EA031683B1 - Полипептид, ингибирующий активность гликозилированного il-17a, и его применение - Google Patents

Полипептид, ингибирующий активность гликозилированного il-17a, и его применение Download PDF

Info

Publication number
EA031683B1
EA031683B1 EA201590611A EA201590611A EA031683B1 EA 031683 B1 EA031683 B1 EA 031683B1 EA 201590611 A EA201590611 A EA 201590611A EA 201590611 A EA201590611 A EA 201590611A EA 031683 B1 EA031683 B1 EA 031683B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
glycosylated
ser
antibody
amino acid
Prior art date
Application number
EA201590611A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201590611A1 (ru
Inventor
Микела Силаччи Мелькко
Надя Бэнцигер
Ричард Вудс
Вэньцзюань Чжа
Изабелла Аттингер
Роджер Сантимария
Вибке Лембке
Сара Бэти
Улрике Фон Дер Бей
Юлиан БЕРТШИНГЕР
Драган ГРАБУЛОВСКИ
Original Assignee
Коваген Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47010256&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA031683(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Коваген Аг filed Critical Коваген Аг
Publication of EA201590611A1 publication Critical patent/EA201590611A1/ru
Publication of EA031683B1 publication Critical patent/EA031683B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)

Abstract

Изобретение раскрывает полипептид, ингибирующий активность гликозилированного IL-17A; конструкции, содержащие заявленный полипептид; нуклеиновые кислоты, кодирующие заявленный полипептид и конструкции; фармацевтические композиции для лечения воспалительного, аутоиммунного и/или связанного с потерей костной массы заболевания, содержащие заявленный полипептид, конструкцию, нуклеиновую кислоту или их комбинацию; а также соответствующее применение фармацевтических композиций.

Description

Изобретение относится к полипептиду, ингибирующему активность гликозилированного IL-17A, где полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
(a)
GVTLFVALYDY (X1) (X2) (X3) (X4) (X5) (X6) DLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTG ETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 1), где аминокислоты в положениях (X1)-(X6) могут быть любой аминокислотной последовательностью; и (b) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотной последовательности (a), где при определении идентичности исключают аминокислоты в положениях (X1)-(X6) при условии, что аминокислотная последовательность STHEYE (SEQ ID NO: 2) в положениях аминокислот 31-36 последовательности SEQ ID NO: 1 является консервативной.
Изобретение также относится к конструкциям, слитым с дополнительным соединением, композициям и медицинским применениям, включающим указанный полипептид.
В настоящем описании цитирован ряд документов, включая патентные заявки и руководства производителей. Описания этих документов, несмотря на то что они не являются релевантными настоящему изобретению, включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Более конкретно, все цитированные документы включены в качестве ссылок в той степени, как если бы каждый отдельный документ конкретно и отдельно указывали как включенный в качестве ссылки.
CD4+ T-клетки играют ключевую роль в регуляции иммунных ответов, содействуя другим клеткам адаптивной или врожденной иммунной системы. В ранних исследованиях идентифицировали два класса CD4+ T-клеток (Th1 и Th2). Недавно идентифицировали новую субпопуляцию CD4+ T-клеток, линию Th17. TI117-клетки, по-видимому, эволюционировали как ветвь адаптивной иммунной системы, специализирующаяся на повышенной защите хозяина от внеклеточных бактерий, а также некоторых грибов и микроорганизмов, не полностью охватываемых Th1- или ^2-иммунитетом.
'П117-к.1е'тки идентифицировали в связи с открытием нового семейства цитокинов, семейства IL-17, как известно на настоящий момент, содержащего шесть членов (IL-17A-F). IL-17 (ранее обозначаемый как CTLA-8), в основном, экспрессируется Th17-клетками, и его обозначили как IL-17A для указания того, что он является первоначальным членом этого семейства цитокинов. Интерлейкин-17A человека (IL-17) представляет собой плейотропный, провоспалительный цитокин, являющийся ключевым для определения клеточной линии CD4+ T-хелперов 17 (TH17), как указано выше (Miossec P. et al. (2009) N. Engl. J. Med. 361, p.888-898). IL-17A является гомодимерной молекулой и после расщепления сигнального пептида из 23 аминокислот он секретируется в виде гликозилированного, ковалентно связанного гомодимера (ссылочная последовательность NCBI: NP 002181.1; идентификационный номер UniProtK: Q16552; SEQ ID: 10). Расщепление F-эндогликозидазой сдвигает кажущуюся молекулярную массу IL17A человека, экспрессируемого клетками млекопитающих, с 22 до 15 кДа при электрофорезе в ПААГ в присутствие SDS в восстановительных условиях, что, таким образом, свидетельствует о том, что цитокин является гликозилированным (Fossiez F. et al. (1998) Int Rev Immunol. 16(5-6); p. 541-551).
Идентификация Th17-KreTOK в качестве центральных медиаторов хронических воспалительных процессов и в качестве основных патогенных эффекторов в нескольких типах аутоиммунных состояний, которые, как считали ранее, опосредованы Th1, дает надежду на создание новых терапевтических подходов (Weaver Т. et al. (2008) Annu. Rev. Immunol., 25, p. 821-852). Фактически, провоспалительный цитокин IL-17, в основном, экспрессируется ^И-клетками и присутствует при повышенных уровнях в синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом (RA), и показано, что он участвует в развитии раннего RA. Кроме того, IL-17 является мощным индуктором TNF-альфа и IL-1, последний из которых, в основном, отвечает за эрозию кости и очень болезненные последствия у пациентов (Lubberts E. (2008) Cytokine, 41, р. 84-91). Кроме того, неправильная или избыточная продукция IL-17 связана с патологией при других различных заболеваниях и нарушениях, таких как остеоартрит, потеря костной ткани вокруг имплантатов, острое отторжение трансплантата (Antonysamy et al., (1999) J. Immunol., 162, p. 577-584; van Kooten et al. (1998) J. Am. Soc. Nephrol., 9, p. 1526-1534), септицемия, септический или эндотоксический шок, аллергия, астма (Molet et al. (2001) J. Allergy Clin. Immunol., 108, p. 430-438), потеря костной массы, псориаз (Teunissen et al. (1998) J. Invest. Dermatol, 111, p. 645-649), ишемия, системная склеродермия (Kurasawa et al. (2000) Arthritis Rheum., 43, p. 2455-2463), инсульт и другие воспалительные нарушения.
Таким образом, соединения против IL-17 возможно могут использоваться как противовоспалительные средства, терапевтический подход, соответствующий ряду исследований in vivo, показывает, что нейтрализация IL-17 снижает воспалительные процессы, такие как артрит. Например, ранняя нейтрализация эндогенного IL-17 с помощью слитого белка рецептора IL-17-IgG1-Fc, начинающаяся после иммунизации на начальной фазе артрита, подавляет начало экспериментального артрита (Lubberts et al. (2001) J. Immunol., 167, p. 1004-1013). Кроме того, обработка нейтрализующим антителом против IL-17 на модели животных после начала коллаген-индуцированного артрита снижала воспаление суставов, деграда
- 1 031683 цию хряща и эрозию кости (Lubberts et al. (2004) Arthritis and Rheumatism, 50; 650-659). С помощью гистологического анализа подтверждали супрессию воспаления хряща, и после обработки антителом против IL-17 уровни системного IL-6 значимо снижались. В отличие от этого, системная, а также местная гиперэкспрессия IL-17, достигаемая с помощью аденовирусного вектора, экспрессирующего IL-17 мыши, ускоряла начало коллаген-индуцированного артрита (CIA) и ухудшала синовиальное воспаление в этом участке (Lubberts et al. (2001) J. Immunol., 167, p. 1004-1013 и Lubberts et al. (2002), Inflamm. Res. 51, p102-104). К настоящему времени было показано, что использование антител против IL-17 улучшает клинические симптомы псориаза, ревматоидного артрита и неинфекционного увеита (Leonardi С. et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366, p. 1190-1199; Hueber W. et al. (2010) Sci. Transl. Med. 2 (52):52ra72).
Для лечения множества различных заболеваний широко используют моноспецифические средства. Большинство существующих на рынке биологических средств являются моноспецифическими и поэтому способны взаимодействовать и влиять на единственную мишень. Однако комплексные заболевания по своей природе зачастую являются мультифакториальными и включают множественное или синергичное действие медиаторов заболевания. Таким образом, блокада многочисленных, отличных патологических факторов и путей может приводить к улучшеннию терапевтической эффективности (Konterman R.E. (2012) mAbs, 4:2, p. 182-197).
Кроме IL-17A, другой ключевой молекулой, вовлеченной в этиологию воспалительных, аутоиммунных заболеваний и заболеваний, связанных с потерей костной массы, в том числе различных форм артрита, включая ревматоидный артрит, является фактор некроза опухоли (TNF). Несколько терапевтических средств против TNF разрешены для лечения ревматоидного артрита, псориаза, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита и болезни Крона, и они проходят тестирование в клиниках для других воспалительных состояний. В настоящее время существуют пять классов биологических средств, доступных для лечения воспалительного артрита, каждое из которых ингибирует отдельный аспект иммуноопосредованного воспалительного пути (обзор в Scott D.L. (2012) Clin. Pharmacol. Ther., 91(1), p. 3143): (i) ингибиторы TNF (адалимумаб, этанерцепт, инфликсимаб, цертолизумаб, голимумаб), (ii) антагонист рецептора интерлейкина-1 (анакинра), (iii) ингибитор B-клеток (ритуксимаб), (iv) ингибитор костимуляции T-клеток (абатацепт) и (v) ингибитор интерлейкина-6 (тоцилизумаб). Другие разрешенные биологические средства для лечения воспалительных состояний включают канакинумаб (анти-[Б-1 бета) и устекинумаб (анти-Ш-12/23) (Reichert J.M. (2012) mAbs, 4:3, p. 413-415). TNF-связывающие молекулы, разработанные для терапевтического применения, также описаны в Tak and Kalden (2011) (Arthritis Research and Therapy, 3; 1-14).
В статье Koenders et al. (2011) (Arthritis and Rheumatism, 63; 2329-2339) описано, что взаимодействие TNF и IL-17 запускает молекулярные механизмы, приводящие к необратимой деградации хряща на модели артрита у животных. Кроме того, авторами было обнаружено, что комбинация растворимого рецептора интерлейкина-17 и TNF-связывающего белка была более эффективной для лечения артрита, чем лечение, направленное против любого цитокина по отдельности. TNF-связывающая молекула, описываемая в публикации Koenders et al. (2011), является димерно связанным пегилированным растворимым рецептором TNF I p55. В документе WO 2010/102251 описаны связывающие белки, содержащие первую и вторую полипептидные цепи, где связывающий белок способен связываться с IL-17 и TNF человека. Обе полипептидные цепи имеют молекулярную структуру, состоящую из вариабельных и константных доменов антитела. В литературе описано несколько других биспецифических и/или мультиспецифических слитых белков (см. обзор Konterman R.E. (2012) mAbs, 4:2, p. 182-197).
Полипептиды, полученные из SH3 Fyn, хорошо известны в данной области и описаны, например, в статье Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204; WO 2008/022759; Bertschinger et al. (2007) Protein Eng. Des. Sel. 20(2):57-68; и Gebauer and Skerra (2009) Curr. Opinion in Chemical Biology 13:245-255. Термин полипептид, полученный из SH3 Fyn, который в настоящем описании используемый взаимозаменяемо с термином Буномер. относится к связывающему (поли)пептиду, полученному не из иммуноглобулина (например, так называемый каркас, как описано в статье Gebauer and Skerra (2009) Curr. Opinion in Chemical Biology 13:245-255), полученному из домена SH3 Fyn человека. Домен SH3 киназы Fyn человека успешно использовали как каркас для конструирования белков (связывающих белков, полученных из SH3 Fyn, названных Fуnомерами), с высокой аффинностью и специфичностью связывающихся с различными белковыми мишенями (WO 2008/022759, WO 2011/023685, Grabulovski D. et al., (2007) J. Biol. Chem. 282, p. 3196-3204, Bertschinger J. et al. (2007) Protein Eng. Des. Sel., 20, p. 57-68 и Schlatter et al. (2012) mAbs, 4(4) p. 497-50).
В WO 2011/023685 описаны IL-17-ингибирующие полипептиды ('Турмеры), соответствующие слитые белки, композиции и их медицинское применение. Эти IL-17-ингибирующие полипептиды обладают высокой специфичностью и высокой аффинностью в отношении IL-17A. Технической задачей, лежащей в основе настоящего изобретения, является получение других IL-17A-ингибирующих полипептидов и, в частности, технически усовершенствованных IL-17A-ингибирующих полипептидов.
Техническая задача решена вариантами осуществления, охарактеризованными в формуле изобретения.
Таким образом, настоящее изобретение относится к первому варианту осуществления полипептида,
- 2 031683 ингибирующего активность гликозилированного IL-17A, где полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
(a)
GVTLFVALYDY (X1) (X2) (X3) (X4) (X5) (X6) DLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTG ETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 1), где аминокислоты в положениях (X1)-(X6) могут быть любой аминокислотной последовательностью; и (b) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотной последовательности (a), где при определении идентичности исключают аминокислоты в положениях (X1)-(X6), при условии, что аминокислотная последовательность STHEYE (SEQ ID NO: 2) в положениях аминокислот 31-36 последовательности SEQ ID NO: 1 является консервативной.
Изобретение также относится к конструкциям, слитым с дополнительным соединением, композициям и медицинскому применению, включающему указанный полипептид.
Настоящее изобретение относится ко второму варианту осуществления полипептида, связывающегося с гликозилированным IL-17A и, предпочтительно, ингибирующим его активность, где полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: (a)
GVTLFVALYDY (X1) (X2) (X3) (X4) (X5) (X6) DLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTG ETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 1), где аминокислоты в положениях (X1)-(X6) могут быть любой аминокислотной последовательностью; и (b) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотной последовательности (a), где при определении идентичности исключают аминокислоты в положениях (X1)-(X6), при условии, что аминокислотная последовательность STHEYE (SEQ ID NO: 2) в положениях аминокислот 31-36 последовательности SEQ ID NO: 1 является консервативной. Изобретение также относится к конструкциям, слитым с дополнительным соединением, композициям и медицинскому применению, включающему указанный полипептид.
Следующие определения, примеры, предпочтительные и независимые варианты осуществления относятся как к первому, так и ко второму вариантам осуществления изобретения.
Как используется в настоящем описании, термин полипептид обозначает линейные молекулярные цепи аминокислот, включая одноцепочечные белки или их фрагменты, содержащие более приблизительно 50 аминокислот. Полипептиды могут также образовывать мультимеры, например олигомеры, состоящие по меньшей мере из двух идентичных или разных молекул. Соответствующие структуры таких мультимеров более высокого порядка называют, соответственно, гомо- или гетеродимеры, гомо-или гетеротримеры и т.д. Кроме того, настоящее изобретение также относится к пептидомиметикам таких полипептидов, в которых аминокислоты и/или пептидные связи заменены на функциональные аналоги. К таким функциональным аналогам относятся все известные аминокислоты, отличные от 20-генкодирующих аминокислот, например селеноцистеин. Термин полипептид также относится к природным модифицированным полипептидам, где модификация осуществляется, например, посредством гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования и аналогичных модификаций, хорошо известных в данной области.
Настоящее изобретение также относится к фрагментам полипептида по изобретению, которые по существу, сохраняют способность связываться с гликозилированным IL-17A. В этом случае предпочтительные фрагменты содержат по меньшей мере 30 аминокислот, по меньшей мере 35 аминокислот, по меньшей мере 40 аминокислот или по меньшей мере 45 аминокислот при условии, что фрагменты содержат менее приблизительно 55 аминокислот. Кроме того, во фрагменте, предпочтительно, сохраняются положения аминокислот, соответствующие RT- и src-петле, как определено в описании ниже.
Как используется в настоящем описании, термин полипептид, ингибирующий активность гликозилированного IL-17A обозначает полипептид, который обладает способностью снижать или полностью устранять активность гликозилированного IL-17A, подробно изложенной ниже. В этом случае ингибирование активности гликозилированного IL-17A, предпочтительно, обозначает ингибирование связывания гликозилированного IL-17A с поверхностным клеточным рецептором типа I, обозначенным как IL-17R (рецептор интерлейкина-17). В данной области известны по меньшей мере три варианта IL-17R, а именно IL17RA, IL17RB и IL17RC. В связи с этим, помимо прочего, полипептид, предпочтительно, ингибирует активность гликозилированного IL-17A по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или 100%. Также предпочтительно, чтобы значение IC50 для ингибирования гликозилированного IL-17A полипептидами по изобретению составляло 1000 нМ или менее, 500 нМ или менее, 400 нМ или менее, 300 нМ или менее, 200 нМ или менее, 100 нМ или менее или 75 нМ или менее. В связи с этим полипептиды по изобретению, предпочтительно, специфически ингибируют активность гликозилированного IL-17A и, таким образом, не ингибируют другие родственные белки, такие как гликозилированный IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E или IL-17F. Полипептид по изобретению ингибирует активность гликозилированного IL
- 3 031683
17A. Полипептид, предпочтительно, ингибирует активность гликозилированного и негликозилированного IL-17A. Таким образом, указанные выше определения можно использовать, с учетом соответствующих необходимых изменений, в отношении ингибирования негликозилированного IL-17A.
Следует понимать, что ингибирование активности гликозилированного IL-17A также включает связывание с гликозилированным IL-17A. В связи с этим предпочтительно, чтобы связывание с гликозилированным IL-17A также приводило к ингибированию активности гликозилированного IL-17A. Термин связывание с гликозилированным IL-17A обозначает, что полипептиды или фрагменты по изобретению вступают в связывающие взаимодействия (in vivo и/или in vitro) с гликозилированным IL-17A. Предпочтительно, полипептиды по изобретению связываются с гликозилированным IL-17A с KD от 10'7 до 10' М, более предпочтительно, от 10' до 10' М, наиболее предпочтительно, от 10' до 10' М. В этом случае полипептиды по изобретению, предпочтительно, специфически связываются с IL-17A и, таким образом, не связываются с другими родственными белками, такими как IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E или IL-17F. Полипептид по изобретению связывается с гликозилированным IL-17A. Полипептид, предпочтительно, связывается с гликозилированным и негликозилированным IL-17A. Таким образом, указанные выше определения можно использовать, с учетом соответствующих необходимых изменений, в отношении связывания негликозилированного IL-17A.
Последовательность SEQ ID NO: 1, как указано в настоящем описании выше, получают из аминокислотной последовательности домена SH3 киназы Fyn человека (SEQ ID NO: 20; а/к 83-145 киназы Fyn, описана в статье Kawakami et al. и Semba et al. в 1986). SEQ ID NO: 20 представляет собой
GVTLFVALYDYEARTEDDLSFHKGEKFQILNSSEGDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 20). В последовательности SEQ ID NO: 20, представленной выше, последовательности RT- и src-петли обозначены одинарным и двойным подчеркиванием, соответственно. В статье Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204 было исследовано влияние мутаций в RT- и src-петлях доменов SH3 Fyn и показано, что мутации в обеих петлях вблизи гидрофобной поверхности могут определять способность этого домена участвовать в межмолекулярных взаимодействиях. Кроме того, в документе EP 2054432 показано, что мутации в RT- и/или src-петле и вблизи них определяют специфичность связывания домена SH3. Аминокислотная последовательность SH3 Fyn является полностью консервативной у людей, мышей, крыс и обезьян (гиббонов). SH3 Fyn курицы отличается по одному положению аминокислоты, a SH3 Fyn Xenopus laevis по двум положениям аминокислот от соответствующего домена человека. Как и другие домены SH3, SH3 Fyn состоит из двух анти-параллельных β-слоев и содержит две гибкие петли (обозначенные как RT- и src-петли) для взаимодействия с другими белками.
Более подробно, последовательность SEQ ID NO: 1 является последовательностью, полученной при выравнивании последовательностей SEQ ID NO: 3-9 (см. фиг. 8). Как видно на фиг. 8, положения (X1)(X6) последовательности SEQ ID NO: 1 соответствуют RT-петле домена SH3 киназы Fyn последовательности SEQ ID NO: 20. В связи с этим, предпочтительно, чтобы аминокислоты полипептида по изобретению в положениях (Xx)-(X6) не содержали последовательность EARTED (SEQ ID NO: 19). Кроме того, как видно на фиг. 8, положения, соответствующие src-петле домена SH3 киназы Fyn с последовательностью SEQ ID NO: 20, а именно последовательность STHEYE (подчеркнутая в SEQ ID NO: 1, как показано выше), являются консервативными в последовательностях SEQ ID NO: 3-9. Положения аминокислот в RT-и src-петле определяют специфичность связывания с гликозилированным IL-17A.
Как используется в настоящем изобретении, термин процент (%) идентичности последовательности обозначает количество совпадений (совпадения) идентичных нуклеотидов/аминокислот двух или более выравниваемых последовательностей нуклеиновой кислоты или аминокислотных последовательностей по сравнению с количеством нуклеотидов или аминокислотных остатков, составляющих общую длину первоначальных последовательностей нуклеиновой кислоты или аминокислотных последовательностей. Другими словами, используя выравнивание двух или более последовательностей или подпоследовательностей можно определять процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов (например, идентичность 85, 90 или 95%) при сравнении и выравнивании (под)последовательностей для максимального соответствия в пределах окна сравнения или в пределах обозначенной области, как измерено с помощью алгоритма сравнения последовательностей, как известно в данной области, или при выравнивании вручную и визуальной оценке. Таким образом, последовательности, сравниваемые для определения идентичности последовательностей, могут отличаться заменами, вставками или делециями нуклеотидов или аминокислот. Это определение также применимо к последовательностям, которые комплементарны тестируемым последовательностям.
Специалисту в данной области также известны подходящие программы для выравнивания последовательностей нуклеиновой кислоты. Процент идентичности последовательности для полипептидных последовательностей можно определять, например, используя программы, описанные выше, CLUSTLAW, FASTA и BLAST. Предпочтительно используют программу BLAST, а именно алгоритм NCBI BLAST (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic. Acids Res. 25:3389-3402).
Что касается идентичности последовательности, как указано в пункте (b) описания выше, предпоч
- 4 031683 тительно, идентичность последовательности составляет по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98%.
Как используется в настоящем описании, фраза при определении идентичности исключают аминокислоты в положениях (X!)-(X6) обозначает, что при вычислении идентичности последовательности относительно последовательности SEQ ID NO: 1 не принимают во внимание аминокислоты в положениях (X!)-(X6), и его ограничивают оставшимися 58 положениями аминокислот последовательности SEQ ID NO: 1. Как используется в настоящем описании при условии, что аминокислотная последовательность STHEYE (SEQ ID NO: 2) в положениях аминокислот 31-36 последовательности SEQ ID NO: 1 является консервативной обозначает, что в положения аминокислот 31-36 последовательности SEQ ID NO: 1 нельзя вносить замены аминокислот. В других терминах положения аминокислот, соответствующие положениям аминокислот 31-36 последовательности SEQ ID NO: 1, имеют последовательность STHEYE (SEQ ID NO: 2) во всех полипептидах, попадающих в диапазон первого варианта осуществления изобретения и его предпочтительных примеров.
В связи с этим предпочтительно, положения аминокислот, соответствующие положениям аминокислот 31-37 последовательности SEQ ID NO: 1, имеют последовательность STHEYED (SEQ ID NO: 18) во всех полипептидах, попадающих в диапазон первого варианта осуществления изобретения и его предпочтительных примеров. Другими словами, в отношении первого варианта осуществления изобретения и его предпочтительных примеров предпочтительным является соответствие условию, по которому аминокислотная последовательность STHEYED (SEQ ID NO: 18) в положениях аминокислот 31-37 последовательности SEQ ID NO: 1 является консервативной.
Любая замена аминокислоты в последовательности SEQ ID NO: 1, предпочтительно, является консервативной заменой аминокислоты. Консервативная замена означает замену аминокислоты другой аминокислотой, имеющей химические свойства, схожие с таковыми у замещаемой аминокислоты. Как используется в настоящем описании, предпочтительно, консервативная замена является заменой, выбранной из группы, состоящей из: (i) замены основной аминокислоты другой основной аминокислотой; (ii) замены кислой аминокислоты другой кислой аминокислотой; (iii) замены ароматической аминокислоты другой ароматической аминокислотой; (iv) замены неполярной алифатической аминокислоты другой неполярной алифатической аминокислотой; и (v) замены полярной незаряженной аминокислоты другой полярной незаряженной аминокислотой. Основными аминокислотами являются аргинин, гистидин и лизин. Кислыми аминокислотами являются аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота. Ароматическими аминокислотами являются фенилаланин, тирозин и триптофан. Неполярными алифатическими аминокислотами являются глицин, аланин, валин, лейцин, метионин, изолейцин и пролин. Полярными, незаряженными аминокислотами являются серин, треонин, цистеин, аспарагин и глутамин. В отличие от консервативной замены аминокислоты, неконсервативная замена аминокислоты является заменой одной аминокислоты любой аминокислотой, не попадающей в диапазон описанных выше консервативных замен (i)-(v).
Термин IL-17A или интерлейкин-17А (ранее обозначаемый как CTLA-8, а также обозначаемый в настоящем описании и в данной области просто как IL-17 или интерлейкин-17, т.к. он является первоначальным членом семейства IL-17) означает мощный провоспалительный цитокин, продуцируемый активированными T-клетками памяти (Gurney and Aggarwal (2002), IL-17: prototype member of an emerging cytokine family, J. Leukoc. Biol. 71(1): 1-8). Более подробно, IL-17A является цитокином, действующим как мощный медиатор в реакциях замедленного типа, повышая продукцию хемокинов в различных тканях для рекрутирования моноцитов и нейтрофилов в участок воспаления, аналогично интерферону гамма. IL-17A продуцируется T-хелперными клетками и индуцируется IL-23, что приводит к деструкции ткани в реакциях замедленного типа. Интерлейкин-17A, как и семейство, функционирует как провоспалительный цитокин, отвечающий на проникновение в иммунную систему внеклеточных патогенов и индуцирующий деструкцию клеточного матрикса патогена. Интерлейкин-17A действует синергично с фактором некроза опухоли и интерлейкином-1. IL-17A человека является белком размером 155 аминокислот, предпочтительно, содержащим или состоящим из SEQ ID NO: 10, являющимся связанным дисульфидной связью, гомодимерным, секретируемым гликопротеином с молекулярной массой 35 кДа. Каждая субъединица гомодимера составляет приблизительно 15-20 кДа. Структура IL-17A состоит из сигнального пептида размером 23 аминокислот (а/к) со следующей за ним областью цепи размером 132 а/к, характерной для семейства IL-17. Впервые N-связанный участок гликозилирования в белке идентифицировали после очистки белка, при которой выявили две полосы, одна - 15 кДа, а другая - 20 кДа. Как указано, исходно определенный IL-17 обозначили как IL-17A для указания того, что он является первоначальным членом этого семейства цитокинов. В дополнение к IL-17A, члены семейства IL-17 включают IL-17B, IL17C, IL-17D, IL-17E (также называемый IL-25) и IL-17F. Считают, что семейство IL-17 представляет собой отдельную сигнальную систему, по-видимому, являющуюся высококонсервативной в эволюции позвоночных. Все члены семейства IL-17 имеют схожую структуру белка с четырьмя высоконсервативными остатками цистеина, критичными для их 3-мерной структуры, при этом они не обладают схожестью последовательности с любыми другими известными цитокинами.
IL-17A-ингибирующие полипептиды, представленные в настоящем описании, неожиданно, имеют
- 5 031683 высокую специфичность и высокую аффинность по отношению к негликозилированному IL-17A, а также гликозилированному IL-17A. В частности, SEQ ID NO: 3-9 по изобретению способны полностью ингибировать гликозилированный IL-17A со схожими активностями по сравнению с негликозилированным IL-17A (см. пример 3). Это является преимуществом по сравнению с ГЬ-ПА-связывающими полипептидами, полученными из SH3 Fyn, известными из WO 2011/023685. IL-17A-связываюшие полипептиды, полученные из SH3 Fyn, описываемые в WO 2011/023685, не ингибируют гликозилированный IL-17A полностью даже в высоких концентрациях и/или демонстрируют значительные различия в активности ингибирования (значениях IC50) между гликозилированным и негликозилированным IL-17A (см. пример 3 и фиг. 3). Как представлено в настоящем описании выше, IL-17A секретируется in vivo в виде гликозилированного, ковалентно связанного гомодимера. Новые IL-17A-связывающие молекулы, представленные в настоящем описании, имеющие преимущество связывания и ингибирования гликозилированного IL-17A, таким образом, особенно подходят для применения, требующего определения или связывания с IL-17A in vivo, где он присутствует преимущественно в виде гликозилированного белка. Таким применением является, например, диагностика и медицинское лечение, предпочтительно, составление лекарственных средств для лечения и/или профилактики IL-17A-опосредованных заболеваний.
В примерах, приведенных ниже, показано, что аминокислоты, указанные для аминокислот в положениях (X1)-(X6), придают специфичность связывания с гликозилированным IL-17A, в частности с гликозилированным IL-17A, содержащим последовательность SEQ ID NO: 10. Более подробно, в случае выравнивания последовательностей SEQ ID NO: 3-9 по изобретению на фиг. 8 показано, что аминокислоты в положениях (X1)- (X6) выбраны из (X1), представляющей собой A, K, S, D или E; (X2), представляющей собой N, Q, A, K, S или R; (X3), представляющей собой H, K, R, L или V; (X4), представляющей собой G или S; (X5), представляющей собой H, Q, A, W, V или N; и (X6), представляющей собой R, L или S, в последовательности SEQ ID NO: 3-9. Таким образом, можно ожидать, что также другие аминокислотные последовательности, выбранные из (X1)-(X6), как определено выше, иные, чем конкретные комбинации аминокислот для (X!)-(X6), представленные в последовательности SEQ ID NO: 3-9, придают специфичность связывания с гликозилированным IL-17A. В предпочтительном варианте осуществления изобретения аминокислоты в положениях (X')-(X6) полипептида по изобретению, таким образом, выбраны из (X1) представляющей собой A, K, S, D или E; (X2), представляющей собой N, Q, A, K, S или R; (X3), представляющей собой H, K, R, L или V; (X4), представляющей собой G или S; (X5), представляющей собой H, Q, A, W, V или N; и (X6), представляющей собой R, L или S (см. SEQ ID NO: 21).
Настоящее изобретение также включает консервативные замены аминокислот (X1), представляющей собой A, K, S, D или E; (X2), представляющей собой N, Q, A, K, S или R; (X3), представляющей собой H, K, R, L или V; (X4), представляющей собой G или S; (X5), представляющей собой H, Q, A, W, V или N; и (X6), представляющей собой R, L или S.
Особенно предпочтительно, аминокислоты в положениях (X')-(X6) полипептида по изобретению выбраны из (X1), представляющей собой S или E; (X2), представляющей собой A или S; (X3), представляющей собой R или V; (X4), представляющей собой G или S; (X5), представляющей собой Q или V; и (X6), представляющей собой L или S. Эти аминокислоты соответствуют положениям (X')-(X6) в последовательности SEQ ID NO: 5 и 7 соответственно. Наиболее предпочтительно, аминокислоты в положениях (X')-(X6) полипептида по изобретению являются (X1), представляющей собой S; (X2), представляющей собой A; (X3), представляющей собой R; (X4), представляющей собой G; (X5), представляющей собой Q; и (X6), представляющей собой L. Эти аминокислоты соответствуют положениям (X')-(X6) в последовательности SEQ ID NO: 5.
В соответствии с полипептидом по пункту (b) описания первого полипептида, по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (или SEQ ID NO: 3-9) могут отличаться не только положения аминокислот (X')-(X6). но также и дополнительные положения аминокислот, не находящиеся в RT-и/или src-петле (имеющей последовательность STHEYE (SEQ ID NO: 2) по изобретению) домена SH3 киназы Fyn (SEQ ID NO: 20). Полагают, что различия аминокислот в этих положениях не важны для специфичности связывания SEQ ID NO: 3-9. Таким образом, эти положения аминокислот можно заменять, или подвергать делеции, или можно добавлять дополнительные аминокислоты без существенного ухудшения специфичности связывания с гликозилированным IL-17A. При замене аминокислот консервативные замены являются предпочтительными.
В более предпочтительном варианте осуществления полипептид по изобретению содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из любой из SEQ ID NO: 3-9.
Как показано в примерах в описании ниже, обнаружили, что последовательности SEQ ID NO: 3-9 связываются и ингибируют негликозилированный, а также гликозилированный IL-17A, имеющий последовательность SEQ ID NO: 10. Более подробно, неожиданно обнаружили, что IL-17A-связывающие полипептиды, полученные из SH3 Fyn, с последовательностями SEQ ID NO: 3-9 способны полностью ингибировать гликозилированный IL-17A со схожими активностями по сравнению с негликозилированным IL-17A. Это является преимуществом по сравнению с IL-17A-связывающими полипептидами, полученными из SH3 Fyn, описываемыми в WO 2011/023685 (см. сравнительные данные в примере 3).
- 6 031683
Среди последовательностей SEQ ID NO: 3-9 предпочтение отдают последовательностям SEQ ID NO: 5 и 7. Последовательности SEQ ID NO: 5 и 7 используют для получения конструкций, слитых с дополнительным соединением, и конструкций, представленных в примере 4. Полученные конструкции, слитые с дополнительным соединением, и конструкции были особенно подходящими, т.к. они являются стабильными, мономерными, растворимыми и демонстрируют исключительные биофизические и подобные лекарственным средствам свойства. Кроме того, слияние SEQ ID NO: 5 и 7 с дополнительными соединениями не влияло на исключительное связывание с гликозилированным IL-17A.
Как известно, незначительные изменения в аминокислотной последовательности, такие как делеция, вставка или замена одной нескольких аминокислот может приводить к образованию мутантной формы исходного белка, имеющей, по существу, идентичные свойства. Таким образом, что касается SEQ ID NO: 3-9, настоящее изобретение также включает полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно, по меньшей мере на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 98% идентична любой из SEQ ID NO: 3-9, при условии, что аминокислотная последовательность STHEYE (SEQ ID NO: 2) в положениях аминокислот 31-36 последовательности SEQ ID NO: 1 является консервативной. При замене аминокислот предпочтительными являются консервативные замены.
Кроме того, в соответствии с изобретением предпочтительно, чтобы IL-17A содержал или состоял из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.
Как видно из примеров, представленных ниже, IL-17A человека, имеющий последовательность SEQ ID NO: 10, используют в качестве белка-мишени для идентификации полипептидов, имеющих последовательности SEQ ID NO: 3-9. Первые 23 аминокислоты последовательности SEQ ID NO: 10 представляют собой сигнальный пептид. Таким образом, особенно предпочтительно, чтобы полипептид по изобретению связывался с гликозилированным IL-17A в положениях аминокислот 24-155 последовательности SEQ ID NO: 10.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к конструкции, содержащей полипептид по изобретению, слитый с дополнительным соединением.
Как используется в настоящем описании, термин слитая конструкция обозначает слияние полипептида по изобретению с дополнительным соединением. Соединение может быть белковым соединением или небелковым соединением. В случае, когда соединение является белковым соединением (например цитокином или хемокином, как представлено в настоящем описании ниже), конструкцию, слитую с дополнительным соединением, также можно обозначать как слитый белок. Как используется в настоящем описании термин слитый белок, в целом, относится к полипептидной конструкции, полученной посредством присоединения и экспрессии двух или более генов, кодирующих отдельные полипептиды. Другими словами, трансляция этого слитого гена приводит к образованию единственного полипептида с функциональными свойствами, полученными от каждого из исходных полипептидов. Полипептиды можно подвергать слиянию напрямую или через линкер, т.е. короткую пептидную последовательность. В основном, слитые белки получают искусственно с помощью технологии рекомбинантных ДНК, хорошо известной специалисту в данной области (например, Alberts et al., Molecular biology of the Cell, 4th ed. Garland Science, p. 518-519). Однако полипептиды и слитые белки по изобретению можно получать любым из множества общепринятых и хорошо известных способов, таких как общепринятые стратегии органического синтеза, способы твердофазного синтеза, или с помощью коммерчески доступных автоматизированных синтезаторов. Слитые белки можно использовать в биологических исследованиях или терапии. Примерами небелковых соединений в качестве дополнительного соединения являются, например, низкомолекулярные органические соединения, такие как полиэтиленгликоль (PEG), или Alexa Fluor, или радионуклиды. Дополнительные конкретные примеры небелковых дополнительных соединений представлены в настоящем описании ниже.
По предпочтительному варианту осуществления дополнительное соединение является фармацевтически активным соединением, пролекарством, фармацевтически приемлемым носителем, диагностически активным соединением, усилителем проницаемости клетки и/или соединением, модулирующим время полужизни в сыворотке.
Фармацевтически активное соединение является соединением, имеющим биологическую активность после введения индивидууму, приводящую к положительному воздействию на индивидуума. Пролекарство является соединением, вводимым индивидууму в неактивной (или менее чем полностью активной) форме, затем преобразуемой в фармацевтически активное или фармацевтически полностью активное соединение с помощью метаболических процессов в организме индивидуума. Фармацевтически (полностью) активное соединение, предпочтительно, является соединением, подходящим для профилактического лечения любого из конкретных заболеваний, определенных в настоящем описании ниже.
Диагностически активное соединение является соединением, имеющим активность после введения индивидууму, позволяющим определять или идентифицировать возможное заболевание или нарушение. Примеры диагностически активных соединений включают детектируемые маркеры, такие как флуоресцентные красители, радионуклиды или контрастные средства для диагностической визуализации. Конкретные примеры флуоресцентных красителей, радионуклидов и контрастных средств для диагностиче
- 7 031683 ской визуализации представлены в настоящем описании ниже. Диагностически активное соединение, подвергнутое слиянию с полипептидом по изобретению, в частности, можно использовать для определения или идентификации любого из конкретных заболеваний, определенных в настоящем описании ниже, имеющих общим то, что их происхождение и/или симптомы связаны с IL-17A и/или Th-17. Аспекты такого заболевания можно определять или идентифицировать с помощью полипептида по изобретению, слитого с диагностически активным соединением по изобретению.
Усилитель проницаемости клетки является соединением, облегчающим доставку полипептида по изобретению в клетку (in vitro, ex vivo или in vivo).
Соединение, модулирующее время полужизни в сыворотке, является соединением, позволяющим увеличивать время полужизни полипептидов по изобретению in vivo, в частности в кровотоке. Компонентом, модулирующим время полужизни в сыворотке, предпочтительно, является полиэтиленгликоль (PEG).
Фармацевтически приемлемый носитель является соединением, улучшающим доставку и/или эффективность полипептида по изобретению после введения индивидууму. Подходящие фармацевтически приемлемые носители хорошо известны в данной области и включают, например, стабилизаторы, антиоксиданты, регуляторы pH и т. д.
В другом предпочтительном варианте осуществления дополнительное соединение по изобретению выбрано из группы, состоящей из (a) флуоресцентного красителя, (b) фотосенсибилизатора, (c) радионуклида, (d) контрастного средства для диагностической визуализации, (e) цитокина, (f) токсического соединения, (g) хемокина, (h) прокоагулянта, (i) фермента для активации пролекарства, (k) средства, связывающего альбумин, (l) альбумина, (m) средства, связывающего IgG, или (n) полиэтиленгликоля.
Флуоресцентный краситель, предпочтительно, является компонентом, выбранным из красителей Alexa Fluor или Cy.
Фотосенсибилизатор, предпочтительно, является фототоксическим красным флуоресцентным белком KillerRed или гематопорфирином.
Радионуклид, предпочтительно, выбран из группы гамма-излучающих изотопов, более предпочтительно 99mTc, 123I, 111In, и/или из группы излучателей позитронов, более предпочтительно 18F, 64Cu, 68Ga, 86Y, 124I, и/или из группы бета-излучающих изотопов, более предпочтительно 131I, 90Y, 177Lu, 67Cu, или из группы альфа-излучающих изотопов, предпочтительно 213Bi, 211At.
Как используется в настоящем описании, контрастное средство является веществом, используемым для усиления контраста структур или жидкостей в организме при диагностической визуализации. Общепринятые контрастные средства действуют на основе экранирования рентгеновского излучения и усиления сигнала магнитного резонанса.
Цитокин, предпочтительно, выбран из группы, состоящей из IL-2, IL-12, TNF-альфа, IFN альфа, IFN бета, IFN гамма, IL-10, IL-15, IL-24, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, LIF, CD80, B70, TNF-бета, LT-бета, CD40-лиганда, Fas-лиганда, TGF-бета, IL-1 альфа и IL-1 бета. Как известно в данной области, цитокины могут способствовать провоспалительному или противовоспалительному ответу иммунной системы. Таким образом, в зависимости от заболевания, подлежащего лечению, предпочтение можно отдавать конструкциям, слитым с дополнительным соединением, с провоспалительным или противовоспалительным цитокином. Например, для лечения воспалительных заболеваний, в основном, предпочтительными являются конструкции, слитые с дополнительным соединением, содержащие противовоспалительные цитокины, в то время как для лечения злокачественного новообразования, в основном, предпочтительными являются конструкции, слитые с дополнительным соединением, содержащие провоспалительные цитокины.
Токсическое соединение, предпочтительно, является низкомолекулярным органическим соединением или полипептидом, более предпочтительно, токсическим соединением, выбранным из группы, состоящей из калихеамицина, майтанзиноида, неокарциностатина, эсперамицина, динемицина, кедарцидина, мадуропептина, доксорубицина, даунорубицина, ауристатина, A-цепи рицина, модессина, укороченного экзотоксина A Pseudomonas, дифтерийного токсина и рекомбинантного гелонина.
Хемокин, предпочтительно, выбран из группы, состоящей из IL-8, GRO альфа, GRO бета, GRO гамма, ENA-78, LDGF-PBP, GCP-2, PF4, Mig, IP-10, SDF-1 альфа/бета, BUNZO/STRC33, I-TAC, BLC/BCA-1, MIP-1альфа, MIP-1бета, MDC, TECK, TARC, RANTES, HCC-1, HCC-4, DC-CK1, MIP-3 альфа, MIP-3 бета, MCP-1-5, эотаксина, эотаксина-2, I-309, MPIF-1, 6Ckine, CTACK, MEC, лимфотактина и фракталкина.
Прокоагулянт предпочтительно является тканевым фактором (TF) или раковым прокоагулянтом (CP).
Фермент для активации пролекарства предпочтительно является ферментом, выбранным из группы, состоящей из карбоксипептидаз, глюкуронидаз и глюкозидаз.
Примеры средства, связывающего альбумин, и средства, связывающего IgG, описаны в Gebauer and Skerra (2009), 13:245-255. Таким образом, предпочтительными примерами средств, связывающих альбумин, и средств, связывающих IgG, являются отдельные Ig-домены человека (удвоенные Dab против альбумина), нанотела, природный альбумин-связывающий домен (ABD), полученный из стрептококкового
- 8 031683 белка G, и домен, связывающийся с IgG. Такие конструкции, слитые с дополнительным соединением, например, повышают время полужизни полипептида по изобретению после введения пациенту, в частности в кровотоке.
По другому предпочтительному варианту осуществления дополнительное соединение по изобретению состоит из или содержит легкую цепь антитела, тяжелую цепь антитела, Fc-домен антитела, антитело или их комбинацию.
Термин антитело включает моноклональные антитела, поликлональные антитела, одноцепочечные антитела или их фрагменты, специфически связывающие указанный пептид или полипептид, кроме того, включая биспецифические антитела, синтетические антитела, фрагменты антител, иные, чем тяжелые и легкие цепи, такие как Fab-, F(ab2)'-, Fv- или scFv-фрагменты и т.д., или химически модифицированное производное любого из них. Моноклональные антитела можно получать, например, способами, исходно описанными в статье Kohler and Milstein, Nature 256 (1975), 495, и Galfre, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3, включающими слияние миеломных клеток мыши с клетками селезенки, полученными из иммунизированных млекопитающих, с модификациями, разработанными в данной области. Кроме того, антитела или их фрагменты против указанных выше пептидов можно получать, используя способы, описанные, например, в Harlow and Lane Antibodies, A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor,
1988. При получении производных указанных антител с помощью технологии фагового дисплея можно использовать поверхностный плазмонный резонанс, используемый в системе BIAcore, для повышения эффективности фаговых антител, связывающихся с эпитопом пептида или полипептида по изобретению (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Получение химерных антител описано, например, в WO 89/09622. Дополнительным источником антител для применения по настоящему изобретению являются так называемые ксеногенные антитела. Общий принцип получения ксеногенных антител, таких как антитела человека, полученные на мышах, описан, например, в WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 и WO 96/33735. Антитела для применения по настоящему изобретению или их соответствующие иммуноглобулиновые цепи можно дополнительно модифицировать с использованием общепринятых способов, известных в данной области, например, с использованием делеций, инсерций, замен, вставок аминокислот и/или рекомбинаций аминокислот и/или любых других модификаций, известных в данной области в отдельности или в комбинации. Способы для включения таких модификаций в последовательность ДНК, лежащей в основе аминокислотной последовательности цепи иммуноглобулина, хорошо известны специалистам в данной области; см., например, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,
1989.
Термины моноклональное или поликлональное антитело (см. Harlow и Lane, (1988), loc. cit.) также относятся к производным указанных антител, сохраняющим или, по существу, сохраняющим их специфичность связывания. Хотя особенно предпочтительные варианты осуществления указанных производных приведены в настоящем описании ниже, другими предпочтительными производными таких антител являются химерные антитела, содержащие, например, вариабельную область мыши или крысы и константную область человека.
Термин scFv-фрагмент (одноцепочечный Fv-фрагмент) хорошо известен в данной области, и он является предпочтительным по причине небольшого размера и возможности рекомбинантного получения таких фрагментов.
Антитело может быть гуманизированным антителом. Термин гуманизированное антитело обозначает в соответствии с настоящим изобретением антитело нечеловеческого происхождения, белковые последовательности которого модифицируют для повышения схожести с вариантами антител, продуцируемых у людей в природе. Получение гуманизированного антитела можно осуществлять, например, встраивая соответствующие сегменты, кодирующие CDR (отвечающие за желаемые свойства связывания), такие как CDR3 и, предпочтительно, все 6 CDR, в каркас антитела человека. Способы получения гуманизированных антител описаны, например, в EP-A1 0239400 и WO 90/07861.
Термин легкая цепь антитела обозначает малую полипептидную субъединицу антитела, в то время как термин тяжелая цепь антитела обозначает большую полипептидную цепь антитела. Типичное антитело состоит из двух тяжелых цепей иммуноглобулинов (Ig) и двух легких цепей Ig. Каждая легкая цепь состоит из двух тандемных иммуноглобулиновых доменов; одного константного домена (CL) и одного вариабельного домена (VL), важного для связывания антигена. Тяжелая цепь определяет класс или изотип антитела. Каждая тяжелая цепь содержит две области, а именно константную область (одинаковую для всех иммуноглобулинов одного класса, но отличающуюся между классами) и вариабельную область, отличающуюся между разными B-клетками, но одинаковую для всех иммуноглобулинов, продуцируемых одной B-клеткой или клоном B-клетки. Вариабельный домен любой тяжелой цепи состоит из одного иммуноглобулинового домена.
Термин функциональный Fc-домен антитела хорошо известен специалистам в данной области, и его определяют с учетом расщепления антител папаином. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей, иммуноглобулины разделяют на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно дополнительно разделять на подклассы (изотипы), например
- 9 031683
IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, IgA1 и IgA2. В соответствии с константными областями тяжелой цепи различные классы иммуноглобулинов называют [альфа], [дельта], [эпсилон], [гамма] и [мю] соответственно. Функциональный Fc-домен антитела напрямую участвует в ADCC (антителозависимой клеточной цитотоксичности) и CDC (комплементзависимой цитотоксичности) с учетом активации комплемента, связывания C1q и связывания Fc-рецептора. Четыре изотипа IgG человека связываются с различными рецепторами, такими как неонатальный Fc-рецептор, активирующие рецепторы Fc-гамма, FcyRI, FcyRIIa и FcyRIIIa, ингибиторный рецептор FcyRIIb и C1q, с различными аффинностями, что приводит к различным активностям. Известно, что аффинности к активирующим и ингибирующим рецепторам Fc-домена антитела человека можно смоделировать и модифицировать (см. Strohl W. (2009) Curr. Opin. Biotechnol., 20, p. 685-691).
Предпочтительно Fc-домен является одним или несколькими функциональными Fc-доменами человека, позволяющими увеличивать время полужизни полипептидов по изобретению in vivo, некоторые из которых направляют иммунный ответ млекопитающего в участок специфического связывания мишени полипептидным компонентом слитого белка по настоящему изобретению, например, при терапевтическом, профилактическом и/или диагностическом применении, как представлено в настоящем описании ниже. Более предпочтительно такой функциональный Fc-домен человека является Fc-доменом антитела IgG1. Полипептиды по изобретению можно подвергать слиянию с N- или C-концом одного или нескольких функциональных Fc-доменов или с N- и C-концом одного или нескольких Fc-доменов. Предпочтительно слитые белки по изобретению содержат мультимеры, предпочтительно тетрамеры, тримеры, или наиболее предпочтительно димеры полипептидов по изобретению, подвергнутых слиянию по меньшей мере с одной стороной, предпочтительно, с N-концом одного или нескольких, предпочтительно, одного Fc-домена.
В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения Fc-домен является одним или несколькими сконструированными функциональными Fc-доменами IgG1 человека с активирующими или молчащими эффекторными функциями, предпочтительно одним или несколькими сконструированными функциональными Fc-доменами IgG1 человека с молчащими эффекторными функциями и даже более предпочтительно одним или несколькими сконструированными функциональными Fcдоменами IgG1 человека с молчащими эффекторными функциями с мутацией в L234 и L235, нумерация согласно EU-индексу по Kabat (см. Johnson G. and Wu Т.Т. (2000) Nucleic. Acids. Res. 28, p. 214-218), и наиболее предпочтительно, с мутацией L234A и L235A.
Антитело в конструкции, слитой с дополнительным соединением, по настоящему изобретению предпочтительно специфически связывается с TNFa. Термин специфически связывается с относится к тем случаям, когда TNFa связывается с равновесной константой связывания KD, в 2 раза меньшей, предпочтительно в 5 или 10 раз меньшей по сравнению с равновесной константой связывания, наблюдаемой для связывания конструкции, слитой с дополнительным соединением, по изобретению с неродственным белком, не являющимся членом семейства TNF или являющимся другим членом семейства TNF, таким как TNF[’>.
По другому предпочтительному варианту осуществления конструкции, слитой с дополнительным соединением, по настоящему изобретению полипептид по изобретению локализуется ниже C-конца указанного дополнительного соединения, состоящего из или содержащего легкую цепь антитела, тяжелую цепь антитела, Fc-домен антитела, антитело или их комбинацию.
Такое дополнительное соединение можно подвергать слиянию с полипептидом напрямую или через линкер. Таким образом, конструкцию, слитую с дополнительным соединением, можно (напрямую) подвергать слиянию с C-концом дополнительного соединения, более конкретно, посредством образования пептидной связи между карбоксигруппой C-концевой аминокислоты и аминогруппой N-концевой аминокислоты, или можно соединять с C-концом цепи дополнительного соединения через линкер.
Специалисту в данной области известны подходящие линкеры. Линкер по изобретению предпочтительно выбран из группы, состоящей из алкила с 1-30 атомами углерода, полиэтиленгликоля с 1-20 остатками этилена, полиаланина с 1-20 остатками, капроновой кислоты, замещенного или незамещенного поли-п-фенилена и триазола. Предпочтение отдают пептидным линкерам, более конкретно олигопептидам, имеющим длину от 2 до 30 аминокислот. Также предусмотрено использование одной аминокислоты. Предпочтительные диапазоны длины составляют от 5 до 15 аминокислот. Другая предпочтительная длина составляет 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот.
Особенно предпочтительными являются линкеры, являющиеся пептидами, состоящими по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или 100% из небольших аминокислот, таких как глицин, серин и аланин. Особенно предпочтительными являются линкеры, состоящие только из глицина и серина. Наиболее предпочтительными являются линкеры с последовательностями SEQ ID NO: 13-15, при этом особое предпочтение отдают линкеру, являющемуся пептидом, состоящим из последовательности SEQ ID NO: 15.
По другому предпочтительному варианту осуществления конструкции, слитой с дополнительным соединением, по настоящему изобретению дополнительное соединение содержит или состоит из легкой
- 10 031683 цепи антитела, содержащей или состоящей из последовательности SEQ ID NO: 11.
Последовательность SEQ ID NO: 11 представляет собой легкую цепь антитела против TNFa. Также следует понимать, что последовательность SEQ ID NO: 11 можно подвергать слиянию с полипептидом или изобретением напрямую или через линкер. Таким образом, конструкцию, слитую с дополнительным соединением, можно (напрямую) подвергать слиянию с С-концом дополнительного соединения, более конкретно посредством образования пептидной связи между карбоксигруппой С-концевой аминокислоты и аминогруппы N-концевой аминокислоты, или можно соединять с С-концом цепи дополнительного соединения через линкер. Предпочтительные линкеры содержат или состоят из последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 13-15, где последовательность SEQ ID NO: 15 является наиболее предпочтительной. Особенно предпочтительные примеры конструкции, слитой с дополнительным соединением, по этому варианту осуществления содержат или состоят из последовательности SEQ ID NO: 16 или 17, где SEQ ID NO: 16 является наиболее предпочтительной.
В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конструкции, содержащей или состоящей по меньшей мере из одной копии, предпочтительно двух копий конструкции, слитой с дополнительным соединением, содержащей или состоящей из легкой цепи антитела, содержащей или состоящей из последовательности SEQ ID NO: 11, и по меньшей мере из одной копии, предпочтительно двух копий тяжелой цепи антитела последовательности SEQ ID NO: 12.
Последовательность SEQ ID NO: 12 представляет собой тяжелую цепь антитела против TNFa. Таким образом, конструкция по этому варианту осуществления по меньшей мере содержит полипептид по изобретению, связывающийся с гликозилированным IL-17A, легкую цепь антитела против TNFa (SEQ ID NO: 11) и тяжелую цепь антитела против TNFa (SEQ ID NO: 12), где полипептид по изобретению, связывающийся с гликозилированным IL-17A, и легкая цепь антитела против TNFa образуют продукт слияния. Предпочтительно количество копий легкой и тяжелой цепи в конструкции по изобретению является одинаковым. Компонент легкой цепи антитела при соединении с компонентом тяжелой цепи антитела обеспечивает образование антигенсвязывающего участка, распознающего TNFa. В случае, когда конструкция содержит по две копии легкой цепи антитела против TNFa (SEQ ID NO: 11) и тяжелой цепи антитела против TNFa (SEQ ID NO: 12), конструкция, предпочтительно, содержит полное антитело против TNFa, где каждую легкую цепь указанного антитела подвергают слиянию с полипептидом по изобретению напрямую или через линкер. Предпочтительные примеры таких конструкций описаны в примере 4 и приведены в табл. 4 в настоящем описании ниже.
По предпочтительному варианту осуществления настоящее изобретение относится к конструкции, содержащей или состоящей по меньшей мере из одной копии, предпочтительно двух копий конструкций, слитых с дополнительным соединением, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 16 или 17 (где SEQ ID NO: 16 является предпочтительной), и по меньшей мере одной копии, предпочтительно двух копий тяжелой цепи антитела с последовательностью SEQ ID NO: 12.
Предпочтительно эта конструкция содержит или состоит из двух копий конструкций, слитой с дополнительным соединением, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 16 или 17 (где SEQ ID NO: 16 является предпочтительной), и двух копий тяжелой цепи антитела с последовательностью SEQ ID NO: 12. Таким образом, такая конструкция может содержать полное антитело против TNFa.
В конструкции по изобретению предпочтительно, чтобы полипептид по изобретению локализовался ниже C-конца легкой цепи, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 11.
Конструкция по изобретению способна одновременно связываться с двумя молекулами-мишенями, а именно гликозилированным интерлейкином-17A с одной стороны и TNFa с другой стороны. Конструкция содержит функциональный участок связывания гликозилированного IL-17A благодаря наличию полипептида по изобретению.
Конструкцию по настоящему изобретению можно получать посредством объединения указанного слитого белка и указанной тяжелой цепи антитела в подходящих условиях. Подходящие условия известны специалисту в данной области. Такое объединение в подходящих условиях обеспечивает нековалентную сборку, запускаемую взаимодействиями между легкой цепью антитела, содержащейся в указанном слитом белке, и указанной тяжелой цепью антитела. Предпочтительно в конструкции по изобретению присутствуют дисульфидные связи в таком виде, как их, как правило, обнаруживают в антителах. Дисульфидные связи, как правило, находятся вблизи шарнирной области и соединяют две тяжелые цепи и/или легкую цепь и тяжелую цепь.
Кроме того, настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по изобретению, или конструкцию, слитую с дополнительным соединением, по изобретению, или одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих конструкцию по изобретению.
Одна или несколько молекул нуклеиновой кислоты, кодирующие конструкцию по изобретению, могут быть, например, двумя молекулами нуклеиновой кислоты, где одна молекула нуклеиновой кислоты кодирует конструкцию, слитую с дополнительным соединением, по изобретению, а другая молекула нуклеиновой кислоты - тяжелую цепь антитела.
Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включают ДНК, такую как кДНК, и
- 11 031683 мРНК. Кроме того, они включают молекулы, имитирующие нуклеиновую кислоту, известные в данной области, такие как синтетические или полусинтетические производные ДНК или РНК и смешанные полимеры, и смысловые, и антисмысловые цепи. Они могут содержать дополнительные неприродные или дериватизированные основания нуклеотидов, известные специалистам в данной области. В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотиды или молекулы нуклеиновой кислоты являются ДНК. Такие молекулы, имитирующие нуклеиновую кислоту, или производные нуклеиновой кислоты по изобретению включают фосфотиоатную нуклеиновую кислоту, фосфорамидатную нуклеиновую кислоту, 2'O-метоксиэтиловую рибонуклеиновую кислоту, морфолино-нуклеиновую кислоту, гекситоловую нуклеиновую кислоту (HNA) и замкнутую нуклеиновую кислоту (LNA) (см., например, Braasch and Corey, Chemistry & Biology 8, 1-7 (2001)). LNA является производным РНК, в котором кольцо рибозы соединено метиленовой связью между 2'-кислородом и 4'-углеродом.
В целях настоящего изобретения пептид-нуклеиновая кислота (ПНК) является полиамидным типом аналога ДНК. Мономерные единицы соответствующих производных аденина, гуанина, тимина и цитозина являются коммерчески доступными (например, в Perceptive Biosystems). ПНК является синтетической имитацией ДНК с амидным остовом вместо сахаро-фосфатного остова ДНК или РНК. Как следствие, конкретные компоненты ДНК, такие как фосфор, оксиды фосфора или производные дезоксирибозы, не присутствуют в ПНК.
ПНК-химерами по настоящему изобретению являются молекулы, содержащие одну или несколько частей ПНК. Остальная часть химерной молекулы может содержать одну или несколько частей ДНК (ПНК-ДНК-химера) или одну или несколько (поли)пептидных частей (пептид-ПНК-химера). ПептидДНК-химерами по изобретению являются молекулы, содержащие одну или несколько (поли)пептидных частей и одну или несколько частей ДНК. Также предусмотрены молекулы, содержащие части ПНК, пептида и ДНК. Длина части химерной молекулы может находиться в диапазоне от 1 до n-1 оснований, их эквивалентов или аминокислот, где n представляет собой общее количество оснований, их эквивалентов и аминокислот во всей молекуле.
Термин производные в комбинации с описанными выше ПНК, (поли)пептидами, ПНК-химерами и пептид-ДНК-химерами относится к молекулами, где эти молекулы содержат одну или несколько дополнительных групп или заместителей, отличающихся от ПНК, (поли)пептидов и ДНК. Предусмотрены все группы или заместители, известные в данной области и используемые для синтеза этих молекул, такие как защитные группы, и/или для применения, включающего эти молекулы, такого как метки и (расщепляемые) линкеры.
В вариантах осуществления, где молекула нуклеиновой кислоты содержит (а не имеет) указанную последовательность, дополнительные нуклеотиды распределяют по конкретной последовательности с 5'конца или 3'-конца, или обоих концов. Эта дополнительная последовательность может иметь гетерологичную или гомологичную природу и может содержать фрагменты приблизительно от 50 до 500 нуклеотидов, хотя не исключают большие или меньшие значения. В случае гомологичных последовательностей эти варианты осуществления не включают полные геномы и, как правило, ограничены до приблизительно 1500 дополнительных нуклеотидов на 5'- и/или 3'-конце.
Дополнительные гетерологичные последовательности могут включать гетерологичные промоторы, функционально связанные с кодирующими последовательностями указанных молекул. Таким образом, предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с промотором, и более предпочтительно связана с промотором, выбранным из группы прокариотических промоторов, состоящей из элемента промотора T5/lac-оператора, промотора T7/lac-оператора, или из группы эукариотических промоторов, состоящей из hEF1-HTLV, энхансера CMV/промотора hFerL.
Одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению также можно встраивать в один или несколько векторов таким образом, что получают трансляционный продукт слияния с другой молекулой нуклеиновой кислоты. Другая молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно кодирует легкую и/или тяжелую цепь антитела против TNFa и/или линкер, предпочтительные примеры которых представлены в настоящем описании выше.
Одну или несколько клеток-хозяев можно получать встраиванием одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты или одного или нескольких векторов по изобретению в одну или несколько клеток-хозяев, которые, благодаря своему присутствию, опосредуют экспрессию полипептидов, кодируемых указанными молекулами нуклеиновой кислоты или векторами. Клетками-хозяевами предпочтительно являются выделенные клетки-хозяева, что означает, что клетки не находятся в контексте живого организма. Хозяин может быть любой прокариотической или эукариотической клеткой. Подходящим эукариотическим хозяином может быть клетка млекопитающего, клетка амфибии, клетка рыбы, клетка насекомого, клетка гриба или растительная клетка. Эукариотическая клетка может быть клеткой насекомого, такой как клетка Spodoptera frugiperda, дрожжевой клеткой, такой как клетка Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris, клеткой гриба, такой как клетка Aspergillus, или клеткой позвоночного. В отношении последнего предпочтительно, чтобы клетка представляла собой клетку млекопитающего, такую как клетка человека. Клетка может быть частью клеточной линии.
Подходящими прокариотами/бактериями являются те, которых, как правило, используют для кло
- 12 031683 нирования, такие как E.coli (например, штаммы E.coli HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 и JM101), Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Burkholderia glumae, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas stutzeri, Streptomyces lividans, Lactococcus lactis, Mycobacterium smegmatis или Bacillus subtilis. Предпочтительным примером клетки-хозяина, подлежащей генетическому конструированию с использованием молекулы нуклеиновой кислоты или вектора по изобретению, является E.coli.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической или диагностической композиции, содержащей полипептид по изобретению, конструкцию, слитую с дополнительным соединением, по изобретению, конструкцию по изобретению, одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты по изобретению, один или несколько векторов по изобретению, одну или несколько клеток-хозяев по изобретению, или любую их комбинацию.
Как более подробно представлено в настоящем описании выше, IL-17A участвует во многих заболеваниях. Таким образом, полипептид, конструкция, слитая с дополнительным соединением, конструкция, молекулы нуклеиновой кислоты, векторы, клетки-хозяева по изобретению или любая их комбинация применимы в качестве лекарственного средства. Предпочтительно, чтобы в указанной фармацевтической композиции полипептид, конструкция, слитая с дополнительным соединением, конструкция, молекулы нуклеиновой кислоты, векторы, клетки-хозяева по изобретению или любая их комбинация являлись единственным активным средством. Предпочтительно, фармацевтическую композицию вводят млекопитающим, таким как домашние животные. Наиболее предпочтительно, их вводят людям. Фармацевтические композиции, представленные в настоящем описании, будут вводить индивидууму в подходящей дозе.
Фармацевтическую композицию для применения по настоящему изобретению можно составлять общепринятыми способами, известными в данной области, с использованием одного или нескольких физиологических носителей или эксципиентов, см., например, Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 1999. Таким образом, фармацевтическую композицию можно вводить перорально, парентерально, например подкожно, внутривенно, внутримышечно, интраперитонеально, интратекально, трансдермально, чресслизисто, субдурально или местно с помощью ионтофореза, сублингвально, с помощью спрея для ингаляции, аэрозоля или ректально и т. п. в стандартных лекарственных формах, необязательно, содержащих общепринятые фармацевтически приемлемые эксципиенты. Диагностические композиции по изобретению также можно получать любым общепринятым способом.
Фармацевтическую композицию по изобретению можно вводить в качестве единственного активного ингредиента или в комбинации, например, с адъювантом, или в комбинации с другими лекарственными средствами, например иммуносупрессорными или иммуномодулирующими средствами или другими противовоспалительными средствами, например для лечения или профилактики указанных выше заболеваний. Например, полипептиды, конструкции, слитые с дополнительным соединением, и конструкции по изобретению можно использовать в комбинации с иммуносупрессорными моноклональными антителами, например, моноклональными антителами с аффинностью к лейкоцитарным рецепторам, например, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40, CD45, CD58, CD80, CD86 или их лигандам; другими иммуномодулирующими соединениями, например рекомбинантной связывающей молекулой, содержащей по меньшей мере часть внеклеточного домена CTLA4 или его мутантную форму, например, по меньшей мере, внеклеточную часть CTLA4 или ее мутантную форму, соединенную с белковой последовательностью не CTLA4, например CTLA4Ig (например, обозначенный как ATCC 68629) или его мутантную форму, например LEA29Y; ингибиторами молекул адгезии, например антагонистами LFA-I, антагонистами ICAM-1 или -3, антагонистами VCAM-4 или антагонистами VLA-4. Кроме того, полипептиды, конструкции, слитые с дополнительным соединением, и конструкции по изобретению можно использовать в комбинации с DMARD (базовыми противоревматическими лекарственными препаратами, модифицирующими течение болезни), солями золота, сульфасалазином, противомалярийными средствами, метотрексатом, D-пеницилламином, азатиоприном, микофеноловой кислотой, циклоспорином A, такролимусом, сиролимусом, миноциклином, лефлуномидом, глюкокортикоидами; ингибитором кальциневрина, например, циклоспорином A или FK 506; модулятором рециркуляции лимфоцитов, например, аналогами FTY720 и FTY720; ингибитором mTOR, например рапамицином, 40-O-(2гидроксиэтил)рапамицином, CCI779, ABT578, AP23573 или TAFA-93; аскомицином, имеющим иммуносупрессорные свойства, например ABT-281, ASM981 и т.д.; кортикостероидами; циклофосфамидом; азатиоприном; метотрексатом, лефлуномидом, мизорибином; микофеноловой кислотой; мофетилом микофенолата; 15-дезоксиспергуалином или его иммуносупрессорным гомологом, аналогом или производным; или химиотерапевтическим средством, например, паклитакселом, гемцитабином, цисплатином, доксорубицином или 5-фторурацилом; (другими) средствами против TNFa, например моноклональными антителами против TNFa (предпочтительно, содержащими SEQ ID NO: 11 и/или 12), например инфликсимабом, адалимумабом, CDP870 или конструкциями рецепторов к TNF-RI или TNF-RII, например этанерцептом, PEG-TNF-RI; блокаторами провоспалительных цитокинов, блокаторами IL-1, например анакинрой или ловушкой для IL-1, AAL160, ACZ 885, блокаторами IL-6; ингибиторами или активаторами
- 13 031683 протеаз, например металлопротеаз, антителами против IL-15, антителами против IL-6, антителами против IL-23, антителами против IL-22, антителами против IL-21, антителами против IL-12, антителами против IFN гамма, антителами против IFN альфа, антителами против CD20, антителами против IL-17, антителами против IgGE, НПВС, такими как аспирин, или противоинфекционным средством. Другие подходящие лекарственные средства могут включать ингибитор АПФ, ингибитор ренина, ингибитор ADH, ингибитор альдостерона и блокатор рецептора ангиотензина. Разумеется, этот список средств для совместного введения не является ограничивающим или полным.
В основных терминах фармацевтическую композицию по изобретению используют в лечении или профилактике IL-17A-опосредованного заболевания.
Фармацевтические композиции по изобретению, предпочтительно, содержат фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. Термин фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент обозначает нетоксический твердый, полутвердый или жидкий наполнитель, дилюент, инкапсулирующий материал или вспомогательное средство любого типа. Примеры фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов описаны, например, в Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 1999.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, описанном выше, полипептид по изобретению соединяют с флуоресцентным красителем, фотосенсибилизатором, радионуклидом или контрастным средством для диагностической визуализации. Такие конструкции, слитый с дополнительным соединением, являются особенно подходящими для диагностического применения, например, для идентификации участков нежелательных физиологических уровней гликозилированного IL-17A в организме индивидуума. В основных терминах диагностический агент в композицию по изобретению используют в диагностике IL-17A-опосредованного заболевания.
Дозировка диагностических и фармацевтических композиций по изобретению, разумеется, будет варьироваться в зависимости от конкретного полипептида, конструкции, слитой с дополнительным соединением, конструкции, одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты, одного или нескольких векторов, одной или нескольких клеток-хозяев по изобретению, или любой их комбинации, отдельной группы пациентов или пациента, необязательного наличия других диагностически или медицински активных соединений и природы и тяжести заболевания, подлежащего диагностике или лечению. Однако в настоящее время предпочтительно использовать диагностическую или фармацевтическую композицию в дозировках приблизительно от 0,01 мг до приблизительно 20 мг на килограмм массы тела, предпочтительно, приблизительно от 0,1 мг до приблизительно 5 мг на килограмм массы тела. Диагностические или фармацевтические композиции можно вводить несколько раз, например, для мониторинга течения заболевания в случае диагностической композиции или для продления лечения в случае фармацевтической композиции. Предпочтительно, частота введения диагностической или фармацевтической композиции находится в диапазоне от ежедневного введения до приблизительно одного раза каждые 3 месяца, предпочтительно, приблизительно от одного раза каждые 2 недели до приблизительно одного раза каждые 10 недель, более предпочтительно, один раз каждые 4-8 недель. Предпочтительный режим дозирования включает введение диагностических или фармацевтических композиций по изобретению от одного раза в месяц до одного раза каждые 2-3 месяца или менее часто.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная фармацевтическая композиция предназначена для использования в способе лечения воспалительного, аутоиммунного и/или заболевания, связанного с потерей костной массы.
В более предпочтительном варианте осуществления изобретения заболевание выбрано из группы, состоящей из артрита, предпочтительно ревматоидного артрита, хронического прогрессирующего артрита, реактивного артрита, псориатического артрита, энтеропатического артрита и деформирующего артрита, ревматических заболеваний, спондилоартропатий, анкилозирующего спондилита, синдрома Рейтера, гиперчувствительности (включая гиперчувствительности дыхательных путей и кожной гиперчувствительности), аллергии, системной красной волчанки, воспалительных мышечных нарушений, полихондрита, склеродомы, гранулематоза Вегенера, дерматомиозита, синдрома Стивенса-Джонсона, хронического активного гепатита, миастении Gravis, псориаза, идиопатической целиакии, аутоиммунного воспалительного заболевания кишечника, язвенного колита, болезни Крона, синдрома раздраженного кишечника, эндокринной офтальмопатии, болезни Грейвса, саркоидоза, рассеянного склероза, первичного биллиарного цирроза, юношеского диабета (сахарного диабета типа I), аутоиммунных гематологических нарушений, гемолитической анемии, апластической анемии, врожденной апластической анемии, идиопатической тромбоцитопении, увеита (переднего и заднего), сухого кератоконъюнктивита, весеннего кератоконъюнктивита, интерстициального фиброза легких, гломерулонефрита (с нефротическим синдромом и без него), идиопатического нефротического синдрома или болезни минимальных изменений, опухолей, воспалительного заболевания кожи, воспаления роговицы, миозита, потеря костной ткани вокруг имплантатов, нарушений обмена веществ, атеросклероза, диабета и дислипидемии, потеря костной массы, остеоартрита, остеопороза, болезни пародонта, обструктивных или воспалительных заболеваний дыхательных путей, астмы, бронхита, пневмокониоза, эмфиземы легких, острых и сверхострых воспалительных реакций, острых инфекций, септического шока, эндотоксического шока, респираторного дистресс
- 14 031683 синдрома взрослых, менингита, пневмонии, тяжелых ожогов, кахексии, инсульта, герпетического стромального кератита и заболевание сухого глаза.
Все из указанных выше заболеваний имеют общим то, что их происхождение и/или симптомы связаны с IL-17A и/или Th-17-.
На фигурах показано на фиг. 1 показаны эксклюзионные хроматограммы (SEC) Ш-17А-связывающих полипептидов по изобретению: (A) 1L3-B09 (SEQ ID NO: 3), (B) 11L0-C6 (SEQ ID NO: 4), (C) 11L5-B06 (SEQ ID NO:5), (D) 11L6-F03 (SEQ ID NO: 6), (E) 11L9-C09 (SEQ ID NO: 7), (F) 11L10-A05 (SEQ ID NO: 8), (G) 11L11A09 (SEQ ID NO: 9);
на фиг. 2 изображены результаты дозозависимого ингибирования гликозилированного и негликозилированного IL-17A in vitro полипептидами по изобретению, полученными из SH3 Fyn. (A) 1L3-B09 (SEQ ID NO: 3), (B) 11L0-C6 (SEQ ID NO: 4), (C) 11L5-B06 (SEQ ID NO: 5), (D) 11L6-F03 (SEQ ID NO: 6), (E) 11L9-C09 (SEQ ID NO: 7), (F) 11L10-A05 (SEQ ID NO: 8);
на фиг. 3 - результаты дозозависимого ингибирования гликозилированного и негликозилированного IL-17A in vitro связывающими средствами, полученными из SH3 Fyn, описаны в WO 2011/023685: (A) IL17-связывающее средство, полученное из SH3 Fyn, 2C1 (SEQ ID NO: 107, описанная в WO 2011/023685).
(B) IL-17-связывающее средство, полученное из SH3 Fyn, A1_2 (A1) (SEQ ID NO: 53, описанная в WO 2011/023685). (C) IL-17-связывающее средство, полученное из SH3 Fyn, B1_2 (B1) (SEQ ID NO: 39, описанная в WO 2011/023685);
на фиг. 4 показаны эксклюзионные хроматограммы (SEC) биспецифических IL-17A/TNFaсвязывающих полипептидов по изобретению: (A) LC11L5-B06 (биспецифическая конструкция (по изобретению) с тяжелой цепью и легкой цепью, состоящими из последовательностей SEQ ID NO: 12 и 16, соответственно), и (B) LC11L9-C09 (биспецифическая конструкция (по изобретению) с тяжелой цепью и легкой цепью, состоящими из последовательностей SEQ ID NO: 12 и 17 соответственно);
на фиг. 5 - одновременное ингибирование IL-17A и TNFa биспецифическими слитыми белками против IL-17A/TNFa. Уровни Gro-альфа в супернатантах при ELISA представлены после стимуляции клеток HT-29 с использованием 200 пМ TNFa и 400 пМ IL-17A. После добавления указанных концентраций LC11L5-B06 (продукт слияния SEQ ID NO: 12 (тяжелая цепь) и 16 (легкая цепь)) (фиг. 5.A) или LC11L9-C09 (продукт слияния SEQ ID NO: 12 (тяжелая цепь) и 17 (легкая цепь)) (фиг. 5.B), дозозависимое ингибирование IL-17A и TNFa можно наблюдать по снижению уровней Gro-альфа с повышением концентраций ингибиторов. В качестве контролей клетки обрабатывали отдельными цитокинами (IL-17A или TNFa) или только средой. Представлены средние значения для трех повторений, планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения (SD);
на фиг. 6 изображено ингибирование IL-17A и TNFa человека in vivo. (A) и (B): мышам внутривенно (i.v.) инъецировали LC11L5-B06 (обозначенный как LC-B06) (продукт слияния SEQ ID NO: 12 (тяжелая цепь) и 16 (легкая цепь)) с последующей инъекцией s.c. IL-17A (hIL-17A) человека (A) или TNFa человека (hTNFa) (B). Через два часа после введения указанного цитокина из мышей получали образцы крови и определяли уровни КС с помощью ELISA. Также представлены мыши, которым делали внутривенную инъекцию антитела против TNFa (фиг. 6.B) (aTNFamAb) или PBS. В качестве контроля представлены исходные уровни КС (у мышей, которым вводили только PBS (i.v.) без стимуляции цитокинами). (C) и (D): LC11L9-C09 (обозначенный как LC-C09) (продукт слияния SEQ ID NO: 12 (тяжелая цепь) и 17 (легкая цепь)) внутривенно (i.v.) инъецировали мышам с последующей инъекцией s.c. IL-17A (C) или TNFa (D). Через два часа после введения указанного цитокина из мышей получали образцы крови и определяли уровни КС с помощью ELISA. Также представлены мыши, которым делали внутривенную инъекцию антитела против TNFa (фиг. 6.D) (aTNFamAb) или PBS. В качестве контроля представлены исходные уровни КС (у мышей, которым вводили только PBS (i.v.) без стимуляции цитокинами). Представлены средние уровни КС у 5 мышей на группу (±SEM);
на фиг. 7 представлены концентрации в сыворотке (A) LC11L5-B06 (продукт слияния SEQ ID NO: 12 (тяжелая цепь) и 16 (легкая цепь)) и (B) LC11L9-C09 (продукт слияния SEQ ID NO: 12 (тяжелая цепь) и 17 (легкая цепь)) в различные моменты времени после однократной инъекции i.v. мышам C57BL/6. Концентрацию в сыворотке определяли с помощью ELISA с использованием TNFa и IL-17A в качестве средств захвата (указаны в скобках). Последние моменты времени (24-168 часов) использовали для вычисления конечного времени полужизни. Средние концентрации в сыворотке у 5 мышей построены в виде графика относительно времени, планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения (SD);
на фиг. 8 - выравнивание последовательностей SEQ ID NO: 3-9 и 20. SEQ ID NO: 3-9 также соответствуют внутренним обозначениям в примерах заявки, как видно на фиг. 8;
на фиг. 9 - результаты дозозависимого ингибирования гликозилированного и негликозилированного IL-17A in vitro с помощью полипептида по изобретению, полученного из SH3 Fyn, 11L11-A09 (SEQ ID NO: 9);
на фиг. 10 - ингибирование IL-17A биспецифическими слитыми белками против IL-17A/TNFa
- 15 031683
LC11L5-B06 и LC11L9-C09. Уровни IL-6 при ELISA в супернатантах культур клеток представлены после стимуляции клеток NHDF IL-17A и IL-1 β (IL·-17A/IL-1 β). После добавления указанных концентраций LC11L5-B06 (продукт слияния SEQ ID NO: 12 (тяжелая цепь) и 16 (легкая цепь)) или LC11L9-C09 (продукт слияния SEQ ID NO: 12 (тяжелая цепь) и 17 (легкая цепь)) наблюдали дозозависимое ингибирование IL-17A-опосредованного высвобождения IL-6. В контрольных экспериментах клетки обрабатывали отдельными цитокинами (IL-17A или ΓΕ-1β) или только средой для культивирования клеток (среда). Представлены средние значения для трех повторений, планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения (SD);
на фиг. 11 - способы сэндвич-ELISA и прямого ELISA, (слева) сэндвич-ELISA осуществляли для определения интактных молекул LC11L5-B06 и LC11L9-C09. Биотинилированный TNF иммобилизировали в лунках покрытых нейтравидином 96-луночных планшетов для микротитрования. В лунки добавляли плазму, содержащую LC11L5-B06 или LC11L9-C09. Для определения использовали меченый дигоксигенином IL-17A, а затем конъюгат антитела против дигоксигенина и HRP для обработки субстрата и окрашивания, (справа) прямой ELISA осуществляли для определения специфического связывания TNF. Биотинилированный TNF иммобилизировали в лунках покрытых нейтравидином 96-луночных планшетов для микротитрования. В лунки добавляли плазму, содержащую LC11L5-B06 или LC11L9-C09. Связавшийся LC11L5-B06 или LC11L9-C09 определяли с использованием конъюгата антитела против IgG человека и HRP для обработки субстрата и окрашивания;
на фиг. 12 - концентрации (A) LC11L5-B06 (продукт слияния SEQ ID NO: 12 (тяжелая цепь) и 16 (легкая цепь)) и (B) LC11L9-C09 (продукт слияния SEQ ID NO: 12 (тяжелая цепь) и 17 (легкая цепь)) в плазме в различные моменты времени после однократной i.v. инъекции яванским макакам. Концентрацию в плазме определяли с помощью сэндвич-ELISA с использованием TNFa в качестве средства захвата и меченого дигоксигенином IL-17A, а затем конъюгата антитела против дигоксигенина и HRP для обработки субстрата и окрашивания. Средние концентрации в плазме для 3 яванских макак строили в виде графика относительно времени, планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения (SD);
на фиг. 13 - концентрации LC11L5-B06 (A) или LC11L9-C09 (B) в плазме яванских макак, определяемые с помощью сэндвич-ELISA и прямого ELISA. Концентрации в плазме являлись сравнимыми для обоих белков, что свидетельствует о том, что LC11L5-B06 и LC11L9-C09 стабильны у яванских макак в течение по меньшей мере 220 ч.
Изобретение иллюстрируют с помощью следующих примеров.
Пример 1. Полипептиды по изобретению, полученные с помощью SH3 Fyn, связываются с IL-17A, что определяют с помощью моноклонального ELISA лизата.
Способы.
Используя фаговые библиотеки Fуnомеров, описываемые в Schlatter et al. (Schlatter et al. (2012) imAbs, 4(4) p. 497-50), выделяли связывающие белки, полученные из SH3 Fyn, специфичные к IL-17A, с использованием рекомбинантного IL-17A (R&D Systems) в качестве антигена и стандартного фагового дисплея в качестве способа селекции (Grabulovski D. et al., (2007) J. Biol. Chem. 282, p. 3196-3204, Viti F. et al. (2000) Methods Enzymol. 326, 480-505). При селекции обогащали полипептид по изобретению, полученный из SH3 Fyn, 1L3-B09 (SEQ ID NO: 3), содержащий последовательность n-src-петли STHEYE (SEQ ID NO: 2). 1L3-B09 (SEQ ID NO: 3) связывался с IL-17A (см. пример 2), и неожиданно обнаруживали, что он ингибирует гликозилированный IL-17A так же, как и негликозилированный IL-17A (см. пример 3). Для получения IL-17A-связывающих средств, полученных из SH3 Fyn, с более высокими аффинностями в качестве матрицы для созревания аффинности использовали 1L3-B09 (SEQ ID NO: 3). Последовательность n-src-петли STHEYE (SEQ ID NO: 2) сохраняли постоянной и комбинировали с рандомизированным репертуаром RT-петли (6 аминокислотных остатков, обозначенных как (X1) (X2) (X3) (X4) (X5) (X6) в SEQ ID NO: 1). Способ получения библиотеки созревания аффинности являлся, по существу, тем же, что описан для клонирования наивной библиотеки с рандомизированной RT-петлей (библиотека 0 в Schlatter et al. (2012) mAbs, 4(4) p. 497-50).
После селекций наивных и аффинно зрелых клонов обогащенные полипептиды, полученные из SH3 Fyn, подвергали скринингу на связывание с IL-17A с помощью ELISA лизата. ДНК, кодирующую связывающие белки, полученные из SH3 Fyn, клонировали в бактериальный экспрессирующий вектор pQE12 (Qiagen) таким образом, что полученные конструкции несли C-концевую myc-гексагистидиновую метку, как описано в Grabulovski et al. (Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204). Полипептиды экспрессировали в цитозоле бактерий E.coli в 96-луночном формате и получали 200 мкл очищенного лизата на лунку, как описано в Bertschinger et al. (Bertschinger et al. (2007) Protein Eng. Des. Sel. 20(2): p. 57-68). В кратком изложении, колонии трансформированных бактерий собирали с чашки с агаром и выращивали в круглодонном 96-луночном планшете (Nunc., кат. № 163320) в 200 мкл среды 2xYT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 0,1% (мас./об.) глюкозы. Экспрессию белка индуцировали после выращивания в течение 3 ч при 37°C и 200 об/мин посредством добавления 1 мМ IPTG (Applichem, Germany). Белки экспрессировали в течение ночи в ротационном шейкере (200 об/мин, 30°C). Затем 96-луночный планшет
- 16 031683 центрифугировали при 1800 g в течение 10 мин и удаляли супернатант. Бактериальные осадки ресуспендировали в 200 мкл лизирующего буфера (50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, pH 8,0), содержащего 1 мг/мл лизоцима, и оставляли на 30 мин на льду. Затем бактериальные клетки лизировали с помощью обработки ультразвуком на водяной бане (шесть импульсов в течение 10 с), а затем центрифугировали при 1800 g в течение 10 мин. Для ELISA использовали моноклональные бактериальные лизаты: биотинилированный IL-17A (полученный в клетках HEK EBNA для внутреннего пользования, биотинилирование осуществляли с использованием NHS-PEO4-биотина (Pierce) по инструкциям производителя) иммобилизировали на покрытых стрептавидином лунках (StreptaWells, High Bind, Roche) и после блокирования с использованием PBS, 2% молока (Rapilait, Migros, Switzerland), наносили 50 мкл PBS, 4% молока, содержащего 6 мкг/мл антитела против myc 9E10 (конечная концентрация 3 мкг/мл) и 50 мкл бактериального лизата. После инкубации в течение 1 ч и промывания связавшиеся полипептиды, полученные из SH3 Fyn, определяли с помощью конъюгата антитела против мыши и HRP (Sigma). Определение активности пероксидазы осуществляли посредством добавления субстрата BM blue POD (Roche) и останавливали реакцию добавлением 1М H2SO4. Последовательность ДНК конкретных связывающих средств проверяли с помощью секвенирования ДНК.
Результаты.
Аминокислотные последовательности ELISA-позитивных полипептидов, полученных из SH3 Fyn, связывающихся с IL-17A, представлены в последовательностях SEQ ID NO: 3-9, как приведено в списке последовательностей.
Пример 2. Полипептиды по изобретению, полученные из SH3 Fyn, связываются с гликозилированным IL-17A человека с высокими аффинностями.
В этом примере представлены выходы экспрессии IL-17A-связывающих полипептидов, полученных из SH3 Fyn, и определение свойств этих полипептидов с помощью экспериментов по эксклюзионной хроматографии и поверхностному плазмонному резонансу.
Способы.
a) Выходы экспрессии IL-17A-связывающих полипептидов, полученных из SH3 Fyn.
IL-17A-связывающие полипептиды, полученные из SH3 Fyn, экспрессировали в цитозоле бактерий E.coli TG1, а также их очищали, как описано в Grabulovski et al. (Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204).
b) Эксклюзионная хроматография (SEC).
В случае родительского IL-17A-связывающего полипептида, полученного из SH3 Fyn, 1L3-B9 (SEQ ID NO: 3) эксклюзионную хроматографию (SEC) осуществляли с помощью системы AKTA FPLC с использованием колонки Superdex 75 Short Column (5/150) (GE Healthcare). SEC аффинно зрелых клонов 11L0-C06 (SEQ ID NO: 4), 11L5-B06 (SEQ ID NO: 5), 11L6-F03 (SEQ ID NO: 6), 11L9-C09 (SEQ ID NO: 7), 11L10-A05 (SEQ ID NO: 8) и 11L11-A09 (SEQ ID NO: 9) осуществляли с помощью устройства для ВЭЖХ Agilent Technologies 1200 Infinity Series с использованием колонки SEC-3 (Agilent).
c) Измерения аффинности.
Измерения аффинности осуществляли с использованием устройства BIAcore T200 (GE Healthcare). Для анализа взаимодействий между гликозилированным IL-17A (полученным для внутреннего пользования в клетках HEK EBNA) и мономерными IL-17A-связывающими полипептидами, полученными из SH3 Fyn, использовали чип серии S CM5 (GE Healthcare) с 2000 RU IL-17A, иммобилизированного с использованием набора присоединения по аминогруппе (GE Healthcare). Подвижным буфером являлся PBS, содержащий 0,05% Tween 20. Взаимодействия измеряли при скорости потока 30 мкл/мин и инъецировании различных концентраций IL-17A-связывающих полипептидов, полученных из SH3 Fyn. Все кинетические данные о взаимодействиях оценивали с использованием аналитического программного обеспечения BIAcore T200.
Результаты.
a) Выходы экспрессии.
Выходы экспрессии мономерных IL-17A-связывающих полипептидов по изобретению, полученных из SH3 Fyn, находились в диапазоне от 14 до 57 мг/л бактериальной культуры в неоптимизированных условиях во встряхиваемых колбах (табл. 1).
- 17 031683
Таблица 1. Выходы экспрессии IL-17A-связывающих полипептидов, полученных из SH3 Fyn, продуцируемых в бактериях E.coli TG1
FynoMep SEQ ID NO: Выход (мг/л)
1L3-B09 3 57
11L0-C06 4 43
11L5-B06 5 36
11L6-F03 6 14
11L9-C09 7 14
11L10-A05 8 32
11L11-A09 9 35
b) Эксклюзионная хроматография (SEC).
Профили эксклюзионной хроматографии (SEC) показали, что все конструкции элюировали, в основном, в виде отдельных, мономерных пиков (фиг. 1).
c) Измерения аффинности.
Свойства связывания анализировали с помощью анализа взаимодействий в реальном времени на чипе BIAcore, при котором выявляли следующие константы диссоциации (KD) для выбранных IL-17Aсвязывающих полипептидов:
Таблица 2. Кинетические константы связывания IL-17A-связывающих полипептидов, полученных из SH3 Fyn, с рекомбинантным гликозилированным IL-17A человека (полученным в клетках HEK EBNA)
FynoMep SEQ ID NO: KD (нМ)
1L3-B09 3 245
11L0-C06 4 7
11L5-B06 5 12
11L6-F03 6 11
11L9-C09 7 11
11L10-A05 8 7
11L11-A09 9 24
Пример 3. Полипептиды по изобретению, полученные из SH3 Fyn, ингибируют гликозилированный IL-17A.
Родительский клон 1L3-B09 и пять аффинно зрелых полипептидов по изобретению, полученных из SH3 Fyn, с наибольшей аффинностью к IL-17A (11L0-C06 (SEQ ID NO: 4), 11L5-B06 (SEQ ID NO: 5), 11L6-F03 (SEQ ID NO: 6), 11L9-C09 (SEQ ID NO: 7), 11L10-A05 (SEQ ID NO: 8)), тестировали на их способность ингибировать IL-17A: IL-17A и TNFcz индуцируют продукцию IL-6 в фибробластах дозозависимым образом. Ингибиторные активности указанных IL-17A-связывающих полипептидов, полученных из SH3 Fyn, тестировали с помощью стимуляции дермальных фибробластов человека рекомбинантным гликозилированным IL-17A (полученным для внутреннего пользования в клетках HEK EBNA) и рекомбинантным TNFa (Thermo Fisher Scientific) в отсутствие или присутствие различных концентраций IL17A-связывающих полипептидов по изобретению, полученных из SH3 Fyn. Супернатанты культур клеток собирали после 24 ч стимуляции и определяли концентрацию IL-6 в супернатанте с помощью ELISA. Результаты показали, что IL-17A-связывающие полипептиды способны специфически ингибировать гликозилированный IL-17A.
Способы.
Для удаления эндотоксина растворы белков фильтровали три раза с помощью мембраны Acrodisc Mustang E (VWR). После фильтрации уровни эндотоксина в растворах белков, содержащих ингибиторные IL-17A-связывающие полипептиды по изобретению, полученные из SH3 Fyn, составляли менее 0,1 ЭЕ/мл, как определяли с помощью теста лизата амебоцитов Limulus (LAL) (анализа PYROGENT Single test Gel Clot LAL Assay (Lonza)).
Распределяли по 100 мкл клеточной суспензии, содержащей приблизительно 3900 нормальных дермальных фибробластов человека (PromoCell, NHDF-c, C12300), на лунку (96-луночный планшет, TPP или Corning) и культивировали в течение 24 ч при 37°C (среда: среда для выращивания фибробластов C23010, PromoCell). Супернатант отсасывали и после смешивания различных концентраций IL-17Aсвязывающих полипептидов по изобретению, полученных из SH3 Fyn, со средой, содержащей IL-17A и TNFcz (конечные концентрации 1 нг/мл и 50 пг/мл соответственно), добавляли 100 мкл соответствующего раствора на лунку. В качестве контролей PBS смешивали со средой, содержащей IL-17A и TNFcz (положительный контроль = без ингибитора), и средой, содержащей только отдельные цитокины IL-17A
- 18 031683 или TNFa (последний из которых являлся лункой TNFa-контроля). В качестве отрицательного контроля PBS смешивали только со средой. Для сравнения также осуществляли анализ с использованием негликозилированного IL-17A (R&D Systems) в тех же условиях. Через 24 ч инкубации при 37°C осуществляли ELISA супернатанта для определения концентрации IL-6 с использованием набора для ELISA IL-6 по инструкциям производителя (IL-6 ELISA kit, R&D Systems). Строили графики процента ингибирования и вычисляли значения IC50 с использованием программного обеспечения Prism 5.
Процент ингибирования IL-17A определяли по следующей формуле:
Ингибирование (%)=100-((А450-650 нм (образец)-Ά450-650 нм (TNFa-контроль) )xlOO)/ (А450-650 нм (положительный контроль)А450-650 нм (TNFa-контроль))
Результаты.
Нормальные дермальные фибробласты человека инкубировали с IL-17A/TNFa и различными концентрациями указанных IL-17A-связывающих полипептидов по изобретению, полученных из SH3 Fyn. Наблюдали, что полипептиды по изобретению, полученные из SH3 Fyn, ингибировали гликозилированный IL-17A. Значения IC50 представлены в табл. 3. На фиг. 2 показаны кривые дозозависимого ингибирования указанными IL-17A-связывающими полипептидами по изобретению, полученными из SH3 Fyn, ингибирующими гликозилированный и негликозилированный IL-17A. Неожиданно обнаруживали, что IL-17A-связывающие полипептиды, полученные из SH3 Fyn, представленные в настоящем описании, способны полностью ингибировать гликозилированный IL-17A со схожими активностями по сравнению с негликозилированным IL-17A. Это является преимуществом по сравнению с IL-17A-связывающими полипептидами, полученными из SH3 Fyn, изобретенными ранее (WO 2011/023685). На фиг. 3 показаны три примера IL-17A-связывающих полипептидов, полученных из SH3 Fyn, описываемых в WO 2011/023685 (IL-17-связывающее средство, полученное из SH3 Fyn, 2C1 (SEQ ID NO: 107, описываемая в WO 2011/023685), IL-17-связывающее средство, полученное из SH3 Fyn, A1 2 (SEQ ID NO: 53, описываемая в WO 2011/023685), и IL-17-связывающее средство, полученное из SH3 Fyn, BQ 2 (B1) (SEQ ID NO: 39, описываемая в WO 2011/023685)), не ингибирующих гликозилированный IL-17A полностью даже в высоких концентрациях и/или демонстрирующих большие различия в активности ингибирования (значения IC50) между гликозилированным и негликозилированным IL-17A (см. фиг. 3).
Таблица 3. Значения IC50 для ингибирования гликозилированного IL-17A IL-17A-связывающими полипептидами, полученными из SH3 Fyn
FynoMep SEQ ID NO: Значение IC50 (нМ)
1L3-B09 (родительский клон) 3 300
11L0-C06 4 35
11L5-B06 5 43
11L6-F03 6 63
11L9-C09 7 32
11L10-A05 8 28
Пример 4. Выходы экспрессии и очистки биспецифических продуктов слияния антитела против IL17A/TNFa и IL-17A-связывающего полипептида, полученного из SH3 Fyn IL-17A-связывающие полипептиды, полученные из SH3 Fyn (11L5-B06 (SEQ ID NO: 5) и 11L9-C09 (SEQ ID NO: 7)), генетически подвергали слиянию с C-концом легкой цепи антитела против TNFa (SEQ ID NO: 11) через линкер из 15 аминокислот (линкер: SEQ ID NO: 15). Полученные биспецифические конструкции против IL17A/TNFa, обозначенные как LC11L5-B06 (биспецифическая конструкция (по изобретению) с тяжелой цепью и легкой цепью, состоящими из последовательностей SEQ ID NO: 12 и 16, соответственно) и LC11L9-C09 (биспецифическая конструкция (по изобретению) с тяжелой цепью и легкой цепью, состоящими из последовательностей SEQ ID NO: 12 и 17, соответственно), транзиторно трансфицировали в клетки Freestyle CHO-S и экспрессировали в течение 6-10 дней в средах, не содержащих сыворотку/животные компоненты. Белки выделяли из супернатантов с помощью аффинной хроматографии с протеином A (колонка Mab Select Sure; GE Healthcare) и эксклюзионной хроматографии (SEC; колонка Superdex G200, 30/100 GL; GE Healthcare) на устройстве Akta Purifier (GE Healthcare). Концентрации определяли с помощью измерений поглощения при 280 нм. Выходы приведены в табл. 4.
- 19 031683
Таблица 4. Выходы очистки биспецифических продуктов слияния антитела и IL-17A-связывающих полипептидов, полученных из SH3 Fyn, продуцируемых в транзиторно трансфицированных клетках CHO-S
SEQ ID NO Выход (мг/л)
(тяжелая цепь, легкая цепь)
LC11L5-B06 12, 16 110
LC11L9-C09 12, 17 110
После очистки осуществляли эксклюзионную хроматографию с использованием системы AKTA FPLC и колонки Superdex G200, 30/100 GL (GE Healthcare). Профили эксклюзионной хроматографии (SEC) после очистки показали, что оба слитых белка элюировали в виде отдельных, мономерных пиков, что свидетельствует о том, что слитые белки имеют исключительные биофизические свойства (фиг. 4).
Пример 5. Измерения аффинности продуктов слияния антитела и IL-17A-связывающих полипептидов, полученных из SH3 Fyn, к IL-17A и TNFa человека и яванского макака Аффинности LC11L5-B06 и LC11L9-C09 к IL-17A (человека и яванского макака) и TNFa (человека и яванского макака) измеряли с использованием устройства BIAcore T200 (GE Healthcare). Чип серии S CM5 (GE Healthcare) покрывали 8000 RU Fc-специфичесого антитела козла против IgG человека (Jackson Immunoresearch). Подвижным буфером являлся PBS, содержащий 0,05% Tween 20.
Взаимодействия измеряли посредством захвата приблизительно от 400 до 500 RU LC11L5-B06 или LC11L9-C09 при скорости потока 30 мкл/мин с последующей инъекцией различных концентраций антигенов при скорости потока 30 мкл/мин. Все кинетические данные о взаимодействиях оценивали с использованием аналитического программного обеспечения BIAcore T200. Аффинности приведены в табл. 5 для антигенов человека и в табл. 6 для антигенов яванского макака.
Таблица 5. Константы диссоциации для связывания продуктов слияния антитела и IL-17A-связывающих полипептидов, полученных из SH3 Fyn, с рекомбинантным гликозилированным IL-17A человека и TNFa человека
Значения KD для
SEQ ID NO (тяжелая цепь, легкая цепь) гликозилированного IL-17A человека (пМ) Значения KD для TNFa человека (пМ)
LC11L5-B06 12, 16 44 144
LC11L9-C09 12, 17 48 89
Таблица 6. Константы диссоциации для связывания продуктов слияния антитела и IL-17A-связывающих полипептидов, полученных из SH3 Fyn^ рекомбинантным гликозилированным IL-17A яванского макака и TNFa яванского макака
SEQ ID NO (тяжелая цепь, легкая цепь) Значения KD для гликозилированного IL-17A яванского макака (пМ) Значения KD для TNFa яванского макака (пМ)
LC11L5-B06 12, 16 63 120
LC11L9-C09 12, 17 70 133
Пример 6. LC11L5-B06 и LC11L9-C09 одновременно ингибируют IL-17A и TNFa.
IL-17A и TNFa индуцируют продукцию Gro-a в клетках HT-29 (линии клеток колоректальной аденокарциномы человека) дозозависимым образом. Ингибиторные активности указанных конструкций (LC11L5-B06 и LC11L9-C09) тестировали посредством стимуляции клеток HT-29 (линии клеток колоректальной аденокарциномы человека) гликозилированным IL-17A и TNFa в отсутствие или присутствие различных концентраций LC11L5-B06 и LC11L9-C09. Супернатанты культур клеток собирали после 48 ч стимуляции и анализировали на Gro-a с помощью ELISA.
Способы.
LC11L5-B06 или LC11L9-C09 разбавляли в среде для анализа (среде МакКоя 5A (GIBCO), дополненной 10% FBS). 50 мкл каждой указанной концентрации смешивали с 50 мкл среды для анализа, содержащей IL-17A (полученного для внутреннего пользования в клетках HEK EBNA) и TNF (Thermo Fisher Scientific) в конечных концентрациях 400 и 200 пМ соответственно. В качестве контроля получали среду без ингибитора. Кроме того, получали среду с отдельными цитокинами или без цитокинов. После 1 ч инкубации в растворы добавляли 100 мкл клеточной суспензии, содержащей приблизительно 20000 клеток HT-29 (ATCC, #HTB-38), распределяли по лункам (96-луночный планшет, TPP или Corning) и культивировали в течение 48 ч при 37°C и 5% CO2. После 48 ч инкубации при 37°C удаляли супернатант и определяли концентрацию Gro-a с помощью ELISA по инструкциям производителя (набор Gro-a ELISA, R&D Systems).
- 20 031683
Результаты.
На фиг. 5 показана концентрация Gro-альфа (обозначенная как сигнал при ELISA) в супернатанте клеток HT-29 после стимуляции IL-17A, TNFa и их комбинацией. Как показано на фиг. 5, биспецифические конструкции LC11L5-B06 и LC11L9-C09 были способны одновременно ингибировать IL-17A и TNFa дозозависимым образом. Полученные относительные значения IC50 (табл. 7) показали, что биспецифические соединения по изобретению способны ингибировать IL-17A и TNFa с высокой активностью.
Таблица 7. Относительные значения IC50 для одновременного ингибирования IL-17A и TNFa, полученные для биспецифических продуктов слияния антитела и IL-17A-связывающих полипептидов, полученных из SH3 Fyn
Относительные значения 1С50
SEQ ID NO (пМ) для одновременного (тяжелая цепь, ингибирования IL-17A и легкая цепь)
TNFa
LC11L5-B06 12, 16 247
LC11L9-C09 12, 17 222
Пример 7. LC11L5-B06 и LC11L9-C09 ингибируют IL-17A и TNFa in vivo.
Способность LC11L5-B06 и LC11L9-C09 ингибировать IL-17A и TNFa in vivo определяли с использованием модели острого воспаления у мышей C57BL/6. IL-17A человека связывает и стимулирует рецептор IL-17 мыши. При инъецировании мышам IL-17A запускает значительное повышение хемокина КС (CXCL1), определяемого в течение 1-4 ч в сыворотке и промывных жидкостях мышей, которым делали инъекцию. Аналогичные наблюдения можно делать в случае TNFa человека, также приводящего к значительному повышению уровней КС в сыворотке при инъецировании мышам.
Способы.
Мышам (C57BL/6, Charles River) внутривенно инъецировали ингибиторы LC11L5-B06 (2 мг/кг), LC11L9-C09 (2 мг/кг) или, в качестве контроля для ингибирования TNF, коммерчески доступное антитело против TNFa (2 мг/кг) (адалимумаб (HUMIRA®)), разбавленное в PBS без эндотоксина (5 мышей на группу). Через 3,5 ч после внутривенной инъекции ингибиторов стимулировали экспрессию КС с помощью IL-17A человека или TNFa человека посредством подкожного введения (3 мкг IL-17A на мышь или 0,25 мкг TNFa на мышь). Через два часа забирали кровь для получения образцов сыворотки и определяли концентрацию КС с использованием коммерчески доступного набора для ELISA КС по инструкциям производителя (иммунологический анализ КС мыши Quantikine, R&D Systems).
Результаты.
После инъекции s.a мышам IL-17A или TNFa человека у животных гиперэкспрессировался хемокин, называемый КС. Повышенные уровни КС в сыворотках мышей можно измерять с помощью ELISA. Предшествующая инъекция i.v. продуктов слияния полипептидов по изобретению, полученных из SH3 Fyn, (LC11L5-B06 и LC11L9-C09) и контрольного антитела против TNFa (фиг. 6B и 6D) предотвращала повышающую регуляцию КС in vivo. На фиг. 6 показаны мощные ингибиторные свойства LC11L5-B06 (обозначенного как LC-B06) и LC11L9-C09 (обозначенного как LC-C09).
Пример 8. LC11L5-B06 и LC11L9-C09 проявляют антителоподобный профиль РК in vivo.
Фармакокинетические свойства слитых белков по изобретению LC11L5-B06 и LC11L9-C09 in vivo определяли, измеряя концентрации в сыворотке мыши, полученной в различные моменты времени после однократной инъекции i.v., с помощью ELISA.
Способы.
LC11L5-B06 и LC11L9-C09 инъецировали внутривенно 5 мышам (C57BL/6, Charles River) в дозе 10 мг/кг. Через 10 мин, 6, 24, 48, 96, 120, 144 и 168 ч с помощью капилляра Microvette CB 300 (Sarstedt) получали приблизительно 20 мкл крови из подкожной вены. Образцы крови центрифугировали в течение 10 мин при 9500xg и хранили сыворотку при -20° до проведения анализа ELISA. Используя серию разведений с известными концентрациями LC11L5-B06 и LC11L9-C09, с помощью ELISA с использованием TNFa и IL-17A в качестве средств захвата определяли концентрацию в сыворотке: 50 мкл биотинилированного IL-17A (120 нМ) (R&D Systems, биотинилированного с использованием EZ-link NHS-PGE4biotin (Pierce) по инструкциям производителя) или 50 мкл биотинилированного TNFa (10 нМ) (Thermo Scientific, биотинилированного с использованием EZ-link NHS-PGE4-biotin (Pierce) по инструкциям производителя) добавляли в покрытые стрептавидином лунки (Reactibind, Pierce) и после блокирования 200 мкл PBS, 4% молока, (Rapilait, Migros, Switzerland) добавляли 50 мкл разведенных образцов сыворотки (в PBS, 4% молока). После инкубации в течение 1 ч и промывания PBS определяли связавшиеся слитые белки антитела и Fуnомера с использованием конъюгата протеина A и HRP (Sigma). Активность пероксидазы определяли посредством добавления субстрата QuantaRed Enhanced Chemifluorescent HRP Substrate (Pierce). Интенсивность флуоресценции измеряли через 1-5 мин при 544 нм (возбуждение) и 590 нм (эмиссия). Используя концентрации LC11L5-B06 и LC11L9-C09, определяемые в сыворотке в различные
- 21 031683 моменты времени, и полученного угла наклона кривой к в фазу элиминации (построенной в полулогарифмической шкале), вычисляли время полужизни по формуле tp2=ln2/-k.
Результаты.
Концентрации LC11L5-B06 и LC11L9-C09 в сыворотке представлены на фиг. 7. Время полужизни, определяемое в фазу элиминации (бета-фазу, моменты времени 24-168 ч), находились в диапазоне от 4,9 до 9,6 дней для обоих слитых белков (см. табл. 8), что находится в том же диапазоне, что и зарегистрированные значения времени полужизни для стандартных терапевтических антител, инъецируемых мышам. Эти данные свидетельствуют о том, что LC11L5-B06 и LC11L9-C09 обладают IgG-подобными свойствами РК in vivo.
Таблица 8. Конечные значения времени полужизни для биспецифических продуктов слияния антитела и IL-17A-связывающих полипептидов, полученных из SH3 Fyn
SEQ ID NO
Время полужизни (тяжелая цепь, (дни) легкая цепь)
LC11L5-B06
12, 16 6,2 (Определение IL-17A)
LC11L5-B06
12, 169,6 (Определение TNFa)
LC11L9-C09
12, 174,9 (Определение IL-17A)
LC11L9-C09
12, 179,6 (Определение TNFa)
Пример 9. Полипептид по изобретению 11L11-A09, полученный из SH3 Fyn, ингибирует гликозилированный IL-17A.
Fуnомер 11L11-A09 (SEQ ID NO: 9) тестировали на его способность ингибировать IL-17A.
Способы.
Экспериментальные условия являлись теми же, которые описаны в примере 3 для других полипептидов по изобретению, полученных из SH3 Fyn (SEQ ID NO: 3-8).
Результаты.
Нормальные дермальные фибробласты человека инкубировали с IL-17A/TNFa и различными концентрациями полипептида по изобретению 11L11-A09, полученного из SH3 Fyn (SEQ ID NO: 9). Наблюдали, что 11L11-A09 (SEQ ID NO: 9) ингибировал гликозилированный IL-17A со значением IC50 66 нМ (табл. 9). На фиг. 9 показаны кривые дозозависимого ингибирования для полипептида по изобретению 11L11-A09, полученного из SH3 Fyn (SEQ ID NO: 9), ингибирующего гликозилированный и негликозилированный IL-17A со сравнимой активностью и эффективностью.
Таблица 9. Значение IC50 для ингибирования гликозилированного IL-17A, полученное для IL-17A-связывающего полипептида 11L11-A09, полученного из SH3 Fyn (SEQ ID NO: 9)
FynoMep SEQ ID NO: Значение IC50 (нМ)
11L11-A09 9 66
Пример 10. LC11L5-B06 и LC11L9-C09 ингибируют гликозилированный IL-17A с высокой активностью.
В этом примере дополнительно демонстрируют способность полипептидов по изобретению, полученных из SH3 Fyn, специфически ингибировать гликозилированный IL-17A. Биспецифические конструкции против IL-17A/TNFa LC11L5-B06 (биспецифическую конструкцию (по изобретению) с тяжелой цепью и легкой цепью, состоящими из последовательностей SEQ ID NO: 12 и 16, соответственно) и LC11L9-C09 (биспецифическую конструкцию (по изобретению) с тяжелой цепью и легкой цепью, состоящими из последовательностей SEQ ID NO: 12 и 17, соответственно) экспрессировали и очищали, как описано в примере 4. Тестировали ингибиторные активности LC11L5-B06 и LC11 L9-C09, стимулируя нормальные дермальные фибробласты человека (клетки NHDF) рекомбинантным гликозилированным IL-17A (полученным для внутреннего пользования в клетках HEK EBNA) и рекомбинантным IL-1P (R&D Systems) для продуцирования IL-6 в отсутствие или присутствие различных концентраций LC11L5-B06 или LC11L9-C09. Супернатанты культур клеток удаляли после 16-24 ч стимуляции и определяли концентрацию IL-6 в супернатанте с помощью ELISA. Результаты свидетельствуют о том, что слитые белки, содержащие IL-17A-связывающие полипептиды по изобретению, были способны специфически ингибировать гликозилированный IL-17A.
Способы.
Распределяли по 100 мкл клеточной суспензии, содержащей приблизительно 3900 нормальных дермальных фибробластов человека (PromoCell, NHDF-c, C12300), на лунку (96-луночный планшет, TPP)
- 22 031683 и культивировали в течение 24 ч при 37°C/5% CO2 (среда: среда для выращивания фибробластов C23010, PromoCell). Отсасывали супернатант и после смешивания различных концентраций LC11L5-B06 или LC1L9-C09 (конечные концентрации представлены на фиг. 10) со средой, содержащей IL-17A и IL1β (конечные концентрации: IL-17A: 64 пМ; IL-1 β: 10 фМ), к клеткам добавляли 100 мкл соответствующего раствора (три повторения). В контрольных экспериментах PBS смешивали со средой, содержащей IL-17A/IL-1 β (IL-17A/IL-1 β), и средой с отдельными цитокинами IL-17A или IL-1 β (обозначенные как контрольные лунки IL-17A и IL-1 β). В качестве отрицательного контроля PBS смешивали только со средой (среда). Через 16-24 ч инкубации при 37°C/5% CO2 определяли концентрацию IL-6 в супернатанте с использованием набора для ELISA IL-6 по инструкциям производителя (IL-6 ELISA kit, R&D Systems). Для вычисления значений IC50 определяли процентные доли ингибирования и вычисляли значения IC50 с использованием программного обеспечения Prism 5.
Процент ингибирования IL-17A определяли по следующей формуле:
Ингибирование (%)=100-((А450-650 нм (образец)-А450-650 нм (IL1β) ) хЮО) / (А450-650 нм (IL-17A/IL-lp)-А450-650 нм (IL-Ιβ) )
Результаты.
На фиг. 10 показаны значения для ELISA (поглощение), полученные при определении концентраций IL-6 в супернатантах клеток NHDF. Как показано на фиг. 10, биспецифические конструкции LC11L5-B06 и LC11L9-C09 были способны ингибировать IL-17A-опосредованную продукцию IL-6 дозозависимым образом, что свидетельствует о том, что они были способны специфически ингибировать гликозилированный IL-17A. Как и ожидали, не ингибировали индуцируемое IL-1 β высвобождение IL-6. Полученные значения IC50 для ингибирования IL-17A (табл. 10) свидетельствуют о том, что биспецифические соединения по изобретению способны ингибировать IL-17A с высокой активностью.
Таблица 10. Значения IC50 для ингибирования IL-17A, полученные для биспецифических продуктов слияния антитела и IL-17A-связывающего полипептида, полученного из SH3 Fyn.
SEQ ID NO (тяжелая цепь, легкая цепь) Значения 1С50 (пМ) для ингибирования IL-17A
LC11L5-B06 12, 16 121
LC11L9-C09 12, 17 66
Пример 11. LC11L5-B06 и LC11L9-C09 стабильны in vivo и проявляют длительное время полужизни у яванского макака.
Определяли фармакокинетические свойства слитых белков по изобретению LC11L5-B06 и LC11L9C09, измеряя их концентрации у яванского макака в различные моменты времени после однократной инъекции i.v. Используя серию разведений с известными концентрациями LC1L5-B06 и LC11L9-C09, определяли концентрацию в плазме с использованием сэндвич-ELISA, обеспечивая измерение только полностью функциональных и интактных биспецифических молекул LC1L5-B06 и LC11L9-C09. Для дополнительной демонстрации того, что LC11L5-B06 и LC11L9-C09 остаются интактными, и полипептиды по изобретению, полученные из SH3 Fyn, не отщепляются от антител in vivo (у яванских макак), разрабатывали дополнительный ELISA, в котором определяли только антительный компонент слитых белков (прямой ELISA). Два способа определения с помощью ELISA представлены на фиг. 11. Способы Биспецифические конструкции против IL-17A/TNFa LC1L5-B06 (биспецифическую конструкцию (по изобретению) с тяжелой цепью и легкой цепью, состоящими из последовательностей SEQ ID NO: 12 и 16, соответственно) и LC11L9-C09 (биспецифическую конструкцию (по изобретению) с тяжелой цепью и легкой цепью, состоящими из последовательностей SEQ ID NO: 12 и 17, соответственно) экспрессировали и очищали, как описано в примере 4. LC11L5-B06 и LC11L9-C09 инъецировали внутривенно 3 самцам яванского макака в дозе 3 мг/кг. Кровь забирали из периферических вен в указанные моменты времени после завершения введения (0,6 мл собранного объема на образец). В качестве антикоагулянта использовали раствор ЭДТА (7,5%). После забора крови образцы центрифугировали при 4°C в течение 10 мин при 1200 g и хранили плазму при -80°C до проведения анализа ELISA.
Сэндвич-ELISA. Покрытые нейтравидином лунки (Biomat MCP44-11) блокировали 150 мкл/лунку блокирующего буфера (1-кратный PBS - 5% BSA) в течение 60 мин при комнатной температуре (RT) и осторожном рото-орбитальном встряхивании при 300 об/мин. Лунки промывали 200 мкл/лунку промывочного буфера (1-кратный PBS - 0,1% Tween 20), а затем инкубировали с 100 мкл/лунку раствора, содержащего 0,2 мкг/мл биотинилированного TNF-альфа (PrepoTech, биотинилированный с использованием набора для мечения биотином от ANP Technologies по инструкциям производителя), разбавленного в буфере для анализа (1-кратный PBS - 1% BSA) в течение 60 мин при RT и осторожном встряхивании. После трех промываний 200 мкл/лунку промывочного буфера образцы, разбавленные в соотношении 1:4 в буфере для анализа, распределяли по лункам (100 мкл/лунку) и инкубировали в течение 1 ч при осторожном встряхивании. Планшет 3 раза промывали промывочным буфером (200 мкл/лунку) перед добав- 23 031683 лением 100 мкл/лунку раствора, содержащего 64 нг/мл меченого дигоксигенином IL-17A (PrepoTech, меченого дигоксигенином с использованием набора для мечения дигоксигенином, приобретенного в Solulink, по инструкциям производителя), разбавленного в буфере для анализа. Затем осуществляли дополнительную инкубацию в течение 1 ч при RT и осторожном встряхивании. После 3 промываний (200 мкл/лунку) промывочным буфером планшет инкубировали с 100 мкл/лунку HRP-конъюгированного антитела против дигоксигенина (Roche), разбавленного в соотношении 1:10000 буфером для анализа. Инкубацию осуществляли при комнатной температуре в течение 60 минут при 300 об/мин. Планшет 3 раза промывали промывочным буфером (200 мкл/лунку), незамедлительно добавляли 100 мкл/лунку TMB (Sigma) и инкубировали в течение 5-10 мин при комнатной температуре в темноте. В конце добавляли в каждую лунку аликвоту (100 мкл/лунку) стоп-раствора для остановки ферментативной реакции. Оптическую плотность измеряли при 450 нм с использованием спектрофотометра для считывания планшетов для микротитрования Victor2V (Wallac Perkin Elmer).
Прямой ELISA: 96 покрытых нейтравидином лунок (Biomat MCP44-11) блокировали 150 мкл/лунку блокирующего буфера (1-кратный PBS - 5% BSA) в течение 60 мин при RT и осторожном рото-орбитальном встряхивании при 300 об/мин. Лунки промывали 200 мкл/лунку промывочного буфера (1-кратный PBS - 0,1% Tween20), а затем инкубировали с 100 мкл/лунку раствора 0,2 мкг/мл биотинилированного TNF-альфа, разбавленного в буфере для анализа (1-кратный PBS - 1% BSA) в течение 60 мин при RT и осторожном встряхивании. После трех промываний 200 мкл/лунку промывочного буфера образцы, разбавленные в соотношении 1:4 в буфере для анализа, распределяли по лункам (100 мкл/лунку) и инкубировали в течение 1 ч при осторожном встряхивании. Планшет 3 раза промывали промывочным буфером (200 мкл/лунку) перед добавлением 100 мкл/лунку раствора 44 нг/мл HRP-конъюгированного антитела обезьяны против IgG человека (ABCam), разбавленного в буфере для анализа. Затем осуществляли дополнительную инкубацию в течение 1 ч при RT и осторожном встряхивании. Планшет 3 раза промывали промывочным буфером (200 мкл/лунку), незамедлительно добавляли 100 мкл/лунку TMB (Sigma) и инкубировали в течение 5-10 мин при комнатной температуре в темноте. В конце в каждую лунку добавляли аликвоту стоп-раствора (100 мкл/лунку) для остановки ферментативной реакции. Оптическую плотность измеряли при 450 нм с использованием спектрофотометра для считывания планшетов для микротитрования Victor2V (Wallac Perkin Elmer).
Фармакокинетический анализ LC11L5-B06 и LC11L9-C09 осуществляли с использованием концентраций в плазме, определяемых способами ELISA, с использованием пакета Watson (v. 7.4, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).
Результаты.
Концентрации LC11L5-B06 и LC11L9-C09 в плазме представлены на фиг. 12. Оба соединения демонстрировали низкое выведение из крови и конечное время полужизни в несколько дней у яванских макак, что, как правило, регистрируют для стандартных терапевтических моноклональных антител. Важно, что концентрации в плазме, полученные с использованием двух различных способов ELISA, являлись очень схожими, доказывая, что LC11L5-B06 и LC11L9-C09 являются стабильными in vivo в течение по меньшей мере 220 ч и что у яванских макак полипептиды, полученные из SH3 Fyn, не отщепляются от антитела (фиг. 13).
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Covagen AG <120> ПОЛИПЕПТИД, ИНГИБИРУЮЩИЙ АКТИВНОСТЬ ГЛИКОЗИЛИРОВАННОГО IL-17A, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ <130> U2194 PCT <150> EP 12185425.1 <151> 2012-09-21 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 64 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
- 24 031683 <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
последовательности выравнивание
<220>
<221> вариант
<222> 12
<223> /замена= Cys
/замена=' Asp
/замена=' Glu
/замена=' Phe
/ замена = Gly
/ замена =' His
/ замена =' Ile
/ замена =' Lys
/ замена =' Leu
/ замена =' Met
/ замена =' Asn
/ замена =' Pro
/ замена =' Gln
/ замена =' Arg
/ замена =' Ser
/ замена =' Thr
/ замена =' Val
/ замена =' Trp
/ замена =' Tyr
<220>
<221> вариант
<222> 13
<223> / замена =' Cys
/ замена =' Asp
/ замена =' Glu
/ замена =' Phe
/ замена =' Gly
/ замена =' His
/ замена =' Ile
/ замена =' Lys
/ замена =' Leu
/ замена =' Met
/ замена =' Asn
/ замена =' Pro
/ замена =' Gln
/ замена =' Arg
/ замена =' Ser
/ замена =' Thr
/ замена =' Val
/ замена =' Trp
/ замена =' Tyr
<220>
<221> вариант
<222> 14
<223> / замена =' Cys
/ замена =' Asp
/ замена =' Glu
/ замена =' Phe
/ замена =' Gly
/ замена =' His
/ замена =' Ile
/ замена =' Lys
/ замена =' Leu
/ замена =' Met
/ замена =' Asn
- 25 031683 /замена=Рго /замена=О1п /замена=Агд /замена=5ег /замена=ТЬг / замена=Уа1 /замена=Тгр /замена=Tyr вариант /замена=СуБ /замена=АБр /замена=О1и /замена=РЬе /замена=О1у /замена=Н1Б /замена=11е /замена=ЬуБ /замена=Ьеи /замена=МеЁ /замена=ЛБп /замена=Рго /замена=О1п /замена=Агд /замена=Бег /замена=ТЬг /замена=Уа1 /замена=Тгр /замена=Tyr вариант / замена=СуБ /замена=АБр /замена=О1и /замена=РЬе /замена=О1у /замена=Н1Б /замена=11е /замена=ЬуБ /замена=Ьеи /замена=МеЁ /замена=АБп /замена=Рго /замена=О1п /замена=Агд /замена=Бег /замена=ТЬг /замена=Уа1 /замена=Тгр /замена=Туг вариант /замена=СуБ /замена=АБр /замена=О1и /замена=РЬе /замена=О1у
- 26 031683 /3aMeHa=His /замена=11е /замена=ЬуБ /замена=Ьеи /замена=МеЁ /замена=ЛБп /замена=Рго /замена=О1п /замена=Агд /замена=Бег /замена=ТЬг / замена=\7а1 /замена=Тгр /замена= Tyr <400> 1
Gly 1 Val Thr Leu Phe 5 Val Ala Leu Tyr Asp 10 Tyr Ala Ala Ala Ala 15 Ala
Ala Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Ser Thr
20 25 30
His Glu Tyr Glu Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu
35 40 45
Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln
50 55 60
<210> 2 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
рекомбинантная src-петля <400>2
Ser Thr His Glu Tyr Glu <210>3 <211>64 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> /примечание=Описание искусственной последовательности: 1L3-B9 <400> 3
Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Ala Asn His Gly Asn
5 10 15
- 27 031683
Arg Asp Leu Ser 20 Phe His Lys Gly Glu 25 Lys Phe Gln Ile Leu 30 Ser Thr
His Glu Tyr Glu Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu
35 40 45
Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln
50 55 60
<210> 4 <211> 64 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> /примечание=Описание искусственной последовательности: 11L0-C6 <400>4
Gly 1 Val Thr Leu Phe Val 5 Ala Leu Tyr Asp 10 Tyr Lys Gln Lys Gly His 15
Leu Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Ser Thr
20 25 30
His Glu Tyr Glu Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu
35 40 45
Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln
50 55 60
<210>5 <211>64 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> /примечание=Описание искусственной последовательности: 11L5-B06 <400> 5
Gly 1 Val Thr Leu Phe 5 Val Ala Leu Tyr Asp 10 Tyr Ser Ala Arg Gly 15 Gln
Leu Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Ser Thr
20 25 30
His Glu Tyr Glu Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu
35 40 45
Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln
50 55 60
- 28 031683 <210> 6 <211> 64 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> /примечание=Описание искусственной последовательности: 11L6-F03 <400>6
Gly Val 1 Thr Leu Phe 5 Val Ala Leu Tyr Asp 10 Tyr Asp Lys Leu Ser 15 Ala
Leu Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Ser Thr
20 25 30
His Glu Tyr Glu Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu
35 40 45
Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln
50 55 60
<210>7 <211>64 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> /примечание=Описание искусственной последовательности: 11L9-C09 <400> 7
Gly 1 Val Thr Leu Phe Val 5 Ala Leu Tyr Asp 10 Tyr Glu Ser Val Ser 15 Trp
Ser Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Ser Thr
20 25 30
His Glu Tyr Glu Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu
35 40 45
Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln
50 55 60
<210> 8 <211> 64 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> /примечание=Описание искусственной последовательности: 11L10-A05 <400> 8
- 29 031683
Gly Val 1 Thr Leu Phe Val 5 Ala Leu Tyr Asp 10 Tyr Ser Ser Arg Gly Val 15
Leu Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Ser Thr
20 25 30
His Glu Tyr Glu Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu
35 40 45
Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln
50 55 60
<210> 9 <211> 64 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> /примечание=Описание искусственной последовательности: 11L11-A09 <400> 9
Gly 1 Val Thr Leu Phe 5 Val Ala Leu Tyr Asp 10 Tyr Ser Arg Lys Ser 15 Asn
Leu Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Ser Thr
20 25 30
His Glu Tyr Glu Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu
35 40 45
Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln
50 55 60
<210> 10 <211> 155 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <220>
<223> IL-17A человека, включая сигнальную последовательность <400> 10
Met 1 Thr Pro Gly Lys 5 Thr Ser Leu Val Ser 10 Leu Leu Leu Leu Leu 15 Ser
Leu Glu Ala Ile Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly
20 25 30
Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn
35 40 45
- 30 031683
Leu Asn 50 Ile His Asn Arg Asn 55 Thr Asn Thr Asn Pro 60 Lys Arg Ser Ser
Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu
65 70 75 80
Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His
85 90 95
Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser
100 105 110
Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His
115 120 125
Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys
130 135 140
Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala
145 150 155
<210> 11 <211> 214 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> /примечание=Описание искусственной последовательности: легкая цепь антитела против TNF <400> 11
Asp 1 Ile Gln Met Thr 5 Gln Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
- 31 031683
Thr Phe Gly Gln 100 Gly Thr Lys Val Glu 105 Ile Lys Arg Thr Val 110 Ala Ala
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 <210> 12 <211> 451 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> /примечание=Описание искусственной последовательности: тяжелая цепь антитела против TNF <400> 12
Glu Val 1 Gln Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly Leu 10 Val Gln Pro Gly 15 Arg
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
- 32 031683
Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
- 33 031683
Glu Lys Thr Ile 340 Ser Lys Ala Lys Gly 345 Gln Pro Arg Glu Pro 350 Gln Val
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450 <210> 13 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> /примечание=' Описание искусственной последовательности: линкер <400>13
Gly Gly Gly Gly Ser
<210> <211> <212> <213> 14 10 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220>
<223> /примечание=' Описание искусственной последовательности: линкер <400>14
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
510 <210>15
- 34 031683 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> /примечание=Описание искусственной последовательности: линкер <400>15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
5 1015 <210> 16 <211>293 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> /примечание=Описание искусственной последовательности: легкая цепь антитела против Т№/линкер/11Б5-В06 <400> 16
Asp 1 Ile Gln Met Thr 5 Gln Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
- 35 031683
Glu Ser Val Thr Glu 165 Gln Asp Ser Lys Asp 170 Ser Thr Tyr Ser Leu 175 Ser
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr
225 230 235 240
Ser Ala Arg Gly Gln Leu Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe
245 250 255
Gln Ile Leu Ser Thr His Glu Tyr Glu Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser
260 265 270
Leu Thr Thr Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro
275 280 285
Val Asp Ser Ile Gln
290 <210> 17 <211> 293 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> /примечание=Описание искусственной последовательности: легкая цепь антитела против TNF/линкер/11L9-C09 <400> 17
Asp 1 Ile Gln Met Thr 5 Gln Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
- 36 031683
Ser Gly Ser 65 Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Gln Pro 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr
225 230 235 240
Glu Ser Val Ser Trp Ser Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe
245 250 255
Gln Ile Leu Ser Thr His Glu Tyr Glu Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser
260 265 270
Leu Thr Thr Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro
275 280 285
Val Asp Ser Ile Gln
<210> 18 <211> 7
290
- 37 031683 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
рекомбинантная последовательность <400> 18
Ser Thr His Glu Tyr Glu Asp
5 <210> 19 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
рекомбинантная RT-петля <400> 19
Glu Ala Arg Thr Glu Asp
1 5
<210> 20
<211> 63
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 20
Gly Val 1 Thr Leu Phe 5 Val Ala Leu Tyr Asp 10 Tyr Glu Ala Arg Thr 15 Glu
Asp Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Asn Ser
20 25 30
Ser Glu Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu Thr
35 40 45
Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln
50 55 60

Claims (18)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Полипептид, ингибирующий активность гликозилированного IL-17A, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из (a) последовательности
    GVTLFVALYDY (X1) (X2) (X3) (X4) (X5) (X6) DLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTG ETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 1), в которой аминокислотные остатки в положениях (X1)-(X6) могут быть любыми; и (b) последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотной последовательности (a), причем при определении идентичности исключают аминокислоты в положениях (X1)-(X6), при условии, что аминокислотная последовательность STHEYE (SEQ ID NO: 2) в положениях аминокис- 38 031683 лот 31-36 последовательности SEQ ID NO: 1 является консервативной.
  2. 2. Полипептид по п.1, в котором (X1) является A, K, S, D или E;
    (X2) является N, Q, A, K, S или R;
    (X3) является H, K, R, L или V;
    (X4) является G или S;
    (X5) является H, Q, A, W, V или N;
    (X6) является R, L или S.
  3. 3. Полипептид по п.1 или 2, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 3-9.
  4. 4. Конструкция, ингибирующая активность гликозилированного IL-17A, содержащая полипептид по любому из пп.1-3, слитый с (a) фармацевтически активным соединением, (b) пролекарством, (c) фармацевтически приемлемым носителем, (d) диагностически активным соединением, (e) усилителем проницаемости клетки и/или (f) соединением, модулирующим время полужизни конструкции в сыворотке.
  5. 5. Конструкция по п.4, содержащая дополнительное соединение, которое выбрано из (a) флуоресцентного красителя, (b) фотосенсибилизатора, (c) радионуклида, (d) контрастного средства для диагностической визуализации, (e) цитокина, (f) токсического соединения, (g) хемокина, (h) прокоагулянта, (i) фермента для активации пролекарства, (k) средства, связывающего альбумин, (l) альбумина, (m) средства, связывающего IgG, или (n) полиэтиленгликоля.
  6. 6. Конструкция по п.4, содержащая дополнительное соединение, которое состоит из или содержит легкую цепь антитела, тяжелую цепь антитела, Fc-домен антитела или их комбинацию.
  7. 7. Конструкция по п.6, в которой легкая цепь антитела и тяжелая цепь антитела являются частью полного антитела, имеющего как легкую, так и тяжелую цепи.
  8. 8. Конструкция по п.6, в которой полипептид по любому из пп.1-3 связан с C-концом указанного дополнительного соединения.
  9. 9. Конструкция по любому из пп.6 или 8, содержащая дополнительное соединение, которое содержит или состоит из легкой цепи антитела, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 11.
  10. 10. Конструкция, содержащая или состоящая по меньшей мере из одной копии конструкции по п.9 и по меньшей мере одной копии тяжелой цепи антитела с последовательностью SEQ ID NO: 12.
  11. 11. Конструкция по п.10, содержащая или состоящая из двух копий конструкции по п.9 и двух копий тяжелой цепи антитела с последовательностью SEQ ID NO: 12.
  12. 12. Конструкция по п.10, содержащая или состоящая по меньшей мере из одной копии, предпочтительно двух копий конструкции, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 16 или 17, и по меньшей мере одной копии, предпочтительно двух копий тяжелой цепи антитела с последовательностью SEQ ID NO: 12.
  13. 13. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по любому из пп.1-3.
  14. 14. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая конструкцию по любому из пп.6-9.
  15. 15. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая конструкцию по любому из пп.10-12.
  16. 16. Фармацевтическая композиция для лечения воспалительного, аутоиммунного и/или связанного с потерей костной массы заболевания, содержащая полипептид по любому из пп.1-3, конструкцию по пп.4-9, конструкцию по любому из пп.10-12, молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.13-15 или любую их комбинацию.
  17. 17. Применение фармацевтической композиции по п.16 в лечении воспалительного, аутоиммунного и/или связанного с потерей костной массы заболевания.
  18. 18. Применение по п.17, где заболевание выбрано из группы, состоящей из артрита, предпочтительно ревматоидного артрита, хронического прогрессирующего артрита, реактивного артрита, псориатического артрита, энтеропатического артрита и деформирующего артрита, ревматических заболеваний, спондилоартропатий, анкилозирующего спондилита, синдрома Рейтера, системной красной волчанки, воспалительных мышечных нарушений, полихондрита, склеродомы, гранулематоза Вегенера, дермато
    - 39 031683 миозита, синдрома Стивенса-Джонсона, хронического активного гепатита, миастении Gravis, псориаза, идиопатической целиакии, аутоиммунного воспалительного заболевания кишечника, язвенного колита, болезни Крона, синдрома раздраженного кишечника, эндокринной офтальмопатии, болезни Грейвса, саркоидоза, рассеянного склероза, первичного биллиарного цирроза, юношеского диабета (сахарного диабета типа I), аутоиммунных гематологических нарушений, гемолитической анемии, апластической анемии, врожденной апластической анемии, идиопатической тромбоцитопении, увеита (переднего и заднего), сухого кератоконъюнктивита, весеннего кератоконъюнктивита, интерстициального фиброза легких, гломерулонефрита (с нефротическим синдромом и без него), идиопатического нефротического синдрома или болезни минимальных изменений, опухолей, воспалительного заболевания кожи, воспаления роговицы, миозита, потери костной ткани вокруг имплантатов, атеросклероза, диабета и дислипидемии, потери костной массы, остеоартрита, остеопороза, болезни пародонта или обструктивных или воспалительных заболеваний дыхательных путей, астмы, бронхита, пневмокониоза, эмфиземы легких, острых и сверхострых воспалительных реакций, острых инфекций, септического шока, эндотоксического шока, респираторного дистресс-синдрома взрослых, менингита, пневмонии, тяжелых ожогов, кахексии, инсульта, герпетического стромального кератита и болезни сухих глаз.
    - 40 031683
    - 41 031683
    Log концентрации (нМ) гликозилированный IL-17A негликозилированный IL-17A гликозилированный IL-17A негликозилированный IL-17A
    -ф- гликозилированный IL-17A негликозилированный IL-17A
EA201590611A 2012-09-21 2013-09-19 Полипептид, ингибирующий активность гликозилированного il-17a, и его применение EA031683B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20120185425 EP2711016A1 (en) 2012-09-21 2012-09-21 Novel IL-17A binding molecules and medical uses thereof
PCT/EP2013/069481 WO2014044758A1 (en) 2012-09-21 2013-09-19 Novel il-17a binding molecules and medical uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201590611A1 EA201590611A1 (ru) 2015-07-30
EA031683B1 true EA031683B1 (ru) 2019-02-28

Family

ID=47010256

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201590611A EA031683B1 (ru) 2012-09-21 2013-09-19 Полипептид, ингибирующий активность гликозилированного il-17a, и его применение

Country Status (17)

Country Link
US (1) US9315557B2 (ru)
EP (2) EP2711016A1 (ru)
JP (1) JP6009678B2 (ru)
KR (1) KR20150065677A (ru)
CN (1) CN104684571B (ru)
AU (1) AU2013320251B2 (ru)
CA (1) CA2884290C (ru)
CL (1) CL2015000709A1 (ru)
CR (1) CR20150196A (ru)
EA (1) EA031683B1 (ru)
ES (1) ES2583832T3 (ru)
IL (1) IL237845A0 (ru)
MX (1) MX2015003310A (ru)
PE (1) PE20150923A1 (ru)
PH (1) PH12015500461A1 (ru)
SG (1) SG11201502167WA (ru)
WO (1) WO2014044758A1 (ru)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160124165A (ko) 2014-02-21 2016-10-26 제넨테크, 인크. 항-il-13/il-17 이중특이적 항체 및 그의 용도
DK3119885T3 (da) * 2014-03-17 2021-09-13 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Antistof-fynomer-konjugater
CN108064235A (zh) * 2015-01-12 2018-05-22 阿菲博迪公司 Il-17a结合多肽
TW201639596A (zh) * 2015-01-24 2016-11-16 艾伯維有限公司 用於治療牛皮癬性關節炎之組合物及方法
JP2017057201A (ja) * 2015-09-16 2017-03-23 田辺三菱製薬株式会社 抗体−フィノマー複合体を含む医薬組成物
MX2019002970A (es) * 2016-09-14 2019-09-18 Beijing hanmi pharm co ltd Anticuerpo que se une especificamente a il-17a y fragmento funcional del mismo.
CN106769349B (zh) * 2017-01-06 2020-01-21 上海君联医疗设备有限公司 血液中异常糖基化蛋白细胞的检测方法
US10722589B2 (en) 2017-04-03 2020-07-28 Covagen Ag FGFR3 binding molecules
CN107522783B (zh) * 2017-09-30 2020-07-07 华博生物医药技术（上海）有限公司 一种抗白介素17a的抗体、其制备方法和应用
US20190153096A1 (en) 2017-10-02 2019-05-23 Covagen Ag Cd3/cd33 bispecific binding molecules
US20190100587A1 (en) 2017-10-02 2019-04-04 Covagen Ag IgG1 Fc MUTANTS WITH ABLATED EFFECTOR FUNCTIONS
AU2020215795A1 (en) 2019-01-31 2021-07-29 Numab Therapeutics AG Multispecific antibodies having specificity for TNFA and IL-17A, antibodies targeting IL-17A, and methods of use thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011023685A1 (en) * 2009-08-27 2011-03-03 Covagen Ag Il-17 binding compounds and medical uses thereof
WO2012159836A1 (en) * 2011-05-20 2012-11-29 Covagen Ag New chymase binding compounds and medical uses thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
EP0362371A4 (en) 1988-04-15 1990-10-24 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
DK0463151T3 (da) 1990-01-12 1996-07-01 Cell Genesys Inc Frembringelse af xenogene antistoffer
AU675661B2 (en) 1992-07-24 1997-02-13 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
EP1892248A1 (en) 2006-08-21 2008-02-27 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Specific and high affinity binding proteins comprising modified SH3 domains of FYN kinase
CN101960021A (zh) * 2008-02-28 2011-01-26 希森美康株式会社 产生il-17的辅助t细胞检测用标记及产生il-17的辅助t细胞的检测方法
PE20160653A1 (es) 2009-03-05 2016-07-24 Abbvie Inc Proteinas de union a il-17

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011023685A1 (en) * 2009-08-27 2011-03-03 Covagen Ag Il-17 binding compounds and medical uses thereof
WO2012159836A1 (en) * 2011-05-20 2012-11-29 Covagen Ag New chymase binding compounds and medical uses thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COVAGEN ADVANCED BIOPHARMACEUTICALS: "Covagen utilizes the unique versatility of Fynomers to creat next generation biologics", 1 November 2011 (2011-11-01), pages 1, XP002669730, Retrieved from the Internet <URL:http://www.proteins-congress.com/wordpress/wp-content/uploads/2011/11/Bispecific-Fynomers-Innovations-in-antibody-fusion-proteins.pdf> *
EUGEN DHIMOLEA AND JANICE M. REICHERT: "World Bispecific Antibody Summit, September 27�28, 2011, Boston, MA", MABS, LANDES BIOSCIENCE, US, vol. 4, no. 1, 1 January 2012 (2012-01-01), US, pages 4 - 16, XP009156606, ISSN: 1942-0862, DOI: 10.4161/mabs.4.1.18821 *
KOENDERS MARIJE I; MARIJNISSEN RENOUD J; DEVESA ISABEL; LUBBERTS ERIK; JOOSTEN LEO A B; ROTH JOHANNES; VAN LENT PETER L E M; VAN D: "Tumor Necrosis Factor-Interleukin-17 Interplay Induces S100A8, Interleukin-1 beta, and Matrix Metalloproteinases, and Drives Irreversible Cartilage Destruction In Murine Arthritis Rationale for Combination Treatment During Arthritis", ARTHRITIS & RHEUMATISM, WILEY INTERSCIENCE, US, vol. 63, no. 8, 1 August 2011 (2011-08-01), US, pages 2329 - 2339, XP009156595, ISSN: 0004-3591, DOI: 10.1002/art.30418 *

Also Published As

Publication number Publication date
US9315557B2 (en) 2016-04-19
IL237845A0 (en) 2015-05-31
PH12015500461A1 (en) 2015-04-20
CL2015000709A1 (es) 2015-07-31
WO2014044758A1 (en) 2014-03-27
MX2015003310A (es) 2016-01-20
JP6009678B2 (ja) 2016-10-19
CA2884290C (en) 2021-08-10
JP2015531604A (ja) 2015-11-05
CN104684571B (zh) 2017-09-22
CR20150196A (es) 2015-05-18
EA201590611A1 (ru) 2015-07-30
KR20150065677A (ko) 2015-06-15
CA2884290A1 (en) 2014-03-27
CN104684571A (zh) 2015-06-03
US20150322125A1 (en) 2015-11-12
ES2583832T3 (es) 2016-09-22
EP2872163A1 (en) 2015-05-20
EP2872163B1 (en) 2016-05-04
EP2711016A1 (en) 2014-03-26
AU2013320251A1 (en) 2015-03-26
PE20150923A1 (es) 2015-06-27
AU2013320251B2 (en) 2017-09-14
SG11201502167WA (en) 2015-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6009678B2 (ja) 新規なｉｌ−１７ａ結合分子およびその医療用途
RU2550272C2 (ru) Новые il-17-связывающие соединения и их медицинское применение
EP3144320B9 (en) Fc fusion proteins comprising novel linkers or arrangements
EP2902039B1 (en) IL-17 antagonistic antibodies
EP2640745B1 (en) Bivalent and bispecific anti-il6/anti-il23 antibodies
RU2749712C2 (ru) IL-17A-связывающие полипептиды
EP2941439B1 (en) Human serum albumin binding compounds and fusion proteins thereof
KR20220127866A (ko) Il2 뮤테인
JP2009543579A (ja) 抗炎症反応のための標的としてのＷＳＸ−１／ｐ２８

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG TJ TM

PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title