ES2830036T3

ES2830036T3 - Adrenomedulina para guiar una terapia de disminución de la presión sanguínea

Info

Publication number: ES2830036T3
Application number: ES14711741T
Authority: ES
Inventors: Andreas Bergmann
Original assignee: Sphingotec GmbH
Current assignee: Sphingotec GmbH
Priority date: 2013-03-20
Filing date: 2014-03-19
Publication date: 2021-06-02
Anticipated expiration: 2034-03-19
Also published as: DK2976646T3; CA2907467A1; US10598674B2; CN105102985B; JP2016521351A; HK1258520A1; WO2014147153A1; RU2673455C2; RU2015144699A; EP2976646A1; CN108362885A; JP6820399B2; CN105102985A; SG10201800309SA; JP2020073896A; SG11201507774YA; EP2976646B1; US20170010286A1; JP2018059947A; JP6259905B2

Abstract

Un método in vitro para la identificación temprana de un sujeto que necesita un reemplazo de fluidos o la administración de un vasopresor o para la identificación de un paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico, en el que dicho paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico es un sujeto que puede necesitar un reemplazo de fluidos o un tratamiento con un vasopresor, que comprende las siguientes etapas: - determinar el nivel de proadrenomedulina, proADM (SEC ID NO:1) y/o sus fragmentos en un fluido corporal de dicho sujeto, en el que dicha muestra se selecciona del grupo que comprende plasma con citrato humano, plasma con heparina, plasma con EDTA, sangre entera, suero; y - correlacionar dicho nivel con la necesidad de dicho sujeto de un reemplazo de fluidos o de la administración de un vasopresor, en el que se identifica que dicho sujeto tiene dicha necesidad si el nivel de proADM (SEC ID NO:1) y/o sus fragmentos en el fluido corporal de dicho sujeto está por encima de un umbral, o - correlacionar dicho nivel con el riesgo del paciente para desarrollar estados de choque fisiológico, en el que se identifica que dicho sujeto tiene dicho riesgo si el nivel de proADM (SEC ID NO:1) y/o sus fragmentos en el fluido corporal de dicho paciente está por encima de un umbral; y en el que dichos fragmentos de proADM (SEC ID NO:1) se seleccionan del grupo que comprende adrenomedulina, ADM (SEC ID NO:4) y/o ADM 1-52-Gly (SEC ID NO:5) y región intermedia de proadrenomedulina, MR-proADM (SEC ID NO:3) y proadrenomedulina C-terminal, CT-proADM (SEC ID NO:6) y péptido terminal N-20 de proadrenomedulina (SEC ID NO:2).

Description

DESCRIPCIÓN

Adrenomedulina para guiar una terapia de disminución de la presión sanguínea

El contenido de la presente invención es un método in vitro para la identificación temprana de un sujeto que necesita un reemplazo de fluidos o la administración de un vasopresor o para la identificación de un paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico; en el que dicho paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico es un sujeto que puede necesitar un reemplazo de fluidos o un tratamiento con un vasopresor, que comprende las siguientes etapas:

• determinar el nivel de proADM (SEC ID NO:1) y/o sus fragmentos en un fluido corporal de dicho sujeto, en el que dicha muestra se selecciona del grupo que comprende plasma con citrato humano, plasma con heparina, plasma con EDTA, sangre entera, suero; y

• correlacionar dicho nivel con la necesidad de dicho paciente de un reemplazo de fluidos o de la administración de un vasopresor, en el que se identifica que dicho paciente tiene dicha necesidad si el nivel de proADM (SEC ID NO:1) y/o sus fragmentos en el fluido corporal de dicho sujeto está por encima de un umbral, o

• correlacionar dicho nivel con el riesgo del paciente para desarrollar estados de choque fisiológico, en el que se identifica que dicho sujeto tiene dicho riesgo si el nivel de proADM (SEC ID NO:1) y/o sus fragmentos en el fluido corporal de dicho paciente está por encima de un umbral; y

en el que dichos fragmentos de proADM (SEC ID NO:1) se seleccionan del grupo que comprende adrenomedulina, ADM (SEC ID NO:4) y/o ADM 1-52-Gly (SEC ID NO:5) y región intermedia ("Midregional") de proadrenomedulina, MR-proADM (SEC ⁱD NO:3) y proadrenomedulina C-terminal, CT-proADM (SEC ID NO:6) y péptido terminal N-20 de proadrenomedulina (SEC ID NO:2).

El péptido adrenomedulina (ADM) fue descrito por primera vez en Kitamura et al. (cf. 1; los datos numéricos se basan en la lista adjunta de referencias bibliográficas) como un nuevo péptido hipotensor que comprende 52 aminoácidos, que se ha aislado a partir de un feocromocitoma humano. En ese mismo año también se describió un ADNc que codifica un péptido precursor que comprende 185 aminoácidos y la secuencia de aminoácidos completa de este péptido precursor. El péptido precursor, que comprende, entre otras, una secuencia señal de 21 aminoácidos en el extremo N-terminal, se denomina "preproadrenomedulina" (pre-proADM). La pre-proADM comprende 185 aminoácidos. La ADM se muestra en SEC ID NO:4 y la ADM-Gly se muestra en SEQ No. 5.

El péptido adrenomedulina (ADM) es un péptido amidado que comprende 52 aminoácidos (SEC ID NO:4) y que comprende los aminoácidos 95 a 146 de pre-proADM, a partir del cual se forma mediante ruptura proteolítica. Hasta la fecha, sustancialmente solo unos pocos fragmentos de los fragmentos peptídicos formados tras la ruptura de la pre-proADM han sido caracterizados con mayor exactitud, en particular los péptidos fisiológicamente activos adrenomedulina (ADM) y "PAMP", un péptido que comprende 20 aminoácidos (22-41) que siguen a los 21 aminoácidos del péptido señal en la pre-proADM. Para ADM y PAMP, también se han descubierto subfragmentos fisiológicamente activos y estos se han investigado con mayor detalle. El descubrimiento y la caracterización de la ADM en 1993 desató una intensa actividad de investigación y una gran cantidad de publicaciones, cuyos resultados han sido resumidos en fechas recientes en diversos artículos de revista y, en el contexto de la presente descripción, se remite en particular a los artículos que se encuentran en el número de "Peptides" dedicado a la ADM (Peptides, 22 (2001)), en particular (2) y (3). Otro análisis se encuentra en (4). En las investigaciones científicas realizadas hasta la fecha, se ha descubierto, entre otras cuestiones, que la ADM puede considerarse como un péptido regulador polifuncional. Se libera en la circulación en una forma inactiva extendida por glicina (5). También existe una proteína de unión (6) que es específica para la ADM y que, probablemente y de modo similar, modula el efecto de la ADM.

Los efectos fisiológicos de la ADM , así como de la PAMP, que son de importancia primordial en las investigaciones realizadas hasta la fecha son los efectos que influyen en la presión sanguínea. Por tanto, la ADM es un vasodilatador eficaz, y es posible asociar el efecto hipotensor, en particular, con segmentos peptídicos en la parte C-terminal de la ADM.

También se ha descubierto que el otro péptido fisiológicamente activo PAMP mencionado anteriormente, formado a partir de pre-proADM, muestra, de modo similar, un efecto hipotensor, aunque parece que presenta un mecanismo de acción diferente del de la ADM (cf. además de los artículos de revista mencionados anteriormente (3) y (4), también (7), (8) o (9) y (10)).

También se ha descubierto que las concentraciones de ADM que pueden medirse en la circulación y otros fluidos biológicos, en una serie de estados patológicos, están significativamente por encima de las concentraciones que se encuentran en personas control sanas. Así, el nivel de ADM en pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva, infarto de miocardio, enfermedades renales, trastornos hipertensivos, diabetes mellitus, y que están en la fase aguda de un choque y en sepsis y choque séptico está significativamente aumentado, aunque en diferentes grados. Las concentraciones de PAMP también son mayores en algunos de dichos estados patológicos, pero los niveles en plasma son menores con relación a la ADM ((3); p. 1702).

También se sabe que se observan concentraciones inusualmente elevadas de ADM en la sepsis o en el choque séptico (cf. (3) y (11), (12), (13), (14) y (15)). Estos descubrimientos están relacionados con los típicos cambios hemodinámicos que se sabe que son fenómenos típicos del desarrollo de una enfermedad en pacientes con sepsis y otros síndromes graves, tales como, por ejemplo, SIRS.

Aunque se supone que ADM y PAMP se forman a partir del mismo péptido precursor, la pre-proADM, en el que las secuencias de aminoácidos correspondientes a estos péptidos están presentes como péptidos parciales en cantidades equimolares, las concentraciones de ADM o PAMP mensurables en fluidos biológicos parecen diferir. Esto no es raro.

Así, las concentraciones mensurables de diferentes productos de degradación de uno y el mismo péptido precursor pueden ser diferentes, por ejemplo, porque son el resultado de diferentes vías de degradación en competencia que, por ejemplo, en el caso de diferentes estados patológicos, conducen a una fragmentación diferente del péptido precursor y, por tanto, a diferentes productos de degradación. Ciertos péptidos parciales contenidos en el péptido precursor pueden formarse como péptidos libres o pueden no formarse y/o se forman péptidos diferentes de modos diferentes y en diferentes cantidades. Aunque solo se siga una única vía de degradación para procesar un péptido precursor y, por tanto, todos los productos de degradación se originan de uno y el mismo péptido precursor y se han tenido que formar per se en principio en cantidades equimolares, las concentraciones en estado estacionario de los diferentes péptidos parciales y fragmentos mensurables en fluidos biológicos pueden ser muy diferentes, concretamente, por ejemplo, cuando se forman péptidos precursores individuales a una tasa diferente y/o tienen diferentes estabilidades individuales (tiempo de vida) en el respectivo fluido biológico, o si se retiran de la circulación en base a diferentes mecanismos de eliminación y/o a diferentes tasas de eliminación.

La adrenomedulina desempeña un papel crucial durante el desarrollo de la sepsis ((16), (17)) y en numerosas enfermedades agudas y crónicas ((18), (4)).

Se han descrito varios métodos para medir los niveles en circulación de ADM: medir la ADN directamente, o de modo indirecto, determinando un fragmento más estable de su péptido precursor cognado. En fechas muy recientes se ha publicado un método que describe un ensayo para medir la ADM madura en circulación (Di Somma S., Magrini L., Travaglino F., Lalle I., Fiotti N., Cervellin G., Avanzi G.C., Lupia E., Maisel A., Hein F. et al., Opinion paper on innovative approach of biomarkers for infectious diseases and sepsis management in the emergency department, Clinical chemistry and laboratory medicine, CCLM/FESCC, 2013:1-9.)

También se han descrito otros métodos para cuantificar fragmentos derivados del precursor de ADM, por ejemplo, la medición de MR-proADM (Morgenthaler N.G., Struck J., Alonso C., Bergmann A., Clin. Chem., octubre de 2005, 51(10):1823-1829), PAMP (Washimine H., Kitamura K., Ichiki Y., Yamamoto Y., Kangawa K., Matsuo H., Eto T., Biochem. Biophys. Res. Commun., 29 de julio de 1994, 202(2):1081-1087), CT-proADM (documento EP211552). Está disponible en el mercado un ensayo para la medición de MR-proADM (BRAHMS MR-proADM KRYPT^oR; BRAHMS GmbH, Hennigsdorf, Alemania) (Clin. Biochem., mayo de 2009, 42(7-8):725-728, doi: 10.1016/j.clinbiochem.2009.01.002, Epub 23 de enero de 2009). También, Homogeneous time-resolved fluoroimmunoassay for the measurement of midregional proadrenomedullin in plasma on the fully automated system B.R.A.H.M.S KRYPTOR (Caruhel P., Mazier C., Kunde J., Morgenthaler N.G., Darbouret B.). Puesto que estos péptidos se generan en una proporción estequiométrica a partir del mismo precursor, sus niveles en plasma se correlacionan hasta cierto punto.

Solo en unos pocos estudios se ha medido la ADM en plasma en pacientes con inflamación sistémica, sepsis, sepsis grave o choque séptico, y los niveles se han correlacionado con parámetros hemodinámicos.

En un estudio de Hirata et al., se descubrió que la ADM en plasma en pacientes sépticos se correlacionaba con la frecuencia cardíaca, la presión arterial derecha, pero no con la presión arterial promedio ("mean arterial pressure", MAP) (Hirata Y., Mitaka C., Sato K., Nagura T., Tsunoda Y., Amaha K., Marumo F., Increased circulating adrenomedullin, a novel vasodilatory peptide, in sepsis, The Journal of clinical endocrinology and metabolism, 1996, 81 (4):1449-1453).

Nishio et al. han indicado que un aumento en las concentraciones en plasma de ADM se correlaciona con la relajación del tono vascular en pacientes con choque séptico (correlación con el índice cardíaco, el índice de volumen de ictus, la frecuencia cardíaca, la disminución en la presión sanguínea diastólica, el índice de resistencia vascular sistémico y el índice de resistencia vascular pulmonar), aunque no aparece una correlación significativa con la presión sanguínea promedio [19].

En sujetos sanos sometidos a ejercicio, se descubrió una correlación significativa negativa de ADM y MAP en plasma [20].

No se sabe nada acerca de la asociación de la ADM en circulación o los niveles de péptidos relacionados, como pro-ADM o sus fragmentos, y los requisitos para un reemplazo de fluidos y vasopresores en pacientes que desarrollan un choque. Esta es una necesidad médica no cubierta, puesto que los vasopresores habitualmente se administran de un modo muy tardío cuando el estado del paciente es muy grave. Una necesidad médica no cubierta consiste en identificar los pacientes que necesitan un reemplazo de fluidos y vasopresores antes de que el estado del paciente sea muy grave. Una necesidad médica no cubierta consiste en predecir la necesidad de una terapia de reemplazo de fluidos y vasopresores antes de aplicar el valor de corte de la medición de la presión sanguínea de 65 mmHg, tal como recomiendan las líneas directrices [21]. Si la presión sanguínea cae, esto conduce a una disminución en el suministro de oxígeno, la disfunción de órganos y la muerte. Por tanto, una necesidad no cubierta consiste en identificar pacientes, de un modo temprano, que están en riesgo de desarrollar una disminución en la presión sanguínea. Si estos pacientes pudiesen identificarse antes, podrían aplicarse otros valores de corte, por ejemplo, más altos, para la presión arterial promedio para iniciar la terapia de reemplazo de fluidos y vasopresores. Unos niveles umbral más altos son < 70 mmHg, preferiblemente < 75 mmHg. Esto significa que la terapia se inicia cuando ya se está por encima de 65 mmHg.

• correlacionar dicho nivel con la necesidad de dicho sujeto o paciente de un reemplazo de fluidos o de la administración de un vasopresor, en el que se identifica que dicho sujeto o paciente tiene dicha necesidad si el nivel de proADM (SEC ID NO:1) y/o sus fragmentos en el fluido corporal de dicho sujeto está por encima de un umbral, o

en el que dichos fragmentos de proADM (SEC ID NO:1) se seleccionan del grupo que comprende adrenomedulina, ADM (SEC ID NO:4) y/o ADM 1-52-Gly (SEC ID NO:5) y región intermedia ("Midregional") de proadrenomedulina, MR-proADM (SEC ID NO:3) y proadrenomedulina C-terminal, CT-proADM (SEC ID NO:6) y péptido terminal N-20 de proadrenomedulina (SEC ID NO:2).

En una realización de los métodos según la invención, el sujeto tiene una presión arterial promedio > 65 mmHg. Además, dicho sujeto puede tener una presión arterial promedio < 75 mmgHg, y en otra realización < 70 mmgHg.

En una realización de la invención, dicho método es un método para la identificación temprana de un reemplazo de fluidos o de la administración de un vasopresor o para la identificación de un paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico, en el que temprana significa antes que la aplicación de un valor de corte de la medición de la presión sanguínea de 65 mmgHg o antes de que la presión sanguínea disminuya hasta 65 mmgHg.

Un fluido corporal según la presente invención es, en una realización particular, una muestra de sangre. Una muestra de sangre puede seleccionarse del grupo que comprende sangre entera, suero y plasma.

En una realización específica de la invención, dicha proADM y/o sus fragmentos se seleccionan del grupo que comprende:

SEC ID NO:1 (proADM): 164 aminoácidos (22-185 de preproADM)

ARLDVASEF RKKWNKWALS RGKRELRMS S SYPTGLADVK AGPAQTLIRP

QDMKGASRSP EDSSPDAARI RVKRYRQ SMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL

AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYGRRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA

HGAPAPPSGS APHFL

SEC ID NO:2 (péptido terminal N-20 de proadrenomedulina): Péptidos 22-41

ARLDVASEF RKKWNKWALS R

SEC ID NO:3 (región intermedia de proadrenomedulina, MR-proADM): Péptidos 45-92

ELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RV

SEC ID NO:4 (adrenomedulina (ADM); amidad): Péptidos 95-146-CONH2

YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGY

CONH2

SEC ID NO:5 (adrenomedulina 1-52-Gly (ADM 1-52-Gly)): Péptidos 95-147

YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYG

SEC ID NO:6 (proadrenomedulina C-terminal, CT-proADM): Péptidos 148-185

RRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL

En una realización específica de la invención, dicha proADM y/o sus fragmentos se seleccionan del grupo que comprende ADM (SEC ID NO:4) y/o ADM 1-52-Gly (SEC ID NO:5) y MR-proADM (SEC ID NO:3) y CT-proADM (SEC ID NO:6).

En una realización específica de la invención, se determina el nivel de inmunorreactividad de ADM (SEC ID NO:4) y/o ADM 1-52-Gly (SEC ID NO:5) o el nivel de inmunorreactividad de MR-proADM (SEC ID NO:3) o el nivel de inmunorreactividad CT-proADM (SEC ID NO:6) y se correlaciona con la necesidad de dicho paciente de un reemplazo de fluidos o de la administración de un vasopresor, o para identificar un paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico, en el que se identifica que dicho paciente tiene dicha necesidad si el nivel de inmunorreactividad de ADM (SEC ID NO:4) y/o ADM 1-52-Gly (S^eC ID NO:5) o el nivel de inmunorreactividad de MR-proADM (SEC ID NO:3) o el nivel de inmunorreactividad de CT-proADM (S^eC ID NO:6) en el fluido corporal de dicho sujeto está por encima de un umbral.

En una realización específica de la invención, el nivel de pro-ADM y/o sus fragmentos se determina usando al menos un ligante seleccionado del grupo: un ligante que se une a una región comprendida dentro de la siguiente secuencia de ADM (SEC ID NO:4) y/o ADM 1-52-Gly (S^eC ID NO:5), y un segundo ligante que se une a una región comprendida dentro de la secuencia de ADM (SEC ID NO:4) y/o ADM 1-52-Gly (SEC ID NO:5).

En una realización específica de la invención, el nivel de pro-ADM y/o sus fragmentos se determina usando al menos un ligante seleccionado del grupo: un ligante que se une a una región comprendida dentro de la secuencia de MR-proADM (SEC ID NO:3), y un segundo ligante que se une a una región comprendida dentro de la secuencia de MR-proADM (SEC ID NO:3)

En una realización específica de la invención, el nivel de pro-ADM y/o sus fragmentos se determina usando al menos un ligante seleccionado del grupo: un ligante que se une a una región comprendida dentro de la secuencia de CT-proADM (SEC ID NO:6), y un segundo ligante que se une a una región comprendida dentro de la secuencia de CT-proADM (SEC ID NO:6).

En una realización específica de la invención, se usa un ensayo para determinar el nivel de proADM y/o sus fragmentos, en el que la sensibilidad de ensayo de dicho ensayo es capaz de cuantificar la ADM de sujetos sanos y es < 70 pg/ml, preferiblemente < 40 pg/ml, y más preferiblemente < 10 pg/ml.

En una realización específica de la invención, dicho ligante muestra una afinidad de unión a proADM y/o a sus fragmentos de al menos 107 M-1, preferiblemente 108 M-1, y una afinidad preferida es mayor que 109 M-1, lo más preferiblemente mayor que 1010 M-1. Los expertos en la técnica saben que puede considerarse compensar una afinidad menor mediante la aplicación de una dosis mayor de compuestos, y esta medida no está fuera del alcance de la invención.

Para determinar la afinidad de los anticuerpos por la adrenomedulina, se determinó la cinética de unión de la adrenomedulina a un anticuerpo inmovilizado mediante resonancia de plasmón de superficie sin marcadores usando un sistema Biacore 2000 (Ge Healthcare Europe GmbH, Friburgo, Alemania). Se realizó una inmovilización reversible de los anticuerpos usando un anticuerpo anti-Fc de ratón acoplado covalentemente a alta densidad con una superficie detectora CM5 según las instrucciones del fabricante (kit de captura de anticuerpos de ratón; GE Healthcare) (22).

En una realización específica de la invención, dicho ligante se selecciona del grupo que comprende un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, o un andamiaje que no es una Ig que se une a proADM y/o sus fragmentos.

En una realización específica de la invención, se usa un ensayo para determinar el nivel de proADM y/o sus fragmentos, en el que dicho ensayo es un ensayo de sándwich, preferiblemente un ensayo totalmente automático. En una realización de la invención, puede usarse el denominado ensayo POC ("point-of-care", prueba de concepto), que es una tecnología de ensayo que permite realizar el ensayo dentro de menos de 1 hora cerca del paciente sin necesitar un sistema de ensayo totalmente automático. Un ejemplo de esta tecnología es la tecnología de ensayo inmunocromatográfico.

En una realización de la invención, dicho ensayo es un inmunoensayo de sándwich que emplea cualquier tipo de tecnología de detección, que incluye, pero no se limita a marcadores de enzimas, marcadores de quimioluminiscencia, marcadores de electroquimioluminiscencia, preferiblemente un ensayo totalmente automático. En una realización de la invención, dicho ensayo es un ensayo de sándwich marcado con enzimas. Los ejemplos de un ensayo automático o totalmente automático comprenden ensayos que pueden usarse en uno de los siguientes sistemas: Roche Elecsys®, Abbott Architect®, Siemens Centauer®, Brahms Kryptor®, BiomerieuxVidas®, Alere Triage®.

Se conoce una diversidad de inmunoensayos, y estos pueden usarse para los ensayos y los métodos de la presente invención, e incluyen: radioinmunoensayos ("radioimmunoassays", RIA), inmunoensayos multiplicados por enzimas homogéneos ("homogeneous enzyme-multiplied immunoassays", EMIT), ensayos inmunoadsorbentes ligados a enzimas ("enzyme linked immunoadsorbent assays", ELISA), inmunoensayo de reactivación de apoenzimas ("apoenzyme reactivation immunoassay", ARIS), inmunoensayos de varillas graduadas y ensayos de inmunocromatografía.

En una realización específica de la invención, al menos uno de dichos dos ligantes está marcado para que pueda detectarse.

Los métodos de detección preferidos comprenden inmunoensayos en diversos formatos, tales como, por ejemplo, radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos de quimioluminiscencia y de fluorescencia, inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA), matrices de esferas basado en Luminex, ensayos de micromatrices de proteínas, y formatos de ensayos rápidos, tales como, por ejemplo, ensayos de tiras inmunocromatográficos.

En una realización preferida, dicho marcador se selecciona del grupo que comprende un marcador quimioluminiscente, un marcador de enzima, un marcador de fluorescencia, un marcador de radioyodo.

Los ensayos pueden ser ensayos homogéneos o heterogéneos, ensayos competitivos y no competitivos. En una realización, el ensayo está en forma de un ensayo de sándwich, que es un inmunoensayo no competitivo, en el que la molécula que se va a detectar y/o cuantificar se une a un primer anticuerpo y a un segundo anticuerpo. El primer anticuerpo puede estar unido a una fase sólida, por ejemplo, una esfera, la superficie de un pocillo u otro recipiente, un chip o una tira, y el segundo anticuerpo es un anticuerpo que está marcado, por ejemplo, con un tinte, con un radioisótopo, o un resto reactivo o catalíticamente activo. Después la cantidad de anticuerpo marcado unido al analito se mide mediante un método apropiado. La composición general y los procedimientos implicados en los "ensayos de sándwich" están bien establecidos y son conocidos por los expertos en la técnica (23).

En otra realización, el ensayo comprende dos moléculas de captura, preferiblemente anticuerpos que están ambos presentes como dispersiones en una mezcla de reacción líquida, en el que un primer componente de marcaje se une a la primera molécula de captura, en el que dicho primer componente de marcaje es parte de un sistema de marcaje basado en la amplificación o la extinción de la fluorescencia o la quimioluminiscencia, y un segundo componente de marcaje de dicho sistema de marcaje se une a la segunda molécula de captura, de modo que, tras la unión de ambas moléculas de captura al analito, se genera una señal mensurable que permite la detección de los complejos de sándwich formados en la disolución que comprende la muestra.

En otra realización, dicho sistema de marcaje comprende criptatos de tierras raras o quelados de tierras raras en combinación con un tinte de fluorescencia o un tinte de quimioluminiscencia, en particular un tinte de tipo cianina. En el contexto de la presente invención, los ensayos basados en fluorescencia comprenden el uso de tintes, que pueden seleccionarse, por ejemplo, del grupo que comprende FAM (5- o 6-carboxifluoresceína), VIC, n Ed , fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), IRD-700/800, tintes de cianina, tales como CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Cy7, xanteno, 6-carboxi-2',4',7',4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), TET, 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetodifluoresceína (JOE), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 5-carboxirrodamina-6G (R6G5), 6-carboxirrodamina-6G (RG6), rodamina, verde de rodamina, rojo de rodamina, rodamina 110, tintes de BODIPY, tales como BODIPY TMR, verde de Oregón, cumarinas, tales como umbeliferona, benzimidas, tales como Hoechst 33258; fenantridinas, tales como rojo de Texas, amarillo de Yakima, Alexa Fluor, PET, bromuro de etidio, tintes de acridinio, tintes de carbazol, tintes de fenoxazina, tintes de porfirina, tintes de polimetina y similares.

En el contexto de la presente invención, los ensayos basados en quimioluminiscencia comprenden el uso de tintes, basándose en los principios físicos descritos para los materiales quimioluminiscentes en (24). Los tintes quimioluminiscentes preferidos son los ésteres de acridinio.

Tal como se menciona en la presente, un "ensayo" o un "ensayo de diagnóstico" puede ser de cualquier tipo aplicado al campo del diagnóstico. Este ensayo puede basarse en la unión de un analito que se va a detectar a una o más sondas de captura con cierta afinidad. Con respecto a la interacción entre las moléculas de captura y las moléculas diana o moléculas de interés, la constante de afinidad preferiblemente es mayor que 108 M-1.

En el contexto de la presente invención, las "moléculas de ligante" son moléculas que pueden usarse para unir moléculas diana o moléculas de interés, concretamente, analitos (concretamente, en el contexto de la presente invención, PCT y sus fragmentos), procedentes de una muestra. Por tanto, las moléculas de ligante pueden conformarse de modo adecuado, espacialmente y en términos de características de su superficie, tales como carga superficial, hidrofobicidad, hidrofilicidad, presencia o ausencia de donantes y/o aceptores de Lewis, para unirse específicamente a las moléculas diana o moléculas de interés. Por esto, la unión puede estar mediada, por ejemplo, por interacciones iónicas, de Van der Waals, pi-pi, sigma-pi, hidrófobas o de enlaces de hidrógeno, o una combinación de dos o más de las interacciones mencionadas, entre las moléculas de captura y las moléculas diana o moléculas de interés. En el contexto de la presente invención, las moléculas de unión pueden seleccionarse, por ejemplo, del grupo que comprende una molécula de ácido nucleico, una molécula de carbohidrato, una molécula de PNA, una proteína, un anticuerpo, un péptido o una glicoproteína. Preferiblemente, las moléculas de ligante son anticuerpo, incluyendo sus fragmentos con afinidad suficiente por una diana o molécula de interés, e incluyen anticuerpos recombinantes o fragmentos de anticuerpos recombinantes, así como derivados química y/o bioquímicamente modificados de dichos anticuerpos o fragmentos derivados de su cadena variable con una longitud de al menos 12 aminoácidos.

Un marcador quimioluminiscente puede ser un marcador de éster de acridinio, marcadores de esteroides que implican marcadores de isoluminol y similares.

Los marcadores de enzimas pueden ser lactato deshidrogenasa (LDH), creatina quinasa (CPK), fosfatasa alcalina, aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), fosfatasa ácida, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, etc.

En una realización de la invención, al menos uno de dichos dos ligantes está unido a una fase sólida, tal como partículas magnéticas y superficies de poliestireno.

En una realización específica de la invención, al menos uno de dichos dos ligantes está unido a una fase sólida. En una realización de la invención, la concentración de ADM, o sus fragmentos, medida en la muestra está en el intervalo entre 10-500 pg/ml en plasma o sangre.

Se han determinado los niveles de ADM de la presente invención o los niveles de proADM o sus fragmentos, respectivamente, con el ensayo de ADM descrito, tal como perfila en los ejemplos (o los ensayos de proADM o sus fragmentos, respectivamente). Los valores mencionados anteriormente pueden ser diferentes de otros ensayos de ADM (o ensayos de proADM o sus fragmentos, respectivamente), dependiendo de su forma de calibración. En consecuencia, los valores mencionados anteriormente se aplicarán para dichos ensayos de ADM calibrados de modo diferente tomando en cuenta las diferencias en la calibración. Los ensayos de ADM pueden calibrarse mediante correlación y ajuste a lo largo de sus intervalos normales (población sana) (o los ensayos de proADM o sus fragmentos, respectivamente). Como alternativa, pueden usarse muestras control disponibles en el mercado para el ajuste de diferentes calibraciones (ICI Diagnostics, Berlín, Alemania).

Con el ensayo de ADM descrito, se ha determinado que la mediana de una población normal es de 24,7 pg/ml. En una realización específica de la invención, se aplica un umbral para la ADM en plasma de 90 pg/ml, preferiblemente de 70 pg/ml.

En una realización específica de la invención, se aplica un umbral para la MR-proADM en plasma de 0,9 nmol/l, preferiblemente de 0,7 nmol/l.

En una realización específica de la invención, se aplica un umbral para la CT-proADM en plasma de 1,0 nmol/l, preferiblemente de 0,8 nmol/l.

Si el nivel de ADM en plasma o de MR-proADM en plasma o de CT-proADM en plasma está por encima de dicho umbral, la persona puede necesitar un tratamiento con un vasopresor.

En una realización específica de la invención, dicha muestra se selecciona del grupo que comprende plasma con citrato humano, plasma con heparina, plasma con EDTA, sangre entera.

El sujeto que puede necesitar un reemplazo de fluidos o un tratamiento con un vasopresor puede padecer un trastorno seleccionado del grupo que comprende: pacientes en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico, tal como se describe con más detalle a continuación, pero también infecciones, SIRS, sepsis, insuficiencia cardíaca, parada cardiopulmonar, cirugía cardíaca postoperatoria, infarto ventricular derecho, bradiarritmias, politraumatismos, quemaduras, lesiones renales.

Este tipo de choque puede ser provocado por:

• Sangrado grave.

• Embolia pulmonar (un coágulo de sangre en los pulmones).

• Vómitos y diarrea graves.

• Lesión espinal.

• Envenenamiento.

También existen tipos específicos de choque fisiológico, con síntomas muy concretos.

Choque cardiogénico:

El choque cardiogénico aparece cuando el corazón se daña con gravedad (por un ataque cardíaco masivo, por ejemplo) y ya no puede bombear sangre a través del cuerpo de modo adecuado, lo cual provoca una presión sanguínea muy baja. Esto se desarrolla después de aproximadamente 8 % de los ataques cardíacos. Puede ser difícil de tratar, pero pueden administrarse fármacos para que el latido del corazón sea más fuerte. Esto puede ser suficiente para que un sujeto atraviese la peor parte hasta que el corazón se arregle por sí mismo, pero el choque cardiogénico sigue siendo mortal en un número tan alto como de ocho por cada diez casos. Los nuevos tratamientos para 'revascularizar' o restablecer el flujo sanguíneo al músculo cardíaco están mejorando las tasas de supervivencia.

Choque séptico:

Se produce cuando una infección bacteriana muy grande provoca la caída de la presión sanguínea. Es mortal en más del 50 % de los casos. Aunque está provocado por una infección bacteriana, el tratamiento del choque séptico con antibióticos es complicado, porque las bacterias liberan cantidades enormes de toxinas cuando mueren, lo cual, en un primer momento, empeora el choque. Siempre debe tratarse en un hospital en donde pueden administrarse los fármacos correctos y el soporte de fluidos. Un tipo de choque séptico es el síndrome del choque tóxico, una enfermedad poco frecuente, pero grave, provocada por ciertas cepas de la bacteria Staphylococcus aureus.

Choque anafiláctico:

El choque anafiláctico es una grave reacción alérgica. Los activadores habituales incluyen picaduras de abeja y avispa, frutos secos, marisco, huevos, látex y ciertas medicaciones, que incluyen la penicilina. Los síntomas incluyen:

• Sensación de quemazón e hinchamiento de los labios y la lengua.

• Dificultad para respirar (como en un ataque de asma).

• Piel roja, con picores o con ampollas, estornudos.

• Lagrimeo.

• Náuseas.

• Ansiedad.

La anafilaxis requiere un tratamiento urgente en un hospital. Las personas en riesgo siempre deben llevar consigo un kit de tratamiento de la anafilaxis de emergencia que incluya adrenalina.

La sepsis y sus formas intensificadas (sepsis grave, choque séptico) siguen siendo un problema médico principal, con unas tasas de mortalidad que varían del 30 al 70 %. A pesar de los avances en los cuidados paliativos, cada año 750.000 personas desarrollan sepsis y 225.000 mueren solo en EE. UU., y la incidencia de la sepsis está aumentando a unas tasas de entre 1,5 % y 8 % anuales [4-6]. Para salvar la vida de un paciente séptico, es fundamental, en primer lugar, combatir oportunamente el estímulo infeccioso con antibióticos u otras medidas, y, en segundo lugar, reconocer oportunamente la intensificación de la situación, por ejemplo, cuando la sepsis grave avanza al choque séptico, porque solo entonces puede iniciarse una terapia con vasopresores adecuada de forma temprana. Cualquier retraso aumentaría el riesgo de morir del paciente.

Las condiciones bajo las cuales se recomienda iniciar un reemplazo de fluidos o una terapia con vasopresores/inótropos en pacientes que están avanzando hacia el choque séptico se describen en las directrices de the Surviving Sepsis Campaign [3]: Se recomienda aplicar vasopresores para la hipotensión que no respondan al reemplazo de fluidos inicial para mantener una presión arterial promedio (MAP) de >65 mmHg. Las directrices también indican cuál vasopresor/inótropo aplicar preferentemente y cuándo. La opinión de consenso actual es: Norepinefrina como vasopresor de primera elección, y epinefrina (añadida a la norepinefrina y potencial sustituta de esta) cuando es necesario un agente adicional para mantener una presión sanguínea adecuada. Puede añadirse vasopresina 0,03 unidades/minuto a la norepinefrina (NE) con el fin de aumentar la MAP o disminuir la dosificación de NE (UG). En general, los vasopresores e inótropos usados en la actualidad en la práctica clínica son [7, 8]:

Catecolaminas (dopamina, dobutamina, norepinefrina, epinefrina, isoproterenol, fenilefrina), inhibidores de fosfodiesterasa III (milrinona, amrinona), vasopresina, levosimendano.

Además, están desarrollándose otros compuestos vasoactivos, tales como, por ejemplo, selepresina, un agonista del receptor V1a de vasopresina selectivo [9] y anticuerpos antiadrenomedulina.

Se han investigado otros compuestos, pero los datos clínicos disponibles para estos tratamientos son escasos, y se han obtenido resultados bastante equívocos de estas estrategias en ensayos más grandes [10]. Estos son inhibidores de los canales de K+ dependientes de ATP (glibenclamida; [11, 12]) de NOS (NG-monometil-L-arginina [13, 14]) y de cGMP (azul de metileno [15, 16]).

Los vasopresores y los inótropos se aplican en la clínica para tratar y prevenir diversos tipos de choque fisiológico, pero también enfermedades cardiovasculares (insuficiencia cardíaca congestiva, parada cardiopulmonar, cirugía cardíaca postoperatoria, infarto ventricular derecho, bradiarritmias) [7]

Puesto que siempre se controla la presión sanguínea en pacientes que presentan una condición crítica, desde un punto de vista clínico, los pacientes con valores superiores a los respectivos umbrales, por ejemplo, ADM elevada (>70 pg/ml) sin necesidad de vasopresores en la presentación deben ser tratados con vasopresores adaptando los puntos de decisión desde MAP <66 mmHg a, por ejemplo, <75 mmHg para que un apoyo temprano a la circulación proteja al paciente frente a una presión sanguínea baja asociada con disfunciones de órganos y una posterior mortalidad alta. Usando esta regla para pacientes con ADM >70 pg/ml y tratando con vasopresores a MAP <=75 mmHg, los pacientes (grupo 3) serán tratados un promedio de 1,6 días antes del tratamiento paliativo convencional (<=66 mmHg).

Así, en una realización específica de la invención, se identifica que dicho paciente necesita la administración de un vasopresor si el nivel de proADM y/o sus fragmentos en el fluido corporal de dicho sujeto es superior a un umbral, y si el paciente tiene una MAP </=75 mmHg, pero preferiblemente >66 mmHg, más preferiblemente una MAP >70 mmHg.

En una realización específica de la invención, se aplica un umbral para la ADM en plasma de 90 pg/ml, preferiblemente de 70 pg/ml y/o el paciente tiene una MAP <=/75 mmHg, pero preferiblemente >66 mmHg, más preferiblemente una MAP >70 mmHg.

En una realización específica de la invención, se aplica un umbral para la MR-proADM en plasma de 0,9 nmol/l, preferiblemente de 0,7 nmol/l y/o el paciente tiene una MAP <=/75 mmHg, pero preferiblemente >66 mmHg, más preferiblemente una MAP >70 mmHg.

En una realización específica de la invención, se aplica un umbral para la CT proADM en plasma de 1,0 nmol/l, preferiblemente de 0,8 nmol/l y/o el paciente tiene una MAP <=/75 mmHg, pero preferiblemente >66 mmHg, más preferiblemente una MAP >70 mmHg.

Si el nivel de ADM en plasma o de MR-proADM en plasma o de CT proADM en plasma está por encima de dicho umbral y/o si el paciente tiene una MAP <=/75 mmHg, pero preferiblemente >66 mmHg, más preferiblemente una MAP >70 mmHg, la persona puede necesitar un tratamiento con un vasopresor.

El reemplazo de fluidos es la práctica médica de reabastecer el fluido corporal perdido a través de la sudoración, el sangrado, el desplazamiento de fluidos u otros procesos patológicos, tal como se describió anteriormente.

Los fluidos pueden reemplazarse mediante administración oral (bebiendo), administración intravenosa, por vía rectal, o mediante hipodermoclisis, la inyección directa de fluido al tejido subcutáneo. Los fluidos administrados a través de las vías oral e hipodérmica se absorben más lentamente que los que se administran por vía intravenosa. La terapia de rehidratación oral ("oral rehydration therapy", ORT) es un tratamiento sencillo para la deshidratación asociada con diarrea, en particular gastroenteritis/gastroenteropatía, tales como las provocadas por cólera o rotavirus. La ORT consiste en una disolución de sales y azúcares que se toma a través de la boca.

En la deshidratación severa, se prefiere un reemplazo de fluidos intravenoso, que puede salvar vidas. Es especialmente útil cuando disminuyen los fluidos en el espacio intracelular y en los espacios vasculares.

El reemplazo de fluidos también está indicado en la disminución de fluidos debido a cualquiera de los trastornos descritos anteriormente.

Un anticuerpo según la presente invención es una proteína que incluye uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de las regiones constantes kappa, lambda, alfa (IgA), gamma (IgG¹, IgG², IgG3, IgG4), delta (IgD), épsilon (IgE) y mu (IgM), así como la miríada de genes de la región variable de inmunoglobulinas. Las cadenas ligeras de inmunoglobulina de longitud entera tienen una longitud en general de aproximadamente 25 Kd o 214 aminoácidos. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina de longitud entera tienen una longitud en general de aproximadamente 50 Kd o 446 aminoácidos. Las cadenas ligeras son codificadas por un gen de región variable en el extremo NH2-terminal (con una longitud de aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de región constante kappa o lambda en el extremo COOH-terminal. De modo similar, las cadenas pesadas son codificadas por un gen de región variable (con una longitud de aproximadamente 116 aminoácidos) y un gen de las otras regiones constantes.

La unidad estructural básica de un anticuerpo es, en general, un tetrámero que consiste en dos parejas idénticas de cadenas de inmunoglobulina, y cada pareja contiene una cadena ligera y una cadena pesada. En cada pareja, las regiones variables de cadena ligera y pesada se unen a un antígeno, y las regiones constantes median en las funciones efectoras. Las inmunoglobulinas también existen en una diversidad de otras formas que incluyen, por ejemplo, Fv, Fab, y (Fab')², así como anticuerpos híbridos bifuncionales y monocatenarios (por ejemplo, Lanzavecchia etal., Eur. J. Immunol., 17:105, 1987; Huston etal., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883, 1988; Bird et al., Science, 242:423-426, 1988; Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2a ed., 1984; Hunkapiller y Hood, Nature 323:15-16, 1986). Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina incluye una región de marco interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad ("complementarity determining regions", CDR) (véase, Sequences of Proteins of Immunological Interest, E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, 1983). Tal como se indicó anteriormente, las CDR son principalmente responsables de la unión a un epitopo de un antígeno. Un inmunocomplejo es un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o anticuerpo humano, o un fragmento de anticuerpo funcional, específicamente unido al antígeno.

Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos cuyos genes de cadena ligera y pesada han sido construidos, generalmente mediante ingeniería genética, a partir de genes de regiones variables y constantes de inmunoglobulinas que pertenecen a especies distintas. Por ejemplo, los segmentos variables de los genes procedentes de un anticuerpo monoclonal de ratón pueden unirse a segmentos constantes humanos, tales como kappa y gamma 1 o gamma 3. En un ejemplo, un anticuerpo quimérico terapéutico es, por tanto, una proteína híbrida compuesta del dominio variable o de unión al antígeno procedente de un anticuerpo de ratón, y el dominio constante o efector procedente de un anticuerpo humano, aunque pueden emplearse otras especies de mamífero, o la región variable puede producirse mediante técnicas moleculares. Los métodos para fabricar anticuerpos quiméricos son muy conocidos en la técnica, por ejemplo, véase la. patente de EE. UU. n.° 5.807.715. Una inmunoglobulina "humanizada" es una inmunoglobulina que incluye una región de marco humana y una o más CDR procedentes de una inmunoglobulina no humana (tal como de ratón, rata o sintética). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina un "donante", y la inmunoglobulina humana que proporciona el marco se denomina un "aceptor". En una realización, todas las CDR proceden de la inmunoglobulina donante en una inmunoglobulina humanizada. No es necesario que estén presentes regiones constantes, pero si lo están, deben ser sustancialmente idénticas a regiones constantes de inmunoglobulinas humanas, es decir, al menos aproximadamente 85-90 %, tal como aproximadamente 95 % o más idénticas. Por tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto quizás las CDR, son sustancialmente idénticas a las correspondientes partes de las secuencias de inmunoglobulina humanas naturales. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que comprende una inmunoglobulina de cadena pesada humanizada y de cadena ligera humanizada. Un anticuerpo humanizado se une al mismo antígeno que el anticuerpo donante que proporciona las CDR. El marco aceptor de un anticuerpo o inmunoglobulina humanizada puede contener un número limitado de sustituciones por aminoácidos obtenidos del marco donante. Los anticuerpos humanizados u otros anticuerpos monoclonales pueden tener otras sustituciones de aminoácidos conservadoras, que sustancialmente no tienen efecto sobre la unión al antígeno u otras funciones de la inmunoglobulina. Los ejemplos de sustituciones conservadoras son gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; y phe, tyr. Las inmunoglobulinas humanizadas pueden construirse mediante ingeniería genética (por ejemplo, véase la patente de EE. UU. n.° 5.585.089). Un anticuerpo humano es un anticuerpo en el que los genes de cadena ligera y pesada son de origen humano. Los anticuerpos humanos pueden generarse usando métodos conocidos en la técnica. Los anticuerpos humanos pueden producirse inmortalizando una célula B humana que segrega el anticuerpo de interés. Puede lograrse la inmortalización, por ejemplo, mediante infección con EBV o fusionando una célula B humana con una célula de mieloma o hibridoma para producir una célula de trioma. También pueden producirse anticuerpos humanos mediante métodos de presentación de fagos (véase, por ejemplo, Dower et al., publicación PCT n.° WO91/17271; McCafferty et al., publicación PCT n.° WO92/001047; y Winter, publicación PCT n.° WO92/20791), o seleccionarse a partir de un banco de anticuerpos monoclonales combinatorios humanos (véase el sitio web de Morphosys). Los anticuerpos humanos también pueden prepararse usando animales transgénicos que portan un gen de inmunoglobulina humana (por ejemplo, véase, Lonberget al., publicación PCT n.° WO93/12227; y Kucherlapati, publicación PCT n.° WO91/10741).

Por tanto, el anticuerpo puede tener los formatos conocidos en la técnica. Los ejemplos son anticuerpos humanos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR. En una realización preferida, los anticuerpos según la presente invención son anticuerpos producidos de modo recombinantes, por ejemplo, como IgG, una inmunoglobulina de longitud entera típica, o fragmentos de anticuerpo que contienen al menos el dominio variable F de cadena pesada y/o ligera, como, por ejemplo, anticuerpos acoplados de modo químico (fragmento de unión al antígeno) que incluyen, pero no se limitan a fragmentos Fab, que incluyen minicuerpos de Fab, anticuerpos de Fab monocatenarios, anticuerpos de Fab monovalentes con marcadores de epitopo, por ejemplo, Fab-V5Sx2; Fab bivalentes (minianticuerpo) dimerizados con el dominio CH3; Fab bivalentes o Fab multivalentes, por ejemplo, formados a través de multimerización con la ayuda de un dominio heterólogo, por ejemplo, a través de dimerización de dominios dHLX, por ejemplo, Fab-dHLX-FSx2; fragmentos F(ab')2, fragmentos scFv, fragmentos scFv multivalentes multimerizados y/o multiespecíficos, diacuerpos bivalentes y/o biespecíficos, BITE® (acoplador a células T biespecífico), anticuerpos trifuncionales, anticuerpos polivalentes, por ejemplo, procedentes de una clase diferente de G; anticuerpos de dominio único, por ejemplo, nanocuerpos derivados de inmunoglobulinas de camélidos o de peces, y numerosos otros.

Además de los anticuerpos, en la técnica se conocen otros andamiajes de biopolímeros para complejar una molécula diana, y se han usado para la generación de biopolímeros muy específicos de diana. Los ejemplos son aptámeros, spiegelmeros, anticalinas y conotoxinas.

En una realización preferida, el formato de anticuerpo se selecciona del grupo que comprende un fragmento Fv, un fragmento scFv, un fragmento Fab, un fragmento scFab, un fragmento (Fab)2 y una proteína de fusión de scFv-Fc. En otra realización preferida, el formato de anticuerpo se selecciona del grupo que comprende un fragmento scFab, un fragmento Fab, un fragmento scFv y sus conjugados optimizados para la biodisponibilidad, tales como fragmentos PEGilados. Uno de los formatos más preferidos es el formato scFab.

Los andamiajes que no son Ig pueden ser andamiajes de proteína y pueden usarse como imitaciones de anticuerpos que son capaces de unirse a ligandos o antígenos. Los andamiajes que no son Ig pueden seleccionarse del grupo que comprende andamiajes que no son Ig basados en tetranectina (por ejemplo, descritos en el documento US 2010/0028995), andamiajes de fibronectina (por ejemplo, descritos en el documento EP 1266 025; andamiajes basados en lipocalina (por ejemplo, descritos en el documento WO 2011/154420); andamiajes de ubiquitina (por ejemplo, descritos en el documento WO 2011/073214), andamiajes de transferencia (por ejemplo, descritos en el documento US 2004/0023334), andamiajes de proteína A (por ejemplo, descritos en el documento EP 2231860), andamiajes basados en repeticiones de anquirina (por ejemplo, descritos en el documento WO 2010/060748), andamiajes de microproteínas, preferiblemente microproteínas que forman un nudo de cistina (por ejemplo, descritos en el documento EP 2314308), andamiajes basados en el dominio SH3 de Fyn (por ejemplo, descritos en el documento WO 2011/023685), andamiajes basados en el dominio EGFR-A (por ejemplo, descritos en el documento WO 2005/040229) y andamiajes basados en el dominio de Kunitz (por ejemplo, descritos en el documento EP 1941867).

En una realización de la invención, los anticuerpos según la presente invención pueden producirse como sigue. Un ratón Balb/c se inmunizó con ADM - 100 pg de conjugado de BSA-péptido de ADM en el día 0 y 14 (emulsionado en 100 pl de adyuvante de Freund completo) y 50 pg en el día 21 y 28 (en 100 pl de adyuvante de Freund incompleto). Tres días antes de realizar el experimento de fusión, el animal recibió 50 pg del conjugado disuelto en 100 pl de disolución salina, administrados como una inyección intraperitoneal y una inyección intravenosa.

Se fusionaron esplenocitos procedentes del ratón inmunizado y células de la línea celular de mieloma SP2/0 con 1 ml de polietilenglicol al 50 % durante 30 s a 37 °C. Después de lavar, las células se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos. Se seleccionaron los clones híbridos cultivando en medio HAT [medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con suero de ternero fetal al 20 % y suplemento HAT]. Después de dos semanas, el medio HAT se reemplaza por medio HT en tres transferencias, seguido de la vuelta al medio de cultivo celular normal.

Los sobrenadantes del cultivo celular primero se seleccionaron para anticuerpos IgG específicos de antígeno tres semanas después de la fusión. Los microcultivos ensayados positivos se trasladaron a placas de 24 pocillos para la propagación. Después de volver a ensayar, los cultivos seleccionados se clonaron y se reclonaron usando la técnica de dilución limitante, y se determinaron los isotipos (véase también, Lane, R.D. (1985), A short-duration polyethylene glycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas, J. Immunol. Meth., 81:223-228; Ziegler, B. et al. (1996), Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies, Horm. Metab. Res., 28:11-15).

Los anticuerpos pueden producirse mediante presentación de fagos según el siguiente procedimiento.

Se usaron los bancos de genes de anticuerpos sin estimular humanos HAL7/8 para el aislamiento de dominios variables F monocatenarios (scFv) recombinantes contra el péptido de adrenomedulina. Los bancos de genes de anticuerpos se seleccionaron con una estrategia de inmunoadsorción ("panning") que comprende el uso de péptidos que contienen un marcador de biotina unido a través de dos espaciadores diferentes a la secuencia del péptido de adrenomedulina. Se usó una mezcla de rondas de inmunoadsorción empleando un antígeno no unido específicamente y un antígeno unido a estreptavidina para minimizar el fondo de ligantes no específicos. Los fagos eluidos de la tercera ronda de inmunoadsorción se usaron para la generación de cepas de E. coli que expresan scFv monoclonal. Los sobrenadantes del cultivo de estas cepas clonales se usaron directamente para un ensayo de ELISA de antígenos (véase Hust, M., Meyer, T., Voedisch, B., Rülker, T., Thie, H., El-Ghezal, A., Kirsch, M.I., Schütte, M., Helmsing, S., Meier, D., Schirrmann, T., Dübel, S., 2011, A human scFv antibody generation pipeline for proteome research, Journal of Biotechnology, 152, 159-170; Schütte, M., Thullier, P., Pelat, T., Wezler, X., Rosenstock, P., Hinz, D., Kirsch, M.I.,Hasenberg, M., Frank, R., Schirrmann, T., Gunzer, M., Hust, M., Dübel, S., 2009, Identification of a putative Crf splice variant and generation of recombinant antibodies for the specific detection of Aspergillus fumigatus, PLoS One, 4, e6625).

Puede realizarse la humanización de anticuerpos murinos según el siguiente procedimiento: Para la humanización de un anticuerpo de origen murino, la secuencia del anticuerpo se analiza para la interacción estructural de las regiones de marco ("framework regions", FR) con las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y el antígeno. Basándose en la formación de modelos estructurales, se selecciona una FR apropiada de origen humano, y las secuencias de CDR murinas se trasplantan a la FR humana. Pueden introducirse variaciones en la secuencia de aminoácidos de las CDR o las FR para recuperar interacciones estructurales, que fueron abolidas por el cambio de especie para las secuencias FR. Esta recuperación de las interacciones estructurales puede lograrse mediante una estrategia aleatoria usando bancos de presentación de fagos o a través de una estrategia dirigida por la formación de modelos moleculares (véase Almagro J.C., Fransson J., 2008, Humanization of antibodies, Front Biosci., 1 de enero de 2008, 13:1619-1633).

Otro de los contenidos de la presente invención es un vasopresor para su uso en el tratamiento de un sujeto que necesita un reemplazo de fluidos o la administración de un vasopresor, en el que dicho paciente se identifica según cualquiera de los métodos in vitro descritos anteriormente, que incluyen todas las realizaciones de dichos métodos in vitro. Otro contenido de la presente invención es un vasopresor para su uso en un método de tratamiento in vivo de un sujeto que necesita la administración de un vasopresor, en el que se identifica que dicho sujeto presenta un nivel de proADM (SEC ID NO:1) y/o dichos fragmentos de esta, en una muestra de fluido corporal de dicho sujeto, por encima de un umbral, en el que se aplica un umbral para la ADM en plasma de 90 pg/ml o 70 pg/ml, y en el que se aplica un umbral para la MR-proADM en plasma de 0,9 nmol/l o 0,7 nmol/l, en el que dicha muestra se selecciona del grupo que comprende plasma con citrato humano, plasma con heparina, plasma con EDTA, sangre entera, suero, y en el que dicha proADM (SEC ID NO:1) y/o dichos fragmentos de esta se seleccionan del grupo que comprende adrenomedulina, ADM (SEC ID NO:4) y/o ADM 1-52-Gly (SEC ID NO:5) y la región intermedia de proadrenomedulina, MR-proADM (SEC ID NO:3) y proadrenomedulina C-terminal, CT-proADM (SEC ID NO:6) y péptido terminal N-20 de proadrenomedulina (SEC ID NO:2) y proADM (SEC ID NO:1).

Descripción de las figuras

Figura 1: La figura 1 muestra una curva de dosis de ADM/señal típica, y una curva de dosis de ADM-señal en presencia de 100 pg/ml de anticuerpo NT-H.

Figura 2: Predicción de la mortalidad intrahospitalaria - Resultados de la regresión logística.

Figura 3: Predicción de la mortalidad intrahospitalaria - La ADM es independiente de Apache y proporciona información de prognóstico adicional.

Figura 4: La presión arterial promedio depende de los niveles de ADM en plasma. Se muestra un diagrama de dispersión y el coeficiente de correlación para los valores obtenidos de los pacientes en el momento del ingreso. La significancia estadística es de p<0,0001.

Figura 5: Concentraciones de adrenomedulina en pacientes en el momento del ingreso que requieren terapia con vasopresores frente a pacientes que no requieren terapia con vasopresores. La diferencia entre los dos grupos es estadísticamente significativa (p<0,0001).

Figura 6: Concentraciones de ADM de pacientes en el momento del ingreso que se trataron con vasopresores en el momento del ingreso ("con ADM"), que no necesitaron una terapia con vasopresores dentro de los primeros cuatro días después del ingreso ("nunca"), y que necesitaron una terapia con vasopresores dentro de los primeros cuatro días después del ingreso, pero no en el día del ingreso ("después"). En la gráfica, se indica el intervalo normal de concentraciones de ADM.

Figura 7: Curva de característica operativa del receptor ("Receiver Operator Characteristics", ROC) para las concentraciones de ADM de pacientes con insuficiencia cardíaca aguda que requieren (sensibilidad) y que no requieren (especificidad) una terapia con vasopresores. El área bajo la curva es de 0,75 (p<0,0001).

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos y determinación de sus constantes de afinidad

Se desarrollaron anticuerpos monoclonales de ratón que se unen a la parte N-terminal, la región intermedia y la parte C-terminal de ADM y se determinaron sus constantes de afinidad (tabla 1).

Péptidos para la inmunización

Los péptidos fueron suministrados por JPT Peptide Technologies GmbH (Berlín, Alemania). Los péptidos se acoplaron a BSA usando el método de entrecruzamiento Sulfo-SMCC. El procedimiento de entrecruzamiento se realizó según las instrucciones del fabricante (Thermo Fisher/Pierce). Los anticuerpos murinos se generaron según el siguiente método.

Un ratón Balb/c se inmunizó con 100 gg de conjugado de péptido-BSA en el día 0 y 14 (emulsionado en 100 gl de adyuvante de Freund completo) y 50 gg en el día 21 y 28 (en 100 gl de adyuvante de Freund incompleto). Tres días antes de realizar el experimento de fusión, el animal recibió 50 gg del conjugado disuelto en 100 gl de disolución salina, administrados como una inyección intraperitoneal y una inyección intravenosa.

Los sobrenadantes del cultivo celular primero se seleccionaron para anticuerpos IgG específicos de antígeno tres semanas después de la fusión. Los microcultivos ensayados positivos se trasladaron a placas de 24 pocillos para la propagación. Después de volver a ensayar, los cultivos seleccionados se clonaron y se reclonaron usando la técnica de dilución limitante, y se determinaron los isotipos (Lane, R.D., "A short-duration polyethylene glycol fusiontechnique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas", J. Immunol. Meth., 81:223-228, (1985); Ziegler, B. et al., "Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies", Horm. Metab. Res., 28:11-15 (1996)).

Tabla 1:

Producción de anticuerpos monoclonales

Se produjeron anticuerpos mediante métodos de producción de anticuerpos convencionales (Marx et al., Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 121, 1997) y se purificaron mediante proteína A. La pureza de los anticuerpos fue > 95 % basada en un análisis de electroforesis en gel de SDS.

Constantes de afinidad

Para determinar la afinidad de los anticuerpos por la adrenomedulina, se determinó la cinética de unión de la adrenomedulina a un anticuerpo inmovilizado mediante resonancia de plasmón de superficie sin marcadores usando un sistema Biacore 2000 (GE Healthcare Europe GmbH, Friburgo, Alemania). Se realizó una inmovilización reversible de los anticuerpos usando un anticuerpo anti-Fc de ratón acoplado covalentemente a alta densidad con una superficie detectora CM5 según las instrucciones del fabricante (kit de captura de anticuerpos de ratón; GE Healthcare).

Procedimiento de marcaje (marcador): Se mezclaron 100 ug (100 ul) de anticuerpo (1 mg/ml en PBS, pH 7,4,) con 10 ul de NHS-éster de acridinio (1 mg/ml en acetonitrilo, InVent GmbH, Alemania) (57) y se incubó durante 20 min a temperatura ambiente. El CT-H marcado se purificó mediante HPLC de filtración en gel en un Bio-Sil® SEC 400-5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., EE. UU.). El anticuerpo marcado purificado se diluyó en fosfato de potasio 300 mmol/, NaCl 100 mmol/l, Na-EDTA 10 mmol/l, albúmina de suero bovina 5 g/l, pH 7,0. La concentración final fue de aproximadamente 800.000 unidades relativas de luz ("relative light units", RLU) de compuesto marcado (aproximadamente 20 ng de anticuerpo marcado) por 200 gl. Se midió la quimioluminiscencia del éster de acridinio usando un AutoLumat LB 953 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).

Fase sólida: Se revistieron tubos de poliestireno (Greiner Bio-One International AG, Austria) (18 h a temperatura ambiente) con anticuerpo (1,5 pg de anticuerpo/0,3 ml de NaCI 100 mmol/l, TRIS/HCl 50 mmol/l, pH 7,8). Después de bloquear con albúmina de suero bovina al 5 %, los tubos se lavaron con PBS, pH 7,4, y se secaron al vacío. Calibradores:

La ADM humana sintética (Bachem, Suiza) se diluyó linealmente usando Tris 50 mM/HCl, NaCl 250 mM, Triton X-100 al 0,2 %, BSA al 0,5 %, 20 comprimidos/l de comprimidos de cóctel de inhibidores de proteasas Protease cOmplete (Roche AG); pH 7,8. Los calibradores se conservaron a -20 °C antes del uso.

Ejemplo 2: Determinación de la combinación de anticuerpo que produce una alta proporción de señal/ruido Inmunoensayo de ADM:

Se pipetearon 50 ul de muestra (o calibrador) en tubos revestidos, y después de añadir anticuerpo secundario marcado (200 ul), los tubos se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. El marcador no unido se retiró mediante un lavado en 5 veces (cada una con 1 ml) con disolución de lavado (PBS 20 mM, pH 7,4, Triton X-100 al 0,1 %).

Se midió la quimioluminiscencia unida al tubo usando LB 953.

Todos los anticuerpos se usaron en un inmunoensayo de sándwich en forma de tubo revestido y anticuerpo marcado y se combinaron usando las siguientes variaciones (tabla 2).

La incubación se realizó como se describe en el inmunoensayo de hADM. Los resultados se indican en proporción de señal específica (a ADM 10 ng/ml)/señal de fondo (muestra sin ADM).

Tabla 2:

De modo sorprendente, se descubrió que la combinación de MR-ADM y CT-ADM es la combinación con la mayor proporción de señal/ruido.

Después se usó esta combinación de anticuerpo para posteriores investigaciones. Se empleó MR-ADM como anticuerpo de fase sólida y CT-ADM como anticuerpo marcado. En la figura 1 se muestra una curva de dosis/señal típica. La sensibilidad analítica (promedio de 10 pruebas, muestra sin ADM 2DE) del ensayo es de 2 pg ADM/ml. Ejemplo 3: Estabilidad de la adrenomedulina humana

La ADM humana se diluyó en plasma con citrato humano (n = 5, concentración final 10 ng ADM/ml) y se incubó a 24 °C. En los momentos seleccionados, se congelaron partes alícuotas a -20 °C. Inmediatamente después de descongelar las muestras, se cuantificó la hADM usando el inmunoensayo de hADM descrito anteriormente.

La tabla 3 muestra la estabilidad de hADM en plasma humano a 24 °C.

De modo sorprendente, usando las combinaciones de anticuerpo MR-ADM y CT-ADM en un inmunoensayo de sándwich, la estabilidad preanalítica del analito es alta (pérdida promedio de inmunorreactividad de tan solo 0,9 %/h). Por contraste, usando otros métodos de ensayo, se ha indicado una semivida en plasma de tan solo 22 min (Hinson, 2000). Puesto que el tiempo desde que se toma la muestra hasta su análisis en el procedimiento habitual hospitalario es menor que 2 h, el método de detección de ADM usado es adecuado para una diagnosis rutinaria. Resulta notable que no es necesario ningún aditivo no habitual para las muestras (tal como aprotinina (20)) para lograr una estabilidad de inmunorreactividad de ADM aceptable.

Ejemplo 4: Reproducibilidad de las preparaciones de calibradores

Se descubrió una elevada variación de los resultados en la preparación de calibradores para los ensayos de ADM (promedio de CV 8,5 %, véase la tabla 4). Esto puede ser debido a una elevada adsorción de hADM a las superficies de plástico y vidrio (véase también (58)). Este efecto solo se redujo ligeramente mediante la adición de detergentes (hasta Triton X 100 al 1 % o Tween 20 al 1 %), proteínas (hasta BSA al 5 %) y elevada fuerza iónica (hasta NaCl 1 M) o sus combinaciones. De modo sorprendente, si se añade un exceso de anticuerpo anti-ADM (10 ug/ml) al tampón de dilución del calibrador, la recuperación y la reproducibilidad de las preparaciones de calibradores para el ensayo de ADM mejoran sustancialmente hasta < 1 % de CV entre preparaciones (tabla 4).

Por suerte, la presencia de anticuerpos N-terminales no afecta a la señal de ADM generada por la combinación de anticuerpos de MR y C-terminales (figura 1).

Tabla 4:

Variación entre preparaciones de calibradores.

Se prepararon calibradores del ensayo de ADM como se describió anteriormente con y sin 10 ug/ml de anticuerpo NT-ADM. Los coeficientes de variación se indican a partir de 5 pruebas de la preparación independientes. Los calibradores se midieron usando el ensayo de ADM descrito anteriormente. p-s/r = proporción de señal a ruido. Para todos los estudios siguientes, se usó un ensayo de ADM basado en calibradores, preparado en presencia de 10 ug/ml de anticuerpo NT-ADM y 10 ug/ml de anticuerpo NT-ADM como suplemento en el tampón de marcador. Ejemplo 5: Sensibilidad

El objetivo de la sensibilidad del ensayo es cubrir completamente la concentración de ADM de sujetos sanos.

Concentración de ADM en sujetos sanos:

Se midieron sujetos sanos (n = 100, promedio de edad de 56 años) usando el ensayo de ADM. El valor de la mediana era de 24,7 pg/ml, el valor más bajo era de 11 pg/ml y el 99° percentil era 43 pg/ml. Puesto que la sensibilidad del ensayo es de 2 pg/ml, 100 % de todos los sujetos sanos fueron detectables usando el ensayo de ADM descrito.

Se usó un ensayo comercial para medir la MR-proADM (BRAHMS MR-proADM KRYPTOR) (BRAHMS GmbH, Hennigsdorf, Alemania) (Clin. Biochem., mayo de 2009, 42(7-8):725-728, doi: 10.1016/j.clinbiochem.2009.01.002.

Epub, 23 de enero de 2009, Homogeneous time-resolved fluoroimmunoassay for the measurement of midregional proadrenomedullin in plasma on the fully automated system B.R.A.H.M.S KRYPTOR.Caruhel P., Mazier C., Kunde J., Morgenthaler N.G., Darbouret B.).

Ejemplo 6: Estudio clínico

101 pacientes ED que cumplen la definición de sepsis (Dellinger R.P., Levy M.M., Carlet J.M., Bion J., Parker M.M., Jaeschke R., Reinhart K., Angus D.C., Brun-Buisson C., Beale R. et al., Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock, 2008, Critical Care Medicine, 2008, 36(1):296-327) posteriormente fueron hospitalizados (promedio de 5 días de hospitalización) y recibieron un tratamiento paliativo habitual. Se generó plasma con EDTA desde el día 1 (presentación de ED) y una muestra diaria durante la estancia hospitalaria. El tiempo hasta congelar las muestras para la posterior medición de la ADM fue menor de 4 h.

Las características de los pacientes se resumen en la tabla 5.

Tabla 5:

Murieron 26,7 % de todos los pacientes durante la estancia hospitalaria y se contaron como no respondedores al tratamiento, y 73,3% de todos los pacientes sobrevivieron a la sepsis y se contaron como respondedores al tratamiento.

De todos los pacientes que presentan sepsis, 66% tenían un valor de ADM no normal > 43 pg/ml (99° percentil), lo cual indica que ADM no es un marcador para la infección.

Resultados del estudio clínico

La ADM inicial es altamente prognóstica.

Se correlacionó el valor inicial de ADM con la mortalidad en el hospital y se comparó la ADM con la puntuación APACHE 2. La ADM es altamente prognóstica del resultado de la sepsis (véase la figura 2) y es comparable a la puntuación APACHE 2. Se produce una significativa adición de información si se combinan ADM y APACHE 2 (figura 3).

ADM en el control del tratamiento.

Los pacientes se trataron basándose en los tratamientos paliativos habituales (tabla 5). El promedio del tiempo de hospitalización fue de 5 días. Se midió la ADM a diario en el hospital (día 1 = admisión) y se correlacionó con la mortalidad en el hospital (tabla 6). La ADM cambió durante la estancia en el hospital, y el cambio durante ese tiempo mejoró el valor de prognóstico en 52 % desde una Chi2 inicial de 19,2 hasta 29,2 en el día 5 .

Usando un modelo de punto de corte sencillo, 70 pg/ml de ADM demostraron un riesgo de muerte del 68 % para pacientes que comienzan a unas concentraciones de ADM > 70 pg/ml y, durante toda la estancia hospitalaria, permanecen > 70 pg/ml (tratamiento de no respondedor). Los pacientes que, en todo momento, presentaron un valor de ADM < 70 pg/ml o que cambia desde > 70 pg/ml hasta < 70 pg/ml tuvieron una mortalidad de solo 11 % (bien tratado/respondedor al tratamiento), y los pacientes que presentaron unos valores de ADM > 70 pg/ml y que redujeron su concentración de ADM durante el tratamiento en el hospital hasta unos valores < 70 pg/ml tuvieron una mortalidad del 0 %. No hubo pacientes que cambiaron desde <70 pg/ml hasta > 70 pg/ml durante el tratamiento en el hospital. El tiempo promedio necesario para generar información de respondedores/no respondedores para todos los pacientes fue de aproximadamente 1 día. Los pacientes > 70 pg/ml que respondieron al tratamiento durante la estancia en el hospital necesitaron aproximadamente 2 días para indicar el éxito del tratamiento mediante ADM. Tabla 6

Relación de la ADM en plasma con la presión arterial promedio (MAP) y la necesidad de una terapia con vasopresores

Se descubrió una correlación significativa entre las concentraciones de ADM y la presión arterial promedio (figura 4) y la necesidad de una terapia con vasopresores para tratar/prevenir el choque (figura 5).

También se investigó la relación temporal de las concentraciones de ADM y la necesidad de una terapia con vasopresores (figura 6): De los 101 pacientes investigados, 18 ya necesitaban de una terapia con vasopresores en el ingreso; la mediana de la concentración de ADM para estos pacientes en el ingreso fue de 129 pg/ml. Los pacientes que nunca necesitaron de una terapia con vasopresores durante su estancia en el hospital dentro de los primeros cuatro días después del ingreso (n = 79) presentaban una mediana de concentración de ADM de 48,5 pg/ml. De manera importante, los pacientes que necesitaron una terapia con vasopresores durante su estancia en el hospital posteriormente a su ingreso presentaban unos niveles elevados de ADM ya en el momento del ingreso (mediana de 87,2 pg/ml), por ejemplo, el aumento en la concentración de ADM en plasma fue anterior a la terapia con vasopresores.

En las muestras de plasma también se midió MR-proADM, un fragmento estable de la molécula precursora de ADM. Se ha propuesto a MR-proADM como marcador sustituto de la liberación de ADM madura (Struck J., Tao C., Morgenthaler N.G., Bergmann A., Identification of an Adrenomedullin precursor fragment in plasma of sepsis patients, Peptides, 2004, 25(8):1369-1372; Morgenthaler N.G., Struck J., Alonso C., Bergmann A., Measurement of midregional proadrenomedullin in plasma with an immunoluminometric assay, Clinical Chemistry, 2005, 51(10):1823-1829). Se usó un ensayo de MR-proADM del mercado (BRAHMS MR-proADM KRYPTOR) según las instrucciones del fabricante (BRAHMS GmbH, Hennigsdorf, Alemania). La mediana de los niveles en el día del ingreso fue de 0,63 nmol/l para los pacientes que no requirieron una terapia con vasopresores, y de 1,57 nmol/l para los pacientes que sí requirieron una terapia con vasopresores. Las concentraciones de MR-proADM se correlacionaron significativamente con las concentraciones de ADM (r = 0,79).

Ejemplo 7: Análisis de punto de corte para el diagnóstico y la predicción de la necesidad de vasopresores

Para los datos de los pacientes, véase el ejemplo 6. El análisis se realizó basado en la primera sangre extraída durante la presentación en la unidad de urgencias del paciente con sepsis.

Se seleccionó un valor de corte de 70 pg/ml, y < 70 pg/ml indica un riesgo bajo de necesidad de vasopresores y >70 pg/ml indica un riesgo alto de necesidad de vasopresores. El grupo 1 son pacientes que no necesitaron vasopresores (MAP <= 66 mmHg) ni recibieron vasopresores en el momento de la presentación ni durante un periodo de seguimiento de 4 días. El grupo 2 son pacientes con necesidad de vasopresores (MAP <= 66mmHg) o que recibieron vasopresores en el momento de la presentación. El grupo 3 son pacientes que no necesitaron vasopresores ni recibieron vasopresores en el momento de la presentación, pero que desarrollaron la necesidad de vasopresores durante un periodo de seguimiento de 4 días. Los pacientes (n = 2) con falta de información acerca de un tratamiento con vasopresores se excluyeron.

Tabla 7

Usando un simple análisis de punto de corte a 70 pg/ml, 89,5 % de todos los pacientes que necesitaron vasopresores en el momento de la presentación ED fueron identificados mediante ADM (grupo 2). Hubo 20 pacientes >70 pg/ml que no necesitaron vasopresores en el momento de la presentación (grupo 1/3), 15 (75 %) no desarrollaron la necesidad de vasopresores durante un seguimiento de 4 días, y 5 (25 %) de los pacientes desarrollaron la necesidad de vasopresores durante un seguimiento de 4 días. Por contraste, si ADM era < 70 pg/ml en los pacientes sin necesidad de vasopresores en el momento de la presentación (grupo 1/3), 56 (96,5 %) no desarrollaron la necesidad de vasopresores durante el seguimiento de 4 días, y solo 2 (3,5 %) desarrollaron la necesidad de vasopresores. El riesgo de desarrollar necesidad de vasopresores durante los siguientes 4 días en pacientes con un valor de ADM mayor que 70 pg/ml es 7,1 veces mayor que para los pacientes con unos niveles de ADM menores que 70 pg/ml (25 % frente a 3,5 %).

Puesto que siempre se controla la presión sanguínea, desde un punto de vista clínico, los pacientes con ADM elevada (>70 pg/ml) sin necesidad de vasopresores en la presentación deben ser tratados con vasopresores adaptando los puntos de decisión desde MAP <66 mmHg a, por ejemplo, <75 mmHg para que un apoyo temprano a la circulación proteja al paciente frente a una presión sanguínea baja asociada con disfunciones de órganos y una posterior mortalidad alta. Usando esta regla para pacientes con ADM >70 pg/ml y tratando con vasopresores a MAP <=75 mmHg, los pacientes (grupo 3) serán tratados un promedio de 1,6 días antes del tratamiento paliativo convencional (<=66 mmHg).

Se obtuvieron resultados similares cuando se usa MR-proADM con un valor de corte de 0,78 nmol/l en el análisis, en lugar de ADM.

Tabla 8

Ejemplo 8: Estudio clínico/insuficiencia cardíaca aguda

Los pacientes reclutados fueron pacientes admitidos en el departamento de urgencias con insuficiencia cardíaca aguda. Características de los pacientes: Edad promedio ± DE, 74,3 ± 12,2 años; n = 1022 (643 hombres, 63 %); enfermedad cardíaca isquémica previa 31 %, hipertensión 58 %, diabetes 33 %, insuficiencia cardíaca 35 %. Los pacientes recibieron un seguimiento de 2 años. Las muestras de plasma para la medición de ADM y otros analitos se obtuvieron en el día del ingreso.

Un análisis Cox reveló que la ADM es un predictor independiente de muerte a 1 año (tabla 9) y muerte/hospitalización a 1 año debido a insuficiencia cardíaca descompensada aguda (tabla 10). Un análisis de regresión logística reveló que la ADM es un predictor independiente de la muerte en el hospital (tabla 11).

Los pacientes que requirieron una terapia con vasopresores (inótropos) presentaban unas concentraciones de ADM significativamente más altas que todos los demás pacientes (área bajo la curva = 0,75; p<0001; figura 7).

Tabla 9

Tabla 10

Tabla 11

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Claims

REIVINDICACIONES

1 Un método in vitro para la identificación temprana de un sujeto que necesita un reemplazo de fluidos o la administración de un vasopresor o para la identificación de un paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico, en el que dicho paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico es un sujeto que puede necesitar un reemplazo de fluidos o un tratamiento con un vasopresor, que comprende las siguientes etapas:

• determinar el nivel de proadrenomedulina, proADM (SEC ID NO:1) y/o sus fragmentos en un fluido corporal de dicho sujeto, en el que dicha muestra se selecciona del grupo que comprende plasma con citrato humano, plasma con heparina, plasma con EDTA, sangre entera, suero; y

• correlacionar dicho nivel con la necesidad de dicho sujeto de un reemplazo de fluidos o de la administración de un vasopresor, en el que se identifica que dicho sujeto tiene dicha necesidad si el nivel de proADM (SEC ID NO:1) y/o sus fragmentos en el fluido corporal de dicho sujeto está por encima de un umbral, o

• correlacionar dicho nivel con el riesgo del paciente para desarrollar estados de choque fisiológico, en el que se identifica que dicho sujeto tiene dicho riesgo si el nivel de proADM (SEC ID NO:1) y/o sus fragmentos en el fluido corporal de dicho paciente está por encima de un umbral; y

en el que dichos fragmentos de proADM (SEC ID NO:1) se seleccionan del grupo que comprende adrenomedulina, ADM (SEC ID NO:4) y/o ADM 1-52-Gly (SEC ID NO:5) y región intermedia de proadrenomedulina, MR-proADM (SEC ID NO:3) y proadrenomedulina C-terminal, CT-proADM (SEC ID NO:6) y péptido terminal N-20 de proadrenomedulina (SEC ID NO:2).
2. - Un método in vitro para la identificación de un sujeto que necesita un reemplazo de fluidos o la administración de un vasopresor o para la identificación de un paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico, en el que dicho paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico es un sujeto que puede necesitar un reemplazo de fluidos o un tratamiento con un vasopresor según la reivindicación 1, en el que se determina el nivel de inmunorreactividad de ADM (SEC ID NO:4) y/o el nivel de inmunorreactividad de ADM 1-52-Gly (SEC ID NO:5) o el nivel de inmunorreactividad de MR-proADM (SEC ID NO:3) o el nivel de inmunorreactividad CT-proADM (SEC ID NO:6) y se correlaciona con la necesidad de dicho paciente de un reemplazo de fluidos o de la administración de un vasopresor, en el que se identifica que dicho paciente tiene dicha necesidad si el nivel de inmunorreactividad de ADM (SEC ID ⁿO:4) y/o el nivel de inmunorreactividad de ADM 1-52-Gly (SEC ID NO:5) o el nivel de inmunorreactividad de MR-proADM (SEC ID NO:3) o el nivel de inmunorreactividad de CT-proADM (SEC ID NO:6) en el fluido corporal de dicho sujeto está por encima de un umbral.
3. - Un método in vitro para la identificación de un sujeto que necesita un reemplazo de fluidos o la administración de un vasopresor o para la identificación de un paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico, en el que dicho paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico es un sujeto que puede necesitar un reemplazo de fluidos o un tratamiento con un vasopresor según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que se determina el nivel de pro-ADM (SEC ID NO:1) y/o dichos fragmentos de esta usando al menos un ligante seleccionado del grupo: un ligante que se une a una región comprendida dentro de la siguiente secuencia de ADM (SEC ID NO:4) y/o ADM 1-52-Gly (SEC ID NO:5), y un segundo ligante que se une a una región comprendida dentro de la siguiente secuencia de AdM (SEC ID NO:4) y/o ADM 1-52-Gly madura (SEC ID NO:5).
4. - Un método in vitro para la identificación de un sujeto que necesita un reemplazo de fluidos o la administración de un vasopresor o para la identificación de un paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico, en el que dicho paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico es un sujeto que puede necesitar un reemplazo de fluidos o un tratamiento con un vasopresor según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que se determina el nivel de pro-ADM (SEC ID NO:1) y/o dichos fragmentos de esta usando al menos un ligante seleccionado del grupo: un ligante que se une a una región comprendida dentro de la siguiente secuencia de MR-proADM (SEC ID NO:3), y un segundo ligante que se une a una región comprendida dentro de la siguiente secuencia de MR-proADM (SEC ID NO:3).
5. - Un método in vitro para la identificación de un sujeto que necesita un reemplazo de fluidos o la administración de un vasopresor o para la identificación de un paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico, en el que dicho paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico es un sujeto que puede necesitar un reemplazo de fluidos o un tratamiento con un vasopresor según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que se determina el nivel de pro-ADM (SEC ID NO:1) y/o dichos fragmentos de esta usando al menos un ligante seleccionado del grupo: un ligante que se une a una región comprendida dentro de la siguiente secuencia de CT-proADM (SEC ID NO:6), y un segundo ligante que se une a una región comprendida dentro de la siguiente secuencia de CT-proADM (SEC ID NO:6).
6. - Un método in vitro para la identificación de un sujeto que necesita un reemplazo de fluidos o la administración de un vasopresor o para la identificación de un paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico, en el que dicho paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico es un sujeto que puede necesitar un reemplazo de fluidos o un tratamiento con un vasopresor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se usa un ensayo para determinar el nivel de proADM (SEC ID NO:1) y/o dichos fragmentos de esta, en el que la sensibilidad de ensayo de dicho ensayo es capaz de cuantificar la ADM de sujetos sanos y es < 70 pg/ml.
7.- Un método in vitro para la identificación de un sujeto que necesita un reemplazo de fluidos o la administración de un vasopresor o para la identificación de un paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico, en el que dicho paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico es un sujeto que puede necesitar un reemplazo de fluidos o un tratamiento con un vasopresor según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que dicho ligante muestra una afinidad de unión a proADM (SEC ID NO:1) y/o a dichos fragmentos de esta de al menos 107 M-1.
8. - Un método in vitro para la identificación de un sujeto que necesita un reemplazo de fluidos o la administración de un vasopresor o para la identificación de un paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico, en el que dicho paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico es un sujeto que puede necesitar un reemplazo de fluidos o un tratamiento con un vasopresor según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que dicho ligante se selecciona del grupo que comprende un anticuerpo específico de proADM o un fragmento de un anticuerpo específico de proADM o un andamiaje que no es una Ig (no es una inmunoglobulina) específico de proADM que se une a proADM (SEC ID NO:1) y/o a dichos fragmentos de esta.
9. - Un método in vitro para la identificación de un sujeto que necesita un reemplazo de fluidos o la administración de un vasopresor o para la identificación de un paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico, en el que dicho paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico es un sujeto que puede necesitar un reemplazo de fluidos o un tratamiento con un vasopresor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que se usa un ensayo para determinar el nivel de proADM (SEC ID NO:1) y/o dichos fragmentos de esta, en el que dicho ensayo es un ensayo de sándwich.
10. - El método in vitro de la reivindicación 9, en el que el ensayo de sándwich es un ensayo totalmente automático.
11. - Un método in vitro para la identificación de un sujeto que necesita un reemplazo de fluidos o la administración de un vasopresor o para la identificación de un paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico, en el que dicho paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico es un sujeto que puede necesitar un reemplazo de fluidos o un tratamiento con un vasopresor según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, en el que al menos uno de dichos dos ligantes está marcado para poder ser detectado.
12. - Un método in vitro para la identificación de un sujeto que necesita un reemplazo de fluidos o la administración de un vasopresor o para la identificación de un paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico, en el que dicho paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico es un sujeto que puede necesitar un reemplazo de fluidos o un tratamiento con un vasopresor según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, en el que al menos uno de dichos dos ligantes está unido a una fase sólida.
13. - Un método in vitro para la identificación de un sujeto que necesita un reemplazo de fluidos o la administración de un vasopresor o para la identificación de un paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico, en el que dicho paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico es un sujeto que puede necesitar un reemplazo de fluidos o un tratamiento con un vasopresor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que se aplica un umbral para la ADM en plasma de 90 pg/ml.
14. - Un método in vitro para la identificación de un sujeto que necesita un reemplazo de fluidos o la administración de un vasopresor o para la identificación de un paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico, en el que dicho paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico es un sujeto que puede necesitar un reemplazo de fluidos o un tratamiento con un vasopresor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que se aplica un umbral para la MR-proADM (SEC ID NO:3) en plasma de 0,9 nmol/l.
15. - Un método in vitro para la identificación de un sujeto que necesita un reemplazo de fluidos o la administración de un vasopresor o para la identificación de un paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico, en el que dicho paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico es un sujeto que puede necesitar un reemplazo de fluidos o un tratamiento con un vasopresor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que se identifica que dicho paciente tiene dicha necesidad si el nivel de proADM (SEC ID NO:1) y/o dichos fragmentos de esta en el fluido corporal de dicho sujeto está por encima de un umbral y si el paciente presenta una presión arterial promedio (MAP) >66 mmHg.
16. - Un método in vitro para la identificación de un sujeto que necesita un reemplazo de fluidos o la administración de un vasopresor o para la identificación de un paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico, en el que dicho paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico es un sujeto que puede necesitar un reemplazo de fluidos o un tratamiento con un vasopresor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende las siguientes etapas:

• determinar el nivel de proADM (SEC ID NO:1) y/o dichos fragmentos de esta en un fluido corporal de dicho sujeto, y

• correlacionar dicho nivel con la necesidad de dicho paciente de un reemplazo de fluidos o de la administración de un vasopresor independientemente de la presión arterial promedio del paciente, en el que se identifica que dicho paciente tiene dicha necesidad si el nivel de proADM (SEC ID NO:1) y/o dichos fragmentos de esta en el fluido corporal de dicho sujeto está por encima de un umbral.
17. - Un método in vitro para la identificación de un sujeto que necesita un reemplazo de fluidos o la administración de un vasopresor o para la identificación de un paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico, en el que dicho paciente en riesgo de desarrollar estados de choque fisiológico es un sujeto que puede necesitar un reemplazo de fluidos o un tratamiento con un vasopresor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende las siguientes etapas:

• determinar el nivel de proADM (SEC ID NO:1) y/o dichos fragmentos de esta en un fluido corporal de dicho sujeto, y

• correlacionar dicho nivel con la necesidad de aumentar el valor umbral de intervención de la presión arterial promedio del paciente hasta 70 mm Hg, para iniciar el reemplazo de fluidos o una terapia con vasopresores, en el que se identifica que dicho paciente tiene dicha necesidad si el nivel de proADM (SEC ID NO:1) y/o dichos fragmentos de esta en el fluido corporal de dicho sujeto está por encima de un umbral.
18. - El método in vitro de la reivindicación 17, en el que el umbral de intervención es de 75 mmHg.
19. - El método in vitro de la reivindicación 17, en el que el umbral de intervención es de 80 mmHg.
20. - Un vasopresor seleccionado del grupo que comprende adrenalina, catecolaminas, inhibidores de fosfodiesterasa, vasopresina, levosimendano, agonistas del receptor V1a de vasopresina, anticuerpos antiadrenomedulina, inhibidores de los canales de K+ dependientes de ATP+, inhibidores de NOS y de c-GMP, para su uso en un método de tratamiento in vivo de un sujeto que padece de estados de choque fisiológico, que incluyen choque séptico, choque cardiogénico y choque anafiláctico; infecciones, sepsis, insuficiencia cardíaca, parada cardiopulmonar, cirugía cardíaca postoperatoria, infarto ventricular derecho, bradiarritmias, politraumatismos, quemaduras, lesiones renales, en el que dicho sujeto tiene un nivel de proADM (SEC ID NO:1) y/o sus fragmentos, en el que dichos fragmentos se seleccionan del grupo que comprende adrenomedulina, ADM (SEC ID NO:4), ADM il-52-Gly (SEC ID NO:5), región intermedia de proadrenomedulina, MR-proADM (SEC ⁱD NO:3), proadrenomedulina C-terminal, CT-proADM (SEC ID NO:6) y péptido terminal N-20 de proadrenomedulina (^sE^cID NO:2) en una muestra de fluido corporal seleccionada del grupo que comprende plasma con citrato humano, plasma con heparina, plasma con EDTA, sangre entera, suero, que está por encima de un umbral.