ES2877548T3 - Agonista del receptor de glucocorticoides e inmunoconjugados del mismo - Google Patents

Agonista del receptor de glucocorticoides e inmunoconjugados del mismo Download PDF

Info

Publication number
ES2877548T3
ES2877548T3 ES17733222T ES17733222T ES2877548T3 ES 2877548 T3 ES2877548 T3 ES 2877548T3 ES 17733222 T ES17733222 T ES 17733222T ES 17733222 T ES17733222 T ES 17733222T ES 2877548 T3 ES2877548 T3 ES 2877548T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
tnf
alpha
antigen
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17733222T
Other languages
English (en)
Inventor
Michael J Mcpherson
Adrian D Hobson
Martin E Hayes
Christopher C Marvin
Diana Schmidt
Wendy Waegell
Christian Goess
Jason Z Oh
Jr Axel Hernandez
John T Randolph
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AbbVie Inc
Original Assignee
AbbVie Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=59215995&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2877548(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by AbbVie Inc filed Critical AbbVie Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2877548T3 publication Critical patent/ES2877548T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/58—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J71/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton is condensed with a heterocyclic ring
    • C07J71/0005—Oxygen-containing hetero ring
    • C07J71/0026—Oxygen-containing hetero ring cyclic ketals
    • C07J71/0031—Oxygen-containing hetero ring cyclic ketals at positions 16, 17
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Un compuesto: **(Ver fórmula)** en donde n es 2 o 4, y A es un anticuerpo que comprende SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 73 o adalimumab.

Description

DESCRIPCIÓN
Agonista del receptor de glucocorticoides e inmunoconjugados del mismo
Campo de la invención
El campo de la invención se refiere generalmente a inmunoconjugados agonistas del receptor de glucocorticoides y métodos para preparar y usar los mismos, por ejemplo, para tratar enfermedades autoinmunes o inflamatorias. Antecedentes de la invención
El factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) juega un papel central en la fisiopatología de varios trastornos humanos, y los agentes anti-TNFa (por ejemplo, adalimumab, etanercept e infliximab) tienen una utilidad terapéutica clínicamente validada en el tratamiento de trastornos autoinmunitarios e inflamatorios, como artritis reumatoide, psoriasis y enfermedad inflamatoria intestinal. A pesar de su éxito en la clínica, los biológicos anti-TNFa todavía están limitados en la eficacia máxima que pueden lograr en los pacientes, lo que requiere la identificación y el desarrollo de terapéuticas más potentes y efectivas. Los pacientes tratados con biológicos anti-TNFa también pueden desarrollar una respuesta inmunogénica a la terapéutica, lo que limita así su eficacia. Por lo tanto, las terapéuticas anti-TNFa con menor inmunogenicidad y alta eficacia serían útiles para controlar aún más la enfermedad.
Los agonistas de los receptores de glucocorticoides sintéticos (por ejemplo, dexametasona, prednisolona y budesonida) son una clase potente de moléculas pequeñas que se usan en el tratamiento de trastornos inflamatorios, pero su utilidad en el tratamiento crónico de enfermedades es limitada debido a los efectos secundarios graves. Se han descrito varios enfoques para conservar la eficacia antiinflamatoria de los glucocorticoides sintéticos mientras se evitan las toxicidades no deseadas (Rosen, J y Miner, JN Endocrine Reviews 26: 452-64 (2005)). Sin embargo, estas metodologías han tenido poco éxito. Existe una necesidad en el campo de las terapéuticas de enfermedades inflamatorias y autoinmunes para desarrollar terapéuticas con una eficacia mejorada y una acción de mayor duración en comparación con los anticuerpos anti-TNF y con efectos no deseados mínimos.
Breve resumen de la invención
La presente invención proporciona un compuesto:
Figure imgf000002_0001
en donde n es 2 o 4, y A es un anticuerpo que comprende SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 73 o adalimumab. En otras modalidades de la invención, n es 4. En otras modalidades de la invención, n es 2. En otras modalidades de la invención, A es adalimumab.
Breve descripción de los dibujos/figuras
La Figura 1 muestra la estabilidad proteolítica de un ADC que contiene un esteroide y un ADC que contiene MMAE (monometil auristatina E). (Vea el ejemplo 76).
La Figura 2 muestra la cinética de la pérdida de ADC esteroidal en el enlazador de fármacos en ratones. (Vea el ejemplo 77).
La Figura 3 muestra la actividad de una respuesta a una dosis terapéutica única de ADC esteroidal anti-mTNFa en un modelo de artritis en ratón. (Vea el ejemplo 85.)
La Figura 4 muestra la actividad del esteroide anti-TNFa humano en el modelo de artritis de ratón huTNFa Tg CAIA. (Vea el ejemplo 87).
La Figura 5 es un cromatograma HIC que muestra una mezcla heterogénea que contiene anticuerpos que tienen cero moléculas SM-LQ unidas (pico "E0"), dos moléculas SM-LQ unidas (pico "E2"), cuatro moléculas SM-LQ unidas (pico "E4"), restos SM-LQ unidos (pico "E6") y ocho moléculas SM-LQ unidas (pico"E8"), en dependencia del número de enlaces disulfuro entre cadenas que se han reducido. (SM es un radical de un glucocorticosteroide; L es un enlazador y Q es un grupo heterobifuncional o grupo heterotrifuncional; o Q está ausente). (Vea el ejemplo 74).
La Figura 6 es un cromatograma SEC de adalimumab conjugado con un glucocorticosteroide. (Vea el ejemplo 74).
La Figura 7 es un gráfico de líneas que muestra datos de MS sin procesar de adalimumab conjugado con un glucocorticosteroide. (Vea el ejemplo 74).
La Figura 8 es un gráfico de líneas que muestra datos de EM deconvolucionado de adalimumab conjugado con un glucocorticosteroide. El cuadrado negro y el círculo representan el ADC con succinimida hidrolizada y no hidrolizada, respectivamente. La abundancia relativa de ADC hidrolizado y no hidrolizado se usa para determinar la conversión de hidrólisis. (Vea el ejemplo 74).
La Figura 9 muestra que un ADC esteroidal anti-TNF es significativamente más eficaz para reducir la inflamación del oído en ratones que la combinación concurrente del anticuerpo anti-TNF y el esteroide o el anticuerpo anti-TNF solo. (Vea el ejemplo 84).
La Figura 10 muestra que una dosis única de un ADC esteroidal anti-TNF es tan eficaz para reducir la hinchazón de la pata como 21 días de dosificación diaria de un esteroide. (Vea el ejemplo 85).
La Figura 11 muestra el cambio de peso de los animales tratados con esteroides, un anticuerpo anti-TNF, un ADC anti-TNF o un isotipo ADC. (Vea el ejemplo 85).
La Figura 12 muestra que una dosis única de un ADC esteroidal anti-TNF puede reducir la hinchazón establecida de la pata, mientras que una dosis única de un anticuerpo anti-TNF tuvo un efecto mínimo. (Vea el ejemplo 88). La Figura 13 muestra el efecto del tratamiento con un ADC esteroidal anti-TNF sobre la pérdida ósea del tarso medida por micro-tomografía computarizada (pCT). (Los puntos de datos individuales (por ejemplo, círculos, cuadrados o triángulos) representan animales individuales). (Vea el ejemplo 88).
La Figura 14 muestra el efecto del tratamiento con un ADC esteroidal anti-TNF sobre la inflamación. (Los puntos de datos individuales (por ejemplo, círculos, cuadrados o triángulos) representan animales individuales). (Vea el ejemplo 88).
La Figura 15 muestra el efecto del tratamiento con un ADC esteroidal anti-TNF sobre la formación de pannus. (Los puntos de datos individuales (por ejemplo, círculos, cuadrados o triángulos) representan animales individuales). (Vea el ejemplo 88).
La Figura 16 muestra el efecto del tratamiento con un ADC esteroidal anti-TNF sobre la erosión ósea. (Los puntos de datos individuales (por ejemplo, círculos, cuadrados o triángulos) representan animales individuales). (Vea el ejemplo 88).
La Figura 17 muestra el efecto del tratamiento con un ADC esteroidal anti-TNF sobre el daño del cartílago. (Los puntos de datos individuales (por ejemplo, círculos, cuadrados o triángulos) representan animales individuales). (Vea el ejemplo 88).
La Figura 18 muestra el efecto del tratamiento con un ADC esteroidal anti-TNF sobre glóbulos blancos en sangre periférica. (Los puntos de datos individuales (por ejemplo, círculos, cuadrados o diamantes) representan animales individuales). (Vea el ejemplo 88).
La Figura 19 muestra el efecto del tratamiento con un ADC esteroidal anti-TNF sobre neutrófilos en sangre periférica. (Los puntos de datos individuales (por ejemplo, círculos, cuadrados o diamantes) representan animales individuales). (Vea el ejemplo 88).
La Figura 20 muestra el efecto del tratamiento con un ADC esteroidal anti-TNF sobre linfocitos en sangre periférica. (Los puntos de datos individuales (por ejemplo, círculos, cuadrados o diamantes) representan animales individuales). (Vea el ejemplo 88).
La Figura 21 muestra el efecto del tratamiento con un ADC esteroidal anti-TNF sobre monocitos en sangre periférica. (Los puntos de datos individuales (por ejemplo, círculos, cuadrados o diamantes) representan animales individuales). (Vea el ejemplo 88).
La Figura 22 muestra el efecto del tratamiento con un ADC esteroidal anti-TNF sobre eosinófilos en sangre periférica. (Vea el ejemplo 88).
La Figura 23 muestra el efecto del tratamiento con un ADC esteroidal anti-TNF sobre basófilos en sangre periférica. (Vea el ejemplo 88).
La Figura 24 muestra la actividad de un ADC esteroidal anti-TNF y un ADC esteroidal anti-CD 163 en artritis inducida por colágeno de ratón. (Vea el ejemplo 89.)
Descripción detallada de la invención
I. Definiciones
Para facilitar la comprensión de la presente descripción, a continuación se definen varios términos y frases.
El término "proteína anti-TNF alfa" se refiere a proteínas que son capaces de (i) unirse a TNF alfa e (ii) inhibir la unión de TNF-alfa soluble a receptores de TNF de la superficie celular (p55 y/o p75) y/o lisar células que expresan el receptor de TNF alfa o TNF alfa de superficie in vitro en presencia de complemento. Las proteínas anti-TNF alfa incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF o fragmentos de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, adalimumab o infliximab) así como receptores de TNF solubles (por ejemplo, etanercept).
Como se usa en la presente descripción, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" son términos de la técnica y se pueden usar indistintamente en la presente descripción y se refieren a una molécula con un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a un antígeno.
El término "anticuerpo" significa una molécula de inmunoglobulina que reconoce y se une específicamente a una diana, como una proteína, polipéptido, péptido, carbohidrato, polinucleótido, lípido o combinaciones de los anteriores a través de al menos un sitio de reconocimiento del antígeno dentro de la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo" abarca anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada siempre que los anticuerpos exhiban la actividad biológica deseada. Un anticuerpo puede ser de cualquiera de las cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, o subclases (isotipos) de las mismas (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), basado en la identidad de sus dominios constantes de cadena pesada denominadas alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las diferentes clases de inmunoglobulinas tienen estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales diferentes y bien conocidas. Los anticuerpos pueden estar desnudos o conjugados con otras moléculas tales como toxinas, radioisótopos, etc. Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo" abarca anticuerpos biespecíficos y multiespecíficos.
El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de un anticuerpo intacto. Un "fragmento de unión al antígeno" se refiere a una porción de un anticuerpo intacto que se une a un antígeno. Un fragmento de unión al antígeno puede contener las regiones variables determinantes de antígeno de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, anticuerpos lineales y anticuerpos monocatenarios. Un "fragmento de unión al antígeno" puede ser un fragmento de unión al antígeno biespecífico o multiespecífico.
El término "anticuerpo anti-TNF-alfa" o "un anticuerpo que se une a TNF-alfa" se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse al TNF-alfa con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico en el TNF-alfa diana. El grado de unión de un anticuerpo anti-TNF-alfa a una proteína no TNF-alfa, no relacionada, puede ser menor que aproximadamente el 10 % de la unión del anticuerpo al TNF-alfa medido, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA). En determinadas modalidades, un anticuerpo que se une a TNF-alfa tiene una constante de disociación (Kd) de <1 pM, <100 nM, <10 nM, <1 nM o <0,1 nM.
Un anticuerpo "monoclonal" o un fragmento de unión al antígeno del mismo se refiere a un anticuerpo homogéneo o una población de fragmentos de unión al antígeno implicada en el reconocimiento y unión altamente específicos de un único determinante antigénico, o epítopo. Esto contrasta con los anticuerpos policlonales que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes antigénicos. El término anticuerpo "monoclonal" o fragmento de unión al antígeno del mismo abarca tanto anticuerpos monoclonales intactos como de longitud completa, así como fragmentos de anticuerpos (tales como Fab, Fab', F(ab') 2, Fv), mutantes de cadena sencilla (scFv), proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprenda un sitio de reconocimiento del antígeno. Además, anticuerpo "monoclonal" o fragmento de unión al antígeno del mismo se refiere a dichos anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos elaborados de diversas formas, que incluyen pero no se limitan a, hibridomas, selección de fagos, expresión recombinante y animales transgénicos.
El término anticuerpo "humanizado" o fragmento de unión al antígeno del mismo se refiere a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) o fragmentos de unión al antígeno que son cadenas de inmunoglobulinas específicas, inmunoglobulinas quiméricas o fragmentos de las mismas que contienen secuencias mínimas no humanos (por ejemplo murinas). Normalmente, los anticuerpos humanizados o sus fragmentos de unión al antígeno son inmunoglobulinas humanas en las que los residuos de la región determinante complementaria (CDR) se reemplazan por residuos de la CDR de una especie no humana (por ejemplo, ratón, rata, conejo, hámster) que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas ("CDR injertada") (Jones y otros, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann y otros, Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen y otros, Science 239: 1534-1536 (1988)). En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) Fv de una inmunoglobulina humana se reemplazan con los residuos correspondientes en un anticuerpo o fragmento de una especie no humana que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. El anticuerpo humanizado o su fragmento de unión al antígeno se pueden modificar adicionalmente mediante la sustitución de residuos adicionales en la región marco Fv y/o dentro de los residuos no humanos reemplazados para refinar y optimizar el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la misma especificidad, afinidad, y/o capacidad. En general, el anticuerpo humanizado o su fragmento de unión al antígeno comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos o tres, dominios variables que contienen todas o sustancialmente todas las regiones CDR que corresponden a la inmunoglobulina no humana mientras que todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado o su fragmento de unión al antígeno también pueden comprender al menos una parte de una región o dominio constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente el de una inmunoglobulina humana. Se describen ejemplos de métodos usados para generar anticuerpos humanizados en la patente de Estados Unidos 5,225,539; Roguska y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., EE. UU., 91(3): 969-973 (1994), y Roguska y otros, Protein Eng.
9(10): 895-904 (1996). En algunas modalidades, un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo revestido.
Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea sola o en combinación. Las regiones variables de la cadena pesada y ligera constan cada una de cuatro regiones marco (FR) conectadas por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos. Existen al menos dos técnicas para determinar las CDR: (1) un enfoque basado en la variabilidad de la secuencia entre especies (es decir, Kabat y otros. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); y (2) un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Al-lazikani y otros (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Además, en ocasiones se usan en la técnica combinaciones de estos dos enfoques para determinar las CDR.
El sistema de numeración de Kabat se usa generalmente cuando se hace referencia a un residuo en el dominio variable (aproximadamente los residuos 1-107 de la cadena ligera y los residuos 1-113 de la cadena pesada) (por ejemplo, Kabat y otros, Sequences of Immunological Interest. 5a Ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. (1991)). A menos que se indique explícitamente lo contrario, el sistema de numeración usado en la presente descripción es el sistema de numeración de Kabat.
La numeración de la posición de los aminoácidos, como en Kabat, se refiere al sistema de numeración usado para los dominios variables de la cadena pesada o los dominios variables de la cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. (1991). Mediante el uso de este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o más, correspondientes a un acortamiento o inserción en un FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir un inserto de un solo aminoácido (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 del FR de la cadena pesada. La numeración de residuos de Kabat se puede determinar para un anticuerpo dado mediante el alineamiento en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "estándar". Chothia se refiere en cambio a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). El final del bucle Chothia CDR-H1 cuando se numera mediante el uso de la convención de numeración de Kabat varía entre H32 y H34 en dependencia de la longitud del bucle (esto se debe a que el esquema de numeración de Kabat coloca las inserciones en H35A y H35B; si ni 35A ni 35B están presentes, el bucle termina en 32; si solo está presente 35A, el bucle termina en 33; si están presentes tanto 35A como 35B, el bucle termina en 34). Las regiones hipervariables de AbM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y son usadas mediante el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular.
Bucle Kabat AbM Chotia
L1 L24-L34 L24-L34 L24-L34
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56
L3 L89-L97 L89-L97 L89-L97
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32..34
(Numeración de Kabat)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32
(Numeración de Chothia)
H2 H50-H65 H50-H58 H52-H56
H3 H95-H102 H95-H102 H95-H102
En ciertos aspectos, las CDR de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se pueden determinar de acuerdo con el esquema de numeración de Chothia, que se refiere a la ubicación de los bucles estructurales de inmunoglobulina (vea, por ejemplo, Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B y otros, (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C y otros, (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A y otros, (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82; y Patente de Estados Unidos No. 7.709.226). Normalmente, cuando se usa la convención de numeración de Kabat, el bucle CDR-H1 de Chothia está presente en los aminoácidos 26 a 32, 33 o 34 de la cadena pesada, el bucle CDR-H2 de Chothia está presente en los aminoácidos 52 a 56 de la cadena pesada, y el bucle CDR-H3 de Chothia está presente en los aminoácidos 95 a 102 de la cadena pesada, mientras que el bucle CDR-L1 de Chothia está presente en los aminoácidos 24 a 34 de la cadena ligera, el bucle CDR-L2 de Chothia está presente en los aminoácidos 50 a 56 de la cadena ligera, y el bucle CDR-L3 de Chothia está presente en los aminoácidos 89 a 97 de la cadena ligera. El final del bucle CDR-H1 de Chothia cuando se numera al usar la convención de numeración de Kabat varía entre H32 y H34 en dependencia de la longitud del bucle (esto se debe a que el esquema de numeración de Kabat coloca las inserciones en H35A y H35B; si ni 35A ni 35B están presentes, el bucle termina en 32; si solo está presente 35A, el bucle termina en 33; si están presentes tanto 35A como 35B, el bucle termina en 34).
En ciertos aspectos, las CDR de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se pueden determinar de acuerdo con el sistema de numeración IMGT como se describe en Lefranc MP, (1999) The Immunologist 7: 132-136 y Lefranc MP y otros, (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212. De acuerdo con el esquema de numeración IMGT, VH-CDR1 está en las posiciones 26 a 35, VH-CDR2 está en las posiciones 51 a 57, VH-CDR3 está en las posiciones 93 a 102, VL-CDR1 está en las posiciones 27 a 32, VL-CDR2 está en las posiciones 50 a 52, y VL-CDR3 está en las posiciones 89 a 97.
En ciertos aspectos, las CDR de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se pueden determinar de acuerdo con MacCallum RM y otros, (1996) J Mol Biol 262: 732-745. Vea también, por ejemplo, Martin A. "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains", en Antibody Engineering, Kontermann y Dübel, eds., Capítulo 31, págs. 422-439, Springer-Verlag, Berlín (2001).
En ciertos aspectos, las CDR de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se pueden determinar de acuerdo con el esquema de numeración AbM, que se refiere a regiones hipervariables de AbM que representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y son usadas por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular (Oxford Molecular Group, Inc.).
El término anticuerpo "humano" significa un anticuerpo producido por un ser humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un anticuerpo producido por un ser humano elaborado mediante el uso de cualquier técnica conocida en la técnica. Esta definición de un anticuerpo humano incluye anticuerpos intactos o de longitud completa, fragmentos de los mismos y/o anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de cadena pesada y/o ligera humana tales como, por ejemplo, un anticuerpo que comprende polipéptidos de cadena ligera murina y cadena pesada humana.
El término anticuerpos "quiméricos" se refiere a anticuerpos en donde la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina se deriva de dos o más especies. Normalmente, la región variable de las cadenas ligera y pesada corresponde a la región variable de anticuerpos derivados de una especie de mamíferos (por ejemplo, ratón, rata, conejo, etc.) con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas, mientras que las regiones constantes son homólogas a las secuencias en anticuerpos derivados de otro (generalmente humano) para evitar provocar una respuesta inmune en esa especie.
El término "epítopo" o "determinante antigénico" se usa indistintamente en la presente descripción y se refiere a la parte de un antígeno capaz de ser reconocido y unido específicamente por un anticuerpo particular. Cuando el antígeno es un polipéptido, los epítopos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos se retienen normalmente tras la desnaturalización de proteínas, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario se pierden normalmente tras la desnaturalización de proteínas. Un epítopo incluye normalmente al menos 3, y más usualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.
La "afinidad de unión" generalmente se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, como se usa en la presente descripción, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y generalmente se puede representar mediante la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir mediante métodos comunes conocidos en la técnica, que incluyen los descritos en la presente descripción. Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen al antígeno más rápido y tienden a permanecer unidos por más tiempo. Se conocen en la técnica una variedad de métodos para medir la afinidad de unión, cualquiera de los cuales puede usarse para los propósitos de la presente descripción. A continuación se describen modalidades ilustrativas específicas.
"O mejor" cuando se usa en la presente descripción para referirse a la afinidad de unión se refiere a una unión más fuerte entre una molécula y su pareja de unión. "O mejor" cuando se usa en la presente descripción se refiere a una unión más fuerte, representada por un valor numérico de Kd más pequeño. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una afinidad por un antígeno de "0,6 nM o mejor", la afinidad del anticuerpo por el antígeno es <0,6 nM, es decir, 0,59 nM, 0,58 nM, 0,57 nM, etc. o cualquier valor inferior a 0,6 nM.
Por "se une específicamente", generalmente se quiere decir que un anticuerpo se une a un epítopo a través de su dominio de unión al antígeno, y que la unión implica cierta complementariedad entre el dominio de unión al antígeno y el epítopo. De acuerdo con esta definición, se dice que un anticuerpo "se une específicamente" a un epítopo cuando se une a ese epítopo, a través de su dominio de unión al antígeno, más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo aleatorio no relacionado. El término "especificidad" se usa en la presente descripción para calificar la afinidad relativa por la que un determinado anticuerpo se une a un cierto epítopo. Por ejemplo, se puede considerar que el anticuerpo "A" tiene una mayor especificidad por un epítopo dado que el anticuerpo "B", o se puede decir que el anticuerpo "A" se une al epítopo "C" con una mayor especificidad que la que tiene por el epítopo "D" relacionado.
Por "se une preferentemente" se entiende que el anticuerpo se une específicamente a un epítopo más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo relacionado, similar, homólogo o análogo. Por tanto, un anticuerpo que "se une preferentemente" a un epítopo dado se unirá más probablemente a ese epítopo que a un epítopo relacionado, incluso aunque dicho anticuerpo pueda reaccionar de forma cruzada con el epítopo relacionado.
Se dice que un anticuerpo "inhibe competitivamente" la unión de un anticuerpo de referencia a un epítopo dado si el anticuerpo se une preferentemente a ese epítopo o un epítopo superpuesto en la medida en que bloquea, hasta cierto grado, la unión del anticuerpo de referencia al epítopo. La inhibición competitiva puede determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos ELISA de competición. Se puede decir que un anticuerpo inhibe competitivamente la unión del anticuerpo de referencia a un epítopo dado en al menos un 90 %, al menos un 80 %, al menos un 70 %, al menos un 60 % o al menos un 50 %.
Un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que está "aislado" es un polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que se encuentra en una forma que no se encuentra en la naturaleza. Los polipéptidos, anticuerpos, polinucleótidos, vectores, células o composiciones aislados incluyen aquellos que se han purificado hasta el punto de que ya no se encuentran en la forma en que se encuentran en la naturaleza. En algunas modalidades, un anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que se aísla es sustancialmente puro.
Como se usa en la presente descripción, "sustancialmente puro" se refiere a material que es al menos 50 % puro (es decir, libre de contaminantes), al menos 90 % puro, al menos 95 % puro, al menos 98 % puro, o al menos 99 % puro.
El término "inmunoconjugado", "conjugado", "conjugado anticuerpo-fármaco" o "ADC", como se usa en la presente descripción, se refiere a un compuesto o un derivado del mismo que está unido a una proteína, como un agente de unión celular (por ejemplo, un anticuerpo anti-TNF -alfa o fragmento del mismo) y se define por una fórmula genérica: (SM-L-Q) n -A, en la que SM = radical derivado de un agonista del receptor de glucocorticoides de molécula pequeña, por ejemplo, un glucocorticosteroide, L = enlazador, Q = grupo heterobifuncional, un grupo heterotrifuncional, o está ausente, y A = una proteína (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, una proteína anti-TNF, un anticuerpo anti-TNF-alfa o fragmento del mismo, un receptor soluble, o un receptor de TNF soluble) y n = 1-10. Los inmunoconjugados también se pueden definir mediante la fórmula genérica en orden inverso: A-(Q-L-SM)n A modo de ilustración, la siguiente fórmula genérica muestra un inmunoconjugado que tiene un enlazador dipéptido (Ala-Ala) y un grupo heterobifuncional basado en tioéter de succinimida:
Figure imgf000007_0001
En la presente descripción, el término "enlazador" se refiere a cualquier resto químico capaz de unir una proteína, por ejemplo, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) o equivalente funcional a un glucocorticosteroide. Los enlazadores pueden ser susceptibles a escisión (un "enlazador escindible") lo que facilita así la liberación del glucocorticosteroide. Por ejemplo, tales enlazadores escindibles pueden ser susceptibles a la escisión inducida por ácido, escisión fotoinducida, escisión inducida por peptidasas, escisión inducida por esterasa y escisión de enlaces disulfuro, en condiciones en las que el glucocorticosteroide y/o el anticuerpo permanecen activos. Alternativamente, los enlazadores pueden ser sustancialmente resistentes a la escisión (un "enlazador no escindible").
En la presente descripción, los enlazadores no escindibles son cualquier resto químico capaz de unir un glucocorticosteroide a un anticuerpo de una manera covalente estable y no cae en las categorías enumeradas anteriormente para enlazadores escindibles. Por tanto, los enlazadores no escindibles son sustancialmente resistentes a la escisión inducida por ácido, la escisión fotoinducida, la escisión inducida por peptidasas, la escisión inducida por esterasa y la escisión del enlace disulfuro. Además, no escindible se refiere a la capacidad del enlace químico en el enlazador o adyacente al enlazador para resistir la escisión inducida por un ácido, un agente de escisión fotolábil, una peptidasa, una esterasa o un compuesto químico o fisiológico que escinde un enlace disulfuro, en condiciones en las que un glucocorticosteroide y/o el anticuerpo no pierden su actividad.
Algunos enlazadores escindibles son escindidos por peptidasas ("enlazadores escindibles por peptidasa"). Sólo ciertos péptidos se escinden fácilmente dentro o fuera de las células, vea, por ejemplo, Trout y otros, 79 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 626-629 (1982) y Umemoto y otros 43 Int. J. Cancer, 677-684 (1989). Además, los péptidos están compuestos de unidades de a-aminoácidos y enlaces peptídicos, que químicamente son enlaces amida entre el carboxilato de un aminoácido y el grupo amino de un segundo aminoácido. Se entiende que otros enlaces amida, como el enlace entre un carboxilato y el grupo a-aminoácido de la lisina, no son enlaces peptídicos y se consideran no escindibles.
Algunos enlazadores son escindidos por esterasas ("enlazadores escindibles por esterasa"). Solo ciertos ésteres pueden ser escindidos por las esterasas presentes dentro o fuera de las células. Los ésteres se forman por la condensación de un ácido carboxílico y un alcohol. Los ésteres simples son ésteres producidos con alcoholes simples, como alcoholes alifáticos y alcoholes aromáticos pequeños cíclicos y pequeños.
En algunas modalidades, el componente enlazador escindible puede comprender un péptido que comprende de uno a diez residuos de aminoácidos. En estas modalidades, el péptido permite la escisión del enlazador por una proteasa, lo que facilita así la liberación del glucocorticosteroide tras la exposición a proteasas intracelulares, tales como enzimas lisosomales (Doronina y otros (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784). Los péptidos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos y pentapéptidos. Los dipéptidos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, alanina-alanina (ala-ala), valinecitrulina (vc o val-cit), alanina-fenilalanina (af o ala-phe); fenilalaninalisina (fk o phe-lys); fenilalanina-homolisina (phe-homolisina); y N-metil-valina-citrulina (Me-val-cit). Los tripéptidos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Un péptido puede comprender residuos de aminoácidos naturales y/o no naturales. El término "aminoácido de origen natural" se refiere a Ala, Asp, Cys, Glu, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp y Tyr. Los "aminoácidos no naturales" (es decir, los aminoácidos no se encuentran naturalmente) incluyen, a modo de ejemplo no limitante, homoserina, homoarginina, citrulina, fenilglicina, taurina, yodotirosina, selenocisteína, norleucina ("Nle"), norvalina ("Nva"), beta-alanina, L- o D-naftalanina, ornitina ("Orn") y similares. Los péptidos pueden diseñarse y optimizarse para la escisión enzimática por una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada a tumores, catepsina B, C y D, o una proteasa plasmina.
Los aminoácidos también incluyen las formas D de aminoácidos naturales y no naturales. "D-" designa un aminoácido que tiene la configuración "D" (dextrogiratoria), en oposición a la configuración en los aminoácidos ("L-") que se encuentran en la naturaleza. Los aminoácidos naturales y no naturales pueden adquirirse comercialmente (Sigma Chemical Co., Advanced Chemtech) o sintetizarse mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. En la presente descripción, el término "glucocorticosteroide" se refiere a hormonas esteroideas naturales o sintéticas que interactúan con los receptores de glucocorticoides. Los glucocorticosteroides ilustrativos no limitantes incluyen:
Figure imgf000008_0001
budesonida flunisolida acetónido de triamcinolona
Figure imgf000008_0002
propionato de fluticasona dipropionato de beclometasona
A modo de ejemplo, los anillos A, B, C y D del esqueleto de esteroides están marcados para budesonida. Los glucocorticosteroides se describen en el documento WO 2009/069032.
Un "radical de un glucocorticosteroide" se deriva de la eliminación de uno o más átomos de hidrógeno de un glucocorticosteroide original. La eliminación del(los) átomo(s) de hidrógeno facilita(n) la unión del glucocorticosteroide original a un enlazador. En una modalidad, el átomo de hidrógeno se elimina de cualquier grupo adecuado -NH2 del glucocorticosteroide parental. En otra modalidad, el átomo de hidrógeno se elimina de cualquier grupo -OH adecuado del glucocorticosteroide parental. En otra modalidad, el átomo de hidrógeno se elimina de cualquier grupo -SH adecuado del glucocorticosteroide parental. En otra modalidad, el átomo de hidrógeno se elimina de cualquier grupo -N(H) adecuado del glucocorticosteroide parental. En otra modalidad, el átomo de hidrógeno se elimina de cualquier grupo - CH3 , -CH2 - o -CH = adecuado del glucocorticosteroide parental. En una modalidad, el "radical de un glucocorticosteroide" es un radical monovalente derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un glucocorticosteroide parental.
En la presente descripción, el término "grupo heterobifuncional" o el término "grupo heterotrifuncional" se refiere a un resto químico que conecta un enlazador y una proteína, por ejemplo, un anticuerpo. Los grupos heterobi y trifuncionales se caracterizan por tener diferentes grupos reactivos en cada extremo del resto químico. Los grupos heterobifuncionales ilustrativos no limitantes incluyen:
Figure imgf000009_0001
Un grupo heterotrifuncional ilustrativo no limitante es:
Figure imgf000009_0002
El término "razón de fármaco-anticuerpo" o "DAR" se refiere al número de SM (es decir, radicales derivados de un agonista del receptor de glucocorticoides de molécula pequeña, por ejemplo, un glucocorticosteroide) unidos a A (es decir, una proteína, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, una proteína anti-TNF, un anticuerpo anti-TNF-alfa o fragmento del mismo, un receptor soluble o un receptor de TNF soluble). Por tanto, en el inmunoconjugado que tiene la fórmula genérica (SM-L-Q)n-A, el DAR se define por la variable "n".
Cuando se hace referencia a un compuesto que tiene la fórmula (SM-L-Q)n-A que representa un inmunoconjugado individual, el DAR se refiere al número de SM enlazados al individuo A (por ejemplo, n es un número entero del 1 al 10).
Cuando se hace referencia a un compuesto que tiene la fórmula (SM-L-Q)n-A que representa una pluralidad de inmunoconjugados, el DAR se refiere al número promedio de SM enlazados al As (por ejemplo, n es un número entero o fracción del 1 al 10). Así, a modo de ejemplo, un compuesto que tiene la fórmula (SM-L-Q)n-A que comprende un primer inmunoconjugado con 3 SM por A y un segundo inmunoconjugado con 4 SM por A tendría un DAR (es decir, una "n") de 3,5.
El término "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero), que incluyen, entre otros, humanos, primates no humanos, roedores y similares, que va a ser el receptor de un tratamiento particular. Normalmente, los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en la presente descripción en referencia a un sujeto humano. El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica del ingrediente activo sea eficaz y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación. La formulación puede ser estéril.
Términos como "al tratar" o "tratamiento" o "tratar" o "al aliviar" o "aliviar" se refieren a medidas terapéuticas que curan, ralentizan, reducen los síntomas de, y/o detienen la progresión de una afección o trastorno patológico diagnosticado. Por lo tanto, aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya han sido diagnosticados o se sospecha que tienen el trastorno. Las medidas profilácticas o preventivas se refieren a medidas que previenen y/o retrasan el desarrollo de una condición o trastorno patológico específico. Por tanto, aquellos que necesitan medidas profilácticas o preventivas incluyen aquellos propensos a padecer el trastorno y aquellos en los que se debe prevenir el trastorno.
"Polinucleótido" o "ácido nucleico", como se usa indistintamente en la presente descripción, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluye ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse a un polímero mediante ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación de la estructura de los nucleótidos puede impartirse antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede interrumpirse por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido se puede modificar adicionalmente después de la polimerización, por ejemplo mediante conjugación con un componente de marcaje. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "tapas", sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, cabamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), los que contienen restos colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, ply-L-lisina, etc.), los que tienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), los que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), los que contienen alquilantes, los que tienen enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del(los) polinucleótido (s). Además, cualquiera de los grupos hidroxilo normalmente presentes en los azúcares puede reemplazarse, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegerse con grupos protectores estándar o activarse para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o puede conjugarse con soportes sólidos. El OH terminal 5 'y 3' puede fosforilarse o sustituirse con aminas o restos de grupos protectores orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. También se pueden derivar otros hidroxilos a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares ribosa o desoxirribosa que se conocen generalmente en la técnica, que incluyen, por ejemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alilo, 2'-fluoroo 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares a-anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares piranosa, azúcares furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos tales como metil ribósido. Se pueden reemplazar uno o más enlaces fosfodiéster por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a, modalidades en las que el fosfato se reemplaza por P(O)S ("tioato"), P(S) S ("ditioato"), "(O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P (O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en el que cada R o R' es independientemente H o alquilo (1-20 C) sustituido o no sustituido que contiene opcionalmente un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No es necesario que todos los enlaces en un polinucleótido sean idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en esta descripción, que incluyen ARN y ADN.
El término "vector" significa una construcción, que es capaz de administrar, y opcionalmente expresar, uno o más genes o secuencias de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, vectores de plásmidos, cósmidos o fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas, y ciertas células eucariotas, como las células productoras.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, como la conjugación con un componente de marcaje. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluidos, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que, debido a que los polipéptidos de esta descripción se basan en anticuerpos, en ciertas modalidades, los polipéptidos pueden presentarse como cadenas simples o cadenas asociadas.
Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y alinean (mediante la introducción de huecos, si es necesario) para una correspondencia máxima, sin considerar ninguna sustitución conservativa de aminoácidos como parte de la identidad de secuencia. El porcentaje de identidad se puede medir mediante el uso del software o algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Se conocen en la técnica varios algoritmos y software que pueden usarse para obtener alineamientos de secuencias de aminoácidos o nucleótidos. Un ejemplo no limitante de un algoritmo de alineación de secuencias es el algoritmo descrito en Karlin y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268 (1990), modificado en Karlin y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877 (1993), e incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (Altschul y otros, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1991)). En determinadas modalidades, Gapped BLASt se puede usar como se describe en Altschul y otros, Nucleic Acids Res. 25:3389 -3402 (1997). BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul y otros, Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) o Megalign (DNASTAR) son otros programas de software disponibles públicamente que se pueden usar para alinear secuencias. En ciertas modalidades, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina mediante el uso del programa GAP en el software GCG (por ejemplo, mediante el uso de una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de espacio de 40, 50, 60, 70 o 90 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6). En ciertas modalidades alternativas, el programa GAP en el paquete de software GCG, que incorpora el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) se puede usar para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo, mediante el uso de una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5). Alternativamente, en ciertas modalidades, el porcentaje de identidad entre secuencias de nucleótidos o aminoácidos se determina mediante el uso del algoritmo de Myers y Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Por ejemplo, el porcentaje de identidad se puede determinar mediante el uso del programa ALIGN (versión 2.0) y mediante el uso de un PAM120 con tabla de residuos, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4. Un experto en la técnica puede determinar los parámetros apropiados para la alineación máxima mediante un software de alineación particular. En determinadas modalidades, se usan los parámetros predeterminados del software de alineación. En ciertas modalidades, el porcentaje de identidad "X" de una primera secuencia de aminoácidos a una segunda secuencia de aminoácidos se calcula como 100 x (Y/Z), donde Y es el número de residuos de aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas en la alineación de la primera y segunda secuencias (alineadas por inspección visual o un programa de alineación de secuencias particular) y Z es el número total de residuos en la segunda secuencia. Si la longitud de una primera secuencia es más larga que la segunda secuencia, el porcentaje de identidad de la primera secuencia a la segunda secuencia será más largo que el porcentaje de identidad de la segunda secuencia a la primera secuencia.
Como ejemplo no limitante, si cualquier polinucleótido en particular tiene un cierto porcentaje de identidad de secuencia (por ejemplo, es al menos un 80 % idéntico, al menos un 85 % idéntico, al menos un 90 % idéntico y, en algunas modalidades, al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico) a una secuencia de referencia puede, en ciertas modalidades, determinarse mediante el uso del programa Bestfit (Paquete de Análisis de Secuencia de Wisconsin, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981)) para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineación de secuencias para determinar si una secuencia en particular es, por ejemplo, 95 % idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente descripción, los parámetros se establecen de manera que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de referencia y que se permiten huecos en la homología de hasta el 5 % del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia.
En algunas modalidades, dos ácidos nucleicos o polipéptidos de la descripción son sustancialmente idénticos, lo que significa que tienen al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % y en algunas modalidades al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de residuos de nucleótidos o aminoácidos, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, según se mide mediante el uso de un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. La identidad puede existir en una región de las secuencias que tiene al menos aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 40-60 residuos de longitud o cualquier valor integral entre ellos, y puede estar en una región más larga que 60-80 residuos, por ejemplo, en al menos aproximadamente 90-100 residuos, y en algunas modalidades, las secuencias son sustancialmente idénticas en toda la longitud de las secuencias que se comparan, como la región codificante de una secuencia de nucleótidos, por ejemplo.
Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es aquella en la que un residuo de aminoácido se reemplaza con otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, que incluyen cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales de ramificación beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por ejemplo, la sustitución de una fenilalanina por una tirosina es una sustitución conservativa. En algunas modalidades, las sustituciones conservativas en las secuencias de los polipéptidos y anticuerpos de la descripción no anulan la unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos al antígeno o antígenos, por ejemplo, el TNF-alfa al que se une el anticuerpo. Los métodos para identificar sustituciones conservativas de nucleótidos y aminoácidos que no eliminan la unión de antígenos son bien conocidos en la técnica (vea, por ejemplo, Brummell y otros, Biochem. 32: 1180 -1187 (1993); Kobayashi y otros, Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); y Burks y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)).
En la presente descripción, el término "grupo protector" o "PG" se refiere a un grupo que bloquea, es decir, protege, la funcionalidad amina mientras se llevan a cabo reacciones en otros grupos funcionales o partes de la molécula.
Los expertos en la técnica estarán familiarizados con la selección, unión y escisión de grupos protectores de amina, y apreciarán que se conocen muchos grupos protectores diferentes en la técnica, siendo la idoneidad de un grupo protector u otro dependiente de la particularidad del esquema sintético planeado. Se encuentran disponibles para consulta tratados sobre el tema, como Wuts, PGM; Greene, TW, "Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", 4a Ed., J. Wiley & Sons, NY, 2007. Los grupos protectores adecuados incluyen el grupo carbobenciloxi (Cbz), terc-butiloxicarbonilo (BOC), 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC) y bencilo (Bn). En una modalidad, el grupo protector es el grupo BOC.
Los compuestos descritos en la presente descripción contienen centros asimétricos y, por tanto, dan lugar a enantiómeros, diastereómeros y otras formas estereoisoméricas. La presente descripción pretende abarcar el uso de todas estas formas posibles, así como sus formas racémicas y resueltas y mezclas de las mismas. Los enantiómeros individuales pueden separarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica en vista de la presente descripción. Cuando los compuestos descritos en la presente descripción contienen dobles enlaces olefínicos u otros centros de asimetría geométrica, y a menos que se especifique lo contrario, se pretende que incluyan isómeros geométricos tanto E como Z. También se pretende que todos los tautómeros queden abarcados por la presente descripción.
La presente descripción abarca la preparación y el uso de solvatos de los compuestos descritos en la presente descripción. Los solvatos normalmente no alteran significativamente la actividad fisiológica o la toxicidad de los compuestos y, como tales, pueden funcionar como equivalentes farmacológicos. El término "solvato" como se usa en la presente descripción es una combinación, asociación física y/o solvatación de un compuesto de la presente descripción con una molécula de disolvente tal como, por ejemplo, un disolvato, monosolvato o hemisolvato, donde la razón de molécula de disolvente a compuesto de la presente descripción es aproximadamente 2:1, aproximadamente 1:1 o aproximadamente 1:2, respectivamente. Esta asociación física implica diversos grados de enlaces iónicos y covalentes, incluidos los enlaces de hidrógeno. En ciertos casos, el solvato puede aislarse, como cuando se incorporan una o más moléculas de disolvente en la red cristalina de un sólido cristalino. Por tanto, "solvato" abarca tanto solvatos en fase de solución como solvatos aislables. Los compuestos descritos en la presente descripción pueden estar presentes como formas solvatadas con un disolvente farmacéuticamente aceptable, tal como agua, metanol, etanol y similares, y se pretende que la descripción incluya formas tanto solvatadas como no solvatadas de los compuestos descritos en la presente descripción. Un tipo de solvato es un hidrato. Un "hidrato" se refiere a un subgrupo particular de solvatos donde la molécula de disolvente es agua. Los solvatos normalmente pueden funcionar como equivalentes farmacológicos. La preparación de solvatos es conocida en la técnica. Vea, por ejemplo, M. Caira y otros, J. Pharmaceut. Sci., 93(3):601 -611 (2004), que describe la preparación de solvatos de fluconazol con acetato de etilo y con agua. EC van Tonder y otros, AAPS Pharm describen preparaciones similares de solvatos, hemisolvatos, hidratos y similares. Sci. Tech., 5(1): Artículo 12 (2004), y Al Bingham y otros, Chem. Comun. 603-604 (2001). Un proceso típico, no limitante, para preparar un solvato implicaría disolver un compuesto descrito en la presente descripción en un disolvente deseado (orgánico, agua o una mezcla de los mismos) a temperaturas por encima de 20 °C a aproximadamente 25 °C, luego enfriar la solución a una velocidad suficiente para formar cristales y aislar los cristales mediante métodos conocidos, por ejemplo, filtración. Se pueden usar técnicas analíticas como la espectroscopía infrarroja para confirmar la presencia del disolvente en un cristal del solvato.
La presente descripción abarca la preparación y el uso de sales de los compuestos descritos en la presente descripción, incluidas las sales no tóxicas farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de sales de adición farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición de ácidos orgánicos e inorgánicos y sales básicas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales metálicas tales como sal de sodio, sal de potasio, sal de cesio y similares; metales alcalinotérreos tales como sal de calcio, sal de magnesio y similares; sales de amina orgánica tales como sal de trietilamina, sal de piridina, sal de picolina, sal de etanolamina, sal de trietanolamina, sal de diciclohexilamina, sal de N,N'-dibenciletilendiamina y similares; sales de ácidos inorgánicos tales como clorhidrato, bromhidrato, fosfato, sulfato y similares; sales de ácidos orgánicos tales como citrato, lactato, tartrato, maleato, fumarato, mandelato, acetato, dicloroacetato, trifluoroacetato, oxalato, formato y similares; sulfonatos tales como metanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y similares; y sales de aminoácidos tales como arginato, asparginato, glutamato y similares.
Las sales de adición de ácido se pueden formar mediante la mezcla de una solución del compuesto particular descrito con una solución de un ácido no tóxico farmacéuticamente aceptable como ácido clorhídrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido acético, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido carbónico, ácido fosfórico, ácido oxálico, ácido dicloroacético o similares. Las sales básicas se pueden formar mediante la mezcla de una solución del compuesto de la presente descripción con una solución de una base no tóxica farmacéuticamente aceptable tal como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de colina, carbonato de sodio y similares.
Como se usa en la presente descripción y reivindicaciones, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen formas plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Se entiende que siempre que se describen en la presente descripción modalidades con el lenguaje "que comprende", también se proporcionan modalidades análogas descritas en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".
El término "y/o" como se usa en una frase como "A y/o B" en la presente descripción pretende incluir tanto "A como B", "A o B", "A" y "B". Asimismo, el término "y/o" como se usa en una frase como "A, B y/o C" pretende abarcar cada una de las siguientes modalidades: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).
II. Proteínas para la unión a agonistas del receptor de glucocorticoides
La presente descripción proporciona agentes inmunoconjugados que contienen agonistas del receptor de glucocorticoides unidos a proteínas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos y proteínas receptoras solubles. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es humano, humanizado, quimérico o murino. En algunas modalidades, la proteína, por ejemplo, el anticuerpo, su fragmento de unión al antígeno o la proteína receptora soluble, puede unirse a una diana en la superficie de una célula y volverse internalizada.
La presente descripción también proporciona inmunoconjugados que contienen agonistas del receptor de glucocorticoides unidos a proteínas anti-TNF alfa. En determinadas modalidades, las proteínas anti-TNF alfa son anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos. En determinadas modalidades, las proteínas anti-TNF alfa son anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen a TNF alfa (por ejemplo, TNF alfa soluble y/o TNF alfa unido a membrana). En determinadas modalidades, las proteínas anti-TNF alfa son proteínas receptoras de TNF solubles, por ejemplo, proteínas receptoras de TNF solubles fusionadas a un dominio constante de la cadena pesada o un fragmento del mismo tal como un Fc. En algunas modalidades, la proteína anti-TNF alfa, por ejemplo, el anticuerpo anti-TNF, su fragmento de unión al antígeno o el receptor de TNF soluble pueden unirse al TNF alfa en la superficie de una célula y volverse internalizado. Por ejemplo, el documento US 2014/0294813 describe proteínas anti-TNF que exhiben internalización celular al unirse al TNF humano de la superficie celular.
En determinadas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos se unen al TNF-alfa humano y/o de ratón. Se conocen en la técnica anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno que se unen a TNF-alfa.
La longitud completa de la secuencia de aminoácidos unida a la membrana de TNF alfa humano es: MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQ REEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQ LVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKP WYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL (SEQ ID NO: 1). El TNF alfa humano soluble contiene los aminoácidos 77-233 de SEQ ID NO: 1. La longitud completa de la secuencia de aminoácidos para la membrana murino unido a TNF-alfa es:
MSTESMIRDVELAEEALPQKMGGFQNSRRCLCLSLFSFLLVAGATTLFCLLNFGVIGPQRDEKFPN GLPLISSMAQTLTLRSSSQNSSDKPVAHVVANHQVEEQLEWLSQRANALLANGMDLKDNQLVV PADGLYLVYSQVLFKGQGCPDYVLLTHTVSRFAISYQEKVNLLSAVKSPCPKDTPEGAELKPWY EPIYLGGVFQLEKGDQLSAEVNLPKYLDFAESGQVYFGVIAL (SEQ ID NO: 2). El TNF alfa murino soluble contiene los aminoácidos 80-235 de SEQ ID NO: 2.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TNF-alfa o su fragmento de unión al antígeno se unen al TNF-alfa humano. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TNF-alfa o su fragmento de unión al antígeno son humanos, humanizados o quiméricos.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TNF-alfa o su fragmento de unión al antígeno se unen al TNF-alfa murino. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TNF-alfa o su fragmento de unión al antígeno son murinos. En determinadas modalidades, el anticuerpo anti-TNF-alfa o el fragmento de unión al antígeno tienen uno o más de los siguientes efectos: neutralizan la citotoxicidad del TNF-alfa humano en un ensayo de L929 in vitro con una IC50 de 1X10'7 M o menos; bloquean la interacción de TNF-alfa con los receptores de superficie celular p55 y p75; y/o lisan células que expresan TNF de superficie in vitro en presencia de complemento.
En determinadas modalidades, el anticuerpo anti-TNF-alfa o el fragmento de unión al antígeno no se unen al TNF-beta.
Los anticuerpos anti-TNF-alfa y sus fragmentos de unión al antígeno incluyen, por ejemplo, adalimumab, infliximab, certolizumab pegol, afelimomab, nerelimomab, ozoralizumab, placulumab y golimumab. Se proporcionan anticuerpos anti-TNF-alfa y fragmentos de unión al antígeno adicionales, por ejemplo, en los documentos Wo 2013/087912, Wo 2014/152247 y WO 2015/073884.
El adalimumab se describe en la Patente de Estados Unidos No. 6.258.562. Infliximab se describe en la patente de Estados Unidos No. 5.656.272. El certolizumab se analiza en el documento WO 01/94585. El afelimomab (también conocido como MAK195) se analiza en Vincent, Int. J. Clin. Pract. 54: 190-193 (2000). Ozoralizumab (también conocido como ATN-103) es un nanocuerpo. Contiene tres regiones variables de cadena pesada fusionadas por enlazadores GlySer. Las regiones variables 1 y 3 son idénticas y el ozoralizumab no contiene una cadena pesada. El ozoralizumab se analiza en el documento WO 2012/131053. Placulumab (también conocido como CEP-37247) es un anticuerpo de dominio que consiste en un dímero de VL-pCH1-CH2-CH3 o [V-kappa]2-Fc y se analiza en Gay y otros, Mabs 2: 625-638 (2010). Golimumab (también conocido como CNTO 148) se analiza en el documento WO2013/ 087912, y las secuencias se proporcionan en GenBank: DI496971.1 y GenBank DI 496970.1.
Los anticuerpos anti-TNF-alfa y sus fragmentos de unión al antígeno también incluyen anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que inhiben competitivamente la unión de adalimumab, infliximab, certolizumab pegol, afelimomab, nerelimomab, ozoralizumab, placulumab o golimumab a TNF-alfa. Los anticuerpos anti-TNF-alfa y sus fragmentos de unión al antígeno también incluyen anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno que se unen al mismo epítopo de TNF-alfa que adalimumab, infliximab, certolizumab pegol, afelimomab, nerelimomab, ozoralizumab, placulumab o golimumab.
En determinadas modalidades, el anticuerpo anti-TNF-alfa o su fragmento de unión al antígeno inhiben competitivamente la unión de adalimumab a TNF-alfa. En determinadas modalidades, el anticuerpo anti-TNF-alfa o su fragmento de unión al antígeno se unen al mismo epítopo de TNF-alfa que el adalimumab. En determinadas modalidades, el anticuerpo anti-TNF-alfa o su fragmento de unión al antígeno es adalimumab o un fragmento de unión al antígeno del mismo. En determinadas modalidades, el anticuerpo anti-TNF-alfa o su fragmento de unión al antígeno es adalimumab.
En determinadas modalidades, el anticuerpo anti-TNF-alfa o su fragmento de unión al antígeno comprenden secuencias de adalimumab. Las secuencias de adalimumab se proporcionan en las Tablas 1-6.
Tabla 1 Secuencias de aminoácidos de CDR de la cadena pesada variable:
Figure imgf000014_0002
Tabla 2: Secuencias de aminoácidos de CDR de la cadena ligera variable
Figure imgf000014_0005
Tabla 3: Secuencias variables de aminoácidos de la cadena pesada
Figure imgf000014_0003
Tabla 4: Secuencias de aminoácidos de la cadena ligera variable
Figure imgf000014_0004
Tabla 5: Secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de longitud completa
Figure imgf000014_0001
Tabla 6: Secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de longitud completa
Figure imgf000015_0001
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante el uso de métodos de hibridomas, tales como los descritos por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495. Mediante el uso del método del hibridoma, se inmuniza un ratón, hámster u otro animal huésped apropiado para provocar la producción por linfocitos de anticuerpos que se unirán específicamente a un antígeno inmunizante. Los linfocitos también se pueden inmunizar in vitro. Después de la inmunización, los linfocitos se aíslan y fusionan con una línea celular de mieloma adecuada mediante el uso, por ejemplo, de polietilenglicol, para formar células de hibridoma que luego pueden seleccionarse de linfocitos no fusionados y células de mieloma. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales dirigidos específicamente contra un antígeno elegido según se determina mediante inmunoprecipitación, inmunotransferencia o mediante un ensayo de unión in vitro (por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA); ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)) pueden luego propagarse en cultivo in vitro mediante el uso de métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) o in vivo como tumores ascíticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales pueden luego purificarse del medio de cultivo o del fluido ascítico como se describe para los anticuerpos policlonales.
Alternativamente, también se pueden preparar anticuerpos monoclonales mediante el uso de métodos de ADN recombinante como se describe en la Patente de Estados Unidos 4.816.567. Los polinucleótidos que codifican un anticuerpo monoclonal se aíslan de células B maduras o células de hibridoma, como por RT-PCR mediante el uso de cebadores oligonucleotídicos que amplifican específicamente los genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, y su secuencia se determina mediante el uso de procedimientos convencionales. Los polinucleótidos aislados que codifican las cadenas pesada y ligera se clonan luego en vectores de expresión adecuados, que cuando se transfectan en células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otra manera no producen proteína inmunoglobulina, los anticuerpos monoclonales son generados por las células huésped. Además, los anticuerpos monoclonales recombinantes o fragmentos de los mismos de la especie deseada pueden aislarse de bibliotecas de presentación de fagos que expresan CDR de la especie deseada como se describe (McCafferty y otros, 1990, Nature, 348:552-554; Clackson y otros, 1991, Nature, 352:624-628; y Marks y otros, 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597).
El polinucleótido o polinucleótidos que codifican un anticuerpo monoclonal se pueden modificar adicionalmente de varias formas diferentes mediante el uso de tecnología de a Dn recombinante para generar anticuerpos alternativos. En algunas modalidades, los dominios constantes de las cadenas ligeras y pesadas de, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de ratón puede sustituirse 1) por aquellas regiones de, por ejemplo, un anticuerpo humano para generar un anticuerpo quimérico o 2) para un anticuerpo no polipéptido de inmunoglobulina para generar un anticuerpo de fusión. En algunas modalidades, las regiones constantes se truncan o eliminan para generar el fragmento de anticuerpo deseado de un anticuerpo monoclonal. Puede usarse mutagénesis dirigida al sitio o de alta densidad de la región variable para optimizar la especificidad, afinidad, etc. de un anticuerpo monoclonal.
En algunas modalidades, el anticuerpo monoclonal contra el TNF-alfa es un anticuerpo humanizado. En determinadas modalidades, dichos anticuerpos se usan terapéuticamente para reducir la antigenicidad y las respuestas de HAMA (anticuerpo anti-ratón humano) cuando se administran a un sujeto humano.
También se pueden usar métodos para manipular, humanizar o renovar anticuerpos humanos o no humanos y son bien conocidos en la técnica. Un anticuerpo humanizado, revestido o modificado por ingeniería genética de manera similar puede tener uno o más residuos de aminoácidos de una fuente que no es humana, por ejemplo, pero no se limita a, ratón, rata, conejo, primate no humano u otro mamífero. Estos residuos de aminoácidos no humanos se reemplazan por residuos que a menudo se denominan residuos "importados", que normalmente se toman de un dominio variable, constante u otro dominio "importado" de una secuencia humana conocida.
Dichas secuencias importadas pueden usarse para reducir la inmunogenicidad o reducir, potenciar o modificar la unión, afinidad, velocidad activa, velocidad inactiva, avidez, especificidad, vida media o cualquier otra característica adecuada, como se conoce en la técnica. En general, los residuos de CDR están directa y más sustancialmente implicados en influir en la unión de TNF-alfa. Por consiguiente, parte o todas las secuencias de CDR no humanas o humanas se mantienen mientras que las secuencias no humanas de las regiones variable y constante pueden reemplazarse con aminoácidos humanos u otros.
Los anticuerpos también pueden ser opcionalmente humanizados, revestidos, modificados por ingeniería genética o anticuerpos humanos diseñados con retención de alta afinidad por el antígeno, por ejemplo, TNF-alfa y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, los anticuerpos humanizados (o humanos) o modificados por ingeniería genética y los anticuerpos revestidos pueden prepararse opcionalmente mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos conceptuales humanizados y modificados mediante el uso de modelos tridimensionales de las secuencias parentales, modificadas y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Hay disponibles programas informáticos que ilustran y muestran probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estos arreglos permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno, tal como TNF-alfa. De esta manera, los residuos del marco (FR) pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias de importación y consenso de modo que se logre la característica deseada del anticuerpo, tal como una mayor afinidad por el o los antígenos diana.
La humanización, revestimiento o ingeniería de anticuerpos de la presente descripción se puede realizar mediante el uso de cualquier método conocido, tal como, pero no limitado a, los descritos en Winter (Jones y otros, Nature 321:522 (1986); Riechmann y otros, Nature 332:323 (1988); Verhoeyen y otros, Science 239:1534 (1988)), Sims y otros, J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta y otros, J. Immunol. 151:2623 (1993), patente de Estados Unidos. No. 5,639,641, 5,723.,323; 5,976.,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539; 4.816.567; PCT/: US98/16280; US96/18978; US91/09630; US91/05939; US94/01234; GB89/01334; GB91/01134; GB92/01755; WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; EP 229246; 7,557,189; 7,538,195; y 7,342,110.
En determinadas modalidades alternativas, el anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-TNF alfa) es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden preparar directamente mediante el uso de diversas técnicas conocidas en la técnica. Se pueden generar linfocitos B humanos inmortalizados inmunizados in vitro o aislados de un individuo inmunizado que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (Vea, por ejemplo, Cole y otros, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985); Boemer y otros, 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; y Patente de Estados Unidos 5,750,373). Además, el anticuerpo humano puede seleccionarse de una biblioteca de fagos, donde esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos, como se describe, por ejemplo, en Vaughan y otros, 1996, Nat. Biotech., 14:309-314, Sheets y otros, 1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 95:6157-6162, Hoogenboom y Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381 y Marks y otros, 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Las técnicas para la generación y uso de bibliotecas de fagos de anticuerpos también se describen en las Patentes de Estados Unidos No. 5,969,108, 6,172,197, 5,885,793, 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593,081; 6,300,064; 6,653,068; 6,706,484; y 7,264,963; y Rothe y otros, 2007, J. Mol. Bio., Doi: 10.1016/j.jmb.2007.12.018. Las estrategias de maduración por afinidad y las estrategias de reorganización de cadenas (Marks y otros, 1992, Bio/Technology 10:779-783) son conocidas en la técnica y pueden emplearse para generar anticuerpos humanos de alta afinidad.
Los anticuerpos humanizados también se pueden preparar en ratones transgénicos que contienen loci de inmunoglobulina humana que, tras la inmunización, son capaces de producir el repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Este enfoque se describe en las Patentes de Estados Unidos 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661,016.
En determinadas modalidades, se proporciona un fragmento de anticuerpo para, por ejemplo, aumentar la penetración del tumor. Se conocen varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtienen mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (por ejemplo, Morimoto y otros, 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; Brennan y otros, 1985, Science, 229:81). En determinadas modalidades, los fragmentos de anticuerpos se producen de forma recombinante. Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y scFv pueden expresarse y secretarse a partir de E. coli u otras células huésped, lo que permite la producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Dichos fragmentos de anticuerpos también se pueden aislar de bibliotecas de fagos de anticuerpos. El fragmento de anticuerpo también puede ser anticuerpos lineales como se describe en la patente de Estados Unidos 5,641,870. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos resultarán evidentes para el médico experto.
Para los propósitos de la presente descripción, debe apreciarse que los anticuerpos modificados pueden comprender cualquier tipo de región variable que proporcione la asociación del anticuerpo con el antígeno (por ejemplo, TNF alfa). A este respecto, la región variable puede comprender o derivarse de cualquier tipo de mamífero que pueda inducirse a montar una respuesta humoral y generar inmunoglobulinas contra el antígeno asociado al tumor deseado. Como tal, la región variable de los anticuerpos modificados puede ser, por ejemplo, de origen humano, murino, de primates no humanos (por ejemplo, monos cynomolgus, macacos, etc.) o de lupino. En algunas modalidades, tanto las regiones variables como las constantes de las inmunoglobulinas modificadas son humanas. En otras modalidades, las regiones variables los anticuerpos compatibles (normalmente derivados de una fuente no humana) se pueden modificar por ingeniería genética o adaptar específicamente para mejorar las propiedades de unión o reducir la inmunogenicidad de la molécula. A este respecto, las regiones variables útiles en la presente descripción se pueden humanizar o alterar de otro modo mediante la inclusión de secuencias de aminoácidos importadas.
Las proteínas anti-TNF alfa incluyen proteínas receptoras de TNF solubles. La proteína anti-TNF alfa puede ser un receptor de TNF p75 soluble. La proteína anti-TNF alfa puede ser un receptor de TNF p55 soluble.
El receptor de TNF soluble puede unirse tanto al TNF alfa como al TNF beta. El receptor de TNF soluble puede unirse al TNF alfa, pero no al TNF beta.
El receptor de TNF soluble puede inhibir la unión de TNF alfa (y opcionalmente TNF beta) a los receptores de TNF de la superficie celular.
El receptor de TNF soluble puede ser etanercept.
Una proteína anti-TNF alfa, por ejemplo, un receptor de TNF soluble, puede fusionarse con un dominio constante de la cadena pesada o un fragmento del mismo o una región Fc o un fragmento del mismo. El fragmento del dominio constante de la cadena pesada o el fragmento Fc puede ser una parte del dominio constante o Fc que es capaz de unirse al receptor Fc. El fragmento de dominio constante de la cadena pesada o el fragmento Fc puede ser una parte del dominio constante o Fc que es capaz de inducir la lisis celular in vitro en presencia de complemento. El fragmento del dominio constante de la cadena pesada o el fragmento Fc puede ser una parte del dominio constante o Fc que es capaz de inducir ADCC.
El dominio constante de la cadena pesada o fragmento del mismo o región Fc o fragmento de la misma puede ser un dominio constante de la cadena pesada humana o fragmento del mismo o región Fc humana o fragmento de la misma. El dominio constante de cadena pesada o fragmento del mismo o región Fc o fragmento de la misma puede ser un dominio constante de la cadena pesada de IgG1 o fragmento del mismo o una región Fc de IgG1 o fragmento de la misma. El dominio constante de la cadena pesada o fragmento del mismo o la región Fc o fragmento de la misma puede ser un dominio constante de la cadena pesada de IgG1 humana o fragmento del mismo o la región Fc de IgG1 humana o fragmento de la misma.
Los expertos en la técnica apreciarán que los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos de esta descripción y las proteínas anti-TNF de esta descripción incluyen anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno de los mismos y proteínas anti-TNF (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos, o proteínas receptoras de TNF solubles) que comprenden uno o más de los dominios de la región constante, incluidos los dominios que se han alterado para proporcionar las características bioquímicas deseadas, como la vida media sérica reducida en comparación con un anticuerpo, fragmento de unión al antígeno del mismo, o proteína anti-TNF de aproximadamente la misma inmunogenicidad que comprende una región constante nativa o inalterada. En algunas modalidades, la región constante del anticuerpo, su fragmento de unión al antígeno o proteína anti-TNF (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno o proteínas receptoras de TNF solubles) comprenderán una región constante humana. Las modificaciones de la región constante compatibles con esta descripción comprenden adiciones, deleciones o sustituciones de uno o más aminoácidos en uno o más dominios. Es decir, el anticuerpo, fragmento de unión al antígeno del mismo o proteínas anti-TNF (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno o proteínas receptoras de TNF solubles) descritos en la presente descripción pueden comprender alteraciones o modificaciones de uno o más de los tres dominios constantes de la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) y/o el dominio constante de la cadena ligera (CL). En algunas modalidades, se contemplan regiones constantes modificadas en donde uno o más dominios están parcial o totalmente eliminados. En algunas modalidades, los anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno de los mismos o proteínas anti-TNF (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno o proteínas receptoras de TNF solubles) comprenderán construcciones o variantes de dominio delecionados en donde el dominio CH2 completo se ha eliminado (construcciones ACH2). En algunas modalidades, el dominio de la región constante omitido será reemplazado por un espaciador de aminoácidos corto (por ejemplo, 10 residuos) que proporciona algo de la flexibilidad molecular impartida normalmente por la región constante ausente.
Se observará que en ciertas modalidades, los anticuerpos, sus fragmentos de unión al antígeno o proteínas anti-TNF (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno o proteínas receptoras de TNF solubles) pueden modificarse por ingeniería genética para fusionar el dominio CH3 directamente a la región bisagra de los respectivos anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno de los mismos o proteínas anti-TNF (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno o proteínas receptoras de TNF solubles). En otras construcciones, puede ser deseable proporcionar un espaciador de péptidos entre la región bisagra y los dominios CH2 y/o CH3 modificados. Por ejemplo, podrían expresarse construcciones compatibles en las que el dominio CH2 se ha eliminado y el dominio CH3 restante (modificado o no modificado) se une a la región bisagra con un espaciador de 5-20 aminoácidos. Se puede añadir un espaciador de este tipo, por ejemplo, para garantizar que los elementos reguladores del dominio constante permanezcan libres y accesibles o que la región bisagra permanezca flexible. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que los espaciadores de aminoácidos pueden, en algunos casos, resultar inmunogénicos y provocar una respuesta inmune no deseada contra la construcción. Por consiguiente, en determinadas modalidades, cualquier espaciador añadido a la construcción será relativamente no inmunogénico, o incluso se omitirá por completo, para mantener las cualidades bioquímicas deseadas de los anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno de los mismos o proteínas anti-TNF (por ejemplo anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos o proteínas receptoras de TNF solubles).
Se apreciará que los anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno de los mismos y proteínas anti-TNF (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno o proteínas receptoras de TNF solubles) de la presente descripción pueden ser proporcionados por deleción o sustitución de unos pocos o incluso de un solo aminoácido. Por ejemplo, la mutación de un solo aminoácido en áreas seleccionadas del dominio CH2 puede ser suficiente para reducir sustancialmente la unión del Fc y por tanto aumentar la localización del tumor. De manera similar, puede ser deseable eliminar simplemente la parte de uno o más dominios de la región constante que controlan la función efectora (por ejemplo, la unión del complemento C1Q) que se va a modular. Tales deleciones parciales de las regiones constantes pueden mejorar las características seleccionadas del anticuerpo (vida media sérica) mientras dejan intactas otras funciones deseables asociadas con el dominio de la región constante sujeto. Además, como se mencionó anteriormente, las regiones constantes de los anticuerpos descritos, los fragmentos de unión al antígeno de los mismos y las proteínas anti-TNF (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno o proteínas receptoras de TNF solubles) se pueden modificar mediante la mutación o sustitución de uno o más aminoácidos que potencia el perfil de la construcción resultante. A este respecto, puede ser posible interrumpir la actividad proporcionada por un sitio de unión conservado (por ejemplo, unión de Fc) mientras se mantiene sustancialmente la configuración y el perfil inmunogénico de los anticuerpos, los fragmentos de unión al antígeno de los mismos y las proteínas anti-TNF (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno o proteínas receptoras de TNF solubles). Ciertas modalidades pueden comprender la adición de uno o más aminoácidos a la región constante para mejorar las características deseables tales como disminuir o aumentar la función efectora o proporcionar mayor unión agonista del receptor de glucocorticoides. En tales modalidades, puede ser deseable insertar o replicar secuencias específicas derivadas de dominios de regiones constantes seleccionadas.
Se apreciará que los anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno de los mismos y proteínas anti-TNF (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno o proteínas receptoras de TNF solubles) de la presente descripción se pueden modificar para reducir la inmunogenicidad, es decir, para reducir la respuesta inmune anti-fármacos (ADA). Los métodos para hacerlo se describen, por ejemplo, en el documento WO 2015/073884.
La presente descripción abarca además variantes y equivalentes que son sustancialmente homólogos a anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno de los mismos y proteínas anti-TNF (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno o proteínas receptoras de TNF solubles) expuestas en la presente descripción. Estos pueden contener, por ejemplo, mutaciones de sustitución conservativas, es decir, la sustitución de uno o más aminoácidos por aminoácidos similares. Por ejemplo, la sustitución conservativa se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro dentro de la misma clase general como, por ejemplo, un aminoácido ácido por otro aminoácido ácido, un aminoácido básico por otro aminoácido básico o un aminoácido neutro por otro aminoácido neutro. Lo que se pretende con una sustitución conservativa de aminoácidos es bien conocido en la técnica.
Los polipéptidos de la presente descripción pueden ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos naturales o polipéptidos sintéticos de un anticuerpo, fragmento de unión al antígeno del mismo o proteína anti-TNF. Se reconocerá en la técnica que algunas secuencias de aminoácidos de la descripción se pueden variar sin un efecto significativo de la estructura o función de la proteína. Por tanto, la descripción incluye además variaciones de los polipéptidos que muestran una actividad sustancial o que incluyen regiones de un anticuerpo, fragmento de unión al antígeno del mismo o proteína anti-TNF alfa. Dichos mutantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones tipo.
Los polipéptidos y análogos se pueden modificar adicionalmente para contener restos químicos adicionales que normalmente no forman parte de la proteína. Esos restos derivatizados pueden mejorar la solubilidad, la vida media biológica o la absorción de la proteína. Los restos también pueden reducir o eliminar cualquier efecto secundario deseable de las proteínas y similares. Se puede encontrar una descripción general de esos restos en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).
Los polipéptidos aislados descritos en la presente descripción pueden producirse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Dichos métodos van desde métodos de síntesis de proteínas directos hasta la construcción de una secuencia de ADN que codifica secuencias polipeptídicas aisladas y que expresan esas secuencias en un huésped transformado adecuado. En algunas modalidades, se construye una secuencia de ADN mediante el uso de tecnología recombinante mediante el aislamiento o la síntesis de una secuencia de ADN que codifica una proteína de interés de tipo salvaje. Opcionalmente, la secuencia puede mutagenizarse mediante mutagénesis sitio-específica para proporcionar análogos funcionales de la misma. Vea, por ejemplo, Zoeller y otros, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984) y la patente de Estados Unidos No. 4,588,585.
En algunas modalidades, se construiría una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés mediante síntesis química mediante el uso de un sintetizador de oligonucleótidos. Dichos oligonucleótidos pueden diseñarse basado en la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado y mediante la selección de aquellos codones que se favorecen en la célula huésped en la que se producirá el polipéptido recombinante de interés. Se pueden aplicar métodos estándar para sintetizar una secuencia polinucleotídica aislada que codifica un polipéptido aislado de interés. Por ejemplo, se puede usar una secuencia de aminoácidos completa para construir un gen retrotraducido. Además, se puede sintetizar un oligómero de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido aislado particular. Por ejemplo, varios oligonucleótidos pequeños que codifican porciones del polipéptido deseado pueden sintetizarse y luego ligarse. Los oligonucleótidos individuales contienen normalmente salientes 5 'o 3' para el ensamblaje complementario.
Una vez ensambladas (por síntesis, mutagénesis sitio-dirigida u otro método), las secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido aislado particular de interés se insertarán en un vector de expresión y se unirán operativamente a una secuencia de control de expresión apropiada para la expresión de la proteína en un huésped deseado. El ensamblaje adecuado puede confirmarse mediante secuenciación de nucleótidos, mapeo de restricción y expresión de un polipéptido biológicamente activo en un huésped adecuado. Como es bien conocido en la técnica, para obtener altos niveles de expresión de un gen transfectado en un huésped, el gen debe estar operativamente ligado a secuencias de control de la expresión transcripcional y traduccional que sean funcionales en el huésped de expresión elegido.
En determinadas modalidades, los vectores de expresión recombinantes se usan para amplificar y expresar ADN que codifica anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno de los mismos o proteínas anti-TNF (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno o proteínas receptoras de TNF solubles). Los vectores de expresión recombinantes son construcciones de ADN replicables que tienen fragmentos de ADN sintéticos o derivados de ADNc que codifican una cadena polipeptídica de un anticuerpo, fragmento de unión al antígeno del mismo o proteína anti-TNF (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno, o proteínas receptoras de TNF solubles), operativamente enlazadas a elementos reguladores transcripcionales o de traducción adecuados derivados de genes de mamíferos, microbianos, virales o de insectos. Una unidad transcripcional generalmente comprende un ensamblaje de (1) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadores transcripcionales, (2) una secuencia estructural o codificante que se transcribe en ARNm y se traduce en proteína, y (3) secuencias apropiadas de iniciación y terminación de la transcripción y traducción. Dichos elementos reguladores pueden incluir una secuencia de operador para controlar la transcripción. Se puede incorporar adicionalmente la capacidad de replicarse en un huésped, normalmente conferida por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes. Las regiones de ADN están unidas operativamente cuando están relacionadas funcionalmente entre sí. Por ejemplo, el ADN de un péptido señal (líder secretor) se une operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como un precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está operativamente ligado a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está operativamente ligado a una secuencia codificante si está posicionado para permitir la traducción. Los elementos estructurales previstos para su uso en sistemas de expresión de levadura incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula huésped. Alternativamente, cuando la proteína recombinante se expresa sin una secuencia líder o de transporte, puede incluir un residuo de metionina N-terminal. Opcionalmente, este residuo se puede escindir posteriormente de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.
La elección de la secuencia de control de la expresión y el vector de expresión dependerá de la elección del huésped. Puede emplearse una amplia variedad de combinaciones de vector/huésped de expresión. Los vectores de expresión útiles para huéspedes eucariotas incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de la expresión de SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus. Los vectores de expresión útiles para huéspedes bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, tales como plásmidos de Escherichia coli, que incluyen pCR 1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos de intervalo de huésped más amplio, tales como M13 y fagos de ADN monocatenario filamentoso.
Las células huéspedes adecuadas para la expresión de anticuerpos, sus fragmentos de unión al antígeno y proteínas anti-TNF (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno o proteínas receptoras de t Nf solubles) incluyen procariotas, levaduras, insectos o células eucariotas superiores bajo el control de promotores apropiados. Los procariotas incluyen organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo E. coli o bacilos. Las células eucariotas superiores incluyen líneas celulares establecidas de origen mamífero. También se podrían emplear sistemas de traducción sin células. Pouwels y otros describen vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y de mamíferos. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985). Se puede encontrar información adicional con respecto a los métodos de producción de proteínas, incluida la producción de anticuerpos, por ejemplo, en la publicación de patente de Estados Unidos No. 2008/0187954, las patentes de Estados Unidos No. 6,413,746 y 6,660,501 y la publicación de patente internacional No. WO 04009823.
También se emplean ventajosamente varios sistemas de cultivo de células de mamíferos o insectos para expresar proteína recombinante. La expresión de proteínas recombinantes en células de mamíferos se puede realizar porque tales proteínas generalmente se pliegan correctamente, se modifican apropiadamente y son completamente funcionales. Ejemplos de líneas celulares huéspedes de mamíferos adecuadas incluyen HEK-293 y HEK-293T, las líneas COS-7 de células de riñón de mono, descritas por Gluzman (Cell 23:175, 1981), y otras líneas celulares que incluyen, por ejemplo, células L C127, 3T3, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender elementos no transcritos tales como un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuado ligado al gen que se va a expresar, y otras secuencias no transcritas flanqueantes 5 'o 3', y secuencias no traducidas 5 'o 3', tales como sitios de unión de ribosomas necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de empalme y secuencias de terminación de la transcripción. Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988) revisan los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos.
Las proteínas producidas por un huésped transformado pueden purificarse de acuerdo con cualquier método adecuado. Dichos métodos estándar incluyen cromatografía (por ejemplo, cromatografía en columna de intercambio iónico, afinidad y tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Las etiquetas de afinidad tales como hexahistidina, dominio de unión a maltosa, secuencia de cubierta de influenza y glutatión-S-transferasa se pueden unir a la proteína para permitir una fácil purificación mediante el paso sobre una columna de afinidad apropiada. Las proteínas aisladas también se pueden caracterizar físicamente mediante el uso de técnicas tales como proteólisis, resonancia magnética nuclear y cristalografía de rayos X.
Por ejemplo, los sobrenadantes de sistemas que secretan proteína recombinante en medios de cultivo se pueden concentrar primero mediante el uso de un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación adecuada. Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. Alternativamente, se puede emplear una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Finalmente, se pueden emplear una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución (RP-HPLC) en fase reversa que emplean medio RP-HPLC hidrófobo, por ejemplo, gel de sílice que tiene metilo colgante u otros grupos alifáticos, para purificar más proteínas anti-TNF (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos que se unen al antígeno o proteínas receptoras de TNF solubles). Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, también pueden emplearse para proporcionar una proteína recombinante homogénea.
La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano puede aislarse, por ejemplo, mediante extracción inicial de sedimentos celulares, seguida de una o más etapas de concentración, desalinización, intercambio iónico acuoso o cromatografía de exclusión por tamaño. Puede emplearse cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para las etapas finales de purificación. Las células microbianas empleadas en la expresión de una proteína recombinante pueden romperse mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, alteración mecánica o uso de agentes de lisis celular.
Los métodos conocidos en la técnica para purificar anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno de los mismos y proteínas anti-TNF alfa también incluyen, por ejemplo, los descritos en las publicaciones de patente de Estados Unidos No. 2008/0312425, 2008/0177048 y 2009/0187005.
III. Inmunoconjugados que contienen agonistas del receptor de glucocorticoides
En la presente descripción se proporcionan inmunoconjugados que contienen agonistas del receptor de glucocorticoides. La invención proporciona inmunconjugados con la fórmula:
Figure imgf000020_0001
en donde n es 2 o 4, y A es un anticuerpo que comprende las SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 73 o adalimumab. En otras modalidades de la invención, n es 4. En otras modalidades de la invención, n es 2. En otras modalidades de la invención, A es adalimumab.
En otra modalidad, se describe en la presente descripción un compuesto que tiene la Fórmula VIII, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, seleccionado del grupo que consiste en:
Figure imgf000021_0001
IV. Métodos para fabricar inmunoconjugados e intermedios sintéticos
De acuerdo con la presente descripción, los agonistas del receptor de glucorticoides pueden unirse al anticuerpo, fragmento de unión al antígeno del mismo o proteínas anti-TNF alfa mediante cualquier método y en cualquier ubicación que no impida que el anticuerpo, fragmento de unión al antígeno del mismo o la proteína anti-TNF alfa se una al antígeno (por ejemplo, TNF alfa) o que prevenga la actividad del agonista del receptor de glucorticoides. Los métodos para lograr tal enlace se han discutido, por ejemplo, en Panowski y otros, MAbs 6: 34-45 (2014), Jain y otros, Pharm. Res. 32: 3526-3540 (2015), Mack y otros, Seminars in Oncology 41: 637-652 (2014), Solicitud publicada de Estados Unidos No. 2008/0305044 y Solicitud publicada de Estados Unidos No. 2011/0097322.
El agonista del receptor de glucorticoides también se puede unir a un residuo de cisteína. Se conocen métodos de conjugación mediante cisteína. Los anticuerpos IgG1 contienen cuatro enlaces disulfuro intercaten arios, y la conjugación a través de la cisteína puede ocurrir después de que la reducción de estos enlaces crea sulfhidrilos disponibles para la conjugación.
Los agonistas del receptor de glucocorticoides pueden unirse al anticuerpo, su fragmento de unión al antígeno o proteínas anti-TNF alfa mediante conjugación sitio-específica.
Un método de conjugación sitio-específica es la conjugación sitio-específica basada en cisteína. Un ejemplo de este método ha sido informado por Junutula y otros, Nat. Biotechnol 26: 925-935 (2008); vea también Junutula y otros, J. Immunol. Methods 332: 41-52 (2008). Mediante el uso de este método, los anticuerpos, los fragmentos de unión a antígeno de los mismos o las proteínas anti-TNF alfa pueden modificarse por ingeniería genética con cisteínas adicionales que proporcionen grupos tiol reactivos para conjugar el agonista del receptor de glucocorticoides. Estas publicaciones también brindan orientación sobre la selección de cisteínas reactivas que no interfieren con la unión del antígeno.
Otro método de conjugación sitio-específica usa selenocisteína. La selenocisteína es similar a la cisteína pero contiene un átomo de selenio más reactivo en lugar del átomo de azufre en la cisteína. Se pueden usar condiciones en las que las selenocisteínas se activen selectivamente. Hofer y otros, Biochemistry 48: 12047-12057 (2009) han ejemplificado esta técnica.
Otro método de conjugación sitio-específica hace uso de aminoácidos no naturales, por ejemplo, acetilfenilalanina (pAcPhe) o para-azido fenilalanina (pAF). Wang y otros Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 56 - 61 (2003), Axup y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. 109:16101-16106 (2012), y Kern y otros, JACS 138: 1430-1445 (2016) han ejemplificado esta técnica.
Otro método de conjugación sitio-específica hace uso de enfoques enzimáticos, por ejemplo, a través de glicotransferasas o transglutaminasas. Pueden usarse glicotransferasas mutantes para unir un resto de azúcar químicamente activo a un sitio de glicosilación en un anticuerpo, fragmento de unión al antígeno del mismo o proteína anti-TNF alfa. Los anticuerpos IgG humanos contienen un sitio de N-glicosilación en el residuo Asn-297 del fragmento Fc. Los glicanos unidos a este residuo pueden desgalactosilarse de modo que una glicotransferasa mutante sea capaz de transferirse a ellos. Boeggeman y otros, Bioconjug. Chem. 20: 1228-1236 (2009) ha ejemplificado esta técnica. Las transglutaminasas, por ejemplo, de Streptoverticillium mobaranse, reconocen una etiqueta de glutamina, por ejemplo, LLQG, que puede modificarse por ingeniería genética en una proteína anti-TNF alfa. Jeger y otros, Angew Chem. En t. Ed. Engl. 49: 9995-9997 (2010) ha ejemplificado esta técnica.
También se puede usar la unión C-terminal mediante ligación de proteínas expresadas. Por ejemplo, la formación de tioéster C-terminal mediada por inteína puede usarse para la ligación quimioselectiva con una proteína anti-TNF alfa que contiene un péptido de cisteína N-terminal. Chiang y otros, J. Am. Chem. Soc. 136: 3370-3373 (2014) ha ejemplificado esta técnica.
V. Métodos de uso y composiciones farmacéuticas
En la presente descripción se proporciona un inmunoconjugado agonista del receptor de glucocorticoides que puede usarse in vitro o in vivo. Por consiguiente, también se proporcionan en la presente descripción composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas para ciertos usos in vivo, que comprenden un conjugado o un agonista del receptor de glucocorticoides descrito en la presente descripción que tiene el grado deseado de pureza en un vehículo, excipiente o estabilizador fisiológicamente aceptable (Remington's Pharmaceutical Sciences (1990)). Mack Publishing Co., Easton, PA). Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas.
Las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) que se usarán para la administración in vivo pueden ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través, por ejemplo, de membranas de filtración estériles. Las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) que se utilizarán para la administración in vivo pueden comprender un conservante.
Una composición farmacéutica que comprende un agonista del receptor de glucocorticoides proporcionado en la presente descripción puede formularse, por ejemplo, como un aerosol nasal, un aerosol de inhalación (por ejemplo, para inhalación oral) o una cápsula, tableta o píldora (por ejemplo, para administración oral).
Los agonistas del receptor de glucocorticoides proporcionados en la presente descripción (por ejemplo, un ADC anti-TNF) son compuestos, en donde el número promedio de glucocorticosteroides por anticuerpo (DAR) en la composición es 2 o 4.
Los agonistas del receptor de glucocorticoides y las composiciones farmacéuticas que comprenden un agonista del receptor de glucocorticoides descrito en la presente descripción pueden ser útiles para inhibir la liberación de citocinas (in vitro o in vivo) y/o para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o inflamatorias. Los agonistas del receptor de glucocorticoides y las composiciones farmacéuticas que comprenden un agonista del receptor de glucocorticoides descritos en la presente descripción pueden usarse para el tratamiento del asma (por ejemplo, asma bronquial), enfermedad de Crohn (por ejemplo, enfermedad de Crohn activa de leve a moderada en la que interviene el íleon y/o el colon ascendente y/o el mantenimiento de la remisión clínica de la enfermedad de Crohn de leve a moderada en la que interviene el íleon y/o el colon ascendente durante un máximo de 3 meses), colitis ulcerosa (por ejemplo, para la inducción de la remisión en pacientes con colitis ulcerosa activa, de leve a moderada), rinitis alérgica (por ejemplo, síntomas nasales asociados con rinitis alérgica estacional y/o rinitis alérgica perenne). Para la administración a pacientes humanos, la dosis diaria total de agonistas del receptor de glucocorticoides proporcionada en la presente descripción está normalmente en el intervalo de 0,001 mg a 5000 mg, o en el intervalo de 0,01 mg a 1000 mg, en dependencia del modo de administración. Por ejemplo, la administración oral o intravenosa, intramuscular, intraarticular o periarticular puede requerir una dosis diaria total de 0,01 mg a 1000 mg, o de 0,1 mg a 100 mg. La dosis diaria total se puede administrar en dosis únicas o divididas.
Se puede formular una composición farmacéutica que comprende un conjugado proporcionado en la presente descripción, por ejemplo, para administración intravenosa o infusión.
Los conjugados y las composiciones farmacéuticas que comprenden conjugados descritos en la presente descripción pueden ser útiles para lisar una célula que exprese TNF-alfa de superficie (in vitro o in vivo), para el tratamiento de enfermedades o trastornos caracterizados por un aumento de TNF-alfa (por ejemplo, aumento de TNF-alfa en el fluido sinovial) y/o para el tratamiento de una enfermedad autoinmune o inflamatoria.
Una composición farmacéutica que comprende un agonista del receptor de glucocorticoides o un conjugado descrito en la presente descripción se usa para el tratamiento de la artritis reumatoide (RA), la artritis idiopática juvenil (J IA), artritis psoriásica (PSA), una espondiloartropatía tales como la espondilitis anquilosante (AS) o axial espondiloartritis (axSpA), enfermedad de Crohn del adulto (EC), enfermedad de Crohn pediátrica, colitis ulcerosa (CU), psoriasis en placas (Ps), hidradenitis supurativa (HS), uveítis, enfermedad de Behcet o psoriasis, incluida la psoriasis en placas. Para la administración a pacientes humanos, la dosis diaria total de conjugado proporcionada en la presente descripción está normalmente en el intervalo de 0,01 mg a 100 mg por kg de peso corporal y se puede administrar una o más veces al día, semanalmente, mensualmente o anualmente.
Las modalidades de la presente descripción se pueden definir adicionalmente mediante referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, que describen en detalle la preparación de ciertos anticuerpos de la presente descripción y métodos para usar anticuerpos de la presente descripción.
Ejemplos
Se entiende que los ejemplos y modalidades descritos en la presente descripción son solo para fines ilustrativos y que se sugerirán a los expertos en la técnica diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos y se incluirán dentro del espíritu y alcance de esta descripción.
Métodos analíticos para la síntesis y caracterización de compuestos
Los datos analíticos se incluyen dentro de los procedimientos siguientes, en las ilustraciones de los procedimientos generales o en las tablas de ejemplos. A menos que se indique lo contrario, todos los datos de RMN de 1H y 13C se recopilaron en un instrumento Varian Mercury Plus 400 MHz o Bruker AVIII 300 MHz; los cambios químicos se cotizan en partes por millón (ppm). Los datos analíticos de HPLC se detallan dentro del experimento o se referencian a la tabla de condiciones de LC/MS y HPLC, mediante el uso del método proporcionado en la Tabla 7.
Tabla 7: Lista de métodos LC/MS y GC/MS
Figure imgf000023_0001
Las abreviaturas usadas en los ejemplos siguientes son:
Figure imgf000023_0002
Ejemplo 2A: Síntesis de (6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 10R, 11aR, 12aS, 12bS)-10-(4-(3-aminobencil)fenil)-7-hidroxi-8b-(2-hidroxiacetil)-6a, 8a-dimetil-1,2,6a, 6b, 7,8,8a, 8b, 11a,12,12a,12b-dodecahidro-4H-nafto[2',1':4,5]indeno[1,2-d][1,3] dioxol-4-ona (Cpd. No. 41).
Etapa 1: Síntesis de 4-(bromometil) benzaldehído
Figure imgf000024_0001
A una solución de 4-(bromometil) benzonitrilo (50 g, 255 mmol) en tolueno (1 L) se le añadió hidruro de diisobutilaluminio (383 mL, 383 mmol, 1 M en tolueno) gota a gota a 0 °C. La mezcla se agitó durante 1 hora. Se prepararon dos viales adicionales como se describió anteriormente. Se combinaron las tres mezclas de reacción. Se añadió HCl acuoso al 10 % (1,5 L) y luego se extrajo con DCM (3 x 1,5 L). La capa orgánica se secó sobre Na2SÜ4, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluido con éter de petróleo/acetato de etilo = 10/1) para producir el compuesto del título (120 g, 82 %) como un sólido blanco. 1H RMN (400 MHz, CDCla) 610,01 (s, 1H), 7,86 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,55 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 4,51 (s, 2H).
Etapa 2: Síntesis de 3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il) anilina
Figure imgf000024_0002
A una solución de 3-bromoanilina (80 g, 465 mmol) en 1,4-dioxano (960 mL) se le añadió 4,4,4',4',5,5,5',5'-octametil-2, 2'-bi (1,3,2-dioxaborolano) (177 g, 698 mmol), acetato de potasio (91 g, 930 mmol), 2-diciclohexilfosfino-2', 4', 6'-tri-i-propil-1,1'-bifenilo (13,45 g, 23,25 mmol) y tris (dibencilidenacetona) dipaladio (0) (17,03 g, 18,60 mmol). La mezcla se calentó a 80 °C durante 4 horas bajo nitrógeno. Se prepararon dos viales adicionales como se describió anteriormente. Se combinaron tres mezclas de reacción, se concentraron y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluido con éter de petróleo/acetato de etilo = 10/1) para producir el compuesto del título (150 g, 46,6 %) como un sólido amarillo claro. 1H RMN (400 MHz, CDCb) 67.23 a 7.13 (m, 3H), 6,80 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 3,82 - 3,38 (m, 2H), 1,34 (s, 12H).
Etapa 3: Síntesis de (3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)carbamato de terc-butilo
Figure imgf000024_0003
Se mezclaron 3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il) anilina (50 g, 228 mmol) y dicarbonato de di-terc-butilo (64,8 g, 297 mmol) en tolueno (500 mL) y la mezcla se agitó a 100 °C durante 24 horas. Se prepararon dos viales adicionales como se describió anteriormente. Se combinaron las tres mezclas de reacción. La mezcla marrón se concentró y el residuo se lavó con PE para producir el compuesto del título (120 g, 49,5 %) como un sólido blanco.
1H RMN (400 MHz, CDCla) 67,62 (s, 2H), 7,48 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,35 - 7,29 (m, 1H), 6,46 (br. s., 1H), 1,52 (s, 9H), 1,34 (s, 12H).
Etapa 4: Síntesis de (3-(4-formilbencil) fenil) carbamato de terc-butilo
Figure imgf000025_0001
Una mezcla de 4-(bromometil) benzaldehído (29,9 g, 150 mmol), 1,1 '-bis (difenilfosfino) ferrocenodicloro paladio (II) (20,63 g, 28,2 mmol), terc-butil (3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il) fenil) carbamato (30 g, 94 mmol) y carbonato de potasio (64,9 g, 470 mmol) en THF (600 mL) se calentó a 80 °C durante 12 horas. Se prepararon tres viales adicionales como se describió anteriormente. Se combinaron las cuatro mezclas de reacción. La mezcla de reacción se diluyó con agua (1 L). La capa acuosa se extrajo con EtOAc (3 X 800 mL). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 , se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluido con PE/EtOAc = 10/1) para producir el compuesto del título (35,5 g, 27,3 %) como un sólido blanco. 1H RMN (400 MHz, CDCla) 69,97 (s, 1H), 7,80 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,35 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,26 (s, 2H), 7,24 - 7,13 (m, 2H), 6,84 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 6,43 (br.s., 1H), 4,02 (s, 2H), 1,50 (s, 9H).
Etapa 5: Síntesis de (6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS,10R,11aR,12aS, 12bS)-10-(4-(3-aminobencil)fenil) -7-hidroxi-8b-(2-hidroxiacetil) -6a, 8a-dimetil-1,2,6a, 6b, 7,8,8a, 8b,11a,12,12a,12b-dodecahidro-4H-nafto[2',1':4,5]indeno[1,2-d][1,3]dioxol-4-ona
Figure imgf000025_0002
A una solución de (8S,9S, 10R,11S,13S,14S,16R, 17S)-11,16,17-trihidroxi-17-(2-hidroxiacetil)-10,13-dimetil-6,7,8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodecahidro-3H-ciclopenta[a] fenantren-3-ona (6 g, 15,94 mmol) y terc-butil (3-(4-formilbencil) fenil) carbamato (4,96 g, 15,94 mmol) en MeCN (50 mL) se añadió gota a gota ácido perclórico (4,79 mL, 80 mmol) mientras se mantenía una temperatura interna por debajo de 25 °C mediante el uso de un baño de hielo. Después de la adición, la mezcla se agitó a 20 °C durante 2 horas. Se prepararon tres viales adicionales como se describió anteriormente. Se combinaron las cuatro mezclas de reacción. La mezcla de reacción se inactivó con NaHCO3 saturado acuoso (500 mL) y se extrajo con diclorometano (3 X 800 mL). La fase orgánica se concentró y el residuo se purificó mediante Prep-HpLC para producir el compuesto del título (10 g, 27,0 %) como un sólido amarillo.
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 67,36 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,31 (d, J = 10,1 Hz, 1 H), 7,20 (d, J = 7,9 Hz, 2 H), 6,89 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 6,39 - 6,28 (m, 3H), 6,16 (dd, J = 1,5, 9,9 Hz, 1H), 5,93 (s, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,08 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 4,98 - 4,87 (m, 3 H), 4,78 (d, J = 3,1Hz, 1 H), 4,49 (dd, J = 6,2, 19,4 Hz, 1 H), 4,29 (br. s., 1H), 4,17 (dd, J = 5,5, 19,6 Hz, 1H), 3,74 (s, 2H), 2,61 - 2,53 (m, 1H), 2,36 - 2,26 (m, 1H), 2,11 (d, J = 11,0 Hz, 1 H), 2,07 (s, 1 H), 2,02 (d, J = 12,8 Hz, 1H), 1,83 - 1,54 (m, 5 H), 1,39 (s, 3H), 1,16 - 0,96 (m, 2H), 0,85 (s, 3H). LCMS: tn = 2,365 min, 98 % de pureza, m/z = 570,2 (M H)+ LC/MS (Tabla 7, método a)
Método de Prep-HPLC: Instrumento: Sistema de HPLC semipreparativo Gilson 281, Fase móvil: A: CF3 COOH/H2O = 0,075 % v/v; B: CH3 CN, Columna: Phenomenex Luna (2) C18 250 * 50 10u, velocidad de flujo: 80 mL/min, longitud de onda del monitor: 220 y 254 nm, Tiempo B %, 0,028, 20,045, 20,1 45, 20,2 100, 30,2100, 0,328, 31,5 28.
Ejemplo 34A: Síntesis de 3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-ilo)-N-((S)-1-(((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-hidroxi-8b-(2-hidroxiacetil)-6a, 8a-dimetil-4-oxo-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodecahidro-1H-nafto[2',1':4,5]indeno[1,2-d][1,3]dioxol-10-il)bencil)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-1-oxopropan-2-il)propanamida (Cpd. No. 88)
Etapa 1: Síntesis de (S)-2-aminoN-((S)-1-((3-(4-((6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 10R, 11aR, 12aS, 12bS)-7-hidroxi-8b-(2-hidroxiacetil)-6a, 8a-dimetil-4-oxo-2,4,6a, 6b, 7,8,8a, 8b, 11a, 12,12a, 12b-dodecahidro-1H-nafto[2', 1': 4,5] indeno [1,2-d] [1,3] dioxol-10-il)bencil)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)propanamida
Figure imgf000026_0001
Se añadió HATU (601 mg, 1,580 mmol) y 2,6-lutidina (0,37 mL, 3,16 mmol) a una solución a 0 °C de ácido (S)-2-((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)propanamido)propanoico (765 mg, 2,00 mmol), (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-aminobencil) fenil)-7-hidroxi-8b-(2-hidroxiacetil) -6a, 8adimetil-6a, 6b, 7,8,8a, 8b,11a,12,12a,12b-decahidro-1H-nafto[2',1':4,5] indeno[1,2-d][1,3] dioxol-4(2H)-ona (600 mg, 1,053 mmol) en DCM (6 ml) y DMF (12 mL). Después de 30 min, la mezcla se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se añadió dietilamina (2,18 mL, 21,06 mmol) a la mezcla de reacción y se continuó la agitación a temperatura ambiente durante 3 h, después de lo cual se eliminaron los disolventes volátiles a presión reducida. El residuo se disolvió en DMSO:MeOH 1:1 (12 mL) y se purificó por HPLC de fase inversa en una columna Phenomenex C18 (2) de 10 micrómetros (columna de 250 x 50 mm). Se usó un gradiente de MeCN (A) y TFA al 0,1 % en agua (B), a una velocidad de flujo de 90 mL/min (0-5,0 min 15 % de A, 5,0-20 min gradiente lineal 15-85 % de A, mantener 5 minutos). Las fracciones de producto combinadas se liofilizaron para dar el compuesto del título como un sólido blanquecino (447 mg, 0,628 mmol, 60 % de rendimiento). CL-EM (Método r, Tabla 7) Rt = 0,78 min, m/z = 711,9 [M H]. 1H RMN (501 MHz, DMSO- d6) ó 10,03 (s, 1H), 8,63 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 8,07 (d, J = 5,4 Hz, 3H), 7,44 - 7,38 (m, 2H), 7,38 - 7,34 (m, 2H), 7,29 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 7,23 - 7,16 (m, 3H), 6,90 (dt, J = 7,7, 1,3 Hz, 1H), 6,14 (dd, J = 10,1, 1,9 Hz, 1H), 5,90 (t, J = 1,6 Hz, 1H), 5,38 (s, 1H), 4,90 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 4,52 - 4,37 (m, 2H), 4,27 (q, J = 3,3 Hz, 1H), 4,16 (d, J = 19,4 Hz, 1H), 3,87 (s, 2H), 2,58 - 2,49 (m, 1H), 2,28 (ddd, J = 13,4, 4,5, 2,1 Hz, 1H), 2,09 (dtd, J = 17,0, 10,6, 5,0 Hz, 1H), 2,00 (dd, J = 12,2, 5,7 Hz, 1H), 1,78 - 1,54 (m, 5H), 1,37 (s, 3H), 1,35 (s, 3H), 1,30 (d, J = 7,1 Hz, 3H), 1,01 (ddd, J = 22,1, 11,9, 4,2 Hz, 2H), 0,84 (s, 3H).
Etapa 2: Síntesis de 3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-ilo)-W -((S) -1-(((S)-1-((3-(4-((6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 10R, 11aR, 12aS, 12bS)-7-hidroxi-8b-(2-hidroxiacetil)-6a, 8a-dimetil-4-oxo-2,4, 6a, 6b, 7,8,8a, 8b, 11a, 12,12a, 12bdodecahidro-1H-nafto[2',1': 4,5] indeno[1,2-d][1,3] dioxol -10-il)bencil)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il) amino)-1-oxopropan-2-il) propanamida
Figure imgf000026_0002
3-maleimidopropionato (250 mg, 0,938 mmol) y (S)-2-amino-W -((S)-1-((3-(4-((6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 10R, 11aR, 12aS, 12bS)7-hidroxi-8b-(2-hidroxiacetil)-6a, 8a-dimetil-4-oxo-2,4,6a, 6b, 7,8,8a, 8b, 11a, 12,12a, 12b-dodecahidro-1H-nafto[2 ', 1': 4,5] indeno[1,2-d] [1,3] dioxol-10-il)bencil)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il) propanamida (445 mg, 0,625 mmol) en DMF (12 mL). Después de 30 min a temperatura ambiente, los disolventes volátiles se eliminaron a presión reducida. El residuo se diluyó con DMSO:MeOH 1:1 (12 mL) y se purificó mediante HPLC de fase inversa en una columna Phenomenex C18 (2) de 10 micrómetros (columna de 250 x 50 mm). Se usó un gradiente de MeCN (A) y TFA al 0,1 % en agua (B), a una velocidad de flujo de 90 mL/ min (0-5,0 min 25 % de A, 5,0-20 min gradiente lineal 25-90 % de A, mantener 5 minutos). Las fracciones de producto combinadas se liofilizaron para dar el compuesto del título como un sólido blanquecino (295,1 mg, 0,342 mmol, 55 % de rendimiento). CL-EM (Método r, Tabla 7) Rt = 0,85 min, m/z = 863,4 [M+H]. 1H RMN (501 MHz, DMSO-d6) ó 9,71 (s, 1H), 8,17 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 8,03 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 7,43 (dd, J = 7,8, 1,1 Hz, 2H), 7,38 - 7,32 (m, 2H), 7.29 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 7,22 - 7,15 (m, 3H), 6.96 (s, 2H), 6.88 (dt, J = 7,8, 1,3 Hz, 1H), 6,13 (dd, J = 10,1, 1,9 Hz, 1H), 5,90 (t, J = 1,6 Hz, 1 H), 5,37 (s, 1H), 4,90 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,48 (d, J = 19,4 Hz, 1H), 4,32 (p, J = 7,1 Hz, 1H), 4,27 (q, J = 3,3 Hz, 1H), 4,21 (p, J = 7,1 Hz, 1H), 4,16 (d, J = 19,4 Hz, 1H), 3,87 (s, 2H), 3,59 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,57 - 2,49 (m, 1H), 2,38 (dd, J = 8,0, 6,6 Hz, 2H), 2,32 -2,24 (m, 1 H), 2,15 - 2,04 (m, 1H), 2,04 - 1,95 (m, 1H), 1,80 - 1,54 (m, 5 H), 1,37 (s, 3H), 1,26 (d, J = 7,1 Hz, 3H), 1,15 (d, J = 7,1 Hz, 3H), 1,02 (ddd, J = 21,2, 12,1, 4,2 Hz, 2H), 0,84 (s, 3H).
Ejemplo 35:
Los siguientes compuestos se prepararon mediante el uso de los métodos descritos anteriormente.
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000027_0003
Ejemplo 73: Protocolos de conjugación
Protocolo general de conjugación de cisteína
Se preparó una solución de aproximadamente 10 mg/mL del anticuerpo deseado en tampón PBS, pH 7,4, así como una solución de TCEP 10 mM en PBS (Pierce Bond-Breaker, cat. 77720). Los anticuerpos (anti-hTNF hIgG1 (D2E7) o anti-mTNF mIgG2a (8C11; McRae BL y otros J Crohns Colitis 10 (1): 69-76 (2016)) luego se redujeron parcialmente al añadir aproximadamente dos eq molares de TCEP 10 mM, al mezclar brevemente e incubar durante 60 min a 37 °C. A continuación, se añadió DMSO a los anticuerpos parcialmente reducidos en cantidad suficiente hasta un 15 % de DMSO total. Para las conjugaciones, se añadieron luego 8 eq molares de una solución de DL-maleimida 10 mM (en la que SM es un radical de un glucocorticosteroide y L es un enlazador) y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, se eliminó el exceso de combo y DMSO mediante el uso de columnas de desalación NAP-5 (GE Healthcare, cat. 17-0853-02) previamente equilibrado con tampón PBS, pH 7,4. A continuación, las muestras desaladas se analizaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) y espectrometría de masas reducida.
Hidrólisis de tiosuccinimida
Figure imgf000027_0002
La hidrólisis del anillo de tiosuccinimida de los ADC de la descripción se logró al incubar los ADC a un pH elevado. Brevemente, se preparó una solución de arginina 0,7 M, pH 9,0 y se añadió a cada ADC en tampón PBS para llevar la concentración total de arginina a 50 mM (pH ~ 8,9). A continuación, el material se incubó a 25 °C durante 72 horas. A continuación, se confirmó la hidrólisis del anillo de succinimida mediante espectrometría de masas reducida, después de lo cual, se interrumpió la hidrólisis con la adición de una solución de ácido acético 0,1 M a ácido acético total 12,5 mM (pH ~ 7,1).
Procedimientos analíticos de ADC
Cromatografía de interacción hidrofóbica. Los ADC se perfilaron mediante cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) para determinar el grado de conjugación y calcular las proporciones aproximadas de fármaco a fármaco de anticuerpo (DAR). En resumen, se cargaron 100 mg de los AdC en un sistema Ultimate 3000 Dual LC (Thermo Scientific) equipado con una columna butil-NPR de 4,6 x 35 mm (Tosoh Bioscience, cat. 14947). Los ADC se cargaron en la columna equilibrada en tampón A al 100 % y se eluyeron mediante el uso de un gradiente lineal desde tampón A al 100 % hasta tampón B al 100 % durante 12 min a 0,8 mL/min, donde el tampón A es fosfato de sodio 25 mM, sulfato de amonio 1,5 M, pH 7,25 y el tampón B es fosfato de sodio 25 mM, isopropanol al 20 %, pH 7,25. El DAR se determinó al tomar la suma de cada área porcentual máxima multiplicada por su correspondiente carga de fármaco y al dividir la suma ponderada por 100.
Cromatografía de exclusión por tamaño. Las distribuciones de tamaño de los ADC se perfilaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) mediante el uso de un sistema Ultimate 3000 Dual LC (Thermo Scientific) equipado con una columna TSK-gel 3000SWxl de 7,8 x 300 mm (Tosoh Bioscience, cat. 08541). Se cargaron 20 ug de cada uno de los ADC en la columna y se eluyeron durante 17 min mediante el uso de un gradiente isocrático a 1 mL/min de sulfato de sodio 100 mM, fosfato de sodio 100 mM, pH 6,8 a 0,8 mL/min.
Ejemplo 74: Preparación de adalimumab conjugado con un glucocorticosteroide para dar un ADC
Figure imgf000028_0001
El ADC esteroidal de adalimumab MP-ala-ala con un DAR promedio de 3,5 se preparó mediante un proceso químico de dos etapas: reducción con disulfuro de adalimumab seguida de alquilación (conjugación) con Cpd esteroidal maleimidopropil alanina-alanina. No. 88.
En la primera etapa, se reduce un número limitado de enlaces disulfuro intercatenarios de adalimumab con tris (2-carboxietil) fosfina ("TCEP") (> 1,8 equiv.). A continuación, el adalimumab parcialmente reducido se conjuga con Cpd. No. 88 (> 5 equiv.) en DMSO.
Con referencia a la Figura 5, que muestra una resolución cromatográfica de la preparación de ADC resultante, el ADC es una mezcla heterogénea que contiene anticuerpos sin moléculas enlazadoras de fármacos unidas (pico "E0"), dos moléculas enlazadoras de fármacos unidas (pico "E2"), cuatro moléculas enlazadoras unidas (pico "E4"), seis moléculas enlazadoras de fármacos unidas (pico "E6") y ocho moléculas enlazadoras de fármacos unidas (pico "E8"), en dependencia del número de enlaces disulfuro intercatenarios reducidos. Hamblett y otros, Clin Cancer Res 2004; 10:7063-7070 describen métodos para separar y aislar cromatográficamente los picos homogéneos de E2 y E4. Las condiciones de HIC usadas en la Figura 5 fueron las siguientes:
La columna era TOSOH Tskgel Butyl-NPR, 4,6 mm x 3,5 cm, 2,5 p y la temperatura de la columna era 30 °C. La longitud de onda fue de 280 nm, el tiempo de ejecución fue de 22 minutos, la inyección, el volumen fue de 40 pL, la velocidad de flujo fue de 0,5 mL/minuto. Fase móvil A: Na2HPO425 mM, pH 7,0 y (NH4)2SO41,5 M, Fase móvil B: Na2HPO425 mM, pH 7,0/IPA = 75/25. Perfil de gradiente:
Figure imgf000028_0002
Hamblett y otros, Clin Cancer Res 2004;10:7063-7070 describen métodos para separar y aislar cromatográficamente los picos homogéneos de E2 y E4. Brevemente, después de la hidrólisis y el ajuste a pH <7,4, la mezcla de distribución amplia se trató con tampón de sulfato de amonio 3 M/fosfato 50 mM para llevar la concentración general de la solución de sulfato de amonio a aproximadamente 0,8 M. Una columna de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) pre-empacada (resina butil sefarosa HP) se preparó mediante desinfección con solución de NaOH 0,5 N (4 CV), enjuague con agua para inyección (WFI, 0,5 CV) y equilibrio con tampón sulfato amónico 0,8 M/fosfato 25 mM (4 CV). La solución tampón de sulfato de amonio/de distribución amplia se cargó en la columna HIC (carga aproximada, 30 mg de proteína por mL de resina) seguido de un lavado con tampón sulfato de amonio 0,8 M/fosfato 25 mM (2,5 CV). La elución del producto fue como sigue: tampón sulfato de amonio 0,72 M/fosfato 25 mM (3 CV), mAb no conjugado; tampón sulfato de amonio 0,56 M/fosfato 25 mM (4,5 CV), DAR2 ADC; Tampón sulfato de amonio 0,32 M/fosfato 25 mM (6,5 CV), DAR4 ADC. A continuación, las fracciones de producto Da R 2 y DAR4 se concentraron por separado hasta aproximadamente 30 mg/mL mediante ultrafiltración (Millipore Ultracel, corte de 30 kD) seguido de diafiltración en WFI (8 CV).
La succinimida del conjugado de E4 purificado se hidrolizó para proporcionar la unión estabilizada mediante el ajuste del pH de la solución de producto a > 9 mediante el uso de un tampón de arginina. La solución se mantuvo a temperatura ambiente durante > 2 días, momento en el que el análisis de LC-MS determinó que la hidrólisis era > 90 % completa. Vea la Figura 6 para una parte del cromatograma LC-MS. Las condiciones SEC utilizadas en la Figura 6 fueron las siguientes:
La columna era TOSOH TSK-gel G3000SWxl, 5p, 250Á, 7,8 x 300 mm, la columna estaba a temperatura ambiente, la longitud de onda era de 214 nm, el tiempo de ejecución era de 55 minutos, el volumen de inyección era de 10 pL, la velocidad de flujo era de 0,25 mL/minuto, la temperatura del muestreador automático fue 4 °C. Fase móvil: Na2HPO4100 mM y Na2SO4100 mM, pH 6,8 / IPA = 90/10.
Datos de MS brutos (Figura 7) y deconvolucionados (Figura 8) de adalimumab conjugado con MP-ala-ala esteroide Cpd. No. 88. El cuadrado negro y el círculo representan el ADC con succinimida hidrolizada y no hidrolizada, respectivamente. La abundancia relativa de ADC hidrolizado y no hidrolizado se usa para determinar la conversión de hidrólisis.
Ejemplo 75: Actividad in vitro de esteroides de molécula pequeña
Ensayo de unión al receptor de glucocorticoides
Se ensayaron moléculas pequeñas para la unión del receptor de glucocorticoides (GR) mediante el uso del kit de ensayo de receptor de glucocorticoides Polarscreen™, Rojo (ThermoFisher A 15898) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, los compuestos se diluyeron en serie en DMSO y luego se transfirieron al tampón del kit de ensayo a una dilución 1:10. Los compuestos se diluyeron adicionalmente 1:5 en tampón del kit de ensayo y se transfirieron 10 pL a una placa de paredes negras de volumen bajo de 384 pocillos (Corning 4514). Se añadieron 5 pL de solución madre 4X Fluormone GS Rojo y 5 pl de solución madre 4x GR de longitud completa a cada pocillo que contenía el compuesto de prueba, y las placas se incubaron protegidas de la luz a temperatura ambiente durante 4 horas. La polarización de fluorescencia (mP) se midió para cada placa mediante el uso de un lector de placas de etiquetas múltiples EnVision (Perkinelmer # 2104-0010), y los datos se analizaron mediante el uso de un ajuste de curva de cuatro parámetros para generar valores de EC50. Los resultados se muestran en la Tabla 10 a continuación.
Ensayo de células receptoras de mineralocorticoides
Se ensayaron moléculas pequeñas para determinar la actividad agonista del receptor de mineralocorticoides (MR) mediante el uso de la línea celular PathHunter® NHRPRO CHO-K1 MR (DiscoveRx cat# 93-0451C2) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, se sembraron 20000 células/pocillo en medio de cultivo en una media placa de pocillo de 96 (Costar cat# 3885) durante la noche a 37 °C. El medio se retiró y se reemplazó con moléculas pequeñas diluidas en serie en medio del ensayo (30 pL; DMSO final al 0,3 %). Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C. Se retiró el medio, se reemplazó con reactivo de detección (DiscoveRx cat# 93-0001; 12 pL/pocillo) y se incubó a temperatura ambiente (RT) durante 60 minutos. Se midió la luminiscencia para cada placa mediante el uso de un lector de placas de etiquetas múltiples EnVision (Perkinelmer # 2104-0010), y los datos se analizaron mediante el uso de un ajuste de curva de cuatro parámetros para generar valores de EC50. Los resultados se muestran en la Tabla 10 a continuación.
Ensayo de unión al receptor de progesterona
Se analizaron moléculas pequeñas para la unión al receptor de progesterona (PR) mediante el uso de una modificación del ensayo del coactivador del receptor de progesterona LanthaScreen® TR-FRET (Thermofisher cat # A15903) donde el péptido coactivador marcado con fluoresceína se reemplazó con Fluormone AL-Red (Thermofisher cat # PV4294) para mejorar la señal del ensayo. Brevemente, los compuestos se diluyeron en serie en DMSO, luego se transfirieron a tampón de ensayo (Thermofisher cat # PV4301 DTT 5 mM) a una dilución 1:10. Se transfirieron 10 pl del compuesto a una placa de 96 pocillos negros de media área (Corning cat# 3694) por duplicado. Se añadieron a cada pocillo 5 pL de proteína PR-LBD (stock 4 nM en tampón de ensayo; Thermofisher cat# P2899). Además, se añadieron a cada pocillo 5 pL de una mezcla preparada de Fluormone AL-Red (12 nM) y anticuerpo monoclonal anti-GST (mAb) marcado con terbio (20 nM; Thermofisher cat # PV3550) en tampón de ensayo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente (RT) durante 2 horas, y luego se midió la relación de emisión TR-FRET mediante el uso de un lector de placas de múltiples etiquetas EnVision (Perkinelmer # 2104­ 0010). Los datos se analizaron mediante el uso de un ajuste de curva de cuatro parámetros para generar valores de EC50. Los resultados se muestran en la Tabla 10 a continuación.
Ensayo de unión al receptor de andrógenos
Se probaron moléculas pequeñas para la unión al receptor de andrógenos (AR) mediante el uso de una modificación del ensayo de coactivador de receptor de andrógenos LanthaScreen® TR-FRET (Thermofisher cat # A15878) donde el péptido coactivador marcado con fluoresceína se reemplazó con Fluormone AL-Red (Thermofisher cat # PV4294) para mejorar la señal del ensayo. Brevemente, los compuestos se diluyeron en serie en DMSO y luego se transfirieron al tampón de ensayo (Thermofisher cat# PV4295 DTT 5 mM) a una dilución 1:10. Se transfirieron 10 pl del compuesto a una placa de 96 pocillos negros de media área (Corning cat#3694) por duplicado. Se añadieron a cada pocilio 5 pL de proteína AR-LBD (stock 5 nM en tampón de ensayo; Thermofisher cat#3009). Además, se añadieron a cada pocilio 5 pL de una solución madre preparada de Fluormone AL-Red (20 nM) y anticuerpo monoclonal anti-GST (mAb) marcado con terbio (30 nM; Thermofisher cat# PV3550) en tampón de ensayo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente (TA) durante 6 horas y luego se midió la relación de emisión t R-FRET mediante el uso de un lector de placas de múltiples etiquetas EnVision (Perkinelmer # 2104-0010). Los datos se analizaron mediante el uso de un ajuste de curva de cuatro parámetros para generar valores de EC50. Los resultados se muestran en la Tabla 10 a continuación.
Ensayo del Reportero GRE
Las células GRE parentales K562 (pGL4.36 [luc2P/MMTV/Hygro]) descritas en el Ejemplo 78 se sembraron en placas de 96 pocillos blancas de cultivo de tejidos tratadas (Costar: 3917) a 50000 células por pocillo en 50 pL de medio de ensayo (RPMI, 1 % CSFBS, 1% de L-glutamina, 1% de piruvato de sodio y 1% de MEa A). Los compuestos agonistas de GR de molécula pequeña se diluyeron en serie a una concentración inicial de 100 pM y se diluyeron en serie 4 veces en DMSO al 100 %. Los compuestos de molécula pequeña se diluyeron más en medio de ensayo mediante la transferencia de 2 pl de compuestos diluidos en serie a 248 mL de medio de ensayo en una placa de dilución secundaria (dilución 1:125). Las células se trataron entonces con 25 pL del compuesto agonista GR diluido 1:125 para una concentración final de partida de 266,7 nM (1:3) o medio solo y se incubaron durante 24 horas a 37°, 5 % de CO2. Después de 24 horas de incubación, las células se trataron con 75 pL del Sistema de Ensayo de Luciferasa Dual-Glo (Promega-E2920) durante 10 minutos y se analizaron para determinar la luminiscencia mediante el uso de TopCount o MicroBeta2 (PerkinElmer).
Ensayo de unión al receptor de estrógeno
Se analizaron moléculas pequeñas para la unión al receptor de estrógeno (ER) alfa mediante el uso de una modificación del ensayo de coactivador alfa del receptor de estrógeno LanthaScreen® TR-FRET (Thermofisher cat# A15885) donde el péptido coactivador marcado con fluoresceína se reemplazó con Fluormone ES2 Green (Thermofisher cat# PV6045) para mejorar la señal del ensayo. Brevemente, los compuestos se diluyeron en serie en DMSO y luego se transfirieron a tampón de ensayo (Thermofisher cat# PV4295 dTt 5 mM) a una dilución 1:10. Se transfirieron 10 pl de compuesto a una placa de 96 pocillos negra de media área (Corning cat# 3694) por duplicado. Se añadieron a cada pocillo 5 pL de proteína ER-LBD (stock 5 nM en tampón de ensayo; Thermofisher cat # 4542). Además, se añadieron a cada pocillo 5 pL de una solución madre preparada de Fluormone ES2 Green (12 nM) y anticuerpo monoclonal anti-GST marcado con terbio (mAb) (8 nM; Thermofisher cat# PV3550) en tampón de ensayo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente (TA) durante 4 horas, y luego se midió la relación de emisión TR-FRET mediante el uso de un lector de placas de múltiples etiquetas EnVision (Perkinelmer # 2104-0010). Los datos se analizaron mediante el uso de un ajuste de curva de cuatro parámetros para generar valores de EC50. Los resultados se muestran en la Tabla 10 a continuación.
Figure imgf000031_0001
Ejemplo 76: Estabilidad de inmunoconjugados anti-TNF-alfa
Estabilidad de la matriz
Se probaron los ADC esteroidales anti-TNFa para determinar su susceptibilidad a liberar prematuramente una carga útil de moléculas pequeñas en condiciones fisiológicas. En estos experimentos, los ADC se diluyeron en el plasma (humano, mono, ratón o rata) o tampón por duplicado y se incubaron durante 6 días a 37 °C, 5 % de CO2. Cada muestra se inactivó en el tiempo 0 minutos y en varios puntos de tiempo durante el período de 6 días. A continuación, las muestras se analizaron mediante el uso de LC/MS/MS y se compararon con las curvas estándar para la molécula pequeña correspondiente. Se calculó el % de liberación máxima de carga útil de moléculas pequeñas a lo largo del tiempo. Los resultados se resumen en la Tabla 11 a continuación.
Tabla 11: Estabilidad de los ADC esteroides anti-TNFa
Figure imgf000032_0001
Estos resultados demuestran que los ADC esteroidales anti-TNFa son estables en tampón y plasma de múltiples especies y que se observa una liberación mínima de moléculas pequeñas.
Estabilidad proteolítica
La susceptibilidad de los ADC esteroidales para liberar su carga útil a través del tratamiento con proteasa se comparó con un ADC generado mediante el uso del enlazador de fármacos vcmcMMAE conjugado con un anticuerpo CD-19 murino. Los ADC (DAR promedio de 4) se incubaron con catepsina B o proteinasa K, y la liberación de carga útil se analizó mediante LC-MS en varios puntos de tiempo (0, 1, 4, 7 y 24 horas).
Los resultados se muestran en la Figura 1 y demuestran que los ADC esteroidales son resistentes a la liberación de carga útil mediada por catepsina exógena desde el ADC. Esto contrasta con un ADC de enlazador de carga útil conocido (mcvcMMAE), donde MMAE se libera en cantidades significativas tras el tratamiento con catepsina. Estos datos indican que los ADC esteroidales son mucho menos susceptibles a la liberación prematura de carga útil que resulta de la actividad de la catepsina en circulación que los ADC conocidos. De hecho, la liberación de esteroides solo se observa con proteinasa K, una serina proteasa que muestra una amplia especificidad de escisión. Esto indica que la porción de anticuerpo del ADC esteroidal debe catabolizarse significativamente antes de la escisión del enlazador de esteroides y que la liberación de la carga útil puede restringirse a un entorno donde puede producirse la digestión del andamio del anticuerpo del ADC, como el lisosoma.
Digestión con catepsina B
Se preparó una solución madre de 0,2 mg/mL de catepsina B (Sigma) en tampón (Tris 25 mM, NaCl 50 mM y glicerol al 5 %). Para generar una solución de trabajo de 10 pg/mL de catepsina B, se mezclaron 5 pL de 0,2 mg/mL de stock de catepsina B con 95 ml de tampón de activación (acetato de sodio 50 mM pH 5, EDTA 1 mM y DTT 5 mM) y se incubaron a 37 °C durante 15 minutos. Para la digestión con ADC, se mezclaron 20 pL de 100 pg/mL de ADC y 20 pL de solución de trabajo de catepsina B con 160 pl de tampón de dilución (acetato de sodio 50 mM, EDTA 1 mM). La muestra se incubó a 37 °C con agitación y se retiraron alícuotas de 40 pL después de 0, 1, 4, 7 y 24 horas. A cada alícuota se le añadieron 160 pL de solución de inactivación (ácido fórmico al 0,1 %; MeOH: MeCN 1:1; carbutamida 100 nM) y se detectó la molécula pequeña liberada por LC-MS/MS como se describió anteriormente. Digestión con proteinasa K
Se preparó una solución madre de 5 mg/mL de proteinasa K (Sigma) en agua desionizada (DI). Se preparó una solución de trabajo de 0,25 mg/mL de proteinasa K al mezclar 50 ml de proteinasa K de 5 mg/mL con 950 pL de tampón de dilución (1x HBSS y EDTA 1 mM). Para la digestión de ADC, se mezclaron 20 pL de 100 pg/mL de AdC y 40 pL de solución de trabajo de proteinasa K con 140 pL de tampón de dilución. La muestra se incubó a 37 °C con agitación y se retiraron alícuotas de 40 pL después de 0, 1, 4, 7 y 24 horas. A cada alícuota se le añadieron 160 pL de solución de inactivación (ácido fórmico al 0,1 %; MeOH: MeCN 1:1; carbutamida 100 nM) y se detectó la molécula pequeña liberada por LC-MS/MS como se describió anteriormente.
Ejemplo 77: Estabilidad in vivo de inmunoconjugados anti-TNF-alfa
Se evaluó en ratones la susceptibilidad del ADC esteroidal a sufrir una pérdida de enlazador del fármaco. El esteroide MP-Ala-Ala se conjugó con mAb IgG1 humano (promedio DAR 4) y se incubó a pH 9 para catalizar la hidrólisis de la apertura del anillo de tiosuccinimida. Después de la neutralización, se inyectó el esteroide ADC en ratones y se controló la cinética de la pérdida del enlazador del fármaco durante 7 días mediante LC-MS.
En estos experimentos, el ADC formulado en solución salina tampón fosfato se dosificó por vía intravenosa a 15 ratones macho DBA/1 a 5 mg /kg. Se sacrificaron tres ratones a 1 hora, 24 horas, 72 horas, 168 horas y 240 horas después de la dosis. Se recogió sangre entera con EDTA y se preparó suero para análisis DAR in vivo mediante espectrometría de masas.
Predilución de la muestra de suero
Las muestras de suero se diluyeron en suero de caballo (Life Technologies, 16050-122) en base a las concentraciones de anticuerpos totales de ADC medidas mediante el ensayo de unión de ligando de anticuerpo total. Las diluciones se basaron en estimaciones de la concentración final en un intervalo de 10-30 pg/mL, que es adecuado para el límite superior de capacidad de unión de las perlas magnéticas.
Purificación por afinidad por inmunoafinidad
En un tubo de proteína LoBind (Eppendorf North America), se agregaron 350 pL de suero de caballo a 100 pL de cada muestra de suero ADC prediluido hasta un volumen total de 450 pL, seguido de la adición de 4 pg de biotina -anticuerpo Fc antihumano (2 pL de biotina-antihumano a 2 mg/mL de solución). Las muestras se incubaron durante 2 horas (h) a temperatura ambiente mediante agitación a 900 rpm en un agitador orbital. Para cada muestra de suero, se equilibraron 50 pL de suspensión de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina (Pierce, Cat# 88817) con Tween al 0,1 % en tampón PBS (PBST) en un tubo LoBind. La solución salina tamponada con fosfato con tampón Tween 20 (PBST) se eliminó con una pipeta después de tirar de las perlas magnéticas hacia el lado del tubo LoBind colocando el tubo LoBind en una rejilla magnética. Las muestras de suero después de 2 horas de incubación con el reactivo de captura antihumano se transfirieron a los tubos LoBind que contenían perlas magnéticas equilibradas y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora a 900 rpm en un agitador orbital. El suero se eliminó después de la incubación de la perla magnética y la perla magnética se lavó minuciosamente con 500 pL de PBST (3 veces) seguido de 500 pL de MeOH al 5 % en agua MilliQ (3 veces). El ADC unido a perlas magnéticas se liberó mediante la incubación de las perlas magnéticas con 100 pl de ácido fórmico al 0,5 % en MeOH al 50 %/agua MilliQ durante 15 minutos.
Reducción de ADC purificado
El ADC liberado se redujo mediante la adición de 10 pL del reactivo reductor (TCEP 10 mM recién preparado a partir de polvo comprado en Thermo Scientific, con EDTA 10 mM en tampón Tris 2 M pH 7,5) a 100 pL de muestra y se incubó a 37 °C durante 30 minutos.
Análisis LC/MS
Se inyectaron muestras reducidas (10 pL) en un sistema LC/MS Agilent 6550 QTof a través de un muestreador automático CTC con temperatura controlada (5 °C). La elución de la muestra se logró en un Waters C-4, 3,5 pm, 300 A, 2,1 x 50 mm i.d. Columna de HPLC. Las fases móviles fueron: A: ácido fórmico al 0,1 % en agua y B: ácido fórmico al 0,1 % en MeCN; la velocidad de flujo fue de 0,45 mL/min; y el compartimento de la columna se mantuvo a 40 °C.
El gradiente de HPLC fue el siguiente:
Tiempo (min) % A % B
0 95 5
0,6 95 5
1,1 10 90
2,2 10 90
2,4 95 5
3,5 95 5
El análisis de MS de alta resolución del ADC reducido se realizó en un tiempo de vuelo cuádruple Agilent 6550 (Agilent Technology, San Clara, CA) equipado con una fuente de ionización por electropulverización (ESI) Dual Agilent Jet Stream operada en modo de iones positivos. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en el modo de intervalo dinámico extendido (2G Hz) con un intervalo de MS de hasta 3200 m/z. La fuente de ESI primaria se usó para el análisis de LC/MS, y la sonda de ESI secundaria se usó para infundir la solución de calibración a 922009 798 m/z para lograr la calibración de MS en tiempo real. El espectrómetro de masas se calibró diariamente. Los errores de masa típicos de los analitos en relación con las masas teóricas fueron menos de ± 5 partes por millón en operaciones diarias. Los datos de MS se procesaron mediante el uso de MassHunter Qual Browser Build 5.0.
Deconvolución del espectro de MS
Se usó el método de máxima entropía en el paquete de software MassHunter Bioconfirm para deconvolucionar los espectros de masas de iones de carga múltiple para derivar espectros de peso molecular neutro. La intensidad del pico deconvolucionado se usó para calcular DAR.
Cálculo del valor DAR a partir del espectro de MS deconvolucionado
Los valores de DAR se calcularon mediante el uso de la intensidad máxima de MS deconvolucionado según las siguientes ecuaciones:
Valor DAR de la cadena ligera (LC): LC DAR = (2 x intensidad máxima de LC A)/((intensidad máxima de LC intensidad máxima de LC a))
LC y LC a son cadenas ligeras con cero y un enlazador de fármaco, respectivamente.
Valor DAR de la cadena pesada (HC):
HC DAR = 2 x (intensidad máxima de HC a + 2 x intensidad máxima de HC aa + 3 x intensidad máxima de HC AAA)/(intensidad máxima de HC intensidad máxima de HC a intensidad máxima de HC aa intensidad máxima de HC AAA)
HC, HC a, HC aa y hc aaa son cadenas pesadas con cero, uno, dos y tres enlazadores de fármacos, respectivamente.
Total DAR = LC DAR HC DAR
Resultados
Los resultados se muestran en la Figura 2. Este ejemplo demuestra que se observa una pérdida mínima del enlazador de fármaco a partir de ADC esteroidales durante 7 días.
Ejemplo 78: Generación de líneas celulares del reportero GRE de TNF-alfa transmembrana humanas y de ratón Para crear una línea celular parental, se sembraron células K562 en una placa de 6 pocillos (Costar: 3516) con 2 mL de medio de crecimiento completo (RPMI, 10 % FBS, 1 % L-glutamina, 1 % piruvato de sodio y 1% MeM NEAA) a 500 000 células por pocillo durante 24 horas a 37°, 5 % C02. Al día siguiente, 1,5 pg de pGL4.36[Luc2P/MMTV/Hygro] (Promega: E316), 1,5 pg de pG14,75 [hRLuc/CMV] (Promega: E639A) y 3 pL de reactivo PLUS (Invitrogen: 10964- 021) se diluyeron en 244 uL de Opti-MEM (Gibco: 31985-070) y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. El vector pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro] contiene MMTV LTR (Repetición terminal larga del virus del tumor mamario murino) que dirige la transcripción del gen indicador de luciferasa luc2P en respuesta a la activación de varios receptores nucleares como el receptor de glucocorticoides y el receptor de andrógenos. El vector pGL4.75[hRluc/CMV] codifica el gen indicador de luciferasa hRluc (Renilla reniformis) y está diseñado para una alta expresión y una transcripción anómala reducida. Después de la incubación, la solución de ADN diluida se preincubó con una solución de Lipofectamina LTX 1:1 (Invitrogen: 94756) (13,2 pL 256,8 pL de Opti-MEM) y se incubó a temperatura ambiente durante 25 minutos para formar complejos de ADN-Lipofectamina LTX. Después de la incubación, se añadieron directamente al pocillo que contenía las células 500 pl de complejos de ADN-lipofectamina. K562 células fueron transfectadas durante 24 horas a 37°, 5 % C0 2. Después de la incubación, las células se lavaron con 3 mL de PBS y se seleccionaron con medio de crecimiento completo que contenía 125 pg/mL de higromicina B (Invitrogen: 10687-010) durante dos semanas. Se produjeron células "K562 pGL4.36[Luc2P/MMTV/Hygro] _pGL4.75 [hRLuc/CMV]".
Con el fin de crear una línea celular reportera de GRE de TNF-alfa transmembrana murina, las células parentales, K562 pGL4.36[Luc2P/MMTV/Hygro] _pGL4.75 [hRLuc / CMV], se sembraron en una placa de 6 pocillos (Costar: 3516) con 2 mL de medio de crecimiento completo (RPMI, 10 % FBS, 1 % de L-glutamina, 1 % de piruvato de sodio y 1 % de MEM NEAA) a 500000 células por pocillo durante 24 horas a 37°, 5 % C02. Al día siguiente, se diluyeron 3 pg de ADN de mFL_TNFa (Origene: MC208048), que codifica TNF de ratón no etiquetado, y 3 pL de reactivo PLUS (Invitrogen: 10964-021) en 244 uL de Opti-MEM (Gibco: 31985-070) e incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de la incubación, la solución de ADN diluida se preincubó con una solución de Lipofectamina LTX 1:1 (Invitrogen: 94756) (13,2 uL 256,8 uL de Opti-MEM) y se incubó a temperatura ambiente durante 25 minutos para formar complejos de ADN-Lipofectamina LTX. Después de la incubación, se añadieron directamente al pocillo que contenía las células 500 pl de complejos de ADN-lipofectamina. Las células parentales K562 pGL4.36[Luc2P/MMTV/Hygro] _pGL4.75 [hRLuc/CMV] se transfectaron durante 24 horas a 37 °, 5 % C02. Después de la incubación, las células se lavaron con 3 mL de PBS y se seleccionaron con medio de crecimiento completo que contenía 125 pg/mL de higromicina B (Invitrogen: 10687-010) y 250 pg/mL G418 (Gibco: 10131-027) durante dos semanas. Se produjeron células "K562 ratón FL-TNFa GRE (pGL4.36 [luc2P/MMTV/Hygro])".
Para crear una línea celular reportera de GRE de TNF-alfa transmembrana humana, las células parentales, K562 pGL4.36[Luc2P/MMTV/Hygro] _pGL4.75 [hRLuc/CMV], se transfectaron con la construcción del plásmido hTNF delta 1-12 C -Myc pcDNA3.1(-). Este plásmido es pcDNA 3,1 (Thermofisher cat# V79020) que codifica para TNF transmembrana resistente a tace (es decir, SEQ ID NO:1 que carece de los aminoácidos 77-88). (Vea Perez C y otros Cell 63 (2): 251-8 (1990) que discuten el TNF transmembrana resistente a tace). Estas líneas celulares se usaron luego en los ensayos reporteros de TNF-alfa descritos en los ejemplos siguientes.
Ejemplo 79: Actividad de inmunoconjugados anti-TNF-alfa en ensayos del reportero de GRE de TNF-alfa transmembrana
Se sembraron células GRE parentales K562 (pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro]) y células K562 mFL-TNF-a o hTNF delta 1-12 GRE (pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro]) en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos blancas tratadas (Costar: 3917) a 50000 células por pocilio en 50 pL de medio de ensayo (RPMI, CSFBS al 1 %, L-glutamina al 1 %, piruvato de sodio al 1 % y MEAA al 1 %). Las células se trataron con 25 pL de 3x murino diluido en serie o-a anti-TNF de anticuerpos conjugados de fármacos humanos en medio de ensayo, compuesto esteroidal, o medio solo y se incubaron durante 48 horas a 37 °, 5 % de CO2. Después de 48 horas de incubación, las células se trataron con 75 pL de Sistema de Ensayo de Luciferasa Dual-Glo (Promega-E2920) durante 10 minutos y se analizaron para determinar la luminiscencia mediante el uso de TopCount (PerkinElmer). Los datos se analizaron mediante el uso de un ajuste de curva de cuatro parámetros para generar valores de EC50. El % de activación máxima se normalizó a dexametasona 100 nM, que se consideró activación máxima. Los resultados mediante el uso de la línea celular de TNF-alfa murino se muestran en la Tabla 12 a continuación, y los resultados mediante el uso de la línea celular de TNF-alfa humana se muestran en la Tabla 13 a continuación. En la Tabla 12 a continuación, A se refiere a 8C11. En la Tabla 13 a continuación, A se refiere a adalimumab (SEQ ID NO: 66 y 73). La SEC determinó el porcentaje (%) de monómero como se describió anteriormente (vea los procedimientos analíticos de ADC).
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
Ejemplo 81: Actividad de los ADC esteroidales alfa anti-hTNF en el ensayo de liberación de citocinas PBMC humanas estimuladas por lipopolisacáridos
Se adquirieron células mononucleares de sangre periférica humana primaria (PBMC) de Biological Specialty Corporation (# de cat. 214-00-10), se lavaron en 50 mL de PBS, se resuspendieron en FBS con DMSO al 5 %, se dividieron en alícuotas y se criopreservaron en nitrógeno líquido hasta su uso. Las PBMC se descongelaron, se resuspendieron en RPMI suplementado con FBS al 2 % y penicilina-estreptomicina al 1 %, y se colocaron en placas en una placa de ensayo celular (Costar # 3799). Las células se incubaron con concentraciones variables de ADC esteroidal anti-hTNF alfa a 37 °C y 5 % de CO2 durante 4 horas. A continuación, las células se estimularon con 100 ng/mL de LPS durante la noche. Al día siguiente, la placa se centrifugó durante cinco minutos a 1000 rpm, y 100 mL de medio sobrenadante se transfirieron directamente a una placa adicional de 96 pocillos y se analizaron para concentraciones de IL-6 (MSD, # K151AKB) e IL-1 beta (MSD, # K151AGB). Los datos de dosis-respuesta se ajustaron a una curva sigmoidea mediante el uso de una regresión no lineal, y los valores de CI50 se calcularon con la ayuda de GraphPad 5.0 (GraphPad Software, Inc.). Los resultados mostrados en la Tabla 17 demuestran que los ADC esteroidales anti-hTNF alfa tienen una potente actividad en inhibir la liberación de las citocinas proinflamatorias IL-6 e IL-1beta de células inmunes primarias activadas.
Tabla 17: Actividad in vitro de los ADC anti-TNF alfa humanos en el ensayo de liberación de citocinas PBMC humanas estimuladas con LPS (n = 2)
Figure imgf000038_0001
Ejemplo 82: Actividad del inmunoconjugado anti-TNF-alfa en el ensayo de citotoxicidad inducida por TNFa en células L929
L929 es una línea celular de fibrosarcoma aneuploide murino que se sensibiliza mediante el tratamiento previo con actinomicina D. El tratamiento con TNFa inicia la apoptosis y la posterior muerte celular. Las células L929 en fase logarítmica se recogieron mediante el uso de tripsina al 0,05 %, se lavaron dos veces con D-PBS y se contaron mediante CEDEX. Las células se resuspendieron a 1E6 células/mL en medio de ensayo que contenía 4 pg/mL de actinomicina D y se añadieron 50 pl a todos los pocillos. El ADC esteroidal anti-TNF alfa murino (anti-TNF alfa 8C11 murino conjugado con Cpd 71; también conocido como ADC esteroidal anti-mTNF alfa) y el mAb anti-TNF murino (8C11) se diluyeron a una concentración de 43 en el medio de ensayo y se realizaron diluciones seriadas 1:3. El TNFa de ratón se diluyó a una concentración 4x de 600 pg/mL. El ADC esteroidal anti-mTNF y mAb anti-mTNF (125 mL) se añadieron al mTNFa (125 pL) en un esquema de dilución 1:2 y se dejaron incubar durante 1 hora a temperatura ambiente, y se agitó suavemente. La mezcla de anticuerpo/mTNFa (o ADC/ mTNFa) se añadió a los pocillos a 50 pL/pocillo por triplicado. Las placas se incubaron durante 20 horas a 37 °C, 5 % de CO2. Para cuantificar la viabilidad, se agregaron a los pocillos 10 mL del reactivo WST-1 (Roche cat# 11644807001). Las placas se incubaron en condiciones de ensayo durante 3,5 horas, se centrifugaron a 500 x g y se transfirieron 75 pL de sobrenadante a una placa ELISA (Costar cat#3369). Las placas se leyeron a una DO 420-600 nm mediante el uso de un lector de placas de ELISA Spectromax 190. Los datos se analizaron y los valores de IC50 calculados mediante el uso de un ajuste de dosis-respuesta sigmoidal (pendiente variable) en GraphPad Prism 5.
El ADC esteroidal anti-mTNF alfa tuvo una potencia neutralizante (IC50 1,9 nM) comparable al mAb anti-mTNF alfa no conjugado (IC501,5 nM).
Ejemplo 83: Unión de ADC esteroidal anti-mTNF-alfa a receptores Fcgamma de ratón
Se usó un instrumento Biacore T200 basado en SPR (resonancia de plasmón superficial) (GE Healthcare) para evaluar la unión de ADC esteroidal anti-mTNF-alfa (anti-mTNF 8C11 conjugado a Cpd 71) y mAb anti-mTNF-alfa a los FcgR de ratón recombinante (todos Sistemas R&D). Los FcgR se inmovilizaron directamente en la superficie de las células de flujo dos, tres y/o cuatro del chip(s) Biacore CM5 tipo S para lograr densidades de ~ 1000-2000 RU (unidades de resonancia). La superficie modificada en blanco de la célula de flujo, uno de cada chip Biacore, se usó como una superficie de referencia. Cada experimento constó de fases de asociación y disociación. La fase de asociación consistió en valorar mAb parental y ADC en todas las células de flujo a una velocidad de flujo de 50 ul/min y concentraciones de 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 y 0 nM para FcgRIIB y FcgRIII y 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56 y 0 nM para los receptores I y IV. La fase de disociación consistió en el flujo continuo del tampón de funcionamiento (HBS-Ep , pH 7,4, GE Healthcare) a una velocidad de flujo de 50 ul/min. Las fases de asociación y disociación se monitorearon durante 5 min cada una (receptores I y IV) o 1 min (receptores II y III). Las superficies de las virutas se regeneraron con un pulso de 5s de HCl 100 mM a una velocidad de flujo de 100 ul/min después de cada ciclo de unión. Se usó el software de evaluación Biacore para ajustar los datos crudos a modelos de unión 1:1 (FcgRI y IV) o de estado estacionario (receptores IIB y III). Los resultados se muestran en la Tabla 19.
ka es la constante de velocidad de asociación (1/Ms); kd es la constante de velocidad de disociación (1/s); Kd es la constante de disociación de equilibrio (M).
Tabla 19: Afinidades de unión del inmunoconjugado anti-TNF-alfa a los receptores Fcgamma de ratón
Figure imgf000039_0001
Ejemplo 84: Actividad de ADC esteroidal anti mTNF-alfa en un modelo de hipersensibilidad por contacto
Los ADC esteroidales anti-mTNF alfa se evaluaron en un modelo de hipersensibilidad de contacto agudo, una estimulación de inflamación aguda de la piel mediante el uso de una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) (impulsada por células T) mediante la aplicación de un agente sensibilizante (isotiocianato de fluoresceína (FITC)). La eficacia de los ADC esteroidales anti-mTNF alfa se midió por la capacidad de reducir la inflamación de la oreja. Los biomarcadores esteroidales corticosterona y propéptido N-terminal de procolágeno tipo 1 (P1NP) se incluyeron como lecturas para evaluar el impacto putativo del tratamiento con ADC esteroidales anti-mTNF alfa en el eje hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA) y el recambio óseo, respectivamente.
Inflamación de la oreja
El día 0, los ratones se colocaron bajo anestesia general y se les afeitaron los abdómenes. Mediante el uso de una micropipeta, se sensibilizó a los ratones mediante la aplicación epicutánea de 400 uL de solución de FITC (solución al 1,5 % en acetona:DBP 1:1) en el abdomen. Seis días después, los ratones fueron dosificados con vehículo o agente terapéutico 1 hora antes del estímulo de la oreja con FITC. Para el estímulo de la oreja, los ratones se colocaron bajo anestesia general y se estimularon con 20 pL de FITC aplicados en la oreja derecha. 24 horas después de la exposición, los ratones se colocaron bajo anestesia general y se midió el grosor de sus orejas con un calibre. Se calculó la diferencia entre las orejas estimuladas y no estimuladas. 72 horas después de la estimulación de la oreja, los ratones fueron inyectados con ACTH a 1 mpk IP, y se les extrajo sangre terminal 30 minutos después de la ACTH. El plasma se recolectó y se analizaron los niveles moleculares de P1NP, corticosterona, esteroides libres y moléculas grandes.
Cuantificación de esteroides libres liberados y corticosterona endógena
La curva de calibración del esteroide se preparó en plasma de ratón con concentraciones finales de 0,03 nM a 0,1 |jM a 8 niveles de concentración diferentes. Se preparó una curva de calibración de corticosterona que varió de concentraciones finales de corticosterona de 0,3 nM a 1 jM en 70 mg/mL de solución de albúmina de suero bovino en tampón PBS. Se añadió una solución de 160 pL de MeCN con ácido fórmico al 0,1 % a 40 pL de muestras de plasma de estudio o estándares de calibración. Los sobrenadantes se diluyeron con agua destilada y se inyectaron 30 pL de solución de muestra final para análisis LC/MS.
La cuantificación del esteroide libre liberado y la corticosterona se realizó en un espectrómetro de masas triple cuádruple AB Sciex 5500 conectado a un sistema de HPLC Shimadzu AC20 interconectado con una fuente de ionización por electropulverización que funciona en modo positivo. Se usó una columna Waters XBridge BEH C18, 2,1 x 30 mm, 3,5 pm para la separación por cromatografía. La fase móvil A fue ácido fórmico al 0,1 % en agua HPLC Milli Q, y la fase móvil B fue ácido fórmico al 0,1 % en MeCN. Se aplicó un gradiente lineal del 2 % de la fase móvil B al 98 % de la fase móvil B de 0,6 a 1,2 minutos. El tiempo de ejecución total fue de 2,6 min a una velocidad de flujo de 0,8 mL/min. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo MRM positivo a una temperatura de la fuente de 700 °C.
Cuantificación de P1NP en plasma
La cuantificación de P1NP en plasma se realizó en una plataforma LC/MS basada en la digestión de proteínas con tripsina. Las muestras de plasma se precipitaron parcialmente y se redujeron completamente mediante la adición de una mezcla de MeCN/bicarbonato de amonio 0,1 M/DTT. El sobrenadante se recogió y se alquiló mediante la adición de ácido yodoacético. Las proteínas alquiladas se digirieron con tripsina y los péptidos trípticos resultantes se analizaron mediante LC/MS. La curva de calibración se generó mediante el uso del péptido tríptico sintético añadido en suero de caballo (matriz sustituta que no interfiere). Se usó un péptido flanqueante marcado con isótopos estables (extensión de 3-6 aminoácidos en ambos extremos del péptido tríptico) como patrón interno añadido en la mezcla de precipitación de proteínas MeCN/DTT para normalizar tanto la eficiencia de la digestión como la inyección LC/MS.
Se usó una columna Columnex Chromenta BB-C18, 2,1 x 150 mm, 5 jm para la separación por cromatografía. La fase móvil A fue ácido fórmico al 0,1 % en agua HPLC Milli Q y la fase móvil B fue ácido fórmico al 0,1 % en MeCN. Se aplicó un gradiente lineal del 2 % de la fase móvil B al 65 % de la fase móvil B de 0,6 a 3 min. El tiempo de ejecución total fue de 8 min a una velocidad de flujo de 0,45 mL/min. Se usó un espectrómetro de masas AB Sciex 4000Qtrap en modo MRM positivo para cuantificar los péptidos P1NP, a una temperatura de fuente de 700 °C. Cuantificación del ADC total en plasma
Las concentraciones de anticuerpo total (ADC y mAb de la cadena principal) se midieron mediante un ensayo de unión de ligando mediante el uso de la plataforma Mesoscale Discovery (MSD). Se usó TNF de ratón marcado con biotina como reactivo de captura para ADC esteroidales anti-mTNF alfa y se usó un anticuerpo de detección anti­ ratón de cabra conjugado con Sulfo-TAG para la detección. Se generó una curva de calibración mediante dilución en serie de la molécula de ADC en la matriz correspondiente y se usaron muestras de control de calidad para calificar el ensayo
Resultados
Los resultados se muestran en la Tabla 20 a continuación:
Tabla 20: Comparación de la actividad de ADC esteroidales anti-mTNF alfa sobre la inflamación de la oreja y los biomarcadores esteroidales en el modelo de inflamación de CHS
Figure imgf000040_0001
Estos resultados demuestran que los ADC esteroidales anti-mTNF alfa pueden obtener una respuesta eficaz equivalente al tratamiento con esteroides de molécula pequeña mientras se evitan los efectos no deseados sobre corticosterona y P1NP.
Se realizó un estudio adicional de hipersensibilidad por contacto (CHS) para analizar si se requería la conjugación de la carga útil de esteroides con mAb anti-TNF para mejorar la eficacia. Los ratones se dosificaron ip una vez de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente con vehículo, mAb anti-mTNF alfa (10mpk), ADC esteroidal antimTNF alfa (10mpk) (cpd no 139) o una mezcla de mAb anti-mTNF alfa codosificado (administrado simultáneamente en una sola inyección ip) con una cantidad equivalente de esteroide de molécula pequeña para igualar la estequiometría de ADC. Para una dosis de 10 mpk de ADC esteroidal anti-mTNF alfa con un DAR de 4, se calculó que era 4 pg de esteroide de molécula pequeña (Cpd. No. 42). Los resultados mostrados en la Figura 9 demuestran que el tratamiento con ADC esteroide anti-mTNF alfa tuvo una eficacia significativamente mayor para reducir la inflamación de la oreja en comparación con la combinación de mAb anti-mTNF alfa y esteroide de molécula pequeña o mAb anti-mTNF alfa solo.
Ejemplo 85: Actividad de ADC esteroidal anti-mTNF-alfa en artritis inducida por colágeno
La capacidad del ADC esteroidal anti-mTNF alfa (Cpd. No. 137) para afectar a la enfermedad se evaluó en el modelo de artritis de artritis inducida por colágeno (CIA).
En estos experimentos, se obtuvieron ratones macho DBA/1J de Jackson Labs (Bar Harbor, ME). Los ratones se usaron entre las 6 y las 12 semanas de edad. Todos los animales se mantuvieron a temperatura y humedad constantes bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron con comida para roedores (Lab Diet 5010 PharmaServ, Framingham, MA) y agua ad libitum. AbbVie está acreditada por la AAALAC (Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio), y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y monitoreados por un veterinario a cargo. Se controlaron el peso corporal y la condición, y los animales se sacrificaron si presentaban una pérdida de peso > 20 %.
Los ratones macho DBA/J se inmunizaron por vía intradérmica (id) en la base de la cola con 100 pL de emulsión que contenía 100 pg de colágeno bovino tipo II (MD Biosciences) disuelto en ácido acético 0,1 N y 200 pg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra inactivado por calor (adyuvante completo de Freund, Difco, Laurence, KS). Veintiún días después de la inmunización con colágeno, los ratones se reforzaron IP con 1 mg de Zymosan A (Sigma, St. Louis, MO) en PBS. Después del refuerzo, los ratones fueron monitoreados de 3 a 5 veces por semana para detectar artritis. Se evaluó la inflamación de las patas traseras mediante el uso de calibradores de resorte Dyer (Dyer 310-115)
Los ratones se inscribieron entre los días 24 y 28 ante los primeros signos clínicos de la enfermedad y se distribuyeron en grupos de gravedad artrítica equivalente. El tratamiento terapéutico temprano comenzó en el momento de la inscripción.
Los animales se dosificaron una vez por vía oral (p.o.) con esferoide (Cpd. No. 3) (10mpk) en un vehículo de HPMC al 0,5 %/Tween80 al 0,02 % [v/] o intraperitoneal (i.p.) con mAb anti-mTNF alfa (l0mpk) (8C11) o ADC esferoidal anfi-mTNF alfa (10mpk) (Cpd. No. 137) en solución salina al 0,9 %. Se recogió sangre para la exposición al anticuerpo mediante una muesca en la cola a las 24 y 72 horas después de la dosis. Las patas se recogieron en el punto de tiempo terminal para histopatología. La sangre se recogió en el punto de tiempo terminal mediante punción cardíaca para realizar recuentos sanguíneos completos (Sysmex XT-2000iV). La significación estadística se determinó mediante ANOVA.
Los resultados se muestran en la Figura 3 y demuestran que una sola dosis de ADC esteroidal anti-mTNF alfa puede exhibir una duración de acción prolongada mediante la mejora de la inflamación de la pata durante ~ 6 semanas en comparación con mAb anti-mTNF alfa o esteroide de molécula pequeña solo.
En un estudio separado diseñado para abordar la funcionalidad de orientación al TNF del ADC esteroidal anti-mTNF alfa, los animales recibieron una dosis i.p. una vez con mAb anti-mTNF alfa (10mpk) o ADC esteroidal anti-mTNF alfa (10mpk) (Cpd. No. 145) o con ADC esteroidal isotipo (10mpk) (Cpd. No. 224):
Figure imgf000041_0001
que reconoce la proteína de huevo de gallina ovoalbúmina, un antígeno no expresado en ratones. Ambos ADC tuvieron una carga de fármaco equivalente. El esteroide de molécula pequeña (3mpk) se dosificó por vía oral una vez al día (q.d.). Los resultados se muestran en la Figura 10 y demuestran que una sola dosis de ADC esteroidal anti-mTNF alfa tiene una eficacia equivalente a la del esteroide de molécula pequeña dosificado diariamente durante un período de 21 días. Una dosis única del ADC esteroidal de isotipo no dirigido solo tuvo una eficacia parcial, similar al mAb anti-mTNF solo durante el mismo período de tiempo. Los porcentajes indican el % de inhibición en comparación con el vehículo. Una evaluación de los pesos corporales de los animales a lo largo del curso de este estudio (Figura 11) reveló que todos los grupos de tratamiento con la excepción del grupo de ADC esteroidales antimTNF alfa perdieron peso. Por el contrario, los ratones tratados con ADC esteroidales anti-mTNF alfa mostraron un aumento de peso normal durante los 21 días del estudio.
Ejemplo 86: Actividad de varios ADC esteroidales anti-mTNF alfa en artritis inducida por colágeno
Se probaron varios ADC esteroidales anti-mTNF alfa con diferentes cargas útiles de esteroides o razones de fármaco: anticuerpo (DAR) para determinar su eficacia en un modelo de artritis en ratón. Los estudios se realizaron de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 85. Los resultados se muestran en la Tabla 21 a continuación.
Tabla 21: Eficacia de los ADC esteroidales anti-mTNF alfa en un modelo de artritis
Figure imgf000041_0002
Ejemplo 87: Actividad de los inmunoconjugados anti-hTNF-alfa en un modelo de ratón inactivado para Tg1278TNF transgénico para TNF humano de artritis inducida por anticuerpos de colágeno
La eficacia de los ADC anti-TNF alfa humanos se evaluó en un modelo de artritis de ratón transgénico con TNFa humano.
El modelo de artritis inducida por anticuerpos de colágeno (CAIA) (Moore, AR J Transl Med 12:285 (2014)) se realizó mediante el uso de ratones inactivados para Tg1278TNF transgénicos para TNF humano como se describió anteriormente (Moore A y otros J Transl Med 12 (1): 285 (2014)). Se administraron ocho mg de un cóctel de anticuerpos monoclonales que se dirigen a diferentes epítopos de colágeno tipo II (ArthritoMab™) por vía intraperitoneal (i.p.) a los ratones el día 0. El día 3, se inyectaron a los ratones por vía i.p. 10 pg de LpS para potenciar la patología de la enfermedad. Se evaluó la puntuación artrítica de los animales diariamente desde el día 3 hasta el día 14 del estudio. Se usaron ocho ratones machos por grupo y se administraron artículos de prueba o vehículo PBS por vía i.p. dos veces por semana durante dos semanas.
Los resultados se muestran en la Figura 4 y demuestran que los ADC anti-TNF alfa humanos pueden reducir significativamente la puntuación de la enfermedad en comparación con un mAb anti-TNF alfa humano (adalimumab). Ejemplo 88: Actividad de los ADC esteroidales anti-mTNF alfa en el pico de inflamación
Se llevó a cabo un experimento de CIA en ratón para establecer la eficacia del ADC esteroidal anti-mTNF alfa en animales con inflamación máxima. Para la dosificación terapéutica tardía, los ratones se inscribieron en el estudio ante los primeros signos clínicos de la enfermedad y se dosificaron 6 días después de la inscripción. Se sacrificó un grupo de animales en el día 7 de la enfermedad para proporcionar un valor de referencia para los cambios artríticos mediante micro tomografía computarizada (pCT) y análisis histológico en el momento en que se dosificaron todos los demás grupos. Todos los animales se dosificaron una vez el día 6 con vehículo (solución salina al 0,9 %), mAb antimTNF alfa (10mpk) (8C11) o ADC esteroidal anti-mTNF alfa (10mpk) (Cpd. No. 145) y sacrificado el día 21. Se recogieron las patas traseras artríticas y se realizó un análisis de pCT. A continuación, se usaron las mismas patas para la evaluación histológica. Al final del experimento, se recogió sangre completa mediante punción cardíaca para evaluar los recuentos sanguíneos completos (CBC).
Tomografía microcomputarizada (pCT)
Las patas traseras se retiraron intactas en la tibia/peroné y se fijaron en formalina al 10 %. Las patas se escanearon mediante pCT (Scanco Medical AG, Micro-CT40) a 55 kVp a 145 pA en configuración de alta resolución (1000 proyecciones/ 180° a una reconstrucción de píxeles de 2048x2048) mediante el uso de vóxeles isotrópicos y un tiempo de integración de 300 milisegundos. Se dibujó manualmente un contorno cilíndrico alrededor de la región de interés desde la unión tibiotalar y se extendió hasta el tobillo en 100 rebanadas (1,8 mm). La evaluación se realizó mediante el software Scanco mediante el uso de sigma gauss 0,8, con un umbral superior de 1000 y un umbral inferior de 320.
Evaluación histológica
Las patas traseras de los ratones tratados se fijaron por inmersión en formalina tamponada neutra al 10 % y se descalcificaron parcialmente en solución de Calrite durante 48 horas para permitir el recorte de los bordes lateral y medial del tarso. Luego, las patas se volvieron a colocar en Calrite durante ~ 48 horas para completar la descalcificación. Las muestras se procesaron de forma rutinaria, se incluyeron en parafina en el plano sagital, se seccionaron a 5 micras y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Los portaobjetos se evaluaron microscópicamente para detectar la presencia de inflamación/formación de pannus, infiltración de neutrófilos, erosión ósea y daño del cartílago mediante el uso de una escala de 0-4: 0 = ninguno presente, 1 = leve, 2 = moderado, 3 = marcado, 4 = severo.
Los resultados mostrados en la Figura 12 demuestran que una dosis única de ADC esteroidal anti-mTNF alfa puede revertir la enfermedad establecida y reducir la inflamación de la pata hasta casi el valor de referencia. Por el contrario, una sola dosis de mAb anti-mTNF alfa tuvo un efecto mínimo sobre la inflamación.
El efecto del tratamiento sobre la pérdida ósea del tarso medida por mCT se muestra en la Figura 13. Los resultados demuestran que una dosis única de ADC esteroidal anti-mTNF alfa administrada en el pico de inflamación es capaz de inhibir significativamente la erosión ósea articular mediada por la enfermedad en comparación con mAb antimTNF alfa solo.
Los resultados de la evaluación histológica de las articulaciones de los ratones tratados con CIA se muestran en las Figuras 14-17. Demuestran que una sola dosis de ADC esteroidal anti-mTNF alfa administrada en el pico de la enfermedad dio como resultado una disminución significativa de la inflamación, la formación de pannus, la erosión ósea y el daño del cartílago el día 21 en relación con los controles de vehículo de la misma edad (p <0,001), y los niveles de la enfermedad fueron equivalentes a los niveles observados en los controles al inicio del estudio (vehículo d6). En dos de las seis patas evaluadas, no se detectó ninguna enfermedad en las articulaciones tarso/ falángicas de los animales tratados con ADC esteroidal anti-mTNF alfa el día 21, en comparación con la incidencia del 100 % en ratones el día 6 de referencia (antes del tratamiento) y los ratones tratados con vehículo el día 21.
Por el contrario, una dosis única de mAb anti-mTNF alfa en el pico de la enfermedad no inhibió la inflamación, la erosión ósea, la formación de pannus o la destrucción del cartílago, en relación con los controles con vehículo de la misma edad el día 21. Los niveles de la enfermedad fueron más graves que los controles de referencia y se observó una leve tendencia a mejorar la inflamación.
Se analizó la sangre completa para evaluar los cambios en los subconjuntos de células sanguíneas periféricas con el tratamiento. Los resultados mostrados en las Figuras 18-23 demuestran que el aumento en algunas poblaciones de células sanguíneas periféricas observado en animales enfermos puede resolverse con una sola dosis de ADC esteroidal anti-mTNF alfa. Se observaron reducciones estadísticamente significativas en los glóbulos blancos, neutrófilos y monocitos en general con el tratamiento con ADC esteroidal anti-mTNF alfa.
Ejemplo 89: Comparación de ADC esteroidales anti-mTNF-alfa y ADC anti-CD 163
Para demostrar la eficacia terapéutica mejorada de un inmunoconjugado anti-TNF en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria, comparamos su actividad con un ADC dirigido al receptor removedor de hemoglobina CD163, un enfoque inmunoconjugado de glucocorticoides descrito en la literatura que tiene una funcionalidad antiinflamatoria dirigida (PCT Int. Appl. WO2011039510A2 de Graversen NJH, y otros; Graversen JH y otros, Mol. Ther. 20 (8): 1550-8 (2012)).
Generación de una línea celular reportera de GRE CD163 de ratón
Se creó una línea celular parental similar a la descrita en el Ejemplo 78 pero con células CHO-K1 en lugar de células K562. La línea celular parental resultante CHO pGL4.36[Luc2P/MMTV/Hygro] _PGL4.75[hRLuc/CMV] se transfectó luego con un plásmido que codifica para CD163 de ratón (Origene cat. No. MR216798) en las condiciones descritas en el Ejemplo 78. La línea celular resultante CHO mCD163 GRE (pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro]) se usó para probar la actividad in vitro de inmunoconjugados anti-mTNF-alfa y anti-CD163 de ratón (también denominados inmunoconjugados anti-mCD163 o ADC esteroidal anti-mCD163).
Preparación de un inmunoconjugado anti-CD163 de ratón
Se generó un anticuerpo quimérico de rata anti-ratón CD163 mIgG2a/k a partir de la secuencia VH y VL para el clon 3E10B10 como se describe (SEQ ID NO: 87/88 de PCT Int. Appl. WO 2011/039510A2). Este anticuerpo se conjugó con Cpd. No. 99 mediante el uso de las condiciones resaltadas bajo el protocolo general de conjugación de cisteína en el Ejemplo 36 para dar una razón fármaco: anticuerpo (DAR) de 4.
Actividad de un inmunoconjugado anti-CD163 de ratón en el ensayo reportero de GRE de CD163 de ratón
Se ensayó la actividad del inmunoconjugado anti-CD163 de ratón en la línea celular CHO mCD163 GRE (pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro]) en las condiciones descritas en el Ejemplo 79. Un ADC esteroidal anti-mTNF alfa (Cpd. No. 145) se incluyó como control negativo. Los resultados de la Tabla 22 demuestran el inmunoconjugado anti-CD163 de ratón (Cpd. No. 223):
Figure imgf000043_0001
muestra actividad dependiente de antígeno disociada del ADC esteroidal anti-mTNF alfa en la línea celular CD163 GRE de ratón.
Cuadro 22
Figure imgf000043_0002
Actividad del inmunoconjugado anti-CD163 de ratón en artritis inducida por colágeno en ratón
La capacidad del inmunoconjugado esteroidal anti-ratón CD163 para impactar la inflamación de la pata se evaluó en el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) de ADC esteroidal anti-mTNF alfa control de RA A (cpd 139) con el mismo enlazador de fármacos y DAR que el ADC esteroidal anti-mCD163 también se evaluó en el mismo estudio y los mAb parentales para ambos ADC también se incluyeron como grupos de tratamiento. El experimento se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 85. Los resultados se muestran en la Figura 24 y demuestran que aunque el ADC esteroidal anti-mCD163 inicialmente reduce la inflamación de la pata en los primeros días después del tratamiento de dosis única, este efecto es transitorio. En comparación, una sola dosis de ADC esteroidal anti-mTNF alfa es suficiente para suprimir completamente la inflamación durante la duración del estudio.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Un compuesto:
    Figure imgf000094_0001
    en donde n es 2 o 4, y A es un anticuerpo que comprende SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 73 o adalimumab. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde n es 4.
    Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde n es 2.
    Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en donde A es adalimumab.
ES17733222T 2016-06-02 2017-06-01 Agonista del receptor de glucocorticoides e inmunoconjugados del mismo Active ES2877548T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662344948P 2016-06-02 2016-06-02
US201662371134P 2016-08-04 2016-08-04
PCT/US2017/035518 WO2017210471A1 (en) 2016-06-02 2017-06-01 Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2877548T3 true ES2877548T3 (es) 2021-11-17

Family

ID=59215995

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17733222T Active ES2877548T3 (es) 2016-06-02 2017-06-01 Agonista del receptor de glucocorticoides e inmunoconjugados del mismo

Country Status (35)

Country Link
US (4) US20180126000A1 (es)
EP (2) EP3901162A1 (es)
JP (2) JP6843891B2 (es)
KR (2) KR20220119529A (es)
CN (1) CN109476699B (es)
AU (2) AU2017274442B2 (es)
BR (1) BR112018074922B1 (es)
CA (1) CA3025377A1 (es)
CL (1) CL2018003406A1 (es)
CO (1) CO2018012996A2 (es)
CR (1) CR20180594A (es)
CY (1) CY1124293T1 (es)
DK (1) DK3464318T3 (es)
DO (1) DOP2018000261A (es)
EC (1) ECSP18094857A (es)
ES (1) ES2877548T3 (es)
HR (1) HRP20210924T1 (es)
HU (1) HUE054804T2 (es)
IL (1) IL263214B2 (es)
LT (1) LT3464318T (es)
MA (1) MA51586A (es)
MX (2) MX2018014927A (es)
MY (1) MY194619A (es)
PE (1) PE20190622A1 (es)
PH (1) PH12018502539A1 (es)
PL (1) PL3464318T3 (es)
PT (1) PT3464318T (es)
RS (1) RS62040B1 (es)
RU (1) RU2745748C2 (es)
SG (2) SG11201810678WA (es)
SI (1) SI3464318T1 (es)
TW (1) TWI728118B (es)
UY (1) UY37269A (es)
WO (1) WO2017210471A1 (es)
ZA (1) ZA201808623B (es)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3025377A1 (en) * 2016-06-02 2017-12-07 Abbvie Inc. Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
US10711032B2 (en) 2016-11-08 2020-07-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Steroids and protein-conjugates thereof
CA3063871A1 (en) 2017-05-18 2018-11-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cyclodextrin protein drug conjugates
RU2020117698A (ru) 2017-12-01 2022-01-04 Эббви Инк. Агонист глюкокортикоидного рецептора и его иммуноконъюгаты
KR20200108002A (ko) * 2018-01-08 2020-09-16 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 스테로이드 및 이의 항체-접합체
CN110357959B (zh) * 2018-04-10 2023-02-28 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 Gcgr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
JP2021523147A (ja) 2018-05-09 2021-09-02 レゲネロン ファーマシューティカルス，インコーポレーテッド 抗ｍｓｒ１抗体及びその使用方法
BR112021013464A2 (pt) * 2019-01-08 2021-09-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ligantes sem traço e conjugados de proteína dos mesmos
EP3947450A4 (en) * 2019-04-05 2023-05-31 The Regents Of The University Of California METHODS AND COMPOSITIONS INVOLVING CHIMERIC BINDING POLYPEPTIDES
WO2021161263A1 (en) * 2020-02-13 2021-08-19 Abbvie Inc. Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
WO2022135332A1 (zh) * 2020-12-21 2022-06-30 映恩生物制药（苏州）有限公司 一种甾体偶联物
MX2023008096A (es) * 2021-01-07 2023-09-22 Immunext Inc Nuevas cargas utiles de esteroides, enlazadores de esteroides, adc que los contienen y uso de estos.
CA3207416A1 (en) * 2021-02-04 2022-08-11 Lingjian ZHU Drug conjugate of glucocorticoid receptor agonist, and application thereof in medicine
WO2022171101A1 (zh) * 2021-02-10 2022-08-18 映恩生物制药（苏州）有限公司 一种甾体偶联物
AR125079A1 (es) 2021-03-23 2023-06-07 Lilly Co Eli Agonistas de receptores de glucocorticoides sustituidos con carboxi
AR125084A1 (es) 2021-03-23 2023-06-07 Lilly Co Eli Agonistas del receptor de glucocorticoides novedosos
TW202304462A (zh) 2021-03-23 2023-02-01 美商美國禮來大藥廠 糖皮質素受體激動劑
CN117580849A (zh) 2021-06-24 2024-02-20 江苏先声药业有限公司 甾体类化合物、其药物组合物及其应用
EP4366779A1 (en) * 2021-07-09 2024-05-15 Bright Peak Therapeutics AG Modified tnf-antibodies and uses thereof
CN117500816A (zh) * 2021-08-26 2024-02-02 映恩生物制药（苏州）有限公司 一种甾体化合物及其缀合物
TW202327620A (zh) * 2021-09-14 2023-07-16 大陸商映恩生物製藥（蘇州）有限公司 一種抗炎症的化合物及其用途
WO2023092048A1 (en) 2021-11-18 2023-05-25 Adafre Biosciences, Llc Anti-tnf-alpha antibodies and compositions
TW202340252A (zh) * 2022-01-29 2023-10-16 大陸商上海盛迪醫藥有限公司 糖皮質激素的藥物偶聯物
TW202345788A (zh) * 2022-04-01 2023-12-01 大陸商江蘇先聲藥業有限公司 配體-藥物偶聯物及其用途
WO2023220549A1 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Eli Lilly And Company Human tumor necrosis factor alpha antibody glucocorticoid conjugates
WO2023235738A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Eli Lilly And Company Human interleukin-4 receptor alpha antibody glucocorticoid conjugates
WO2023250341A2 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Eli Lilly And Company Human cd33 antibodies and glucocorticoid conjugates
WO2024006681A1 (en) 2022-06-28 2024-01-04 Adafre Biosciences, Llc Anti-tnf-αlpha antibodies and compositions
WO2024020164A2 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Firefly Bio, Inc. Glucocorticoid receptor agonists and conjugates thereof
WO2024064779A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Eli Lilly And Company Glucocorticoid receptor agonists

Family Cites Families (164)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3126375A (en) 1964-03-24 Chioacyl
GB933867A (en) 1958-12-08 1963-08-14 American Cyanamid Co Fluorinated steroids
IT1057859B (it) 1972-04-28 1982-03-30 Sigma Tao Ind Farmaceutiche Sp Perivato del triamoinolone
US4588585A (en) 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DE3546806C2 (es) 1985-03-30 1991-03-28 Marc Genf/Geneve Ch Ballivet
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
US5681718A (en) 1986-03-14 1997-10-28 Celltech Limited Methods for enhanced production of tissue plasminogen activator in cell culture using alkanoic acids or salts thereof
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
EP0315456B1 (en) 1987-11-05 1994-06-01 Hybritech Incorporated Polysaccharide-modified immunoglobulins having reduced immunogenic potential or improved pharmacokinetics
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5010176A (en) 1988-11-10 1991-04-23 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
AU652539B2 (en) 1989-05-16 1994-09-01 Medical Research Council Co-expression of heteromeric receptors
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0814159B1 (en) 1990-08-29 2005-07-27 GenPharm International, Inc. Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
GB9109645D0 (en) 1991-05-03 1991-06-26 Celltech Ltd Recombinant antibodies
US7192584B2 (en) 1991-03-18 2007-03-20 Centocor, Inc. Methods of treating psoriasis with anti-TNF antibodies
US6284471B1 (en) 1991-03-18 2001-09-04 New York University Medical Center Anti-TNFa antibodies and assays employing anti-TNFa antibodies
US5656272A (en) 1991-03-18 1997-08-12 New York University Medical Center Methods of treating TNF-α-mediated Crohn's disease using chimeric anti-TNF antibodies
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
EP1291360A1 (en) 1991-12-13 2003-03-12 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
AU683463B2 (en) 1993-04-02 1997-11-13 Astrazeneca Ab New prednisolone derivates
WO1994025478A1 (en) 1993-04-29 1994-11-10 Instytut Farmaceutyczny 16α,17α-ACETAL GLUCOCORTICOSTEROIDAL DERIVATIVES
EP0749438B1 (de) 1994-03-09 2000-12-13 Byk Gulden Lomberg Chemische Fabrik GmbH Neue silylverbindungen und ihre verwendung
JP2749778B2 (ja) 1994-09-05 1998-05-13 日清食品株式会社 トリアムシノロン誘導体
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
ATE219517T1 (de) 1995-08-18 2002-07-15 Morphosys Ag Protein-/(poly)peptidbibliotheken
US6706484B1 (en) 1995-08-18 2004-03-16 Morphosys Ag Protein/(poly)peptide libraries
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US5792758A (en) 1995-12-08 1998-08-11 G. D. Searle & Co. Steroid nitrite ester derivatives useful as anti-inflammatory drugs
CN1300173C (zh) 1996-02-09 2007-02-14 艾博特生物技术有限公司 结合人TNFα的人抗体
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5824669A (en) 1996-03-22 1998-10-20 Nitromed, Inc. Nitrosated and nitrosylated compounds and compositions and their use for treating respiratory disorders
DE19635498A1 (de) 1996-09-03 1998-03-26 Byk Gulden Lomberg Chem Fab Verfahren zur Epimerenanreicherung
WO2000049993A2 (en) 1999-02-24 2000-08-31 Nitromed, Inc. Nitrosated and nitrosylated steroids for the treatment of cardiovascular diseases and disorders
US8383081B2 (en) 1999-05-10 2013-02-26 Immunomedics, Inc. Anti-CD74 immunoconjugates and methods of use
CA2339889C (en) 1999-07-02 2012-01-31 Morphosys Ag Identification of specific binding partners binding to (poly)peptides encoded by genomic dna fragments or ests
GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
US7468433B2 (en) 2000-11-10 2008-12-23 Nycomed Gmbh Process for the production of 16,17-[(cyclohexylmethylen)bis(oxy)]-11,21-dihydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion or its 21-isobutyrat by transketalisation
DE10055820C1 (de) 2000-11-10 2002-07-25 Byk Gulden Lomberg Chem Fab Verfahren zur Herstellung eines Glucocorticoids
CA2385745C (en) 2001-06-08 2015-02-17 Abbott Laboratories (Bermuda) Ltd. Methods of administering anti-tnf.alpha. antibodies
US7595378B2 (en) 2001-06-13 2009-09-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
US20060073141A1 (en) 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
AU2002368077B2 (en) 2001-07-12 2010-03-04 Jefferson Foote Super humanized antibodies
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
EP2292271A3 (en) 2001-10-10 2011-09-14 BioGeneriX AG Remodelling and glycoconjugation of an antibody
CN1585778A (zh) 2001-11-12 2005-02-23 默克专利有限公司 修饰的抗－TNFα抗体
US7538195B2 (en) 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
GB0216648D0 (en) 2002-07-18 2002-08-28 Lonza Biologics Plc Method of expressing recombinant protein in CHO cells
EP1562627A4 (en) 2002-08-23 2006-11-02 Mclean Hospital Corp CORTICOSTEROID CONJUGATES AND ITS USES
CA2528776A1 (en) 2002-10-24 2004-05-06 G & R Pharmaceuticals, Llc Antifungal formulations
MY150740A (en) 2002-10-24 2014-02-28 Abbvie Biotechnology Ltd Low dose methods for treating disorders in which tnf? activity is detrimental
AU2003285878B2 (en) 2002-11-07 2011-04-28 Immunogen, Inc. Anti-CD33 antibodies and method for treatment of acute myeloid leukemia using the same
EP1569925A1 (en) 2002-12-13 2005-09-07 Neurogen Corporation 2-substituted quinazolin-4-ylamine analogues as capsaicin receptor modulators
JP2006516636A (ja) 2003-01-30 2006-07-06 メディミューン，インコーポレーテッド 抗インテグリンαｖβ３抗体製剤及びその用途
MY143936A (en) 2003-03-27 2011-07-29 Nycomed Gmbh Process for preparing crystalline ciclesonide with defined particle size
WO2005044759A2 (en) 2003-08-14 2005-05-19 Sun Pharmaceutical Industries Limited Acetalization process for preparation of steroid compounds
PL1670482T5 (pl) 2003-09-16 2022-10-03 Covis Pharma Gmbh Zastosowanie cyklezonidu w leczeniu chorób układu oddechowego
WO2005028495A1 (en) 2003-09-24 2005-03-31 Glaxo Group Limited Anti-inflammatory glucocorticoids
CA2542834C (en) 2003-10-21 2012-04-24 Igf Oncology, Llc Conjugates or co-administration of igf-1 receptor ligands with anti-cancer chemotherapeutic agents
ATE356124T1 (de) 2003-11-13 2007-03-15 Hoffmann La Roche Hydroxyalkylsubstituierte pyrido-7-pyrimidin-7- one
CA2550435A1 (en) 2003-12-19 2005-07-14 Bristol-Myers Squibb Company Azabicyclic heterocycles as cannabinoid receptor modulators
WO2005063777A1 (en) 2003-12-23 2005-07-14 Corus Pharma Benzylphosphate and substituted benzylphosphate prodrugs for the treatment of pulmonary inflammation
EP1729724A4 (en) 2003-12-31 2008-07-23 Cydex Inc INHALATION FORMULATION WITH SULFOALKYL ETHER GAMMA CYCLODEXTRIN AND CORTICOSTEROID
GB0402797D0 (en) 2004-02-09 2004-03-10 Novartis Ag Organic compounds
ES2533695T3 (es) 2004-03-02 2015-04-14 Seattle Genetics, Inc. Anticuerpos cargados parcialmente y métodos para su conjugación
US20080187954A1 (en) 2004-03-10 2008-08-07 Lonza Ltd. Method For Producing Antibodies
WO2006019447A1 (en) 2004-07-15 2006-02-23 Xencor, Inc. Optimized fc variants
WO2006024497A1 (en) 2004-08-30 2006-03-09 Lonza Biologics Plc. Affinity- plus ion exchange- chromatography for purifying antibodies
PT2990422T (pt) 2004-09-03 2018-10-18 Genentech Inc Antagonistas humanizados anti-beta7 e suas utilizações
CA2579007A1 (en) 2004-09-10 2006-03-16 Altana Pharma Ag Ciclesonide and syk inhibitor combination and methods of use thereof
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
JP2008521828A (ja) 2004-11-29 2008-06-26 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 操作された抗体およびイムノコンジュゲート
WO2006097458A1 (en) 2005-03-15 2006-09-21 Nycomed Gmbh Novel combination
WO2006110593A2 (en) 2005-04-07 2006-10-19 Macrogenics, Inc. Biological targets for the diagnosis, treatment and prevention of cancer
EP1712220A1 (en) 2005-04-15 2006-10-18 PARI GmbH Spezialisten für effektive Inhalation Pharmaceutical aerosol composition
WO2006135479A2 (en) 2005-05-10 2006-12-21 Angiotech International Ag Anti-scarring agents, therapeutic compositions, and use thereof
US20100209508A1 (en) 2005-06-14 2010-08-19 Corus Pharma, Inc. Substituted Phenylphosphates as Mutual Prodrugs of Steroids and ß-Agonists for the Treatment of Title Pulmonary Inflammation and Bronchoconstriction
DK1912677T3 (da) 2005-06-20 2014-01-13 Psma Dev Company L L C PSMA-antistof-lægemiddel-konjugater
WO2007054974A2 (en) 2005-09-28 2007-05-18 Arch Pharmalab Limited A green chemistry process for the preparation of pregnadiene esters
CA2648582C (en) 2006-04-07 2016-12-06 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of an anti-tnf-alpha antibody
WO2008015696A2 (en) 2006-05-23 2008-02-07 Cadila Healthcare Limited Process for preparing ciclesonide
EP2446904B1 (en) 2006-05-30 2015-04-29 Genentech, Inc. Anti-CD22 antibodies, their immunoconjugates and uses thereof
WO2008035066A2 (en) 2006-09-19 2008-03-27 Cipla Limited Processes for the preparation of ciclesonide and its crystal form
WO2008052350A1 (en) 2006-11-03 2008-05-08 Qlt Inc. Photodynamic therapy for the treatment of hidradenitis suppurativa
US7691980B2 (en) 2007-01-09 2010-04-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced capacity and purification of antibodies by mixed mode chromatography in the presence of aqueous-soluble nonionic organic polymers
NO331891B1 (no) 2007-03-20 2012-04-30 Clavis Pharma Asa Kjemiske forbindelser, et farmasoytisk preparat inneholdende slike forbindelser, samt anvendelse derav for behandling av kreft, inflammasjon og KOLS
UA100120C2 (en) 2007-04-03 2012-11-26 Анадис Фармасьютикалз, Инк. 5,6-dihydro-1h-pyridin-2-one compounds
EP2173169B1 (en) 2007-06-28 2014-05-21 CyDex Pharmaceuticals, Inc. Nasal delivery of aqueous corticosteroid solutions
NZ585434A (en) * 2007-11-30 2012-06-29 Pfizer Ltd Novel glucocorticoid receptor agonists
CL2008003802A1 (es) 2007-12-21 2010-02-19 Schering Corp Compuestos derivados de tioeteres c-21, agonistas del receptor de glucocorticoide; composicion farmaceutica; y uso para el tratamiento o profilaxis de una enfermedad o afeccion inmune, autoinmune o inflamatoria, tales como artritis reumatoide y esclerosis multiple.
TW200944540A (en) 2007-12-21 2009-11-01 Schering Corp C20-C21 substituted glucocorticoid receptor agonists
US8093364B2 (en) 2008-01-18 2012-01-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced purification of antibodies and antibody fragments by apatite chromatography
AU2009217824A1 (en) 2008-02-27 2009-09-03 Astrazeneca Ab 16 alpha, 17 alpha-acetal glucocorticosteroidal derivatives and their use
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
CA2714653A1 (en) 2008-03-13 2009-09-17 Farmabios S.P.A. Process for the preparation of pregnane derivatives
US20090318396A1 (en) 2008-06-10 2009-12-24 Gilead Sciences, Inc. Corticosteroid linked beta-agonist compounds for use in therapy
BRPI0914789A2 (pt) 2008-06-16 2015-10-20 Immunogen Inc efeitos sinérgicos
KR101273765B1 (ko) 2008-06-24 2013-06-12 아이알엠 엘엘씨 Ｇ 단백질-커플링된 수용체를 조정하는 화합물 및 방법
US20100120733A1 (en) 2008-11-07 2010-05-13 Auspex Pharmaceuticals, Inc. Steroid modulators of glucocorticoid receptor
CA2745271A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
HUE043084T2 (hu) 2008-12-19 2019-08-28 Macrogenics Inc Kovalens diatestek és alkalmazásaik
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
WO2010104187A1 (ja) 2009-03-09 2010-09-16 三笠製薬株式会社 ステロイド化合物
WO2010126953A1 (en) 2009-04-29 2010-11-04 Gilead Sciences, Inc. Corticosteroid linked beta-agonist compounds for use in therapy
WO2010132743A1 (en) 2009-05-15 2010-11-18 Gilead Sciences, Inc. Corticosteroid beta-agonist compounds for use in therapy
WO2010136940A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Pfizer Limited Novel glucocorticoid receptor agonists
GB0917044D0 (en) 2009-09-29 2009-11-18 Cytoguide As Agents, uses and methods
MX2012006406A (es) 2009-12-04 2012-07-25 Genentech Inc Anticuerpos multiespecificos, analogos de anticuerpo, composiciones y metodos.
CN102665757A (zh) 2009-12-09 2012-09-12 免疫医疗公司 通过双特异性抗体预靶向的用于细胞毒性药物的递送系统
WO2011081937A1 (en) 2009-12-15 2011-07-07 Gilead Sciences, Inc. Corticosteroid-beta-agonist-muscarinic antagonist compounds for use in therapy
CN102167741B (zh) 2010-02-25 2014-05-14 上海百迈博制药有限公司 一种全人源抗TNF-α单克隆抗体、其制备方法及用途
SG184473A1 (en) 2010-04-07 2012-11-29 Abbvie Inc Tnf-alpha binding proteins
TWI586806B (zh) 2010-04-23 2017-06-11 建南德克公司 異多聚體蛋白質之製造
JP5881254B2 (ja) 2010-05-18 2016-03-09 セルリアン・ファーマ・インコーポレイテッド 自己免疫疾患およびその他の疾患の治療のための組成物および方法
MX2012014080A (es) 2010-06-03 2013-05-01 Abbvie Biotechnology Ltd Usos y composiciones para el tratamiento de hidradenitis superativa (hs).
RU2013103060A (ru) 2010-06-24 2014-07-27 Эббви Инк. Иммуноглобулины с двумя вариабельными доменами и их применение
AU2011305566A1 (en) 2010-09-22 2013-05-02 Map Pharmaceuticals, Inc. Aerosol composition for administering drugs
AR084210A1 (es) 2010-12-08 2013-05-02 Abbott Lab PROTEINAS DE UNION AL TNF-a
WO2012082947A1 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Irm Llc Compounds and compositions as tgr5 agonists
WO2012089247A1 (en) 2010-12-29 2012-07-05 Nokia Siemens Networks Oy A method and apparatus for transmitting an identity
JP6130350B2 (ja) 2011-03-30 2017-05-17 アブリンクス エン．ヴェー． ＴＮＦαに対する単一ドメイン抗体で免疫障害を処置する方法
JP5827511B2 (ja) 2011-07-25 2015-12-02 新日鉄住金エンジニアリング株式会社 石炭ガスの製造方法およびメタンの製造方法
IN2014CN03936A (es) 2011-10-24 2015-09-04 Abbvie Inc
AU2012328917B2 (en) 2011-10-24 2017-05-25 Abbvie Inc. Bispecific immunobinders directed against TNF and IL-17
US20130115269A1 (en) 2011-11-04 2013-05-09 Henry John Smith Anti-tumor necrosis factor alpha (TNF-a) antibody used as a targeting agent to treat arthritis and other diseases
US9580501B2 (en) 2011-12-16 2017-02-28 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Anti-TNF alpha monoclonal secretory IgA antibodies and methods for treating inflammatory diseases
US9109005B2 (en) 2012-02-23 2015-08-18 Boehringer Ingelheim International Gmbh Method for manufacturing of ciclesonide
EP2641900A1 (en) 2012-03-20 2013-09-25 Almirall, S.A. Novel polymorphic Crystal forms of 5-(2-{[6-(2,2-difluoro-2-phenylethoxy) hexyl]amino}-1-(R)-hydroxyethyl)-8-hydroxyquinolin-2(1h)-one, heminapadisylate as agonist of the ß2 adrenergic receptor.
CN103421075B (zh) 2012-05-16 2017-07-28 上海特化医药科技有限公司 孕烷衍生物16,17‑缩醛(酮)的制备方法
EP2855745A4 (en) 2012-06-01 2016-01-20 Momenta Pharmaceuticals Inc METHODS RELATING TO ADALIMUM AB
SG11201502816YA (en) 2012-10-12 2015-05-28 Agency Science Tech & Res Optimised heavy chain and light chain signal peptides for the production of recombinant antibody therapeutics
ES2701076T3 (es) 2012-11-24 2019-02-20 Hangzhou Dac Biotech Co Ltd Enlazadores hidrofílicos y sus usos para la conjugación de fármacos a las moléculas que se unen a las células
US9107960B2 (en) 2012-12-13 2015-08-18 Immunimedics, Inc. Antibody-SN-38 immunoconjugates with a CL2A linker
WO2014096116A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Pharmaceutical formulation comprising ciclesonide
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
EP2970458A1 (en) * 2013-03-15 2016-01-20 AbbVie Inc. Improved tnf binding proteins
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
RU2015145491A (ru) * 2013-03-27 2017-05-16 ОЛЕДВоркс ГмбХ МОДЕРНИЗИРОВАННЫЙ ИСТОЧНИК СВЕТА НА ОРГАНИЧЕСКИХ СВЕТОИЗЛУЧАЮЩИХ ДИОДАХ (ОСИДах)
CA2920192A1 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Immunomedics, Inc. Anti-trop-2 antibody-drug conjugates and uses thereof
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
US10464955B2 (en) 2014-02-28 2019-11-05 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Charged linkers and their uses for conjugation
EP3125943A4 (en) * 2014-04-04 2017-12-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Phosphate based linkers for intracellular delivery of drug conjugates
EP3160499A4 (en) 2014-06-30 2018-03-14 Immunomedics, Inc. Antibodies reactive with an epitope located in the n-terminal region of muc5ac comprising cysteine-rich subdomain 2 (cys2)
WO2016042163A2 (en) 2014-09-19 2016-03-24 Medterials, Inc. Ophthalmic drug compositions
US10233210B2 (en) 2015-01-30 2019-03-19 Coral Drugs Pvt. Ltd. Process for preparation of glucocorticoid steroids
JP2016190798A (ja) 2015-03-31 2016-11-10 三笠製薬株式会社 アレルギー性鼻炎治療用局所点鼻薬
JP2017066075A (ja) 2015-09-30 2017-04-06 三笠製薬株式会社 リウマチ治療薬
CA3025377A1 (en) * 2016-06-02 2017-12-07 Abbvie Inc. Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor
US10711032B2 (en) 2016-11-08 2020-07-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Steroids and protein-conjugates thereof

Also Published As

Publication number Publication date
PH12018502539A1 (en) 2019-09-30
CY1124293T1 (el) 2022-07-22
TWI728118B (zh) 2021-05-21
SG11201810678WA (en) 2018-12-28
DOP2018000261A (es) 2018-12-31
EP3464318A1 (en) 2019-04-10
RS62040B1 (sr) 2021-07-30
KR20220119529A (ko) 2022-08-29
HUE054804T2 (hu) 2021-09-28
BR112018074922B1 (pt) 2022-10-25
BR112018074922A2 (pt) 2019-03-12
ZA201808623B (en) 2019-08-28
IL263214A (en) 2018-12-31
MX2020012562A (es) 2021-02-09
US20220354959A1 (en) 2022-11-10
ECSP18094857A (es) 2019-01-31
PL3464318T3 (pl) 2021-11-08
DK3464318T3 (da) 2021-06-28
RU2745748C2 (ru) 2021-03-31
JP2021088582A (ja) 2021-06-10
MY194619A (en) 2022-12-07
UY37269A (es) 2018-01-02
PT3464318T (pt) 2021-07-02
CA3025377A1 (en) 2017-12-07
CL2018003406A1 (es) 2019-02-15
TW201801749A (zh) 2018-01-16
AU2017274442A1 (en) 2018-12-13
KR102435599B1 (ko) 2022-08-29
US20190262465A1 (en) 2019-08-29
CN109476699A (zh) 2019-03-15
MA51586A (fr) 2019-04-10
SI3464318T1 (sl) 2021-07-30
JP6843891B2 (ja) 2021-03-17
WO2017210471A1 (en) 2017-12-07
IL263214B2 (en) 2023-06-01
RU2018145728A (ru) 2020-07-10
JP2019524645A (ja) 2019-09-05
US10668167B2 (en) 2020-06-02
RU2018145728A3 (es) 2020-08-04
CN109476699B (zh) 2021-10-12
CO2018012996A2 (es) 2019-01-18
US20180126000A1 (en) 2018-05-10
MX2018014927A (es) 2019-04-09
AU2017274442B2 (en) 2021-08-19
US20200338208A1 (en) 2020-10-29
HRP20210924T1 (hr) 2021-09-03
EP3901162A1 (en) 2021-10-27
LT3464318T (lt) 2021-06-25
PE20190622A1 (es) 2019-04-26
KR20190014542A (ko) 2019-02-12
CR20180594A (es) 2019-07-29
AU2021269433A1 (en) 2021-12-16
EP3464318B1 (en) 2021-04-21
SG10202001787QA (en) 2020-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2877548T3 (es) Agonista del receptor de glucocorticoides e inmunoconjugados del mismo
US9808537B2 (en) Antibody-drug conjugate
TWI504408B (zh) 葉酸受體１抗體類和免疫共軛物類及彼等之用途
AU2011320318B2 (en) Non-antagonistic EGFR-binding molecules and immunoconjugates thereof
ES2719548T3 (es) Anticuerpos humanizados para liv-1 y uso de los mismos para tratar el cáncer
ES2883176T3 (es) Anticuerpos monoclonales recombinantes y antígenos correspondientes para cánceres de colon y de páncreas
TW202304996A (zh) 抗-b7-h3抗體及抗體藥物結合物
US20210403594A1 (en) Epcam antibodies, activatable antibodies, and immunoconjugates, and uses thereof
KR20160047567A (ko) 조작된 항-dll3 접합체 및 사용 방법
JP2016531920A (ja) Ｃｄ７０結合ペプチドおよびそれに関連する方法、プロセスおよび用途
CA2815277A1 (en) Novel egfr-binding molecules and immunoconjugates thereof
WO2015112822A1 (en) Antibody-drug conjugates targeting kit receptor and uses thereof
US11795225B2 (en) Therapeutic binding molecules
ES2710976T3 (es) Anticuerpos anti-CD52
EP3599249A1 (en) Anti-5t4 antibody-drug conjugate and use thereof
ES2796560T3 (es) Moléculas de unión específicas para ASCT2 y usos de las mismas
CN117015553A (zh) 包含白细胞介素-18结合蛋白和抗血清白蛋白的抗原结合片段的重组融合蛋白及其组合物和用途
NZ788703A (en) Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
WO2024015830A1 (en) Epcam immunoconjugates and uses thereof
JP2023546293A (ja) 抗ｃｓｐｇ４結合剤、そのコンジュゲートおよびその使用方法
BR122020012304B1 (pt) Composto ligante para conjugados anticorpo-fármaco, método e intermediários de produção do mesmo