JP6855118B2

JP6855118B2 - 全身状態の良不良を評価するための情報を提供する方法及び測定試薬

Info

Publication number: JP6855118B2
Application number: JP2017048568A
Authority: JP
Inventors: 和雄北村; 勇男恒吉; 豊明丸田; 剛大田尾; 浩二五十嵐; 怜史島本
Original assignee: University of Miyazaki; Tosoh Corp
Current assignee: University of Miyazaki; Tosoh Corp
Priority date: 2017-03-14
Filing date: 2017-03-14
Publication date: 2021-04-07
Anticipated expiration: 2037-03-14
Also published as: JP2018151295A

Description

本発明は検体中のアドレノメデュリン類を測定することによる侵襲的治療介入あるいは臓器障害などの患者の全身状態の良不良を評価するための情報を提供する方法および測定試薬に関する。

集中治療を要する患者や侵襲的治療介入を行う患者において全身状態の病状把握手段として臓器障害指標であるＳＯＦＡスコア（ＳｅｑｕｅｎｔｉａｌＯｒｇａｎＦａｉｌｕｒｅＡｓｓｅｓｍｅｎｔＳｃｏｒｅ）や、ＡＰＡＣＨＥスコア（ＡｃｕｔｅＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＣｈｒｏｎｉｃＨｅａｌｔｈＥｖａｌｕａｔｉｏｎＳｃｏｒｅ）が用いられている。ＳＯＦＡスコアやＡＰＡＣＨＥスコアは複数のパラメーターから算出されるスコアリング方法であり、ＳＯＦＡスコアは呼吸器を酸素比（ＰａＯ２／ＦｉＯ２）、凝固系を血小板数、肝機能をビリルビン値、心血管系を血圧やエピネフリン投与量、中枢神経をＧｌａｓｇｏｗＣｏｍａＳｃａｌｅ、腎機能をクレアチニンもしくは尿量にて、それぞれ５段階に分類しスコアリングする。さらにＧｌａｓｇｏｗＣｏｍａＳｃａｌｅは開眼機能、言語機能、運動機能からなる３機能のスコアリングの合計値をもってなされる。ＡＰＡＣＨＥスコアはさらに複数のパラメーターからスコアリングがなされる。また、これらスコアの一部等を用いた簡易的な全身状態の把握手段として、ｑＳＯＦＡスコアやカテコールアミンインデックス等も利用されている。これらスコアの算出は極めて煩雑であり、集中管理下の状態では可能であるが、一般病棟においては困難であること、終日経時的にスコアを算出することはさらに困難であること、重症の患者においては治療介入により全身状態を反映しないスコアになること等の問題があり、簡便にＳＯＦＡスコア等に置き換わる、あるいは匹敵するような全身状態の良不良を評価可能な簡便に測定可能な診断マーカーが切望されている。

ＳＯＦＡスコアが用いられる代表的な疾患として敗血症があげられる。２０１６年敗血症の定義が世界的に改められＳＯＦＡスコアと関連づけられた。それまで敗血症マーカーとしての位置づけはＳＩＲＳ（ＳｙｓｔｅｍｉｃｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙＲｅｓｐｏｎｓｅＳｙｎｄｒｏｍｅ）と敗血症の弁別に重きをおかれていたが、現在ＳＯＦＡスコアの変動が重視される。血清マーカーとしてプロカルシトニン、プレセプシン、アドレノメデュリン（非特許文献１，２）、中間領域プロアドレノメデュリン（非特許文献３，４）が敗血症で濃度上昇する報告がある。また一般的な炎症マーカーであるＣＲＰやＩＬ−６なども敗血症で濃度上昇することが知られている。しかし、これらマーカーとＳＯＦＡスコアの変動との関連性に関しての詳細に検討された報告はない。

アドレノメデュリンは北村らによりヒト褐色細胞腫組織から発見された血管拡張性ペプチドであり、５２個のアミノ酸からなり、最終的にＣ末端がアミド化され生理活性を有した成熟型アドレノメデュリンとなる（非特許文献５、特許文献１）。ヒトアドレノメデュリン前駆体は１８５個のアミノ酸からなり、Ｎ末端側より２１アミノ酸からなるシグナルペプチド、２０個のアミノ酸からなるプロアドレノメデュリン（ＰＡＭＰ）、５４アミノ酸からなる中間領域プロアドレノメデュリン（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）、５２アミノ酸からなるアドレノメデュリン（以下、ＡＭと記載する場合もある。配列番号１に記載のアミノ酸配列から成るもの）、３８アミノ酸からなるＣ末端アドレノメデュリンの構成である。ＡＭは前駆体であるｐｒｅｐｒｏＡＭからプロセッシングを受け切断された後、Ｃ末端にグリシンが付加した状態の中間体アドレノメデュリン（以下、ｉＡＭと記載する場合もある。配列番号１に記載のアミノ酸配列のＣ末端にグリシン（Ｇｌｙ）が付加したもの）を経て、アミド化酵素によりＣ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）の成熟型アドレノメデュリン（以下、ｍＡＭと記載する場合もある。配列番号１に記載のアミノ酸配列のＣ末端がアミド化（−ＣＯＮＨ２）したもの）となる。ＰＡＭＰならびにｍＡＭはそのセレプターを介した生理活性を有することから、血清中での消失が通常の代謝に加えレセプターによる取込みにより極めて短い特徴を有している。ＡＭの生理活性は血行動態改善、臓器保護作用、抗炎症作用、組織再生等の報告があるが未だ不明な点も多い。またアドレノメデュリンは、血中半減期が極めて短いことから血清マーカーとしての利用が困難（非特許文献６，７）とされていた。血清中のＡＭ濃度が変動する疾患としては、敗血症、心疾患、炎症性腸疾患等の報告があるがＳＯＦＡスコアの変動を鋭敏に反映し変動することを示す報告はない。

特開平７−１９６６９３号公報

Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．１９９７；２５：９５３−９５７Ｊ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ．２０１７；３８：６８−７２ＩｎｔｅｎｓｉｖｅＣａｒｅＭｅｄ．２０１３；３９：１９４５−１９５２ＭｉｎｅｒｖａＭｅｄｉｃａ２０１６；８２：７６０−７６６Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９３；１９２：５５３−５６０Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．１９９７；８２：９５−１００Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９８；４４：５７１−５７７

これまでにアドレノメデュリンが敗血症で濃度上昇することは多くの報告があるが、敗血症以外でＳＯＦＡスコアとアドレノメデュリンの関連性に関する報告はないこと、また時間単位で変動するＳＯＦＡスコアの変動を鋭敏に反映する報告はなかった。本発明はアドレノメデュリン類濃度を測定することにより、集中治療を要する患者や侵襲的治療介入を行う患者において全身状態を簡便に判定する方法を提供することにある。

本発明者らは、全身状態の症状が短時間で大きく変動する各種手術事例において、手術介入に伴う経時的なＳＯＦＡスコアと各種パラメーターを解析した結果、アドレノメデュリン類（以下、ＡＭ類と記載する場合もある）が最も良好な相関性を示し、さらに時間単位で変動するＳＯＦＡスコアを鋭敏に反映することを見いだし、本発明に到達した。即ち本発明は下記の発明を包含する。

（１）侵襲的治療介入を受ける動物の全身状態の良不良を評価するための情報を提供する方法であって、
前記動物に由来する検体中のアドレノメデュリン類を測定すること、及び
前記アドレノメデュリン類の測定値と前記動物の全身状態の良不良との関連付けをすること、
を含む方法。
（２）敗血症以外の全身状態の良不良を評価する、（１）に記載の方法。
（３）ＳＯＦＡスコア、ＡＰＡＣＨＥスコア、又はｑＳＯＦＡスコアにより全身状態の良不良を評価する、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）アドレノメデュリン類が配列番号１記載のアミノ酸配列を含む、（１）〜（３）いずれかに記載の方法。
（５）アドレノメデュリン類が、配列番号１に記載のアミノ酸配列から成るアドレノメデュリン、中間体アドレノメデュリン、又は成熟型アドレノメデュリンである、（１）〜（４）いずれかに記載の方法。
（６）アドレノメデュリン類が、アドレノメデュリン部分ペプチドである、（１）〜（４）いずれかに記載の方法。
（７）アドレノメデュリン類が、配列番号１に記載のアミノ酸配列から成るアドレノメデュリン、中間体アドレノメデュリン、成熟型アドレノメデュリン、及びアドレノメデュリン部分ペプチドである、（１）〜（６）いずれかに記載の方法。
（８）アドレノメデュリン類が、成熟型アドレノメデュリンおよびその部分ペプチドである、（１）〜（６）いずれかに記載の方法。
（９）アドレノメデュリン類を認識する抗体を用いて免疫化学的方法により測定する、（１）〜（１０）いずれかに記載の方法。
（１０）アドレノメデュリン類を認識する抗体を含有することを特徴とする、（１）〜（９）いずれかに記載の方法に使用するための測定試薬。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。

本発明において、侵襲的治療介入とは特に限定されるものではないが、例えば手術等を上げることができる。

本発明において用いられる検体は侵襲的治療介入を受ける動物に由来するものであるが、特に限定はなく、ヒト由来の検体が好ましい。また検体としては、血液成分等をあげることができ、その中でも全血、血球、血漿などが好ましく、血清、血漿が更に好ましい。また、検体採取後のアドレノメデュリン（ＡＭ）類の分解を抑える目的で消化酵素阻害剤を添加する、あるいは添加された採血管を使用することが好ましい。

本発明において、全身状態の良不良を評価するとは、良／不良の二者を識別し評価するだけでなく、良〜不良間の程度を評価することも含まれるものである。

本発明の方法により、侵襲的治療介入を受ける動物の全身状態の良不良を評価するための情報が提供される。そして医師等は、提供された情報等を参照して、全身状態の良不良を評価する。即ち本発明の方法自体は、全身状態の良不良に関する最終的な判断行為は含まず、医師等に判断材料を提供する段階までを含むものである。

また本発明の方法は、敗血症以外において全身状態の良不良を評価するための情報を提供するのに好ましいものである。

また評価に際しては、ＳＯＦＡスコア、ＡＰＡＣＨＥスコア、又はｑＳＯＦＡスコアにより全身状態の良不良を評価することが好ましく、特にＳＯＦＡスコアにより評価することが更に好ましい。

本発明において、測定されるアドレノメデュリン類には特に限定はないが、配列番号１記載のアミノ酸配列を含むものが好ましい。また配列番号１に記載のアミノ酸配列から成るアドレノメデュリン、中間体アドレノメデュリン、又は成熟型アドレノメデュリンを測定することも好ましく、特に成熟型アドレノメデュリンを測定することが更に好ましい。一方、アドレノメデュリン類として、アドレノメデュリン部分ペプチドを測定してもよい。このアドレノメデュリン部分ペプチドとは、配列番号１に記載のアミノ酸配列から成るアドレノメデュリン、中間体アドレノメデュリン、又は成熟型アドレノメデュリンなどのアドレノメデュリン類がペプチダーゼなどにより分解を受けた部分ペプチドのことを意味する。

さらにアドレノメデュリン類として、配列番号１に記載のアミノ酸配列から成るアドレノメデュリン、中間体アドレノメデュリン、成熟型アドレノメデュリン、及びアドレノメデュリン部分ペプチドを測定する、即ちこれらすべてを測定対象とすることも好ましく、本発明ではこれらの合計量をｔＡＭ（ｔｏｔａｌＡＭを意味する）と記載する場合もある。またアドレノメデュリン類として、成熟型アドレノメデュリンおよびその部分ペプチドを測定することも好ましいものである。

以上のように測定対象のアドレノメデュリン類には種々のものがあるが、なかでも成熟型アドレノメデュリン（ｍＡＭ）又はｔＡＭを測定することが、本発明の方法においては特に好ましいものである。

本発明において上述のようなＡＭ類を測定する方法には特に限定はないが、例えばこれらを認識する抗体を用いた免疫化学的方法があげられる。より具体的には、測定対象のＡＭ類を認識する抗体を含有する試薬を用いて行うことができる。このとき、例えば測定対象のＡＭ類を認識する固相化抗体と、それとは異なる部位で測定対象のＡＭ類を認識する標識化抗体を利用した試薬を用いて、サンドイッチ法により行うことができる。このときの標識としては、酵素等があげられる。なお、ｔＡＭの測定方法及びｍＡＭの測定方法は、Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．１９９７；２５：９５３−９５７、およびＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９９；４５：２４４−２５１に記載の抗体を用いて作製された、Ｅｎｄｏ．Ｃｏｎｎｅｃｔ．２０１５；４：４３−４９に記載の測定法により、測定可能である。

本発明により、様々な手術例において術前、手術直後、術後１時間、２時間と短時間の中でＳＯＦＡスコアの変動に伴い鋭敏にＳＯＦＡスコアの変化を追随し、ＳＯＦＡスコアの変動を反映する診断マーカーを探索した結果、アドレノメデュリン類が極めて優れていることを見いだした。

アドレノメデュリン類は血中半減期が短いことから、採血時点でのリアルタイムの全身状態の良不良を反映すると考えられる。結果として全身状態の悪化、ならびに改善を鋭敏に反映するマーカーであると推察される。

また本発明により、ｔＡＭ又はｍＡＭを経時的に２点以上測定した場合、その濃度変動が一定値ごとに（即ち、ｔＡＭの濃度変動約２．２ｐｍｏｌ／Ｌごとに、又はｍＡＭの濃度変動約０．１８ｐｍｏｌ／Ｌごとに）ＳＯＦＡスコアが１ポイント変動することが明らかとなった。このようにｔＡＭ又はｍＡＭは、ＳＯＦＡスコアの変動を反映する優れたマーカーである。

本発明によれば、検体中のアドレノメデュリン類を測定することにより、全身状態の良不良の程度を判定するための情報を提供することが可能である。本発明の測定試薬を用い測定を実施すれば、短時間でアドレノメデュリン類を定量可能であり、リアルタイムで全身状態を把握することが可能であり、集中治療室においても簡便、低コストで検査可能な試薬を提供することができる。

ＳＯＦＡスコアごとのｔＡＭの濃度分布を示す箱ひげ図である。箱ひげ図の表示は典型的表記であり、具体的には中央の箱は２５−７５パーセンタイルと中央値を示しており、上限下限の各棒線は７５および２５パーセンタイル値の１．５倍以上のデータを除く最大値、最小値を示しており、他の箱ひげ図も同様である。ＳＯＦＡスコアごとのｍＡＭの濃度分布を示す箱ひげ図である。ＳＯＦＡスコアごとのＰｒｅｓｅｐｓｉｎの濃度分布を示す箱ひげ図である。ＳＯＦＡスコアごとのＩＬ−６の濃度分布を示す箱ひげ図である。ＳＯＦＡスコアごとのＣＲＰの濃度分布を示す箱ひげ図である。ＳＯＦＡスコアごとのＷＢＣの濃度分布を示す箱ひげ図である。ＳＯＦＡスコアごとの各パラメーターの弁別能をＲＯＣ解析した際のＡＵＣを示す図である。ＳＯＦＡスコア５以上の各パラメーターの弁別能の比較結果をＲＯＣ曲線で示す図である。ＳＯＦＡスコア９以上の各パラメーターの弁別能の比較結果をＲＯＣ曲線で示す図である。３例の患者における術前（Ｂ）、術後０時間（０ｈ）、１時間（１ｈ）、２時間（２ｈ）後の各パラメーターの変動を示す図である。ｔＡＭのＳＯＦＡスコア弁別能をＲＯＣ解析した際のカットオフ値を示した図である。各ＳＯＦＡスコアのｔＡＭカットオフ値を１次回帰した際の相関式ならびに相関係数を示している。ｍＡＭのＳＯＦＡスコア弁別能をＲＯＣ解析した際のカットオフ値を示した図である。各ＳＯＦＡスコアのｍＡＭカットオフ値を１次回帰した際の相関式ならびに相関係数を示している。

以下に実施例を示すが、本発明は実施例に記載された例に限られるものではない。以下の実験を行うに当たっては、各施設の研究倫理委員会での承認のもと実施した。ｔＡＭ測定ならびにｍＡＭ測定は、前述のＣｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．１９９７；２５：９５３−９５７、およびＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９９；４５：２４４−２５１に記載の抗体を用いて作製された、Ｅｎｄｏ．Ｃｏｎｎｅｃｔ．２０１５；４：４３−４９に記載の測定法により、自動免疫測定装置ＡＩＡシリーズ（東ソー社製）を用い実施した。

実施例１：患者背景と検体数
様々な手術対象者（心臓手術、弓部大動脈人工血管置換術部分切除術、冠動脈バイパス移植術、胸部大動脈人工血管置換術、肝部分切除、膵頭部十二指腸切除術、食道亜全摘手術、頸椎椎弓形成術）に対し、手術前、手術直後（０ｈ）、術後１時間後（１ｈ）、２時間後（２ｈ）の各点にて採血を実施し、各種パラメーターを測定しその変動の確認を行った。症例により採血できなかったものもあり、採血ポイントでの検体数は表１に示す通りである。パラメーターとして、ＳＯＦＡスコア、ｔＡＭ、ｍＡＭ、Ｐｒｅｓｅｐｓｉｎ、ＩＬ−６（インターロイキン６）、ＣＲＰ（Ｃ反応性ペプチド）、ＷＢＣ（白血球数）を測定した。

実施例２：ＳＯＦＡスコアとの相関性
実施例１の検体において、術例に関わらずＳＯＦＡスコアに対する各パラメーターの相関性（Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓｒｈｏ）を検証した。表２に示す通り、ＳＯＦＡスコアとＣＲＰ間では相関性が認められないものの、他のパラメーターは有意差をもって相関性を示した。ｔＡＭならびにｍＡＭにおいては順位相関係数がそれぞれ０．７７１、０．７５５と良好な相関性を示すものであった。

実施例３：ＳＯＦＡスコアごとの各パラメーターの分布
実施例１の検体において、ＳＯＦＡスコアごとの各パラメーターの濃度あるいは数量の分布を図１、図２、図３、図４、図５、図６に示す。ＳＯＦＡスコアごとの例数はＳＯＦＡスコア０／１／２／３／４／５／６／７／８／９／１０／１１それぞれ８／２５／８／１０／８／８／１６／７／８／７／３／３検体の計１１１検体である。

実施例４：各パラメーターのＳＯＦＡスコア診断能比較
実施例１の検体において、それぞれのＳＯＦＡスコアの弁別能をＲＯＣ（ＲｅｃｅｉｖｅｒＯｐｅｒａｔｉｎｇＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）解析によりＡＵＣ（曲線下面積）にて比較した。例えばＳＯＦＡスコア５以上の弁別能の検証ではＳＯＦＡスコアが４以下を陰性群、５以上を陽性群としＲＯＣ解析を行った。その結果を図７に示す。なお横軸は、当該スコア以上の弁別能の検証を行ったものである。ＳＯＦＡスコア１から１１までの全域を通してｔＡＭが最も優れたＡＵＣを示し０．８７４以上を示した。続いてｍＡＭが優れたＡＵＣを示し０．８２１以上を示した。ＡＵＣ一覧を表３に示す。またＳＯＦＡスコア５以上のＲＯＣ解析図ならびにＳＯＦＡスコア９以上のＲＯＣ解析図をそれぞれ図８、図９に示す。

実施例５：各パラメーターの経時変化
実施例１の患者において術前、術後０時間、１時間、２時間後の４点全てでＳＯＦＡスコア、ｔＡＭ、ｍＡＭ、Ｐｒｅｓｅｐｓｉｎ、ＩＬ−６、ＣＲＰ、ＷＢＣ全てのパラメーターが測定できた３例の患者（心臓手術１例、食道亜全摘手術２例）の各パラメーターの経時変化を図１０に示す。ＳＯＦＡスコアの時間単位での変動を鋭敏に反映するパラメーターはｍＡＭであり、続いてｔＡＭが概ね変動傾向を反映している。その他パラメーターは症例により必ずしもＳＯＦＡスコアと変動傾向を同一にするものではなかった。

実施例６：アドレノメデュリン測定値によるＳＯＦＡスコアの弁別
実施例１の患者を含めて、ＳＯＦＡスコア、ｔＡＭ、ｍＡＭの３パラメーターが取得された患者背景を表４に示す。４０５検体のｔＡＭ、ｍＡＭの測定値を用いＳＯＦＡスコアの弁別能をＲＯＣ解析した。ＡＵＣ、カットオフ値、感度、特異度を表５（ｔＡＭ）ならびに表６（ｍＡＭ）に示す。なおカットオフ値は（１−感度）２＋（１−特異度）２が最小値となる濃度を求めた。各ＳＯＦＡスコアとカットオフ値の関連性を検証した結果、ｔＡＭ（ｒ＝０．９８２）、ｍＡＭ（ｒ＝０．９８４）それぞれ高い相関係数を示し、またその比例関係はそれぞれｔＡＭカットオフ値＝２．１９８１×ＳＯＦＡスコア＋９．２００７、ｍＡＭカットオフ値＝０．１７８１×ＳＯＦＡスコア＋１．０１５９で示されるものであった（図１１、図１２）。本結果より、ｔＡＭ、ｍＡＭそれぞれは、カットオフ値の一定の濃度変動をもってＳＯＦＡスコアが１ポイントずつ変動することを示している。すなわちｔＡＭを経時的に２点以上測定した場合、その濃度変動約２．２ｐｍｏｌ／Ｌ濃度ごとにＳＯＦＡスコアが１ポイント変動すること、またｍＡＭを経時的に２点以上測定した場合、その濃度変動約０．１８ｐｍｏｌ／Ｌ濃度ごとにＳＯＦＡスコアが１ポイント変動することを示している。

Claims

侵襲的治療介入を受けた後の動物の全身状態の良不良を評価することを補助するための情報を提供する方法であって、
前記動物に由来する検体中のアドレノメデュリン類を測定すること、及び
前記アドレノメデュリン類の測定値と前記動物の全身状態の良不良との関連付けを補助すること、
を含む方法。
敗血症以外の全身状態の良不良を評価することを補助する、請求項１に記載の方法。
ＳＯＦＡスコア、ＡＰＡＣＨＥスコア、又はｑＳＯＦＡスコアにより全身状態の良不良を評価することを補助する、請求項１又は２に記載の方法。
アドレノメデュリン類が配列番号１記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
アドレノメデュリン類が、配列番号１に記載のアミノ酸配列から成るアドレノメデュリン、中間体アドレノメデュリン、又は成熟型アドレノメデュリンである、請求項１〜４いずれかに記載の方法。
アドレノメデュリン類が、アドレノメデュリン部分ペプチドである、請求項１〜４いずれかに記載の方法。
アドレノメデュリン類が、配列番号１に記載のアミノ酸配列から成るアドレノメデュリン、中間体アドレノメデュリン、成熟型アドレノメデュリン、及びアドレノメデュリン部分ペプチドである、請求項１〜６いずれかに記載の方法。
アドレノメデュリン類が、成熟型アドレノメデュリンおよびその部分ペプチドである、請求項１〜６いずれかに記載の方法。
アドレノメデュリン類を認識する抗体を用いて免疫化学的方法により測定する、請求項１〜８いずれかに記載の方法。
アドレノメデュリン類を認識する抗体を含有することを特徴とする、請求項１〜９いずれかに記載の方法に使用するための測定試薬。