CN108362885B

CN108362885B - 用于指导血压下降疗法的肾上腺髓质素

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Publication number: CN108362885B
Application number: CN201810035720.XA
Authority: CN
Inventors: 安德里亚斯·伯格曼
Original assignee: Severin Hightech Co ltd
Current assignee: Severin Hightech Co ltd
Priority date: 2013-03-20
Filing date: 2014-03-19
Publication date: 2021-05-14
Anticipated expiration: 2034-03-19
Also published as: RU2015144699A; HK1216264A1; ES2830036T3; DK2976646T3; CN108362885A; EP2976646A1; JP6820399B2; CA2907467A1; EP2976646B1; JP6259905B2; CN105102985B; JP2016521351A; CN105102985A; JP2018059947A; SG10201800309SA; US20170010286A1; US20200249246A1; RU2673455C2; SG11201507774YA; JP2020073896A

Abstract

本发明的主题为鉴定需要给予流体复苏或血管加压剂的对象的体外方法，包括以下步骤：确定所述对象的体液中proADM和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平将所述水平与所述患者对流体复苏或给予血管加压剂的需要相关联，其中如果所述对象的体液中proADM和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平大于阈值，则所述患者被鉴定为具有这样的需要。

Description

用于指导血压下降疗法的肾上腺髓质素

本发明的主题为鉴定需要给予流体复苏或血管加压剂的对象的体外方法，包括以下步骤：

·确定所述对象的体液中proADM和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平

·将所述水平与所述患者对流体复苏或血管加压剂给药的需要相关联，其中如果所述对象的体液中proADM和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平大于阈值，则所述患者被鉴定为具有这样的需要。

Kitamura等(参见1；数值数据是基于参考文献附录)首次将肾上腺髓质素(ADM)肽描述为新的包含52个氨基酸的低压肽，其从人嗜铬细胞瘤分离而来。同年，编码包含185个氨基酸的前体肽的cDNA及该前体肽的完整氨基酸序列也被公开。该前体肽尤其在N端包含21个氨基酸的信号序列，被称为“肾上腺髓质素原前体”(pre-proADM)。Pre-proADM包含185个氨基酸。成熟ADM示出为SEQ ID No.4，且ADM-Gly示出为SEQ No.5。

成熟肾上腺髓质素(ADM)肽为包含52个氨基酸(SEQ ID No:4)的酰胺肽，它包含pre-proADM的通过蛋白水解切割形成的氨基酸95-146。迄今为止，切割pre-proADM形成的肽片段中的基本上仅少数片段得到较为精确的表征，特别是生理活性肽肾上腺髓质素(ADM)和“PAMP”，其为包含在pre-proADM中信号肽的21个氨基酸后的20个氨基酸(22-41)的肽。对于ADM和PAMP，已发现了生理活性亚片段并进行了更为详尽的研究。1993年对ADM的发现和表征引发了广泛的研究活动和大量的出版物，其结果最近被总结于多种综述文章中，在本说明书的上下文中，特别引用在致力于ADM的“肽”议题中发现的文章(Peptides 22(2001))，尤其是(2)和(3)。另外的综述为(4)。在迄今为止的科学研究中，尤其发现ADM可被认为是多功能调控肽。它被释放至通过甘氨酸延伸的失活形式的循环中(5)。还有结合蛋白(6)，其为ADM特异性的并且可能同样地调节ADM的影响。

在迄今为止的研究中首要的ADM以及PAMP的那些生理效应为影响血压的效应。因此，ADM是有效的血管扩张剂，可能可以将低压效应特别与是ADM的C端部分中的肽片段相关联。

此外还发现从pre-proADM形成的上述另外的生理活性肽PAMP同样显示低压效应，即使其看起来具有不同于ADM的作用机制(除了上述综述文章(3)和(4)外，还参见(7)、(8)或(9)和(10))。

此外还发现在循环和其他生物流体中能够测量的ADM在许多病理状态下的浓度，显著高于在健康对照人体中发现的浓度。因此，患有充血性心力衰竭、心肌梗死、肾病、高压病症、糖尿病、休克急性期及败血症和败血性休克的患者的ADM水平显著增加，尽管程度不同。在一些所述病理状态下PAMP浓度也增加，但相对于ADM血浆水平降低((3)；第1702页)。

此外还已知，异乎寻常的高浓度ADM可在败血症或败血性休克中观察到(参见(3)和(11)、(12)、(13)、(14)和(15))。该发现与被认为是患有败血症和其他严重综合征如SIRS的患者的疾病进程的典型现象的典型的血液动力学变化有关。

尽管假定ADM和PAMP由相同的前体肽pre-proADM形成，其中对应于这些肽的氨基酸序列作为等摩尔量的部分肽存在，生物流体中可测量的ADM或PAMP的浓度明显不同。这没有什么异常。

因此，完全相同的前体肽的不同降解产物的可测浓度可能不同，例如，因为它们为不同竞争性降解途径的结果，例如其在不同病理状态情况下引起前体肽不同的片段化并因此产生不同的降解产物。前体肽中包含的某些部分肽可形成为游离肽或者可能不形成，和/或不同的肽以不同的方式和不同的量形成。即使仅采用单一降解途径来处理前体肽，并因此所有降解产物来源于完全相同的前体肽且必然主要以等摩尔量自身形成，生物流体中可测量的不同部分肽和片段的稳态浓度可能截然不同，即例如，当其中的个别组分在各自的生物流体中以不同的速率形成和/或具有不同的个别稳定性(使用期)时，或者如果它们基于不同的清除机制和/或以不同的清除率从循环中去除时。

肾上腺髓质素在败血症发展((16),(17))以及在众多急性和慢性疾病((18),(4))中起着关键作用。

已描述了数种测量ADM的循环水平的方法：直接ADM或间接通过确定其同源前体肽的更稳定的片段。最近，公开了一种方法，其描述了用于测量循环中成熟ADM的测定法(DiSomma S,Magrini L,Travaglino F,Lalle I,Fiotti N,Cervellin G,Avanzi GC,LupiaE,Maisel A,Hein F et al:Opinion paper on innovative approach of biomarkersfor infectious diseases and sepsis management in the emergencydepartment.Clinical chemistry and laboratory medicine:CCLM/FESCC 2013:1-9)。

描述了定量来源于ADM前体的片段的其他方法，例如，测量MR-proADM(Morgenthaler NG,Struck J,Alonso C,Bergmann A.Clin Chem.2005 Oct；51(10):1823-9.)、PAMP(Washimine H,Kitamura K,Ichiki Y,Yamamoto Y,Kangawa K,Matsuo H,EtoT.Biochem Biophys Res Commun.1994 Jul 29；202(2):1081-7.)、CT-proADM(EP211552)。可获取用于测量MR-proADM的商业测定法(BRAHMS MR-proADM KRYPTOR；BRAHMS GmbH,Hennigsdorf,Germany)(Clin Biochem.2009 May；42(7-8):725-8.doi:10.1016/j.clinbiochem.2009.01.002.Epub 2009 Jan 23)。

用于在完全自动化的系统B.R.A.H.M.S KRYPTOR上测量血浆中的中间区域肾上腺髓质素原的同质时间分辨的荧光测定法(Caruhel P,Mazier C,Kunde J,MorgenthalerNG,Darbouret B.)。因为这些肽以化学计量比从相同的前体产生，其血浆水平在某一程度上相互关联。

仅在一些研究中，测量了患有全身炎症、败血症、严重败血症或败血性休克的患者的血浆ADM，并将这些水平与血液动力学参数相关联。

在Hirata等的研究中，发现败血症患者的血浆ADM与心率、右动脉压而非平均动脉压(MAP)相关(Hirata Y,Mitaka C,Sato K,Nagura T,Tsunoda Y,Amaha K,Marumo F:Increased circulating adrenomedullin,a novel vasodilatory peptide,insepsis.The Journal of clinical endocrinology and metabolism 1996,81(4):1449-1453)。

Nishio等报道ADM增加的血浆浓度与患有败血症休克的患者的血管紧张度的松弛相关(与心脏指数、心搏容量指数、心率、舒张压降低、全身血管阻力指数和肺血管阻力指数相关)，但与平均血压无显著相关性[19]。

在健康的对象中，在运动下，发现了血浆ADM与MAP的显著负相关[20]。

关于在发生休克的患者中循环ADM或作为pro-ADM或其片段的相关肽的水平与对流体复苏和血管加压剂的需要的关联还一无所知。这是未被满足的医疗需求，因为血管加压剂通常在非常晚，当患者的病况非常严重时给予。对在患者的病况非常严重之前鉴定需要流体复苏和血管加压剂的那些患者的医疗需求还未被满足。对早于通过应用65mm Hg的临界值的血压测量(如指导中所建议的[21])，预测对流体复苏和血管加压剂疗法的需要的医疗需求还未被满足。如果血压下降，这将引起氧供应减少、器官功能障碍和死亡。因此，对早期鉴定存在发生血压下降风险的患者的需求还未被满足。如果这样的患者能够尽早确定，可以应用平均动脉压的其他例如较高临界值来开始流体复苏和血管加压剂疗法。较高的阈值-水平为<70mm Hg，优选<75mm Hg。这意味着治疗在已大于65mmHg开始。

本发明的主题为鉴定需要流体复苏或给予血管加压剂的对象的体外方法，包括以下步骤：

·将所述水平与所述对象或患者对流体复苏或给予血管加压剂的需要相关联，其中如果所述对象的体液中proADM和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平大于阈值，则所述对象或患者被鉴定为存在这样的需要。

在根据本发明的方法的一个实施方案中，所述对象具有大于65mm Hg额平均动脉压。此外，所述对象可具有小于75mmg Hg的平均动脉压，在另一实施方案中，平均动脉压<70mmg Hg。

在本发明的一个实施方案中，所述方法为早期鉴定流体复苏或给予血管加压剂的方法，其中较早意味着早于通过应用65mmg Hg的临界值的血压测量或在血压降至65mmg Hg之前。

一个特定的实施方案中，根据本发明的体液为血液样本。血液样本可选自全血、血清和血浆。

在本发明的具体实施方案中，所述proADM和/或其具有至少6个氨基酸的片段选自：

SEQ ID No.1(proADM):164个氨基酸(preproADM的22-185)

SEQ ID No.2(肾上腺髓质素原N-20末端肽):肽22-41

ARLDVASEF RKKWNKWALS R

SEQ ID No.3(中间区肾上腺髓质素原,MR-proADM):肽45-92

ELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RV

SEQ ID No.4(成熟肾上腺髓质素(成熟ADM)；酰胺化的):肽95-146-CONH₂

YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGY-CONH2

SEQ ID No.5(肾上腺髓质素1-52-Gly(ADM 1-52-Gly)):肽95-147

YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYG

SEQ ID No.6(C端肾上腺髓质素原,CT-proADM):肽148-185RRR RRSLPEAGPGRTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL

在本发明的具体实施方案中，所述proADM和/或其具有至少6个氨基酸的片段选自：成熟ADM(SEQ ID No.4)和/或成熟ADM 1-52-Gly(SEQ ID No.5)和MR-proADM(SEQ IDNo.3)和CT-proADM(SEQ ID No.6)。

在本发明的具体实施方案中，确定了成熟ADM(SEQ ID No.4)和/或成熟ADM 1-52-Gly(SEQ ID No.5)–免疫反应性水平或者MR-proADM(SEQ ID No.3)免疫反应性水平或CT-proADM(SEQ ID No.6)免疫反应性水平，并将所述水平与所述患者对流体复苏或血管加压剂给药的需要相关联，其中如果所述对象的体液中成熟ADM(SEQ ID No.4)和/或成熟ADM1-52-Gly(SEQ ID No.5)–免疫反应性水平或者MR-proADM(SEQ ID No.3)免疫反应性水平或CT-proADM(SEQ ID No.6)免疫反应性水平大于阈值，则所述患者被鉴定为具有这样的需要。

在本发明的具体实施方案中，通过使用选自以下的至少一种结合剂来确定pro-ADM和/或其片段的水平：与包含于以下序列中的区域结合的结合剂：成熟ADM(SEQ IDNo.4)和/或成熟ADM 1-52-Gly(SEQ ID No.5)，以及与包含于成熟ADM(SEQ ID NO.4)和/或成熟ADM 1-52-Gly(SEQ ID No.5)的序列中的区域结合的第二结合剂。

在本发明的具体实施方案中，通过使用选自以下的至少一种结合剂来确定pro-ADM和/或其片段的水平：与包含于MR-proADM(SEQ ID No.3)的序列中的区域结合的结合剂，以及与包含于MR-proADM(SEQ ID No.3)的序列中的区域结合的第二结合剂。

在本发明的具体实施方案中，通过使用选自以下的至少一种结合剂来确定pro-ADM和/或其片段的水平：与包含于CT-proADM(SEQ ID No.6)的序列中的区域结合的结合剂，以及与包含于CT-pro ADM(SEQ ID No.6)的序列中的区域结合的第二结合剂。

在本发明的具体实施方案中，使用测定法来确定proADM和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平，其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康对象的ADM，并且<70pg/ml，优选<40pg/ml，且更优选<10pg/ml。

在本发明的具体实施方案中，所述结合剂显示与proADM和/或其片段的至少10⁷M^-1，优选10⁸M^-1的结合亲和力，优选的亲和力为大于10⁹M^-1，最优选大于10¹⁰M^-1。本领域技术人员了解可以考虑通过施用较高剂量的化合物来补偿较低的亲和力，并且这一措施不会超出本发明的范围。

为了确定抗体对肾上腺髓质素的亲和力，借助无标记的表面等离子体共振，使用Biacore 2000系统(GE Healthcare Europe GmbH,Freiburg,Germany)来确定肾上腺髓质素与固定的抗体的结合动力学。使用以高密度与CM5传感器表面共价结合的抗小鼠Fc抗体，根据厂商的指导(小鼠抗体捕获试剂盒；GE Healthcare)，进行抗体的可逆固定(22)。

在本发明的具体实施方案中，所述结合剂选自与proADM和/或其片段结合的抗体或抗体片段或非Ig支架。

在本发明的具体实施方案中，使用测定法来确定proADM和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平，其中这样的测定法为夹心式测定法(sandwich assay)，优选完全自动化的测定法。

在本发明的一个实施方案中，它可以是所谓的POC-测试(即时(point-of-care)测试)，这是一项允许在少于1小时内，在患者附近进行测试，而无需完全自动化的测定系统的测试技术。这样的技术的一个实例为免疫层析测试技术。

在本发明的一个实施方案中，这样的测定法为使用任何种类的检测技术的夹心式免疫测定法，包括但不限于酶标记、化学发光标记、电化学发光标记，优选完全自动化的测定法。在本发明的一个实施方案中，这样的测定法为酶标记的夹心式测定法。自动化或完全自动化的测定法的实例包括可用于以下系统中的一种的测定法：Roche

Abbott

Siemens

Brahms

Alere

多种免疫测定方法是已知的，并且可用于本发明的测定法和方法，这些包括：放射免疫测定(“RIA”)、均质酶-多重免疫测定(“EMIT”)、酶联免疫吸附测定(“ELISA”)、脱辅酶再活化免疫测定(“ARIS”)、量油尺免疫测定和免疫-层析测定。

在本发明的具体实施方案中，所述两种结合剂中的至少一种被标记以便检测。

优选的检测方法包括多种形式的免疫测定方法，如放射免疫测定(RIA)、化学发光-免疫测定和荧光-免疫测定、酶联免疫测定(ELISA)、基于Luminex的珠子测定、蛋白微阵列测定和快速测试形式，如免疫层析试纸条测试。

在优选的实施方案中，所述标记选自化学发光标记、酶标记、荧光标记、放射碘标记。

测定法可为均质的或异质的测定法、竞争性的和非竞争性的测定法。在一个实施方案中，所述测定法为夹心式测定形式，其为非竞争性的免疫测定方法，其中待检测和/或定量的分子与第一抗体和第二抗体结合。所述第一抗体可与固相如珠子、孔井或其他容器表面、芯片或试纸条结合，以及所述第二抗体为用例如染料、放射性同位素或者反应性或催化活性部分标记的抗体。然后通过合适的方法测量与分析物结合的经标记的抗体的量。涉及“夹心式测定”的通用组成和操作程序是成熟的，且为技术人员所知(23)。

在另一实施方案中，所述测定法包含两种捕获分子，优选抗体，两者均在液体反应混合物中作为分散体存在，其中第一标记组分与第一捕获分子结合，其中所述第一标记组分为基于荧光-或化学发光-淬灭或放大的标记系统的一部分，并且所述标识系统的第二标记组分与第二捕获分子结合，使得在两种捕获分子与分析物结合后，产生可测量的信号，其允许在包含样本的溶液中检测形成的夹心式复合物的。

在另一实施方案中，所述标记系统包含与荧光染料或化学发光染料，特别是花青类型染料组合的稀土穴状化合物或稀土螯合物。

在本发明的上下文中，基于荧光的测定法包括使用染料，其可以选自例如FAM(5-羧基荧光素或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、IRD-700/800、花青染料如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7、咕吨(Xanthen)、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素(HEX)、TET、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)、6-羧基-X-若丹明(ROX)、5-羧基若丹明-6G(R6G5)、6-羧基若丹明-6G(RG6)、若丹明、若丹明绿、若丹明红、若丹明110、BODIPY染料，如BODIPY TMR、俄勒冈绿、香豆素如伞形花内酯、苯甲亚胺类，如Hoechst 33258；菲啶，如德克萨斯红、雅基马黄(YakimaYellow)、Alexa Fluor、PET、溴乙菲啶、吖啶染料、咔唑染料、吩恶嗪染料、紫菜碱染料、聚甲炔染料等。

在本发明的上下文中，基于化学发光的测定法包括基于(24)中描述的化学发光物质的物理原理使用染料。优选的化学发光染料为吖啶酯

如本文所提及的，“测定法”或“诊断测定法”可以是诊断领域应用的任何类型。这样的测定法可以基于待检测分析物与具有一定亲和力的一种或多种捕获探针的结合。关于捕获分子与靶标分子或感兴趣的分子之间的相互作用，亲和常数优选大于10⁸M^-1。

在本发明的上下文中，“结合剂分子”为可以用于结合来自样本的靶标分子或感兴趣的分子即分析物(即，在本发明的上下文中，PCT及其片段)的分子。因此，结合剂分子的形状必须在空间上和在表面特征方面(如表面电荷、疏水性、亲水性、路易斯供体和/或受体(lewis donors and/or acceptors)的有无)充分适合以特异性结合靶标分子或感兴趣的分子。据此，例如，所述结合可通过捕获分子与靶标分子或感兴趣的分子之间的离子、范德华力、π-π、σ-π、疏水或氢键相互作用或者上述相互作用中的两种或更多种的组合而介导。在本发明的上下文中，结合剂分子可以选自例如核酸分子、糖类分子、PNA分子、蛋白、抗体、肽或糖蛋白。优选地，所述结合剂分子为抗体，包括其与靶标或感兴趣的分子具有足够亲和力的片段，并且包括重组抗体或重组抗体片段，以及所述抗体或其来源于具有至少12个氨基酸长度的可变链的片段的化学和/或生物化学修饰的衍生物。

化学发光标记可为吖啶酯标记、类固醇标记，包括异鲁米诺标记，等等。

酶标记可以为乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CPK)、碱性磷酸酶、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、酸性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等。

在本发明的一个实施方案中，所述两种结合剂中的至少一种与作为磁性粒子的固相和聚苯乙烯表面结合。

在本发明的具体实施方案中，所述两种结合剂中的至少一种与固相结合。

在本发明的一个实施方案中，测量的血浆或血液样本中的ADM或其片段的浓度范围为10-500pg/ml。

利用描述的ADM测定法，如实施例中所概述的(或者分别为proADM或其片段测定法)分别确定本发明的ADM水平或proADM水平或其片段。在其他ADM测定法(或者分别为proADM或其片段测定法)中上述值可能是不同的，这取决于其校准方式。相应地，考虑进校准差异，上述值应当适用于此类不同校准的ADM测定法。可以通过经由正常范围(健康群体)的关联和调整而校准ADM测定(或者分别为proADM或其片段测定)。可选地，可商购的对照样本可用于调整不同的校准(ICI Diagnostics,Berlin,Germany)。

利用描述的ADM测定法，正常群体的中值确定为24.7pg/mL。

在本发明的具体实施方案中，应用90pg/ml，优选70pg/ml的血浆ADM阈值。

在本发明的具体实施方案中，应用0.9nmol/L，优选0.7nmol/L的血浆MR-proADM阈值。

在本发明的具体实施方案中，应用1.0nmol/L，优选0.8nmol/L的血浆CT-proADM阈值。

如果血浆ADM或血浆MR-proADM或血浆CT-proADM的水平大于上述阈值，则该个体可能需要用血管加压剂治疗。

在本发明的具体实施方案中，所述样本选自人柠檬酸盐血浆、肝素血浆、EDTA血浆、全血。

可能需要流体复苏或血管加压剂治疗的对象可患有选自以下的病况：存在发展如下文更详细描述的生理休克状况，以及感染、SIRS、败血症、心力衰竭、心肺骤停、心脏术后、右室梗死、心动过缓、多发性创伤、烧伤、肾损伤风险的患者。

这类休克可由以下引起：

·严重出血。

·肺栓塞(肺部血凝块)。

·严重呕吐和腹泻。

·脊髓损伤。

·中毒。

还有特定类型的生理休克，其具有非常特别的症状。

心源性休克：

心源性休克在以下情况下发生：心脏严重受损，例如由于重大心脏病发作，并且不再能够恰当地将血液泵送至全身，造成非常低的血压。这在约8％的心脏病发作后出现。心源性休克的治疗可能是困难的，但可以给予药物来使心脏更强搏动。这可能足以挽救一些人脱离生命危险，直到心脏能够自我修复，但心源性休克仍然在多达80％的情况下是致命的。“血运重建(revascularise)”或恢复心肌血流的新的治疗正在改善存活率。

败血性休克：

这在大量的细菌感染造成血压下降时发生。其在超过50％的病例中是致命的。尽管败血性休克是由细菌感染引起的，但它却远非用抗生素治疗那样简单，因为细菌在其被杀死时释放大量的毒素，这首先使得休克更为严重。它必须一直在可给予恰当的药物和流体支持的医院内治疗。一种类型的败血性休克为中毒性休克综合征-一种由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的某些菌株引起的罕见但严重的疾病。

过敏性休克:

过敏性休克是严重的过敏反应。常见的诱因包括蜜蜂和黄蜂叮刺、坚果、甲壳类动物、蛋类、乳胶和某些药物，包括亲霉素。症状包括：

·嘴唇和舌头的发热和肿胀。

·呼吸困难(如同哮喘发作)。

·皮肤发红、发痒或起泡，打喷嚏。

·流眼泪。

·恶心。

·焦虑。

过敏需要院内紧急治疗。存在风险的人应当一直携带包含肾上腺素的紧急过敏治疗套装。

败血症及其升级形式(严重败血症、败血性休克)仍然为主要的医疗问题，其死亡率为30％-70％。尽管支持性护理取得了进展，仅美国每年仍有750,000人发展败血症，且225,000人死亡，并且败血症的发生率以每年1.5％-8％的速率上升[4-6]。为了挽救败血症患者的生命，必须首先及时通过抗生素或其他措施对抗感染性刺激物，其次要及时识别状况的升级，例如当严重败血症进展为败血性休克时，因为仅在这时能够尽早开始合适的血管加压剂疗法。任何延迟都将增加患者死亡的风险。

在进展为败血性休克的患者中建议启动流体复苏或血管加压剂/强心剂(inotrope)治疗的病况描述于Surviving Sepsis Campaign(败血症生存运动)[3]的指南中：它建议对未对初始的流体复苏作出反应的低压施用血管加压剂从而维持≥65mm Hg的平均动脉压(MAP)。该指南还讲述了在何时优先施用哪种血管加压剂/强心剂。当前的共同观点为：去甲肾上腺素为血管加压剂的第一选择。当需要另外的试剂来维持足够的血压时，肾上腺素(添加至并且可能替代去甲肾上腺素)。可将加压素0.03单位/分钟添加至去甲肾上腺素(NE)，旨在增加MAP或降低NE剂量(UG)。通常而言，临床实践中目前使用的血管加压剂和强心剂为[7,8]：

儿茶酚胺类(多巴胺、多巴酚丁胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、异丙肾上腺素、苯肾上腺素)、磷酸二酯酶III抑制剂(米力农、氨力农)、加压素、左西孟旦。

另外，其他血管活性化合物正在研发中，诸如例如Selepressin，一种选择性的加压素V1a受体激动剂[9]和抗肾上腺髓质素抗体。

已研究了其他化合物，但这些治疗可获取的临床数据很少，并且在较大的试验中获得了这些方法的相当模棱两可的结果[10]。这些为NOS(NG-单甲基-L-精氨酸[13,14])和cGMP(亚甲蓝[15,16])的ATP依赖性的K⁺通道(格列本脲；[11,12])的抑制剂。

血管加压剂和强心剂临床上用于治疗和预防多种生理休克类型，以及心血管疾病(充血性心力衰竭、心肺骤停、心脏术后、右室梗死、心动过缓)[7]。

因为一直会监测出现危险状况的患者的血压，从临床角度而言，具有大于各自阈值的值如高ADM(>70pg/ml)而未出现血管加压剂需要的患者应当通过调整决定点从<66mmHg MAP至例如<75mmHg而进行血管加压剂治疗，旨在尽早支持循环从而保护患者免于低血压相关的器官功能障碍和随后的高死亡率。对于>70pg/ml ADM的患者，使用这一规则并且在MAP<＝75mmHg时用血管加压剂治疗，患者(第3组)将在标准的护理治疗(<＝66mmHg)前治疗平均1.6天。

因此，在本发明的具体实施方案中，如果所述对象的体液中proADM和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平大于阈值，并且如果所述患者具有<＝75mmHg的MAP但优选>66mmHg，更优选>70mmHg的MAP，则所述患者被鉴定为具有血管加压剂给药的需要。

在本发明的具体实施方案中，应用90pg/ml，优选70pg/ml的血浆ADM的阈值，和/或所述患者具有<＝75mmHg MAP但优选>66mmHg，更优选>70mmHg MAP。

在本发明的具体实施方案中，应用0.9nmol/L，优选0.7nmol/L的血浆MR-proADM阈值，和/或所述患者具有<＝75mmHg MAP但优选>66mmHg，更优选>70mmHg MAP。

在本发明的特定实施方案中，使用1.0nmol/L，优选0.8nmol/L的血浆CT proADM的阈值，和/或所述患者具有<＝75mmHg MAP，但优选>66mmHg，更优选>70mmHg MAP。

如果血浆ADM或血浆MR-proADM或血浆CT proADM的水平大于所述阈值和/或如果患者具有<＝75mmHg MAP但优选>66mmHg，更优选>70mmHg的MAP，此人可能需要用血管加压剂治疗。

补液或流体复苏是补充通过出汗、出血、流体转移或如上文所述的其他病理过程而出现的体液流失的医疗实践。可通过经口给予(饮用)、静脉内给予、经直肠或通过皮下灌注(直接注射流体至皮下组织)来进行补液。通过经口和皮下途径给予的流体相比经静脉给予的那些吸收更慢。口服补液疗法(ORT)对于与腹泻，特别是肠胃炎/胃肠病变如霍乱或轮状病毒引起的那些相关的脱水而言是简单的治疗方法。ORT由经口摄入的盐和糖的溶液组成。

在严重脱水中，静脉补液是优选的，并且可以救命。它在细胞内空间和血管空间中存在流体消耗的情况下尤其有效。

在由于任何上述病况引起的流体耗损中，也提示补液。

根据本发明的抗体为蛋白，其包含基本上由免疫球蛋白基因编码的、特异性结合抗原的一个或多个多肽。已识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA)、γ(IgG1,IgG2,IgG3,IgG4)、δ(IgD)、ε(IgE)和μ(IgM)恒定区域基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白轻链通常为约25Kd或214个氨基酸长度。全长免疫球蛋白重链通常为约50Kd或446个氨基酸长度。轻链由NH₂-端的可变区基因(约110个氨基酸长度)和COOH-端的κ或λ恒定区基因编码。重链类似地由可变区基因(约116个氨基酸长度)和其他恒定区基因中的一个编码。

抗体的基本结构单元通常为四聚物，其由两对相同的免疫球蛋白链组成，每对具有一条轻链和一条重链。在每对中，轻链和重链可变区与抗原结合，并且恒定区介导效应器功能。免疫球蛋白还以多种其他形式存在，包括例如Fv、Fab和(Fab')2，以及双功能杂合抗体和单链(例如，Lanzavecchia et al.,Eur.J.Immunol.17:105,1987；Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:5879-5883,1988；Bird et al.,Science 242:423-426,1988；Hood et al.,Immunology,Benjamin,N.Y.,2nd ed.,1984；Hunkapiller and Hood,Nature 323:15-16,1986)。免疫球蛋白轻链或重链可变区包含由3个高变区，也称为互补决定区(CDR)隔开的框架区(参见，Sequences of Proteins of Immunological Interest,E.Kabat et al.,U.S.Department of Health and Human Services,1983)。如上文所示，CDR主要负责与抗原的表位结合。免疫复合物为特异性与抗原结合的抗体，如单克隆抗体、嵌合抗体、人源化的抗体或人抗体，或功能抗体片段。

嵌合抗体为这样的抗体，其轻链和重链基因通常通过遗传改造从属于不同物种的免疫球蛋白可变区和恒定区基因构建而来。例如，可将来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区节段与人恒定区节段如κ和γ1或γ3连接。因此，在一个实例中，治疗性嵌合抗体为由来自小鼠抗体的可变或抗原结合结构域和来自人抗体的恒定或效应器结构域组成的杂合蛋白，但也可使用其他哺乳动物物种，或者可通过分子技术制备可变区。制备嵌合抗体的方法为本领域熟知，例如参见美国专利第5,807,715号。“人源化的”免疫球蛋白为包含人框架区域以及一个或多个来自非人的(如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。可提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，并且可提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施方案中，所有CDR均来自人源化的免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。恒定区域不必存在，但如果它们存在，则必须基本上与人免疫球蛋白恒定区相同，即至少约85-90％，诸如约95％或更高的同一性。因此，人源化的免疫球蛋白除可能的CDR外的所有部分，基本上与天然人免疫球蛋白序列的相应部分相同。“人源化的抗体”为包含人源化的轻链和人源化的重链免疫球蛋白的抗体。人源化的抗体与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原。人源化的免疫球蛋白或抗体的受体框架可以具有有限数目的取自供体框架的氨基酸取代。人源化的或其他单克隆抗体可具有额外的保守氨基酸取代，其对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本上无影响。示例性的保守取代为诸如gly、ala；val、ile、leu；asp、glu；asn、gln；ser、thr；lys、arg；和phe、tyr的那些。可通过遗传改造(例如，参见美国专利第5,585,089号)的方式构建人源化的免疫球蛋白。人抗体为其中轻链和重链基因为人来源的抗体。可使用本领域已知的方法产生人抗体。可通过将分泌目标抗体的人B细胞永生化而制备人抗体。可通过例如EBV感染或通过将人B细胞与骨髓瘤或杂交瘤细胞融合而产生三源杂交瘤(trioma)细胞来实现永生化。人抗体还可以通过噬菌体展示方法(参见，例如Dower et al.,PCT公开第WO91/17271号；McCafferty et al.,PCT公开第WO92/001047号；和Winter,PCT公开第WO92/20791号)来制备，或选自人组合单克隆抗体文库(参见Morphosys网站)。也可通过使用携带人免疫球蛋白基因的转基因动物来制备人抗体(例如，参见Lonberg et al.,PCT公开第WO93/12227号；和Kucherlapati,PCT公开第WO91/10741号)。

因此，抗体可具有本领域已知的形式。实例为人抗体、单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、CDR接枝的抗体。在优选实施方案中，本发明的抗体为重组产生的抗体如IgG(一种典型的全长免疫球蛋白)或包含至少重链和/或轻链的F-可变域的抗体片段，如化学偶联的抗体(片段抗原结合)，包括但不限于Fab-片段，包括Fab小抗体、单链Fab抗体、具有表位标签的单价Fab抗体，如Fab-V5Sx2；与CH3结构域二聚化的二价Fab(小抗体)；二价Fab或多价Fab，如在异源结构域的帮助下通过多聚化，例如通过dHLX结构域的二聚化而形成的，例如Fab-dHLX-FSx2；F(ab‘)2-片段、scFv-片段、多聚化的多价或/和多特异性scFv-片段、二价和/或双特异性双体、

(双特异性T-细胞连接物)、三功能抗体、多价抗体，如来自不同于G的类型的；单结构域抗体，例如来源于骆驼或鱼免疫球蛋白的纳米抗体及众多其他类型。

除了抗体，其他生物聚合物支架在本领域熟知复合靶标分子，并且已被用于产生具有高度靶标特异性的生物聚合物。实例为适配子、镜像体(spiegelmer)、anticalin和芋螺毒素(conotoxin)。

在优选的实施方案中，抗体形式选自Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab片段、(Fab)2片段和scFv-Fc融合蛋白。在另一优选的实施方案中，抗体形式选自scFab片段、Fab片段、scFv片段及其生物利用度优化的缀合物，如PEG化的片段。一种最优选的形式为scFab形式。

非Ig支架可为蛋白支架并且可用作抗体模拟物，因为它们能够结合配体或抗基因(antigene)。非Ig支架可选自基于四连接素的非Ig支架(例如，US 2010/0028995中描述的)、纤连蛋白支架(例如，EP 1266025中描述的)；基于lipocalin的支架((例如，WO 2011/154420中描述的)；泛素支架(例如，WO 2011/073214中描述的)、转移支架(例如，US 2004/0023334中描述的)、蛋白A支架(例如，EP 2231860中描述的)、基于锚蛋白重复的支架(例如，WO 2010/060748中描述的)、微蛋白，优选形成胱氨酸结的微蛋白)支架(例如，EP2314308中描述的)、基于Fyn SH3结构域的支架(例如，WO 2011/023685中描述的)、基于EGFR-A结构域的支架(例如，WO 2005/040229中描述的)和基于Kunitz结构域的支架(例如，EP 1941867中描述的)。

在本发明的一个实施方案中，可按如下方式制备根据本发明的抗体：

在第0和14天用ADM-100μg肽-BSA缀合物(乳化于100μl完全弗氏佐剂中)免疫Balb/c小鼠，并在第21和28天用50μg(于100μl不完全弗氏佐剂中)免疫。在进行融合实验前3天，动物接受溶于100μl盐水中的50μg缀合物，作为一次腹膜内和一次静脉内注射给药。

将来自免疫的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞与1ml50％聚乙二醇在37℃下融合30s。在洗涤后，将细胞接种于96孔细胞培养板中。通过在HAT培养基[RPMI 1640培养基，补充有20％胎牛血清和HAT-补充物]中生长来选择杂交克隆。两周后，将HAT培养基用HT培养基替换三代，然后回复至正常细胞培养基。

在融合后3周，初步筛选细胞培养上清液的抗原特异性的IgG抗体。将测试阳性的微量培养物转移至24孔板用于繁殖。再次测试后，将选择的培养物克隆，并使用有限稀释技术再次克隆，并确定同种型(还参见Lane,R.D.(1985).A short-duration polyethyleneglycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas.J.Immunol.Meth.81:223-228；Ziegler,B.et al.(1996)Glutamate decarboxylase(GAD)is not detectable on the surface of rat isletcells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediatedcytotoxicity of monoclonal GAD antibodies,Horm.Metab.Res.28:11-15)。

可通过噬菌体展示的方式，根据以下程序产生抗体：

使用人初始(naive)抗体基因文库HAL7/8来分离针对肾上腺髓质素肽的重组单链F-可变域(scFv)。使用淘选策略筛选抗体基因文库，包括使用肽，其包含经由两种不同的间隔子与肾上腺髓质素肽序列连接的生物素标签。将使用非特异性结合抗原和链霉亲和素结合的抗原的淘选循环混合用于将非特异性结合剂的背景最小化。将从淘选的第三个循环洗脱的噬菌体用于产生表达单克隆scFv的大肠杆菌菌株。将来自这些克隆菌株的培养的上清液直接用于抗原ELISA测试(参见Hust,M.,Meyer,T.,Voedisch,B.,Rülker,T.,Thie,H.,El-Ghezal,A.,Kirsch,M.I.,Schütte,M.,Helmsing,S.,Meier,D.,Schirrmann,T.,Dübel,S.,2011.A human scFv antibody generation pipeline for proteomeresearch.Journal of Biotechnology 152,159–170；Schütte,M.,Thullier,P.,Pelat,T.,Wezler,X.,Rosenstock,P.,Hinz,D.,Kirsch,M.I.,Hasenberg,M.,Frank,R.,Schirrmann,T.,Gunzer,M.,Hust,M.,Dübel,S.,2009.Identification of a putativeCrf splice variant and generation of recombinant antibodies for the specificdetection of Aspergillusfumigatus.PLoS One 4,e6625)。

可根据以下程序进行鼠抗体的人源化：

对于鼠来源抗体的人源化，分析了抗体序列的框架区域(FR)与互补决定区(CDR)及抗原的结构相互作用。基于结构建模，选择了合适的人来源的FR，并将鼠CDR序列移植于人FR中。可以引入CDR或FR的氨基酸序列的变异以重新获得结构相互作用，其通过FR序列的物种转换被消除。结构相互作用的这一恢复可通过使用噬菌体展示文库的随机方法，或经由通过分子建模指导的定向方法来实现(参见Almagro JC,Fransson J.,2008.Humanization of antibodies.Front Biosci.2008 Jan 1；13:1619-33)。

本发明的另一主题为用于治疗需要流体复苏或血管加压剂给药的对象的血管加压剂，其中所述对象根据任何上述体外方法(包括所述体外方法的所有实施方案)进行鉴定。

附图说明

图1:

图1显示了典型的ADM剂量/信号曲线。以及在100μg/mL抗体NT-H存在下的ADM剂量信号曲线。

图2

预测院内死亡率–来自逻辑回归(logistic regression)的结果

图3

预测院内死亡率–ADM独立于Apache且提供额外的预后信息

图4

依赖于血浆ADM水平的平均动脉压。示出了获自患者入院时的值的散点图和相关系数。统计显著性为p<0.0001。

图5

入院时需要血管加压剂疗法的患者相对于不需要血管加压剂疗法的患者的肾上腺髓质素浓度。两组间的差异具有统计学意义(p<0.0001)。

图6

在入院时用血管加压剂治疗(“ADM时(on ADM)”)、在入院后的前4天不需要血管加压剂疗法(“从不(never)”)和在入院后的前4天需要但在入院当天不需要血管加压剂疗法(“随后(later)”)的入院患者的ADM浓度。在图中，指示了ADM浓度的正常范围。

图7

需要(灵敏度)和不需要(特异性)血管加压剂疗法的急性心力衰竭患者的ADM浓度的受试者操作特征(ROC)曲线。曲线下面积为0.75(p<0.0001)。

实施例1

抗体制备及其亲和常数的确定

我们开发了与ADM的N端、中间区和C端部分结合的小鼠单克隆抗体，并确定了其亲和常数(表1)。

用于免疫的肽

肽由JPT Peptide Technologies GmbH(Berlin,Germany)提供。使用Sulfo-SMCC交联方法将肽与BSA偶联。根据厂商的指导(Thermo Fisher/Pierce)进行交联程序。

根据以下方法制备鼠抗体：

以100μg肽-BSA缀合物在第0和14天(乳化于100μl完全弗氏佐剂中)，且在第21和28天以50μg(于100μl不完全弗氏佐剂中)免疫Balb/c小鼠。在进行融合实验前3天，动物接受溶于100μl盐水中的50μg缀合物，其作为为一次腹膜内和一次静脉内注射给予。

用1ml 50％聚乙二醇将来自免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞在37℃下融合30s。洗涤后，将细胞接种于96孔细胞培养板中。通过在HAT培养基[RPMI 1640培养基，补充有20％胎牛血清和HAT-补充物]中生长来选择杂交克隆。2周后，将HAT培养基用HT培养基替换3代，然后回复至正常细胞培养基。

融合后3周初步筛选细胞培养上清液的抗原特异性IgG抗体。将测试阳性的微量培养物转移至24孔板用于繁殖。在重新测试后，将选择的培养物克隆，并使用有限稀释技术再克隆，以及确定同种型。

(Lane,R.D.“A short-duration polyethylene glycol fusiontechnique forincreasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas”,J.Immunol.Meth.81:223-228；(1985),Ziegler,B.et al.“Glutamate decarboxylase(GAD)is not detectable on the surface of rat islet cells examined bycytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity ofmonoclonal GAD antibodies”,Horm.Metab.Res.28:11-15,(1996))。

表1：

单克隆抗体制备

通过标准抗体制备方法(Marx et al.,Monoclonal antibody Production,ATLA25,121,1997)制备抗体，并通过蛋白A纯化。基于SDS凝胶电泳分析的抗体纯度为>95％。

亲和常数

为了确定抗体对肾上腺髓质素的亲和力，通过无标记的表面等离子体共振的方式，使用Biacore 2000系统(GE Healthcare Europe GmbH,Freiburg,Germany)确定肾上腺髓质素与固定的抗体结合的动力学。根据厂商的指导(小鼠抗体捕获试剂盒；GEHealthcare)，使用以高密度与CM5传感器表面共价结合的抗小鼠Fc抗体，进行抗体的可逆固定。

标记程序(示踪物)：将100μg(100μl)的抗体(1mg/ml于PBS中,pH 7.4)与10μl吖啶NHS-酯(1mg/ml于乙腈中,InVent GmbH,Germany)混合(57)，并在室温下孵育20min。通过在Bio-

SEC400-5(Bio-Rad Laboratories,Inc.,USA)上进行凝胶过滤HPLC来纯化标记的CT-H。将纯化的经标记的抗体稀释于(300mmol/L磷酸钾,100mmol/L NaCl,10mmol/L Na-EDTA,5g/L牛血清白蛋白,pH 7.0)中。终浓度为每200μL约800.000相对光单位(RLU)的经标记的化合物(约20ng经标记的抗体)。通过使用AutoLumat LB 953(Berthold TechnologiesGmbH&Co.KG)来测量吖啶酯化学发光。

固相：用抗体((1.5μg抗体/0.3mL 100mmol/L NaCl,50mmol/L TRIS/HCl,pH7.8)包被聚苯乙烯管(Greiner Bio-One International AG,Austria)(18h，室温下)。在用5％牛血清白蛋白封闭后，用PBS,pH 7.4 洗涤管子并真空干燥。

校准物：使用pH为7.8的50mM Tris/HCl,250mM NaCl,0.2％Triton X-100,0.5％BSA,20tab/L蛋白酶cOmplete蛋白酶抑制剂混合物片(Roche AG)线性稀释合成的人ADM(Bachem,Switzerland)。使用前将校准物储存于-20℃。

实施例2

确定产生高信噪比的抗体组合

ADM免疫测定：

将50μl样本(或校准物)吸取至包被的管中，在添加标记的二抗(200μl)后，将管在室温下孵育2h。通过用洗涤溶液(20mM PBS,pH 7.4,0.1％Triton X-100)洗涤5次(每次1ml)去除未结合的示踪物。

通过使用LB 953测量与管结合的化学发光

将所有抗体在夹心式免疫测定中用作包被管和标记的抗体，并在以下变型中组合(表2)：

按在hADM-免疫测定下描述的进行孵育。结果以特异性信号(以10ng/ml ADM)/背景(无ADM的样本)信号的比给出。

表2：

信噪比	NT-ADM示踪物	MR-ADM示踪物	CT-ADM示踪物
				NT-ADM	/	195	241
MRADM	204	/	904
				CT-ADM	260	871	/

令人吃惊地，我们发现MR-ADM与CT-ADM的组合为最高信噪比组合。

随后，我们将该抗体组合用于进一步研究。我们使用MR-ADM作为固相抗体并使用CT-ADM作为标记的抗体。典型的剂量/信号曲线示出于图1中。测定的分析灵敏度(10次运行，无ADM的样本的平均值+2SD)为2pg ADM/ml。

实施例3

人肾上腺髓质素的稳定性：

将人ADM溶于人柠檬酸盐血浆(n＝5,终浓度10ng ADM/ml)中，并在24℃下孵育。在选定的时间点，将等分试样冷冻于-20℃。在解冻样本后，立即通过使用上述的hADM免疫测定法定量hADM。

表3显示了人血浆中的hADM在24℃下的稳定性。

令人吃惊地，在夹心式免疫测定法中使用抗体组合MR-ADM和CT-ADM，分析物的分析前稳定性较高(仅0.9％/h的平均免疫反应性丢失)。相比之下，使用其他测定方法，报道了仅22min的血浆半衰期(Hinson 2000)。因为医院日常工作中从取样至分析的时间小于2h，使用的ADM检测方法适合常规诊断。值得注意的是，不需要向样本添加任何非常规添加物(如抑肽酶,(20))来实现可接受的ADM-免疫反应稳定性。

实施例4

校准物制备物的重复性。

我们发现制备用于ADM测定的校准物的结果的高变异性(平均CV 8.5％，参见表4)。这可能是由于hADM对塑料和玻璃表面的高吸附导致的(还参见(58)。通过添加洗涤剂(高达1％Triton X 100或1％ Tween 20)、蛋白(高达5％BSA)和高离子强度(高达1M NaCl)或以上物质的组合，仅轻微降低这一效应。令人吃惊地，如果将剩余的抗ADM抗体(10μg/ml)添加至校准物稀释缓冲液，ADM测定校准物-制备物的回收和重复性大幅提高至<1％的制备物间CV(表4)。

幸运地，N端抗体的存在不影响通过MR和C端抗体(图1)组合产生的ADM-信号。

表4：

校准物的制备物间变异。

按上文所述制备有或无10μg/ml的NT-ADM-抗体的ADM测定校准物。从5次独立的制备过程给出变异系数。使用上述ADM测定法来测量校准物。s/n-r＝信噪比。

对于所有下述研究，我们基于在示踪物缓冲液中补充的10μg/ml的NT-ADM抗体和10μg/ml的NT-ADM抗体存在下制备的校准物使用了ADM测定法。

实施例5

灵敏度

测定灵敏度的目标是完全覆盖健康对象的ADM浓度。

健康对象中的ADM浓度：

使用ADM测定法测量健康对象(n＝100,平均年龄56岁)。中位数为24.7pg/ml，最低值为11pg/ml，且第99百分位数为43pg/ml。因为测定灵敏度为2pg/ml，使用描述的ADM测定法，100％的所有健康对象都是可检测的。

使用商业测定法测量MR-proADM(BRAHMS MR-proADM KRYPTOR)(BRAHMS GmbH,Hennigsdorf,Germany)(ClinBiochem.2009May；42(7-8):725-8.doi:10.1016/j.clinbiochem.2009.01.002.Epub 2009 Jan 23。

在完全自动化的系统B.R.A.H.M.S KRYPTOR.Caruhel P,Mazier C,Kunde J,Morgenthaler NG,Darbouret B)上的均质时间分辨荧光免疫测定用于测量血浆中的中间区肾上腺髓质素原。

实施例6

临床研究

满足败血症定义(Dellinger RP,Levy MM,Carlet JM,Bion J,Parker MM,Jaeschke R,Reinhart K,Angus DC,Brun-Buisson C,Beale R et al:Surviving SepsisCampaign:international guidelines for management of severe sepsis and septicshock:2008.Critical care medicine 2008,36(1):296-327)的101名ED患者随后入院治疗(平均住院5天)，并接受标准的护理治疗。从第1天(ED就诊)起生成EDTA-血浆，且在住院期间每天一份样本。用于随后的ADM-测量的样本冷冻时间为少于4h。

患者特征概述于表5中

表5:

全部患者的26.7％在住院期间死亡并计算为治疗非响应者，全部患者的73.3％从败血症中存活并计算为治疗响应者。

66％的出现败血症的所有患者具有非正常ADM值>43pg/ml(第99百分位数)，指示ADM并非感染的标志物。

临床研究结果

初始ADM具有高预后价值。

我们将初始ADM值与院内死亡率相关联，并将ADM与APACHE 2评分比较。ADM对败血症结果具有高预后价值(参见图2)，且与APACHE 2评分相当。如果组合ADM和APACHE 2产生明显增加的信息(图3)。

治疗监测中的ADM。

基于标准护理疗法治疗患者(表5)。平均住院时间为5天。院内每天测量ADM(第1天＝入院)，并将其与院内死亡率相关联(表6)。住院期间ADM发生变化，并且在第5天期间的变化将预后值提高了52％，从初始的Chi²的19.2增加至29.2。

对于以ADM浓度>70pg/ml开始的患者，使用70pg/ml的ADM的简单临界值模型显示68％的死亡风险，并且整个住院期间保持>70pg/ml(治疗非响应者)。在所有时间具有ADM值<70pg/ml或从>70pg/ml进展为<70pg/ml的患者具有仅11％的死亡率(良好治疗的/治疗响应者)，以及出现ADM值>70pg/ml且在住院治疗期间其ADM浓度降至值<70pg/ml的患者具有0％的死亡率。在院内治疗期间没有患者从<70pg/ml发展至>70pg/ml。产生所有患者的响应者/非响应者信息所需的平均时间为约1天。住院期间响应治疗的>70pg/ml-患者需要约2天来指示通过ADM的治疗成功。

表6

血浆ADM与平均动脉压(MAP)的关系及对血管加压剂疗法的需要

我们发现了ADM浓度与平均动脉压(图4)及对用于治疗/预防休克的血管加压剂疗法的需要的显著相关性(图5)。

我们还研究了ADM浓度及对血管加压剂疗法的需要的时态关系(图6)：在研究的101名患者中，已有18名在入院时需要血管加压剂疗法；这些患者入院时的中值ADM浓度为129pg/mL。在其入院后前4天的住院期间从不需要血管加压剂疗法的患者(n＝79)，具有48.5pg/mL的中值ADM浓度。重要的是，在其入院后的住院期间需要血管加压剂疗法的患者入院时已具有升高的ADM水平(中值87.2pg/mL)，例如：血浆ADM浓度的升高早于血管加压剂治疗。

在血浆样本中，还测量了MR-proADM-ADM前体分子的稳定片段。MR-proADM已被提议为成熟ADM释放的替代标志物(Struck J,Tao C,Morgenthaler NG,Bergmann A:Identification of an Adrenomedullin precursor fragment in plasma of sepsispatients.Peptides 2004,25(8):1369-1372,Morgenthaler NG,Struck J,Alonso C,Bergmann A:Measurement of midregional proadrenomedullin in plasma with animmunoluminometric assay.Clinical chemistry 2005,51(10):1823-1829)。根据厂商(BRAHMS GmbH,Hennigsdorf,Germany)的说明书使用商业MR-proADM测定(BRAHMS MR-proADM KRYPTOR)。不需要血管加压剂疗法的患者入院当天的中值水平为0.63nmol/L，需要血管加压剂疗法的患者为1.57nmol/L。MR-proADM的浓度与ADM浓度显著相关(r＝0.79)。

实施例7

诊断和预测对血管加压剂需要的临界值分析。

患者数据参见实施例6。基于败血症患者急诊单元就诊期间采集的抽取首份血液抽取进行分析。

选择70pg/ml的临界值，<70pg/ml指示低风险的血管加压剂需要，且>70pg/ml指示高风险的血管加压剂需要。第1组为不需要血管加压剂(MAP<＝66mmHg)或者在就诊时或在4天随后期间未接受血管加压剂的患者。第2组为具有血管加压剂需要(MAP<＝66mmHg)或在就诊时接受了血管加压剂的患者。第3组为无血管加压剂需要或者在就诊时未接受血管加压剂但在4天随后期间发展出血管加压剂需要的患者。排除丢失了关于血管加压剂治疗的信息的患者(n＝2)。

表7

	<70pg/ml ADM	>70pg/ml ADM
				第1组	56	15	79％特异性
第2组	3	18	89.5％灵敏度
				第3组	2	5	71％正确分类

使用70pg/ml的简单的截止值分析，通过ADM鉴定了89.5％的所有在ED就诊时需要血管加压剂的患者(第2组)。有20名患者>70pg/ml在就诊时不具有血管加压剂需要(组1/3)，有15名(75％)在4天的随后期间未产生血管加压剂需要，并且有5名(25％)患者在4天的随后期间产生血管加压剂需要。相反，如果在就诊时无血管加压剂需要的患者ADM为<70pg/ml(组1/3)，56名(96.5％)在4天的随后期间未产生血管加压剂需要，并且仅2名(3.5％)产生血管加压剂需要。具有大于70pg/ml的ADM值的患者在接下来的4天产生血管加压剂需要的风险为具有小于70pg/ml的ADM水平的患者的7.1倍高(25％相对于3.5％)。

因为一直监测血压，从临床观点而言，在就诊时具有高ADM(>70pg/ml)而无血管加压剂需要的患者应当通过将决定点从<66mmHg MAP调整至例如<75mmHg来进行血管加压剂治疗，旨在尽早支持循环，从而保护患者免于低血压相关的器官功能障碍和随后的高死亡率。使用这一规则，对于>70pg/ml ADM且在MAP<＝75mmHg下用血管加压剂治疗的患者，患者(第3组)将在标准的护理治疗(<＝66mmHg)前治疗平均1.6天。

当在分析中使用具有0.78noml/L的临界值的MR-proADM而非ADM时，获得了类似的结果。

表8

实施例8

临床研究/急性心力衰竭

募集的患者为进入急诊科的患急性心力衰竭的患者。患者特征：均值±SD年龄74.3±12.2y；n＝1022(643名男性，63％)；先前的缺血性心脏病31％，高血压58％，糖尿病33％，心力衰竭35％。患者随访2年。在入院当天获得用于测量ADM和其他分析物的血浆样本。

Cox分析揭示出ADM为1年死亡(表9)和由于急性失代偿型心力衰竭的1年死亡/住院治疗(表10)的独立预测因子。逻辑回归分析揭示出ADM为院内死亡的独立预测因子(表11)。

需要血管加压剂治疗(强心剂)的患者具有显著高于所有其他患者的ADM浓度(曲线下面积＝0.75；p<0001；图7)。

表9

表10

表11

参考文献

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序列表

<110> SphingoTec GmbH

<120> 用于指导血压下降疗法的肾上腺髓质素

<130> B75036WO

<150> EP 13 160 265.8

<151> 2013-03-20

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 164

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp

1 5 10 15

Ala Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro

20 25 30

Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg

35 40 45

Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro

50 55 60

Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn

65 70 75 80

Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val

85 90 95

Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp

100 105 110

Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr Gly Arg Arg

115 120 125

Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly Arg Thr Leu Val Ser

130 135 140

Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro Pro Ser Gly Ser Ala

145 150 155 160

Pro His Phe Leu

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp

1 5 10 15

Ala Leu Ser Arg

20

<210> 3

<211> 48

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys

1 5 10 15

Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala

20 25 30

Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val

35 40 45

<210> 4

<211> 52

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys

1 5 10 15

Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln

20 25 30

Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser

35 40 45

Pro Gln Gly Tyr

50

<210> 5

<211> 53

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys

1 5 10 15

Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln

20 25 30

Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser

35 40 45

Pro Gln Gly Tyr Gly

50

<210> 6

<211> 38

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 6

Arg Arg Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly Arg Thr Leu

1 5 10 15

Val Ser Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro Pro Ser Gly

20 25 30

Ser Ala Pro His Phe Leu

35

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 7

Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys

1 5 10 15

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 8

Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln

1 5 10

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 9

Cys Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr

1 5 10

Claims

1.至少一种结合剂在制备用于鉴定处于发生生理休克状况的风险的患者以便为启动流体复苏或血管加压剂治疗提供指导的试剂或试剂盒中的用途，其中所述结合剂用于确定所述患者的体液中proADM(SEQ ID No.1)和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平，其中所述片段选自：MR-proADM(SEQ ID No.3)、成熟的ADM(SEQ ID No.4)、成熟的ADM 1-52-Gly(SEQ ID No.5)和CT-proADM(SEQ ID No.6)；以及

将所述水平与所述患者发生生理休克状况的风险相关联，其中如果所述患者的体液中proADM(SEQ ID No.1)和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平大于阈值，则所述患者被鉴定为具有这样的风险。

2.如权利要求1所述的用途，其中成熟ADM(SEQ ID No.4)免疫反应性水平和/或成熟ADM 1-52-Gly(SEQ ID No.5)免疫反应性水平、或MR-proADM(SEQ ID No.3)免疫反应性水平、或CT-proADM(SEQ ID No.6)免疫反应性水平被确定并与所述患者发生生理休克状况的风险相关联，其中如果所述患者的体液中成熟ADM(SEQ ID No.4)免疫反应性水平和/或成熟ADM 1-52-Gly(SEQ ID No.5)免疫反应性水平、或MR-proADM(SEQ ID No.3)免疫反应性水平、或CT-ADM(SEQ ID No.6)免疫反应性水平大于阈值，则所述患者被鉴定为具有这样的风险。

3.如权利要求1所述的用途，其中所述至少一种结合剂选自以下：与包含在成熟ADM(SEQ ID No.4)和/或成熟ADM 1-52-Gly(SEQ ID No.5)序列中的区域结合的结合剂，以及与包含在成熟ADM(SEQ ID No.4)和/或成熟ADM 1-52-Gly(SEQ ID No.5)序列中的区域结合的第二结合剂。

4.如权利要求1所述的用途，其中所述至少一种结合剂选自以下：与包含在MR-proADM(SEQ ID No.3)序列中的区域结合的结合剂，以及与包含在MR-proADM(SEQ ID No.3)序列中的区域结合的第二结合剂。

5.如权利要求1所述的用途，其中所述至少一种结合剂选自以下：与包含在CT-proADM(SEQ ID No.6)序列中的区域结合的结合剂，以及与包含在CT-proADM(SEQ ID No.6)序列中的区域结合的第二结合剂。

6.如权利要求1-5任一项所述的用途，其中使用测定法来确定所述proADM(SEQ IDNo.1)和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平，其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康对象的ADM，并且<70pg/ml。

7.如权利要求1-5任一项所述的用途，其中使用测定法来确定所述proADM(SEQ IDNo.1)和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平，其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康对象的ADM，并且<40pg/ml。

8.如权利要求1-5任一项所述的用途，其中使用测定法来确定所述proADM(SEQ IDNo.1)和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平，其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康对象的ADM，并且<10pg/ml。

9.如权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述结合剂显示与所述proADM(SEQ IDNo.1)和/或其具有至少6个氨基酸的片段的至少10⁷M^-1的结合亲和力。

10.如权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述结合剂选自：与所述proADM(SEQ IDNo.1)和/或其具有至少6个氨基酸的片段结合的抗体或抗体片段或非-Ig支架。

11.如权利要求1-5中任一项所述的用途，其中使用测定法来确定所述proADM(SEQ IDNo.1)和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平，其中所述测定法为夹心式测定法。

12.如权利要求1-5中任一项所述的用途，其中使用测定法来确定所述proADM(SEQ IDNo.1)和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平，其中所述测定法为完全自动化的测定法。

13.如权利要求3-5中任一项所述的用途，其中所述两种结合剂中的至少一种被标记以便检测。

14.如权利要求3-5中任一项所述的用途，其中所述两种结合剂中的至少一种与固相结合。

15.如权利要求1-5中任一项所述的用途，其中应用了90pg/ml的ADM阈值。

16.如权利要求1-5中任一项所述的用途，其中应用了70pg/ml的ADM阈值。

17.如权利要求1-5中任一项所述的用途，其中应用了0.9nmol/L的MR-proADM(SEQ IDNo.3)阈值。

18.如权利要求1-5中任一项所述的用途，其中应用了0.7nmol/L的MR-proADM(SEQ IDNo.3)阈值。

19.如权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述体液选自：人柠檬酸盐血浆、肝素血浆、EDTA血浆、全血、血清。

20.如权利要求1-5中任一项所述的用途，其中如果所述患者的体液中所述proADM(SEQID No.1)和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平大于阈值，并且如果患者具有>66mmHg的平均动脉压(MAP)，则所述患者被鉴定为具有这样的风险。

21.如权利要求1-5中任一项所述的用途，其中如果所述患者的体液中所述proADM(SEQID No.1)和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平大于阈值，并且如果患者具有>70mmHg的平均动脉压(MAP)，则所述患者被鉴定为具有这样的风险。

22.如权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述结合剂用于确定所述患者的体液中所述proADM(SEQ ID No.1)和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平；以及

独立于患者的平均动脉压，将所述水平与所述患者发生生理休克状况的风险相关联，其中如果所述患者的体液中proADM(SEQ ID No.1)和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平大于阈值，则所述患者被鉴定为具有这样的风险。

23.如权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述结合剂用于确定所述患者的体液中所述proADM(SEQ ID No.1)和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平；以及

将所述水平与需要将所述患者的平均动脉压的干预阈值增加至70mm Hg，从而开始流体复苏或血管加压剂疗法相关联，其中如果所述患者的体液中proADM(SEQ ID No.1)和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平大于阈值，则所述患者被鉴定为具有这样的需要。

24.如权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述结合剂用于确定所述患者的体液中所述proADM(SEQ ID No.1)和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平；以及

将所述水平与需要将所述患者的平均动脉压的干预阈值增加至75mm Hg，从而开始流体复苏或血管加压剂疗法相关联，其中如果所述患者的体液中proADM(SEQ ID No.1)和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平大于阈值，则所述患者被鉴定为具有这样的需要。

25.如权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述结合剂用于确定所述患者的体液中所述proADM(SEQ ID No.1)和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平；以及

将所述水平与需要将所述患者的平均动脉压的干预阈值增加至80mm Hg，从而开始流体复苏或血管加压剂疗法相关联，其中如果所述患者的体液中proADM(SEQ ID No.1)和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平大于阈值，则所述患者被鉴定为具有这样的需要。

26.权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述患者显示以下迹象或患有以下病况：生理休克状态包括败血症休克、心源性休克和过敏性休克，感染，败血症，心力衰竭，心肺骤停，心脏术后，右室梗死，心动过缓，多发性创伤，烧伤，肾损伤。