JP2022547018A - 抗cxcr2抗体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
抗CXCR2抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。抗体またはそのフラグメントは、CXCR2タンパク質のN末端、細胞外ドメインに特異的に結合する。様々な例において、抗体またはそのフラグメントは、SEQ ID NO: 1のVH CDR1、SEQ ID NO: 2のVH CDR2、SEQ ID NO: 3のVH CDR3、またはSQ ID NO: 7-14のいずれか一つ、SEQ ID NO: 4のVL CDR1、SEQ ID NO: 5のVL CDR2およびSEQ ID NO: 6のVL CDR3、またはそれらの各変異体を含む。がんや炎症性疾患などの疾患の治療および診断のための抗体またはそのフラグメントの使用方法も提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、2019年9月4日に出願されたPCT/CN2019/104336の優先権を主張するものであり、その内容の全体が本明細書に組み込まれているものとする。
Gタンパク質共役型受容体(GPCR)スーパーファミリーは、800超のメンバーからなるヒトゲノム最大のファミリーの一つであり、中枢神経系、免疫系、および循環器系を含む様々な器官および組織に広く分布している。GPCRは、ヒトの生理的および病理学的プロセスに広く関与している。承認されている薬物の約40%がGPCRを介して作用を媒介する。
大部分のGPCRは、進化的な相同性と生理的リガンドの特性から、5つの主要なファミリー:ロドプシン、アドヒージョン、セクレチン、グルタミン酸、Frizzled/TAS2に分類され得る。ロドプシンは最も大きく、最も不均一なファミリーであり、さらにα、β、γ、δの4つのサブファミリーに分けられる。これらのタンパク質は類似した構造:細胞外のN末端、7つの膜貫通領域、および細胞質内のC末端を持つ。それらはアミノ酸、核酸、ペプチド、およびタンパク質など様々なリガンドとの相互作用を介して様々な細胞外刺激を感知し、リガンドが誘発する立体構造変化を介して細胞内シグナル伝達経路を活性化する。標準的なシグナル伝達では、C末端の特定の細胞質領域に細胞内のGTP依存性タンパク質(Gタンパク質)が動員されることによりGPCRシグナルが伝達される、いわゆるGタンパク質依存性シグナル伝達である。その後、関与する特定のGタンパク質に応じて、cAMP経路またはPIP2経路などの下流経路が活性化される。
さらに、細胞内の他の足場タンパク質、例えばβ-アレスチンの動員が、Gタンパク質に依存しないシグナル伝達を活性化することが示されている。多重のシグナル伝達によりGPCRは細胞内で複数の機能を併せ持っており、任意の単一の標的受容体を特定の下流の細胞活動と結び付ける関連アッセイを設計することを困難にしている。これらの重要な標的に対し有効性の高い治療法を開発することは、製薬業界にとって依然として大きな課題である。また、抗体は新しい治療法を右肩上がりに生み出すものとして登場したが、GPCRに対する治療用抗体はまだ1つしか開発されていない。これは、これらの膜タンパク質の機能性立体構造に結合する抗体を作成することが困難であることが主な理由である。
コンビナトリアル抗体は、創薬における強力なツールとして登場した。ファージパニングから得られた81以上の抗体が臨床試験に入り、そのうち11以上が販売許可を得ている。コンビナトリアル抗体ライブラリのアプローチは、最大1014の異なる結合分子からなるレパートリーの膨大な多様性を利用するものである。このようなライブラリから選択された抗体は多様なメカニズムを示し、中和性であることや、または、アゴニスト、アンタゴニスト、もしくはインバースアゴニストとして機能することが可能である。場合によっては、ネイティブリガンドの範囲を超えた機能を発揮することも示されている。
CXCR2(C-X-Cモチーフ型ケモカイン受容体2)は、ケモカイン受容体ファミリーのメンバーで、主に好中球に発現している。CXCR2は、通常、炎症刺激に追随する好中球の走化性に関与していることが示されている。しかし、大腸炎、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息、および糸球体腎炎などの炎症を伴う様々な疾患では、好中球の不要な遊走が病態の大きな部分を占めることがある。例えば、以前の研究では、CXCR2の枯渇がタバコの煙に誘発される炎症および傷害から肺を保護することが報告されている。さらに、CXCR2は、様々な種類のがんの進行に関与し、腫瘍細胞の増殖、生存、および転移に重要な役割を果たし、腫瘍の微小環境全体に影響を及ぼすことが示されている。
これらの臨床的知見から、CXCR2による好中球の遊走を阻害することは、好中球の関連する炎症性疾患および一部のがんを治療するための重要な、ただしいまだ実現されていない戦略であると考えられてきた。CXCR2を標的とするいくつかの小分子が、すでにin vitroまたは動物実験で受容体に対する顕著な阻害効果を示しているが、臨床の場で治療効果を示してはいない。これは、CXCR2への非機能的な結合とオフターゲット効果によるものと考えられている。
対照的に、抗体は、高い特異性、高い血清安定性、高い安全性を有し、その大きさからリガンドの受容体への結合を阻害するという点で、これらの臨床的困難を克服しうるものである。しかし、選択のために、天然の立体構造で安定した抗原を十分な量調製することが難しいため、GPCRを標的とする機能性抗体を同定することは困難であった。
本開示は、CXCR2に結合し、IL-8によるその結合を効果的に阻害し、または完全に阻害し、それによってIL-8に誘発される好中球の走化性を阻害することができる抗体および抗原結合性フラグメントを提供するものである。これらの抗体およびフラグメントは優れた親和性(例えばピコモルレベル)を示し、IL8自体が高い親和性(ナノモルレベル)で結合するという問題を克服し、IL8に誘発される細胞機能の完全阻害をもたらすことができる。さらに、これらの抗体は偏ったアゴニズム効果を示し、CXCR2のエンドサイトーシスを活性化し、CXCR2を介した病的事象をより効率的に抑制し得る。
さらなる実験により、試験した抗CXCR2抗体は、主に、ヒトCXCR2タンパク質の細胞外N末端のアミノ酸残基の一部(残基1-48、特に残基9-19)の側鎖を介してCXCR2と相互作用することがわかった。このような相互作用がIL8結合とIL8に誘発される細胞機能の阻害に十分であったことは、少なくとも、CXCR2はIL8結合にも関与する他の3つの細胞外ドメイン(ループ)を持つことが以前に示唆されていたため、驚きと予想外のことであった。
したがって、本開示の一実施形態に従って、ヒトC-X-Cモチーフ型ケモカイン受容体2(CXCR2)タンパク質に特異的に結合でき、前記結合はSEQ ID NO:15の残基9-19内のアミノ酸残基の少なくとも1つに関与する、抗体またはそのフラグメントを提供する。いくつかの実施形態では、結合は、D13、F14およびW15のうちの少なくとも1つを含む。いくつかの実施形態では、結合は、少なくともF14およびW15を含む。いくつかの実施形態では、結合は、少なくともD13、F14、およびW15を含む。いくつかの実施形態では、結合は、48個のN末端残基の外側の任意のアミノ酸残基を含まない。いくつかの実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、CXCR2とIL-8タンパク質との間の結合を阻害する。
別の実施形態は、ヒトC-X-Cモチーフ型ケモカイン受容体2(CXCR2)タンパク質に対する特異性を有し、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびにCDR1、CDR2、およびCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)を含む抗体またはそのフラグメントであって、前記VH CDR1はSEQ ID NO:1のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:1からのアミノ酸置換を有する変異体を含み;前記VH CDR2は、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:2からのアミノ酸置換を有する変異体を含み;前記VH CDR3は、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列、SEQ ID NO:3からのアミノ酸置換を有する変異体、またはSEQ ID NO:7-14からなる群から選択される変異体を含み;前記VL CDR1は、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:4からのアミノ酸置換を有する変異体を含み;前記VL CDR2は、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:5からのアミノ酸置換を有する変異体を含み;前記VL CDR3は、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:6からのアミノ酸置換を有する変異体を含む、抗体またはそのフラグメントを提供する。
いくつかの実施形態では、VH CDR1はSEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含み;VH CDR2はSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含み;VH CDR3はSEQ ID NO.3のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:7-14からなる群から選択される変異体を含み;VL CDR1はSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含み;VL CDR2はSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含み;VL CDR3は、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、VH CDR3は、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、VHは、SEQ ID NO:17もしくは18のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:17もしくは18に対して少なくとも90%の配列同一性を有するペプチドを含む。いくつかの実施形態では、VHは、SEQ ID NO:18のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:18に対して少なくとも90%の配列同一性を有するペプチドを含む。いくつかの実施形態では、VLは、SEQ ID NO:19のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも90%の配列同一性を有するペプチドを含む。
治療方法および用途も提供される。一実施形態では、治療を必要とする患者のがんまたは炎症性疾患を治療する方法であって、本開示の抗体またはそのフラグメントの有効量を患者に投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、がんは、膀胱がん、肝臓がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、白血病、リンパ腫、膵臓がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、乳がん、尿道がん、頭頸部がん、胃腸がん、食道がん、卵巣がん、腎がん、黒色腫、前立腺がんおよび甲状腺がんからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、炎症性疾患は、パーキンソン病、関節炎、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、ループス、全身性エリテマトーデス、若年性関節リウマチ、若年性特発性関節炎、グレーブ病、橋本甲状腺炎、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、シェーグレン症候群、I型糖尿病、血管炎、ぶどう膜炎、動脈硬化、および強直性脊椎炎の1つまたははそれ以上である。
定義
用語「1つ(a)」または「1つ(an)」の実体は、その実体の1つまたは複数を指すことに留意されたい。例えば、「1つの抗体」は、1つまたは複数の抗体を表すと理解される。このように、用語「1つ(a)」(または「1つ(an)」)、「1つまたは複数」、および「少なくとも1つ」は、本明細書において互換的に使用され得る。
用語「1つ(a)」または「1つ(an)」の実体は、その実体の1つまたは複数を指すことに留意されたい。例えば、「1つの抗体」は、1つまたは複数の抗体を表すと理解される。このように、用語「1つ(a)」(または「1つ(an)」)、「1つまたは複数」、および「少なくとも1つ」は、本明細書において互換的に使用され得る。
本明細書において、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」と複数の「ポリペプチド」を包含することを意図しており、アミド結合(ペプチド結合ともいう)により直鎖状に結合したモノマー(アミノ酸)からなる分子を指すものとする。また、用語「ポリペプチド」とは、2個以上のアミノ酸の任意の鎖を意味し、特定の長さのものを意味するものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または2つ以上のアミノ酸の鎖もしくは鎖(複数)を指すために用いられる他の任意の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語の代わりに、つまり互換的に使用されてもよい。また、用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図しており、これには、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護/ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、または非天然起源アミノ酸による修飾が含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチドは、天然の生物学的資源に由来してもよいし、組換え技術によって製造してもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されたものである必要はない。それは、化学合成を含む任意の方法で生成することができる。
「相同性」または「同一性」または「類似性」とは、2つのペプチド間または2つの核酸分子間の配列の類似性を意味する。相同性は、比較の目的でアライメントされた各配列の位置を比較することにより決定することができる。比較した配列中のある位置が同じ塩基またはアミノ酸で占められている場合、その位置で分子は相同である。配列間の相同性の程度は、配列が共有する一致したまたは相同な位置の数の関数である。「無関係な」または「非相同の」配列は、本開示の配列の1つと40%未満の同一性、好ましくは25%未満の同一性を共有する。
用語「等価な核酸またはポリヌクレオチド」とは、核酸またはその相補体のヌクレオチド配列とある程度の相同性、すなわち配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸をいう。二重鎖核酸のホモログは、それまたはその相補体とある程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むことを意図している。一態様において、核酸のホモログは、核酸またはその相補体にハイブリダイズすることが可能である。同様に、「等価なポリペプチド」とは、参照ポリペプチドのアミノ酸配列とある程度の相同性、すなわち配列同一性を有するポリペプチドを指す。いくつかの態様において、配列同一性は、少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、または99%である。いくつかの態様において、等価なポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比較して、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの付加、欠失、置換およびそれらの組合せを有する。いくつかの態様において、等価な配列は、参照配列の活性(例えば、エピトープ結合)または構造(例えば、塩橋)を保持する。
本明細書において、「抗体」または「抗原結合ポリペプチド」とは、抗原を特異的に認識し結合するポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指す。抗体は、抗体全体およびその任意の抗原結合フラグメントまたは一本鎖であり得る。したがって、用語「抗体」は、抗原に結合する生物学的活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む、任意のタンパク質またはペプチド含有分子を含む。その例としては、重鎖もしくは軽鎖の相補性決定領域(CDR)またはそのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク(FR)領域、もしくはそれらの任意の部分、または結合タンパク質の少なくとも1つの部分が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本明細書で使用する「抗体フラグメント」または「抗原結合フラグメント」という用語は、F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、およびscFvなどの抗体の一部分である。構造にかかわらず、抗体フラグメントは、インタクトな抗体によって認識されるのと同じ抗原と結合する。用語「抗体フラグメント」は、アプタマー、シュピーゲルマー、およびダイアボディを含む。また、用語「抗体フラグメント」は、特定の抗原と結合して複合体を形成することにより、抗体のように作用する合成または遺伝子工学的に設計されたタンパク質も含む。
「単鎖可変領域フラグメント」または「scFv」は、免疫グロブリンの重鎖(VH)と軽鎖(VL)の可変領域の融合タンパク質を指す。いくつかの態様では、これらの領域は10~約25個のアミノ酸の短いリンカーペプチドで接続されている。このリンカーは、柔軟性のためにグリシンを多く含み、溶解性のためにセリンまたはスレオニンを含み、VHのN末端をVLのC末端に、またはその逆を接続することが可能である。このタンパク質は、定常領域を除去し、リンカーを導入したにもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。ScFv分子は当技術分野で既知である、例えば、米国特許第5892019号明細書に記載されている。
抗体という用語は、生化学的に区別できるポリペプチドの様々な広いクラスを包含する。当業者であれば、重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン(、、、、)に分類され、それらの間にいくつかのサブクラス(例えば、l-4)があることを理解するであろう。この鎖の性質によって、抗体の「クラス」がそれぞれIgG、IgM、IgA IgG、またはIgEと決定される。免疫グロブリンのサブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5などはよく特徴づけられており、機能分化させることが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプの各々の改変版は、即時開示の観点から当業者に容易に識別可能であり、それゆえ、即時開示の範囲内である。全ての免疫グロブリンクラスは、明らかに本開示の範囲内であり、以下の議論は、一般に、免疫グロブリン分子のIgGクラスに向けられているものとする。IgGに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量約23,000ダルトンの2つの同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量53,000~70,000の2つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。この4本の鎖は、通常、ジスルフィド結合によって「Y」字型に結合しており、軽鎖が重鎖を「Y」の口から可変領域まで括り付けている。
本開示の抗体、抗原結合ポリペプチド、変異体、またはその誘導体には、ポリクローナル、モノクローナル、多特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合フラグメント、例えば、Fab、Fab'、および F(ab')2、Fd、Fv、単鎖Fv(scFv)、単鎖抗体、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、VKまたはVHドメインのいずれかを含むフラグメント、Fab発現ライブラリによって生成されたフラグメント、および抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本明細書で開示するLIGHT抗体に対する抗Id抗体など)が含まれるが、これらに限定されない。本開示の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY)、クラス(例えば、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、およびIgA2)またはサブクラスであってよい。
軽鎖はカッパとラムダ(,)のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと結合することができる。一般に、軽鎖と重鎖は互いに共有結合しており、免疫グロブリンがハイブリドーマ、B細胞または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって生成される場合、2つの重鎖の「尾部」部分は共有結合のジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合している。重鎖では、アミノ酸配列はY字型に分岐した末端のN末端から各鎖の下端のC末端まで続いている。
軽鎖、重鎖ともに構造的および機能的に相同性のある領域に分けられる。「定常」および「可変」という用語は、機能的に使用される。この点に関して、軽鎖(VK)および重鎖(VH)部分の両方の可変ドメインが、抗原認識および特異性を決定することが理解されよう。逆に、軽鎖(CK)および重鎖(CH1、CH2またはCH3)の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Fc受容体結合、および補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。定常領域ドメインは、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠ざかるにつれて番号が増加するのが通例である。N末端部は可変領域、C末端部は定常領域であり;CH3およびCKドメインは、実際にはそれぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含んでいる。
上記に示したように、可変領域によって、抗体は抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することが可能になる。すなわち、抗体のVKドメインとVHドメイン、または相補性決定領域(CDR)のサブセットが結合して、3次元的な抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この抗体の四次構造が、Yの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、VHおよびVK鎖のそれぞれ上の3つのCDR(すなわち、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3)により規定されている。いくつかの例では、例えば、ラクダ科動物種に由来する、またはラクダ科動物の免疫グロブリンに基づいて設計された特定の免疫グロブリン分子は、完全な免疫グロブリン分子が重鎖のみからなり、軽鎖がない場合がある。例えば、Hamers-Castermanら、Nature 363:446-448(1993)を参照されたい。
自然界に存在する抗体では、各抗原結合ドメインに存在する6つの「相補性決定領域」つまり「CDR」は、短いアミノ酸の非連続配列で、抗体が水性環境下で三次元構造をとる際に抗原結合ドメインを形成するために特異的に配置されている。抗原結合ドメインに含まれる残りのアミノ酸は「フレームワーク」領域と呼ばれ、分子間の変動はあまり見られない。フレームワーク領域は大部分が-シート立体構造をとり、CDRは-シート構造をつなぐループを形成し、場合によっては-シート構造の一部を形成する。このように、フレームワーク領域は、鎖間非共有結合相互作用によって、CDRを正しい方向に配置するための足場を形成するように作用している。配置されたCDRによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原のエピトープと相補的な表面を規定する。この相補的な表面は、抗体とその同族エピトープとの非共有結合を促進する。CDRおよびフレームワーク領域をそれぞれ構成するアミノ酸は、正確に定義されているので、当業者であれば、任意の所与の重鎖または軽鎖の可変領域について容易に同定できる(“Sequences of Proteins of Immunological Interest,” Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); and Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 196:901-917 (1987)を参照されたい)。
当技術分野で使用されているおよび/または受け入れられている用語の定義が2つ以上ある場合、本明細書で使用する用語の定義は、反対のことを明示的に述べない限り、そのような意味をすべて含むことを意図している。具体的な例は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非連続的抗原結合部位を記述するための「相補性決定領域」(「CDR」)という用語の使用である。この特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983)およびChothia et al., J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987)に記載されており、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。KabatおよびChothiaによるCDRの定義には、互いを比較した場合、重複したアミノ酸残基またはサブセットが含まれる。それでもなお、抗体またはその変異体のCDRを指すためにいずれかの定義を適用することは、本明細書で定義され使用される用語の範囲内であることが意図される。上記引用文献の各々によって定義されたCDRを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表に記載する。特定のCDRを包含する正確な残基番号は、CDRの配列およびサイズに依存して変化する。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸配列が与えられれば、どの残基が特定のCDRを構成するかを規定通りに決定することができる。
また、Kabatらは、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列の番号付けシステムを定義している。当業者であれば、配列そのものを超えるいかなる実験データにも依存することなく、この「Kabat番号付け」のシステムを任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用する場合、「Kabat番号付け」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983)に記載された番号付けシステムを意味する。
上記の表に加えて、Kabat番号システムにより、CDR領域は以下のように記述される:CDR-H1はおよそアミノ酸31(すなわち、最初のシステイン残基の約9残基後)から始まり、およそ5-7個のアミノ酸を含み、次のトリプトファン残基で終了する。CDR-H2は、CDR-H1の末端から15番目の残基から始まり、約16-19個のアミノ酸を含み、次のアルギニンまたはリジン残基で終了する。CDR-H3は、CDR-H2の末端から約30番目のアミノ酸残基で始まり、3-25個のアミノ酸を含み、配列W-G-X-G(Xは任意のアミノ酸)で終了する。CDR-L1は、残基約24(すなわち、システイン残基に続く)から始まり、約10-17残基を含み、次のトリプトファン残基で終了する。CDR-L2は、CDR-L1の末端から約16番目の残基から始まり、約7残基を含む。CDR-L3は、CDR-L2の末端から約30番目の残基(すなわち、システイン残基に続く)から始まり、約7-11残基を含み、配列FまたはW-G-X-G(Xは任意のアミノ酸)で終了する。
本明細書に開示される抗体は、鳥類および哺乳類を含む任意の動物由来であってよい。好ましくは、抗体は、ヒト、ネズミ、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリの抗体である。別の実施形態では、可変領域は、軟骨魚綱起源(例えば、サメ由来)であってよい。
本明細書において、用語「重鎖定常領域」は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖定常領域を含むポリペプチドは、CH1ドメイン、ヒンジ(例えば、上部、中部、および/もしく下部ヒンジ領域)ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、またはそれらの変異体もしくはフラグメントのうちの少なくとも1つを含む。例えば、本開示で使用するための抗原結合ポリペプチドは、CH1ドメインを含むポリペプチド鎖;CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびCH2ドメインを含むポリペプチド鎖;CH1ドメインおよびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖;CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖、またはCH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖を含み得る。別の実施形態では、本開示のポリペプチドは、CH3ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本開示で使用するための抗体は、CH2ドメインの少なくとも一部(例えば、CH2ドメインの全部または一部)を欠いていてもよい。上記のように、重鎖定常領域は、それらが天然に存在する免疫グロブリン分子とアミノ酸配列が異なるように修飾されてもよいことは、当業者には理解されよう。
本明細書に開示される抗体の重鎖定常領域は、異なる免疫グロブリン分子に由来してもよい。例えば、ポリペプチドの重鎖定常領域は、IgGl分子由来のCH1ドメインおよびIgG3分子由来のヒンジ領域を含んでいてよい。別の例では、重鎖定常領域は、一部がIgGl分子に、一部がIgG3分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖部分は、一部がIgGl分子に、一部がIgG4分子に由来するキメラヒンジを含み得る。
本明細書で使用する場合、用語「軽鎖定常領域」は、抗体軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖定常領域は、定常カッパドメインまたは定常ラムダドメインの少なくとも1つを含む。
「軽鎖-重鎖ペア」とは、軽鎖のCLドメインと重鎖のCH1ドメインの間のジスルフィド結合により二量体を形成できる軽鎖と重鎖の集合体のことである。
先に示したように、様々な免疫グロブリンのクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元的な配置はよく知られている。本明細書で使用されるように、用語「VHドメイン」は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、用語「CH1ドメイン」は、免疫グロブリン重鎖の第1の(最もアミノ末端の)定常領域ドメインを含む。CH1ドメインは、VHドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端である。
本明細書で使用する場合、用語「CH2ドメイン」は、従来の番号付けスキーム(残基244-360、カバット番号付けシステム;および残基231-340、EU番号付けシステム;Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983)参照)を用いると、例えば抗体のおよそ残基244から残基360に延びる重鎖分子の部分を含む。CH2ドメインは、別のドメインと密接に対になっていない点で独特である。むしろ、2本のN-結合型分岐糖鎖が、無傷の天然IgG分子の2つのCH2ドメインの間に介在している。また、CH3ドメインはCH2ドメインからIgG分子のC-末端まで伸びており、約108残基を含むことがよく知られている。
本明細書で使用する場合、用語「ヒンジ領域」は、CH1ドメインとCH2ドメインを結合している重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は約25残基を含み、柔軟であるため、2つのN末端抗原結合領域が独立して動くことができる。ヒンジ領域は、上部、中部、下部ヒンジドメインという3つの異なるドメインに細分化できる(Roux et al., J. Immunol 161:4083 (1998))。
本明細書において使用する場合、用語「ジスルフィド結合」は、2つの硫黄原子の間に形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、第2のチオール基とジスルフィド結合またはブリッジを形成することができるチオール基を含む。ほとんどの天然に存在するIgG分子において、CH1およびCK領域はジスルフィド結合によって連結され、2つの重鎖は、Kabat番号付けシステムを用いると239および242に対応する位置(226または229位置、EU番号付けシステム)で2つのジスルフィド結合によって連結されている。
本明細書で使用する場合、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性領域または部位が第1の種から得られまたは由来し、定常領域(即時開示に従って無傷、部分的または修飾されてもよい)が第2の種から得られる任意の抗体を意味するとされるであろう。特定の実施形態では、標的結合領域または部位は、非ヒト源(例えば、マウスまたは霊長類)から得られようし、定常領域はヒトである。
本明細書で使用する場合、「ヒト化率」は、ヒト化ドメインと生殖系列ドメインとの間のフレームワークアミノ酸差(すなわち、非CDR差)の数を決定し、その数をアミノ酸の総数から差し引き、それをアミノ酸の総数で割って100を乗算することによって算出される。
一般に、「特異的に結合する」あるいは「特異性を有する」とは、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合し、抗原結合ドメインとエピトープの間に何らかの相補性を伴うことを意味する。この定義によれば、ある抗体が抗原結合ドメインを介して、ランダムで無関係なエピトープに結合するよりも容易にそのエピトープに結合するとき、その抗体はエピトープに「特異的に結合する」という。本明細書において用語「特異性」は、ある抗体があるエピトープに結合する際の相対的な親和性を認定するために使用されている。例えば、抗体「A」は抗体「Bよ」りも所与のエピトープに対して高い特異性を有するとみなされる場合もあるし、抗体「A」は関連エピトープ「D」に対してよりも高い特異性でエピトープ「C」に結合すると言われる場合もある。
本明細書において使用する場合、「治療する」または「治療」という用語は、治療的処置と予防的または防止的措置の両方を指し、その目的は、がんの進行などの望ましくない生理学的変化または障害を防止または減速(軽減)することである。有益なまたは望ましい臨床結果には、症状の緩和、疾患の範囲の縮小、疾患の安定化(すなわち、悪化していない)状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、および検出可能か検出不可能かにかかわらず寛解(部分または全体か)があるが、これらに限定されるものではない。「治療」とは、治療を受けなかった場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長することも意味し得る。治療を必要とする者には、既に病態や障害を有する者だけでなく、病態や障害を有しやすい者、病態や障害を予防しようとする者も含まれる。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳類」とは、診断、予後、治療が望まれる任意の対象、特に哺乳類の対象を意味する。哺乳類対象には、ヒト、家畜、農耕動物、ならびにイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、およびウシなどの動物園動物、スポーツ動物、またはペット動物が含まれる。
本明細書で使用される場合、「治療を必要とする患者に」または「治療を必要とする対象」などの句は、例えば、検出、診断手順および/または治療に用いられる本開示の抗体または組成物の投与から利益を得るであろう哺乳動物対象などの対象を含む。
抗CXCR2抗体およびそのフラグメント
ヒトCXCR2タンパク質は、4つの細胞外フラグメントを持つ膜貫通タンパク質である。N末端と3つの細胞外ループのそれぞれが、IL8との結合に関与しているとされている。例えば、Ahuja, S.K. et al., (1996) The Journal of biological chemistry 271, 225-232; Katancik, J.A., et al., (1997) BioChemical and Biophysical Research Communications 232, 663-668; Luo, Z.W., et al., (1997) Protein Engineering 10, 1039-1045; Berkamp, S., et al., (2017) Journal of Biomolecular Nmr 69, 111-121; Park, S.H. et al., (2017) Biophysical Journal 113, 2695-2705; Park, S.H. et al., (2011) J Mol Biol 414, 194-203; and Park, S.H. et al., (2012) Nature 491, 779-783 を参照されたい。
ヒトCXCR2タンパク質は、4つの細胞外フラグメントを持つ膜貫通タンパク質である。N末端と3つの細胞外ループのそれぞれが、IL8との結合に関与しているとされている。例えば、Ahuja, S.K. et al., (1996) The Journal of biological chemistry 271, 225-232; Katancik, J.A., et al., (1997) BioChemical and Biophysical Research Communications 232, 663-668; Luo, Z.W., et al., (1997) Protein Engineering 10, 1039-1045; Berkamp, S., et al., (2017) Journal of Biomolecular Nmr 69, 111-121; Park, S.H. et al., (2017) Biophysical Journal 113, 2695-2705; Park, S.H. et al., (2011) J Mol Biol 414, 194-203; and Park, S.H. et al., (2012) Nature 491, 779-783 を参照されたい。
本発明者らは、配列解析と試験により、N末端の細胞外フラグメントを抗体スクリーニングのためのエピトープとして同定した。驚くべきことに、大規模スクリーニングから(1011件の候補ライブラリから)で得られた、N末端への選択的結合(ピコモルの効力で)を示す抗体群は、IL8結合を効果的に阻害し、IL8に誘発される好中球の走化性を強力に抑制することができた。この優れた親和性によりIL8自体が高親和性(ナノモル)で結合するという問題は克服され、IL8に誘発される細胞機能は完全に阻害された。さらに、これらの抗体は逆アゴニスト効果までも示し、CXCR2発現による内在性β-アレスチン動員を顕著に抑制することができた。さらに、これらの抗体は偏ったアゴニスト効果を示し、CXCR2のエンドサイトーシスを活性化し、CXCR2を介した病的事象をより効率的に抑制する可能性があることがわかった。
実験データによれば、これらの抗体およびその抗原結合フラグメントは、追加のスクリーニングによって得られる抗体とともに、がん、感染症、炎症性および自己免疫疾患などのCXCR2シグナル伝達に関連する疾患および症状の治療に有用であり得ることが示されている。
本開示の一実施形態に従って、ヒトC-X-Cモチーフ型ケモカイン受容体2(CXCR2)タンパク質に対する結合特異性を有する抗体またはそのフラグメントが提供される。いくつかの実施形態では、結合は、細胞外N末端内の1つまたは複数のアミノ酸残基(すなわち、MEDFNMESDS FEDFWKGEDL SNYSYSSTLP PFLLDAAPCE PESLEINK;SEQ ID NO:15)を含む。いくつかの実施形態では、結合は、少なくとも、SEQ ID NO:15の残基9-19内の1つまたは複数のアミノ酸残基(すなわち、DSFEDFWKGED、SEQ ID NO:16)を含む。いくつかの実施形態では、結合は、3つの細胞外ループ内のものなど、48個のN末端残基の外側の任意のアミノ酸残基を伴わないか、または少なくとも必要としない。
いくつかの実施形態では、結合は、SEQ ID NO:15のD13、F14およびW15の少なくとも1つを含む(言い換えれば、抗体またはフラグメントは、これに結合する)。いくつかの実施形態では、結合は、少なくともD13を含む。いくつかの実施形態では、結合は、少なくともF14を含む。いくつかの実施形態では、結合は、少なくともW15を含む。いくつかの実施形態では、結合は、少なくともD13およびF14を含む。いくつかの実施形態では、結合は、少なくともD13およびW15を含む。いくつかの実施形態では、結合は、少なくともF14およびW15を含む。いくつかの実施形態では、結合は、D13、F14および/またはW15に加えて、SEQ ID NO:15内の少なくとも別の残基を含む。
いくつかの実施形態では、結合は、IL8結合を阻害し、競合し、または完全に排除するのに有効である。いくつかの実施形態では、本開示の抗体またはそのフラグメントは、IL8の媒介するCXCR2シグナル伝達、または内在性CXCR2シグナル伝達さえも阻害することができる。
本開示のいくつかの実施形態は、ヒトC-X-Cモチーフ型ケモカイン受容体2(CXCR2)タンパク質に対する結合特異性を有する抗体またはそのフラグメントを提供する。抗体またはフラグメントは、CDR1、CDR2およびCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびにCDR1、CDR2およびCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)を含む。いくつかの実施形態では、CDRは、表Aに示されるような配列、およびそれらの変異体を含む。表Bは、実験例で試験されたVH CDR3のいくつかの変異体も列挙している。
いくつかの実施形態では、表Aに示すように、VH CDR1はSEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含み;VH CDR2はSEQ ID NO:2のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:2からアミノ酸置換された変異体を含み;VH CDR3はSEQ ID NO.3のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:7-14からなる群から選択される変異体を含み;VL CDR1はSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含み;VL CDR2はSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含み;VL CDR3はSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の抗CXCR2抗体は、表Aに挙げたVHおよびVL CDRに、1つ、2つまたは3つのさらなる修飾を施したものを含む。そのような修飾は、アミノ酸の付加、欠失または置換であり得る。置換は、いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換である。
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換するものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されており、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。したがって、免疫グロブリンポリペプチド中の非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換される。別の実施形態では、アミノ酸の文字列は、側鎖ファミリーのメンバーの順序および/または組成が異なる構造的に類似した文字列に置き換えることができる。
保存的アミノ酸置換の非限定的な例を以下の表に示す。ここで、0以上の類似性スコアは、2つのアミノ酸の間に保存的置換があることを示す。
いくつかの実施形態では、本開示の抗CXCR2抗体は、SEQ ID NO:17もしくは18のVH、SEQ ID NO:19のVL、またはそれらのそれぞれの生物学的等価物を含む。VHまたはVLの生物学的等価物は、全体として80%、85%、90%、95%、98%または99%の配列同一性を有しながら、指定アミノ酸を含む配列である。SEQ ID NO: 18の生物学的等価物は、例えば、SEQ ID NO: 18に対して全体的に80%、85%、90%、95%、98%または99%の配列同一性を有するがCDR(SEQ ID NO: 1-6またはそれらの変異体)を保持するVHであり得る。一実施形態では、VHはSEQ ID NO: 18のアミノ酸配列を有し、VLはSEQ ID NO: 19のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、VHはSEQ ID NO: 17のアミノ酸配列を有し、VLはSEQ ID NO: 19のアミノ酸配列を有する。
また、本明細書に開示されるような抗体は、それらが由来する天然に存在する結合ポリペプチドとアミノ酸配列が異なるように修飾されてもよいことが、当業者には理解されよう。例えば、指定タンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、開始配列に対して類似していてもよく、例えば、あるパーセントの同一性を有していてもよく、例えば、開始配列に対して60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%同一であってもよい。
特定の実施形態では、抗体は、通常、抗体と関連しないアミノ酸配列または1つもしくは複数の部分を含む。例示的な修飾は、以下により詳細に記載される。例えば、本開示の抗体は、柔軟なリンカー配列を含んでもよいし、機能的部分(例えば、PEG、薬物、毒素、または標識)を追加するために修飾されてもよい。
本開示の抗体、変異体、またはその誘導体には、修飾された、すなわち、共有結合が抗体のエピトープへの結合を妨げないように、任意のタイプの分子を抗体へ共有結合させることにより修飾した誘導体が含まれる。例えば、限定するものではないが、抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペギル化、リン酸化、アミド化、既知の保護/ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結等によって修飾され得る。多数の化学修飾のいずれかを、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含むがこれらに限定されない既知の技術によって実施することができる。さらに、抗体は、1つまたは複数の非古典的なアミノ酸を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、抗体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾剤、医薬品、またはPEGにコンジュゲートされてもよい。
抗体は、放射性標識などの検出可能な標識、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療剤または診断剤、薬物または毒素であってもよい細胞毒、超音波増強剤、非放射性標識、これらの組み合わせおよび当技術分野で知られている他のそのような薬剤を含む治療剤とコンジュゲートまたは融合してもよい。
抗体をコードするポリヌクレオチドおよび該抗体を調製する方法
本開示はまた、本開示の抗体、その変異体または誘導体をコードする単離ポリヌクレオチドまたは核酸分子を提供する。本開示のポリヌクレオチドは、同一のポリヌクレオチド分子上、または別々のポリヌクレオチド分子上に、抗原結合ポリペプチド、その変異体または誘導体の重鎖および軽鎖可変領域全体をコードしていてもよい。さらに、本開示のポリヌクレオチドは、抗原結合ポリペプチド、その変異体または誘導体の重鎖および軽鎖可変領域の一部を、同一のポリヌクレオチド分子上または別々のポリヌクレオチド分子上にコードしていてもよい。
本開示はまた、本開示の抗体、その変異体または誘導体をコードする単離ポリヌクレオチドまたは核酸分子を提供する。本開示のポリヌクレオチドは、同一のポリヌクレオチド分子上、または別々のポリヌクレオチド分子上に、抗原結合ポリペプチド、その変異体または誘導体の重鎖および軽鎖可変領域全体をコードしていてもよい。さらに、本開示のポリヌクレオチドは、抗原結合ポリペプチド、その変異体または誘導体の重鎖および軽鎖可変領域の一部を、同一のポリヌクレオチド分子上または別々のポリヌクレオチド分子上にコードしていてもよい。
抗体の作製方法は、当該技術分野において周知であり、本明細書にも記載されている。特定の実施形態では、本開示の抗原結合ポリペプチドの可変領域および定常領域の両方が、完全ヒトである。完全ヒト抗体は、当技術分野で記載され、本明細書に記載されるような技術を用いて作製することができる。例えば、特定の抗原に対する完全ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してそのような抗体を産生するように修飾されたが、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物に抗原を投与することによって調製され得る。そのような抗体を作るために使用できる例示的な技術は、米国特許第6150584号明細書;同第6458592号明細書;同第6420140号明細書に記載されており、これらは参照によりその全体が組み込まれる。
特定の実施形態では、調製された抗体は、治療される動物、例えば、ヒトにおいて、有害な免疫応答を誘発しない。一実施形態では、本開示の抗原結合ポリペプチド、変異体、またはその誘導体は、技術的に認識された技術を用いて、その免疫原性を低減するように改変される。例えば、抗体は、ヒト化、霊長類化、脱免疫化されるか、またはキメラ抗体を作製することができる。これらのタイプの抗体は、非ヒト抗体、典型的にはマウスまたは霊長類の抗体に由来し、親抗体の抗原結合特性を保持または実質的に保持するが、ヒトでは免疫原性が低くなる。これは、(a)非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域に移植してキメラ抗体を生成する、(b)非ヒト相補性決定領域(CDR)の1つ以上の少なくとも一部を、重要なフレームワーク残基を保持するかどうかにかかわらず、ヒトフレームワークおよび定常領域に移植する、または(c)非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によりヒト様セクションでそれを「クローキング」するなど様々な方法によって達成することができる。このような方法は、Morrison et al., ProC. Natl. Acad. Sci. USA 57:6851-6855 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 25:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994), ならびに米国特許第5585089号明細書、同第5693761号明細書、同第5693762号明細書、および同第6190370号明細書に開示されており、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものとする。
脱免疫は、抗体の免疫原性を低下させるために使用することもできる。本明細書で使用される場合、用語「脱免疫」は、T細胞エピトープを修正するための抗体の改変を含む(例えば、国際公開第9852976号および同第/0034317号参照)。例えば、出発抗体からの可変重鎖および可変軽鎖配列を解析し、配列内の相補性決定領域(CDR)および他の重要な残基との関連でエピトープの位置を示す各V領域からのヒトT細胞エピトープ「マップ」を作成する。最終抗体の活性を変化させる危険性の低い代替アミノ酸置換を同定するために、T細胞エピトープマップから個々のT細胞エピトープを解析する。様々な代替となる重鎖可変配列と軽鎖可変配列をアミノ酸置換の組み合わせを含めて設計し、これらの配列をその後、様々な結合ポリペプチドに組み込む。通常、12から24の変異抗体が作製され、結合および/または機能についてテストされる。その後、改変可変領域とヒト定常領域を含む完全な重鎖および軽鎖の遺伝子を発現ベクターにクローニングし、後続のプラスミドを細胞株に導入して抗体全体を産生する。次に、これらの抗体を適切な生化学的および生物学的アッセイで比較し、最適な変異体を同定する。
本開示の抗原結合ポリペプチドの結合特異性は、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ(RIA)または酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)などのin vitroロアッセイにより決定することができる。
あるいは、単鎖ユニットの製造について記載されている技術(米国特許第4694778号明細書;Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., ProC. Natl. Acad. Sci. USA 55:5879- 5883 (1988); およびWard et al., Nature 334:544-554 (1989))を適合して、本開示の単鎖ユニットを製造することができる。単鎖ユニットは、Fv領域の重鎖および軽鎖フラグメントをアミノ酸ブリッジを介して連結することによって形成され、単鎖融合ペプチドをもたらす。大腸菌における機能的なFvフラグメントの組み立てのための技術もまた使用され得る(Skerra et al., Science 242: 1038-1041 (1988))。
単鎖Fv(scFv)および抗体の製造に用いることができる技術の例は、米国特許第300587号明細書、同第4946778号明細書および同第5258498号明細書、Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., ProC. Natl. Sci. USA 90:1995-1999 (1993); ならびにSkerra et al., Science 240:1038-1040 (1988)に記載されている。ヒトにおける抗体のin vivo使用およびin vitro検出アッセイを含むいくつかの用途では、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を使用することが好ましい場合がある。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体などである。キメラ抗体の作製方法は当技術分野で既知である。例えば、Morrison, Science 229:1202(1985); Oi et al., BioTechniques 4:214(1986); Gillies et al., J. Immunol.Methods 125:191-202(1989); 米国特許第5807715号明細書;同第4816567号明細書;および同第4816397号明細書であり、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれているものとする。
ヒト化抗体は、非ヒト種由来の1つ以上の相補性決定領域(CDR)とヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原と結合する、非ヒト種抗体に由来する抗体分子である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基は、CDRドナー抗体からの対応する残基で置換され、抗原結合を変更、好ましくは改善されるであろう。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのCDRとフレームワーク残基の相互作用のモデリング、および特定の位置で異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される。(例えば、Queen et al., 米国特許第5585089号明細書; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)。これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものとする)。抗体は、例えば、CDR移植(欧州特許第239400号明細書;国際公開第91/09967号;米国特許第5225539号明細書;同第5530101号明細書;および同第5585089号明細書)、ベニアリング(veneering)またはリサーフェシング(resurfacing)(欧州特許台592106号明細書;同第519596号明細書;Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., ProC. Natl. Sci. USA 91:969-973 (1994))、および鎖シャッフリング(米国特許第5565332号明細書、これは参照によりその全体が組み込まれるものとする)を含む、当技術分野で既知の様々な技術を用いてヒト化される。
ヒト患者の治療にkは、完全なヒト抗体が特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリを用いたファージディスプレイ法などの当該技術分野で既知の様々な方法によって作製することができる。米国特許第4444887号明細書および同第4716111号明細書;ならびに国際公開第98/46645号、同第98/50433号、同第98/24893号、同第98/16654号、同第96/34096号、同第96/33735号、および同第91/10741号も参照されたい(これら各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする)。
また、機能的な内在性免疫グロブリンを発現できないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子は発現できるトランスジェニックマウスを用いてヒト抗体を作製することも可能である。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、ランダムにまたは相同組換えにより、マウス胚性幹細胞に導入することができる。あるいは、ヒト重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域をマウス胚性幹細胞に導入してもよい。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を相同組換えにより導入する際に、別々にまたは同時に非機能化してもよい。特に、JH領域をホモ接合欠失させると、内因性の抗体産生ができなくなる。改変された胚性幹細胞を膨張させ、胚盤胞に微量注入して、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを交配して、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を作製する。このトランスジェニックマウスは、通常の方法で、選択された抗原、例えば、所望の標的ポリペプチドの全部または一部を用いて免疫される。抗原に向けられるモノクローナル抗体は、通常のハイブリドーマ技術を使用して、免疫されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが保有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞分化の過程で再配列し、その後クラススイッチおよび体細胞変異を起こす。このように、斯かる技術を使用して治療上有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を作製することができる。このヒト抗体を作製する技術の概要については、Lonberg and Huszar Int. Rev. Immunol. 73:65-93 (1995)を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの技術およびそのような抗体を製造するためのプロトコルの詳細な議論については、例えば、国際公開第98/24893号;同第96/34096号;同第96/33735号;米国特許第5413923号明細書;同第5625126号明細書;同第5633425号明細書;同第5569825号明細書;同第5661016号明細書;同第5545806号明細書;同第5814318号明細書;および同第5939598号明細書を参照されたい(これらはその全体が参照によりここに組み込まれるものとする)。さらに、Abgenix, Inc(カリフォルニア州フリーモント)およびGenPharm(カリフォルニア州サンノゼ)などの企業が、上記と同様の技術を使用して選択された抗原に向けられるヒト抗体を提供するために従事し得る。
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイデッドセレクション(guided selection)」と呼ばれる手法で生成することも可能である。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体が、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドするために使用される。(Jespers et al., Bio/Technology 72:899-903(1988)。また、米国特許第5565332号明細書も参照されたい(これはその全体が参照により組み込まれるものとする)。
別の実施形態では、所望のモノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手順(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いる)で容易に分離および配列決定され得る。単離されサブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好ましい供給源として機能する。一旦単離されると、DNAは発現ベクターに置かれる場合があり、これは次に、大腸菌細胞、シミアンCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞または他に免疫グロブリンを生成しない骨髄腫細胞などの原核または真核宿主細胞にトランスフェクトされる。より詳細には、単離されたDNA(本明細書に記載のように合成されてもよい)は、1995年1月25日に出願されたNewmanらの米国特許第5658570号明細書(これは参照により本明細書に組み込まれるものとする)に記載のように、製造抗体のための定常領域および可変領域配列をクローニングするために使用することができる。原則的に、これは、選択された細胞からのRNAの抽出、cDNAへの変換、およびIg特異的プライマーを用いたPCRによる増幅を伴う。この目的のための適切なプライマーは、米国特許第5658570号明細書にも記載されている。以下により詳細に議論されるように、所望の抗体を発現する形質転換細胞は、免疫グロブリンの臨床的および商業的供給を提供するために比較的大量に増殖させることができる。
さらに、通例の組換えDNA技術を使用して、本開示の抗原結合ポリペプチドの1つまたは複数のCDRを、フレームワーク領域内に、例えば、ヒトフレームワーク領域内に挿入して非ヒト抗体をヒト化することもできる。フレームワーク領域は、天然に存在するフレームワーク領域またはコンセンサスフレームワーク領域であってよく、好ましくはヒトフレームワーク領域である(例えば、ヒトフレームワーク領域のリストについてはChothia et al., J. Mol. Biol. 278:457-479 (1998)を参照されたい)。好ましくは、フレームワーク領域とCDRの組み合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、所望のポリペプチド、例えば、LIGHTの少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードしている。好ましくは、1つまたは複数のアミノ酸置換がフレームワーク領域内で行われてもよく、好ましくは、アミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方法を用いて、鎖内ジスルフィド結合に関与する1つまたは複数の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を行って、1つまたは複数の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を生成してもよい。ポリヌクレオチドに対する他の変更は、本開示に包含され、当業者の範囲内である。
また、抗原特異性が適切なマウス抗体分子からの遺伝子と生物活性が適切なヒト抗体分子からの遺伝子とをスプライスすることにより「キメラ抗体」を作製するために開発された技術(Morrison et al.Natl.Acad.Sci. USA:851-855(1984); Neuberger et al., Nature 372:604-608(1984); Takeda et al., Nature 314:452-454(1985))を用いることが可能である。本明細書で用いる場合、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有するものである。
組換え抗体を生成するためのさらに別の非常に効率的な手段が、Newman, Biotechnology 10: 1455-1460(1992)によって開示されている。具体的には、この技術は、サル可変ドメインおよびヒト定常配列を含む霊長類化抗体の生成をもたらす。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものとする。さらに、この技術は、共通に譲渡された米国特許第5658570号明細書、同第5693780号明細書および同第5756096号明細書にも記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
あるいは、抗体産生細胞株は、当業者に周知の技術を用いて選択し、培養することができる。このような技術は、様々な実験マニュアルや一次出版物に記載されている。この点に関して、以下に記載されるような本開示における使用に適した技術は、Current ProtoCols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing AssoCiates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York(1991)に記載されており、これは補足を含めその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
さらに、当業者に知られている標準的な技術を使用して、本開示の抗体をコードするヌクレオチド配列に変異を導入することができ、該変異にはアミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発およびPCR媒介変異誘発が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、変異体(誘導体を含む)は、基準可変重鎖領域、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、可変軽鎖領域、CDR-L1、CDR-L2、またはCDR-L3に対して、50未満のアミノ酸置換、40未満のアミノ酸置換、30未満のアミノ酸置換、25未満のアミノ酸置換、20未満のアミノ酸置換、15未満のアミノ酸置換、10未満のアミノ酸置換、5未満のアミノ酸置換、4未満のアミノ酸置換、3未満のアミノ酸置換、または2未満のアミノ酸置換をコードする。あるいは、飽和変異誘発などにより、コード配列の全部または一部に沿ってランダムに変異を導入し、得られた変異体を生物学的活性についてスクリーニングして、活性を保持する変異体を同定することができる。
がん治療
本明細書に記載されるように、本開示の抗体、変異体または誘導体は、特定の治療法および診断法に使用され得る。
本明細書に記載されるように、本開示の抗体、変異体または誘導体は、特定の治療法および診断法に使用され得る。
本開示は、本明細書に記載の1つまたは複数の障害または状態を治療するために、ヒト患者などの患者に本開示の抗体またはフラグメントを投与することを含む、抗体ベースの治療法をさらに対象とする。本開示の治療薬は、本開示の抗体(本明細書に記載のその変異体および誘導体を含む)および本開示の抗体をコードする核酸またはポリヌクレオチド(本明細書に記載のその変異体および誘導体を含む)を含むが、これらに限定されるわけではない。
本開示の抗体およびフラグメントは、がんの治療または抑制に使用することができる。ケモカイン受容体CXCR2およびそのリガンドは、腫瘍および様々な炎症性疾患の進行に関与している。CXCL/CXCR2軸の活性化は、PI3K、p38/ERK、およびJAK経路を含む複数のシグナル伝達経路を活性化し、細胞の生存と遊走を調節する。CXCL/CXCR2軸は、腫瘍の微小環境と炎症部位への好中球の動員において重要な役割を担っている。慢性炎症における好中球の広範な浸潤は、様々な炎症性疾患における最も重要な発症要因の一つである。
本開示の抗体またはフラグメントで好適に治療できる腫瘍としては、膀胱がん、非小細胞肺がん、腎がん、乳がん、尿道がん、大腸がん、頭頸部がん、扁平上皮がん、メルケル細胞がん、消化器がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、腎がん、および小細胞肺がんが含まれる。従って、ここで開示されている抗体は、そのような任意の1つまたは複数のがんを治療するために使用することができる。
キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法などの細胞療法も、本開示において提供される。本開示の抗CXCR2抗体と接触させられる(または代替的に本開示の抗CXCR2抗体を発現するように操作される)適切な細胞が使用され得る。このような接触または操作の後、その細胞は、次に、治療を必要とするがん患者に導入することができる。がん患者は、本明細書に開示されるようなタイプのいずれかのがんを有することができる。細胞(例えば、T細胞)は、限定されないが、例えば、腫瘍浸潤性Tリンパ球、CD4+T細胞、CD8+T細胞、またはそれらの組合せであり得る。
ある実施形態では、細胞はがん患者自身から単離されたものである。いくつかの実施形態では、細胞はドナーから、または細胞バンクから提供されたものである。細胞ががん患者から分離される場合、望ましくない免疫反応を最小化することができる。
本開示の抗体もしくは変異体、またはそれらの誘導体を用いて治療、予防、診断および/または予後判定され得る、細胞生存率の上昇に関連する追加の疾患または状態には、白血病(急性白血病(例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病(骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、および赤白血病を含む))および慢性白血病(例えば、慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病および慢性リンパ性白血病)を含む)、真赤血腫、リンパ腫(例えば、ホジキン病および非ホジキン病)、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、重鎖症、ならびに固体腫瘍(限定されるわけではないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸がん、膵臓がん、乳がん、甲状腺がん、子宮内膜がん、黒色腫、前立腺がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん。基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄質がん、気管支がん、腎細胞がん、肝がん、胆管がん、絨毛がん、精巣がん、胚細胞がん、ウィルム腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、音響神経腫、オリゴデングリオーマ、血管腫、メラノーマ、神経芽腫および網膜芽細胞腫を含む)などの、悪性腫瘍および関連疾患の進行および/または転移が、限定されるわけではないが、含まれる。
炎症性疾患の治療
実験例で実証されたように、本開示の抗体は免疫応答を変化させることができ、したがって炎症性疾患および状態、自己免疫疾患、ならびに感染症の治療に有用であり得る。
実験例で実証されたように、本開示の抗体は免疫応答を変化させることができ、したがって炎症性疾患および状態、自己免疫疾患、ならびに感染症の治療に有用であり得る。
いくつかの実施形態において、開示される抗体、フラグメントおよび組成物によって治療されるべき炎症性疾患または状態には、アルツハイマー病、アジソン病、アテローム性脊椎炎、強直性脊椎炎、関節炎、変形性関節症(OA)、リウマチ性関節炎(RA)、乾癬性関節炎(PA)、強直性脊椎炎、喘息、動脈硬化症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、クローン病、大腸炎、皮膚炎、憩室炎、線維筋痛症、肝炎、過敏性腸症候群(IBS)、全身性紅班性狼瘡(SLE)、腎炎、パーキンソン病(PD)、血管炎、および潰瘍性大腸炎の1つまたは複数が含まれる。
いくつかの実施形態において、開示される抗体、フラグメントおよび組成物によって治療されるべき自己免疫疾患または状態は、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病(1型)、セリアック病、自己免疫性若年性特発性関節炎、糸球体腎炎、バセドウ病、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、自己免疫性心筋炎、多発性硬化症、天疱瘡/類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、リウマチ性関節炎、強皮症/全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、橋本病甲状腺炎、自己免疫性ぶどう膜炎、白斑、および多発血管炎性肉芽腫症(ウェゲナー病)の1つまたは複数を含む。
関節リウマチ(RA)は、主に関節を侵す長期的な自己免疫疾患である。一般的に、関節が熱を持ち、腫れ、痛みを伴う。痛みとこわばりは、しばしば安静にしていると悪化する。最も一般的には、手首と手に発症し、体の両側で同じ関節に発症するのが普通である。また、この病気は体の他の部位に影響を及ぼすこともある。関節リウマチの原因は明らかではないが、遺伝的要因と環境要因の組み合わせが関与していると考えられている。根本的なメカニズムは、体の免疫システムが関節を攻撃することと関わっている。その結果、炎症が起こり、関節包が厚くなる。治療の目標は、痛みを減らし、炎症を抑え、全身の機能を向上させることである。症状に役立つために、鎮痛剤、ステロイド、およびNSAIDが頻繁に使用される。ヒドロキシクロロキンやメトトレキサートなどの疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARDs)と呼ばれる薬剤群が、病気の進行を遅らせるために使用されることもある。
変形性関節症(OA)は、関節軟骨とその下にある骨が破壊されることで起こる関節疾患の一種である。最も一般的な症状は、関節の痛みとこわばりである。最初は運動後のみ症状が出るが、時間が経つと常に出るようになる。他の症状には、関節の腫れや可動域の減少、腰に影響を受けた場合には手足の脱力感またはしびれが含まれ得る。原因としては、過去の関節損傷、関節または四肢の異常な発達、および遺伝的要因などが挙げられる。太っている人、片足の長さが違う人、関節に高レベルの負担のかかる仕事をしている人などは、リスクが高くなる。変形性関節症は、関節にかかる機械的ストレスと低悪性度の炎症プロセスによって引き起こされると考えられている。治療には、運動、関節への負担を減らす努力、サポートグループ、および鎮痛剤が含まれる。
多発性硬化症(MS)は、脳および脊髄の神経細胞の絶縁被覆が損傷する脱髄疾患である。この損傷により、神経系の各部位の情報伝達能力が損なわれ、身体的、精神的、および時には精神的な問題など、様々な徴候および症状を引き起こす。具体的な症状としては、複視、片目の失明、筋力低下、感覚障害、または協調障害などがあり得る。原因は明らかではないが、免疫系による破壊またはミエリン産生細胞の障害が根本的なメカニズムとして考えられている。多発性硬化症の治療法は知られていない。治療では、発作後の機能を改善し、新たな発作を予防することを試みる。
喘息は、肺の気道に起こる一般的で長期にわたる炎症性疾患である。それは、様々な症状が繰り返し起こること、可逆的な気流閉塞、および気管支痙攣を特徴とする。症状としては、喘鳴、咳、胸の圧迫感、および息切れが挙げられる。喘息は、遺伝的要因と環境要因の組み合わせによって引き起こされると考えられている。環境要因には、大気汚染およびアレルゲンへの曝露が含まれる。喘息は、症状の頻度、1秒間の強制呼気量(FEV1)、およびピーク呼気流速によって分類される。また、アトピーと非アトピーに分類されることもあり、アトピーとは、1型過敏反応を起こしやすい体質を指す。喘息には治療法がない。アレルゲンおよび刺激物などの誘因を避け、吸入コルチコステロイドを使用することで、症状を予防することができる。喘息の症状がコントロールできない場合は、吸入コルチコステロイドに加えて長時間作用型β作動薬(LABA)または抗ロイコトリエン薬が使用されることがある。症状が急速に悪化した場合の治療は、通常、サルブタモールなどの吸入短時間作用型β2アゴニストと、経口投与の副腎皮質ステロイドを用いる。非常に重症の場合は、副腎皮質ステロイドの静脈内投与、硫酸マグネシウム、入院が必要になることもある。
慢性閉塞性肺疾患(COPD)とは、長期にわたる気流低下を特徴とする閉塞性肺疾患の一種である。COPDには、主に肺気腫と慢性気管支炎の2つの状態がある。肺気腫では、多くの気嚢の間の壁が損傷している。その結果、気嚢の形が崩れ、ぺらぺらになる。この損傷はまた、気嚢の壁を破壊し、多くの小さな気嚢の代わりに、より少ない、より大きな気嚢をもたらす可能性がある。こうなると、肺の中のガス交換の量が減少する。慢性気管支炎では、気道の内壁が常に刺激され、炎症を起こしているため、内壁が腫れ上がる。気道にたくさんの濃い粘液が形成され、呼吸がしにくくなる。COPDの治療法は知られてはいないが、症状は治療可能で、その進行を遅らせることができる。
投与
抗体、変異体の投与方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路を含むが、これらに限定されない。抗原結合ポリペプチドまたは組成物は、任意の便利な経路、例えば、注入またはボーラス注入によって、上皮または粘膜の内壁(例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など)を通る吸収によって投与されてもよく、他の生物学的活性剤と一緒に投与されてもよい。したがって、本開示の抗原結合ポリペプチドを含む医薬組成物は、経口、直腸、非経口、大そう内、膣内、腹腔内、局所(粉末、軟膏、ドロップもしくは経皮パッチによる)、鼻腔内、または頬側に、つまり口腔もしくは鼻腔スプレーとして投与され得る。
抗体、変異体の投与方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路を含むが、これらに限定されない。抗原結合ポリペプチドまたは組成物は、任意の便利な経路、例えば、注入またはボーラス注入によって、上皮または粘膜の内壁(例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など)を通る吸収によって投与されてもよく、他の生物学的活性剤と一緒に投与されてもよい。したがって、本開示の抗原結合ポリペプチドを含む医薬組成物は、経口、直腸、非経口、大そう内、膣内、腹腔内、局所(粉末、軟膏、ドロップもしくは経皮パッチによる)、鼻腔内、または頬側に、つまり口腔もしくは鼻腔スプレーとして投与され得る。
本明細書で使用される用語「非経口」は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸腔内、皮下および関節内への注射および注入を含む投与様式を指す。
投与は、全身的または局所的に行うことができる。さらに、脳室内および髄腔内注射を含む任意の適切な経路によって本開示の抗体を中枢神経系に導入することが望ましい場合がある;脳室内注射は、例えば、Ommayaリザーバーなどのリザーバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって促進される場合がある。肺投与もまた、例えば、吸入器またはネブライザーの使用、およびエアロゾル化剤による製剤化によって採用することができる。
本開示の抗体ポリペプチドまたは組成物を、治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合がある;これは、例えば、限定するものではないが、手術時の局所注入、局所塗布、例えば、手術後の創傷被覆材との併用、注射、カテーテルによるもの、座薬によるもの、またはインプラントによるものであり、前記インプラントは、唾液腺膜などの膜、または繊維を含む多孔性、非孔質、またはゼラチン質材料である。好ましくは、本開示の抗体を含むタンパク質を投与する場合、タンパク質が吸収されない材料を使用するよう注意しなければならない。
別の実施形態では、抗体または組成物は、小胞、特にリポソームで送達され得る(Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327参照;一般に同書を参照されたい)。
一般的な提案として、本開示の抗原結合ポリペプチドの患者へ与えられる投与量は、通常、患者の体重の0.1mg/kg~100mg/kg、患者の体重の0.1mg/kg~20mg/kg、または患者の体重の1mg/kg~10mg/kgである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫反応のために、他の種からの抗体よりもヒト体内での半減期が長い。したがって、ヒト抗体の投与量を少なくし、投与頻度を少なくすることがしばしば可能である。さらに、本開示の抗体の投与量および投与頻度は、例えば、脂質化などの修飾によって抗体の取り込みおよび組織浸透(例えば、脳への)を強化することによって低減され得る。
本開示の抗体、変異体、またはその誘導体の投与を含む感染性または悪性疾患、状態、または障害の治療方法は、ヒトに使用する前に、所望の治療または予防活性について、典型的にはin vitroで、次いで、許容できる動物モデルでin vivoで試験される。トランスジェニック動物を含む適切な動物モデルは、当業者にはよく知られている。例えば、本明細書に記載の抗原結合ポリペプチドの治療的有用性を示すためのin vitroアッセイには、細胞株または患者組織サンプルに対する抗原結合ポリペプチドの効果が含まれる。細胞株および/または組織サンプルに対する抗原結合ポリペプチドの効果は、本明細書の他の箇所に開示されるアッセイなど、当業者に既知の技術を利用して決定することができる。本開示に従って、特定の抗原結合ポリペプチドの投与が適応されるかどうかを決定するために使用できるin vitroアッセイには、患者の組織サンプルを培養して成長させ、化合物に曝露するかまたは他の方法で投与し、組織サンプルに対するかかる化合物の効果を観察する、in vitro細胞培養アッセイが含まれる。
様々な送達システムが知られており、本開示の抗体または本開示の抗体をコードするポリヌクレオチドを投与するために使用することができる。例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへのカプセル化、化合物を発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス(例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照されたい)、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築、等である。
診断方法
いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、診断および予後の目的のために使用することができる。いくつかの実施形態では、本抗体の抗体またはそのフラグメントがCXCR2に結合するための条件下でサンプルを該抗体またはそのフラグメントと接触させること、およびサンプルにおけるCXCR2の発現を示す結合を検出することを含む、サンプルにおけるCXCR2の発現を検出する方法が提供される。
いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、診断および予後の目的のために使用することができる。いくつかの実施形態では、本抗体の抗体またはそのフラグメントがCXCR2に結合するための条件下でサンプルを該抗体またはそのフラグメントと接触させること、およびサンプルにおけるCXCR2の発現を示す結合を検出することを含む、サンプルにおけるCXCR2の発現を検出する方法が提供される。
好適には細胞を含むサンプルは、がん患者または診断を希望する患者であり得る患者から採取され得る。細胞は、腫瘍組織または腫瘍ブロックの細胞、血液サンプル、尿サンプル、または患者からの任意のサンプルである。サンプルの任意の前処理により、サンプルは、抗体がサンプル中に潜在的に存在するCXCR2タンパク質と相互作用できる条件下で、本開示の抗体とインキュベートすることができる。ELISAなどの方法が、抗CXCR2抗体を利用して、サンプル中のCXCR2タンパク質の存在を検出するために使用され得る。
サンプル中のCXCR2タンパク質の存在(オプションとしてその量または濃度も)は、がんの診断に、患者が抗体を用いた治療に適していることの指標として、または患者ががん治療に反応した(または反応しなかった)ことの指標として使用することができる。予後判定法としては、がん治療開始時に1回、2回、またはそれ以上、特定の段階で検出を行って、治療の進行度を示すことができる。
組成物
本開示は、医薬組成物も提供する。そのような組成物は、有効量の抗体と、許容可能な担体とを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、第2の抗がん剤(例えば、免疫チェックポイント阻害剤)をさらに含む。
本開示は、医薬組成物も提供する。そのような組成物は、有効量の抗体と、許容可能な担体とを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、第2の抗がん剤(例えば、免疫チェックポイント阻害剤)をさらに含む。
具体的な実施形態において、用語「薬学的に許容される」とは、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されているか、または動物、より詳細にはヒトへの使用について米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。さらに、「薬学的に許容される担体」は、一般に、任意のタイプの非毒性の固体、半固体もしくは液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または製剤補助剤になる。
用語「担体」は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または溶媒を意味する。そのような医薬担体は、水および石油、動物、植物または合成起源のもの、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む油などの無菌液体であり得る。医薬組成物を静脈内投与する場合には、水が好ましい担体である。生理食塩水、ブドウ糖水溶液およびグリセロール水溶液も、特に注射液のための液体担体として利用することができる。好適な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、およびエタノールなどが挙げられる。本組成物は、所望により、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、または酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などのpH緩衝剤も含有することができる。ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤;アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤;エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤;および塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの浸透圧調整剤も想定される。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、カプセル剤、粉末、および徐放性製剤等の形態をとることができる。組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤および担体を用いて、坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含むことができる。適切な医薬担体の例は、E.W.Martin著Remington's Pharmaceutical Sciencesに記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれるものとする。このような組成物は、治療上有効な量の抗原結合ポリペプチド、好ましくは精製された形態のものを、患者への適切な投与のための形態を提供するように、適切な量の担体とともに含有することになる。製剤は、投与様式に適したものでなければならない。親製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または多回投与バイアルに封入することができる。
実施形態において、本組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として、通例の手順に従い製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液に溶解させた溶液である。必要な場合は、組成物は、可溶化剤および注射部位の痛みを緩和するためのリグノカインのような局所麻酔薬を含むこともできる。一般に、成分は別々に、または一緒に混合して、例えば乾燥凍結粉末または水を含まない濃縮物として、活性剤の量を示すアンプルまたは小袋などの密閉容器において、単位投与形態で供給される。組成物が点滴によって投与される場合、滅菌された医薬品グレードの水または生理食塩水を含む点滴ボトルを用いて分配され得る。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合することができるように、滅菌注射用水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
本開示の化合物は、中性または塩の形態で製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するアニオンで形成されるもの、ならびにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するカチオンで形成されるものが挙げられる。
実施例1: 実験の手順
細胞培養
HEK293F細胞(#R79007; Thermo Fisher Scientific)をFreeStyle 293 Expression Medium(#12338-026; Thermo Fisher Scientific)で培養した。U2OS細胞株(ATCC-HTB96; cell bank of Chinese Academy of Science、上海)を、10%(vol/vol)FBSを含むマッコイ5A培地(#16600-082, Gibco)で維持した。Tango(商標)CXCR2-bla U2OS細胞株(#K1807; Thermo Fisher Scientific)は、製造者の指示に従い、マッコイ5A培地を基にした増殖培地で維持した。CHO-K1細胞を、10%(v/v)FBSを含むF12K培地(#21127022; Thermo Fisher Scientific)で培養した。
細胞培養
HEK293F細胞(#R79007; Thermo Fisher Scientific)をFreeStyle 293 Expression Medium(#12338-026; Thermo Fisher Scientific)で培養した。U2OS細胞株(ATCC-HTB96; cell bank of Chinese Academy of Science、上海)を、10%(vol/vol)FBSを含むマッコイ5A培地(#16600-082, Gibco)で維持した。Tango(商標)CXCR2-bla U2OS細胞株(#K1807; Thermo Fisher Scientific)は、製造者の指示に従い、マッコイ5A培地を基にした増殖培地で維持した。CHO-K1細胞を、10%(v/v)FBSを含むF12K培地(#21127022; Thermo Fisher Scientific)で培養した。
コンビナトリアル抗体ライブラリパニング
N末端をビオチンで標識した、ヒトCXCR2のN末端細胞外ドメイン(MEDFNMESDSFEDFWKEDLSNYSSTLPPFLDAAPCEPESLEINK;SEQ ID NO:15)と同じ48アミノ酸のペプチド(pepN48)を、ファージパニング用の抗原として合成した(Chinese Peptide)。パニングの手順は、先に述べたように修正したプロトコルに従った。簡単に言うと、~1011という多様性を有するコンビナトリアルscFv抗体ライブラリを表示するファージ粒子を、抗原pepN48とインキュベートした。次に、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ(#21925; Pierce)を溶液に加えて、ファージ結合したビオチン化抗原をプルダウンした。結合したファージを、結合していないファージを洗い流した後、グリシン-HCl(pH2.0)で溶出し、XL-1 blue細胞(#200228; Agilent)の感染に使用した。感染した細胞は、ヘルパーファージVCSM13(#200251; Agilent)の助けを借りて、次のラウンドのパニングのためのファージ粒子を生成するために使用した。3回の濃縮の後、コロニーを摘出し、ファージELISAで検査し、その後、すべての陽性クローンの配列を決定した。これらのコロニーの配列のコンティグ解析には、国際的なImMunoGeneTics情報システム(IMGT)を使用した。9つの異なるscFv配列が高度に濃縮されていた。
N末端をビオチンで標識した、ヒトCXCR2のN末端細胞外ドメイン(MEDFNMESDSFEDFWKEDLSNYSSTLPPFLDAAPCEPESLEINK;SEQ ID NO:15)と同じ48アミノ酸のペプチド(pepN48)を、ファージパニング用の抗原として合成した(Chinese Peptide)。パニングの手順は、先に述べたように修正したプロトコルに従った。簡単に言うと、~1011という多様性を有するコンビナトリアルscFv抗体ライブラリを表示するファージ粒子を、抗原pepN48とインキュベートした。次に、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ(#21925; Pierce)を溶液に加えて、ファージ結合したビオチン化抗原をプルダウンした。結合したファージを、結合していないファージを洗い流した後、グリシン-HCl(pH2.0)で溶出し、XL-1 blue細胞(#200228; Agilent)の感染に使用した。感染した細胞は、ヘルパーファージVCSM13(#200251; Agilent)の助けを借りて、次のラウンドのパニングのためのファージ粒子を生成するために使用した。3回の濃縮の後、コロニーを摘出し、ファージELISAで検査し、その後、すべての陽性クローンの配列を決定した。これらのコロニーの配列のコンティグ解析には、国際的なImMunoGeneTics情報システム(IMGT)を使用した。9つの異なるscFv配列が高度に濃縮されていた。
ELISA
Avidin(#21121; Pierce)をCarbonate-Bicarbonate緩衝液(#C3041; Sigma)で最終濃度2ng/μlになるように希釈した。96ウェルELISAプレート(Corning Costar)を、アビジン溶液(25μl/ウェル)で4℃で一晩コーティングした。ウェルを150μl/ウェルのPBST緩衝液(PBS中0.05%TWEEN20)で1回洗浄した。PBSに溶解した50ngの抗原(2ng/μl)を各ウェルに添加し、室温で30分間インキュベートした。ウェルをPBSTで3回洗浄し、M-PBST(PBST中3%ミルク、150μl/ウェル)で37℃、5分間ブロックした。M-PBST緩衝液を除去した後、25μlの抗体溶液(適切な濃度でM-PBST緩衝液で希釈)を各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートし、その後、PBSTで5回洗浄を繰り返した。抗M13 HRPコンジュゲート二次抗体(1:3,000希釈;#27-9421-01、GE)または抗ヒトFc HRPコンジュゲート二次抗体(1:3,000希釈;#A0170、Sigma)をウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。その後、ウェルをPBSTで5回洗浄し、50μl/ウェルのABTS溶液(#11684302001; RoChe)と共に20分間室温でインキュベートした。各ウェルの吸光度をプレートリーダー(EnSpire;PerkinElmer)で405nmで測定した。
Avidin(#21121; Pierce)をCarbonate-Bicarbonate緩衝液(#C3041; Sigma)で最終濃度2ng/μlになるように希釈した。96ウェルELISAプレート(Corning Costar)を、アビジン溶液(25μl/ウェル)で4℃で一晩コーティングした。ウェルを150μl/ウェルのPBST緩衝液(PBS中0.05%TWEEN20)で1回洗浄した。PBSに溶解した50ngの抗原(2ng/μl)を各ウェルに添加し、室温で30分間インキュベートした。ウェルをPBSTで3回洗浄し、M-PBST(PBST中3%ミルク、150μl/ウェル)で37℃、5分間ブロックした。M-PBST緩衝液を除去した後、25μlの抗体溶液(適切な濃度でM-PBST緩衝液で希釈)を各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートし、その後、PBSTで5回洗浄を繰り返した。抗M13 HRPコンジュゲート二次抗体(1:3,000希釈;#27-9421-01、GE)または抗ヒトFc HRPコンジュゲート二次抗体(1:3,000希釈;#A0170、Sigma)をウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。その後、ウェルをPBSTで5回洗浄し、50μl/ウェルのABTS溶液(#11684302001; RoChe)と共に20分間室温でインキュベートした。各ウェルの吸光度をプレートリーダー(EnSpire;PerkinElmer)で405nmで測定した。
抗体の発現と精製
scFv抗体候補をコードするDNA配列をpFuse発現ベクター(#pfuse-hg1fc2; InvivoGen)にクローニングし、ヒトIgG1のFcドメイン全体を持つscFv-Fcタンパク質の発現に用いた。IgG1形態の全長を持つ抗体については、scFv配列から重鎖および軽鎖の可変領域(VH&VL)を、それぞれ重鎖および軽鎖の定常ドメイン全体(CH&CL)を持つプラスミドにクローニングした。このscFv-Fc発現プラスミドをHEK293F細胞にトランスフェクションし、または、全長抗体用に等モルの重鎖プラスミドと軽鎖プラスミドを共トランスフェクションし、その後5日間培養して抗体を発現させた。培地中の抗体をHiTrap Protein A HP column(#17-0403-03; GE Healthcare)を用いて、AKTAxpress purifier(GE Healthcare)で精製した。精製した抗体を濃縮し、PBS緩衝液(pH7.4)にて-80℃で保存した。
scFv抗体候補をコードするDNA配列をpFuse発現ベクター(#pfuse-hg1fc2; InvivoGen)にクローニングし、ヒトIgG1のFcドメイン全体を持つscFv-Fcタンパク質の発現に用いた。IgG1形態の全長を持つ抗体については、scFv配列から重鎖および軽鎖の可変領域(VH&VL)を、それぞれ重鎖および軽鎖の定常ドメイン全体(CH&CL)を持つプラスミドにクローニングした。このscFv-Fc発現プラスミドをHEK293F細胞にトランスフェクションし、または、全長抗体用に等モルの重鎖プラスミドと軽鎖プラスミドを共トランスフェクションし、その後5日間培養して抗体を発現させた。培地中の抗体をHiTrap Protein A HP column(#17-0403-03; GE Healthcare)を用いて、AKTAxpress purifier(GE Healthcare)で精製した。精製した抗体を濃縮し、PBS緩衝液(pH7.4)にて-80℃で保存した。
サイズ排除カラムHPLC(SEC-HPLC)
精製したリコンビナント抗体の熱安定性と均質性を調べるために、SEC-HPLC実験を行った。簡単に説明すると、まず抗体溶液を20mg/mLに濃縮し、42℃で5日間インキュベートした。得られた抗体溶液を、SECカラム(Nanofilm SEC-250)を用い、0.05%DDM/0.01%CHS in Tris(pH 8.1)のランニング緩衝液でHPLC分析した。凝集と分解について、タンパク質の均質性の結果で評価した。
精製したリコンビナント抗体の熱安定性と均質性を調べるために、SEC-HPLC実験を行った。簡単に説明すると、まず抗体溶液を20mg/mLに濃縮し、42℃で5日間インキュベートした。得られた抗体溶液を、SECカラム(Nanofilm SEC-250)を用い、0.05%DDM/0.01%CHS in Tris(pH 8.1)のランニング緩衝液でHPLC分析した。凝集と分解について、タンパク質の均質性の結果で評価した。
フローサイトメトリー
細胞を、標的膜タンパク質を含む発現プラスミドでトランスフェクトした。24時間後、細胞をディッシュから剥離し、FACS緩衝液(PBS中0.5%BSA、2mM EDTAを含む)に再懸濁した。チューブあたり500.000個の細胞を、2μg/mLの対応する抗体とともに、FACS緩衝液を用いて4℃で15分間インキュベートした。得られた細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、2μg/mLの二次抗体、Alexa FluorTM 488 goat anti-human IgG(H+L)(#A11013; Life Technologies)とともに4℃で15分間インキュベートした。FACS緩衝液で2回洗浄後、細胞をPBSに再懸濁し、CytoFLEX S(Beckman Coulter)で解析した。
細胞を、標的膜タンパク質を含む発現プラスミドでトランスフェクトした。24時間後、細胞をディッシュから剥離し、FACS緩衝液(PBS中0.5%BSA、2mM EDTAを含む)に再懸濁した。チューブあたり500.000個の細胞を、2μg/mLの対応する抗体とともに、FACS緩衝液を用いて4℃で15分間インキュベートした。得られた細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、2μg/mLの二次抗体、Alexa FluorTM 488 goat anti-human IgG(H+L)(#A11013; Life Technologies)とともに4℃で15分間インキュベートした。FACS緩衝液で2回洗浄後、細胞をPBSに再懸濁し、CytoFLEX S(Beckman Coulter)で解析した。
免疫蛍光測定法
ポリD-リジンでコーティングしたガラス底96ウェルマイクロタイタープレート(PerkinElmer)に細胞を蒔き、培養した。Lipofectamine 3000を用いて、標的の膜タンパク質を発現するプラスミドを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトから24時間後、細胞を4%パラホルムアルデヒドにより室温で20分間固定し、その後PBSで5分間ずつ3回洗浄した。その後、細胞を1%BSA(PBSに溶解)で37℃、30分間ブロックした。ブロック後、細胞を対応する抗体(1%BSA/PBSで希釈、2μg/ml)と共に4℃で一晩インキュベートした。2μg/mLの二次抗体、Alexa FluorTM 488 goat anti-human IgG(H+L)(#A11013; Life Technologies)を、次に1% BSA PBS緩衝液中で1時間、室温で細胞と混合させた。核染色用にDAPI(#10236276001; RoChe)を添加した。PBSで3回洗浄した後,染色した細胞をPBS中に保持し,共焦点顕微鏡(ZEISS LSM710)で免疫蛍光分析を行った。
ポリD-リジンでコーティングしたガラス底96ウェルマイクロタイタープレート(PerkinElmer)に細胞を蒔き、培養した。Lipofectamine 3000を用いて、標的の膜タンパク質を発現するプラスミドを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトから24時間後、細胞を4%パラホルムアルデヒドにより室温で20分間固定し、その後PBSで5分間ずつ3回洗浄した。その後、細胞を1%BSA(PBSに溶解)で37℃、30分間ブロックした。ブロック後、細胞を対応する抗体(1%BSA/PBSで希釈、2μg/ml)と共に4℃で一晩インキュベートした。2μg/mLの二次抗体、Alexa FluorTM 488 goat anti-human IgG(H+L)(#A11013; Life Technologies)を、次に1% BSA PBS緩衝液中で1時間、室温で細胞と混合させた。核染色用にDAPI(#10236276001; RoChe)を添加した。PBSで3回洗浄した後,染色した細胞をPBS中に保持し,共焦点顕微鏡(ZEISS LSM710)で免疫蛍光分析を行った。
表面プラズモン共鳴(SPR)
ビオチン化抗原(精製タンパク質またはペプチド)をSAバイオセンサーチップ(GE healthcare)のストレプトアビジンコート表面に置き、単一分子層を形成させた。抗体と抗原の相互作用は、T200 システム(GE healthcare)で実施した。簡単に述べると、試験用抗体を、ランニングバッファーのHBS-EP+緩衝液(GE healthcare)で0.5、1、2、5、10nMの異なる濃度に連続希釈し、チップ表面に流して抗原と抗体の間の分子間相互作用を検出した。結合/解離のキネティクスを測定し、適切なタンパク質-タンパク質相互作用モデルに当てはめて、対応する結合定数(KD)を算出した。
ビオチン化抗原(精製タンパク質またはペプチド)をSAバイオセンサーチップ(GE healthcare)のストレプトアビジンコート表面に置き、単一分子層を形成させた。抗体と抗原の相互作用は、T200 システム(GE healthcare)で実施した。簡単に述べると、試験用抗体を、ランニングバッファーのHBS-EP+緩衝液(GE healthcare)で0.5、1、2、5、10nMの異なる濃度に連続希釈し、チップ表面に流して抗原と抗体の間の分子間相互作用を検出した。結合/解離のキネティクスを測定し、適切なタンパク質-タンパク質相互作用モデルに当てはめて、対応する結合定数(KD)を算出した。
酵母ディスプレイを用いた親和性成熟
選択した抗体(abN48-IgG1)の重鎖と軽鎖のDNA配列を酵母表面ディスプレイベクターpYD-HAにクローニングした。ランダムに変異させたH-CDR3領域を含むプライマーを用いて、オーバーラップPCRによりCDR3多様化重鎖を作製した。CDR3多様化重鎖フラグメントと直鎖化バックボーンプラスミドをEBY100酵母細胞にエレクトロポレーションでトランスフェクトし、酵母細胞の内在性相同組換え戦略を用いて酵母ベースのFab変異原ライブラリの構築を完了させた。
選択した抗体(abN48-IgG1)の重鎖と軽鎖のDNA配列を酵母表面ディスプレイベクターpYD-HAにクローニングした。ランダムに変異させたH-CDR3領域を含むプライマーを用いて、オーバーラップPCRによりCDR3多様化重鎖を作製した。CDR3多様化重鎖フラグメントと直鎖化バックボーンプラスミドをEBY100酵母細胞にエレクトロポレーションでトランスフェクトし、酵母細胞の内在性相同組換え戦略を用いて酵母ベースのFab変異原ライブラリの構築を完了させた。
変異原ライブラリで形質転換したEBY100酵母細胞をSD/Trp-培地(#630308; Clontech)でOD600 = 1まで増殖させ、20℃で18-24時間SG/R-CAA培地で振盪しながら誘導した。FACS緩衝液(0.5% BSA in PBS、2mM EDTAを含む)で細胞を洗浄した後、pepN48と抗c-mycニワトリIgY部分(#A21281; Life Technologies)を細胞懸濁液に加え(1:500希釈)、室温で30分間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液で3回洗浄した後、R-フィコエリスリンコンジュゲートストレプトアビジン(#21627, Thermo Fisher Scientific)とFITCコンジュゲートヤギ抗ニワトリ二次抗体(#PA1-28794; Invitrogen)を細胞浮遊液に加え(1:500希釈)、4℃で30分間インキュベートした。最後にFACS緩衝液で3回洗浄後、フローサイトメーター(CytoFLEX S; Beckman Coulter)で解析した。ライブラリスクリーニングのため、各ラウンドの蛍光標識酵母細胞をBD FACSAria IIIフローサイトメーター(FACSAria III; BD)でソートした。pepN48の濃度は、各選択ラウンドで1nMから0.25nMまで徐々に減少させた。
Tangoアッセイ
Tangoアッセイでは、hCXCR2を外来転写因子と融合させ、その間にβ-アレスチンと融合した非天然プロテアーゼの特異的な切断配列を連結させた。リガンドがhCXCR2に結合して膜の脱感作を引き起こすと、細胞内のアレスチン-プロテアーゼ融合タンパク質が活性化した受容体に動員され、融合した転写因子がプロテアーゼによって切断されて核内に入り、波長520nmの蛍光を発するレポーター遺伝子が活性化された。Tangoアッセイは、LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit(#K1030; Invitrogen)の製造元の指示にしたがって実施した。簡単に説明すると、TangoCXCR2-bla U2OS細胞をCellCarrier-96(PerkinElmer)プレート上に20,000個/ウェルで蒔き、37℃/5% CO2の培地で一晩培養を行った。得られた細胞をキット付属のアッセイ用培地に再接種し、37℃/5% CO2で48時間培養した。IL8、Groα(CXCL1)、および抗体リガンドなどの異なる濃度のリガンドを上記細胞に混合し、37℃/5% CO2で一晩培養して、そのアゴニスト効果を測定した。
Tangoアッセイでは、hCXCR2を外来転写因子と融合させ、その間にβ-アレスチンと融合した非天然プロテアーゼの特異的な切断配列を連結させた。リガンドがhCXCR2に結合して膜の脱感作を引き起こすと、細胞内のアレスチン-プロテアーゼ融合タンパク質が活性化した受容体に動員され、融合した転写因子がプロテアーゼによって切断されて核内に入り、波長520nmの蛍光を発するレポーター遺伝子が活性化された。Tangoアッセイは、LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit(#K1030; Invitrogen)の製造元の指示にしたがって実施した。簡単に説明すると、TangoCXCR2-bla U2OS細胞をCellCarrier-96(PerkinElmer)プレート上に20,000個/ウェルで蒔き、37℃/5% CO2の培地で一晩培養を行った。得られた細胞をキット付属のアッセイ用培地に再接種し、37℃/5% CO2で48時間培養した。IL8、Groα(CXCL1)、および抗体リガンドなどの異なる濃度のリガンドを上記細胞に混合し、37℃/5% CO2で一晩培養して、そのアゴニスト効果を測定した。
abN48-IgG1およびabN48-2-IgG1の阻害研究では、まず細胞を異なる濃度の抗体で37℃/5% CO2で30分間処理した後、20nMのIL8またはGroα(CXCL1)(EC80)を加え、37℃/5% CO2で一晩インキュベートした。細胞を溶解する前に、検出基質混合物を添加し、室温で2時間インキュベートした。波長460nmで励起し、波長520nmで発光する蛍光を蛍光プレートリーダー(EnVision, PerkinElmer)で記録し、定量した。
カルシウムの流入
カルシウムイオン流入アッセイは、hCXCR2およびGα16タンパク質の両方を安定的に発現させた自社製CHO細胞で行った。384ウェルプレートに20,000個/ウェルで蒔き、1% FBSを添加した増殖培地で4-6時間培養した。培地を除去し、得られた細胞をHBSS緩衝液で2回洗浄した。新しく調製したカルシウム色素 Fluo-4 Direct(商標)(#F10471; Invitrogen)を含む添加液25μLを各ウェルに加え、37℃で30分間インキュベートした。アッセイプレートは、FLIPR検出を行う前に室温に平衡化させた。アゴニスト効果の測定には、IL8、Groα(CXCL1)、およびコンビナトリアル抗体について濃度の異なる5μLのリガンドストック(HBSS緩衝液中)を、色素負荷細胞を含む各ウェルに素早く混合し、直ちにFLIPRリーダー(Tetra Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Devices)において、波長494nm(励起)および516nm(発光)で記録した。最終アッセイ濃度は、IL8とGroα(CXCL1)が100、25、6.2、1.6、0.39、0.098、0.024、0.0061 nM、abN48-IgG1とabN48-2-IgGが3600、900、225、56、14、3.5、0.88、0.22nMであった。
カルシウムイオン流入アッセイは、hCXCR2およびGα16タンパク質の両方を安定的に発現させた自社製CHO細胞で行った。384ウェルプレートに20,000個/ウェルで蒔き、1% FBSを添加した増殖培地で4-6時間培養した。培地を除去し、得られた細胞をHBSS緩衝液で2回洗浄した。新しく調製したカルシウム色素 Fluo-4 Direct(商標)(#F10471; Invitrogen)を含む添加液25μLを各ウェルに加え、37℃で30分間インキュベートした。アッセイプレートは、FLIPR検出を行う前に室温に平衡化させた。アゴニスト効果の測定には、IL8、Groα(CXCL1)、およびコンビナトリアル抗体について濃度の異なる5μLのリガンドストック(HBSS緩衝液中)を、色素負荷細胞を含む各ウェルに素早く混合し、直ちにFLIPRリーダー(Tetra Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Devices)において、波長494nm(励起)および516nm(発光)で記録した。最終アッセイ濃度は、IL8とGroα(CXCL1)が100、25、6.2、1.6、0.39、0.098、0.024、0.0061 nM、abN48-IgG1とabN48-2-IgGが3600、900、225、56、14、3.5、0.88、0.22nMであった。
abN48-IgG1およびabN48-2-IgG1の阻害研究のために、異なる濃度のabN48-IgG1および abN48-2-IgG1を含む5μLのHBSSストックを、25μLの染料負荷CHO細胞を含む対応する各ウェルにまず混合し、その後室温で30分間平衡させた。Ca2+流入シグナルは、IL-8(アッセイにおける最終濃度2.5nM)またはGroα(CXCL1)(アッセイにおける最終濃度7nM)の5μL HBSSストックをFLIPR上の各ウェルに素早く混合することによって開始された。abN48-IgG1およびabN48-2-IgG1のアッセイにおける最終濃度はそれぞれ、IL8阻害では、3600nM、1200、400、130、44、15、4.9、1.6nM、Groα(CXCL1)阻害では、3600、900、225、56、14、3.5、0.88、0.22nMであった。Ca2+の流入の蛍光シグナルは、上記のようにリアルタイムで記録した。
hCXCR2の内部移行
IgGに特異的に結合し、免疫毒素複合体を形成するアダプター-毒素融合タンパク質AL2-PE38KDELを利用した改良法を用いて、抗体刺激CXCR2エンドサイトーシスを測定した(Hou, S.-C. et al,(2016).Scientific reports 6, 31878)。得られた免疫毒素複合体は、細胞内に侵入すると細胞死を誘発する。簡単に説明すると、AL2-PE38KDELを1:1のモル比で抗体溶液に添加し、室温で1時間インキュベートして免疫毒素複合体を生成した。この免疫毒素を、異なる最終濃度でhCXCR2を過剰発現させた細胞と混合し、室温で4時間インキュベートした。得られた細胞を新しい培地に再播種し、37℃/5% CO2で3日間培養した。WST-1(#W201-12; Dojindo)を用いて、製造元のプロトコルに従って450nmの吸光度を測定することにより、細胞の生存率を求めた。
IgGに特異的に結合し、免疫毒素複合体を形成するアダプター-毒素融合タンパク質AL2-PE38KDELを利用した改良法を用いて、抗体刺激CXCR2エンドサイトーシスを測定した(Hou, S.-C. et al,(2016).Scientific reports 6, 31878)。得られた免疫毒素複合体は、細胞内に侵入すると細胞死を誘発する。簡単に説明すると、AL2-PE38KDELを1:1のモル比で抗体溶液に添加し、室温で1時間インキュベートして免疫毒素複合体を生成した。この免疫毒素を、異なる最終濃度でhCXCR2を過剰発現させた細胞と混合し、室温で4時間インキュベートした。得られた細胞を新しい培地に再播種し、37℃/5% CO2で3日間培養した。WST-1(#W201-12; Dojindo)を用いて、製造元のプロトコルに従って450nmの吸光度を測定することにより、細胞の生存率を求めた。
好中球の走化性
好中球の移動は、孔径8μmの膜を備えた24ウェルのトランスウェルチャンバー(#3422、Corning Costar)を用いて検出した。初代ヒト好中球(#PBN-1F、MT-BIO)を走化性培地(0.5% BSA入りRPMI1640培地)に5×105細胞/mlになるように懸濁した。これらの好中球サンプルを、走化性培地中で、abN48-IgG1、abN48-2-IgG1、アイソタイプ抗体、CXCR1/2阻害剤ナバリキシン(MK7123, #HY-10198, MedChemExpress)と異なる濃度で37℃で30分間インキュベートした。化学誘引物質であるリコンビナントヒトIL8(#Z03262-25、GenScript)は、10nMの濃度で各下部チャンバー内の600μl走化性培地に含ませた。250μlの好中球懸濁液を各上部チャンバーに乗せ、37℃で60分間インキュベートした。インキュベート後、下部チャンバーの走化性培地中の細胞を血球計数器(#717810, BRAND)で計数した。
好中球の移動は、孔径8μmの膜を備えた24ウェルのトランスウェルチャンバー(#3422、Corning Costar)を用いて検出した。初代ヒト好中球(#PBN-1F、MT-BIO)を走化性培地(0.5% BSA入りRPMI1640培地)に5×105細胞/mlになるように懸濁した。これらの好中球サンプルを、走化性培地中で、abN48-IgG1、abN48-2-IgG1、アイソタイプ抗体、CXCR1/2阻害剤ナバリキシン(MK7123, #HY-10198, MedChemExpress)と異なる濃度で37℃で30分間インキュベートした。化学誘引物質であるリコンビナントヒトIL8(#Z03262-25、GenScript)は、10nMの濃度で各下部チャンバー内の600μl走化性培地に含ませた。250μlの好中球懸濁液を各上部チャンバーに乗せ、37℃で60分間インキュベートした。インキュベート後、下部チャンバーの走化性培地中の細胞を血球計数器(#717810, BRAND)で計数した。
結晶化、X線データ収集および構造決定
CXCR2の1-48残基と9-19残基にそれぞれ対応する2種類のペプチド、pepN48とpepN9-19はSangon Biotechで合成されたものである。ペプチドの純度および同一性はHPLCおよび質量分析によってテストした。abN48 Fabは、abN48-IgG1(ラムダ型)のパパイン(Sigma-Aldrich、1:50 w/w比)切断により、PBS緩衝液pH7.4において、4℃一晩で生成さし。切断後、abN48 FabをHiTrap lambda HP カラム(GE Healthcare)に乗せ、pH3.0の0.1M 酢酸ナトリウムで溶出させた。溶出画分をプールし、直ちに20mM Tris pH 7.5および50mM NaClを含む緩衝液で平衡化したSuperdex200 increase 10/300GL gel filtration column(GE Healthcare)に適用した。次に、ゲル濾過カラムから精製したabN48 Fabを含む画分をプールし、pepN9-19(Sangon Biotech)とモル比1:3で混合した。この混合物を4℃で一晩インキュベートした後、さらに濃縮した。abN48-2 FabとpepN9-19の複合体は、同様のプロトコルに従って組み立てた。
CXCR2の1-48残基と9-19残基にそれぞれ対応する2種類のペプチド、pepN48とpepN9-19はSangon Biotechで合成されたものである。ペプチドの純度および同一性はHPLCおよび質量分析によってテストした。abN48 Fabは、abN48-IgG1(ラムダ型)のパパイン(Sigma-Aldrich、1:50 w/w比)切断により、PBS緩衝液pH7.4において、4℃一晩で生成さし。切断後、abN48 FabをHiTrap lambda HP カラム(GE Healthcare)に乗せ、pH3.0の0.1M 酢酸ナトリウムで溶出させた。溶出画分をプールし、直ちに20mM Tris pH 7.5および50mM NaClを含む緩衝液で平衡化したSuperdex200 increase 10/300GL gel filtration column(GE Healthcare)に適用した。次に、ゲル濾過カラムから精製したabN48 Fabを含む画分をプールし、pepN9-19(Sangon Biotech)とモル比1:3で混合した。この混合物を4℃で一晩インキュベートした後、さらに濃縮した。abN48-2 FabとpepN9-19の複合体は、同様のプロトコルに従って組み立てた。
Fab抗体-ペプチド複合体の結晶は、ハンギングドロップ(hanging drop)、蒸気拡散法を用いて18℃で得た。pepN9-19と複合体化したabN48 Fabの回折品質の結晶は、1μLのタンパク質溶液(15mg/mL)と1μLのリザーバー溶液(0.1 M HEPES sodium pH 7.5; 2% v/v ポリエチレングリコール400; 2.0M 硫酸アンモニウム)を混ぜることにより、シリコン化カバークリップ上で成長させた。pepN9-19と複合体化したabN48-2 Fabの結晶を0.1 M HEPES pH7.5; 25% w/v ポリエチレングリコール3, 350中で得た。
結晶は、低温保護剤として20%のグリセロールを加えた後、液体窒素中でフラッシュ冷却してデータ収集に用いた。回折データは上海Synchrotron Radiation Facility(SSRF)のビームラインBL19U1にて波長0.9789Åで収集し、HKL3000プログラムで処理した。abN48 FabとpepN9-19の複合体の構造は、PHENIXのPhaserプログラムを用いて分子置換により解いた。探索モデルは、SWISS-MODELで構築したVHドメインと4E10 Fab構造(PDBID: 4XCN, L鎖)のVLドメインを組み合わせて生成されたものである。abN48-2とpepN9-19の複合体構造も同様に、abN48-pepN9-19複合体構造を分子置換検索モデルとして用いて解いた。この初期モデルは、ccp4iのCOOTとRefmac5を用いた手動での構築と精密化のサイクルによってさらに改良された。最終的なモデルの品質はMolProbityで解析された。データ収集と精密化の統計の概要は表S2に示す。図はPyMol(The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.1 Schrodinger, LLC)を用いて作成した。静電計算はPDB2PQRで行った。
水素-重水素交換質量分析法(HDX-MS)
pepN48単独のアミド水素交換は、50μMの1μL pepN48を、19μL D2O緩衝液(25mM Tris, pD 8.0, 150mM NaCl, 1mM TCEP)に10℃で希釈することにより開始した。異なる時点(0s、10s、30s、60s、120s)で、冷やしたクエンチ緩衝液(400mM KH2PO4/K2PO4, pH2.2, 50mM TCEP)を加えて標識反応を停止させ、直ちに液体窒素で凍結させた。abN48存在下での pepN48のHDX-MS では、まず50μMの1μL pepN48を67μM の1μL abN48と混合した。次に、この混合物を、18μL D2O緩衝液を加えることによって、0秒、10秒、30秒、60秒、または120秒間標識してから、急冷して瞬間凍結させた。すべての凍結サンプルは、分析まで-80℃で保存した。
pepN48単独のアミド水素交換は、50μMの1μL pepN48を、19μL D2O緩衝液(25mM Tris, pD 8.0, 150mM NaCl, 1mM TCEP)に10℃で希釈することにより開始した。異なる時点(0s、10s、30s、60s、120s)で、冷やしたクエンチ緩衝液(400mM KH2PO4/K2PO4, pH2.2, 50mM TCEP)を加えて標識反応を停止させ、直ちに液体窒素で凍結させた。abN48存在下での pepN48のHDX-MS では、まず50μMの1μL pepN48を67μM の1μL abN48と混合した。次に、この混合物を、18μL D2O緩衝液を加えることによって、0秒、10秒、30秒、60秒、または120秒間標識してから、急冷して瞬間凍結させた。すべての凍結サンプルは、分析まで-80℃で保存した。
解凍したサンプルは、直ちにインラインでペプチド分解と脱塩を行うHPLC-MS(Agilent 1100)システムに注入した。脱塩された消化物は、Hypersil Gold(商標)分析用 カラム(Thermo)で18分間のグラジエントで分離し、Orbitrap Fusion質量分析計(Thermo)で直接分析した。HPLCシステムは、キャリーオーバーを最小限に抑えるため、サンプル間にブランク注入を行い、広範囲に洗浄した。ペプチドの同定は、orbi/orbiモードのタンデムMS/MSによって行った。すべてのMS/MSスペクトルは、MASCOTプログラムを使用して解析され、最終的なPSMは、1%のFDRで濾過した。ペプチドセントロイドの初期分析は、HD-Examiner v1.3(Sierra Analytics)で行い、その後、保持時間、電荷状態、m/z範囲、重複ペプチドの存在を確認するために、すべてのペプチドを手動で検証した。pepN48のペプチドカバレッジは100%であることが分かり、各ペプチドの相対重水素化レベル(%D)は、現在のLC設定において完全重水素化サンプルが90%Dを保持すると仮定してHD-Examinerで自動的に計算した。
統計解析
統計学的検定はすべてGraphpad Prism 7ソフトウェアで行った。測定値は、特に断りのない限り、平均値または平均値±標準偏差で表した。P値<0.05は有意とみなした。
統計学的検定はすべてGraphpad Prism 7ソフトウェアで行った。測定値は、特に断りのない限り、平均値または平均値±標準偏差で表した。P値<0.05は有意とみなした。
実施例2.ヒトCXCR2に結合するコンビナトリアル抗体の選択
ヒトのCXCR2タンパク質は、N末端と細胞の外側に3つの細胞外ループを持つ膜貫通型タンパク質である。N末端と3つのループのそれぞれは、CXCR2のIL8への結合に関与している(Ahuja, S.K. et al., (1996) The Journal of biological chemistry 271, 225-232; Katancik, J.A., et al., (1997) Biochemical and Biophysical Research Communications 232, 663-668; Luo, Z.W., et al., (1997) Protein Engineering 10, 1039-1045; Berkamp, S., et al., (2017) Journal of Biomolecular Nmr 69, 111-121; Park, S.H. et al., (2017) Biophysical Journal 113, 2695-2705; Park, S.H. et al., (2011) J Mol Biol 414, 194-203; and Park, S.H. et al., (2012) Nature 491, 779-783)。
ヒトのCXCR2タンパク質は、N末端と細胞の外側に3つの細胞外ループを持つ膜貫通型タンパク質である。N末端と3つのループのそれぞれは、CXCR2のIL8への結合に関与している(Ahuja, S.K. et al., (1996) The Journal of biological chemistry 271, 225-232; Katancik, J.A., et al., (1997) Biochemical and Biophysical Research Communications 232, 663-668; Luo, Z.W., et al., (1997) Protein Engineering 10, 1039-1045; Berkamp, S., et al., (2017) Journal of Biomolecular Nmr 69, 111-121; Park, S.H. et al., (2017) Biophysical Journal 113, 2695-2705; Park, S.H. et al., (2011) J Mol Biol 414, 194-203; and Park, S.H. et al., (2012) Nature 491, 779-783)。
配列解析を通じて、本発明者は、CXCR2を介したIL8シグナル伝達を標的とする高選択的で強力なコンビナトリアル抗体のパニングと最適化において、細胞外N末端48アミノ酸をエピトープとして標的とすることに決めた。ヒトCXCR2の柔軟なN末端の最初の48アミノ酸に対応するペプチド(pepN48、図1A)を合成した(Chinese Peptide、Hangzhou)。1011のコンビナトリアルライブラリとpepN48を用いたファージパニングを3回実施した。パニングで高い濃縮度を示した9つのscFv配列をpFuse発現ベクターにサブクローニングした。各scFvコンビナトリアル抗体の発現と親和性結合が、pepN48ペプチド存在下での細胞上清のELISAスクリーニングによって確認された(図5A)。FACSを用いた上清のさらなる分析により、1つのクローンH8(abN48)だけが、U2OS細胞上の膜ヒトCXCR2-mCherryを認識することが示された(図5B)。次に、H8(abN48)scFvコンビナトリアル抗体を過剰発現させ、精製して均質にし、BiacoreでSPR分析を行った。pepN48ありのH8(abN48)のKD値は、2.6 × 10-9 Mと決定された(図5C)。
実施例3.完全長IgG1コンビナトリアル抗体の作製と親和性成熟
H8(abN48)の結合親和性を最適化するために、まずscFv抗体をIgG1形式の完全長コンビナトリアル抗体に変換し(図6A)、abN48-IgG1と名付けた。pepN48を有するabN48-IgG1のKD値は7.8 × 10-10 M と決定された(図1B)。scFv型と比較してabN48-IgG1の親和性が向上していることから、酵母ディスプレイによる親和性成熟を利用してFab構成をさらに最適化し得ることが示唆された。標的エピトープ配列に対する最適なバインダーを発見する可能性を最大化するため、abN48-IgG1のVH上の11個のCDR3残基GYCSSTSCYDYをランダムに変異させ、得られたFab配列を、重鎖および軽鎖を発現するGAL1-10双方向プロモータを含むpESCベクターを用いて酵母表面上に表示させた。これにより、>107の多様性のあるコンビナトリアル抗体ライブラリが生成された。pepN48に対して4回のパニングを行った後、100個の陽性クローンからabN48-1~abN48-8の8個の高濃度配列を選択し、配列決定解析により確認した。Weblogo解析の結果、濃縮配列の中で最も頻度の高い変異はS5RとS7Rであり、これが新しいコンビナトリアル抗体であるabN48-2の配列を構成していることがわかった(図5B)。この8配列をpFuseベクターにサブクローニングし、HEK293T細胞で発現させた。精製した8つの抗体の結合親和性と均一性は、それぞれSPRとSEC-HPLCによって決定した(表1および図7)。
H8(abN48)の結合親和性を最適化するために、まずscFv抗体をIgG1形式の完全長コンビナトリアル抗体に変換し(図6A)、abN48-IgG1と名付けた。pepN48を有するabN48-IgG1のKD値は7.8 × 10-10 M と決定された(図1B)。scFv型と比較してabN48-IgG1の親和性が向上していることから、酵母ディスプレイによる親和性成熟を利用してFab構成をさらに最適化し得ることが示唆された。標的エピトープ配列に対する最適なバインダーを発見する可能性を最大化するため、abN48-IgG1のVH上の11個のCDR3残基GYCSSTSCYDYをランダムに変異させ、得られたFab配列を、重鎖および軽鎖を発現するGAL1-10双方向プロモータを含むpESCベクターを用いて酵母表面上に表示させた。これにより、>107の多様性のあるコンビナトリアル抗体ライブラリが生成された。pepN48に対して4回のパニングを行った後、100個の陽性クローンからabN48-1~abN48-8の8個の高濃度配列を選択し、配列決定解析により確認した。Weblogo解析の結果、濃縮配列の中で最も頻度の高い変異はS5RとS7Rであり、これが新しいコンビナトリアル抗体であるabN48-2の配列を構成していることがわかった(図5B)。この8配列をpFuseベクターにサブクローニングし、HEK293T細胞で発現させた。精製した8つの抗体の結合親和性と均一性は、それぞれSPRとSEC-HPLCによって決定した(表1および図7)。
すべての新しいコンストラクトがpepN48とサブナノモルからピコモルの結合親和性を示し、CXCR2のN末端に共通のエピトープ配列があることが示唆された。図1Bに示すように、コンビナトリアル抗体abN48-2-IgG1はピコモルの結合親和性を示し、KD値は7.2 × 10-12 Mと、abN48-IgG1と比較して100倍も向上していた。さらに、42℃で5日間インキュベートした後、abN48-2-IgG1は検出可能な凝集や分解を示さなかった(図7、上段右)。
abN48-IgG1またはab48-2-IgG1とpepN48の相互作用はさらに検証され、HDX-MS法を用いてそれぞれ12-19および13-21の残基にマッピングされた(図1C)。
実施例4.hCXCR2に特異的に結合するコンビナトリアル抗体の種およびサブタイプ
abN48-IgG1およびabN48-2-IgG1の種およびサブタイプ特異性を決定するために、hCXCR1-mCherry、hCXCR2-mCherry、mCXCR2-mCherry、rCXCR2-mCherry、rbCXCR2-mCherry およびmcCXCR2-mCherryを含む遺伝子構築物をU2OS細胞に過剰発現させた。hCXCR1-mCherry、hCXCR2-mCherry、mCXCR2-mCherryを過剰発現させたU2OSをabN48-IgG1およびabN48-2-IgG1で免疫蛍光共焦点化すると、両抗体は表面のhCXCR2を特異的に認識した(図2A)。この高い特異性はFACS分析によってさらに確認され、abN48-IgG1とabN48-2-IgG1はともにヒト(hCXCR2)と近縁種のマカクザル(mcCXCR2)のCXCR2のみに結合し、マウス、ラット、およびウサギのCXCR1およびCXCR2には結合しなかった(図2B)。
abN48-IgG1およびabN48-2-IgG1の種およびサブタイプ特異性を決定するために、hCXCR1-mCherry、hCXCR2-mCherry、mCXCR2-mCherry、rCXCR2-mCherry、rbCXCR2-mCherry およびmcCXCR2-mCherryを含む遺伝子構築物をU2OS細胞に過剰発現させた。hCXCR1-mCherry、hCXCR2-mCherry、mCXCR2-mCherryを過剰発現させたU2OSをabN48-IgG1およびabN48-2-IgG1で免疫蛍光共焦点化すると、両抗体は表面のhCXCR2を特異的に認識した(図2A)。この高い特異性はFACS分析によってさらに確認され、abN48-IgG1とabN48-2-IgG1はともにヒト(hCXCR2)と近縁種のマカクザル(mcCXCR2)のCXCR2のみに結合し、マウス、ラット、およびウサギのCXCR1およびCXCR2には結合しなかった(図2B)。
実施例5.コンビナトリアル抗体は、hCXCR2が媒介するβ-アレスチンシグナル伝達およびカルシウム流入を強力に阻害した
hCXCR2特異的抗体バインダーの細胞機能を理解するために、CXCR2を介した2つの独立したシグナル伝達経路、β-アレスチン動員と細胞質Ca2+の流入をそれぞれTangoとFLIPR法を用いて評価した。β-アレスチン動員はGタンパク質に依存しない細胞内事象である一方、Ca2+の流入は、Gαタンパク質の活性化によって生成されたIP3に反応してCa2+が小胞体(ER)から細胞質へ放出される結果であり、どちらもCXCR2活性化と直接関連することが知られている。
hCXCR2特異的抗体バインダーの細胞機能を理解するために、CXCR2を介した2つの独立したシグナル伝達経路、β-アレスチン動員と細胞質Ca2+の流入をそれぞれTangoとFLIPR法を用いて評価した。β-アレスチン動員はGタンパク質に依存しない細胞内事象である一方、Ca2+の流入は、Gαタンパク質の活性化によって生成されたIP3に反応してCa2+が小胞体(ER)から細胞質へ放出される結果であり、どちらもCXCR2活性化と直接関連することが知られている。
まず、天然リガンドと2つの選択したコンビナトリアル抗体のβ-アレスチン動員におけるアゴニスト効果をTangoアッセイを用いてテストした。2つの天然リガンド、IL8とGROαだけがβ-アレスチンの動員を誘発し、見かけのEC50の値はそれぞれ4.5nMと5.3nMだった(図3A)。一方、abN48-IgG1およびabN48-2-IgG1の2つの抗体は、100nMまでは動員の活性化を示さなかったが、IL8についてはそれぞれ2.8nMおよび0.90nM、GROαについてはそれぞれ4.7nMおよび0.37nMと、天然リガンドによる動員を完全に阻害した(EC80レベル)(図3B)。また、abN48-IgG1およびabN48-2-IgG1がともに逆アゴニスト効果を示し、そのうち20nMの両抗体がCXCR2発現による内在性β-アレスチン動員を顕著に抑制することが注目される(図8)。
次に、IL8、GROα、およびコンビナトリアル抗体について、Ca2+流入の刺激を検討した。天然リガンドであるIL8とGROαは、用量依存的にCa2+の流入を活性化し、EC50値はそれぞれ0.42nMと1.7nMであった(図3C)。興味深いことに、強結合抗体であるabN48-2-IgG1は、10-1000nMの高濃度領域で部分的なアゴニスト効果を示し、見かけのEC50値は310nMであった(図3C)。一方、abN48-IgG1およびabN48-2-IgG1はともに、天然リガンドによる(EC90レベルでの)Ca2+流入を用量依存的に阻害し、IC50値はIL8でそれぞれ 190nMおよび44nM、GROαでそれぞれ1000nMおよび110nMとなった(図3D)。
abN48-IgG1と比較し、abN48-2-IgG1でCXCR2を介したシグナル伝達に対する拮抗作用の向上が見られることは、CXCR2のN末端エピトープ配列との結合親和性が向上していることと一致する。
実施例6.コンビナトリアル抗体は、hCXCR2の内在化を強力に誘発した
また、IL8は5-10nMでCXCR2のエンドサイトーシスシグナル伝達を誘発することが示されている。CXCR2のエンドサイトーシスに対するコンビナトリアル抗体リガンドの効果を検証するために、FcR受容体ではなく膜hCXCR2を過剰発現させたU2OS細胞を用いて、CXCR2の内部移行を検討した。分子プローブとしてabN48-IgG1またはabN48-2-IgG1のイミュノトキシン複合体を使用した。図3Eに示すように、hCXCR2を過剰発現しているU2OSに対しては、abN48-IgG1とabN48-2-IgG1の免疫毒素複合体のみが用量依存的な細胞毒性を示した。hCXCR2を発現していないU2OS細胞、および無関係のコンビナトリアル抗体の免疫毒素複合体は、実験条件下で検出可能な細胞毒性を示さなかった。abN48-IgG1またはabN48-2-IgG1の活性化作用は、見かけのEC50値が0.1nM未満と高感度であった。
また、IL8は5-10nMでCXCR2のエンドサイトーシスシグナル伝達を誘発することが示されている。CXCR2のエンドサイトーシスに対するコンビナトリアル抗体リガンドの効果を検証するために、FcR受容体ではなく膜hCXCR2を過剰発現させたU2OS細胞を用いて、CXCR2の内部移行を検討した。分子プローブとしてabN48-IgG1またはabN48-2-IgG1のイミュノトキシン複合体を使用した。図3Eに示すように、hCXCR2を過剰発現しているU2OSに対しては、abN48-IgG1とabN48-2-IgG1の免疫毒素複合体のみが用量依存的な細胞毒性を示した。hCXCR2を発現していないU2OS細胞、および無関係のコンビナトリアル抗体の免疫毒素複合体は、実験条件下で検出可能な細胞毒性を示さなかった。abN48-IgG1またはabN48-2-IgG1の活性化作用は、見かけのEC50値が0.1nM未満と高感度であった。
実施例7.モノクローナル抗体abN48-2-IgG1は、IL8に誘発される好中球走化性を強力に阻害した
好中球の走化性は、遠隔の急性障害部位または感染部位で分泌される対応するケモカインの勾配に沿って生じる。CXCR2は主に好中球に発現していることが知られており、その認知リガンドであるIL8は多くの病的過程において重要な調節因子であることが判明しているため、IL8-CXCR2軸は重要な治療介入ターゲットとなる。本例では、最適化されたコンビナトリアル抗体であるabN48-2-IgG1の走化性試験を初代ヒト好中球を用いて実施した。有効な好中球は、全血コレクションから免疫磁気ビーズ分離によってネガティブ選択され、CD15+、CD16+、CD11b+、CD66b+ (MT-Bio, Shanghai)について純度が確認された。
好中球の走化性は、遠隔の急性障害部位または感染部位で分泌される対応するケモカインの勾配に沿って生じる。CXCR2は主に好中球に発現していることが知られており、その認知リガンドであるIL8は多くの病的過程において重要な調節因子であることが判明しているため、IL8-CXCR2軸は重要な治療介入ターゲットとなる。本例では、最適化されたコンビナトリアル抗体であるabN48-2-IgG1の走化性試験を初代ヒト好中球を用いて実施した。有効な好中球は、全血コレクションから免疫磁気ビーズ分離によってネガティブ選択され、CD15+、CD16+、CD11b+、CD66b+ (MT-Bio, Shanghai)について純度が確認された。
まず、abN48-IgG1とabN48-2-IgG1の両方を用いた免疫染色により、ヒト好中球のhCXCR2膜発現を確認した(図4A)。FACS分析では、好中球細胞集団全体がabN48-IgG1またはabN48-2-IgG1によって捕捉され得ることが示され、以前の文献報告と一致していた。次に、IL8による好中球の走化性をトランスウェル移動アッセイでテストした。コンビナトリアル抗体であるabN48-2-IgG1は、最大IL8濃度(10nM)で誘発される好中球の走化性を用量依存的に、非常に強力に、そして完全に阻害した(図4B)。図4Bに示すように、abN48-2-IgG1は、1nMで75%、20nMで120%という極めて強力な好中球の走化性阻害を示した。一方、低分子CXCR1/CXCR2デュアル阻害剤のMK7123は1μMで100%の好中球走化性阻害を示した。abN48-2-IgG1がケモカイン依存性と独立性の両方で好中球の移動を完全に阻害したことは、好中球の基底的な内在性移動にCXCR2が関与していることを示唆しているのかもしれない。
実施例8.X線結晶構造解析および突然変異誘発により特徴づけられるabN48抗体とCXCR2のN末端との相互作用
HDX-MSの結果(図1C)に基づいて、結晶学的研究のためのpepN48の最小相互作用ペプチド配列を同定するために、本例では、pepN48ペプチドのN末端およびC末端からの一連の切断体を設計し、最小9-19アミノ酸(aa)ペプチド(pepN9-19、DSFEDFWKGED、SEQ ID NO:16)はabN48-IgG1およびabN48-2-IgG2の両方のFab型にpepN48と同等のレベルで結合するが、9-19 aaを欠くpepN48(pepN48?9-19)は抗体によってもはや認識されないことが分かった(図9)。
HDX-MSの結果(図1C)に基づいて、結晶学的研究のためのpepN48の最小相互作用ペプチド配列を同定するために、本例では、pepN48ペプチドのN末端およびC末端からの一連の切断体を設計し、最小9-19アミノ酸(aa)ペプチド(pepN9-19、DSFEDFWKGED、SEQ ID NO:16)はabN48-IgG1およびabN48-2-IgG2の両方のFab型にpepN48と同等のレベルで結合するが、9-19 aaを欠くpepN48(pepN48?9-19)は抗体によってもはや認識されないことが分かった(図9)。
abN48とabN48-2(Fab型)とpepN9-19の複合体の結晶構造を最終解像度2.8Åまで解析した(図1D、表3)。1つの非対称単位に2つのabN48/pep9-19タンパク質複合体(プロトマー)が存在する(図10A)。このようなプロトマーの1つ(図10B、左)では、結合したpepN9-19の電子密度が他(図10B、右)よりもはるかに優れていたため、この例では前者に絞って解析を行った。
特に、abN48/pepN9-19の両プロトマーにおいて、pepN9-19のFW14-15aaは電子密度からよく追跡できた(図10B)。これは、この二つの残基がabN48とpepN9-19との結合を定義する上で重要な役割を担っていることを示している。実際、abN48のCDRループは、その可変領域の上部に大きな疎水性キャビティを形成するように配置されていた(図11Aおよび図11B)。残基F14とW15は、この疎水性キャビティにかさ高い芳香族側鎖を挿入し、abN48のCDR2Lを除くすべてのCDRループ上の残基と強い疎水性相互作用を形成した(図11C)。具体的には、CDR3LのW104とF106、およびabN48のCDR3HのW111は、pepN9-19のW15と強いπ-πスタッキング相互作用を形成し、これはabN48の軽鎖フレーム領域のY38および重鎖フレーム領域のW48と相互作用する(図11C)。一方、pepN9-19のF14はCDR1LのY36ならびにabN48の軽鎖フレーム領域のF48およびY38と強いπ-πスタッキング相互作用を形成する(図11C)。さらに、CDR2HのW51はpepN9-19のK16の側鎖に対して疎水的にパッキングされ、それによってもabN48とNT9-19の間の高い親和性相互作用に寄与している(図11C)。したがって、abN48/NT9-19の構造は、CXCR2のN-末端領域のF14とW15が、abN48とabN48-2が認識する重要なエピトープであることを間違いなく示している。興味深いことに、abN48のCDR2HとCDR3Hはともに反平行のβ-シートとして存在し、CDR3Hは一対のα-ストランドジスルフィド結合(C102-C107)により安定化されていることさえある。このようなCDRループのコンフォメーションは、非常にまれではあるが、以前にも観察されている。
さらに検証のため、本例では、hCXCR2のN-末端のD13、F14、W15、およびK16残基に対してアラニンスキャン部位特異的変異誘発を実施した。変異体をmCherryと融合し、U2OS細胞で発現させ、次にFACSと免疫細胞蛍光法で確認した(図12)。結果は、D13、F14、W15が抗体リガンドとの結合に重要なエピトープであるという結晶解析と一致した。したがって、CXCR2のW15はIL8とCXCR2の相互作用に重要である可能性が高く、abN48はCXCR2のF14-W15結合時にIL8と競合することによりCXCR2と拮抗することができると考えられる。
本開示は、本開示の個々の態様の単一の例示として意図される記載された特定の実施形態によって範囲を限定されるものではなく、機能的に同等である任意の組成物または方法も本開示の範囲内である。本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、本開示の方法および組成物において様々な修正および変形を行うことができることは、当業者にとって明らかであろう。したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内に入ることを条件として、本開示の修正および変形をカバーすることが意図される。
本明細書で言及されているすべての出版物および特許出願は、個々の出版物または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているのと同じ程度で、参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (26)
- ヒトC-X-Cモチーフ型ケモカイン受容体2(CXCR2)タンパク質に対して特異性を有し、CDR1、CDR2およびCDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、CDR1、CDR2およびCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)とを含む抗体またはそのフラグメントであって、
前記VH CDR1はSEQ ID NO:1のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:1からアミノ酸置換された変異体を含み;
前記VH CDR2はSEQ ID NO:2のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:2からアミノ酸置換された変異体を含み;
前記VH CDR3はSEQ ID NO:3のアミノ酸配列、SEQ ID NO:3からアミノ酸置換された変異体、またはSEQ ID NO:7-14からなる群から選択される変異体を含み;
前記VL CDR1はSEQ ID NO:4のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:4からアミノ酸置換された変異体を含み;
前記VL CDR2はSEQ ID NO:5のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:5からアミノ酸置換された変異体を含み;
前記VL CDR3はSEQ ID NO:6のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:6からアミノ酸置換された変異体を含む、抗体またはそのフラグメント。 - 前記VH CDR1はSEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含み;
前記VH CDR2はSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含み;
前記VH CDR3はSEQ ID NO:3のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:7-14からなる群から選択される変異体を含み;
前記VL CDR1はSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含み;
前記VL CDR2はSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含み;
前記VL CDR3はSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗体またはそのフラグメント。 - 前記VHCDR3はSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の抗体またはそのフラグメント。
- 重鎖定常領域、軽鎖定常領域、Fc領域、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項1に記載の抗体またはそのフラグメント。
- 前記抗体はヒト抗体である、請求項1~4のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。
- 前記VHは、SEQ ID NO:17もしくは18のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:17もしくは18に対して少なくとも90%の配列同一性を有するペプチドを含む、請求項1~5のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。
- 前記VHは、SEQ ID NO:18のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:18に対して少なくとも90%の配列同一性を有するペプチドを含む、請求項1~6のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。
- 前記VLは、SEQ ID NO:19のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも90%の配列同一性を有するペプチドを含む、請求項6または7に記載の抗体またはそのフラグメント。
- ヒトC-X-Cモチーフ型ケモカイン受容体2(CXCR2)タンパク質に特異的に結合し得、前記結合はSEQ ID NO:15の残基9-19内のアミノ酸残基の少なくとも1つを含む、抗体またはそのフラグメント。
- 前記結合はD13、F14およびW15の少なくとも1つを含む、請求項9に記載の抗体またはそのフラグメント。
- 前記結合は少なくともF14およびW15を含む、請求項9に記載の抗体またはそのフラグメント。
- 前記結合は少なくともD13、F14およびW15を含む、請求項9に記載の抗体またはそのフラグメント。
- 前記結合は48個のN末端残基以外のアミノ酸残基を含まない、請求項9~12のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメント。
- CXCR2とIL-8タンパク質の間の結合を阻害する、請求項9~13のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメント。
- 前記抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である、請求項9~14のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメント。
- 請求項1~15のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメントと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
- 請求項1~15のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメントをコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、単離された細胞。
- 請求項1~15のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメントの有効量を患者に投与することを含む、がんまたは炎症性疾患の治療を必要とする患者のがんまたは炎症性疾患を治療する方法。
- 前記がんは、膀胱がん、肝臓がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、白血病、リンパ腫、膵臓がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、乳がん、尿道がん、頭頸部がん、胃腸がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、腎がん、メラノーマ、前立腺がんおよび甲状腺がんからなる群から選択される、請求項18に記載の方法。
- 前記炎症性疾患は、パーキンソン病、関節炎、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、ループス、全身性紅斑性ループス、若年性関節リウマチ、若年性特発性関節炎、グレーブ病、橋本甲状腺炎、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、シェーグレン症候群、I型糖尿病、血管炎、ぶどう膜炎、アテローム硬化症、強直性脊椎炎からなる群から選択される、請求項18に記載の方法。
- 前記炎症性疾患は感染症によって引き起こされる、請求項18に記載の方法。
- がんまたは炎症性疾患の治療のための薬物の製造のための、請求項1~15のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメントの使用。
- (a)請求項1~15のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメントを用いて、in vitroでT細胞を処理することと;
(b)処理された前記T細胞を前記患者に投与すること
を含む、がんの治療を必要とする患者のがんを治療する方法。 - ステップ(a)の前に、前記患者からT細胞を単離することをさらに含む、請求項23に記載の方法。
- 前記T細胞は、腫瘍浸潤性Tリンパ球、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、またはそれらの組み合わせである、請求項23に記載の方法。
- 請求項1~15のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメントを、該抗体またはそのフラグメントがCXCR2に結合する条件下でサンプルと接触させ、該サンプル中のCXCR2の発現を示す結合を検出することを含む、サンプル中のCXCR2発現を検出する方法。
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