillos se lavaron con 200 l/pocillo de tampón de lavado (1X PBS -Tween 20 al 0,1 %) y a continuación se incubaron con 100 l/pocillo de una solución que contenía 0,2 g/ml de TNF-alfa biotinilado (PeproTech, biotinilado usando un kit de marcado con biotina de ANP Technologies de acuerdo con las

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2