JP2021101707A - 抗Axlアンタゴニスト抗体 - Google Patents
抗Axlアンタゴニスト抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021101707A JP2021101707A JP2021033363A JP2021033363A JP2021101707A JP 2021101707 A JP2021101707 A JP 2021101707A JP 2021033363 A JP2021033363 A JP 2021033363A JP 2021033363 A JP2021033363 A JP 2021033363A JP 2021101707 A JP2021101707 A JP 2021101707A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- axl
- seq
- domain
- antibodies
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3015—Breast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3023—Lung
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3061—Blood cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
- C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/77—Internalization into the cell
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【課題】Axlタンパク質と特異的に結合し、AxlとAxlリガンドGas6との相互作用を阻害する抗体を提供する。【解決手段】以下のいずれかから得られる抗体が結合するエピトープにおいてAxlと結合する抗体;A)ハイブリドーマUT−10C9−B9;又は、B)ハイブリドーマWR−10G5−E5、を提供する。【選択図】なし
Description
本開示は、Axlタンパク質と特異的に結合する抗体に関する。また、抗Axl抗体の作製方法及び使用方法も開示する。
Axlは、ビタミンK依存性リガンドGas6(growth arrest−specific 6、増殖停止特異的6)を共有するTAM(Tyro3−Axl−Mer)受容体チロシンキナーゼ(RTK)のメンバーである。TAMファミリーRTKは、細胞生存性、増殖、自食、遊走、血管新生、血小板凝集及びナチュラルキラー細胞分化を含む多様な範囲の細胞応答を調節する。Axlは、多くの胚組織に発現し、間葉及び神経の発生に関与すると考えられており、成体組織での発現が主に平滑筋細胞に限定される(MGI Gene Expression Database;www.informatics.jax.org)。Axl活性化は、Akt、MAPキナーゼ、NF−κB、STAT及びその他を含む、いくつかのシグナル伝達経路と連係している。Axlは、慢性骨髄性白血病患者由来の形質転換遺伝子として最初に同定されて以降、各種の高度悪性がんとの関連性、及び予後不良との相関性が示されてきた。
広範囲の固形腫瘍及び骨髄性白血病で、Axl受容体の過剰発現が認められる(非特許文献1及び2)。
Axlの発現は、悪性進行と相関性があり、膵臓がん(非特許文献3)、前立腺がん(非特許文献4)、肺がん(非特許文献5及び6)、乳がん(非特許文献7)、大腸がん(非特許文献8)及び急性骨髄性白血病(AML)(非特許文献9)を含む、いくつかの悪性疾患において患者の全生存期間を低下させる独立予測因子である。
腫瘍関連のマクロファージ(非特許文献10)又は自己分泌機構(非特許文献7)により分泌されるタンパク質リガンド(Gas6)により、Axlシグナル伝達が活性化されると、受容体の二量化、自己リン酸化、及び下流シグナル伝達が、例えばPI3キナーゼ(PI3K)−AKT経路、特にAKT経路及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)経路(非特許文献11)経由等で誘発される。また、他のチロシンキナーゼ受容体、例えば上皮成長因子(EGFR)とのヘテロ二量体化も発生することが報告される(非特許文献2及び12)。
腫瘍細胞内でのAxlの異常活性化は、インビトロ及びインビボの標的療法に対する薬剤耐性の獲得と広範囲にわたり関連している(非特許文献6及び13)。Axl標的薬は腫瘍形成、転移を阻止するとともに、トリプルネガティブ乳がん、ホルモン耐性前立腺がん及び肺腺がんを含む、いくつかの実験的がんモデルにおいてEMT/CSCの形質を転換させることにより薬剤耐性(例えばエルロチニブに対する)を克服している(非特許文献4、6、7及び14)。
Axl及び抗Axl抗体に関する他の出願としては、特許文献1[Axlの測定によるがん細胞浸潤性の診断及び予防―Max Planck];特許文献2[抗Axl―Chugai Pharmaceutical];特許文献3[抗Axl−Genentech]、特許文献4[Axl及びVEGFアンタゴニスト併用療法−Genentech];特許文献5[抗Axl 20G7−D9−INSERM]、特許文献6[抗Axl 3E3E8−INSERM];特許文献7[抗Axl−U3 Pharma]及び特許文献8[ヒト化抗Axl−U3 Pharma]があげられる。
Linger et al,Adv Cancer Res.100:35,2008
Linger et al,Expert Opin Ther Targets.14:1073,2010
Song et al,Cancer.117:734,2011
Paccez et al,Oncogene.32:698,2013
Ishikawa et al.Ann Surg Oncol.2012
Zhang et al,Nat Genet.44:852,2012
Gjerdrum,Proc natl Acad Sci USA 107:1124,2010
Yuen et al,PLoS One,8:e54211,2013
Ben−Batalla et al,Blood 122:2443,2013
Loges et al,Blood.115:2264,2010
Korshunov,Clinical Science.122:361,2012
Meyer et al Science Signalling 6:ra66,2013
Byers et al.Clin Cancer Res.19:279,2013
Holland et al Cancer Res 70:1544,2010
Axlが腫瘍形成に果たす機能を考慮すると、Axlとの特異的な結合に有利な特性をもつ抗体のさらなる同定が望まれる。本開示は当該抗体に関する。
本発明は、Axlタンパク質と結合する抗体を提供し、AxlとそのリガンドGas6との結合を阻害する。この抗体はまた、好ましくはAxl発現の下方調節、Axl受容体のシグナル伝達阻害、及び/又は腫瘍成長の阻害をもたらす。
Axlを結合し、AxlとそのリガンドGas6との結合を阻害する当該抗体のうち、2つの具体例を本明細書で開示する。本明細書では、当該抗体を「10C9」(本明細書に記載されるように、ハイブリドーマUT−10C9−B9から得られる)及び「10G5」(本明細書に記載されるように、ハイブリドーマWR−10G5−E5から得られる)という。
したがって、本発明は、本明細書に記載されるように、ハイブリドーマUT−10C9−B9から得られる10C9抗体が結合するエピトープと結合する抗体を提供する。また、本明細書に記載されるように、ハイブリドーマWR−10G5−E5から得られる10G5抗体が結合するエピトープと結合する抗体も提供する。
好ましくは、この抗体はAxlとそのリガンドGas6との結合を阻害する。さらにより好ましくは、この抗体はまた、Axl発現の下方調節、Axl受容体のシグナル伝達阻害、及び/又は腫瘍成長の阻害をもたらす。
10C9抗体
一態様では、本発明は、Axlを結合し、10C9のVHドメイン(配列番号3)及び/又は10C9のVLドメイン(配列番号4)を含む単離された抗体を提供する。好ましくは、これに結合されるAxlは、ヒトAxlである。
一態様では、本発明は、Axlを結合し、10C9のVHドメイン(配列番号3)及び/又は10C9のVLドメイン(配列番号4)を含む単離された抗体を提供する。好ましくは、これに結合されるAxlは、ヒトAxlである。
一態様では、本発明は、Axlを結合し、10G5のVHドメイン(配列番号21)及び/又は10G5のVLドメイン(配列番号22)を含む単離された抗体を提供する。好ましくは、これに結合されるAxlは、ヒトAxlである。非好適な代替的態様では、本発明は、Axlを結合し、10G5[Q1E]VHドメイン(配列番号45)及び/又は10G5のVLドメイン(配列番号22)を含む単離された抗体を提供する。好ましくは、これに結合されるAxlは、ヒトAxlである。
通常、VHドメインはVLドメインと対になり、抗体抗原結合部位を形成するが、以下で詳述するように、VHドメインを単独で用いて抗原と結合させてよい。好ましい一実施形態では、10C9のVHドメイン(配列番号3)を10C9のVLドメイン(配列番号4)と対にすることで、10C9のVHドメイン及びVLドメイン両方を含む抗体抗原結合部位を形成する。
他の実施形態では、10C9のVHは10C9のVL以外のVLドメインと対である。軽鎖の無差別性(promiscuity)は従来技術で確立される。例えば、ある実施形態では、10C9のVHドメイン(配列番号3)は10G5のVLドメイン(配列番号22)と対である。
10C9のVH又はVLドメインから1又はそれ以上のCDRを得ることができ、それを適したフレームワークに組み込みうる。これについては、以下で詳述する。10C9のVH CDR1、2及び3を各々、配列番号5、6及び7で示す。10C9のVL CDR1、2及び3を各々、配列番号8、9及び10で示す。
本発明の一態様では、Axlを結合し、以下の:10C9のVHドメイン(配列番号3)、及び配列番号7のアミノ酸配列を有するVH CDR3と、場合により配列番号6及び配列番号5から選択されるアミノ酸配列を有する1又はそれ以上のVH CDRとを含むVHドメインからなる群から選択される抗体VHドメイン;並びに/又は10C9のVLドメイン(配列番号4)、及び配列番号8、配列番号9及び配列番号10から選択されるアミノ酸配列を有する1又はそれ以上のVL CDRを含むVLドメインからなる群から選択される抗体VLドメイン、を含む抗体を提供する。
例えば、抗体は、配列番号5、配列番号6及び配列番号7のアミノ酸配列を有するVH CDRを含む抗体VHドメインを含んでよい。さらに抗体は、配列番号8、配列番号9及び配列番号10のアミノ酸配列を有するVL CDRを含む抗体VLドメインを含んでよい。
ある実施形態では、抗体は、(i)配列番号5、配列番号6及び配列番号7のアミノ酸配列を有するVH CDRを含む抗体VHドメイン、(ii)配列番号8、配列番号9及び配列番号10のアミノ酸配列を有するVL CDRを含む抗体VLドメインを含む。
この抗体は10C9のVHドメイン(配列番号3)を含み、場合により10C9のVLドメイン(配列番号4)をさらに含んでよい。
好ましくは、抗体は、10C9のVHドメイン(配列番号3)及び10C9のVLドメイン(配列番号4)を含む抗体のAxl結合ドメインと、ヒトAxlへの結合を競合する。
好ましくは、抗体は、本明細書に記載されるように、ハイブリドーマUT−10C9−B9から得られる抗体が結合するエピトープと結合する。
好ましくは、この抗体はAxlとそのリガンドGas6との結合を阻害する。さらにより好ましくは、この抗体はまた、Axl発現の下方調節、Axl受容体のシグナル伝達阻害、及び/又は腫瘍成長の阻害をもたらす。
本発明のさらに他の態様では、本明細書で指定する配列であり、Axlに対する抗体として用いることができ、配列改変又は突然変異及びスクリーニング等の方法により得られうる、VH及びVLドメインの変異体が提供される。当該方法もまた、本発明により提供される。
本明細書で具体的に開示される配列であるVH及びVLドメインのいずれかの可変ドメインのアミノ酸配列変異体を、記載のように本発明により用いうる。個々の変異体には、1又はそれ以上のアミノ酸配列改変(アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び/又は挿入)、おそらく約20未満の改変、約15未満の改変、約10未満の改変又は約5未満の改変(すなわち、4、3、2又は1)が含まれ得る。改変は、1又はそれ以上のフレームワーク領域及び/又は1又はそれ以上のCDR内に施しうる。
本発明による抗体は、抗原と結合し、かつ本明細書で開示される抗体VH及び/又はVLドメイン、本明細書で開示されるVH CDR3、又は当該いずれかの変異体を含むいかなる抗体と、抗原への結合を競合するものであればよい。抗体間の競合は、例えば、ELISA法を用いて、及び/又は、一方の抗体に対して特異的なレポーター分子を標識化し、他方の無標識抗体(複数可)の存在下で検出できるようにして、同一エピトープ又は重複するエピトープと結合する抗体を同定させることで、インビトロで容易に分析しうる。
したがって、本発明は、本明細書で具体的に開示される、いかなる抗体の変異体も含み、該変異体は、1又はそれ以上のフレームワーク領域内及び/又は1又はそれ以上のCDR内に1又はそれ以上のアミノ酸配列改変を含む。例えば、変異体抗体は、いずれか1つのCDR内に4以下の配列改変、例えば、いずれか1つのCDR(例えばVHドメインのCDR3)内に3以下、2以下、1以下の配列改変を含み得る。変異体抗体は、10C9のVHドメイン(配列番号3)及び10C9のVLドメイン(配列番号4)を含む抗体のAxl結合ドメインと、Axl(例えば、ヒトAxl)への結合を競合しうる。
したがって、本発明のさらなる態様は、ヒトAxlへの結合を10C9と競合するヒト抗体抗原結合部位を含む抗体を提供する。
一態様では、本発明は、本明細書に記載されるように、ハイブリドーマUT−10C9−B9から得られる抗体を提供する。
Axlへの結合を10C9と競合しうる、Axlに対する抗体を得るための様々な方法が当技術分野で提供される。
さらなる態様では、本発明は、抗原を結合できる1又はそれ以上の抗体を得る方法を提供し、該方法には、本発明による抗体のライブラリと前記抗原とを接触させること、及び前記抗原と結合できるライブラリの1又はそれ以上の抗体メンバーを選択することを含む。
このライブラリをバクテリオファージ粒子の表面に提示しうる。各粒子は、その表面に提示される抗体VH可変ドメインをコードする核酸、また存在する場合には提示されたVLドメインもコードする場合がある核酸を含む。
抗原を結合でき、バクテリオファージ粒子に提示される抗体を選別した後、前記選別された抗体を提示するバクテリオファージ粒子から核酸を取得しうる。前記選別された抗体を提示するバクテリオファージ粒子から得た核酸配列を有する核酸からの発現により、当該核酸を後続の抗体又は抗体VH可変ドメイン(場合により抗体VL可変ドメイン)の作製に用いうる。
前記選別された抗体の抗体VH可変ドメインのアミノ酸配列を有する抗体VH可変ドメインを単離形態で提供したり、当該VHドメインを含む抗体を提供したりしうる。
Axlとの結合能、またAxlへの結合を10C9と競合能をさらに試験しうる。
あるいは、目的とする抗体が結合するAxl上のエピトープと結合する抗体(例えば、10C9又は10G5抗体のAxlへの結合を阻止するもの)をスクリーニングするため、Antibodies.A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory.Ed Harlow and David Lane(1988)に記載されるような通常のクロスブロッキングアッセイを実施しうる。
本発明による抗体は、10C9の親和性によりAxlを結合しうる。
本発明の抗体は、マウス、ラット、サル、非ヒト霊長類及び/又はヒトのAxlと結合しうる。好ましくは、抗体はヒト及びサルのAxlと結合する。ある実施形態では、抗体は霊長類のAxlを特異的に結合する。例えば、抗体は、ヒト及びサルのAxlを特異的に結合しうる。一実施形態では、抗体はヒトのAxlのみを特異的に結合する。
抗体は、キメラ化、ヒト化、又はCDR移植した抗Axl抗体でよい。例えば、抗体はヒト/マウスキメラ抗体でよい。
異なる抗体の結合親和性及び中和力価を適当な条件下で比較しうる。
抗体配列に加えて、本発明による抗体は例えばペプチド又はポリペプチドを形成する他のアミノ酸、例えばフォールドドメイン、又は抗原を結合能に加えて他の機能的な特徴を分子に付与できるアミノ酸を含んでよい。
本発明の抗体は、また、検出可能な標識を保持することも、又は毒素(例えば細胞毒)、酵素若しくは有機部分に(例えばペプチジル結合又はリンカーを介して)複合体化しうる。
当業者は、タンパク質に分子を化学的に複合体化する数多くの方法を認識している。本発明の一実施形態では、検出可能な蛍光標識、例えばフルオレセインイソチオシアネート(FITC)と、又はレポーター酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と抗体を複合体化しうる。
好ましい実施形態では、抗体は細胞毒性薬と複合体化して、抗体−薬物複合体(ADC)を形成する。抗体が医薬用途を目的とする場合、抗体と薬を連結する結合は、循環(例えば、循環血液)中は安定であるが、複合体が細胞内に隔離された後は不安定であることが好ましい。したがって、免疫複合体として複合体化された抗体を、例えばがんの治療方法に用いうる。
さらなる態様では、本発明は本発明による抗体、VHドメイン及び/又はVLドメインをコードする配列を含む単離した核酸と、本発明の抗体、VHドメイン及び/又はVLドメインの調製方法とを提供し、該方法には、前記抗体、VHドメイン及び/又はVLドメインの産生をもたらす条件下で前記核酸を発現させ、それを回収する方法を含む。
本発明による抗体は、ヒト又は動物の身体の治療方法又は診断方法、例えば前記患者に本発明の抗体又は複合体、若しくはその薬物−複合体を有効量で投与することを含む、ヒト患者での疾患又は障害の治療方法(予防治療を含み得る)に用いうる。本発明による治療が可能な病状は、本明細書に別記するものを含む。
本発明による抗体は、例えば、抗体が結合する細胞の存在又は位置を決定するイメージング方法に用いうる。
さらなる態様では、本発明は、本発明による抗体及び1又はそれ以上の試薬を含む、抗体の抗原への結合を判定する診断キットを提供する。
本発明のさらなる態様は、本明細書で開示される抗体VH可変ドメイン(配列番号3)及び/又はVL可変ドメイン(配列番号4)をコードする核酸、通常は単離した核酸を提供する。ある実施形態では、VHをコードする核酸は、配列番号1に指定された配列を有する。ある実施形態では、VLをコードする核酸は、配列番号2に指定された配列を有する。
本発明の他の態様は、本明細書で開示されるVH CDR又はVL CDRの配列、特に配列番号5、6、及び7から選択されるVH CDR又は配列番号8、9又は10から選択されるVL CDR、最も好ましくは10C9 CDR3(配列番号7)をコードする核酸、通常は単離した核酸を提供する。
さらなる態様は、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞を提供する。
さらに他の態様は、抗体VH可変ドメインの作製方法を提供し、該方法にはコード核酸から発現を生じさせることを含む。当該方法には、前記抗体VH可変ドメインの作製条件下で、宿主細胞を培養することを含んでよい。
VL可変ドメイン並びにVH及び/又はVLドメインを含む抗体の類似した作製方法を本発明のさらなる態様として提供する。
作製方法には、産物の単離及び/又は精製工程を含み得る。
作製方法は、少なくとも1つの添加成分、例えば薬学的に許容される賦形剤を含む組成物に産物を製剤化することを含み得る。
本発明の上記及びその他の態様について、以下でさらに詳細に述べる。
10G5抗体
一態様では、本発明は、Axlを結合し、10G5のVHドメイン(配列番号21)及び/又は10G5のVLドメイン(配列番号22)を含む単離された抗体を提供する。好ましくは、これに結合されるAxlはヒトAxlである。非好適な代替的態様では、本発明は、Axlを結合し、10G5[Q1E]VHドメイン(配列番号45)及び/又は10G5のVLドメイン(配列番号22)を含む単離された抗体を提供する。好ましくは、これに結合されるAxlはヒトAxlである。
一態様では、本発明は、Axlを結合し、10G5のVHドメイン(配列番号21)及び/又は10G5のVLドメイン(配列番号22)を含む単離された抗体を提供する。好ましくは、これに結合されるAxlはヒトAxlである。非好適な代替的態様では、本発明は、Axlを結合し、10G5[Q1E]VHドメイン(配列番号45)及び/又は10G5のVLドメイン(配列番号22)を含む単離された抗体を提供する。好ましくは、これに結合されるAxlはヒトAxlである。
好ましい実施形態では、10G5のVHドメイン(配列番号21)は10G5のVLドメイン(配列番号22)と対になり、10G5のVHドメイン及びVLドメイン両方を含む抗体抗原結合部位を形成する。他の実施形態では、10G5のVHは10G5のVL以外のVLドメインと対である。軽鎖の無差別性は従来技術で確立される。例えば、実施形態によっては、10G5のVHドメイン(配列番号21)は10C9のVLドメイン(配列番号4)と対である。非好適な代替的態様では、10G5[Q1E]VHドメイン(配列番号45)は10G5のVLドメイン(配列番号22)と対になり、10G5のVHドメイン及びVLドメイン両方を含む抗体抗原結合部位を形成する。他の実施形態では、10G5のVHは10G5のVL以外のVLドメインと対である。軽鎖の無差別性は従来技術で確立される。例えば、実施形態によっては、10G5[Q1E]のVHドメイン(配列番号45)は10C9のVLドメイン(配列番号4)と対である。
10G5のVH又はVLドメインから1又はそれ以上のCDRを得ることができ、それを適したフレームワークに組み込みうる。これについては、以下で詳述する。10G5のVH CDR1、2及び3を各々、配列番号23、24及び25に示す。10G5のVL CDR1、2及び3を各々、配列番号26、27及び28に示す。
本発明の一態様では、Axlを結合し、以下:
10G5のVHドメイン(配列番号21)、10G5[Q1E]VHドメイン(配列番号45)、及び配列番号25のアミノ酸配列を有するVH CDR3と、場合により配列番号24及び配列番号23から選択されるアミノ酸配列を有する1又はそれ以上のCDRとを含むVHドメインからなる群から選択される抗体VHドメイン;並びに/又は
10G5のVLドメイン(配列番号22)、及び配列番号26、配列番号27及び配列番号28から選択されるアミノ酸配列を有する1又はそれ以上のVL CDRを含むVLドメインからなる群から選択される抗体VLドメイン;を含む抗体を提供する。
10G5のVHドメイン(配列番号21)、10G5[Q1E]VHドメイン(配列番号45)、及び配列番号25のアミノ酸配列を有するVH CDR3と、場合により配列番号24及び配列番号23から選択されるアミノ酸配列を有する1又はそれ以上のCDRとを含むVHドメインからなる群から選択される抗体VHドメイン;並びに/又は
10G5のVLドメイン(配列番号22)、及び配列番号26、配列番号27及び配列番号28から選択されるアミノ酸配列を有する1又はそれ以上のVL CDRを含むVLドメインからなる群から選択される抗体VLドメイン;を含む抗体を提供する。
例えば、抗体は、配列番号23、配列番号24及び配列番号25のアミノ酸配列を有するVH CDRを含む抗体VHドメインを含んでよい。さらに抗体は、配列番号26、配列番号27及び配列番号28のアミノ酸配列を有するVL CDRを含む抗体VLドメインを含んでよい。
ある実施形態では、抗体は、(i)配列番号23、配列番号24及び配列番号25のアミノ酸配列を有するVH CDRを含む抗体VHドメイン、(ii)配列番号26、配列番号27及び配列番号28のアミノ酸配列を有するVL CDRを含む抗体VLドメインを含む。
抗体は、10G5のVHドメイン(配列番号21)を含み、場合により10G5のVLドメイン(配列番号22)をさらに含んでよい。非好適な代替的実施形態では、抗体は10G5[Q1E]VHドメイン(配列番号45)を含み、場合により10G5のVLドメイン(配列番号22)をさらに含んでよい。
好ましくは、抗体は、10G5のVHドメイン(配列番号21)及び10G5のVLドメイン(配列番号22)を含む抗体のAxl結合ドメインと、ヒトAxlへの結合を競合する。
好ましくは、抗体は、本明細書に記載されるように、ハイブリドーマWR−10G5−E5から得られる抗体が結合するエピトープと結合する。
好ましくは、この抗体はAxlとそのリガンドGas6との結合を阻害する。さらにより好ましくは、この抗体はまた、Axl発現の下方調節、Axl受容体のシグナル伝達阻害、及び/又は腫瘍成長の阻害をもたらす。
本発明のさらに他の態様では、本明細書で指定する配列であり、Axlに対する抗体として用いることができ、配列改変又は突然変異及びスクリーニングといった方法により得られうる、VH及びVLドメインの変異体が提供される。当該方法もまた、本発明により提供される。
本明細書で具体的に開示される配列であるVH及びVLドメインのいずれかの可変ドメインのアミノ酸配列変異体を、記載されるように本発明により用いうる。個々の変異体には、1又はそれ以上のアミノ酸配列改変(アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び/又は挿入)、おそらく約20未満の改変、約15未満の改変、約10未満の改変又は約5未満の改変(すなわち、4、3、2又は1)が含まれ得る。改変は、1又はそれ以上のフレームワーク領域及び/又は1又はそれ以上のCDR内に施しうる。
本発明による抗体は、抗原と結合し、かつ本明細書で開示される抗体VH及び/又はVLドメイン、本明細書で開示されるVH CDR3、又は当該いずれかの変異体を含むいかなる抗体と、抗原との結合を競合するものであればよい。抗体間の競合は、例えば、ELISA法を用いて、及び/又は、一方の抗体に対して特異的なレポーター分子を標識化し、他方の無標識抗体(複数可)の存在下で検出できるようにして、同じエピトープ又は重複するエピトープと結合する抗体の同定を可能にすることにより、インビトロで容易に分析しうる。
あるいは、目的とする抗体が結合するAxl上のエピトープと結合する抗体(例えば、10C9又は10G5抗体のAxlへの結合を阻止するもの)をスクリーニングするため、Antibodies.A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory.Ed Harlow and David Lane(1988)に記載されるような通常のクロスブロッキングアッセイを実施しうる。
したがって、本発明は、本明細書で具体的に開示されるいかなる抗体の変異体も含み、該変異体は、1又はそれ以上のフレームワーク領域内及び/又は1又はそれ以上のCDR内に1又はそれ以上のアミノ酸配列改変を含む。例えば、変異体抗体は、いずれか1つのCDR内に4以下の配列改変、例えば、いずれか1つのCDR(例えばVHドメインのCDR3)内に3以下、2以下、1以下の配列改変を含み得る。変異体抗体は、10G5のVHドメイン(配列番号21)及び10G5のVLドメイン(配列番号22)を含む抗体のAxl結合ドメインと、Axl(例えば、ヒトAxl)への結合を競合しうる。
したがって、本発明のさらなる態様は、ヒトAxlへの結合を10G5と競合するヒト抗体抗原結合部位を含む抗体を提供する。
一態様では、本発明は、本明細書に記載されるように、ハイブリドーマWR−10G5−E5から得られる抗体を提供する。
Axlへの結合を10G5と競合しうる、Axlに対する抗体を得るための様々な方法が当技術分野で提供される。
さらなる態様では、本発明は、抗原と結合できる1又はそれ以上の抗体を得る方法を提供し、該方法には、本発明による抗体のライブラリと前記抗原とを接触させること、及び前記抗原と結合できるライブラリの1又はそれ以上の抗体メンバーを選択する方法を含む。
このライブラリをバクテリオファージ粒子の表面に提示しうる。各粒子は、その表面に提示される抗体VH可変ドメインをコードする核酸、また存在する場合には提示されたVLドメインもコードする場合がある核酸を含む。
抗原を結合でき、バクテリオファージ粒子に提示される抗体を選別した後、前記選別された抗体を提示するバクテリオファージ粒子から核酸を取得しうる。前記選別された抗体を提示するバクテリオファージ粒子から得た核酸配列を有する核酸からの発現により、当該核酸を後続の抗体又は抗体VH可変ドメイン(場合により抗体VL可変ドメイン)の作製に用いうる。
前記選別された抗体の抗体VH可変ドメインのアミノ酸配列を有する抗体VH可変ドメインを単離形態で提供しても、当該VHドメインを含む抗体を提供してもよい。
Axlとの結合能、またAxlへの結合を10G5と競合能をさらに試験しうる。
本発明による抗体は、10G5の親和性によりAxlを結合しうる。
本発明の抗体は、マウス、ラット、サル、非ヒト霊長類及び/又はヒトAxlと結合しうる。好ましくは、抗体はヒト及びサルのAxlと結合する。ある実施形態では、抗体は霊長類のAxlを特異的に結合する。例えば、抗体は、ヒト及びサルのAxlを特異的に結合しうる。一実施形態では、抗体はヒトのAxlのみを特異的に結合する。
抗体は、キメラ化、ヒト化、又はCDR移植した抗Axl抗体でよい。例えば、抗体はヒト/マウスキメラ抗体でよい。
異なる抗体の結合親和性及び中和力価を適当な条件下で比較しうる。
抗体配列に加えて、本発明による抗体は例えばペプチド又はポリペプチドを形成する他のアミノ酸、例えばフォールドドメイン、又は抗原を結合能に加えて他の機能的な特徴を分子に付与できるアミノ酸を含んでよい。
本発明の抗体はまた、検出可能な標識を保持することも、又は毒素(例えば細胞毒)、酵素若しくは有機部分に(例えばペプチジル結合又はリンカーを介して)複合体化しうる。
当業者は、タンパク質に分子を化学的に複合体化する数多くの方法を認識している。本発明の一実施形態では、検出可能な蛍光標識、例えばフルオレセインイソチオシアネート(FITC)と、又はレポーター酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と抗体を複合体化しうる。
好ましい実施形態では、抗体は細胞毒性薬と複合体化して、抗体−薬物複合体(ADC)を形成する。抗体が医薬用途を目的とする場合、抗体と薬を連結する結合は、循環(例えば、循環血液)中は安定であるが、複合体が細胞内に隔離された後は不安定であることが好ましい。したがって、免疫複合体として複合体化された抗体を、例えばがんの治療方法に用いうる。
さらなる態様では、本発明は本発明による抗体、VHドメイン及び/又はVLドメインをコードする配列を含む単離した核酸と、本発明の抗体、VHドメイン及び/又はVLドメインの調製方法とを提供し、該方法には、前記抗体、VHドメイン及び/又はVLドメインの産生をもたらす条件下で前記核酸を発現させ、それを回収する方法を含む。
本発明による抗体は、ヒト又は動物の身体の治療方法又は診断方法、例えば前記患者に本発明の抗体又は複合体、若しくはその薬物−複合体を有効量で投与することを含む、ヒト患者での疾患又は障害の治療方法(予防治療を含み得る)に用いうる。本発明による治療が可能な病状は、本明細書に別記するものを含む。
本発明による抗体は、例えば、抗体が結合する細胞の存在又は位置を決定するイメージング方法に用いうる。
さらなる態様では、本発明は、本発明による抗体及び1又はそれ以上の試薬を含む、抗体の抗原への結合を判定する診断キットを提供する。
本発明のさらなる態様は、本明細書で開示される抗体VH可変ドメイン(配列番号21)、抗体VH可変ドメイン(配列番号45)及び/又はVL可変ドメイン(配列番号22)をコードする核酸、通常は単離した核酸を提供する。ある実施形態では、VHをコードする核酸は、配列番号19に指定された配列を有する。ある実施形態では、VLをコードする核酸は、配列番号20に指定された配列を有する。
本発明の他の態様は、本明細書で開示されるVH CDR又はVL CDRの配列、特に配列番号23、24、及び25から選択されるVH CDR又は配列番号26、27又は28から選択されるVL CDR、最も好ましくは10G5 CDR3(配列番号25)をコードする核酸、通常は単離した核酸を提供する。
さらなる態様は、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞を提供する。
さらに他の態様は、抗体VH可変ドメインの作製方法を提供し、該方法にはコード核酸から発現を生じさせることを含む。当該方法には、前記抗体VH可変ドメインの作製条件下で、宿主細胞を培養することを含んでよい。
VL可変ドメイン並びにVH及び/又はVLドメインを含む抗体の類似した作製方法を本発明のさらなる態様として提供する。
作製方法には、産物の単離及び/又は精製工程を含み得る。
作製方法は、少なくとも1つの添加成分、例えば薬学的に許容される賦形剤を含む組成物に産物を製剤化することを含み得る。
本発明の上記及びその他の態様について、以下でさらに詳細に述べる。
10C9抗体の特性
Axlに対する高親和性
本明細書に記載する10C9抗体は、高親和性でヒトAxlと結合する。実施例5及び13に記載されるように、マウス10C9抗体が0.18nMのKDを有することを特定すると同時に、キメラ型が0.10nMのKDを有することを特定した。
Axlに対する高親和性
本明細書に記載する10C9抗体は、高親和性でヒトAxlと結合する。実施例5及び13に記載されるように、マウス10C9抗体が0.18nMのKDを有することを特定すると同時に、キメラ型が0.10nMのKDを有することを特定した。
したがって、本明細書に記載する10C9抗体及びその変異体は、高親和性でAxlを結合し、好ましくはヒトAxlを高親和性で結合する。ある実施形態では、抗体はAxl(すなわちヒトAxl)と、10−6M以下、例えば5x10−7M以下、10−7M以下、5x10−8M以下、10−8M以下、5x10−9M以下、10−9M以下、5x10−10M以下、2x10−10M以下、1.1x10−10M以下、10−10M以下、5x10−11M以下、10−11M以下、5x10−12M以下、6x10−12M以下、10−12M以下、5x10−13M以下、10−13M以下、5x10−14M以下、10−14M以下、5x10−15M以下又は10−15M以下のKDで結合する。
ある実施形態では、抗体はAxl(すなわちヒトAxl)と、10−8M〜10−10M、10−10M〜10−12M、10−12M〜10−14M、又は10−14M〜10−16MのKDで結合する。
KDは、実施例5又は実施例13に記載の方法で測定して算出しうる。
本明細書に記載する10C9抗体の会合速度(kon)は、非常に速いことを特徴とする。具体的には、実施例5で、マウス10C9抗体の会合速度が、kon=1.61x106M−1s−1と非常に速いことを特定すると同時に、実施例13で、キメラ10C9抗体の会合速度がそれよりも速いkon=2.16x106M−1s−1であることを特定した。
したがって、本明細書に記載する抗体は、好ましくはヒトAxlを速い会合速度で結合する。ある実施形態では、抗体はAxl(すなわちヒトAxl)と、104M−1s−1以上、例えば5x104M−1s−1以上、105M−1s−1以上、5x105M−1s−1以上、106M−1s−1以上、1.5x106M−1s−1以上、2x106M−1s−1以上、5x106M−1s−1以上、107M−1s−1以上、2x107M−1s−1以上、5x107M−1s−1以上、108M−1s−1以上、5x108M−1s−1以上、又は109M−1s−1以上のkonで結合する。
10G5抗体の特性
Axlに対する高親和性
本明細書に記載する10G5抗体は、高親和性でヒトAxlと結合する。実施例5及び13に記載されるように、マウス10G5抗体のKDが0.53nMであることを特定すると同時に、キメラ型のKDが0.10nMのKDであることを特定した。
Axlに対する高親和性
本明細書に記載する10G5抗体は、高親和性でヒトAxlと結合する。実施例5及び13に記載されるように、マウス10G5抗体のKDが0.53nMであることを特定すると同時に、キメラ型のKDが0.10nMのKDであることを特定した。
したがって、本明細書に記載する10G5抗体及びその変異体は、高親和性でAxlを結合し、好ましくはヒトAxlを高親和性で結合する。ある実施形態では、抗体はAxl(すなわちヒトAxl)と、10−6M以下、例えば5x10−7M以下、10−7M以下、5x10−8M以下、10−8M以下、5x10−9M以下、10−9M以下、6x10−10M以下、5x10−10M以下、1.1x10−10M以下、10−10M以下、5x10−11M以下、10−11M以下、5x10−12M以下、6x10−12M以下、10−12M以下、5x10−13M以下、10−13M以下、5x10−14M以下、10−14M以下、5x10−15M以下又は10−15M以下のKDで結合する。
ある実施形態では、抗体はAxl(すなわちヒトAxl)と、10−8M〜10−10M、10−10M〜10−12M、10−12M〜10−14M、又は10−14M〜10−16MのKDで結合する。
KDは、実施例5又は実施例13で記載する方法で測定して算出しうる。
本明細書に記載する10G5抗体の会合速度(kon)は、非常に速いことを特徴とする。具体的には、実施例5で、マウス10G5抗体の会合速度が、kon=0.83x106M−1s−1と非常に速いことを特定すると同時に、実施例13で、キメラ10G5抗体の会合速度が、それよりも速いkon=1.64x106M−1s−1であることを特定した。
したがって、本明細書に記載する抗体は、好ましくはヒトAxlを速い会合速度で結合する。ある実施形態では、抗体はAxl(すなわちヒトAxl)と、104M−1s−1以上、例えば5x104M−1s−1以上、105M−1s−1以上、5x105M−1s−1以上、106M−1s−1以上、1.5x106M−1s−1以上、2x106M−1s−1以上、5x106M−1s−1以上、107M−1s−1以上、2x107M−1s−1以上、5x107M−1s−1以上、108M−1s−1以上、5x108M−1s−1以上、又は109M−1s−1以上のkonで結合する。
10C9及び10G5抗体の特性
特異的結合性
一般に用語「特異的」及び「特異的に結合する」は、抗体がその特異的結合対(複数可)以外の分子にいかなる有意な結合も示さない状況をいう場合に用いうる。例えば、ヒトAxlを「特異的に結合する」抗体は、マウスAxlに対していかなる有意な結合も示さない。
特異的結合性
一般に用語「特異的」及び「特異的に結合する」は、抗体がその特異的結合対(複数可)以外の分子にいかなる有意な結合も示さない状況をいう場合に用いうる。例えば、ヒトAxlを「特異的に結合する」抗体は、マウスAxlに対していかなる有意な結合も示さない。
この用語はまた、例えばいくつかの抗原がもつ特定のエピトープに対して抗体が特異的である場合にも適用しうる。この場合、エピトープを「特異的に結合する」抗体は、認識されたエピトープをもつ様々な抗原すべてと結合しうる。
通常、特異性は、例えば抗原パネルを用いたELISA法等の結合アッセイにより決定しうる。
本明細書に記載する10C9及び10G5抗体は、高特異的にヒトAxlと結合する。すなわち、10C9及び10G5抗体は、ヒトAxlを「特異的に結合する」。このことを実施例で実証する。示される内容は以下の通りである:
(1)実施例2で、10C9及び10G5は、ヒトTAM受容体チロシンキナーゼファミリーの他のメンバーであるhMer及びhTyro3由来の組換え抗原と有意な結合性を示さない;
(2)実施例3で、10C9及び10G5は、ヒトAxlと強く結合するが、マウスAxlとの結合性は示さない(これはマウスAxlリガンドであるマウスGas6が、マウスとヒト両方のAxlと強く結合するとともに、ヒトTyro3とも(より弱く)結合することとは対照的である);
(3)実施例4で、10C9及び10G5は、カニクイザル(Macaca fascicularis)Axlと強く結合する。
(1)実施例2で、10C9及び10G5は、ヒトTAM受容体チロシンキナーゼファミリーの他のメンバーであるhMer及びhTyro3由来の組換え抗原と有意な結合性を示さない;
(2)実施例3で、10C9及び10G5は、ヒトAxlと強く結合するが、マウスAxlとの結合性は示さない(これはマウスAxlリガンドであるマウスGas6が、マウスとヒト両方のAxlと強く結合するとともに、ヒトTyro3とも(より弱く)結合することとは対照的である);
(3)実施例4で、10C9及び10G5は、カニクイザル(Macaca fascicularis)Axlと強く結合する。
このように、本明細書に記載する抗体は、霊長類Axlを特異的に結合することが好ましい。ある実施形態では、本明細書に記載する抗体は、ヒト及びサル(例えばMacaca fascicularis)のAxlを特異的に結合する。一実施形態では、抗体はヒトAxlに限り特異的に結合する。
本発明のある実施形態では、本明細書に記載する抗体は、ヒトTyro3及び/又はヒトMerに有意な結合を示さない。ある実施形態では、本明細書に記載する抗体は、マウスAxlと有意な結合性を示さない。ある実施形態では、本明細書に記載する抗体は、ヒトTyro3、ヒトMer又はマウスAxlのいずれにも有意な結合性を示さない。
抗体が抗原に「有意な結合性を示さない」かどうかは、例えば、実施例2及び3に記載される技術を用いて当業者が容易に特定できる。ある実施形態では、抗体が10−3M超、例えば10−2M超、10−1M超又は1M超のKDで抗原を結合する場合、抗体は特定の抗原に「有意な結合性を示さない」ものと見なす。KDは、実施例5で述べた方法で測定して算出しうる。
Axl/Gas6結合の阻害
本明細書に記載する10C9及び10G5抗体は、AxlとそのリガンドGas6との結合を阻害する。
本明細書に記載する10C9及び10G5抗体は、AxlとそのリガンドGas6との結合を阻害する。
図5は、実施例6に記載される競合結合アッセイの結果を示す。結果は、固定化rhAxlが10C9で飽和されると、それ以降に追加された10C9、又は10G5、rhGas6(rhAxlのリガンドとして既知)若しくはrmGas6のいずれもが結合できないことを示す。これは、10C9、10G5及びGas6が結合するAxl分子の領域が互いに隣接していることを示す。対照的に、10C9の結合は、MAB154抗Axl抗体の結合をまったく阻害しなかった。これは、10C9とMAB154がAxl分子の別々の部分と結合することを意味する。
したがって、好ましい実施形態では、本明細書に記載する抗体は、AxlのGas6への(例えば、rhAxlのrhGas6への)結合を阻害する。すなわち、好ましくは、本明細書に記載する抗体は、ヒトAxlへの結合をヒトGas6と競合する。最も好ましくは、Axl/Gas6結合が阻害される結果、抗体で飽和したAxl試料にGas6の有意な結合がまったく観察できない(例えば、それまで抗体に露出されなかったAxl試料に対して観察される結合が1%以下)。Gas6結合の阻害は、実施例6に記載される競合結合アッセイを用いて評価しうる。
Axl受容体発現の阻害
本発明の抗体により、Axlの発現が有意に低下する。
本発明の抗体により、Axlの発現が有意に低下する。
図8は、実施例9に記載されるウェスタンブロットアッセイの結果を示す。この実施例では、MBA−MD−231細胞を、一連の抗体のいずれかとともに一晩インキュベートした後、Axl発現について試験した。結果は、10C9とともにインキュベートすると、細胞内に存在するAxl受容体タンパク質の量に有意な減少が生じることを示す。これは、10C9抗体の結合がAxl受容体の発現を下方調節することを意味する。
したがって、好ましい実施形態では、本発明の抗体はAxl受容体の発現を下方調節する。
ある実施形態では、本発明の抗体は、Axl受容体の発現を、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をした試料で観察されるレベルの80%未満に減少させる。ある実施形態では、本発明の抗体は、Axl受容体の発現を、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をした試料で観察されるレベルの70%未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満又は10%未満に減少させる。Axl受容体発現のレベルは、実施例9に記載されるアッセイを用いて評価しうる。また当技術分野では、ウェスタンブロット上のバンドを正確に定量化する方法が数多く知られており、例えば、Taylor et al.Mol Biotechnol.2013;55(3):217−226を参照のこと。
ある実施形態では、Axl受容体発現の下方調節は迅速に発生する。例えば、ある実施形態では、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をした試料で観察されるレベルの80%未満へのAxl受容体発現の減少が、試料を抗体と接触させてから12時間以内、例えば試料を抗体と接触させてから12時間以内、6時間以内、3時間以内、又は1時間以内で観察される。
ある実施形態では、抗体は、Axl受容体発現の持続的な下方調節を生じさせる。例えば、ある実施形態では、抗体と接触させた試料のAxl受容体発現のレベルを、試料を抗体と接触させて以降、少なくとも6時間、例えば少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間又は少なくとも96時間の間、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をした試料で観察されるレベルの50%未満に維持する。
理論に束縛されるものではないが、Axl発現に観察された下方調節は、抗体/Axl受容体の複合体が内在化して、細胞により分解されるためであると考えられる。抗体の内在化は、抗体又は抗体と連結された分子を標的細胞に到達させることが望ましい用途において極めて有利である。例えば、標的ががん細胞である場合、抗体は細胞毒性薬と連結される。
したがって、好ましい実施形態では、本発明の抗体は、Axl受容体の内在化の速度を高める。
ある実施形態では、本発明の抗体は、Axl受容体の内在化の速度を、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をした試料で観察されるレベルの少なくとも110%に増加させる。ある実施形態では、本発明の抗体は、Axl受容体の内在化の速度を、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をした試料で観察されるレベルの少なくとも120%、少なくとも130%、少なくとも140%、少なくとも150%、少なくとも160%、少なくとも170%、少なくとも180%、少なくとも190%、少なくとも200%、少なくとも500%、少なくとも1000%に増加させる。
Axl受容体の内在化のレベルは、当技術分野で公知のいずれか1つの受容体内在化アッセイを用いて評価しうる。例えば、Koenig et al.Methods in Molecular Biology Volume 259,2004,pp249−273に記載される方法である。
Axl受容体シグナル伝達の阻害
本発明の抗体が(1)Axl受容体の天然リガンド(例えばGas6)との結合を阻害する、また(2)Axl受容体の発現を下方調節するという観察と一貫して、本発明の抗体はAxl受容体のリガンドにより誘発される下流のシグナル伝達を阻害する。この観察結果を図9に示す。この図から、10C9抗体の存在が、AxlリガンドGas6添加時にAktのSerine 473がリン酸化される程度を有意に減少させることがわかる。
本発明の抗体が(1)Axl受容体の天然リガンド(例えばGas6)との結合を阻害する、また(2)Axl受容体の発現を下方調節するという観察と一貫して、本発明の抗体はAxl受容体のリガンドにより誘発される下流のシグナル伝達を阻害する。この観察結果を図9に示す。この図から、10C9抗体の存在が、AxlリガンドGas6添加時にAktのSerine 473がリン酸化される程度を有意に減少させることがわかる。
したがって、好ましい実施形態では、本発明の抗体はAxl活性を阻害する。阻害される活性は、構成的Axl活性でありうる。
ある実施形態では、本発明の抗体は、Axlの下流のシグナル伝達、例えばSerine 473でのAktのリン酸化を阻害する。ある実施形態では、本発明の抗体と接触させた試料のSerine 473でのAktのリン酸化は、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をした試料で観察されるレベルの80%未満である。ある実施形態では、本発明の抗体と接触させた試料のSerine 473でのAktのリン酸化は、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をした試料で観察されるレベルの70%未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満又は10%未満である。Serine 473でのAktのリン酸化のレベルは、実施例10に記載されるアッセイを用いて評価しうる。また当技術分野では、ウェスタンブロット上のバンドを正確に定量化する方法が数多く知られており、例えば、Taylor et al.Mol Biotechnol.2013;55(3):217−226を参照のこと。
Axl受容体のシグナル伝達を阻害することにより、本発明の抗体はまた、Axl受容体のシグナル伝達が担う範囲の作用に影響を及ぼすことが期待される。
例えば、Axl受容体のシグナル伝達がGas6依存性の細胞増殖を刺激して細胞死を阻害し、その結果、腫瘍成長を助けることが知られている。また、Axl受容体のシグナル伝達は、上皮間葉転換(EMT)を刺激して、その結果、腫瘍転移を促進することも知られている。
したがって、ある実施形態では、本発明の抗体は、例えばアポトーシスによる細胞死を促進する。好ましくは、細胞は、例えば循環腫瘍細胞又は転移細胞等の腫瘍細胞である。例えば、ある実施形態では、本発明の抗体は、細胞死率を、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をした試料で観察されるレベルの少なくとも110%に増加させる。ある実施形態では、本発明の抗体は、細胞死率を、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をした試料で観察されるレベルの少なくとも120%、少なくとも130%、少なくとも140%、少なくとも150%、少なくとも160%、少なくとも170%、少なくとも180%、少なくとも190%、少なくとも200%、少なくとも500%、少なくとも1000%に増加させる。細胞死率は、例えば、BrdU取り込みアッセイ、MTT、[3H]−チミジンの取り込み(例えば、TopCountアッセイ(PerkinElmer))、細胞生存率アッセイ(例えば、CellTiter−Glo(Promega))、DNA断片化アッセイ、カスパーゼ活性化アッセイ、トリプタンブルー染色による排除、クロマチンの形態分析等により測定しうる。
ある実施形態では、本発明の抗体は、Axlの下流シグナル伝達を阻害する。ある実施形態では、本発明の抗体は、Gas6依存性の細胞増殖を阻害する。
ある実施形態では、本発明の抗体は、腫瘍関連マクロファージからの炎症性サイトカインの発現を阻害する。
腫瘍成長の阻害
腫瘍成長におけるAxl及びEMT経路の役割と一貫して、本発明の抗体は、血液学的腫瘍と非血液学的腫瘍両方の成長速度を低下させる。このことを、実施例14及び15に記載される方法により得た、図14及び15に示すデータにより実証している。
腫瘍成長におけるAxl及びEMT経路の役割と一貫して、本発明の抗体は、血液学的腫瘍と非血液学的腫瘍両方の成長速度を低下させる。このことを、実施例14及び15に記載される方法により得た、図14及び15に示すデータにより実証している。
したがって、好ましい実施形態では、本発明の抗体は、例えば腫瘍間質の機能を調節することにより、腫瘍成長及び/又は転移を阻害する。
ある実施形態では、本発明の抗体は、対照腫瘍と比較して少なくとも10%腫瘍成長を阻害する。すなわち、抗体で治療した腫瘍の容積は、対照腫瘍の容積の90%以下である。例えば、ある実施形態では、本発明の抗体は、対照腫瘍と比較して少なくとも20%、例えば、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%腫瘍成長を阻害する。
ある実施形態では、実施例14に記載されるように、腫瘍成長に対する抗体の効果を分析する。ある実施形態では、実施例15に記載されるように、腫瘍成長に対する抗体の効果を分析する。
定義
抗体
この用語は、天然であるか、又は部分合成若しくは全体合成から産生されたかを問わず、免疫グロブリンを意味する。この用語はまた、抗体抗原−結合ドメインを含む、いかなるポリペプチド又はタンパク質にも適用される。抗体抗原−結合ドメインを含む抗体断片には、全抗体(例えばカノニカル配置でVH、CH1、CH2、CH3、VL及びCLドメインを含むIgG抗体)、又は標的抗原に対する結合活性を保持している全抗体の断片を包含する。当該断片としては、Fv(可変断片)、Fab(抗体結合性の断片)及びF(ab’)2断片、並びに一本鎖Fv抗体(scFv)、dsFv、ミニボディ、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、直列型scFv、TandAb、バイボディ、トリボディ、カッパ(ラムダ)ボディ、BiTE、DVD−Ig、SIP、SMIP又はDARTがあげられる。さらに、抗体及びその断片は、例えばEP239400Aに記載されるヒト化抗体であってよい。例えば、モノクローナル及びポリクローナル抗体、組換え抗体、抗体のタンパク質分解性断片及び組換え断片(Fab、Fv、scFv、ダイアボディ)、単一ドメイン抗体(VHH、sdAb、ナノボディ、IgNAR、VNAR)、並びに抗体に無関係なタンパク質であり、これらは、限定されないが、以下のような抗体様特異的結合(抗体模倣体)を有するように操作される。
抗体
この用語は、天然であるか、又は部分合成若しくは全体合成から産生されたかを問わず、免疫グロブリンを意味する。この用語はまた、抗体抗原−結合ドメインを含む、いかなるポリペプチド又はタンパク質にも適用される。抗体抗原−結合ドメインを含む抗体断片には、全抗体(例えばカノニカル配置でVH、CH1、CH2、CH3、VL及びCLドメインを含むIgG抗体)、又は標的抗原に対する結合活性を保持している全抗体の断片を包含する。当該断片としては、Fv(可変断片)、Fab(抗体結合性の断片)及びF(ab’)2断片、並びに一本鎖Fv抗体(scFv)、dsFv、ミニボディ、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、直列型scFv、TandAb、バイボディ、トリボディ、カッパ(ラムダ)ボディ、BiTE、DVD−Ig、SIP、SMIP又はDARTがあげられる。さらに、抗体及びその断片は、例えばEP239400Aに記載されるヒト化抗体であってよい。例えば、モノクローナル及びポリクローナル抗体、組換え抗体、抗体のタンパク質分解性断片及び組換え断片(Fab、Fv、scFv、ダイアボディ)、単一ドメイン抗体(VHH、sdAb、ナノボディ、IgNAR、VNAR)、並びに抗体に無関係なタンパク質であり、これらは、限定されないが、以下のような抗体様特異的結合(抗体模倣体)を有するように操作される。
名称 ベース:
アドネクチン/モノボディ ヒトフィブロネクチン(10Fn3)III型の第10ドメイン、10kDa
アフィボディ プロテインA、Zドメイン、6kDa
アフィリン ヒトγ−クリスタリン/ヒトユビキチン(10〜20kDa)
アフィチン Sac7d(Sulfolobus acidocaldarius由来)、7kDa
アンチカリン リポカリン、20kDa
アビマー 様々な細胞膜受容体のドメイン、9〜18kDa
DARPin アンキリンリピートモチーフ、14kDa
Evibody 細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA−4)、15kDa
フィノマー Fyn、SH3ドメイン、7kDa
クニッツドメインペプチド 様々なプロテアーゼ阻害剤、6kDa
アドネクチン/モノボディ ヒトフィブロネクチン(10Fn3)III型の第10ドメイン、10kDa
アフィボディ プロテインA、Zドメイン、6kDa
アフィリン ヒトγ−クリスタリン/ヒトユビキチン(10〜20kDa)
アフィチン Sac7d(Sulfolobus acidocaldarius由来)、7kDa
アンチカリン リポカリン、20kDa
アビマー 様々な細胞膜受容体のドメイン、9〜18kDa
DARPin アンキリンリピートモチーフ、14kDa
Evibody 細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA−4)、15kDa
フィノマー Fyn、SH3ドメイン、7kDa
クニッツドメインペプチド 様々なプロテアーゼ阻害剤、6kDa
抗体は、抗体の重鎖定常領域及び/又は抗体の軽鎖定常領域のすべて又は部分を含み得る。
モノクローナル抗体やその他の抗体を用い、組換えDNA技術の技法を利用して、元の抗体の特異性を保持する遺伝子操作された抗体又はキメラ分子を作製しうる。当該技術には、抗体の免疫ブロブリン可変領域、すなわち相補性決定領域(CDR)をコードするDNA断片と、異なる免疫グロブリンの免疫ブロブリン定常領域、すなわち定常領域にフレームワーク領域を加えた領域をコードする遺伝子とのライゲーションを伴う場合がある。例えば、EP−A−184187、GB 2188638A又はEP−A−239400を参照のこと。抗体を産生するハイブリドーマ又はその他細胞に、遺伝子突然変異又はその他の改変を施しうる。この改変は、産生される抗体の結合特異性を変更しても、変更しなくてもよい。
抗体がいくつかの方法で改変できる場合、用語「抗体分子」は、要求される特異性をもつ抗体由来の抗原−結合ドメインを有する、いかなるポリペプチド又はその他の分子も含むと解釈されるものとする。したがって、この用語は、天然又は全合成若しくは部分合成を問わず、免疫グロブリン結合ドメインを含む何らかのポリペプチドを含む、抗体断片及び誘導体にも適用される。したがって、他のポリペプチドと融合された、免疫グロブリン結合ドメイン又は等価物を含むキメラ分子も包含される。キメラ抗体のクローニング及び発現については、EP−A−0120694及びEP−A−0125023に記載される。
これには、全抗体の断片が抗原の結合機能を実行できることが示される。結合性断片の例は、(i)VL、VH、CL及びCH1ドメインからなるFab断片;(ii)VH及びCH1ドメインからなるFd断片;(iii)単一抗体のVL及びVHドメインからなるFv断片;(iv)VHドメインからなるdAb断片(Ward,E.S.et al.,Nature 341,544−546(1989));(v)単離されたCDR領域;(vi)2つの連結されたFab断片を含む二価断片であるF(ab’)2断片;(vii)VHドメインとVLドメインとがペプチドリンカーにより連結され、2つのドメインが会合されて抗原結合部位が形成される一本鎖Fv分子(scFv)(Bird et al,Science,242,423−426,1988;Huston et al,PNAS USA,85,5879−5883,1988);(viii)二重特異性一本鎖Fv二量体(PCT/US92/09965)並びに(ix)「ダイアボディ」、すなわち遺伝子融合により構築された多価断片又は多重特異性断片である(WO94/13804;P.Holliger et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,6444−6448,1993)である。Fv、scFv又はダイアボディ分子は、VHドメインとVLドメインとを連結するジスルフィド結合の組み込みにより安定化しうる(Y.Reiter et al,Nature Biotech,14,1239−1245,1996)。CH3ドメインと連結されたscFvを含むミニボディもまた作製しうる(S.Hu et al,Cancer Res.,56,3055−3061,1996)。
抗体は、二重特異性でも、多重特異性でもよい。二重特異性抗体を用いる場合、この抗体は、様々な方法(Holliger,P.and Winter G.Current Opinion Biotechnol.4,446−449(1993))で製造できる従来的な二重特異性抗体(例えば、化学的に調製されたもの又はハイブリッドハイブリドーマから調製されたもの)であっても、上述の二重特異性抗体断片のいずれかであってよい。ダイアボディ及びscFvは、可変ドメインのみを用いてFc領域なしで構築でき、例えば抗体エフェクター機能による副作用、又はマウス起源の抗体を用いる場合にはヒト抗マウス抗体(HAMA)反応による副作用を低減する可能性がある。
二重特異性ダイアボディは、二重特異性全抗体と対照的に、細菌(例えばEscherichia coli)内に容易に構築して発現さうるため、特に有用でありうる。適当な結合特異性のダイアボディ(及び抗体断片等の多数の他のポリペプチド)は、ファージディスプレイ(WO94/13804)を用いて抗体ライブラリから容易に選択しうる。ダイアボディの1本のアームを、例えばAxlに対する特異性を有する定常なものにしたい場合は、他方のアームが可変性となり適当な特異性の抗体が選択されるライブラリを作製しうる二重特異性全抗体は、「ノブイントゥホール」操作(J.B.B.Ridgeway et al,Protein Eng.,9,616−621,1996)により作製しうる。
試料
本明細書で用いられる場合、「試料」は単一細胞であっても、細胞集団であってよい。細胞(複数可)は、通常の健康な細胞(複数可)であっても、腫瘍細胞、例えば循環がん細胞であってよい。
本明細書で用いられる場合、「試料」は単一細胞であっても、細胞集団であってよい。細胞(複数可)は、通常の健康な細胞(複数可)であっても、腫瘍細胞、例えば循環がん細胞であってよい。
試料は、インビボ、ex vivo、又はインビトロでありうる。例えば、試料はインビボ腫瘍腫瘤であっても、インビトロ細胞集団であってよい。
抗原結合ドメイン
これは、抗原の一部又は全体を認識して、それと特異的に結合し、それに相補的である領域を含む抗体分子の一部を意味する。抗原が大きい場合、抗体は、エピトープと呼ばれる、その抗原の特定の部分のみと結合しうる。抗原結合ドメインは、1又はそれ以上の抗体可変ドメイン(例えば、VHドメインからなる、いわゆるFd抗体断片)により構成されうる。好ましくは、抗原結合ドメインは抗体軽鎖可変領域(VL)及び抗体重鎖可変領域(VH)を含む。
これは、抗原の一部又は全体を認識して、それと特異的に結合し、それに相補的である領域を含む抗体分子の一部を意味する。抗原が大きい場合、抗体は、エピトープと呼ばれる、その抗原の特定の部分のみと結合しうる。抗原結合ドメインは、1又はそれ以上の抗体可変ドメイン(例えば、VHドメインからなる、いわゆるFd抗体断片)により構成されうる。好ましくは、抗原結合ドメインは抗体軽鎖可変領域(VL)及び抗体重鎖可変領域(VH)を含む。
ある実施形態では、ヒトAxlポリペプチドは、上記のアイソフォーム「A」に相当する。ある実施形態では、ヒトAxlポリペプチドは、上記のアイソフォーム「B」に相当する。ある実施形態では、ヒトAxlポリペプチドは、上記のアイソフォーム「C」に相当する。
ある実施形態では、マウスAxlポリペプチドは、上記のアイソフォーム「A」に相当する。ある実施形態では、マウスAxlポリペプチドは、上記のアイソフォーム「B」に相当する。ある実施形態では、マウスAxlポリペプチドは、上記のアイソフォーム「C」に相当する。
ヒトTyro3
本明細書で用いられる「ヒトTyro3」とは、受容体チロシンキナーゼのヒトTAMファミリーのTyro3メンバーをいう。ある実施形態では、ヒトTyro3ポリペプチドは、NCBIアクセッション番号NP_006284.2、GI:27597078、登録更新日:2014年11月28日12:30AM(配列番号39)に相当する。一実施形態では、ヒトTyro3ポリペプチドをコードする核酸は、NCBIアクセッション番号NM_006293.3、GI:295842183、登録更新日:2014年11月28日12:30AMに相当する。
本明細書で用いられる「ヒトTyro3」とは、受容体チロシンキナーゼのヒトTAMファミリーのTyro3メンバーをいう。ある実施形態では、ヒトTyro3ポリペプチドは、NCBIアクセッション番号NP_006284.2、GI:27597078、登録更新日:2014年11月28日12:30AM(配列番号39)に相当する。一実施形態では、ヒトTyro3ポリペプチドをコードする核酸は、NCBIアクセッション番号NM_006293.3、GI:295842183、登録更新日:2014年11月28日12:30AMに相当する。
ヒトMer
本明細書で用いられる「ヒトMer」とは、受容体チロシンキナーゼのヒトTAMファミリーのMerメンバーをいう。ある実施形態では、ヒトMerポリペプチドは、NCBIアクセッション番号NP_006334.2、GI:66932918、登録更新日:2014年9月6日04:03AM(配列番号40)に相当する。一実施形態では、ヒトMerポリペプチドをコードする核酸は、NCBIアクセッション番号NM_006343、バージョン番号NM_006343.2 GI:66932917、登録更新日:2014年9月6日04:03AMに相当する。
本明細書で用いられる「ヒトMer」とは、受容体チロシンキナーゼのヒトTAMファミリーのMerメンバーをいう。ある実施形態では、ヒトMerポリペプチドは、NCBIアクセッション番号NP_006334.2、GI:66932918、登録更新日:2014年9月6日04:03AM(配列番号40)に相当する。一実施形態では、ヒトMerポリペプチドをコードする核酸は、NCBIアクセッション番号NM_006343、バージョン番号NM_006343.2 GI:66932917、登録更新日:2014年9月6日04:03AMに相当する。
ある実施形態では、ヒトAktポリペプチドは、上記のアイソフォーム「A」に相当する。ある実施形態では、ヒトAktポリペプチドは、上記のアイソフォーム「B」に相当する。ある実施形態では、ヒトAktポリペプチドは、上記のアイソフォーム「C」に相当する。
ヒトGas6
本明細書で用いられる「ヒトGas6」(増殖停止特異的6)とは、受容体チロシンキナーゼのTAMファミリーのリガンドをいう。ある実施形態では、ヒトGas6ポリペプチドは、NCBIアクセッション番号NP_000811.1、GI:4557617、登録更新日:2014年9月6日02:44AM(配列番号42)に相当する。一実施形態では、ヒトGas6ポリペプチドをコードする核酸は、NCBIアクセッション番号NM_000820.3、GI:673038877、登録更新日:2014年9月6日02:44AMに相当する。
本明細書で用いられる「ヒトGas6」(増殖停止特異的6)とは、受容体チロシンキナーゼのTAMファミリーのリガンドをいう。ある実施形態では、ヒトGas6ポリペプチドは、NCBIアクセッション番号NP_000811.1、GI:4557617、登録更新日:2014年9月6日02:44AM(配列番号42)に相当する。一実施形態では、ヒトGas6ポリペプチドをコードする核酸は、NCBIアクセッション番号NM_000820.3、GI:673038877、登録更新日:2014年9月6日02:44AMに相当する。
BSA
本明細書で用いられる「BSA」とはウシ血清アルブミンをいう。ある実施形態では、BSAは「A9647−ウシ血清アルブミン」(Sigma Aldrich)に相当する。ある実施形態では、BSAは、Genbankアクセッション番号CAA76847、バージョン番号CAA76847.1 GI3336842、登録更新日:2011年1月7日02:30PMに相当する。
本明細書で用いられる「BSA」とはウシ血清アルブミンをいう。ある実施形態では、BSAは「A9647−ウシ血清アルブミン」(Sigma Aldrich)に相当する。ある実施形態では、BSAは、Genbankアクセッション番号CAA76847、バージョン番号CAA76847.1 GI3336842、登録更新日:2011年1月7日02:30PMに相当する。
Comprise(を含む)
この用語は一般に、「include(あげられる・を含む)」、すなわち1又はそれ以上の特徴又は成分の存在を許容する意味で用いられる。
この用語は一般に、「include(あげられる・を含む)」、すなわち1又はそれ以上の特徴又は成分の存在を許容する意味で用いられる。
単離された
この用語は、本発明の抗体又は当該抗体をコードする核酸が、一般に本発明によりありうる状態をいう。抗体及び核酸は、それらが自然に会合する物質、例えば、その天然の環境中で、又はインビトロ若しくはインビボで実施される組換えDNA技術により調製される場合、その調製環境(例えば、細胞培養)中で共存する他のポリペプチド又は核酸等の物質を含まないか、又は実質的に含まない。抗体及び核酸は希釈剤又はアジュバントとともに製剤化できるが、その場合でも実用目的のため単離でき、例えば、その抗体を、イムノアッセイに用いられるマイクロタイタープレートのコーティングに用いる場合、通常ゼラチン又は他の担体と混合し、あるいは診断又は療法に用いる場合、薬学的に許容される担体又は希釈剤と混合する。抗体は、天然又は異種起源の真核細胞系(例えば、CHO又はNS0(ECACC 85110503)細胞)によりグリコシル化される場合もあれば、(例えば、原核細胞での発現により産生される場合には)非グリコシル化形態の場合もある。
この用語は、本発明の抗体又は当該抗体をコードする核酸が、一般に本発明によりありうる状態をいう。抗体及び核酸は、それらが自然に会合する物質、例えば、その天然の環境中で、又はインビトロ若しくはインビボで実施される組換えDNA技術により調製される場合、その調製環境(例えば、細胞培養)中で共存する他のポリペプチド又は核酸等の物質を含まないか、又は実質的に含まない。抗体及び核酸は希釈剤又はアジュバントとともに製剤化できるが、その場合でも実用目的のため単離でき、例えば、その抗体を、イムノアッセイに用いられるマイクロタイタープレートのコーティングに用いる場合、通常ゼラチン又は他の担体と混合し、あるいは診断又は療法に用いる場合、薬学的に許容される担体又は希釈剤と混合する。抗体は、天然又は異種起源の真核細胞系(例えば、CHO又はNS0(ECACC 85110503)細胞)によりグリコシル化される場合もあれば、(例えば、原核細胞での発現により産生される場合には)非グリコシル化形態の場合もある。
実質的に指定された
「実質的に指定された」とは、本発明の関連するCDR又はVH若しくはVLドメインが、本明細書で指定した配列を有する特定の領域と同一又は極めて類似していることを意味する。「極めて類似」とは、CDR及び/又はVH若しくはVLドメイン内に、1〜5、好ましくは1〜4、例えば1〜3又は1若しくは2、又は3若しくは4つのアミノ酸置換が施されうることを意味する。
「実質的に指定された」とは、本発明の関連するCDR又はVH若しくはVLドメインが、本明細書で指定した配列を有する特定の領域と同一又は極めて類似していることを意味する。「極めて類似」とは、CDR及び/又はVH若しくはVLドメイン内に、1〜5、好ましくは1〜4、例えば1〜3又は1若しくは2、又は3若しくは4つのアミノ酸置換が施されうることを意味する。
CDRを支持するフレームワーク
本発明のCDRを保持する構造は一般に、再構成された免疫グロブリン遺伝子によりコードされる天然に存在するVH及びVL抗体可変ドメインのCDRに対応する位置にCDRが配置される、抗体重鎖若しくは軽鎖配列又はその実質的部分である。免疫グロブリン可変ドメインの構造及び位置は、Kabat,E.A.et al,Sequences of Proteins of Immunological Interest.4th Edition.US Department of Health and Human Services.1987及びその改訂版(現在は、インターネット上で利用可能(http://immuno.bme.nwu.edu又は検索エンジンを用いて「Kabat」を検索))を参照して特定しうる。
本発明のCDRを保持する構造は一般に、再構成された免疫グロブリン遺伝子によりコードされる天然に存在するVH及びVL抗体可変ドメインのCDRに対応する位置にCDRが配置される、抗体重鎖若しくは軽鎖配列又はその実質的部分である。免疫グロブリン可変ドメインの構造及び位置は、Kabat,E.A.et al,Sequences of Proteins of Immunological Interest.4th Edition.US Department of Health and Human Services.1987及びその改訂版(現在は、インターネット上で利用可能(http://immuno.bme.nwu.edu又は検索エンジンを用いて「Kabat」を検索))を参照して特定しうる。
本発明で用いられる可変ドメインは、何らかの生殖細胞株又は再構成されたマウス若しくはヒトの可変ドメインから得てもよく、又はマウス若しくはヒトの既知の可変ドメインのコンセンサス配列に基づいた合成可変ドメインであってよい。本発明のCDR配列(例えばCDR3)は、組換えDNA技術を用いて、CDR(例えばCDR3)が欠失した可変ドメインのレパートリーに導入しうる。
例えば、Marks et al(Bio/Technology,1992,10:779−783)が、抗体可変ドメインのレパートリーの作製方法を記載する。この方法では、抗体可変ドメイン領域の5末端に設定された、又は5末端と隣接するコンセンサスプライマーを、ヒトVH遺伝子の第3フレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーとともに用いることで、CDR3が欠失したVH可変ドメインのレパートリーを提供する。Marksらはさらに、このレパートリーを特定の抗体のCDR3と、どのように組み合わせることができるかについても記載する。類似技術を用いて、本発明のCDR3由来の配列を、CDR3を欠失したVH又はVLドメインのレパートリーと一緒にシャッフルし、シャッフルした完全なVH又はVLドメインを同族のVL又はVHドメインと組み合わせることにより、本発明の抗体を得られうる。さらに、レパートリーをWO92/01047のファージディスプレイシステム等の適当な宿主系に提示して、適当な抗体を選択しうる。レパートリーは、104を上回る個々の抗体、例えば106〜108又は1010の抗体由来のものからなり得る。
類似したシャッフリング技術又は組み合わせ技術はまた、Stemmer(Nature,1994,370:389−391)によっても開示されており、それには、β−ラクタマーゼ遺伝子と関連するDNAシャッフリング技術が示されるが、この方法を抗体の産生に用いうると記載する。
さらに他の方法では、1又はそれ以上の選択されたVH及び/又はVL遺伝子のランダム突然変異誘発を利用して、完全な可変ドメイン内に突然変異を起こして、本発明のCDR由来の配列を保持する新規のVH又はVL領域を作製する。当該技術は、Gram et al(1992,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,89:3576−3580)に記載されており、ここではエラープローンPCR法が用いられる。
もう一つの方法として、VH又はVL遺伝子のCDR領域に突然変異誘発を誘導する方法も用いうる。当該技術は、Barbas et al.(1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA、91:3809−3813)及びSchier et al.(1996,J.Mol.Biol.263:551−567)により開示される。
上記の技術はすべて当業者に公知であり、それ自体は本発明に属さない。当業者は、当該技術を用いることで、当技術分野での通常の方法論を用いて本発明の抗体を得られうるであろう。
エピトープ特異的抗体
本発明のさらなる態様はAxlエピトープに特異的な抗体を得る方法を提供する。この方法は、本明細書に指定されたVHドメインのアミノ酸配列における1又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、又は挿入により、VHドメインのアミノ酸変異体であるVHドメインを提供することと、場合により、このようにして提供されるVHドメインを1又はそれ以上のVLドメインと組み合わせることと、VHドメイン又はVH/VLの組み合わせ又は複数の組み合わせを試験して、Axlに特異的な抗体分子又は抗体抗原結合ドメインを同定することとを含む。前記VLドメインは、実質的に本明細書に指定されたアミノ酸配列を有しうる。
本発明のさらなる態様はAxlエピトープに特異的な抗体を得る方法を提供する。この方法は、本明細書に指定されたVHドメインのアミノ酸配列における1又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、又は挿入により、VHドメインのアミノ酸変異体であるVHドメインを提供することと、場合により、このようにして提供されるVHドメインを1又はそれ以上のVLドメインと組み合わせることと、VHドメイン又はVH/VLの組み合わせ又は複数の組み合わせを試験して、Axlに特異的な抗体分子又は抗体抗原結合ドメインを同定することとを含む。前記VLドメインは、実質的に本明細書に指定されたアミノ酸配列を有しうる。
目的とする抗体が結合するAxl上のエピトープと結合する抗体(例えば、10C9又は10G5抗体のAxlへの結合を阻止するもの)をスクリーニングするため、Antibodies.A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory.Ed Harlow and David Lane(1988)に記載される、通常のクロスブロッキングアッセイを実施しうる。
本明細書に開示されるVLドメインの1又はそれ以上の配列変異体を1又はそれ以上のVHドメインと組み合わせる類似の方法を用いてよい。
本発明のさらなる態様では、Axlに特異的な抗体を調製する方法を提供する。該方法は、
(a)CDR3が置換されるか、又はCDR3コード領域が欠失しているVHドメインをコードする核酸の出発レパートリーを提供すること;
(b)前記レパートリーを、VH CDR3について本明細書に実質的に指定されたアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせることにより、前記ドナー核酸をレパートリー内のCDR3領域に挿入し、それによりVHドメインをコードする核酸の産物レパートリーを提供すること;
(c)前記産物レパートリーの核酸を発現させること;
(d)Axlに特異的な抗体を選択すること;かつ
(e)前記抗体又はそれをコードする核酸を回収することと、を含む。
(a)CDR3が置換されるか、又はCDR3コード領域が欠失しているVHドメインをコードする核酸の出発レパートリーを提供すること;
(b)前記レパートリーを、VH CDR3について本明細書に実質的に指定されたアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせることにより、前記ドナー核酸をレパートリー内のCDR3領域に挿入し、それによりVHドメインをコードする核酸の産物レパートリーを提供すること;
(c)前記産物レパートリーの核酸を発現させること;
(d)Axlに特異的な抗体を選択すること;かつ
(e)前記抗体又はそれをコードする核酸を回収することと、を含む。
この場合も、CDR3が置換されるか、又はCDR3コード領域が欠失しているVLドメインをコードする核酸のレパートリーと本発明のVL CDR3を組み合わせる類似の方法を用いてよい。
同様に、1又はそれ以上、又は3つすべてのCDRをVH又はVLドメインのレパートリーに移植した後、それをスクリーニングし、Axlに特異的な単一の又は複数の抗体を検出してよい。
免疫グロブリンの可変ドメインの実質的な部分は、少なくとも3つのCDR領域に加え、それらを介在するフレームワーク領域を含む。好ましくは、この部分はまた、1番目及び4番目のフレームワーク領域のいずれか又は両方の少なくとも約50%を含み、この50%は、1番目のフレームワーク領域のC末端50%、及び4番目のフレームワーク領域のN末端50%である。可変ドメインの実質的な部分のN末端又はC末端に位置するその他の残基は、天然に存在する可変ドメイン領域には通常会合しないものであってよい。例えば、組換えDNA技術により作製される本発明の抗体の構築物は、クローニング又は他の操作工程を容易にするのに導入されるリンカーによりコードされるN又はC末端残基の導入をもたらす場合がある。他の操作工程は、以下により詳細するように免疫グロブリン重鎖、他の可変ドメイン(例えばダイアボディの産生における)又はタンパク質標識を含むさらなるタンパク質配列に、本発明の可変ドメインを連結するためにリンカーを導入することを含む。
本発明の好ましい態様では、VH及びVLドメインの対を含む抗体が好ましいが、VH又はVLドメイン配列のいずれかによる単一結合ドメインは、本発明のさらなる態様を構成する。単一免疫グロブリンドメイン、特にVHドメインは、特異的に標的抗原に結合できることが知られている。
いずれかの単一結合ドメインの場合、これらドメインを用いて、Axlに結合できる2ドメイン抗体を形成可能な相補的ドメインをスクリーニングしうる。
スクリーニングは、例えば、WO92/01047に開示される、いわゆる階層的二重コンビナトリアルアプローチを用いたファージディスプレイスクリーニング法により実現しうる。このアプローチでは、H鎖又はL鎖のいずれかのクローンを含む個他のコロニーを用いて他方の鎖(L又はH)をコードするクローンの完全なライブラリを感染させ、得られた二本鎖抗体を先の参考文献に記載のファージディスプレイ法に従って選択する。この技術は、Marksらの論文にも開示される。
本発明の抗体は、抗体定常領域又はその一部をさらに含んでよい。例えば、本発明の抗体は、CL、CH1、CH2及び/又はCH3ドメイン(又は、そのいずれかの組み合わせ)を含んでよい。VLドメインは、そのC末端で、ヒトCκ又はCλ鎖、好ましくはCκ鎖を含む抗体軽鎖定常領域に結合しうる。同様に、VHドメインによる抗体は、そのC末端で、いかなる抗体アイソタイプ、例えばIgG、IgA、IgE、及びIgM、並びにアイソタイプサブクラスのいずれかに由来する免疫グロブリン重鎖のすべて又は一部に結合しうる。WO99/58572に開示されるΔnab及びΔnac等のFc領域を用いてよい。
キメラ抗体、ヒト化抗体、CDR移植抗体
本明細書で用いられる場合、「キメラ」抗体又は「ヒト化」抗体又は「CDR移植」抗体は、非マウス、好ましくはヒト抗体由来の1種以上のタンパク質又はペプチドと組み合わせた、本明細書に記載する抗Axl抗体のいずれかの組み合わせ又はそれに由来する何らかのCDRを含む。
本明細書で用いられる場合、「キメラ」抗体又は「ヒト化」抗体又は「CDR移植」抗体は、非マウス、好ましくはヒト抗体由来の1種以上のタンパク質又はペプチドと組み合わせた、本明細書に記載する抗Axl抗体のいずれかの組み合わせ又はそれに由来する何らかのCDRを含む。
キメラ抗体又はヒト化抗体は、CDRが本明細書に記載する1又はそれ以上の抗Axl抗体に由来し、抗体の少なくとも一部又は残部が1又はそれ以上のヒト抗体から由来するものを含む。したがって、実質的にヒトに免疫原性がない、フレームワーク、CL(例えばCκ又はCλ)、CHドメイン(例えば、CH1、CH2、CH3)、ヒンジ領域が抗体のヒト部分に含まれていてよい。
ヒト抗体由来の抗体領域は、ヒト抗体と100%の同一性を有する必要はない。好ましい実施形態では、免疫原性を無視できるように、マウスのアミノ酸残基は可能な限りほとんど維持されないが、CDRにより形成される抗原結合部位を支持しつつ、同時に抗体のヒト化を最大化するため、マウス残基は必要に応じて保持されうる。当該変更又は変異は、非修飾抗体と比べて、ヒト又は他の種の免疫原性を場合により、及び好ましくは保持又は低減する。
尚、ヒト化抗体は、非ヒト動物、すなわち機能的に再編成されたヒト免疫グロブリン(例えば、重鎖及び/又は軽鎖)遺伝子を発現できる原核細胞又は真核細胞により産生しうる。さらに、抗体が単鎖抗体であるとき、抗体は本来のヒト抗体に存在しないリンカーペプチドを含みうる。例えば、scFvは、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とを接続するリンカーペプチド、例えば2〜約20のグリシン又は他のアミノ酸残基(好ましくはグリシン及びセリン残基(例えば、Gly4Ser又はGly2Serリピート))を含み得る。当該リンカーペプチドは、ヒトに非免疫原性であると考えられる。ある実施形態では、リンカーは少なくとも12アミノ酸長である。
抗体のヒト化は、例えば、個々のヒトフレームワークのプールにインフレーム融合された非ヒト標的モノクローナル抗体の6つすべてのCDRを含むコンビナトリアルライブラリを合成することにより実施しうる。すべての既知の重鎖及び軽鎖ヒト生殖細胞系配列を表す遺伝子を収容するヒトフレームワークライブラリを利用しうる。得られたコンビナトリアルライブラリをさらにスクリーニングして、目的とする抗原との結合を検出しうる。このアプローチは、親抗体に対する結合活性を維持するという観点から、完全なヒトフレームワークの最も好ましい組み合わせの選択が可能である。その後、ヒト化抗体を様々な技術によりさらに最適化しうる。
完全長抗体分子の場合、免疫グロブリン遺伝子をハイブリドーマ細胞株のゲノムDNA又はmRNAから得られうる。その抗体の重鎖及び軽鎖を哺乳動物のベクター系にクローニングする。アセンブリは、当技術分野で既知の方法を用いたシーケンシングにより確認する。抗体構築物は、他のヒト又は哺乳動物の宿主細胞系で発現させることができる。この構築物をさらに、目的とする発現抗体の一過性トランスフェクションアッセイ及びウェスタンブロット解析により検証しうる。迅速なアッセイ方法を用いて、最大の生産性を有する安定な細胞系を単離してスクリーニングしうる。
ヒト化抗体、断片及び領域の定常(C)領域をコードするヒト遺伝子は、既知の方法によるヒト胎児肝臓のライブラリに由来しうる。ヒトC領域遺伝子は、ヒト免疫グロブリンを発現して産生するものを含む、いかなるヒト細胞にも由来しうる。ヒトのCH領域は、γ、μ、α、δ、ε、及びそのサブクラス(例えばG1、G2、G3及びG4)を含むヒト重鎖の既知のクラス又はアイソタイプのいずれかに由来しうる。重鎖アイソタイプは抗体の様々なエフェクター機能の原因となるため、望ましいエフェクター機能、例えば補体結合又は抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性を基準としてCHドメインを選択する。好ましくは、CHドメインはガンマ1(IgG1)に由来する。
ヒトのCL領域は、ヒトL鎖アイソタイプ、カッパ又はラムダのいずれか、好ましくはカッパに由来しうる。
ヒト免疫グロブリンC領域をコードする遺伝子は、標準クローニング技術(Sambrook,et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)and Ausubel et al.,eds.Current Protocols in Molecular Biology(1987−1993))によりヒト細胞から得られる。ヒトC領域遺伝子は、2種類の軽鎖、5つのクラスの重鎖、及びそのサブクラスを表す遺伝子を含む既知のクローンから容易に得られうる。
キメラ抗体断片、例えばFab及びF(ab’)2は、適当に短縮されたキメラ重鎖遺伝子を設計することにより調製しうる。例えば、F(ab’)2断片の重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、短縮された分子を得るために、重鎖のCH1ドメイン及びヒンジ領域をコードするDNA配列に続いて、翻訳終止コドンを含み得る。
非ヒト抗体又はヒト抗体の遺伝子操作方法又はヒト化方法を用いることができ、当該方法は当技術分野において周知である。一般に、ヒト化抗体又は遺伝子操作抗体は、非ヒト起源、例えば、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類又はその他哺乳動物由来の1又はそれ以上のアミノ酸残基を有する。当該ヒトアミノ酸残基は「移入」残基と称されることが多く、通常は既知のヒト配列の「移入」可変ドメイン、定常ドメイン又はその他のドメインから得られる。既知のヒトIg配列は、例えば、www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi;www.atcc.org/phage/hdb.html;www.sciquest.com/;www.abcam.com/;www.antibodyresource.com/onlinecomp.html;www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html;www.mgen.uni−heidelberg.de/SD/IT/IT.html;www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm;www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html;www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/;www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/mikeimages.html;www.antibodyresource.com/;mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.www.immunologylink.com/;pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.html;www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/;www.pebio.com/pa/340913/340913.html;www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/;www.m.ehime−u.ac.jp/.about.yasuhito/Elisa.html;www.biodesign.com/table.asp;www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html;www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html;www.isac−net.org/sites_geo.html;aximt1.imt.uni−marburg.de/.about.rek/AEPStart.html;baserv.uci.kun.nI/.about.jraats/links1.html;www.recab.uni−hd.de/immuno.bme.nwvu.edu/;www.mrc−cpe.cam.ac.uk/imt−doc/public/INTRO.html;www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html;imgt.cnusc.fr:8104/;www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html;antibody.bath.ac.uk/;abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html;www.unizh.ch/.about.honegger/AHOseminar/SlideOI.html;www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/;www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm;www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html;www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html;www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html;www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Web−pages/Pept/spottech.html;www.jerini.de/fr_products.htm;www.patents.ibm.con/ibm.html、Kabat et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Dept.Health(1983)に開示されており、各々全体が参照により本明細書に組み込まれる。
当技術分野で既知のように、当該移入された配列を用いて、免疫原性を低減すること、又は結合性、親和性、結合速度、解離速度、結合活性、特異性、半減期又は他のいずれかの適当な特性を低減、増強若しくは調節しうる。一般に、可変領域及び定常領域の非ヒト配列はヒト又は他のアミノ酸と置換されるが、非ヒト又はヒトCDR配列は一部又はすべてが維持される。
また場合により、抗原に対する高親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持したまま、抗体をヒト化しうる。この目的を達成するために、場合により、親配列及びヒト化配列の3次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念的ヒト化産物を分析する過程を経て、ヒト化抗体を調製しうる。3次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者に熟知される。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な3次元コンフォメーション構造を図示して表示するコンピュータプログラムが提供される。この表示を精査することで、候補免疫グロブリン配列の機能において残基に見込まれる役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンの抗原結合能に影響する残基の分析が可能になる。このように、FR残基をコンセンサス配列及び移入配列から選択して組み合わせることにより、望ましい抗体特性、例えば標的抗原(複数可)に対する親和性の増加等が実現される。
一般にCDR残基は、抗原結合の作用に直接的かつ最も実質的に関与している。抗体のヒト化又は遺伝子操作は、既知のいずれかの方法を用いて実施しうる。例えば、以下に限定されないが、Winter et al.,Nature 321:522 1986);Riechmann et al.,Nature 332:323(1988);Verhoeyen et al.,Science 239:1534(1988)),Sims et al.,J.Immunol.151:2296(1993);Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901(1987),Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285(1992);Presta et al.,J.Immunol.151:2623(1993)、米国特許第5,723,323号、同第5,976,862号、同第5,824,514号、同第5,817,483号、同第5,814,476号、同第5,763,192号、同第5,723,323号、同第5,766,886号、同第5,714,352号、同第6,204,023号、同第6,180,370号、同第5,693,762号、同第5,530,101号、同第5,585,089号、同第5,225,539号;同第4,816,567号、PCT/:US98/16280、US96/18978、US91/09630、US91/05939、US94/01234、GB89/01334、GB91/01134、GB92/01755;WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430、EP229246に記載されるものである。
ヒト化抗体のヒト定常領域は、いかなるクラス又はアイソタイプ(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD等)でもあり得、カッパ又はラムダ軽鎖を含み得る。一実施形態では、ヒト定常領域は、IgG重鎖又は定義済み断片、例えば、IgGサブクラスであるIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のうち、少なくとも1つを含む。
標識抗体
本発明の抗体は、検出可能又は機能的標識で標識してよい。検出可能標識には、[131I]又は[99Tc]等の放射性標識を含み、放射性免疫複合体の技術分野で既知の従来の化学的方法を用いて、これら標識を本発明の抗体に結合させることができる。標識はまた、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素標識を含む。さらに標識は、特異的同族の検出可能部分、例えば、標識されたアビジン又はストレプトアビジンへの結合により検出できるビオチン等の化学成分を含む。好ましくは、標識は蛍光標識、例えばFITCを含む。
本発明の抗体は、検出可能又は機能的標識で標識してよい。検出可能標識には、[131I]又は[99Tc]等の放射性標識を含み、放射性免疫複合体の技術分野で既知の従来の化学的方法を用いて、これら標識を本発明の抗体に結合させることができる。標識はまた、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素標識を含む。さらに標識は、特異的同族の検出可能部分、例えば、標識されたアビジン又はストレプトアビジンへの結合により検出できるビオチン等の化学成分を含む。好ましくは、標識は蛍光標識、例えばFITCを含む。
有機部分
本発明の修飾抗体及び抗原結合性断片は、抗体と直接的又は間接的に共有結合される1又はそれ以上の有機部分を含みうる。本明細書に記載する抗体又は抗原結合性断片に結合される各有機部分は、独立して親水性ポリマー基、脂肪酸基又は脂肪酸エステル基でありうる。本明細書で用いられる場合、用語「脂肪酸」は、モノカルボン酸及びジカルボン酸を包含する。「親水性ポリマー基」は、本明細書でこの用語が用いられる場合、オクタンよりも水に溶解しやすい有機ポリマーをいう。例えば、ポリリジンは、オクタンよりも水に溶解しやすい。したがって、ポリリジンの共有結合により修飾された抗体は本開示に包含される。本明細書に記載する抗体の修飾に適した親水性ポリマーは、直鎖状でも分枝鎖状でよく、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、モノメトキシ−ポリエチレングリコール(mPEG)、PPG等のポリアルカングリコール、炭水化物(例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖類等)、親水性アミノ酸のポリマー(例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアスパルテート等)、ポリアルカン酸化物(例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド等)及びポリビニルピロリドンがあげられる。好ましくは、本明細書に記載する抗体を修飾する親水性ポリマーの分子量は、独立した分子実体として約800〜約150,000ダルトンである。例えば、PEG5000及びPEG20,000を用いてよく、この添字がポリマー平均分子量(ダルトン)である。親水性ポリマー基は、1〜約6個のアルキル基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基と置換されうる。脂肪酸基又は脂肪酸エステル基と置換される親水性ポリマーは、適当な方法を用いて調製しうる。例えば、アミン基を含むポリマーを、脂肪酸又は脂肪酸エステルのカルボキシレートと結合することができ、脂肪酸又は脂肪酸エステルの活性化カルボキシレート(例えば、N,N−カルボニルジイミダゾールで活性化されたもの)をポリマーのヒドロキシル基と結合しうる。
本発明の修飾抗体及び抗原結合性断片は、抗体と直接的又は間接的に共有結合される1又はそれ以上の有機部分を含みうる。本明細書に記載する抗体又は抗原結合性断片に結合される各有機部分は、独立して親水性ポリマー基、脂肪酸基又は脂肪酸エステル基でありうる。本明細書で用いられる場合、用語「脂肪酸」は、モノカルボン酸及びジカルボン酸を包含する。「親水性ポリマー基」は、本明細書でこの用語が用いられる場合、オクタンよりも水に溶解しやすい有機ポリマーをいう。例えば、ポリリジンは、オクタンよりも水に溶解しやすい。したがって、ポリリジンの共有結合により修飾された抗体は本開示に包含される。本明細書に記載する抗体の修飾に適した親水性ポリマーは、直鎖状でも分枝鎖状でよく、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、モノメトキシ−ポリエチレングリコール(mPEG)、PPG等のポリアルカングリコール、炭水化物(例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖類等)、親水性アミノ酸のポリマー(例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアスパルテート等)、ポリアルカン酸化物(例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド等)及びポリビニルピロリドンがあげられる。好ましくは、本明細書に記載する抗体を修飾する親水性ポリマーの分子量は、独立した分子実体として約800〜約150,000ダルトンである。例えば、PEG5000及びPEG20,000を用いてよく、この添字がポリマー平均分子量(ダルトン)である。親水性ポリマー基は、1〜約6個のアルキル基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基と置換されうる。脂肪酸基又は脂肪酸エステル基と置換される親水性ポリマーは、適当な方法を用いて調製しうる。例えば、アミン基を含むポリマーを、脂肪酸又は脂肪酸エステルのカルボキシレートと結合することができ、脂肪酸又は脂肪酸エステルの活性化カルボキシレート(例えば、N,N−カルボニルジイミダゾールで活性化されたもの)をポリマーのヒドロキシル基と結合しうる。
本発明に記載される抗体の修飾に適した脂肪酸及び脂肪酸エステルは、飽和されていても、又は1又はそれ以上の不飽和単位を含有していてよい。本発明に記載される抗体の修飾に適した脂肪酸としては、例えば、n−ドデカン酸(C12、ラウリン酸)、n−テトラデカン酸(C14、ミリスチン酸)、n−オクタデカン酸(C18、ステアリン酸)、n−エイコサン酸(C20、アラキジン酸)、n−ドコサン酸(C22、ベヘン酸)、n−トリアコンタン酸(C30)、n−テトラコンタン酸(C40)、cis−δ 9−オクタデカン酸(C18、オレイン酸)、全cis−δ 5,8,11,14−エイコサテトラエン酸(C20、アラキドン酸)、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸等があげられる。好適な脂肪酸エステルとしては、直鎖又は分枝鎖の低級アルキル基を含むジカルボン酸のモノエステルがあげられる。低級アルキル基は、1〜約12個、好ましくは1〜約6個の炭素原子を含みうる。
修飾ヒト抗体及び抗原結合性断片は、好適な方法を用いて、例えば1又はそれ以上の修飾剤との反応により調製しうる。本明細書で用いられる用語「修飾剤」は、活性基を含む好適な有機基(例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル)をいう。「活性基」とは、適当な条件下で第2の化学基と反応でき、その反応により修飾剤と第2の化学基との間に共有結合が形成される化学的部分又は官能基である。例えば、アミン反応性活性基としては、トシレート、メシレート、ハロ(クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード)、N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル(NHS)等の求電子性基があげられる。チオールと反応しうる活性基としては、例えば、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロイル(acrylolyl)、ピリジルジスルフィド、5−チオール−2−ニトロ安息香酸チオール(TNB−チオール)等があげられる。アルデヒド官能基は、アミン又はヒドラジド含有分子と結合することができ、アジド基は、三価リン基と反応して、ホスホロアミダート又はホスホロイミド結合を形成しうる。活性基を分子に導入する好適な方法は、当技術分野で公知である(例えば、Hernanson,G.T.,Bioconjugate Techniques,Academic Press:San Diego,Calif.(1996)を参照)。活性基は、有機基(例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル)と、直接又はリンカー部分、例えば、二価のC1−C12基(この基は、1個以上の炭素原子が酸素、窒素、又はイオウ等のヘテロ原子と置換されうる)を介して結合しうる。好適なリンカー部分としては、例えば、テトラエチレングリコール、−(CH2)3−、−NH−(CH2)6−NH−、−(CH2)2−NH−、及び−CH2−O−CH2−CH2−O−CH2−CH2−O−CH−NH−があげられる。リンカー部分を含む修飾剤は、例えば、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)の存在下で、モノ−Boc−アルキルジアミン(例えば、モノ−Boc−エチレンジアミン、モノ−Boc−ジアミノへキサン)を脂肪酸と反応させ、遊離アミンと脂肪酸カルボキシレートとの間のアミド結合を形成することにより生成しうる。Boc保護基をトリフルオロ酢酸(TFA)処理により生成物から除去して一級アミンを露出させ、これを記載されるように他のカルボキシレートと結合すること、又は無水マレイン酸と反応させ、得られた生成物を環化して脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成しうる。(例えば、Thompson、et al.,WO92/16221を参照のこと)。
本発明の修飾抗体は、また、ヒト抗体又は抗原結合断片を修飾剤と反応させることにより作製しうる。例えば、アミン反応性修飾剤、例えば、PEGのNHSエステルを用いることにより、有機部分を非部位特異的方法で抗体と結合させることができる。抗体又は抗原結合断片のジスルフィド結合(例えば鎖内ジスルフィド結合)を還元することにより、修飾ヒト抗体又は抗原結合断片を調製しうる。このとき、還元された抗体又は抗原結合断片をチオール反応性修飾剤と反応させて、本明細書に記載される修飾抗体を作製しうる。本明細書に記載される抗体の特異的部位と結合する、有機部分を含んだ修飾ヒト抗体及び抗原結合断片は、好適な方法、例えば、タンパク質分解の逆反応(Fisch et al.,Bioconjugate Chem.,3:147−153(1992);Werlen et al.,Bioconjugate Chem.,5:411−417(1994);Kumaran et al.,Protein Sci.6(10):2233−2241(1997);Itoh et al.,Bioorg.Chem.,24(1):59−68(1996);Capellas et al.,Biotechnol.Bioeng.,56(4):456−463(1997))、及びHermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques,Academic Press:San Diego,Calif.(1996)に記載の方法等を用いて調製しうる。
免疫複合体
本発明はまた、1種以上の細胞毒性剤、例えば化学療法剤若しくは化学療法薬、成長阻害剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌性の酵素活性毒素、真菌、植物若しくは動物起源、又はそれらの断片)又は放射性同位体と複合体化された、本明細書の抗Axl抗体を含む免疫複合体を提供する。
本発明はまた、1種以上の細胞毒性剤、例えば化学療法剤若しくは化学療法薬、成長阻害剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌性の酵素活性毒素、真菌、植物若しくは動物起源、又はそれらの断片)又は放射性同位体と複合体化された、本明細書の抗Axl抗体を含む免疫複合体を提供する。
一実施形態では、免疫複合体は、抗体が1種以上の薬物と複合体化された、抗体−薬物複合体(ADC)であり、例えば薬物としては、以下に限定されないが、メイタンシノイド(米国特許第5,208,020号、同第5,416,064号、及び欧州特許0425235を参照);アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチン薬部分DE及びDF(MMAE及びMMAF)(米国特許第5,635,483号及び第5,780,588号及び第7,498,298号を参照);ドラスタチン;カリケアマイシン又はその誘導体その(米国特許第5,712,374号、同第5,714,586号、同第5,739,116号、同第5,767,285号、同第5,770,701号、同第5,770,710号、同第5,773,001号及び同第5,877,296号;Hinman et al.,Cancer Res.53:3336−3342(1993);及びLode et al.,Cancer Res.58:2925−2928(1998)を参照);アントラサイクリン、例えばダウノマイシン又はドキソルビシン(Kratz et al.,Current Med.Chern.13:477−523(2006);Jeffrey et al.,Bioorganic&Med.Chern.Letters 16:358−362(2006);Torgov et al.,Bioconj.Chern.16:717−721(2005);Nagy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829−834(2000);Dubowchik et al.,Bioorg.&Med.Chern.Letters 12:1529−1532(2002);King et al.,J.Med.Chern.45:4336−4343(2002);及び米国特許第6,630,579号を参照);メトトレキサート;ビンデシン;タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル;トリコテセン及びCC1065があげられる。
他の実施形態では、免疫複合体は、酵素活性毒素又はその断片と複合体化された、本明細書に記載される抗体を含み、酵素活性毒素としては、以下に限定されないが、ジフテリア毒素A鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素A鎖(Pseudomonas aeruginosa由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ−サルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質(P API、P APII及びPAP−S)、momordica charantia阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンがあげられる。
他の実施形態では、免疫複合体は、放射性原子と複合体化されて放射性免疫複合体を形成する、本明細書に記載される抗体を含む。本発明の放射性免疫複合体の作製に様々な放射性同位体を利用できる。例としては、[211At]、[131I]、[125I]、[90Y]、[186Re]、[188Re]、[153Sm]、[212Bi]、[32P]、[212Pb]及びLuの放射性同位体があげられる。放射性免疫複合体を検出に用いる場合、免疫複合体には、シンチグラフィー検査用の放射性原子、例えば[99Tc]又は[123I]、又は核磁気共鳴(NMR)イメージング(別名、磁気共鳴イメージング、MRI)用のスピン標識、例えば同じくヨウ素−123、ヨウ素−131、インジウム−111、フッ素−19、炭素−13、窒素−15、酸素−17、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
抗体と細胞毒性剤との複合体は、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばN−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)、スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(SMCC)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(例えばジメチルアジプイミデートHCl)、活性エステル(例えばジスクシンイミジルスベレート)、アルデヒド(例えばグルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えばビス(p−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス−ジアゾニウム誘導体(例えばビス−(p−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えばトルエン2,6−ジイソシアネート)及びビス活性フッ素化合物(例えば1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼン)を用いて作製しうる。例えば、リシンイムノトキシンは、Vitetta et al.(Science 238:1098(1987))に記載のように調製しうる。炭素−14で標識した1−イソチオシアナトベンジル−3−メチルジエチレン・トリアミンペンタ酢酸(MXDTPA)は、抗体と放射性ヌクレオチドを複合体化するキレート剤の典型例である。WO94/11026を参照のこと。本発明のリンカーは、細胞の細胞毒性薬の放出が容易である「切断可能なリンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー(Chari et al.,Cancer Res.52:127−131(1992);米国特許第5,208,020号)を用いうる。
本明細書の免疫複合体又はADCは、限定されないが、例えばBMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC−SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ−EMCS、スルホ−GMBS、スルホ−KMUS、スルホ−MBS、スルホ−SlAB、スルホ−SMCC及びスルホ−SMPB)並びにSVSB(スクシンイミジル−(4−ビニルスルホン)ベンゾエート)を含むがこれに限定されない(例えばPierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL,U.S.Aから)市販される架橋試薬を用いて調製された、当該複合体を明示的に企図する。
グリコシル化変異体
ある特定の実施形態では、本明細書で提供する抗体を改変して、抗体がグリコシル化される範囲が増減される。1又はそれ以上のグリコシル化部位が生成又は削除されるようにアミノ酸配列を改変することにより、抗体に対するグリコシル化部位の付加又は除去を好都合に達成しうる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供する抗体を改変して、抗体がグリコシル化される範囲が増減される。1又はそれ以上のグリコシル化部位が生成又は削除されるようにアミノ酸配列を改変することにより、抗体に対するグリコシル化部位の付加又は除去を好都合に達成しうる。
抗体がFc領域を含む場合、Fc領域と結合する炭水化物を変更しうる。哺乳動物細胞により産生される本来の抗体は通常、一般にFc領域のCH2ドメインのAsn297にN結合で結合している、分枝状の二分岐オリゴ糖を含む。Wright et al.TIBTECH 15:26−32(1997)を参照のこと。オリゴ糖は様々な炭水化物、例えば、マンノース、N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」にあるGlcNAcに結合しているフコースを含み得る。ある実施形態では、特定の特性が改善された抗体変異体を作製するために、本発明の抗体のオリゴ糖に修飾を施しうる。
一実施形態では、Fc領域に(直接的又は間接的に)結合するフコースがない炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、当該抗体ではフコースの量を1%〜80%、1%〜65%、5%〜65%又は20%〜40%にしうる。フコースの量は、例えば、WO2008/077546に記載のように、MALDI−TOF質量分析法により測定される、Asn297に結合した糖鎖構造(例えば、複合型、混合型、及び高マンノース構造)すべての合計と比較した、Asn297にある糖鎖内のフコースの平均量を算出することにより決定される。Asn297は、Fc領域のおよそ297の位置(Fc領域残基のEu番号付け)に位置するアスパラギン残基をいう。ただし、Asn297はまた、抗体の軽微な配列変異により、位置297のおよそ±3アミノ酸上流又は下流、すなわち位置294と300との間に位置する場合もある。当該フコシル化変異体は、ADCC機能を改善しうる。例えば、米国特許公開US2003/0157108(Presta、L.);US2004/0093621(Kyowa Haklw Kogyo Co.,Ltd)を参照のこと。「非フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連した刊行物の例としては、以下があげられる:US2003/01571;WO2000/61739;WO2001/29246;US2003/0115614;US2002/0164328;US2004/0093621;US2004/0132140;US2004/0110704;US2004/0110282;US2004/0109865;WO2003/085119;WO2003/084570;WO2005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazaki et al.J.Mol.Biol.336:1239−1249(2004);Yamane−Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614(2004)。
非フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているLec13 CHO細胞(Ripka et al.Arch.Biochem.Biophys.249:533−545(1986);米国特許出願公開2003/0157108,Presta,L;及びWO2004/056312 A1,Adams et al.、特に実施例11)、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ−1,6−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、FUT8、ノックアウトCHO細胞(例えば、Yamane−Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614(2004);Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680−688(2006);及びWO2003/085107)を参照)があげられる。
さらに、例えば、抗体のFc領域に結合した二分岐オリゴ糖がGlcNAcにより二分されるバイセクティングオリゴ糖をもつ抗体変異体を提供する。当該抗体変異体は、フコシル化を減少させ得る、及び/又はADCC機能を改善しうる。当該抗体変異体の例は、例えばWO2003/011878(Jean Mairet et al.);米国特許第6,602,684号(Umana et al.);及びUS2005/0123546(Umana et al.)に記載される。Fe領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも1つのガラクトース残基を持つ抗体変異体もまた提供される。当該抗体変異体はCDC機能を改善しうる。当該抗体変異体は、例えばWO1997/30087(Patel et al.);WO1998/58964(Raju,S.);及びWO1999/22764(Raju,S.)に記載される。
Fc領域変異体
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体のFc領域に1又はそれ以上のアミノ酸改変を導入し、それによりFc領域変異体を生成しうる。Fc領域の変異体は、1又はそれ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変(例えば置換)を含むヒトFc領域の配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のFc領域)を含み得る。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体のFc領域に1又はそれ以上のアミノ酸改変を導入し、それによりFc領域変異体を生成しうる。Fc領域の変異体は、1又はそれ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変(例えば置換)を含むヒトFc領域の配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のFc領域)を含み得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、すべてではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を企図し、これはインビボでの抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能(例えば補体結合及びADCC等)は不要又は有害であるような用途に望ましい候補となる。インビトロ及び/又はインビボで細胞毒性アッセイを実施すると、CDC活性及び/又はADCC活性の低減/枯渇を確認しうる。例えば、Fc受容体(FcR)結合アッセイを実施して、抗体がFcγ結合を欠失している(それゆえ、ADCC活性の欠失が見込まれる)が、FcRn結合能は保持していることを確認しうる。ADCC、NK細胞を媒介する初代細胞は、FcγRIIIのみを発現するが、単球はFcγRI、FcγRII及びFcγRIIIを発現する。造血細胞でのFcRの発現については、Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457−492(1991)の464ページ、表3に要約される。目的とする分子のADCC活性を評価するインビトロアッセイの非限定的な例が、米国特許第5,500,362号(例えば、Hellstrom,I.et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059−7063(1986)を参照)及びHellstrom,I et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499−1502(1985);5,821,337(Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166:1351−1361(1987)を参照)に記載される。あるいは、非放射性アッセイ法を用いうる(例えば、フローサイトメトリー用のACTI(商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA);及びCytoTox96(登録商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(Promega,Madison,WI)を参照)。当該アッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(PBMC)及びナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、目的とする分子のADCC活性を、Clynes et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652−656(1998)に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価しうる。また、C1q結合アッセイを実施して、抗体がC1qを結合できず、その結果、補体依存性細胞傷害(CDC)活性を欠失していることを確認しうる。例えば、WO2006/029879及びWO2005/100402のC1q及びC3c結合ELISAを参照のこと。補体活性化を評価するために、CDCアッセイを実施してよい(例えば、Gazzano−Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996);Cragg,M.S.et al.,Blood 101:1045−1052(2003);及びCragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103:2738−2743(2004)を参照)。また、FcRn結合及びインビボクリアランス/半減期のFc測定を、当技術分野で既知の方法を用いて実施しうる(例えば、Petkova,S.B.et al.,Int’l.Immunol.18(12):1759−1769(2006)を参照)。
エフェクター機能が減少した抗体としては、Fc領域の残基238、265、269、270、297、327及び329のうち、1又はそれ以上の置換があるものがあげられる(米国特許第6,737,056号)。当該Fc変異体としては、アミノ酸265、269、270、297及び327位のうち、2又はそれ以上が置換されたFc変異体があげられ、残基265及び297がアラニンに置換された、いわゆる「DANA」Fc突然変異体を含む(米国特許第7,332,581号)。
FcRへの結合を改善又は減少させた特定の抗体変異体が記載される(例えば、米国特許第6,737,056号;WO2004/056312、及びShields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591−6604(2001)を参照)。
ある特定の実施形態では、抗体変異体は、ADCC活性を改善する1又はそれ以上のアミノ酸置換、例えば、Fc領域の298位及び/又は333位(残基のEU番号付け)が置換されたFc領域を含む。
ある実施形態では、例えば、米国特許第6,194,551号、WO99/51642、及びIdusogie et al.J.Immunol.164:4178−4184(2000)に記載されるように、C1q結合及び/又はCDC活性が変化(すなわち改善又は減少)するようにFc領域が改変される。
半減期が増加し、胎児への母体IgGの移送を担う新生児Fc受容体(FcRn)への結合が改善された抗体(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)及びKim et al.,J.Immunol.24:249(1994))が、US2005/0014934A1(Hinton et al.)に記載される。当該抗体は、FcRnへのFc領域の結合を改善する1又はそれ以上の置換を有するFc領域を含む。当該Fc変異体には、Fc領域残基:238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424又は434の1又はそれ以上の置換、例えば、Fc領域の残基434が置換されたものが含まれる(米国特許第7,371,826号)。その他のFc領域変異体の例に関しては、Duncan&Winter,Nature 322:738−40(1988);米国特許第5,648,260号;米国特許第5,624,821号;及びWO94/29351も参照のこと。
システイン操作抗体変異体
ある特定の実施形態では、抗体の1又はそれ以上の残基がシステイン残基と置換されるシステイン操作抗体、例えば「thioMAb」を作製することが望ましい場合がある。
ある特定の実施形態では、抗体の1又はそれ以上の残基がシステイン残基と置換されるシステイン操作抗体、例えば「thioMAb」を作製することが望ましい場合がある。
特定の実施形態では、残基の置換は、抗体の接触可能な部位で生じる。この残基をシステインと置換すると、接触可能な抗体部位に反応性チオール基が配置されるため、これを利用して、例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分等の他の部分と抗体を複合体化し、本明細書でさらに記載される免疫複合体を作製しうる。ある特定の実施形態では、以下のいずれか1又はそれ以上の残基をシステインと置換しうる:軽鎖のV205(Kabat番号付け);重鎖のA118(EU番号付け);及び重鎖Fc領域のS400(EU番号付け)。システイン操作抗体は、例えば米国特許第7,521,541号に記載のように生成しうる。
診断方法及び治療方法
本発明の抗体は、ヒト又は動物対象、好ましくはヒトの診断方法又は治療方法に用いられるように設計される。
本発明の抗体は、ヒト又は動物対象、好ましくはヒトの診断方法又は治療方法に用いられるように設計される。
したがって、本発明のさらなる態様は、提供される抗体を1種以上の試薬、例えばFITC等の検出可能な標識と複合体化して投与することを含む、診断方法を提供する。提供される抗体を用いて、迅速性と信頼性のある、生検組織由来がん細胞の検査を開発しうる。例えば、体液、例えば血液又はリンパ中に循環している循環腫瘍細胞等の転移性がん細胞を発見しうる検査に本抗体を用いうる。目的とする他のがんとして、乳がん、肺がん、胃がん、頭頸部がん、大腸がん、腎臓がん、膵臓がん、子宮がん、肝臓がん、膀胱がん、子宮内膜がん及び前立腺がん、並びにリンパ腫(例えば、非ホジキンリンパ腫、NHL)及び白血病(特に急性骨髄性白血病、AML)があげられる。
本発明のさらなる態様は、提供される抗体の投与を含む治療方法、当該抗体を含む医薬組成物、治療方法に用いられる本明細書に記載される抗体、本明細書に記載される特定の臨床的徴候の治療方法に用いられる本明細書に記載される抗体、及び投与用医薬品の製造への当該抗体の使用、例えば、抗体を薬学的に許容される賦形剤とともに本抗体を製剤化することを含む医薬品又は医薬組成物の製造方法での使用を提供する。
臨床的徴候
ヒトAxlに対して高特異性を有する抗体を用いることで、臨床的利点が得られる臨床的徴候には、Axlが過剰発現している病状、又はAxl拮抗作用が臨床的利点をもたらす病状のいずれをも含む。当該徴候としては、免疫不全、心臓血管疾患、血栓症、糖尿病、免疫チェックポイント障害、線維性障害(線維症)又は増殖性疾患、例えばがん、特に転移性がんがあげられる。さらに、Axlは上皮起源の多くのがんに関与することが知られている。
ヒトAxlに対して高特異性を有する抗体を用いることで、臨床的利点が得られる臨床的徴候には、Axlが過剰発現している病状、又はAxl拮抗作用が臨床的利点をもたらす病状のいずれをも含む。当該徴候としては、免疫不全、心臓血管疾患、血栓症、糖尿病、免疫チェックポイント障害、線維性障害(線維症)又は増殖性疾患、例えばがん、特に転移性がんがあげられる。さらに、Axlは上皮起源の多くのがんに関与することが知られている。
目的とする線維性障害としては、斜視(strabmisus)、強皮症、ケロイド、腎性全身性線維症、肺線維症、特発性肺胞線維症(IPF)、嚢胞性線維症(CF)、全身性硬化症、心臓線維症、非アルコール性脂肪肝炎(NASH)、それ以外の種類の肝線維症、原発性胆汁性胆管炎、腎線維症、がん及びアテローム性動脈硬化症があげられる。当該疾患では、組織内での線維症の慢性的発現が、罹患した臓器の構造を著しく変化させ、それに続く臓器能不全を引き起こす。当該臓器の持続的消耗過程の結果、線維症を伴う疾患の多くは、進行性の病状であることが多く、長期的な予後不良を有する(Rockey,D.C.,Bell,P.D.and Hill,J.A.(2015),N.Engl.Med.,Vol.372,pp.1138−1149を参照)。
目的とする免疫チェックポイント傷害としては、慢性ウイルス感染症、黒色腫、大腸がん、乳がん、卵巣がん、非小細胞肺がん(NSCLC)、前立腺がん、腎細胞がん、膵臓がん、食道がん、膀胱がん、骨髄腫、腎臓がん、膀胱がん、脳腫瘍及びリンパ腫があげられる。
目的とするがんとしては、白血病(例えば、限定されないが、急性白血病、急性リンパ性白血病)、急性骨髄性白血病(例えば、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤芽球性白血病及び骨髄異形成症候群)、慢性白血病(例えば、限定されないが、慢性骨髄性(顆粒球性)白血病、慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病);真性多血症;リンパ腫(例えば、限定されないが、ホジキン病、非ホジキン病);多発性骨髄腫(例えば、限定されないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞性白血病、孤立性形質細胞腫及び髄外性形質細胞腫);ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症症;意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症;良性単クローングロブリン血症;重鎖病;骨及び結合組織肉腫(例えば、限定されないが、骨腫瘍、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟組織肉腫、血管肉腫(血管内皮腫)、線維肉腫、カポシ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、転移性がん、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫);脳腫瘍(例えば、限定されないが、神経膠腫、膠芽腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、乏突起神経膠腫、非グリア腫瘍、聴神経腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫及び原発性脳リンパ腫);乳がん(例えば、限定されないが、腺がん、小葉(小細胞)がん、乳管内がん、髄様乳がん、粘液性乳がん、管状乳がん、乳頭状乳がん、原発性がん、ページェット病及び炎症性乳がん);副腎がん(例えば、限定されないが、クロム親和性細胞腫及び副腎皮質がん);甲状腺がん(例えば、限定されないが、乳頭状又は濾胞性甲状腺がん、甲状腺髄様悪性腫瘍、甲状腺髄様がん及び甲状腺未分化がん);GIST−消化管間質腫瘍;膵臓がん(例えば、限定されないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍及びカルチノイド又は膵島細胞腫瘍);下垂体がん(例えば、限定されないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症及び尿崩症);眼のがん(例えば、限定ないが、眼内黒色腫(例えば、虹彩黒色腫、脈絡膜悪性黒色腫及び毛様体黒色腫)及び網膜芽細胞腫);膣がん(例えば、扁平上皮がん、腺がん及び黒色腫);外陰がん(例えば、扁平上皮がん、黒色腫、腺がん、基底細胞がん、肉腫及びページェット病);子宮頸がん(例えば、限定されないが、扁平上皮がん及び腺がん);子宮がん(例えば、限定されないが、子宮内膜がん及び子宮肉腫);卵巣がん(例えば、限定されないが、卵巣上皮がん、境界腫瘍、胚細胞腫瘍及び間質腫瘍);食道がん(例えば、限定されないが、扁平上皮がん、腺がん、腺様嚢胞がん、粘表皮がん、腺扁平上皮がん、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、いぼ状がん及び燕麦細胞(小細胞)がん);胃がん(例えば、限定されないが、腺がん、菌状(ポリープ状)、潰瘍性、表在拡大型、びまん性拡大型、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫及びがん肉腫);結腸がん;直腸がん;肝臓がん(例えば、限定されないが、肝細胞がん及び肝芽細胞腫)、胆嚢がん(例えば、腺がん);胆管がん(例えば、限定されないが、乳頭状、結節状及びびまん性);肺がん(例えば、非小細胞肺がん(NSCLC)、扁平上皮がん(類表皮がん)、腺がん、大細胞がん及び小細胞肺がん(SCLC));精巣がん(例えば、限定されないが、生殖細胞腫瘍、精上皮腫、未分化、古典的(定型)、精母細胞性、非精上皮腫性、胎生期がん、奇形がん、絨毛がん(卵黄嚢腫瘍))、前立腺がん(例えば、限定されないが、腺がん、平滑筋肉腫及び横紋筋肉腫);生殖器がん(例えば、陰茎がん);口腔がん(例えば、限定されないが、扁平上皮がん);基底がん;唾液腺がん(例えば、限定されないが、腺がん、粘表皮がん及び腺様嚢胞がん);咽頭がん(例えば、限定されないが、扁平上皮がん及びいぼ状がん);皮膚がん(例えば、限定されないが、基底細胞がん、扁平上皮がん及び黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫);腎臓がん(例えば、限定されないが、腎細胞がん、腎明細胞がん、腺がん、腎細胞腫、線維肉腫、移行上皮がん(腎盂及び/又は尿管));ウィルムス腫瘍;膀胱がん(例えば、限定されないが、移行上皮がん;扁平上皮がん、腺がん、がん肉腫)があげられる。加えて、がんには、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽細胞腫、上皮がん、嚢胞腺がん、気管支原性がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん及び乳頭腺がんがあげられる。好ましくは、がんは乳がん、黒色腫、前立腺がん、卵巣がん、大腸がん、肺がん又は神経膠腫がんから選択される。より好ましくは、がんは転移性乳がん又は肺がんである。循環腫瘍細胞の標的化及び治療を想定する。
転移がんの治療は、原発腫瘍の位置に応じて異なる。乳がんが例えば肺まで拡大した場合であっても、依然それは乳がんであり、がんが現在、肺にあるという事実によってではなく、乳房内を起源とする転移がんにより治療が決定される。約5パーセントの確率で、転移がんが発見されても、原発腫瘍を特定できない場合がある。そのような転移がんの治療は、その起源ではなくその箇所に従って行う。転移がんは起源腫瘍(既知である場合)の組織により命名される。例えば、脳に拡大した乳がんは脳転移乳がんと呼ばれる。
本発明による抗Axl治療を利用すると、Axlが過剰発現する病状、又はAxl拮抗作用により臨床的利点が得られる病状がある患者に明らかな利点をもたらしうる。治療は、注射(例えば静脈内)により又は局所送達方法により行いうる。提供される抗体は、また、標的組織への医薬組成物の送達の誘導に用いることも、又は例えば、循環腫瘍細胞(CTC)又はその他の転移細胞を標的とするため全身的に用いうる。
本発明のさらなる態様では、対象のがん幹細胞を阻害する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載される抗体(又は、その複合体)に対象を接触させることを含む。当該方法に用いられる抗体及び複合体も想定される。
EGFRの拮抗作用
本発明はまた、本明細書に開示されるいずれかの有効量の抗Axl抗体を個体に投与し、構成的Axlを阻害することを含む、構成的Axl活性の阻害方法を提供する。
本発明はまた、本明細書に開示されるいずれかの有効量の抗Axl抗体を個体に投与し、構成的Axlを阻害することを含む、構成的Axl活性の阻害方法を提供する。
一態様では、本発明は、EGFR活性化突然変異又はEGFR遺伝子増幅と関連するがんに罹患している対象の治療方法であって、該対象はEGFRアンタゴニストによる治療に耐性を発現し、該治療方法には、対象がAxl発現、Axl活性化突然変異又はAxl遺伝子増幅を有するかどうかを特定することと、Axl活性化突然変異又はAxl遺伝子増幅を有する該対象に、EGFRアンタゴニスト及び本明細書に記載されるいずれかの抗Axl抗体を投与することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、EGFR活性化突然変異又はEGFR遺伝子増幅と関連するがんに罹患している対象の治療方法であって、(i)EGFRアンタゴニストによる治療を受けている対象をモニタリングし、対象がAxl発現、Axl活性化突然変異又はAxl遺伝子増幅を発現しているかどうかを特定すること、(ii)対象がAxl活性化突然変異又はAxl遺伝子増幅を発現している場合に、EGFRアンタゴニストに加えて、本明細書に記載される抗Axl抗体のいずれかを含むように対象の治療計画を変更することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、EGFR活性化突然変異又はEGFR遺伝子増幅と関連するがんに罹患している対象の治療方法であって、(i)EGFRアンタゴニストによる治療を受けている対象をモニタリングし、対象が阻害剤に対する耐性を発現しているかどうかを特定することと、(ii)対象を検査して、対象がAxl発現、Axl活性化突然変異又はAxl遺伝子増幅を有しているかどうかを特定することと、(iii)対象がAxl活性化突然変異又はAxl遺伝子増幅を有している場合に、EGFRアンタゴニストに加えて、本明細書に記載される抗Axl抗体のいずれかを含むように対象の治療計画を変更することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、EGFRアンタゴニストの評価方法であって、(i)EGFRアンタゴニストによる治療を受けている集団をモニタリングし、治療薬に対する耐性を発現している対象を同定することと、(ii)耐性のある対象を検査して、各対象がAxl発現、Axl活性化突然変異又はAxl遺伝子増幅を有しているかどうかを特定することと、(iii)対象がAxl発現、Axl活性化突然変異又はAxl遺伝子増幅を有している場合に、EGFRアンタゴニストに加えて、本明細書に記載される抗Axl抗体のいずれかを含むように対象の治療計画を変更することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、がん細胞のEGFRリン酸化を低減する方法であって、前記がん細胞はEGFRアンタゴニストに対する耐性を獲得し、また前記がん細胞は、Axl活性化突然変異又はAxl遺伝子増幅を含んでおり、該方法は、本明細書に記載されるいずれかの抗Axl抗体及びEGFRアンタゴニストと、細胞を接触させる工程を含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、がん細胞のPBK媒介性シグナル伝達を低減する方法であって、前記がん細胞はEGFRアンタゴニストに対する耐性を獲得し、また前記がん細胞はAxl発現、Axl活性化突然変異又はAxl遺伝子増幅を含んでおり、該方法は、本明細書に記載されるいずれかの抗Axl抗体及びEGFRアンタゴニストと、細胞を接触させる工程を含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、がん細胞のEGFR媒介性シグナル伝達を低減する方法であって、前記がん細胞はEGFRアンタゴニストに対する耐性を獲得し、また前記がん細胞はAxl発現、Axl活性化突然変異又はAxl遺伝子増幅を含み、該方法が、本明細書に記載されるいずれかの抗Axl抗体及びEGFRアンタゴニストと、細胞を接触させることを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、EGFRアンタゴニストに対するがん細胞の感受性を回復する方法であって、前記がん細胞はEGFRアンタゴニストに対する耐性を獲得し、また前記がん細胞はAxl発現、Axl活性化突然変異又はAxl遺伝子増幅を含み、該方法は、本明細書に記載されるいずれかの抗Axl抗体及びEGFRアンタゴニストと、細胞を接触させることを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、がん細胞の成長又は増殖を低減する方法であって、前記がん細胞はEGFRアンタゴニストに対する耐性を獲得し、また前記がん細胞はAxl発現、Axl活性化突然変異又はAxl遺伝子増幅を含み、該方法は、本明細書に記載されるいずれかの抗Axl抗体及びEGFRアンタゴニストと、細胞を接触させる工程を含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、がん細胞のアポトーシスを増加させる方法であって、前記がん細胞はEGFRアンタゴニストに対する耐性を獲得し、また前記がん細胞はAxl発現、Axl活性化突然変異又はAxl遺伝子増幅を含み、該方法は、本明細書に記載されるいずれかの抗Axl抗体及びEGFRアンタゴニストと、細胞を接触させる工程を含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、EGFRアンタゴニストに対するがん細胞の耐性を低減する方法であって、前記がん細胞はEGFRアンタゴニストに対する耐性を獲得し、また前記がん細胞はAxl活性化突然変異又はAxl遺伝子増幅を含み、該方法は、本明細書に記載されるいずれかの抗Axl抗体及びEGFRアンタゴニストと、細胞を接触させる工程を含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、EGFRアンタゴニスト耐性を獲得したがん細胞の治療方法であって、前記がん細胞は、Axl活性化突然変異又はAxl遺伝子増幅を含んでおり、該方法は、本明細書に記載されるいずれかの抗Axl抗体及びEGFRアンタゴニストと、細胞を接触させることを含む方法を提供する。
ある実施形態では、がん細胞はEGFR誘導性のがんである。ある実施形態では、がん細胞はEGFR活性化突然変異を含む。ある実施形態では、がん細胞はEGFR遺伝子増幅を含む。ある実施形態では、EGFR遺伝子増幅は少なくとも2倍である。ある実施形態では、Axl増幅は少なくとも2倍である。ある実施形態では、がん細胞は、EGFRアンタゴニストに対する耐性の増加と関連するEGFR遺伝子突然変異を含む。ある実施形態では、EGFRアンタゴニストに対する耐性の増加と関連するEGFR遺伝子突然変異は、EGFRのT790M突然変異である。
ある実施形態では、EGFRアンタゴニストは、小分子治療薬、核酸治療薬又はタンパク質治療薬である。ある実施形態では、EGFRアンタゴニストは、抗体、アンチセンス分子又は小分子キナーゼ阻害剤である。ある実施形態では、EGFRアンタゴニストは、ゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、パニツムマブからなる群から選択されるEGFRキナーゼ阻害剤である。ある実施形態では、EGFRアンタゴニストは、セツキシマブ、パニツムマブからなる群から選択される抗EGFR抗体である。ある実施形態では、核酸治療薬は、siRNA分子である。
一態様では、本発明は、EGFRアンタゴニスト及び本明細書に記載されるいずれかの抗Axl抗体による治療候補である対象を同定する方法であって、前記対象はEGFRアンタゴニストによる治療を受けたことがあり、前記EGFRアンタゴニストに対する耐性を獲得したがんに罹患しており、前記対象由来のがん細胞において、Axl発現、Axl活性化突然変異又はAxl遺伝子増幅を検出することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、EGFRアンタゴニストによる治療を受けており、前記EGFRアンタゴニストに対する耐性を獲得するリスクのある対象を同定する方法であって、前記対象由来のがん細胞において、Axl発現、Axl活性化突然変異又はAxl遺伝子増幅の存在を検出することを含み、前記Axl発現、Axl活性化突然変異又はAxl遺伝子増幅の存在が、前記耐性を獲得するリスクの指標となる方法を提供する。
一態様では、本発明は、EGFRアンタゴニストによる治療に耐性であるがんに罹患した対象を治療する方法であって、EGFRアンタゴニスト及び本明細書に記載されるいずれかの抗Axl抗体を対象に投与することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、EGFR活性化突然変異又はEGFR遺伝子増幅に関連するがんに罹患している対象の治療方法であって、該対象は、EGFRアンタゴニストによる治療に耐性を発現しており、該方法は、対象がAxl発現、例えば、Axlのレベルの上昇及び/又は活性の上昇を有するかどうかを特定することと、Axl発現、例えば、Axl活性の上昇を有する対象に、EGFRアンタゴニスト及び本明細書に記載されるいずれかの抗Axl抗体を投与することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、EGFR活性化突然変異又はEGFR遺伝子増幅と関連するがんに罹患している対象の治療方法であって、(i)EGFRアンタゴニストによる治療を受けている対象をモニタリングし、対象がAxl発現、例えば、Axlレベルの上昇及び/又はAxl活性の上昇を示すかどうかを特定することと、(ii)対象がAxl発現、例えば、Axlレベルの上昇及び/又は活性の上昇を発現している場合に、EGFRアンタゴニストに加えて、本明細書に記載される抗Axl抗体のいずれかを含むように対象の治療計画を変更することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、EGFR活性化突然変異又はEGFR遺伝子増幅と関連するがんに罹患している対象の治療方法であって、(i)EGFRアンタゴニストによる治療を受けている対象をモニタリングし、対象が阻害剤に対する耐性を発現しているかどうかを特定することと、(ii)対象を検査して、対象がAxl発現、例えばAxlレベルの上昇及び/又は活性の上昇を有しているかどうかを特定することと、(iii)対象がAxlレベルの上昇及び/又は活性の上昇を有している場合に、EGFRアンタゴニストに加えて、本明細書に記載される抗Axl抗体のいずれかを含むように対象の治療計画を変更することを含む方法を提供する。
他の態様では、本発明は、(i)EGFRアンタゴニストに対するがん細胞の感受性を回復し、(ii)EGFRアンタゴニストに対するがん細胞の耐性を低減し、及び/又は(iii)EGFRアンタゴニスト及び本明細書に記載されるいずれかの抗Axl抗体と、細胞を接触させることにより、EGFRアンタゴニスト耐性を獲得したがん細胞を治療する方法を提供する。
例示した実施形態では、がん細胞は、EGFRアンタゴニストに対する耐性を獲得しており、例えば、Axl遺伝子の突然変異活性、Axl遺伝子増幅、又はGas6媒介性Axl活性化に伴うAxl活性及び/又は発現レベルの上昇を含む。本明細書に開示される方法は、がん細胞の感受性の回復、耐性の低減、及び/又は獲得した耐性の治療に用いうる。
他の態様では、本発明は、EGFRアンタゴニスト及び本明細書に記載されるいずれかの抗Axl抗体と、細胞を接触させることにより、がん細胞の成長及び/又は増殖を低減する、又はがん細胞のアポトーシスを増加させる方法を提供する。例示した実施形態では、がん細胞は、EGFRアンタゴニストに対する耐性を獲得しており、例えば、Axl遺伝子の突然変異活性、Axl遺伝子増幅、又はGas6媒介性Axl活性化に伴うAxl活性及び/又は発現の上昇を含む。
医薬組成物
本発明の抗体は通常、抗体に加えて少なくとも1の成分を含み得る医薬組成物の形態で投与される。
本発明の抗体は通常、抗体に加えて少なくとも1の成分を含み得る医薬組成物の形態で投与される。
したがって、本発明による医薬組成物及び本発明により用いられる医薬組成物は、活性成分に加えて、当業者に周知の薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤又は他の材料を含んでよい。当該材料は、非毒性でなければならず、活性成分の効能を妨げてはならない。担体又は他の材料の厳密な性質は、投与経路により異なり、投与経路は経口でも、注射(例えば静脈内)でもよい。本医薬組成物は、ヒト用医薬品及び動物用医薬品に用いられるヒト用又は動物用でありうる。
本明細書に記載する様々な異なる形態の医薬組成物に適した、当該賦形剤の例は、"Handbook of Pharmaceutical Excipients”,2nd Edition,(1994),Edited by A Wade and PJ Wellerにて参照しうる。
治療用途に許容される担体又は希釈剤は、医薬分野で周知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)に記載される。好適な担体の例としては、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトール等があげられる。好適な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロール、水及び緩衝生理食塩水があげられる。
薬剤担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図された投与経路及び標準的な薬務を考慮して選択しうる。医薬組成物には、担体、賦形剤、又は希釈剤として、又はそれに加えて、いかなる好適な結合剤(複数可)、滑沢剤(複数可)、懸濁化剤(複数可)、コーティング剤(複数可)、可溶化剤(複数可)、緩衝剤(複数可)、着香剤(複数可)、界面活性剤(複数可)、粘稠剤(複数可)、防腐剤(複数可)(抗酸化剤を含む)等、意図するレシピエントの血液と等張性のある製剤を提供する目的で含まれる物質を含んでよい。
好適な結合剤の例としては、デンプン、ゼラチン、天然糖(例えば、グルコース、無水ラクトース、易流動性ラクトース、ベータ−ラクトース、とうもろこし甘味剤)、天然ガム及び合成ガム(例えば、アカシア、トラガカント、又はアルギン酸ナトリウム)、カルボキシメチルセルロース並びにポリエチレングリコールがあげられる。
好適な滑沢剤の例としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等があげられる。医薬組成物には、防腐剤、安定剤、色素及び着香剤もあってよい。防腐剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びpヒドロキシ安息香酸のエステルがあげられる。抗酸化剤及び沈殿防止剤も用いうる。
医薬組成物には、経口投与、局所(経皮、頬側、舌下)投与、直腸投与又は非経口(皮下、皮内、筋肉内、及び静脈内を含む)投与、経鼻投与、経肺投与(例えば、吸入)に適したものが含まれる。製剤は、必要な場合、利便上、個々の用量単位で提供されてよく、薬学分野で周知の方法のいずれかにより調製しうる。どの方法にも、活性化合物を液体担体若しくは微粉固体担体又は両方と結合させた後、生成物を必要に応じて望ましい製剤に成形する工程が含まれる。担体が固体である場合の経口投与に適した医薬組成物は、単位用量製剤、例えば、各所定量の活性薬剤を含有する大丸薬、カプセル剤又は錠剤として提供されることが最も好ましい。錠剤は、場合により1又はそれ以上の補助成分とともに、圧縮又は成形することにより作製しうる。圧縮錠剤は、場合により結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、潤滑剤、界面活性剤又は分散剤と混合された易流動性形態、例えば粉末又は顆粒の活性薬剤を、適した機械で圧縮することにより調製しうる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤とともに活性薬剤を成形することにより作製しうる。錠剤は、場合によりコーティングされてよく、コーティングがない場合、場合により刻み目を付けてよい。カプセル剤は、活性薬剤を単独で、又は1種以上の補助成分との混合物としてカプセルシェルに充填した後、通常の方法で密封することにより調製しうる。カシェ剤はカプセル剤と同様に、活性薬剤が何らかの補助成分(複数可)とともにライスペーパー製の包材中に封入される。活性薬剤はまた、分散性粒剤として製剤化でき、例えば、これは投与前に水中で懸濁化したり、食品にふりかけてよい。この粒剤を例えばサシェに包装しうる。担体が液体である場合の経口投与に適した製剤は、水性若しくは非水性液体中の溶液若しくは懸濁液、又は水中油型液体エマルジョンとして提供されてよい。
経口投与のための製剤には、徐放剤形、例えば、活性薬剤が適当な放出制御マトリックス内に製剤化されるか、又は好適な放出制御フィルムでコーティングされる錠剤を含む。当該製剤は特に予防用途に好都合でありうる。
担体が固体である場合の直腸投与に適した医薬組成物は、単位用量坐剤として提供されることが最も好ましい。好適な担体には、当技術分野で一般に用いられるカカオバター及びその他の材料を含む。坐剤は、軟化又は溶解された担体(複数可)と活性薬剤を混合した後、成形型内で冷却して成形することにより、好都合に形成しうる。
非経口投与に適した医薬組成物は、水性又は油性ビヒクル中の活性薬剤の無菌溶液又は懸濁液を含む。
注射用製剤は、ボーラス注射又は連続注入に適したものであってよい。当該製剤は、単位用量又は複数用量容器で提供し、製剤の投入後、使用時に必要となるまで密封されると便利である。あるいは、活性薬剤を粉末形態にし、好適なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水を用いて使用前に作製してよい。
活性化合物はまた、長時間作用性のデポー製剤として調製してもよく、これを例えば皮下又は筋肉内に、筋肉内注射により又は埋め込みにより投与してよい。デポー調製物は、例えば、好適なポリマー材料若しくは疎水性材料又はイオン交換樹脂を含んでよい。当該長時間作用性製剤は、特に予防用途に好都合である。
口腔経由の肺投与に適した製剤は、活性化合物を含有し、望ましくは直径が0.5〜7ミクロンの範囲である粒子状物質をレシピエントの気管支樹に送達するように提供される。一つの可能性として、当該製剤は、吸入装置での使用に適した貫通可能なカプセル、例えばゼラチン内での提供、あるいは活性薬剤と、好適な液体又はガス状の噴射剤、並びに場合により界面活性剤及び/若しくは固体希釈剤等の他の成分を含む、自動噴霧製剤としての提供に好都合である微粉砕粉末の形態である。好適な液体噴射剤としてはプロパン及びクロロフルオロカーボンが挙げられ、好適なガス状噴射剤としては二酸化炭素があげられる。また自動噴霧製剤は、活性薬剤を溶液又は懸濁液の液滴形態で投薬する場合に用いうる。
当該自動噴霧製剤は、当技術分野で既知のものと同様に、既定の手順により調製しうる。自動噴霧製剤は、好適には、望ましい噴霧特性を有する手動操作可能な、又は自動的に機能するバルブを備えた容器で提示される。また有利には、バルブはその作動ごとに一定の量(例えば、25〜100マイクロリットル)を送達する計量型のものである。
さらに他の可能性として、活性薬剤は、加速気流又は超音波撹拌を用いて吸入用の微細な霧状液滴を発生させるアトマイザー又はネブライザーで用いるために溶液又は懸濁液の形態であってよい。
経鼻投与に適した製剤としては、一般に上記の肺投与用のものと類似した製剤があげられる。当該製剤は、投与されるときに鼻腔内に定着できるように、望ましくは10〜200ミクロン範囲の粒径を有する必要があり、これは、必要に応じて好適な粒径の粉末を用いるか又は適当なバルブを選択することにより実現できる。他の好適な製剤としては、鼻の近くに保持した容器から鼻腔への急速吸入により投与する20〜500ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末、及び水性又は油性溶液又は懸濁液中に0.2〜5%w/vの活性薬剤を含む点鼻液があげられる。
薬学的に許容される担体は、当業者に周知であり、それらの担体としては、0.1M、好ましくは0.05Mリン酸緩衝液、又は0.8%生理食塩水があげられるが、これらに限定されない。加えて、当該薬学的に許容される担体は、水性又は非水性の溶液、懸濁液、及びエマルジョンであってよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射用有機エステルである。水性担体としては、生理食塩水及び緩衝化媒体を含めた、水、アルコール/水溶液、エマルジョン、又は懸濁液があげられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、又は不揮発性油があげられる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等の防腐剤及びその他の添加剤が存在してよい。
局所製剤に適した製剤は、例えば、ゲル剤、クリーム剤、又は軟膏剤として提供しうる。当該調製物は、例えば、傷若しくは潰瘍の表面に直接広げるか、又は治療すべき箇所及び部分一面に適用できる包帯、ガーゼ、メッシュ等の好適な支持体に付けて、傷又は潰瘍に塗布しうる。
治療すべき部位、例えば、傷又は潰瘍に直接噴霧するか又はふりかけることができる、液体又は粉末製剤も提供しうる。あるいは、包帯、ガーゼ、メッシュ等の担体に、製剤を噴霧又はふりかけた後、治療すべき部位に適用しうる。
本発明のさらなる態様では、上記の医薬組成物又は動物用組成物を調製する方法であって、活性化合物(複数可)を、例えば混合により、担体と結合させる工程を含む方法が提供される。一般に該製剤は、活性薬剤を、液体担体若しくは微粉固体担体、又はその両方と均一にかつ十分に結合させ、その後、必要な場合には生成物を成形することにより調製される。本発明は、薬剤を、薬学的又は獣医学的に許容される担体又はビヒクルと結合させることを含む、医薬組成物の調製方法にまで及ぶ。
投与
本発明の医薬組成物は、経口、経直腸、経鼻、気管支内、局所(頬側、舌下を含む)、膣若しくは非経口(皮下、筋肉内、静脈内、動脈内及び皮内を含む)、腹腔内、又は髄腔内投与への適合が可能である。好ましくは、製剤は静脈内又は皮下投与される製剤である。
本発明の医薬組成物は、経口、経直腸、経鼻、気管支内、局所(頬側、舌下を含む)、膣若しくは非経口(皮下、筋肉内、静脈内、動脈内及び皮内を含む)、腹腔内、又は髄腔内投与への適合が可能である。好ましくは、製剤は静脈内又は皮下投与される製剤である。
製剤は、好都合には、単位剤形で、すなわち、単位用量、又は単位用量の複数単位若しくは分割単位を含有する個別部分の形態で提示しうる。例として、製剤は錠剤及び徐放性カプセル剤の形態をとることができ、製薬分野で周知のいかなる方法により調製しうる。
本発明における経口投与用製剤は、各々所定の量の活性薬剤を含有するカプセル剤、ゲルーレ(gellules)、ドロップ剤、カシェ剤、丸薬若しくは錠剤等の別個の単位として;粉末若しくは顆粒として;水性液体若しくは非水性液体中の活性薬剤の溶液、エマルジョン、若しくは懸濁液として;又は水中油型液体エマルジョン若しくは油中水型液体エマルジョンとして;又は大丸薬等として提供しうる。好ましくは、当該組成物は、1用量当たり1〜250mg、より好ましくは10〜100mgの活性成分を含有する。
経口投与用組成物(例えば、錠剤及びカプセル剤)に関して、用語「許容される担体」は、ビヒクル、例えば一般的な賦形剤、例えば結合剤、例えばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、ポリビニルピロリドン(ポビドン)、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、スクロース及びデンプン;充填剤及び担体、例えば、トウモロコシデンプン、ゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウム及びアルギン酸;並びに滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム及び他の金属ステアリン酸塩、ステアリン酸グリセロール、ステアリン酸、シリコーン流体、タルク、蝋、油、及びコロイド状シリカを含む。ペパーミント、冬緑油、サクランボ香料等の着香剤も用いうる。剤形を容易に識別できるように、着色剤を添加することが望ましい場合もある。錠剤は、また、当技術分野で周知の方法によりコーティングしうる。
錠剤は、場合により1種以上の補助成分とともに、圧縮又は成形することにより製造しうる。圧縮錠剤は、場合により結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤又は分散剤と混合された易流動性形態、例えば粉末又は顆粒の活性薬剤を、適した機械で圧縮することにより、調製しうる。成形錠剤は、湿った粉末化合物と不活性液体希釈剤との混合物を好適な機械で成形することにより製造しうる。錠剤は、また、場合によりコーティングすることも、刻み目をつけることもでき、活性薬剤をゆっくり又は制御して放出させるように製剤化しうる。
経口投与に適した他の製剤としては、矯味基剤、通常はスクロース及びアカシア、又はトラガカントに活性薬剤を含むトローチ剤;不活性基剤、例えば、ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシアに活性薬剤を含むパステル剤;好適な液体担体に活性薬剤を含む洗口液があげられる。
他の投与形態は、静脈内、動脈内、髄腔内、皮下、皮内、腹腔内又は筋肉内に注射でき、無菌の又は滅菌可能な溶液から調製される溶液又はエマルジョンを含む。注射形態は通常、1用量当たり10〜1000mg、好ましくは10〜250mgの活性成分を含有する。
本発明の医薬組成物はまた、坐剤、膣坐剤、懸濁液、エマルジョン、ローション剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、噴霧剤、溶液又は粉剤の形態であってよい。
経皮投与の代替的な手段は、皮膚パッチの使用によるものである。例えば、ポリエチレングリコール又は液体パラフィンの水性エマルジョンからなるクリーム剤に活性成分を組み込みうる。活性成分はまた、必要とされうる程度の安定剤及び防腐剤を加えた、白蝋又は白色軟質パラフィン基剤からなる軟膏に1〜10質量%の濃度で組み込みうる。
他の製剤手法により、経口又は坐剤経路に適した製剤を提供しうる。投与経路は、効能を最大化する、又は副作用を最小化するために、治療薬の物理化学的特性により、疾患ごとに特別に配慮して決定しうる。
さらに他の投与様式は、留置装置のプレコーティング又はそれ以外の組み込みを用いるものであり、そのために適当な実験により抗体の最適量を決定する。
本発明のいくつかの好ましい実施形態の抗体分子は、単一遺伝子性断片(例えばFab又はscFv)である。当該抗体断片は、半減期が比較的短いという特徴がありうる。
投与量
当業者は、過度の実験をすることなく、対象に投与する、本組成物の適当な用量を容易に決定しうる。通常は、医師が個々の患者に最も適する実際の投与量を決定し、投与量は、用いる特定の薬剤の活性、その薬剤の代謝安定性及び作用の長さ、年齢、体重、全身の健康、性別、食事、投与様式及び投与時間、排泄率、併用薬物、特定の病状の重症度、並びに個他の実行中の療法を含めた様々な因子に応じて異なると予想される。
当業者は、過度の実験をすることなく、対象に投与する、本組成物の適当な用量を容易に決定しうる。通常は、医師が個々の患者に最も適する実際の投与量を決定し、投与量は、用いる特定の薬剤の活性、その薬剤の代謝安定性及び作用の長さ、年齢、体重、全身の健康、性別、食事、投与様式及び投与時間、排泄率、併用薬物、特定の病状の重症度、並びに個他の実行中の療法を含めた様々な因子に応じて異なると予想される。
本発明により、提供される組成物を個々の患者に投与しうる。投与は「治療的有効量」内であることが好ましく、この量は患者に利点をもたらすのに十分な量である。当該利点は、少なくとも1の症状が少なくとも寛解することでありうる。実際の投与量、並びに投与速度及び時間経過は、治療される内容の性質及び重症度に依存する。治療薬の処方(例えば、投与量の決定等)は、一般診療医及びその他の医師の担当範囲内である。抗体の適当な用量は当技術分野で周知である(Ledermann J.A.et al.(1991)Int.J.Cancer 47:659−664;Bagshawe,K.D. et al.(1991)Antibody,Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4:915−922を参照)。
正確な用量は、抗体が診断用又は治療用いずれであるか、治療すべき領域の大きさと位置、抗体(例えば全抗体、抗体断片又はダイアボディ)の明確な性質、及び抗体と結合する検出可能標識又は他の分子の性質を含めた多数の因子に応じて異なると予想される。通常の抗体用量を静脈内にボーラス投与しうる。他の投与様式としては、数時間にわたる静脈注入により、同程度の総蓄積用量を達成されてよい。これは成人患者の単独治療での用量であり、幼児及び乳児の場合には、それに比例して調整でき、また他の形態の抗体の場合、分子量に比例して調整しうる。治療は、医師の裁量で毎日、週2回、毎週又は毎月の間隔で繰り返しうる。
本明細書で開示される投与量は、平均的症例の例示である。言うまでもなく、この投与量範囲よりも高い又は低い方が功を奏する個々の事例もありうるが、当該量も本発明の範囲内である。
本発明により、Axlを阻害する有効量の薬剤を投与しうる。言うまでもなく、この投与量は薬剤の投与種類に応じてさらに変更される。例えば、緊急治療時に「有効量」を達成するためには、非経口投与が好ましい。5%デキストロースの水又は正常生理食塩水中の化合物、又は好適な賦形剤を含む類似の製剤の静脈内注射が最も効果的であるが、筋肉内ボーラス注射も有用である。通常、非経口用量は0.01〜約100mg/kgであり、好ましくはキナーゼの阻害又は標的受容体の飽和に有効な血漿中濃度に薬物濃度を維持するように0.1〜20mg/kgである。薬剤は、毎日1〜4回、約0.4〜約400mg/kg/日の総1日用量を達成するレベルで投与しうる。治療的に有効である正確な活性薬剤量、及び当該薬剤が最適に投与される経路は、薬剤の血中濃度を、治療的効果を得るために必要な濃度と比較することにより、当業者により容易に決定される。
本発明の薬剤はまた、薬物濃度が本明細書に開示される治療的指標のうちの1又はそれ以上を達成するのに十分であるような方法で患者に経口投与しうる。通常、薬剤を含有する医薬組成物は、患者の病状と合致するように約0.1〜約50mg/kgの経口用量で投与される。好ましくは、経口用量は約0.5〜約20mg/kgである。
本発明の薬剤を数種のバイオアッセイのいずれかで試験して、所与の薬理効果を得るために必要な濃度を決定しうる。
併用療法
本発明の抗Axl抗体はまた、単独で投与することも、他の治療薬と組み合わせて、治療すべき病状に応じて同時に又は逐次的に投与しうる。例えば、本発明の抗体又はその複合体を、抗がん単剤療法として、又は下記のような他のがん治療薬との併用療法に用いうる。他の治療薬には、好適な用量の鎮痛薬、例えば非ステロイド性抗炎症薬(例えばアスピリン、イブプロフェン又はケトプロフェン)若しくはオピエート(例えばモルヒネ)、又は制吐剤の投与を含みうる。
本発明の抗Axl抗体はまた、単独で投与することも、他の治療薬と組み合わせて、治療すべき病状に応じて同時に又は逐次的に投与しうる。例えば、本発明の抗体又はその複合体を、抗がん単剤療法として、又は下記のような他のがん治療薬との併用療法に用いうる。他の治療薬には、好適な用量の鎮痛薬、例えば非ステロイド性抗炎症薬(例えばアスピリン、イブプロフェン又はケトプロフェン)若しくはオピエート(例えばモルヒネ)、又は制吐剤の投与を含みうる。
併用療法での使用に適した薬剤
これには、アルキル化剤(例えば、ブスルファン等のスルホン酸アルキル);ナイトロジェンマスタード(例えばクロラムブシル、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メルファラン及びウラムスチン)、エチレンイミン誘導体(例えばチオテパ);ニトロソウレア(例えばカルムスチン、ロムスチン及びストレプトゾシン)、トリアゼン(例えばダカルバジン)、プロカルバジン及びテモゾールアミド(temozolamide);白金化合物、例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン及びピコプラチン、オンナプラチン(onnaplatin)、テトラプラチン、スプリオプラチン(sprioplatin)、イプロプラチン、クロロ(ジエチレンジアミノ)−白金(II)クロリド、ジクロロ(エチレンジアミノ)−白金(II)、ジアミノ(2−エチルマロナト)白金(II)、(1,2−ジアミノシクロヘキサン)マロナト白金(II)、(4−カルボキシフタロ)−(1,2−ジアミノシクロヘキサン)白金(II)、(1,2−ジアミノシクロヘキサン)−(イソシトラト)白金(II)及び(1,2−ジアミノシクロヘキサン)−cis−(ピルバト)白金(II);抗葉酸剤(例えばメトトレキサート、ペメトレキセド(permetrexed)、ラルチトレキセド、及びトリメトレキサート)を含む代謝拮抗薬;ピリミジン類似体(例えばアザシチジン、カペシタビン、シタラビン、エダトレキサート、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン及びトロキサシタビン);プリン類似体(例えばクラドリビン、クロロデオキシアデノシン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチン、チオグアニン);抗腫瘍抗生物質(例えばブレオマイシン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ポルフィロマイシン)、及びアントラサイクリン(例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びバルルビシン)を含む天然生成物;有糸分裂阻害薬(例えばビンカアルカロイド、ビンブラスチン、ビンベシル(vinvesir)、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン);酵素(例えばL−アスパラギナーゼ及びPEG−L−アスパラギナーゼ);微小管ポリマー安定剤(例えばタキサン類のパクリタキセル及びドセタキセル);トポイソメラーゼI阻害剤(例えばカンプトテシン、イリノテカン及びトポテカン);トポイソメラーゼII阻害剤(例えばポドフィロトキシン、アムサクリン、エトポシド、テニポシド、ロソキサントロン及びアクチノマイシン);アンドロゲン(例えばフルオキシメステロン及びテストラクトン)を含むホルモン及びホルモンアンタゴニスト、抗アンドロゲン薬(例えばビカルタミド、シプロテロン、フルタミド及びニルタミド);コルチコステロイド(例えばデキサメタゾン及びプレドニゾン);アロマターゼ阻害剤(例えばアミノグルテチミド、アナストロゾール、エキセメスタン、ホルメスタン及びレトロゾール);エストロゲン(例えばジエチルスチルベストロール);抗エストロゲン薬(例えばフルベストラント、ラロキシフェン、タモキシフェン及びトレミフェン);黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)アゴニスト及びアンタゴニスト(例えばアバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、リュープロリド、ヒストレリン、デスロレリン(desorelin)、酢酸ナファレリン及びトリプトレリン);プロゲスチン(例えば酢酸メドロキシプロゲステロン及び酢酸メゲストロール)及び甲状腺ホルモン(例えばレボチロキシン及びリオチロニン);PKB経路阻害剤(例えばペリホシン、エンザスタウリン塩酸塩及びトリシリビン);PI3K阻害剤(例えばセマフォア(semaphore)及びSF1126);mTOR阻害剤(例えばラパマイシン及び類似体);CDK阻害剤(例えばセリシクリブ、アルボシジブ及び7−ヒドロキシスタウロスポリン);COX−2阻害剤(例えばセレコキシブ);HDAC阻害剤(例えばトリコスタチンA、スベロイルアニリドヒドロキサム酸及びクラミドシン);DNAメチラーゼ阻害剤(例えばテモゾロミド);並びにその他の薬剤(例えばアルトレタミン、三酸化ヒ素、サリドマイド、レナリドミド、硝酸ガリウム、レバミゾール、ミトタン、ヒドロキシウレア、オクトレオチド、プロカルバジン、スラミン、光線力学的化合物(例えばメトキサレン及びポルフィマーナトリウム)、及びプロテアソーム阻害剤(例えばボルテゾミブ))があげられる。
これには、アルキル化剤(例えば、ブスルファン等のスルホン酸アルキル);ナイトロジェンマスタード(例えばクロラムブシル、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メルファラン及びウラムスチン)、エチレンイミン誘導体(例えばチオテパ);ニトロソウレア(例えばカルムスチン、ロムスチン及びストレプトゾシン)、トリアゼン(例えばダカルバジン)、プロカルバジン及びテモゾールアミド(temozolamide);白金化合物、例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン及びピコプラチン、オンナプラチン(onnaplatin)、テトラプラチン、スプリオプラチン(sprioplatin)、イプロプラチン、クロロ(ジエチレンジアミノ)−白金(II)クロリド、ジクロロ(エチレンジアミノ)−白金(II)、ジアミノ(2−エチルマロナト)白金(II)、(1,2−ジアミノシクロヘキサン)マロナト白金(II)、(4−カルボキシフタロ)−(1,2−ジアミノシクロヘキサン)白金(II)、(1,2−ジアミノシクロヘキサン)−(イソシトラト)白金(II)及び(1,2−ジアミノシクロヘキサン)−cis−(ピルバト)白金(II);抗葉酸剤(例えばメトトレキサート、ペメトレキセド(permetrexed)、ラルチトレキセド、及びトリメトレキサート)を含む代謝拮抗薬;ピリミジン類似体(例えばアザシチジン、カペシタビン、シタラビン、エダトレキサート、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン及びトロキサシタビン);プリン類似体(例えばクラドリビン、クロロデオキシアデノシン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチン、チオグアニン);抗腫瘍抗生物質(例えばブレオマイシン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ポルフィロマイシン)、及びアントラサイクリン(例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びバルルビシン)を含む天然生成物;有糸分裂阻害薬(例えばビンカアルカロイド、ビンブラスチン、ビンベシル(vinvesir)、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン);酵素(例えばL−アスパラギナーゼ及びPEG−L−アスパラギナーゼ);微小管ポリマー安定剤(例えばタキサン類のパクリタキセル及びドセタキセル);トポイソメラーゼI阻害剤(例えばカンプトテシン、イリノテカン及びトポテカン);トポイソメラーゼII阻害剤(例えばポドフィロトキシン、アムサクリン、エトポシド、テニポシド、ロソキサントロン及びアクチノマイシン);アンドロゲン(例えばフルオキシメステロン及びテストラクトン)を含むホルモン及びホルモンアンタゴニスト、抗アンドロゲン薬(例えばビカルタミド、シプロテロン、フルタミド及びニルタミド);コルチコステロイド(例えばデキサメタゾン及びプレドニゾン);アロマターゼ阻害剤(例えばアミノグルテチミド、アナストロゾール、エキセメスタン、ホルメスタン及びレトロゾール);エストロゲン(例えばジエチルスチルベストロール);抗エストロゲン薬(例えばフルベストラント、ラロキシフェン、タモキシフェン及びトレミフェン);黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)アゴニスト及びアンタゴニスト(例えばアバレリクス、ブセレリン、ゴセレリン、リュープロリド、ヒストレリン、デスロレリン(desorelin)、酢酸ナファレリン及びトリプトレリン);プロゲスチン(例えば酢酸メドロキシプロゲステロン及び酢酸メゲストロール)及び甲状腺ホルモン(例えばレボチロキシン及びリオチロニン);PKB経路阻害剤(例えばペリホシン、エンザスタウリン塩酸塩及びトリシリビン);PI3K阻害剤(例えばセマフォア(semaphore)及びSF1126);mTOR阻害剤(例えばラパマイシン及び類似体);CDK阻害剤(例えばセリシクリブ、アルボシジブ及び7−ヒドロキシスタウロスポリン);COX−2阻害剤(例えばセレコキシブ);HDAC阻害剤(例えばトリコスタチンA、スベロイルアニリドヒドロキサム酸及びクラミドシン);DNAメチラーゼ阻害剤(例えばテモゾロミド);並びにその他の薬剤(例えばアルトレタミン、三酸化ヒ素、サリドマイド、レナリドミド、硝酸ガリウム、レバミゾール、ミトタン、ヒドロキシウレア、オクトレオチド、プロカルバジン、スラミン、光線力学的化合物(例えばメトキサレン及びポルフィマーナトリウム)、及びプロテアソーム阻害剤(例えばボルテゾミブ))があげられる。
分子標的療法剤チロシンキナーゼ阻害剤としては以下の:機能性治療剤(例えば遺伝子療法剤);アンチセンス療法剤;チロシンキナーゼ阻害剤(例えばエルロチニブ塩酸塩、ゲフィチニブ、メシル酸イマチニブ及びセマクサニブ);RAF阻害剤(例えばソラフェニブ);レチノイド及びレキシノイド等の遺伝子発現モジュレーター(例えばアダパレン、ベキサロテン、trans−レチノイン酸、9−cis−レチノイン酸及びN−(4−ヒドロキシフェニル)レチンアミド);モノクローナル抗体(例えばアレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン、リツキシマブ、トラスツズマブ)を含む表現型特異的療法剤;免疫毒素(例えばエムタンシン)、放射性免疫複合体(例えばI−トシツモマブ(tositumobab))、並びにがんワクチン、があげられる。
生物学的療法剤としては、インターフェロン(例えばインターフェロン−[アルファ]2a及びインターフェロン−[アルファ]2b)、及びインターロイキン(例えばアルデスロイキン、デニロイキンディフティトックス及びオプレルベキン)があげられる。Axl阻害剤としては、1−(6,7−ジヒドロ−5H−ベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2−c]ピリダジン−3−イル)−N3−((7−(S)−ピロリジン−1−イル)−6,7,8,9−テトラヒドロ−5H−ベンゾ[7]アヌレン−2−イル)−1H−1,2,4−トリアゾール−3,5−ジアミン(BGB324/R428)、CH5451098 (Roche)、並びにPCT/US07/089177、PCT/US2010/021275及びPCT/EP2011/004451に記載のAxl阻害剤が挙げられ、各文献は参照により本明細書に援用される。
がん細胞に対して作用することを目的とした当該薬剤に加え、抗がん療法には、保護剤又は補助剤の使用が含まれ、例えば、細胞保護剤(例えばアミフォスチン及びデクスラゾキサン);ホスホネート(例えばパミドロネート、ゾレドロン酸);及び刺激因子(例えばエポエチン、ダルベポエチン(darbeopetin)、フィルグラスチム、PEG−フィルグラスチム及びサルグラモスチム)があげられる。
例えば、カルボプラチン/パクリタキセル、カペシタビン/ドセタキセル、フルオロウラシル(fluorauracil)/レバミゾール、フルオロウラシル/ロイコボリン、メトトレキサート/ロイコボリン及びトラスツズマブ/パクリタキセル)の組み合わせ単独、又はカルボプラチン等とのさらなる併用等、多くの併用化学療法計画が当技術分野で既知である。
本明細書に開示された抗Axl抗体と併用される、特に好ましいクラスの薬剤は、免疫チェックポイントモジュレーター(ICM)、例えば免疫チェックポイント阻害剤(ICI))である。
腫瘍は、免疫系の抑制性経路である免疫チェックポイントを悪用して免疫耐性を誘発しうる。したがって、T細胞刺激性及び抑制性受容体、並びに樹状細胞刺激性受容体を含む、免疫チェックポイントを遮断又は調節し、それによりがんの免疫耐性を低減又は克服する抗体の使用は、がん研究の重要な手段である。
免疫チェックポイントを調節する抗体の使用により調節されうるT細胞刺激性受容体としては、CD28、ICOS、4−1BB、OX40、GITR、CD27、TWEAKR、HVEM及びTIM−1があげられる。免疫チェックポイントを調節する抗体の使用により調節されうるT細胞抑制性受容体としては、PD−L1、CTLA−4、PD−1、BTLA、TIM−3、VISTA、LAG−3及びTIGITがあげられる。免疫チェックポイントを調節する抗体の使用により調節されうる樹状細胞刺激性受容体としては、CD40及び4−1BBがあげられる。
本明細書に開示される抗Axl抗体との併用に適したICMには、免疫チェックポイントを調節又は阻害する抗体を含み、その多くが当技術分野で既知である。特に好適な免疫チェックポイントを調節する抗体としては、以下があげられる:
CTLA−4標的抗体、例えばイピリムマブ及びトレメリムマブ。
PD−1標的抗体、例えばペムブロリズマブ、ミボルマブ(Mivolumab)及びAMP−514/MEDI0680。
BD−L1標的抗体、例えばMPDL3280A、MEDI4736、MSB0010718C及びBMS−936559。
4−1BB標的抗体、例えばウレルマブ及びPF−05082566。
OX−40標的抗体、例えばMEDI6469、MEDI6383(rOX40L)及びMOXR0916。
GITR標的抗体、例えばTRX518。
CD27標的抗体、例えばCDX−1127。
CD40標的抗体、例えばCP−870,893。
LAG3標的抗体、例えばBMS−986016。
CTLA−4標的抗体、例えばイピリムマブ及びトレメリムマブ。
PD−1標的抗体、例えばペムブロリズマブ、ミボルマブ(Mivolumab)及びAMP−514/MEDI0680。
BD−L1標的抗体、例えばMPDL3280A、MEDI4736、MSB0010718C及びBMS−936559。
4−1BB標的抗体、例えばウレルマブ及びPF−05082566。
OX−40標的抗体、例えばMEDI6469、MEDI6383(rOX40L)及びMOXR0916。
GITR標的抗体、例えばTRX518。
CD27標的抗体、例えばCDX−1127。
CD40標的抗体、例えばCP−870,893。
LAG3標的抗体、例えばBMS−986016。
本発明の抗AXL抗体とICM抗体を併用する場合、用いるICM抗体のすべてが抑制性受容体を標的としても、抑制性受容体を標的とするICM抗体と刺激性受容体を標的とするICM抗体との組み合わせを用いてもよい。
したがって本開示は、本明細書に記載するように、治療(例えばがん等の増殖性疾患)に用いられるAxl結合抗体を提供するものであり、ここでの治療は1種以上の免疫チェックポイント調節抗体をさらに含む。同様に、増殖性疾患(例えばがん)の治療用医薬品の製造に、本明細書に記載されるAxl結合抗体を提供するものであり、ここでの治療は1種以上の免疫チェックポイント調節抗体をさらに含む。抗体は、イピリムマブ、トレメリムマブ、ペムブロリズマブ、ミボルマブ、AMP−514/MEDI0680、MPDL3280A、MEDI4736、MSB0010718C、BMS−936559、ウレルマブ、PF−05082566、MEDI6469、MEDI6383(rOX40L)、MOXR0916、TRX518、CDX−1127、CP−870,893及びBMS−986016から選択しうる。がんは肺がん、黒色腫、乳がん、卵巣がん又はがん腫から選択されうる。
本発明の化合物は、1種以上の免疫チェックポイント調節抗体の前に、1種以上の免疫チェックポイント調節抗体と同時に、又は1種以上の免疫チェックポイント調節抗体の後に投与しうる。
本明細書全体にわたって、本明細書に記載される方法は、また、インビトロ又はex vivoで実施されることが好ましい。方法はまた、インビボで実施しうる。
本発明は、本明細書で提供される抗体をAxlと結合させること、又は結合を可能にすること含む方法を提供する。上記のように、当該結合はインビボ(例えば抗体の投与後)、又は抗体をコードする核酸で行われる場合もあれば、インビトロ、例えばELISA法、ウェスタンブロット解析、免疫細胞化学、免疫組織化学、免疫沈降又はアフィニティクロマトグラフィーで行われる場合もある。
Axl受容体と結合する抗体の量を測定しうる。診断を目的とする試験用試料中の抗原量と関連した定量化が可能である。
試料中の抗体の反応性は、いかなる適当な手段により特定しうる。実現可能な手段の一つが放射性免疫アッセイ(RIA)である。放射性標識抗原を非標識抗原(試験用試料)と混合して、抗体と結合させる。結合した抗原を結合していない抗原から物理的に分離し、抗体と結合した放射性抗原の量を測定する。試験用試料中に存在する抗原が増えるほど、抗体と結合する放射性抗原は少なくなる。レポーター分子と結合された抗原又は類似体を用いた、非放射性抗原による競合的結合アッセイを用いることもできる。レポーター分子は、分光吸収特性又は発光特性を有する蛍光色素、蛍光体又はレーザー色素であってよい。好適な蛍光色素としては、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン及びTexas Redがあげられる。好適な発色性色素としては、ジアミノベンジジンがあげられる。
それ以外のレポーターとして、着色された、磁性又は常磁性のラテックスビーズ、及び検出可能なシグナルの視覚的観察、電気的検出若しくはそれ以外の記録が直接的又は間接的になりうる生物学的又は化学的に活性のある薬剤等の巨大分子コロイド状粒子又は微粒子材料がある。当該分子は、例えば、発色若しくは変色、又は電気的特性の変化を起こす反応を触媒する酵素であってよい。それらは分子的に励起可能なため、エネルギー状態間の電子遷移により、特有のスペクトル吸収又は放射が得られる。レポーター分子には、バイオセンサーとともに用いられる化学物質が含まれてよい。ビオチン/アジビン又はビオチン/ストレプトアビジン及びアルカリホスファターゼ検出系を用いうる。
個々の抗体−レポーター複合体により生成されるシグナルを利用して、(標準及び試験)試料中の関連する抗体結合の定量化可能な絶対的又は相対的データを導き出しうる。
本発明はまた、競合アッセイ法での抗原レベルの測定における上記の抗体の使用、すなわち、本発明により提供される抗体を競合アッセイ法で用いることにより、試料中の抗原のレベルを測定する方法も提供する。この方法では、結合抗原を未結合抗原から物理的に分離する必要がない場合がある。結合時に物理的又は光学的変化が生じるように、抗体にレポーター分子を結合することは、実現可能な手段の一つである。このレポーター分子は、検出可能な、また好ましくは測定可能なシグナルを直接的に又は間接的に生じさせることができる。レポーター分子の結合は、直接的若しくは間接的、共有結合的(例えばペプチド結合による)、又は非共有結合的であってよい。ペプチド結合による結合は、抗体及びレポーター分子をコードする融合遺伝子の組換え発現の結果によるものでありうる。
本発明はまた、例えばバイオセンサーシステムにおいて、本発明による抗体を用いることにより抗原レベルを直接測定することを提供する。
結合の測定様式は本発明の特徴ではなく、当業者は自身の選択及び一般知識に従って好適な様式を選択しうる。
本発明はさらに、抗原と結合し、かつ本明細書に実質的に指定されたアミノ酸を有するCDRを含む抗体可変ドメイン(VH若しくはVLのいずれか、又は両方)、又は本明細書に実質的に指定されたアミノ酸配列を有する可変ドメインを含むいかなる抗体とも、Axlへの結合を競合する抗体にまで及ぶ。抗体間の競合は、例えば、一方の結合メンバーに特異的なレポーター分子をタグ付けし、他方のタグ無し結合メンバー(複数可)の存在下で検出できるようにして、同じエピトープ若しくは重複するエピトープを結合する抗体の同定を可能にすることにより、インビトロで容易に分析しうる。競合は、例えば、ELISA法又はフローサイトメトリーを用いて特定しうる。あるいは、競合抗体は、実施例6に記載するように、Biacore装置を用いた表面プラズモン共鳴(SPR)技術により同定しうる。
他の方法では、目的とする抗体が結合するAxl上のエピトープと結合する抗体(例えば、10C9又は10G5抗体のAxlへの結合を阻止するもの)をスクリーニングするため、Antibodies.A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory.Ed Harlow and David Lane(1988)に記載されるような通常のクロスブロッキングアッセイを実施しうる。
競合試験には、抗原のペプチド断片、特に目的とするエピトープを含むペプチドを用いうる。エピトープ配列に加え、1又はそれ以上のアミノ酸をいずれかの末端に有するペプチドを用いうる。当該ペプチドは、特異的配列から「本質的になる」と称しうる。本発明による抗体は、抗原に対する結合が、所与の配列を有する、又はそれを含むペプチドにより阻害されるようなものでもあってよい。そのための試験に、一方の配列に加え、1又はそれ以上のアミノ酸を有するペプチドを用いうる。
特定のペプチドを結合する抗体を、例えば、ペプチド(複数可)を用いたパニングにより、ファージディスプレイライブラリから単離しうる。
本発明はさらに、本発明の抗体をコードする単離された核酸を提供する。核酸にはDNA及びRNAを含む。好適な態様では、本発明は、上記に定義した本発明のCDR、VH又はVLドメインをコードする核酸を提供する。
本発明はまた、上記の少なくとも1つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写カセット又は発現カセットの形態である構築物も提供する。
本発明はまた、上記の1種以上の構築物を含む、組換え宿主細胞も提供する。提供されるCDR、VH若しくはVLドメイン、又は抗体のいずれをコードする核酸も、コード核酸からの発現方法を含む、コード産物の産生方法と同様に、それ自体で本発明の一態様を形成する。発現は、その核酸を含む組換え宿主細胞を適当な条件下で培養することにより、利便に実現されうる。発現による産生後、VH若しくはVLドメイン、又は抗体を当技術分野で既知のいかなる好適な技術を用いて単離及び/又は精製しうる。
本発明による抗体、VH及び/又はVLドメイン、並びにコード核酸分子及びベクターは、例えば天然の環境から、実質的に純粋若しくは均一な形態で、あるいは核酸の場合には、必要とされる機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の核酸も遺伝子源も含まずに、若しくは実質的に含まずに、単離及び/又は精製して提供しうる。本発明による核酸は、DNA又はRNAを含んでよく、また全体的に又は部分的に合成されてよい。本明細書に記載するヌクレオチド配列への言及は、指定された配列を有するDNA分子を包含し、かつ文脈において特に指示がない限り、TがUで置換される指定された配列を有するRNA分子を包含する。
様々な異なる宿主細胞においてポリペプチドをクローニング及び発現する系は周知である。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、酵母、バキュロウイルス及び昆虫細胞系があげられる。当技術分野で、異種ポリペプチドの発現に利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、仔ハムスター腎臓(BHK)細胞、NS0及びSP2/0マウス黒色腫細胞、YB2/0ラット骨髄腫細胞、ヒト細胞株HEK−293及びPER.C6並びに他多数があげられる。一般的な好ましい細菌宿主は大腸菌である。
大腸菌等の原核細胞における抗体及び抗体断片の発現は、当技術分野において十分に確立されている。概説は、例えばPluckthun,A.Bio/Technology 9:545−551(1991)を参照のこと。培養物中での真核細胞の発現もまた、抗体の作製の1つの選択肢として当業者は利用可能である。概説については、例えば、Ref,M.E.(1993)Curr.Opinion Biotech.4:573−576;Trill J.J.et al.(1995)Curr.Opinion Biotech 6:553−560を参照のこと。
必要に応じて、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他の配列を含めた、適当な調節配列を含む好適なベクターを選択又は構築しうる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージ若しくはファージミドであってよい(Sambrook and Russell,2001,Molecular Cloning:a Laboratory Manual:3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press)。Current Protocols in Molecular Biology,Second Edition,Ausubel et al.eds.,John Wiley&Sons,1992には、例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞中へのDNAの導入及び遺伝子発現における核酸の操作、並びにタンパク質解析のための既知の技術及びプロトコルが数多く詳細に記載される。
したがって、本発明のさらに他の態様は、本明細書に開示される核酸を含む宿主細胞を提供する。なおさらなる態様は、当該核酸の宿主細胞への導入を含む方法を提供する。この導入には、いかなる利用可能な技術を用いうる。真核細胞の場合、好適な技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性のトランスフェクション、及びレトロウイルス又は他のウイルス、例えば、ワクシニア、若しくは昆虫細胞の場合、バキュロウイルスを用いる形質導入が含まれ得る。菌体の場合、好適な技術には、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション及びバクテリオファージを用いたトランスフェクションが含まれ得る。
導入に続いて、例えば、遺伝子発現のための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸由来の発現をおこすか、又は発現させうる。
一実施形態では、本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム(例えば染色体)中に組み込まれる。標準技術に従って、このゲノムとの組換えを促進する配列を含めることにより、組み込みを促進しうる。
本発明はまた、上記の抗体又はポリペプチドを発現させるために、発現系で上記構築物を用いることを含む方法も提供する。
ここで以下の実験を参照し、本発明の態様及び実施形態を例示目的として説明する。
本明細書のあらゆる箇所で引用された文献はすべて、参照により本明細書に援用される。
発明の陳述−10C9抗体
以下の段落は、本発明の具体的に想定される多数の実施形態及び組み合わせを記載する。
以下の段落は、本発明の具体的に想定される多数の実施形態及び組み合わせを記載する。
1.Axlを結合する抗体であって、10C9のVHドメイン(配列番号3)、及び配列番号7のアミノ酸配列を有するVH CDR3と、場合により配列番号6及び配列番号5から選択されるアミノ酸配列を有する1又はそれ以上のVH CDRとを含むVHドメインからなる群から選択される抗体VHドメイン;並びに/又は10C9のVLドメイン(配列番号4)、及び配列番号8、配列番号9及び配列番号10から選択されるアミノ酸配列を有する1又はそれ以上のVL CDRを含むVLドメインからなる群から選択される抗体VLドメインを含む抗体。
2.配列番号5、配列番号6及び配列番号7のアミノ酸配列を有するVH CDRを含む抗体VHドメインを含む、段落1による抗体であって、10C9のVHドメイン(配列番号3)及び10C9のVLドメイン(配列番号4)を含む抗体のAxl結合ドメインと、ヒトAxlへの結合を競合する抗体。
3.10C9のVHドメイン(配列番号3)を含む段落1又は段落2による抗体。
4.10C9のVLドメイン(配列番号4)を含む段落3による抗体。
5.段落1〜4のいずれか1項による抗体の変異体であって、1又はそれ以上のフレームワーク領域内及び/又は1又はそれ以上のCDR内に1又はそれ以上のアミノ酸配列改変を含む変異体。
6.抗体の親和性と抗原結合部位の親和性が同一条件下で特定されるとき、10C9のVHドメイン(配列番号3)及び10C9のVLドメイン(配列番号4)により形成されるAxl抗原結合部位の親和性と等しいか、又はそれを上回る親和性でAxlを結合する段落1〜5のいずれか1項による抗体。
7.scFv抗体分子を含む、段落1〜6のいずれか1項による抗体。
8.抗体の定常領域を含む、段落1〜6のいずれか1項による抗体。
9.全抗体を含む、段落8による抗体。
10.抗原結合能に加えて、さらに機能的特徴を備えている付加アミノ酸を含む、段落1〜9のいずれか1項による抗体。
11.2x10−10M以下のKDでAxlを結合する、段落1〜10のいずれか1項による抗体。
12.1.5x106M−1s−1以上のkonでAxlを結合する、段落1〜11のいずれか1項による抗体。
13.AxlがヒトAxlである、段落1〜12のいずれか1項による抗体。
14.霊長類のAxlを特異的に結合する、段階1〜13のいずれか1項による抗体。
15.(i)10−3M超のKDでマウスAxlを結合する;
(ii)10−3M超のKDでヒトMerを結合する;及び/又は
(iii)10−3M超のKDでヒトTyro3を結合する、段階1〜14のいずれか1項による抗体。
(ii)10−3M超のKDでヒトMerを結合する;及び/又は
(iii)10−3M超のKDでヒトTyro3を結合する、段階1〜14のいずれか1項による抗体。
16.AxlのGas6への結合を阻害する、段落1〜15のいずれか1項による抗体。
17.Axl受容体の発現を下方調節する、段落1〜16のいずれか1項による抗体。
18.Axl受容体の発現を、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をした試料で観察されるレベルの50%未満に減少させる、段落17による抗体。
19.Axl受容体発現の下方調節が、試料と抗体との接触後12時間以内に観察される、段落17又は18のいずれか1項による抗体。
20.Axl受容体発現の下方調節が、試料と抗体との接触後、少なくとも24時間持続する、段落17〜19のいずれか1項による抗体。
21.Axl受容体の内在化の速度を増加させる、段落1〜20のいずれか1項による抗体。
22.Axl活性を阻害する、段落1〜21のいずれか1項による抗体。
23.前記抗体が、Axl受容体の下流シグナル伝達を阻害する、段落22による抗体。
24.本発明の抗体と接触させた試料のSerine 473でのAktのリン酸化を、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をした試料で観察されるレベルの50%未満に減少させる、段落22又は23のいずれか1項による抗体。
25.細胞死率を増加させる、段落1〜24のいずれか1項による抗体。
26.腫瘍成長を阻害する、段落1〜25のいずれか1項による抗体。
27.検出可能標識、酵素又は毒素と、場合によりペプチジル結合又はリンカーを介して複合体化された、段落1〜26のいずれか1項による抗体。
28.前記毒素がMMAE及びMMAFからなる群から選択される、段落27による抗体。
29.前記検出可能標識がFITCである、段落27による抗体。
30.ハイブリドーマUT−10C9−B9から得られる10C9抗体が結合するエピトープと結合する、段落1〜29のいずれか1項による抗体。
31.ハイブリドーマUT−10C9−B9から得られる10C9抗体が結合するエピトープと結合する抗体。
32.AxlとそのリガンドGas6との結合を阻害する、段落31による抗体。
33.Axl発現の下方調節、Axl受容体のシグナル伝達阻害、及び/又は腫瘍成長の阻害をもたらす、段落31又は32のいずれか1項による抗体。
34.ハイブリドーマUT−10C9−B9から得られる10C9抗体。
35.段落1〜26のいずれか1項による抗体の、抗体又は抗体のVH若しくはVLドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
36.段落35による核酸で形質転換された宿主細胞。
37.抗体又は抗体のVH若しくはVLドメインの作製方法であって、前記抗体又は抗体のVH若しくはVLドメインの作製条件下で、段落36による宿主細胞を培養することを含む方法。
38.前記抗体又は抗体のVH若しくはVL可変ドメインを単離及び/又は精製することをさらに含む、段落37による方法。
39.前記抗体又は抗体のVH若しくはVL可変ドメインを、少なくとも1種の追加成分を含む組成物に製剤化することをさらに含む、段落37又は段落38による方法。
40.Axlを結合する抗体を得る方法であって、
10C9のVHドメインのアミノ酸配列(配列番号3)における1又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、又は挿入により、各々が10C9のVHドメインのアミノ酸配列変異体である1又はそれ以上のVHドメインを提供し、場合により、このようにして提供される1又はそれ以上のVHドメインのアミノ酸配列変異体を1又はそれ以上のVLドメインと組み合わせ、1又はそれ以上のVH/VLの組み合わせを提供することと;及び/又は
10C9のVLドメインのアミノ酸配列(配列番号4)における1又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、又は挿入により、10C9のVLドメインのアミノ酸配列変異体であるVLドメインを提供し、このようにして提供される1又はそれ以上のVLドメインのアミノ酸配列変異体を1又はそれ以上のVHドメインと組み合わせ、1又はそれ以上のVH/VLドメインの組み合わせを提供することと;
並びにVHドメインのアミノ酸配列変異体又はVH/VLの組み合わせ若しくは複数の組み合わせを試験して、Axlを結合する抗体を同定することと、を含む方法。
10C9のVHドメインのアミノ酸配列(配列番号3)における1又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、又は挿入により、各々が10C9のVHドメインのアミノ酸配列変異体である1又はそれ以上のVHドメインを提供し、場合により、このようにして提供される1又はそれ以上のVHドメインのアミノ酸配列変異体を1又はそれ以上のVLドメインと組み合わせ、1又はそれ以上のVH/VLの組み合わせを提供することと;及び/又は
10C9のVLドメインのアミノ酸配列(配列番号4)における1又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、又は挿入により、10C9のVLドメインのアミノ酸配列変異体であるVLドメインを提供し、このようにして提供される1又はそれ以上のVLドメインのアミノ酸配列変異体を1又はそれ以上のVHドメインと組み合わせ、1又はそれ以上のVH/VLドメインの組み合わせを提供することと;
並びにVHドメインのアミノ酸配列変異体又はVH/VLの組み合わせ若しくは複数の組み合わせを試験して、Axlを結合する抗体を同定することと、を含む方法。
41.Axlを結合する抗体を得る方法であって、
CDR3が置換されるか、若しくはCDR3コード領域が欠失している1又はそれ以上のVHドメインをコードする出発核酸を提供し、前記出発核酸を、配列番号7であるVH CDR3のアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせることにより、前記ドナー核酸を出発核酸内のCDR3領域に挿入し、それによりVHドメインをコードする核酸産物を提供すること;又は
CDR3が置換されるか、若しくはCDR3コード領域が欠失している1又はそれ以上のVLドメインをコードする出発核酸を提供し、前記出発核酸を、配列番号10であるVL CDR3のアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせることにより、前記ドナー核酸を出発核酸内のCDR3領域に挿入し、それによりVLドメインをコードする核酸産物を提供することと;
VHドメインをコードする前記核酸産物の核酸を発現させ、場合により、このようにして提供されるVHドメインを1又はそれ以上のVLドメインと組み合わせてVH/VLの組み合わせを提供すること、及び/若しくはVLドメインをコードする前記核酸産物の核酸を発現させ、このようにして提供されるVLドメインを1又はそれ以上のVHドメインと組み合わせてVH/VLの組み合わせを提供することと;
Axlを結合するVHドメイン若しくはVH/VLの組み合わせを含む抗体を選択することと;
並びに、Axlを結合する前記抗体及び/若しくはAxlを結合する抗体をコードする核酸を回収することと、を含む方法。
CDR3が置換されるか、若しくはCDR3コード領域が欠失している1又はそれ以上のVHドメインをコードする出発核酸を提供し、前記出発核酸を、配列番号7であるVH CDR3のアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせることにより、前記ドナー核酸を出発核酸内のCDR3領域に挿入し、それによりVHドメインをコードする核酸産物を提供すること;又は
CDR3が置換されるか、若しくはCDR3コード領域が欠失している1又はそれ以上のVLドメインをコードする出発核酸を提供し、前記出発核酸を、配列番号10であるVL CDR3のアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせることにより、前記ドナー核酸を出発核酸内のCDR3領域に挿入し、それによりVLドメインをコードする核酸産物を提供することと;
VHドメインをコードする前記核酸産物の核酸を発現させ、場合により、このようにして提供されるVHドメインを1又はそれ以上のVLドメインと組み合わせてVH/VLの組み合わせを提供すること、及び/若しくはVLドメインをコードする前記核酸産物の核酸を発現させ、このようにして提供されるVLドメインを1又はそれ以上のVHドメインと組み合わせてVH/VLの組み合わせを提供することと;
Axlを結合するVHドメイン若しくはVH/VLの組み合わせを含む抗体を選択することと;
並びに、Axlを結合する前記抗体及び/若しくはAxlを結合する抗体をコードする核酸を回収することと、を含む方法。
42.Axlを結合する抗体がVHドメイン及びVLドメインを含む抗体断片である、段落41又は段落41による方法。
43.前記抗体断片がscFv抗体分子である、段落42による方法。
44.前記抗体断片がFab抗体分子である、段落42による方法。
45.全抗体に抗体断片のVHドメイン及び/又はVLドメインを提供することをさらに含む、段落43又は段落44による方法。
46.Axlを結合する抗体又はAxlを結合する抗体の抗体VH若しくはVL可変ドメインを、少なくとも1種の追加成分を含む組成物に製剤化することをさらに含む、段落37〜45のいずれか1項による方法。
47.Axlを結合する抗体をAxl又はAxlの断片に結合することをさらに含む、段落37〜46のいずれか1項による方法。
48.段落1〜29のいずれか1項によるAxlを結合する抗体をAxl又はAxlの断片に結合することを含む方法。
49.前記結合がインビトロで生じる、段落47又は段落48による方法。
50.抗体がAxl又はAxlの断片に結合する量を特定することを含む、段落47〜49のいずれか1項による方法。
51.Axlの過剰発現を特徴とする疾患又は障害を治療する医薬品の製造における、前記抗体の使用をさらに含む、段落37〜46のいずれか1項による方法。
52.段落1〜26のいずれか1項による抗体、又はその免疫複合体を、薬学的に許容される賦形剤とともに含む組成物。
53.免疫チェックポイントモジュレーター及び/又はAxl以外の標的に特異的な抗腫瘍抗体をさらに含む、段落52による組成物。
54.前記免疫チェックポイントモジュレーターが、イピリムマブ、トレメリムマブ、ペムブロリズマブ、ミボルマブ、AMP−514/MEDI0680、MPDL3280A、MEDI4736、MSB0010718C、BMS−936559、ウレルマブ、PF−05082566、MEDI6469、MEDI6383(rOX40L)、MOXR0916、TRX518、CDX−1127、CP−870、893又はBMS−986016等の抗体である、段落53による組成物。
55.Axl以外の標的に特異的な前記抗腫瘍抗体が、リツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、アレムツズマブ、IGN101、アデカツムマブ、ラベツズマブ、huA33、ペムツモマブ、オレゴボマブ、CC49(ミンレツモマブ)、cG250、J591、MOv18、MORAb−003(ファルレツズマブ)、3F8、ch14.18、KW−2871、hu3S193、IgN311、ベバシズマブ、IM−2C6、CDP791、エタラシズマブ、ボロシキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ806、トラスツズマブ、ペルツズマブ、MM−121、AMG 102、METMAB、SCH 900105、AVE1642、IMC−A12、MK−0646、R1507、CP 751871、KB004、IIIA4、マパツムマブ(HGS−ETR1)、HGS−ETR2、CS−1008、デノスマブ、シブロツズマブ、F19、81C6からなる群から選択される、段落53による組成物。
56.治療方法に用いられる、段落1〜29のいずれか1項による抗体、又は段落52〜55のいずれか1項による組成物。
57.増殖性疾患の治療方法に用いられる、段落56による抗体又は組成物。
58.前記増殖性疾患ががんである、段落57による抗体又は組成物。
59.前記がんが転移がんである、段落58による抗体又は組成物。
60.Axlの過剰発現を特徴とする疾患又は障害を治療する医薬品の製造における、段落1〜29のいずれか1項による抗体、又は段落52〜55のいずれか1項による組成物の使用。
61.Axlの過剰発現を特徴とする疾患又は障害の治療方法であって、段落1〜29のいずれか1項による抗体、又は段落52〜55のいずれか1項による組成物を、疾患若しくは障害を有する患者、又は疾患若しくは障害を発現するリスクのある患者に投与することを含む方法。
62.段落56〜59のいずれか1項による抗体、又は請求項61の方法であって、段落1〜29のいずれか1項による抗体、又は段落52〜55のいずれか1項による組成物を、免疫チェックポイントモジュレーター及び/又はAxl以外の標的に特異的な抗腫瘍抗体と組み合わせて投与することを含む治療方法。
63.前記抗体が転移がん細胞を標的とする医薬組成物の送達を誘導する、段落61による方法。
64.Axlの過剰発現を特徴とする疾患又は障害を検出する診断薬の製造における、段落1〜29のいずれか1項による抗体、及び前記抗体と転移がん細胞の結合を特定できる1種以上の試薬の使用。
65.Axlの過剰発現を特徴とする疾患又は障害の診断方法であって、段落1〜29のいずれか1項による抗体、又は段落52〜55のいずれか1項による組成物、及び前記抗体と転移がん細胞との結合を特定できる1種以上の試薬を、疾患若しくは障害を有する患者、又は疾患若しくは障害を発現するリスクのある患者に投与することを含む方法。
66.段落1〜29のいずれか1項による抗体、及び前記メンバーと転移がん細胞との結合を特定できる1種以上の試薬を含む診断キット。
67.段落1〜29のいずれか1項による抗体、又は段落52〜55のいずれか1項による組成物を含むキット。
68.薬学的に許容される賦形剤とともに、有効量の段落1〜29による抗体を活性成分として含む医薬組成物。
発明の陳述−10G5抗体
以下の段落は、本発明の具体的に想定される多数の実施形態及び組み合わせを記載する。
以下の段落は、本発明の具体的に想定される多数の実施形態及び組み合わせを記載する。
1a.Axlを結合する抗体であって、
10G5のVHドメイン(配列番号21)、及び配列番号25のアミノ酸配列を有するVH CDR3と、場合により配列番号24及び配列番号23から選択されるアミノ酸配列を有する1又はそれ以上のVH CDRとを含むVHドメインからなる群から選択される抗体VHドメイン;並びに/又は
10G5のVLドメイン(配列番号22)、及び配列番号26、配列番号27及び配列番号28から選択されるアミノ酸配列を有する1又はそれ以上のVL CDRを含むVLドメインからなる群から選択される抗体VLドメインを含む抗体。
10G5のVHドメイン(配列番号21)、及び配列番号25のアミノ酸配列を有するVH CDR3と、場合により配列番号24及び配列番号23から選択されるアミノ酸配列を有する1又はそれ以上のVH CDRとを含むVHドメインからなる群から選択される抗体VHドメイン;並びに/又は
10G5のVLドメイン(配列番号22)、及び配列番号26、配列番号27及び配列番号28から選択されるアミノ酸配列を有する1又はそれ以上のVL CDRを含むVLドメインからなる群から選択される抗体VLドメインを含む抗体。
1b.Axlを結合する抗体であって、
10G5(Q1E)のVHドメイン(配列番号45)、及び配列番号25のアミノ酸配列を有するVH CDR3と、場合により配列番号24及び配列番号23から選択されるアミノ酸配列を有する1又はそれ以上のVH CDRとを含むVHドメインからなる群から選択される抗体VHドメイン;並びに/又は10G5のVLドメイン(配列番号22)、及び配列番号26、配列番号27及び配列番号28から選択されるアミノ酸配列を有する1又はそれ以上のVL CDRを含むVLドメインからなる群から選択される抗体VLドメインを含む抗体。
10G5(Q1E)のVHドメイン(配列番号45)、及び配列番号25のアミノ酸配列を有するVH CDR3と、場合により配列番号24及び配列番号23から選択されるアミノ酸配列を有する1又はそれ以上のVH CDRとを含むVHドメインからなる群から選択される抗体VHドメイン;並びに/又は10G5のVLドメイン(配列番号22)、及び配列番号26、配列番号27及び配列番号28から選択されるアミノ酸配列を有する1又はそれ以上のVL CDRを含むVLドメインからなる群から選択される抗体VLドメインを含む抗体。
2a.段落1a又は1bによる抗体であって、配列番号23、配列番号24及び配列番号25のアミノ酸配列を有するVH CDRを含む抗体VHドメインを含み、10G5のVHドメイン(配列番号21)及び10G5のVLドメイン(配列番号22)を含む抗体のAxl結合ドメインと、Axlへの結合を競合する抗体。
3a.10G5のVHドメイン(配列番号21)を含む段落1a又は段落2aによる抗体。
3b.10G5(Q1E)のVHドメイン(配列番号45)を含む段落1b又は段落2aによる抗体。
4a.10G5のVLドメイン(配列番号22)を含む段落3aによる抗体。
5a.段落1a〜4aのいずれか1項による抗体の変異体であって、1又はそれ以上のフレームワーク領域内及び/又は1又はそれ以上のCDR内に1又はそれ以上のアミノ酸配列改変を含む変異体。
6a.抗体の親和性と抗原結合部位の親和性が同一条件下で特定されるとき、10G5のVHドメイン(配列番号21)及び10G5のVLドメイン(配列番号22)により形成されるAxl抗原結合部位の親和性と等しいか、又はそれを上回る親和性でAxlと結合する段落1a〜5aのいずれか1項による抗体。
7a.scFv抗体分子を含む、段落1a〜6aのいずれか1項による抗体。
a8.抗体定常領域を含む、段落1a〜6aのいずれか1項による抗体。
9a.全抗体を含む、段落8aによる抗体。
10a.抗原結合能に加えて、さらに機能的特徴を備えている付加アミノ酸を含む、段落1a〜9aのいずれか1項による抗体。
11a.6x10−10M以下のKDでAxlを結合する、段落1a〜10aのいずれか1項による抗体。
12a.8x105M−1s−1以上のkonでAxlを結合する、段落1a〜11aのいずれか1項による抗体。
13a.AxlがヒトAxlである、段落1a〜12aのいずれか1項による抗体。
14a.霊長類のAxlを特異的に結合する、段落1a〜13aのいずれか1項による抗体。
15a.(i)10−3M超のKDでマウスAxlを結合する;
(ii)10−3M超のKDでヒトMerを結合する;及び/又は
(iii)10−3M超のKDでヒトTyro3を結合する、段落1a〜14aのいずれか1項による抗体。
(ii)10−3M超のKDでヒトMerを結合する;及び/又は
(iii)10−3M超のKDでヒトTyro3を結合する、段落1a〜14aのいずれか1項による抗体。
16a.AxlのGas6への結合を阻害する、段落1a〜15aのいずれか1項による抗体。
17a.Axl受容体の発現を下方調節する、段落1a〜16aのいずれか1項による抗体。
18a.Axl受容体の発現を、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をした試料で観察されるレベルの50%未満に減少させる、段落17aによる抗体。
19a.Axl受容体発現の下方調節が、試料と抗体との接触後12時間以内に観察される、段落17a又は18aのいずれか1項による抗体。
20a.Axl受容体発現の下方調節が、試料と抗体との接触後、少なくとも24時間持続する、段落17a〜19aのいずれか1項による抗体。
21a.Axl受容体の内在化の速度を増加させる、段落1a〜20aのいずれか1項による抗体。
22a.Axl活性を阻害する、段落1a〜21aのいずれか1項による抗体。
23a.前記抗体が、Axl受容体の下流シグナル伝達を阻害する、段落22aによる抗体。
24a.本発明の抗体と接触させた試料のSerine 473でのAktのリン酸化を、抗体と接触させないこと以外は同じ処理をした試料で観察されるレベルの50%未満に減少させる、段落22a又は23aのいずれか1項による抗体。
25a.細胞死率を増加させる、段落1a〜24aのいずれか1項による抗体。
26a.腫瘍成長を阻害する、段落1a〜25aのいずれか1項による抗体。
27a.検出可能標識、酵素又は毒素と、場合によりペプチジル結合又はリンカーを介して複合体化された、段落1a〜26aのいずれか1項による抗体。
28a.前記毒素がMMAE及びMMAFからなる群から選択される、段落27aによる抗体。
29a.前記検出可能標識がFITCである、段落27aによる抗体。
30a.ハイブリドーマWR−10G5−E5から得られる10G5抗体が結合するエピトープと結合する、段落1a〜29aのいずれか1項による抗体。
31a.ハイブリドーマWR−10G5−E5から得られる10G5抗体が結合するエピトープと結合する抗体。
32a.AxlとそのリガンドGas6との結合を阻害する、段落31aによる抗体。
33a.Axl発現の下方調節、Axl受容体のシグナル伝達阻害、及び/又は腫瘍成長の阻害をもたらす、段落31a又は32aのいずれか1項による抗体。
34a.ハイブリドーマWR−10G5−E5から得られる10G5抗体。
35a.段落1a〜26aのいずれか1項による抗体の、抗体又は抗体のVH若しくはVLドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
36a.段落35aによる核酸で形質転換された宿主細胞。
37a.抗体又は抗体のVH若しくはVLドメインの作製方法であって、前記抗体又は抗体のVH若しくはVLドメインの作製条件下で、段落36aによる宿主細胞を培養することを含む方法。
38a.前記抗体又は抗体のVH若しくはVL可変ドメインを単離及び/又は精製することをさらに含む、段落37aによる方法。
39a.前記抗体又は抗体のVH若しくはVL可変ドメインを、少なくとも1種の追加成分を含む組成物に製剤化することをさらに含む、段落37a又は段落38aによる方法。
40a.Axlを結合する抗体を得る方法であって、
10G5のVHドメインのアミノ酸配列(配列番号3)における1又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、又は挿入により、各々が10G5のVHドメインのアミノ酸配列変異体である1又はそれ以上のVHドメインを提供し、場合により、このようにして提供される1又はそれ以上のVHドメインのアミノ酸配列変異体を1又はそれ以上のVLドメインと組み合わせ、1又はそれ以上のVH/VLの組み合わせを提供することと;及び/又は
10G5のVLドメインのアミノ酸配列(配列番号4)における1又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、又は挿入により、10G5のVLドメインのアミノ酸配列変異体であるVLドメインを提供し、このようにして提供される1又はそれ以上のVLドメインのアミノ酸配列変異体を1又はそれ以上のVHドメインと組み合わせ、1又はそれ以上のVH/VLドメインの組み合わせを提供することと;並びに
VHドメインのアミノ酸配列変異体又はVH/VLの組み合わせ若しくは複数の組み合わせを試験して、Axlを結合する抗体を同定することと、を含む方法。
10G5のVHドメインのアミノ酸配列(配列番号3)における1又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、又は挿入により、各々が10G5のVHドメインのアミノ酸配列変異体である1又はそれ以上のVHドメインを提供し、場合により、このようにして提供される1又はそれ以上のVHドメインのアミノ酸配列変異体を1又はそれ以上のVLドメインと組み合わせ、1又はそれ以上のVH/VLの組み合わせを提供することと;及び/又は
10G5のVLドメインのアミノ酸配列(配列番号4)における1又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、又は挿入により、10G5のVLドメインのアミノ酸配列変異体であるVLドメインを提供し、このようにして提供される1又はそれ以上のVLドメインのアミノ酸配列変異体を1又はそれ以上のVHドメインと組み合わせ、1又はそれ以上のVH/VLドメインの組み合わせを提供することと;並びに
VHドメインのアミノ酸配列変異体又はVH/VLの組み合わせ若しくは複数の組み合わせを試験して、Axlを結合する抗体を同定することと、を含む方法。
41a.Axlを結合する抗体を得る方法であって、
CDR3が置換されるか、若しくはCDR3コード領域が欠失している1又はそれ以上のVHドメインをコードする出発核酸を提供し、前記出発核酸を、配列番号7であるVH CDR3のアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせることにより、前記ドナー核酸を出発核酸内のCDR3領域に挿入し、それによりVHドメインをコードする核酸産物を提供すること;又は
CDR3が置換されるか、若しくはCDR3コード領域が欠失している1又はそれ以上のVLドメインをコードする出発核酸を提供し、前記出発核酸を、配列番号10であるVL CDR3のアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせることにより、前記ドナー核酸を出発核酸内のCDR3領域に挿入し、それによりVLドメインをコードする核酸産物を提供することと;
VHドメインをコードする前記核酸産物の核酸を発現させ、場合により、このようにして提供されるVHドメインを1又はそれ以上のVLドメインと組み合わせてVH/VLの組み合わせを提供すること、及び/若しくはVLドメインをコードする前記核酸産物の核酸を発現させ、このようにして提供されるVLドメインを1又はそれ以上のVHドメインと組み合わせてVH/VLの組み合わせを提供することと;
Axlを結合するVHドメイン若しくはVH/VLの組み合わせを含む抗体を選択することと;
並びに、Axlを結合する前記抗体及び/若しくはAxlを結合する抗体をコードする核酸を回収することと、を含む方法。
CDR3が置換されるか、若しくはCDR3コード領域が欠失している1又はそれ以上のVHドメインをコードする出発核酸を提供し、前記出発核酸を、配列番号7であるVH CDR3のアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせることにより、前記ドナー核酸を出発核酸内のCDR3領域に挿入し、それによりVHドメインをコードする核酸産物を提供すること;又は
CDR3が置換されるか、若しくはCDR3コード領域が欠失している1又はそれ以上のVLドメインをコードする出発核酸を提供し、前記出発核酸を、配列番号10であるVL CDR3のアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせることにより、前記ドナー核酸を出発核酸内のCDR3領域に挿入し、それによりVLドメインをコードする核酸産物を提供することと;
VHドメインをコードする前記核酸産物の核酸を発現させ、場合により、このようにして提供されるVHドメインを1又はそれ以上のVLドメインと組み合わせてVH/VLの組み合わせを提供すること、及び/若しくはVLドメインをコードする前記核酸産物の核酸を発現させ、このようにして提供されるVLドメインを1又はそれ以上のVHドメインと組み合わせてVH/VLの組み合わせを提供することと;
Axlを結合するVHドメイン若しくはVH/VLの組み合わせを含む抗体を選択することと;
並びに、Axlを結合する前記抗体及び/若しくはAxlを結合する抗体をコードする核酸を回収することと、を含む方法。
42a.Axlを結合する前記抗体がVHドメイン及びVLドメインを含む抗体断片である、段落41a又は段落41aによる方法。
43a.前記抗体断片がscFv抗体分子である、段落42aによる方法。
44a.前記抗体断片がFab抗体分子である、段落42aによる方法。
45a.全抗体に抗体断片のVHドメイン及び/又はVLドメインを提供することをさらに含む、段落43a又は段落44aによる方法。
46a.Axlを結合する抗体又はAxlを結合する抗体の抗体VH若しくはVL可変ドメインを、少なくとも1種の追加成分を含む組成物に製剤化することをさらに含む、段落37a〜45aのいずれか1項による方法。
47a.Axlを結合する抗体をAxl又はAxlの断片に結合することをさらに含む、段落37a〜46aのいずれか1項による方法。
48a.段落1a〜29aのいずれか1項によるAxlを結合する抗体をAxl又はAxlの断片に結合することを含む方法。
49a.前記結合がインビトロで生じる、段落47a又は段落48aによる方法。
50a.抗体がAxl又はAxlの断片に結合する量を特定することを含む、段落47a〜49aのいずれか1項による方法。
51a.Axlの過剰発現を特徴とする疾患又は障害を治療する医薬品の製造における、前記抗体の使用をさらに含む、段落37a〜46aのいずれか1項による方法。
52a.段落1a〜26aのいずれか1項よる抗体、又はその免疫複合体を、薬学的に許容される賦形剤とともに含む組成物。
53a.免疫チェックポイントモジュレーター及び/又はAxl以外の標的に特異的な抗腫瘍抗体をさらに含む、段落52aによる組成物。
54a.前記免疫チェックポイントモジュレーターが、イピリムマブ、トレメリムマブ、ペムブロリズマブ、ミボルマブ、AMP−514/MEDI0680、MPDL3280A、MEDI4736、MSB0010718C、BMS−936559、ウレルマブ、PF−05082566、MEDI6469、MEDI6383(rOX40L)、MOXR0916、TRX518、CDX−1127、CP−870、893又はBMS−986016等の抗体である、段落53aによる組成物。
55a.Axl以外の標的に特異的な前記抗腫瘍抗体が、リツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、アレムツズマブ、IGN101、アデカツムマブ、ラベツズマブ、huA33、ペムツモマブ、オレゴボマブ、CC49(ミンレツモマブ)、cG250、J591、MOv18、MORAb−003(ファルレツズマブ)、3F8、ch14.18、KW−2871、hu3S193、IgN311、ベバシズマブ、IM−2C6、CDP791、エタラシズマブ、ボロシキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ806、トラスツズマブ、ペルツズマブ、MM−121、AMG 102、METMAB、SCH 900105、AVE1642、IMC−A12、MK−0646、R1507、CP 751871、KB004、IIIA4、マパツムマブ(HGS−ETR1)、HGS−ETR2、CS−1008、デノスマブ、シブロツズマブ、F19、81C6からなる群から選択される、段落53aによる組成物。
56a.治療方法に用いられる、段落1a〜29aのいずれか1項による抗体、又は段落52a〜55aのいずれか1項による組成物。
57a.増殖性疾患の治療方法に用いられる、段落56aによる抗体又は組成物。
58a.前記増殖性疾患ががんである、段落57aによる抗体又は組成物。
59a.前記がんが転移がんである、段落58aによる抗体又は組成物。
60a.Axlの過剰発現を特徴とする疾患又は障害を治療する医薬品の製造における、段落1a〜29aのいずれか1項による抗体、又は段落52a〜55aのいずれか1項による組成物の使用。
61a.Axlの過剰発現を特徴とする疾患又は障害の治療方法であって、段落1a〜29aのいずれか1項による抗体、又は段落52a〜55aのいずれか1項による組成物を、疾患若しくは障害を有する患者、又は疾患若しくは障害を発現するリスクのある患者に投与することを含む方法。
62a.段落56a〜59aのいずれか1項による抗体、又は請求項61aの方法であって、段落1a〜29aのいずれか1項による抗体、又は段落52a〜55aのいずれか1項による組成物を、免疫チェックポイントモジュレーター及び/又はAxl以外の標的に特異的な抗腫瘍抗体と組み合わせて投与することを含む治療方法。
63a.前記抗体が転移がん細胞を標的とする医薬組成物の送達を誘導する、段落61aによる方法。
64a.Axlの過剰発現を特徴とする疾患又は障害を検出する診断薬の製造における、段落1a〜29aのいずれか1項による抗体、及び前記抗体と転移がん細胞の結合を特定できる1種以上の試薬の使用。
65a.Axlの過剰発現を特徴とする疾患又は障害の診断方法であって、段落1〜29aのいずれか1項による抗体、又は段落52a〜55aのいずれか1項による組成物、及び前記抗体と転移がん細胞との結合を特定できる1種以上の試薬を、疾患若しくは障害を有する患者、又は疾患若しくは障害を発現するリスクのある患者に投与することを含む方法。
66a.段落1a〜29aのいずれか1項による抗体、及び前記メンバーと転移がん細胞との結合を特定できる1種以上の試薬を含む診断キット。
67a.段落1a〜29aのいずれか1項による抗体、又は段落52a〜55aのいずれか1項による組成物を含むキット。
68a.薬学的に許容される賦形剤とともに、有効量の段落1a〜29aによる抗体を活性成分として含む医薬組成物。
マウス抗Axlモノクローナル抗体の生成
C末端Mycエピトープと融合させた全長ヒトAxlをコードするプラスミドを用いた、免疫応答性NMRIマウス(チャールズリバー)のDNA免疫法により、ヒトAxl受容体に対するモノクローナル抗体(MAb)を生成した。
C末端Mycエピトープと融合させた全長ヒトAxlをコードするプラスミドを用いた、免疫応答性NMRIマウス(チャールズリバー)のDNA免疫法により、ヒトAxl受容体に対するモノクローナル抗体(MAb)を生成した。
血中にrhAxl特異的抗体の存在を示すマウス由来の脾臓細胞を、標準的プロトコルによるマウス骨髄腫細胞との融合に用いた。各細胞を、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン(HAT)培地を入れたプレート(ウェル当たり105細胞)中で培養し、ハイブリドーマを選抜した。12日間の選抜後、生成された14のハイブリドーマの上清を採取して、酵素結合による免疫吸着アッセイ(ELISA)及びフローサイトメトリーにてAxl結合を検出した。限界希釈法による2巡目のサブクローニング後に最も高い抗原結合活性を示す、3つの陽性クローンを拡大培養し、インビトロでの大規模な抗体産生を行った。プロテインGアフィニティクロマトグラフィーにより、MAbを細胞培養上清から精製した。
フローサイトメトリーでAxl+細胞に特異的な結合を示す抗体クローン10C9及び10G5を選抜してさらに性質決定した。
フローサイトメトリーのため、培養液中の付着細胞をPBSで洗浄し、1分間のトリプシン(0.25%)処理により分離し、培養皿を叩いて完全に剥離させた。組織培養用フラスコに完全培地を添加してトリプシンをクエンチした後、細胞をPBSで洗浄した。洗浄工程中に、5分間200gの遠心分離により細胞を収集した。0.02%ウシ血清アルブミン(BSA)含有PBSで、抗体の総濃度を希釈した。
105個の細胞を含む200μLの細胞懸濁液を用いて、室温で20分間、細胞染色を実施した。PBS/0.02%BSAによる2段階の洗浄後、細胞を200μLに再懸濁して、濃度2μg/mLのAPC複合体化ロバ抗マウスIgG(H+L)二次抗体(Jackson Laboratories、カタログ番号715−136−150)とともに室温で20分間インキュベートした。染色した細胞をPBS/0.02%BSAで2回洗浄し、BD LSR Fortessa細胞分析器(BD Biosciences)を用いて分析するまで、氷で保存した。
マウスモノクローナル抗体10C9及び10G5はヒトTAM受容体ファミリーの他のメンバーと交差反応しない
結合実験はすべて、Biacore 3000装置(GE Healthcare)を用いて25℃で実施した。ヒトTAM受容体ファミリーのメンバーである、Axl(rhAxl−Fcキメラ;R&D Systems、カタログ番号154−AL)、Mer(rhMer−Fcキメラ;R&D Systems、カタログ番号891−MR)及びTyro3(rhTyro3/Dtk−Fcキメラ;R&D Systems、カタログ番号859−DK)の細胞外ドメインに対応する可溶性組換え抗原を、CM5センサーチップの表面にアミンカップリングを利用して、各々表面密度393.0、303.6及び364.0のレゾナンスユニット(RU)で固定化した。Biacoreの稼働は、Binding analysisウィザードを用いた自動モードで実施した。HBS−EP緩衝液(GE Healthcare)中に濃度10μg/mLのMAb 10C9又はMAb 10G5を含有している試料を、固定化抗原を有する表面全体に流速30μL/分で3分間注入(会合)した後、5分間、解離させた。
結合実験はすべて、Biacore 3000装置(GE Healthcare)を用いて25℃で実施した。ヒトTAM受容体ファミリーのメンバーである、Axl(rhAxl−Fcキメラ;R&D Systems、カタログ番号154−AL)、Mer(rhMer−Fcキメラ;R&D Systems、カタログ番号891−MR)及びTyro3(rhTyro3/Dtk−Fcキメラ;R&D Systems、カタログ番号859−DK)の細胞外ドメインに対応する可溶性組換え抗原を、CM5センサーチップの表面にアミンカップリングを利用して、各々表面密度393.0、303.6及び364.0のレゾナンスユニット(RU)で固定化した。Biacoreの稼働は、Binding analysisウィザードを用いた自動モードで実施した。HBS−EP緩衝液(GE Healthcare)中に濃度10μg/mLのMAb 10C9又はMAb 10G5を含有している試料を、固定化抗原を有する表面全体に流速30μL/分で3分間注入(会合)した後、5分間、解離させた。
図1に示した結果は、マウスモノクローナル抗体10C9及び10G5がヒトAxlに対して特異的な結合性を示し、組換えヒトMer及びTyro3抗原には結合しなかったことを示す。
マウスモノクローナル抗体10C9及び10G5はマウスAxlと交差反応しない
結合実験は、Biacore 3000装置(GE Healthcare)を用いて25℃で実施した。ヒトAxl(rhAxl−Fcキメラ;R&D Systems、カタログ番号154−AL)、マウスAxl(rmAxl−Fcキメラ;R&D Systems、R&D Systems、カタログ番号854−AX)及びヒトTyro3(rhTyro3/Dtk−Fcキメラ;R&D Systems、カタログ番号859−DK)に対応する可溶性組換え抗原を、CM5センサーチップの表面にアミンカップリングを利用して、各々表面密度1,308.0、2,115.9及び1,429.0RUで固定化した。Biacoreの稼働は、Binding analysisウィザードを用いた自動モードで実施した。
結合実験は、Biacore 3000装置(GE Healthcare)を用いて25℃で実施した。ヒトAxl(rhAxl−Fcキメラ;R&D Systems、カタログ番号154−AL)、マウスAxl(rmAxl−Fcキメラ;R&D Systems、R&D Systems、カタログ番号854−AX)及びヒトTyro3(rhTyro3/Dtk−Fcキメラ;R&D Systems、カタログ番号859−DK)に対応する可溶性組換え抗原を、CM5センサーチップの表面にアミンカップリングを利用して、各々表面密度1,308.0、2,115.9及び1,429.0RUで固定化した。Biacoreの稼働は、Binding analysisウィザードを用いた自動モードで実施した。
HBS−EP緩衝液(GE Healthcare)中に濃度10μg/mLでMAb 10C9、MAb 10G5、又は組換えマウス(rm)Axl−リガンドGas6(R&D Systems、カタログ番号986−GS/CF)を含有している試料を、固定化抗原を有する表面全体に流速30μL/分で3分間注入(会合)した後、5分間、解離させた。
図2に示した結果は、MAb 10C9及び10G5がヒトAxlと特異的に相互作用し、組換えマウスAxl及びヒトMer抗原には結合しなかったことを示す(各々、図2の上段及び中段パネル)。対照的に、対照として用いたマウスGas6は、ヒト及びマウスAxlの両方と強い結合性を示し、ヒトTyro3とはそれより幾分弱い結合性を示した(図2、下段パネル)。
マウスモノクローナル抗体10C9及び10G5は非ヒト霊長類由来のAxl受容体と特異的に結合する
カニクイザル由来のAxl受容体の配列(Macaca fascicularis;配列番号43)をWO2009062690A1から取得した。配列に基づいて、cyno−Axlの組換え細胞外ドメインをCHO細胞での一時的発現によりヒトFcとの融合タンパク質として生成した。組換えcyno−Axl−Fcを、プロテインA−セファロース(GE Healthcare)を用いて均一に精製した。結合実験は、Biacore 3000装置(GE Healthcare)を用いて25℃で実施した。ヒトAxl(rhAxl−Fcキメラ;R&D Systems、カタログ番号154−AL)及びcyno−Axlに対応する可溶性組換え抗原を、CM5センサーチップの表面にアミンカップリングを利用して、各々表面密度775及び880RUで固定化した。Biacoreの稼働は、Binding analysisウィザードを用いた自動モードで実施した。
カニクイザル由来のAxl受容体の配列(Macaca fascicularis;配列番号43)をWO2009062690A1から取得した。配列に基づいて、cyno−Axlの組換え細胞外ドメインをCHO細胞での一時的発現によりヒトFcとの融合タンパク質として生成した。組換えcyno−Axl−Fcを、プロテインA−セファロース(GE Healthcare)を用いて均一に精製した。結合実験は、Biacore 3000装置(GE Healthcare)を用いて25℃で実施した。ヒトAxl(rhAxl−Fcキメラ;R&D Systems、カタログ番号154−AL)及びcyno−Axlに対応する可溶性組換え抗原を、CM5センサーチップの表面にアミンカップリングを利用して、各々表面密度775及び880RUで固定化した。Biacoreの稼働は、Binding analysisウィザードを用いた自動モードで実施した。
HBS−EP緩衝液(GE Healthcare)中に濃度10μg/mLでMAb 10C9、MAb 10G5、又はヒトAxl特異的MAb 5F11(対照)を含有している試料を、固定化抗原を有する表面全体に流速30μL/分で3分間注入(会合)した後、5分間、解離させた。
図3に示した結果は、MAb 10C9及び10G5がヒト及びカニクイザル由来両方のAxl抗原と強力かつ特異的に相互作用することを示す。対照的に、対照抗体5F11は、ヒトAxlとは強力な結合性を示したが、カニクイザル由来のAxlとの交差反応性は示さなかった。
マウスモノクローナル抗体10C9及び10G5の親和性測定
抗Axl抗体10C9及び10G5の親和性測定は、Biacore 3000装置(GE Healthcare)を用いて表面プラズモン共鳴測定により25℃で実施した。固体の抗原コーティング面として、密度190RUでrhAxl−Fcキメラ(R&D Systems、カタログ番号154−AL)を固定化したセンサーチップCM5を用いた。
抗Axl抗体10C9及び10G5の親和性測定は、Biacore 3000装置(GE Healthcare)を用いて表面プラズモン共鳴測定により25℃で実施した。固体の抗原コーティング面として、密度190RUでrhAxl−Fcキメラ(R&D Systems、カタログ番号154−AL)を固定化したセンサーチップCM5を用いた。
速度論的測定のため、HBS−EP緩衝液(Biacore、カタログ番号BR−1001−88)中の濃度の異なる抗Axl抗体(0.3〜666.7nM)を流速30μL/分、注入時間3分間で注入した後、5分間、解離させた(緩衝液のみ)。各サイクル後、再生溶液(10mMのHCl、1MのNaCl)を30秒間、流速50μL/分で注入することにより表面を再生した。
物質移動制御実験は、用いたMAb 10C9及び10G5の両方に有意な物質移動限界が見られないことを示した。付加的な結合反応制御実験では、1濃度のアナライト(MAb 10C9が790nM、10G5が160nM)を1分、3分又は20分間注入した後、解離相が実質的に同一であったため、両方の抗体には結合反応は見られなかった。
速度論的会合速度(結合速度、kon)及び速度論的解離速度(解離速度、koff)は、BIAevaluationソフトウェア及び1:1のLangmuir結合モデルを用いて算出した。平衡解離定数(KD)はkoff/kon比で算出した。形成された抗体−抗原複合体の半減期(t1/2)はln2/koff比で算出した。
図4に示すように、マウスMAb 10C9及び10G5は、各々、KD値0.18nM及び0.53nMの、ナノモル以下範囲の高親和性を示した。
マウスモノクローナル抗体10C9及び10G5はGAS6のAXLへの結合を阻止する
競合結合試験は、Biacore 3000装置(GE Healthcare)及びBinding Analysisウィザードを使用し、2つの試料を数サイクル注入して実施した。第1の試料として、飽和濃度のMAb 10C9(790nM、すなわち120μg/mL)又は10G5(160nM、すなわち24μg/mL)を、rhAxl−Fcでコーティング(アミンカップリング法を使用)されたCM5センサーチップの表面全体に、流速30μL/分で、3分間注入し、続いて2.5分間、安定化させた(HBS−EP緩衝液のみ)後、第2の試料を注入した。第2の試料には、組換えヒト(rh)Gas6(R&D Systems、カタログ番号885−GS)、組換えマウス(rm)Gas6(R&D Systems、カタログ番号986−GS/CF)並びに抗Axl抗体のパネル、例えばMAB154(R&D Systems、カタログ番号MAB154)、10C9及び10G5を用いた。濃度はすべて25μg/mLである。第2の試料を3分間注入し、続いて2.5分間、安定化(緩衝液のみ)させ、さらに流速50μL/分で再生溶液(10mMのHCl、1MのNaCl)を30秒間注入することにより表面を再生した。
競合結合試験は、Biacore 3000装置(GE Healthcare)及びBinding Analysisウィザードを使用し、2つの試料を数サイクル注入して実施した。第1の試料として、飽和濃度のMAb 10C9(790nM、すなわち120μg/mL)又は10G5(160nM、すなわち24μg/mL)を、rhAxl−Fcでコーティング(アミンカップリング法を使用)されたCM5センサーチップの表面全体に、流速30μL/分で、3分間注入し、続いて2.5分間、安定化させた(HBS−EP緩衝液のみ)後、第2の試料を注入した。第2の試料には、組換えヒト(rh)Gas6(R&D Systems、カタログ番号885−GS)、組換えマウス(rm)Gas6(R&D Systems、カタログ番号986−GS/CF)並びに抗Axl抗体のパネル、例えばMAB154(R&D Systems、カタログ番号MAB154)、10C9及び10G5を用いた。濃度はすべて25μg/mLである。第2の試料を3分間注入し、続いて2.5分間、安定化(緩衝液のみ)させ、さらに流速50μL/分で再生溶液(10mMのHCl、1MのNaCl)を30秒間注入することにより表面を再生した。
図5に示した結果は、MAb 10C9及び10G5はいずれも、Axlの結合を、市販の対照抗体MAB154(R&D Systems)と競合しないことを示した。他方で、抗体10C9及び10G5は互いの結合を阻害し、加えて、ヒト及びマウス起源の両方で、そのリガンドGas6によるAxlの結合を阻害した。
3次元(3D)器官型モデルにおいて、マウスモノクローナル抗体10C9及び10G5は高悪性度乳がん細胞の成長を阻害する
高悪性度トリプルネガティブヒト乳がん細胞株MDA−MB−231(ATCC(登録商標)HTB−26(商標))を、10%のウシ胎児血清(FBS)、グルタミン並びにペニシリン及びストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物F−12ハム培地中で、推奨条件に従って培養した。培養した細胞を、細胞表面に抗体の適当な結合が確認されるまで、懸濁液中で少なくとも1時間、37℃で前処理した後、細胞外マトリックスに定置した。細胞培養液は毎日観察し、1日おきに交換処理を行った。抗体は濃度50〜100μg/mLで用いた。位相差及びホフマン光学系両方を利用したNIKON光学顕微鏡で、カバーガラス3Dイメージング分析(35mmディッシュ)を実施した。既に3日目にして、MAb 10C9又はMAb10G5で処理された細胞と、対照の無関係なIgGで処理された細胞との間に成長差が見られた。6日目で、抗体10C9又は10G5で処理された細胞は、対照で処理された細胞と比較して、細胞外マトリックスでの成長と腫瘤の発現を有意に阻害したことが明らかになった(図6)。核染色により、MAb 10G5で処理された細胞は成長を阻害されたが、まだ生存していることが明らかとなった。類似の効果は抗体10C9でも観察された。この実験は、抗Axl抗体10C9及び10G5のいずれもが、器官型腫瘤の発現を阻害する見込みがあることを実証した。
高悪性度トリプルネガティブヒト乳がん細胞株MDA−MB−231(ATCC(登録商標)HTB−26(商標))を、10%のウシ胎児血清(FBS)、グルタミン並びにペニシリン及びストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物F−12ハム培地中で、推奨条件に従って培養した。培養した細胞を、細胞表面に抗体の適当な結合が確認されるまで、懸濁液中で少なくとも1時間、37℃で前処理した後、細胞外マトリックスに定置した。細胞培養液は毎日観察し、1日おきに交換処理を行った。抗体は濃度50〜100μg/mLで用いた。位相差及びホフマン光学系両方を利用したNIKON光学顕微鏡で、カバーガラス3Dイメージング分析(35mmディッシュ)を実施した。既に3日目にして、MAb 10C9又はMAb10G5で処理された細胞と、対照の無関係なIgGで処理された細胞との間に成長差が見られた。6日目で、抗体10C9又は10G5で処理された細胞は、対照で処理された細胞と比較して、細胞外マトリックスでの成長と腫瘤の発現を有意に阻害したことが明らかになった(図6)。核染色により、MAb 10G5で処理された細胞は成長を阻害されたが、まだ生存していることが明らかとなった。類似の効果は抗体10C9でも観察された。この実験は、抗Axl抗体10C9及び10G5のいずれもが、器官型腫瘤の発現を阻害する見込みがあることを実証した。
抗体10C9及び10G5は、インビトロの3D腫瘍クローンの形態変化を誘発する
MDA−MB−231細胞を細胞外マトリックス上で増殖させ、高悪性度の星形形態を形成させる。次に、星形の腫瘤を、実施例7に記載されるように、対照IgG並びに抗体10C9及び10G5で処理した。抗体10C9及び10G5はいずれも、細胞死とDNA断片化に伴う星形パターンの分解を引き起こした(図7)。当該結果は、特異的モノクローナル抗体10C9及び10G5を用いたAxlの阻害が、インビトロの3Dモデルで強い抗腫瘍効果を有することを実証した。
MDA−MB−231細胞を細胞外マトリックス上で増殖させ、高悪性度の星形形態を形成させる。次に、星形の腫瘤を、実施例7に記載されるように、対照IgG並びに抗体10C9及び10G5で処理した。抗体10C9及び10G5はいずれも、細胞死とDNA断片化に伴う星形パターンの分解を引き起こした(図7)。当該結果は、特異的モノクローナル抗体10C9及び10G5を用いたAxlの阻害が、インビトロの3Dモデルで強い抗腫瘍効果を有することを実証した。
抗体10C9及び10G5はAxl受容体の内在化を誘発する
異なる抗体で処理されたMBA−MD−231細胞でのAxl受容体タンパク質の発現を、ウェスタンブロット解析により検討した。細胞を1ウェル当たり5x105細胞の密度で6ウェルプレートに播種し、一晩培養した後、処理を開始した。細胞をアイソタイプ対照(マウスIgG2b)、濃度100μg/mLの抗Axl抗体(10C9、10G5及びMAb#3)、又は濃度0.5μMのマルチキナーゼ阻害剤フォレチニブ(Met、Ron、Axl、Tie−2及びVEGFR2を標的とする)の存在下で20時間処理し、続いて1,200rpmで5分間遠心分離して採取し、滅菌PBSで洗浄した。遠心分離により細胞を採取して、NP40溶解緩衝液で再懸濁した後、30分間、氷上でインキュベートした。細胞可溶化物を遠心分離(12,000rpm、4℃、5分)により清澄化し、BCAタンパク質アッセイを利用してタンパク質濃度を測定した。35μgの総タンパク質を含む細胞可溶化物試料を、還元剤(Life Technologies)の存在下で変性させ、NuPAGE10%Bis−Trisポリアクリルアミド(PAA)ゲル、1.0mmx12ウェル(Invitrogen)の各ウェルに充填した。Bis−Tris SDSランニング緩衝液を用いて、推奨条件(Life Technologies)下で電気泳動を実施し、20%メタノールを用いた転写緩衝液を用いて、XCell II(商標)Blot Module(Invitrogen)用マニュアルの2種類のゲルに関する記載のようにタンパク質をPVDF膜に転写した。5%のスキムミルクを加えたTBS/0.1%Tween20(TBST)の10mLブロッキング緩衝液中で、室温にて1時間、膜をインキュベートし、続いて抗Axl MAb154(R&D Systems)の1:1000希釈液を含有する5mLのインキュベーション緩衝液(3%のスキムミルクを加えたTBST)中で、4℃で一晩インキュベートした。膜を10mLのTBSTで5分ずつ3回洗浄し、続いて5mLのインキュベーション緩衝液中のヤギ抗マウスIgG(H+L)HRP複合体二次抗体(1:2000)とともに、室温で静かに転がしながら1時間インキュベートした。その後、膜を10mLのTBSTで5分間に3回、さらに10mLのTBS緩衝液で2回洗浄した。膜を1mLのECL基質とともに室温で1分間インキュベートした。過剰な基質溶液を吸引し、ブロットをChemiDoc(商標)XRS+撮像装置(Bio Rad)及びImage labソフトウェアを用いて可視化した。負荷対照として、マウス抗アクチン抗体(1:10,000;Sigma)を用いた検出を同条件下で行った。
異なる抗体で処理されたMBA−MD−231細胞でのAxl受容体タンパク質の発現を、ウェスタンブロット解析により検討した。細胞を1ウェル当たり5x105細胞の密度で6ウェルプレートに播種し、一晩培養した後、処理を開始した。細胞をアイソタイプ対照(マウスIgG2b)、濃度100μg/mLの抗Axl抗体(10C9、10G5及びMAb#3)、又は濃度0.5μMのマルチキナーゼ阻害剤フォレチニブ(Met、Ron、Axl、Tie−2及びVEGFR2を標的とする)の存在下で20時間処理し、続いて1,200rpmで5分間遠心分離して採取し、滅菌PBSで洗浄した。遠心分離により細胞を採取して、NP40溶解緩衝液で再懸濁した後、30分間、氷上でインキュベートした。細胞可溶化物を遠心分離(12,000rpm、4℃、5分)により清澄化し、BCAタンパク質アッセイを利用してタンパク質濃度を測定した。35μgの総タンパク質を含む細胞可溶化物試料を、還元剤(Life Technologies)の存在下で変性させ、NuPAGE10%Bis−Trisポリアクリルアミド(PAA)ゲル、1.0mmx12ウェル(Invitrogen)の各ウェルに充填した。Bis−Tris SDSランニング緩衝液を用いて、推奨条件(Life Technologies)下で電気泳動を実施し、20%メタノールを用いた転写緩衝液を用いて、XCell II(商標)Blot Module(Invitrogen)用マニュアルの2種類のゲルに関する記載のようにタンパク質をPVDF膜に転写した。5%のスキムミルクを加えたTBS/0.1%Tween20(TBST)の10mLブロッキング緩衝液中で、室温にて1時間、膜をインキュベートし、続いて抗Axl MAb154(R&D Systems)の1:1000希釈液を含有する5mLのインキュベーション緩衝液(3%のスキムミルクを加えたTBST)中で、4℃で一晩インキュベートした。膜を10mLのTBSTで5分ずつ3回洗浄し、続いて5mLのインキュベーション緩衝液中のヤギ抗マウスIgG(H+L)HRP複合体二次抗体(1:2000)とともに、室温で静かに転がしながら1時間インキュベートした。その後、膜を10mLのTBSTで5分間に3回、さらに10mLのTBS緩衝液で2回洗浄した。膜を1mLのECL基質とともに室温で1分間インキュベートした。過剰な基質溶液を吸引し、ブロットをChemiDoc(商標)XRS+撮像装置(Bio Rad)及びImage labソフトウェアを用いて可視化した。負荷対照として、マウス抗アクチン抗体(1:10,000;Sigma)を用いた検出を同条件下で行った。
図8に示した結果は、無関係なIgG又はMAb#3のいずれかで処理された細胞と比較して、MAb 10C9及び10G5で処理された細胞中のAxlタンパク質が有意に低減することを示した。この結果は、MAb 10C9及び10G5がAxl受容体の内在化及び細胞内分解を誘発することを示す。
抗体10C9及び10G5は、リガンド誘導性のAxl下流シグナル伝達を阻害する
本実験は、ヒト子宮頸がん由来の細胞株HeLa(ATCC(登録商標)CCL−2(商標))を用いて実施した。T175フラスコに、10%のFBS、ペニシリン−ストレプトマイシン及びLグルタミン補充MEM培地(Sigma)中で集密度80%まで細胞を増殖させた。細胞をPBSで洗浄し、0.25%のトリプシン/EDTA(Sigma)で処理して剥離し、続いて遠心分離して、新鮮な培地(MEM/0.5%FBS)で再懸濁した。10%FBS補充MEM培地を入れたペトリ皿に細胞を播種した(1皿当たり3x106細胞)。37℃で3時間培養した後、細胞をPBSで洗浄し、飢餓培地(MEM/0.5%FBS)中で一晩保存した。濃度1μg/mlの抗Axl抗体10C9又は10G5とともに、細胞を1時間プレインキュベートし、続いて濃度10μg/mLの、Axlリガンドである組換えマウスGas6(R&D Systems)で20分間刺激した。細胞可溶化物を実施例9に記載されるように調製し、抗ホスホ−Akt(Ser473)抗体(Cell Signaling)、続いてヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ(Jackson ImmunoResearch)を用いてウェスタンブロット解析を実施した。抗ホスホ−Aktは、AKT1、AKT2及びAKT3を区別していないため、ブロットには「ホスホ−Akt」の総レベルを示す。抗GAPDH抗体(Millipore)による検出を、負荷対照として用いた。
本実験は、ヒト子宮頸がん由来の細胞株HeLa(ATCC(登録商標)CCL−2(商標))を用いて実施した。T175フラスコに、10%のFBS、ペニシリン−ストレプトマイシン及びLグルタミン補充MEM培地(Sigma)中で集密度80%まで細胞を増殖させた。細胞をPBSで洗浄し、0.25%のトリプシン/EDTA(Sigma)で処理して剥離し、続いて遠心分離して、新鮮な培地(MEM/0.5%FBS)で再懸濁した。10%FBS補充MEM培地を入れたペトリ皿に細胞を播種した(1皿当たり3x106細胞)。37℃で3時間培養した後、細胞をPBSで洗浄し、飢餓培地(MEM/0.5%FBS)中で一晩保存した。濃度1μg/mlの抗Axl抗体10C9又は10G5とともに、細胞を1時間プレインキュベートし、続いて濃度10μg/mLの、Axlリガンドである組換えマウスGas6(R&D Systems)で20分間刺激した。細胞可溶化物を実施例9に記載されるように調製し、抗ホスホ−Akt(Ser473)抗体(Cell Signaling)、続いてヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ(Jackson ImmunoResearch)を用いてウェスタンブロット解析を実施した。抗ホスホ−Aktは、AKT1、AKT2及びAKT3を区別していないため、ブロットには「ホスホ−Akt」の総レベルを示す。抗GAPDH抗体(Millipore)による検出を、負荷対照として用いた。
図9に示した結果は、Ser473上のAktの下流リン酸化を読み取り値として用いた場合に、Axl特異的リガンドGas6が、Hela細胞で強力なAxlシグナル伝達を誘発することを示した。このシグナル伝達を抗体10C9の存在下で有意に低減できた。抗体10G5においても類似した結果が得られた。
マウスモノクローナル抗体10C9及び10G5の配列決定
ハイブリドーマ細胞を標準条件下で増殖させた。5x106個のハイブリドーマ細胞を使用し、標準プロトコルに従ってmRNAの単離及びcDNA合成を行った。重鎖及び軽鎖可変領域(各々、VH及びVL)をコードする遺伝子のPCR増幅のため、Mouse IgG Library Primer Set(Progen、Heidelberg,Germany、カタログ番号F2010)を用いた。ハイブリドーマ10C9では、異なるプライマーの組み合わせを用いたPCR増幅により、VH遺伝子に対する5種類のプライマーの組み合わせを用いたPCRから9配列を、VL遺伝子に対する2種類のプライマーの組み合わせを用いたPCRから5配列を得た。その後の作業のため、IMGTデータベースとのヌクレオチドアラインメントにより決定される、対応する生殖細胞系配列との最大相同性を基準としてクローンVH1(A7−1)及びVκ2(E2−2)の配列を選抜した。
ハイブリドーマ細胞を標準条件下で増殖させた。5x106個のハイブリドーマ細胞を使用し、標準プロトコルに従ってmRNAの単離及びcDNA合成を行った。重鎖及び軽鎖可変領域(各々、VH及びVL)をコードする遺伝子のPCR増幅のため、Mouse IgG Library Primer Set(Progen、Heidelberg,Germany、カタログ番号F2010)を用いた。ハイブリドーマ10C9では、異なるプライマーの組み合わせを用いたPCR増幅により、VH遺伝子に対する5種類のプライマーの組み合わせを用いたPCRから9配列を、VL遺伝子に対する2種類のプライマーの組み合わせを用いたPCRから5配列を得た。その後の作業のため、IMGTデータベースとのヌクレオチドアラインメントにより決定される、対応する生殖細胞系配列との最大相同性を基準としてクローンVH1(A7−1)及びVκ2(E2−2)の配列を選抜した。
ハイブリドーマ10G5では、異なるプライマーの組合せを用いたPCR増幅により、VH遺伝子に対する6種類のプライマーの組み合わせを用いたPCRから12配列を、VL遺伝子に対する2種類のプライマーの組み合わせを用いたPCRから5配列を得た。その後の作業のため、IMGTデータベースとのヌクレオチドアラインメントにより決定される、対応する生殖細胞系配列との最大相同性を基準としてクローンVH1(B6−4)及びVκ1(F1−3)の配列を選抜した。
抗体10C9及び10G5のVH及びVLドメインの推定アミノ酸配列を図10に示す。配列解析から、重鎖のCDR1に見込まれるN−グリコシル化部位の存在が明らかになった(CDR−H1;図10で「NFT」のグリコシル化部位を太字で示す)。
VHドメインの1位のグルタミン(Q)がグルタミン酸(E)と置換された場合の10G5のVH変異体の配列も図10に含まれている。この変異体を「10G5[Q1E]」と称する。
キメラモノクローナル抗体10C9及び10G5の生成及び試験
マウスハイブリドーマ10C9及び10G5から取得したVH及びVL配列を用いて、哺乳動物細胞(GeneArt)の発現にコドンが最適化された合成遺伝子を生成した。当該マウスVH及びVL遺伝子を各々、ヒトIgG1重鎖及び軽鎖(C−カッパ)の定常ドメインをコードする遺伝子要素とともに、哺乳動物細胞の抗体産生に適した発現ベクターにインフレームでライゲーションした。キメラ(マウス可変/ヒト定常)IgG1抗体の産生をチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞での一時的発現により達成した後、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製した。
マウスハイブリドーマ10C9及び10G5から取得したVH及びVL配列を用いて、哺乳動物細胞(GeneArt)の発現にコドンが最適化された合成遺伝子を生成した。当該マウスVH及びVL遺伝子を各々、ヒトIgG1重鎖及び軽鎖(C−カッパ)の定常ドメインをコードする遺伝子要素とともに、哺乳動物細胞の抗体産生に適した発現ベクターにインフレームでライゲーションした。キメラ(マウス可変/ヒト定常)IgG1抗体の産生をチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞での一時的発現により達成した後、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製した。
フローサイトメトリーで、精製されたキメラ抗体(純度95%超)のAxl陽性乳がん細胞株MDA−MB−231との結合を分析した。比較のため、親マウスのMAb 10C9及び10G5を用いた。フローサイトメトリーに備え、培養液中の付着細胞をPBSで洗浄し、1分間のトリプシン(0.25%)処理により分離し、培養皿を叩いて完全に剥離させた。組織培養用フラスコに完全培地を添加してトリプシンをクエンチした後、細胞をPBSで洗浄した。洗浄工程中に、5分間200gの遠心分離により細胞を収集した。0.02%ウシ血清アルブミン(BSA)含有PBSで、抗体の総濃度を希釈した。105個の細胞を含む200μLの細胞懸濁液を用いて、室温で20分間、細胞染色を実施した。APC複合体ロバ抗ヒト又は抗マウス各々のIgG(H+L)F(ab’)2断片(Jackson ImmunoResearch)を用いて、細胞に結合した抗体を検出した。PBS/0.02%BSAによる2段階の洗浄後、細胞を200μLに再懸濁して、Accuri C6フローサイトメーター(BD Biosciences)で分析するまで氷で保存した。図11に示した結果から、フローサイトメトリーにおいてキメラ抗体はAxl陽性MDA−MB−231細胞との強い結合を示した。
加えて、キメラ抗体c10C9及びc10G5のAxl結合特性を、Biacore 3000装置(GE Healthcare)及び表面密度1,308.0RUでヒトAxl(rhAxl−Fcキメラ;R&D Systems、カタログ番号154−AL)をコーティングしたセンサーチップCM5を用いて試験した。Biacoreの稼働は、Binding analysisウィザードを用いた自動モードで実施した。HBS−EP緩衝液(GE Healthcare)中に濃度10μg/mLのキメラ抗体c10C9及びc10G5又はそれに相当するマウス抗体を含有している試料を、固定化抗原を有する表面全体に流速30μL/分で3分間注入(会合)した後、5分間、解離させた。
図12に示す結果は、キメラ抗体c10C9及びc10G5はいずれも、ハイブリドーマ10C9及び10G5に由来するマウス抗体の相当する結合プロファイルと極めて類似したプロファイルで、固定化されたAxlと結合することを示す。
キメラ抗体10C9及び10G5は親マウス抗体と同じ親和性でAxlを結合する
キメラ抗Axl抗体c10C9及びc10G5の親和性測定は、Biacore 3000装置(GE Healthcare)を用いて表面プラズモン共鳴測定により25℃で実施した。固体の抗原コーティング面として、密度190RUでrhAxl−Fcキメラ(R&D Systems、カタログ番号154−AL)を固定化したセンサーチップCM5を用いた。
キメラ抗Axl抗体c10C9及びc10G5の親和性測定は、Biacore 3000装置(GE Healthcare)を用いて表面プラズモン共鳴測定により25℃で実施した。固体の抗原コーティング面として、密度190RUでrhAxl−Fcキメラ(R&D Systems、カタログ番号154−AL)を固定化したセンサーチップCM5を用いた。
速度論的測定のため、HBS−EP緩衝液(Biacore、カタログ番号BR−1001−88)中の濃度の異なる抗Axl抗体(0.3〜333.3nM)を流速30μL/分、注入時間3分間で注入した後、5分間、解離させた(緩衝液のみ)。各サイクル後、再生溶液(10mMのHCl、1MのNaCl)を30秒間、流速50μL/分で注入することにより表面を再生した。
物質移動制御実験は、キメラMAb c10C9及びc10G5両方に有意な物質移動限界が見られないことを示した。
速度論的会合速度(結合速度、kon)及び速度論的解離速度(解離速度、koff)は、BIAevaluationソフトウェア及び1:1のLangmuir結合モデルを用いて算出した。平衡解離定数(KD)はkoff/kon比で算出した。形成された抗体−抗原複合体の半減期(t1/2)はln2/koff比で算出した。
図13に示すように、キメラMAb c10C9及びc10G5はいずれも、親マウス抗体の親和性を若干上回る(実施例5を参照)、KD値0.10nMのナノモル以下範囲の高親和性を示した。
キメラ抗体10G5は、ヒト非小細胞肺がんのマウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害する
抗Axlキメラ抗体のインビボでの抗腫瘍活性を評価するために、本発明者らは、ヒト非小細胞肺がん(NSCLC)のマウス異種移植モデルを用いた。ヒトNSCLC A549細胞(ATCC#CCL−185)A549細胞を、10%のFBS、2mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン、0.01MのHEPES緩衝液、0.45%のD−(+)−グルコース、1mMピルビン酸ナトリウム補充DMEM培地中で、単層培養としてインビトロで増殖させた。ヌードマウスの側腹部に、無血清培地/マトリゲル(1:1)で再懸濁した5x106のA549細胞を皮下(s.c.)注入した。腫瘍サイズが100mm3に達したら(図14の0日目)、動物をランダム化して、4週間、週2回の腹腔内(i.p.)注入により、20mg/kgのビヒクル(滅菌PBS)又は抗Axlキメラ抗体10G5のいずれかで処置した。
抗Axlキメラ抗体のインビボでの抗腫瘍活性を評価するために、本発明者らは、ヒト非小細胞肺がん(NSCLC)のマウス異種移植モデルを用いた。ヒトNSCLC A549細胞(ATCC#CCL−185)A549細胞を、10%のFBS、2mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン、0.01MのHEPES緩衝液、0.45%のD−(+)−グルコース、1mMピルビン酸ナトリウム補充DMEM培地中で、単層培養としてインビトロで増殖させた。ヌードマウスの側腹部に、無血清培地/マトリゲル(1:1)で再懸濁した5x106のA549細胞を皮下(s.c.)注入した。腫瘍サイズが100mm3に達したら(図14の0日目)、動物をランダム化して、4週間、週2回の腹腔内(i.p.)注入により、20mg/kgのビヒクル(滅菌PBS)又は抗Axlキメラ抗体10G5のいずれかで処置した。
図14に示すように、キメラ抗体10G5は、対照と比較して、A549腫瘍の成長を有意に減衰させた(P<0.01、双方向ANOVAにより決定)。4週間の処置後、約40%の阻害が観察された。
キメラ抗体10G5は、ヒト急性骨髄性白血病のマウス異種移植モデルの腫瘍成長を阻害する
抗Axlキメラ抗体の血液がんモデルでの抗腫瘍活性を評価するために、本発明者らは、ヒト急性骨髄性白血病(AML)のマウス異種移植モデルを用いた。ヒトAML Mv4−11細胞(ATCC#CRL−9591)細胞を、10%のFBS、2mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシン補充IMDM培地の懸濁液中で増殖させた。ヌードマウスの側腹部に、無血清IMDM培地とマトリゲル(1:1)との混合物で再懸濁した5x106のMv4−11細胞をs.c.注入した。腫瘍サイズが200mm3に達したら(図15の0日目)、動物をランダム化して、4週間、週2回のi.p.注入により、30mg/kgのビヒクル(滅菌PBS)又は抗Axlキメラ抗体10G5のいずれかで処置した。
抗Axlキメラ抗体の血液がんモデルでの抗腫瘍活性を評価するために、本発明者らは、ヒト急性骨髄性白血病(AML)のマウス異種移植モデルを用いた。ヒトAML Mv4−11細胞(ATCC#CRL−9591)細胞を、10%のFBS、2mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシン補充IMDM培地の懸濁液中で増殖させた。ヌードマウスの側腹部に、無血清IMDM培地とマトリゲル(1:1)との混合物で再懸濁した5x106のMv4−11細胞をs.c.注入した。腫瘍サイズが200mm3に達したら(図15の0日目)、動物をランダム化して、4週間、週2回のi.p.注入により、30mg/kgのビヒクル(滅菌PBS)又は抗Axlキメラ抗体10G5のいずれかで処置した。
図15に示すように、キメラ抗体10G5は、対照と比較して、Mv4−11腫瘍の成長を極めて有意に減衰させた(P<0.0001、双方向ANOVAにより決定)。3週間の処置後、約75%の阻害が観察された。
非フコシル化グリコシル化操作したC10G5(GLYMAX)は、ヒト非小細胞肺がんのマウスモデルにおいてC10G5と比較して増強された抗腫瘍効果を示す
抗Axl裸抗体は、標定受容体に特異的なシグナル伝達経路を阻害すること、並びに/又はそのエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞障害(ADCC)、補体依存性細胞傷害(CDC)及び/若しくは抗体依存性細胞貪食作用(ADCP)による腫瘍細胞の殺傷のいずれによっても腫瘍成長を防止しうる。コアがフコシル化されていない抗体は、抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害(ADCC)の有意な増強及び抗腫瘍活性作用の増加を示す。
抗Axl裸抗体は、標定受容体に特異的なシグナル伝達経路を阻害すること、並びに/又はそのエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞障害(ADCC)、補体依存性細胞傷害(CDC)及び/若しくは抗体依存性細胞貪食作用(ADCP)による腫瘍細胞の殺傷のいずれによっても腫瘍成長を防止しうる。コアがフコシル化されていない抗体は、抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害(ADCC)の有意な増強及び抗腫瘍活性作用の増加を示す。
キメラ抗体c10G5の2つの変異体(wt及び非フコシル化)の抗腫瘍効果を比較するために、本発明者らは、ヒト非小細胞肺がん(NSCLC)のマウス異種移植モデルを用いた。ヒトNSCLC A549細胞(ATCC#CCL−185)A549細胞を、10%のFBS、2mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン、0.01MのHEPES緩衝液、0.45%のD−(+)−グルコース、1mMピルビン酸ナトリウム補充DMEM培地中で、単層培養としてインビトロで増殖させた。SCIDマウスの側腹部に、無血清培地/マトリゲル(1:1)で再懸濁した5x106のA549細胞を皮下(s.c.)注入した。腫瘍サイズが130mm3に達したら(図15の0日目)、動物をランダム化して、4週間、週2回の腹腔内(i.p.)注入により、30mg/kgの抗Axl c10G5又はGlymax−c10G5のいずれかで処置した。
図16に示すように、抗体Glymax−c10G5は、c10G5と比較して、A549腫瘍の成長を有意に減衰させた(P<0.0001、双方向ANOVAにより決定)。キメラ10G5のwt型と非フコシル化型の活性に有意差が見られたことは、腫瘍成長の阻害における抗体依存性細胞傷害(ADCC)の重要性を示す。
フレームワーク変異体1(FV1)は、ヒト非小細胞肺がんのマウスモデルの腫瘍成長を阻害する
FV1は、CDRを有し、10G5との結合特異性を有するが、Vドメインのフレームワーク領域に複数の置換を有する抗体である。抗Axl FV1のインビボでの抗腫瘍活性を評価するために、本発明者らは、ヒト非小細胞肺がん(NSCLC)のマウス異種移植モデルを用いた。ヒトNSCLC A549細胞(ATCC#CCL−185)A549細胞を、10%のFBS、2mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン、0.01MのHEPES緩衝液、0.45%のD−(+)−グルコース、1mMピルビン酸ナトリウム補充DMEM培地中で、単層培養としてインビトロで増殖させた。SCIDマウスの側腹部に、無血清培地/マトリゲル(1:1)で再懸濁した5x106のA549細胞を皮下(s.c.)注入した。腫瘍サイズが100mm3に達したら(図16の18日目)、動物をランダム化して、2週間、週2回の腹腔内(i.p.)注入により、30mg/kgのビヒクル(SYNAGIS)又は抗Axl FV1のいずれかで処置した。図17に示すように、抗体FV1は、対照と比較して、A549腫瘍の成長を有意に減衰させた(P<0.051、双方向ANOVAにより決定)。2週間の処置後、約25%の阻害が観察された。
FV1は、CDRを有し、10G5との結合特異性を有するが、Vドメインのフレームワーク領域に複数の置換を有する抗体である。抗Axl FV1のインビボでの抗腫瘍活性を評価するために、本発明者らは、ヒト非小細胞肺がん(NSCLC)のマウス異種移植モデルを用いた。ヒトNSCLC A549細胞(ATCC#CCL−185)A549細胞を、10%のFBS、2mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン、0.01MのHEPES緩衝液、0.45%のD−(+)−グルコース、1mMピルビン酸ナトリウム補充DMEM培地中で、単層培養としてインビトロで増殖させた。SCIDマウスの側腹部に、無血清培地/マトリゲル(1:1)で再懸濁した5x106のA549細胞を皮下(s.c.)注入した。腫瘍サイズが100mm3に達したら(図16の18日目)、動物をランダム化して、2週間、週2回の腹腔内(i.p.)注入により、30mg/kgのビヒクル(SYNAGIS)又は抗Axl FV1のいずれかで処置した。図17に示すように、抗体FV1は、対照と比較して、A549腫瘍の成長を有意に減衰させた(P<0.051、双方向ANOVAにより決定)。2週間の処置後、約25%の阻害が観察された。
グリコシル化操作されたFV2(FV2−GLYMAXX)は、ヒト非小細胞肺がんのマウスモデルの腫瘍成長に対する抗EGFR治療薬の効果を増強する
FV2−GLYMAXXは、CDRを有し、10G5との結合特異性を有するが、Vドメインのフレームワーク領域に複数の置換を有する抗体である。抗FV2−GLYMAXXのインビボでの抗腫瘍活性を評価するために、本発明者らは、ヒト非小細胞肺がん(NSCLC)のマウス異種移植モデルを用いた。ヒトNSCLC A549細胞(ATCC#CCL−185)A549細胞を、10%のFBS、2mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン、0.01MのHEPES緩衝液、0.45%のD−(+)−グルコース、1mMピルビン酸ナトリウム補充DMEM培地中で、単層培養としてインビトロで増殖させた。ヌードマウスの側腹部に、無血清培地/マトリゲル(1:1)で再懸濁した5x106のA549細胞を皮下(s.c.)注入した。腫瘍サイズが100mm3に達したら(図18の0日目)、動物をランダム化して、ビヒクル(SYNAGIS)、Erbitux(20mg/kg)又はFV2−GLYMAXX(15又は30mg/kg)のいずれかを単独で若しくは組み合わせて処置した。抗体は、3週間、週2回の腹腔内(i.p.)注入により投与した。
FV2−GLYMAXXは、CDRを有し、10G5との結合特異性を有するが、Vドメインのフレームワーク領域に複数の置換を有する抗体である。抗FV2−GLYMAXXのインビボでの抗腫瘍活性を評価するために、本発明者らは、ヒト非小細胞肺がん(NSCLC)のマウス異種移植モデルを用いた。ヒトNSCLC A549細胞(ATCC#CCL−185)A549細胞を、10%のFBS、2mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン、0.01MのHEPES緩衝液、0.45%のD−(+)−グルコース、1mMピルビン酸ナトリウム補充DMEM培地中で、単層培養としてインビトロで増殖させた。ヌードマウスの側腹部に、無血清培地/マトリゲル(1:1)で再懸濁した5x106のA549細胞を皮下(s.c.)注入した。腫瘍サイズが100mm3に達したら(図18の0日目)、動物をランダム化して、ビヒクル(SYNAGIS)、Erbitux(20mg/kg)又はFV2−GLYMAXX(15又は30mg/kg)のいずれかを単独で若しくは組み合わせて処置した。抗体は、3週間、週2回の腹腔内(i.p.)注入により投与した。
図18に示すように、FV2−GLYMAXXは、抗EGFR治療抗体セツキシマブ(Erbitux)の抗腫瘍効果と酷似した適度な抗腫瘍活性を示した。しかしながら、いずれの抗体も単剤として用いた場合、アイソタイプ対照抗体(Synagis)で処置したマウスコホートと比較して統計学的に有意な効果は観察されなかった。両方の抗体を併用すると、アイソタイプ対照で処置した動物と比較して、有意な腫瘍成長の遅延が得られた(P<0.0001;双方向ANOVAにより決定)。FV2−GLYMAXX抗体又はErbituxのいずれか単独による処置群と比較した場合にも、効果が有意であった(P<0.05;双方向ANOVAにより決定)。
配列
配列番号1[10C9 VHドメイン(nt)]
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGACTTCTGACTACAATTTCACACGCTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAACTGGTGATTCTAAATACAATGAGAAGTTCAAGGGCAGGGCCACACTGACGGCAGACACATCCTCCAGCACTGCCTACATGCAGCTCAGCTCCCAAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGGAATGGTAACTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCGCGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCC
配列番号2[10C9 VLドメイン(nt)]
GATATTGTGATGACGCAGGCTGCACCCTCTGGACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGCAATGGCAACACTTACTTATATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAACTCCTGATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTATCTATTACTGTATGCAACATCGAGAATATCCTTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAACTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCC
配列番号3[10C9 VHドメイン(aa)]
QVQLQQPGPELVKPGASVKISCKTSDYNFTRYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGTGDSKYNEKFKGRATLTADTSSSTAYMQLSSQTSEDSAVYFCARNGNYWYFDVWGAGTAVTVSS
配列番号4[10C9 VLドメイン(aa)]
DIVMTQAAPSGPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGIYYCMQHREYPFTFGGGTKLEIK
配列番号5[10C9重鎖CDR1]
DYNFTRYYIH
配列番号6[10C9重鎖CDR2]
WIYPGTGDSKYNEKFKG
配列番号7[10C9重鎖CDR3]
NGNYWYFDV
配列番号8[10C9軽鎖CDR1]
RSSKSLLHSNGNTYLY
配列番号9[10C9軽鎖CDR2]
RMSNLAS
配列番号10[10C9軽鎖CDR3]
MQHREYPFT
配列番号11[10C9重鎖FR1]
QVQLQQPGPELVKPGASVKISCKTS
配列番号12[10C9重鎖FR2]
WVKQRPGQGLEWIG
配列番号13[10C9重鎖FR3]
RATLTADTSSSTAYMQLSSQTSEDSAVYFCAR
配列番号14[10C9重鎖FR4]
WGAGTAVTVSS
配列番号15[10C9軽鎖FR1]
DIVMTQAAPSGPVTPGESVSISC
配列番号16[10C9軽鎖FR2]
WFLQRPGQSPQLLIY
配列番号17[10C9軽鎖FR3]
GVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGIYYC
配列番号18[10C9軽鎖FR4]
FGGGTKLEIK
配列番号19[10G5 VHドメイン(nt)]
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGTTTCACTGACTTCTATATAAACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGCAAGGATTTTTCCTGGAGGTGATAATACTTACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGAAGAATCCTCCAGCACTGCCTACATACAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCAAGACGGGGACTTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAATCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCC
配列番号20[10G5 VLドメイン(nt)]
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTGCACAGTAATGGAATCCCCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACGCTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGTTCTCAAGGTACACATGTTCCTCCGACGTTCGGTGGTGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCC
配列番号21[10G5 VHドメイン(aa)]
QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTDFYINWVRQRPGQGLEWIARIFPGGDNTYYNEKFKGKATLTAEESSSTAYIQLSSLTSEDSAVYFCARRGLYYAMDYWGQGISVTVSS
配列番号22[10G5 VLドメイン(aa)]
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGIPYLHWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQGTHVPPTFGGGTKLEIK
配列番号23[10G5重鎖CDR1]
GYSFTDFYIN
配列番号24[10G5重鎖CDR2]
RIFPGGDNTYYNEKFKG
配列番号25[10G5重鎖CDR3]
RGLYYAMDY
配列番号26[10G5軽鎖CDR1]
RSSQSLVHSNGIPYLH
配列番号27[10G5軽鎖CDR2]
RVSNRFS
配列番号28[10G5軽鎖CDR3]
SQGTHVPPT
配列番号29[10G5重鎖FR1]
QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKAS
配列番号30[10G5重鎖FR2]
WVRQRPGQGLEWIA
配列番号31[10G5重鎖FR3]
KATLTAEESSSTAYIQLSSLTSEDSAVYFCAR
配列番号32[10G5重鎖FR4]
WGQGISVTVSS
配列番号33[10G5軽鎖FR1]
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISC
配列番号34[10G5軽鎖FR2]
WYLQKPGQSPKLLIY
配列番号35[10G5軽鎖FR3]
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC
配列番号36[10G5軽鎖FR4]
FGGGTKLEIK
配列番号37[ヒトAxl]
MGIQAGEPDPPEEPLTSQASVPPHQLRLGSLHPHTPYHIRVACTSSQGPSSWTHWLPVETPEGVPLGPPENISATRNGSQAFVHWQEPRAPLQGTLLGYRLAYQGQDTPEVLMDIGLRQEVTLELQGDGSVSNLTVCVAAYTAAGDGPWSLPVPLEAWRPGQAQPVHQLVKEPSTPAFSWPWWYVLLGAVVAAACVLILALFLVHRRKKETRYGEVFEPTVERGELVVRYRVRKSYSRRTTEATLNSLGISEELKEKLRDVMVDRHKVALGKTLGEGEFGAVMEGQLNQDDSILKVAVKTMKIAICTRSELEDFLSEAVCMKEFDHPNVMRLIGVCFQGSERESFPAPVVILPFMKHGDLHSFLLYSRLGDQPVYLPTQMLVKFMADIASGMEYLSTKRFIHRDLAARNCMLNENMSVCVADFGLSKKIYNGDYYRQGRIAKMPVKWIAIESLADRVYTSKSDVWSFGVTMWEIATRGQTPYPGVENSEIYDYLRQGNRLKQPADCLDGLYALMSRCWELNPQDRPSFTELREDLENTLKALPPAQEPDEILYVNMDEGGGYPEPPGAAGGADPPTQPDPKDSCSCLTAAEVHPAGRYVLCPSTTPSPAQPADRGSPAAPGQEDGA
配列番号38[マウスAxl]
MGRVPLAWWLALCCWGCAAHKDTQTEAGSPFVGNPGNITGARGLTGTLRCELQVQGEPPEVVWLRDGQILELADNTQTQVPLGEDWQDEWKVVSQLRISALQLSDAGEYQCMVHLEGRTFVSQPGFVGLEGLPYFLEEPEDKAVPANTPFNLSCQAQGPPEPVTLLWLQDAVPLAPVTGHSSQHSLQTPGLNKTSSFSCEAHNAKGVTTSRTATITVLPQRPHHLHVVSRQPTELEVAWTPGLSGIYPLTHCNLQAVLSDDGVGIWLGKSDPPEDPLTLQVSVPPHQLRLEKLLPHTPYHIRISCSSSQGPSPWTHWLPVETTEGVPLGPPENVSAMRNGSQVLVRWQEPRVPLQGTLLGYRLAYRGQDTPEVLMDIGLTREVTLELRGDRPVANLTVSVTAYTSAGDGPWSLPVPLEPWRPVSEPPPRAFSWPWWYVLLGALVAAACVLILALFLVHRRKKETRYGEVFEPTVERGELVVRYRVRKSYSRRTTEATLNSLGISEELKEKLRDVMVDRHKVALGKTLGEGEFGAVMEGQLNQDDSILKVAVKTMKIAICTRSELEDFLSEAVCMKEFDHPNVMRLIGVCFQGSDREGFPEPVVILPFMKHGDLHSFLLYSRLGDQPVFLPTQMLVKFMADIASGMEYLSTKRFIHRDLAARNCMLNENMSVCVADFGLSKKIYNGDYYRQGRIAKMPVKWIAIESLADRVYTSKSDVWSFGVTMWEIATRGQTPYPGVENSEIYDYLRQGNRLKQPVDCLDGLYALMSRCWELNPRDRPSFAELREDLENTLKALPPAQEPDEILYVNMDEGGSHLEPRGAAGGADPPTQPDPKDSCSCLTAADVHSAGRYVLCPSTAPGPTLSADRGCPAPPGQEDGA
配列番号39[ヒトTyro3]
MALRRSMGRPGLPPLPLPPPPRLGLLLAALASLLLPESAAAGLKLMGAPVKLTVSQGQPVKLNCSVEGMEEPDIQWVKDGAVVQNLDQLYIPVSEQHWIGFLSLKSVERSDAGRYWCQVEDGGETEISQPVWLTVEGVPFFTVEPKDLAVPPNAPFQLSCEAVGPPEPVTIVWWRGTTKIGGPAPSPSVLNVTGVTQSTMFSCEAHNLKGLASSRTATVHLQALPAAPFNITVTKLSSSNASVAWMPGADGRALLQSCTVQVTQAPGGWEVLAVVVPVPPFTCLLRDLVPATNYSLRVRCANALGPSPYADWVPFQTKGLAPASAPQNLHAIRTDSGLILEWEEVIPEAPLEGPLGPYKLSWVQDNGTQDELTVEGTRANLTGWDPQKDLIVRVCVSNAVGCGPWSQPLVVSSHDRAGQQGPPHSRTSWVPVVLGVLTALVTAAALALILLRKRRKETRFGQAFDSVMARGEPAVHFRAARSFNRERPERIEATLDSLGISDELKEKLEDVLIPEQQFTLGRMLGKGEFGSVREAQLKQEDGSFVKVAVKMLKADIIASSDIEEFLREAACMKEFDHPHVAKLVGVSLRSRAKGRLPIPMVILPFMKHGDLHAFLLASRIGENPFNLPLQTLIRFMVDIACGMEYLSSRNFIHRDLAARNCMLAEDMTVCVADFGLSRKIYSGDYYRQGCASKLPVKWLALESLADNLYTVQSDVWAFGVTMWEIMTRGQTPYAGIENAEIYNYLIGGNRLKQPPECMEDVYDLMYQCWSADPKQRPSFTCLRMELENILGQLSVLSASQDPLYINIERAEEPTAGGSLELPGRDQPYSGAGDGSGMGAVGGTPSDCRYILTPGGLAEQPGQAEHQPESPLNETQRLLLLQQGLLPHSSC
配列番号40[ヒトMer]
MGPAPLPLLLGLFLPALWRRAITEAREEAKPYPLFPGPFPGSLQTDHTPLLSLPHASGYQPALMFSPTQPGRPHTGNVAIPQVTSVESKPLPPLAFKHTVGHIILSEHKGVKFNCSISVPNIYQDTTISWWKDGKELLGAHHAITQFYPDDEVTAIIASFSITSVQRSDNGSYICKMKINNEEIVSDPIYIEVQGLPHFTKQPESMNVTRNTAFNLTCQAVGPPEPVNIFWVQNSSRVNEQPEKSPSVLTVPGLTEMAVFSCEAHNDKGLTVSKGVQINIKAIPSPPTEVSIRNSTAHSILISWVPGFDGYSPFRNCSIQVKEADPLSNGSVMIFNTSALPHLYQIKQLQALANYSIGVSCMNEIGWSAVSPWILASTTEGAPSVAPLNVTVFLNESSDNVDIRWMKPPTKQQDGELVGYRISHVWQSAGISKELLEEVGQNGSRARISVQVHNATCTVRIAAVTRGGVGPFSDPVKIFIPAHGWVDYAPSSTPAPGNADPVLIIFGCFCGFILIGLILYISLAIRKRVQETKFGNAFTEEDSELVVNYIAKKSFCRRAIELTLHSLGVSEELQNKLEDVVIDRNLLILGKILGEGEFGSVMEGNLKQEDGTSLKVAVKTMKLDNSSQREIEEFLSEAACMKDFSHPNVIRLLGVCIEMSSQGIPKPMVILPFMKYGDLHTYLLYSRLETGPKHIPLQTLLKFMVDIALGMEYLSNRNFLHRDLAARNCMLRDDMTVCVADFGLSKKIYSGDYYRQGRIAKMPVKWIAIESLADRVYTSKSDVWAFGVTMWEIATRGMTPYPGVQNHEMYDYLLHGHRLKQPEDCLDELYEIMYSCWRTDPLDRPTFSVLRLQLEKLLESLPDVRNQADVIYVNTQLLESSEGLAQGSTLAPLDLNIDPDSIIASCTPRAAISVVTAEVHDSKPHEGRYILNGGSEEWEDLTSAPSAAVTAEKNSVLPGERLVRNGVSWSHSSMLPLGSSLPDELLFADDSSEGSEVLM
配列番号41[ヒトAkt3]
MSDVTIVKEGWVQKRGEYIKNWRPRYFLLKTDGSFIGYKEKPQDVDLPYPLNNFSVAKCQLMKTERPKPNTFIIRCLQWTTVIERTFHVDTPEEREEWTEAIQAVADRLQRQEEERMNCSPTSQIDNIGEEEMDASTTHHKRKTMNDFDYLKLLGKGTFGKVILVREKASGKYYAMKILKKEVIIAKDEVAHTLTESRVLKNTRHPFLTSLKYSFQTKDRLCFVMEYVNGGELFFHLSRERVFSEDRTRFYGAEIVSALDYLHSGKIVYRDLKLENLMLDKDGHIKITDFGLCKEGITDAATMKTFCGTPEYLAPEVLEDNDYGRAVDWWGLGVVMYEMMCGRLPFYNQDHEKLFELILMEDIKFPRTLSSDAKSLLSGLLIKDPNKRLGGGPDDAKEIMRHSFFSGVNWQDVYDKKLVPPFKPQVTSETDTRYFDEEFTAQTITITPPEKCQQSDCGMLGNWKK
配列番号42[ヒトGas6]
MAPSLSPGPAALRRAPQLLLLLLAAECALAALLPAREATQFLRPRQRRAFQVFEEAKQGHLERECVEELCSREEAREVFENDPETDYFYPRYLDCINKYGSPYTKNSGFATCVQNLPDQCTPNPCDRKGTQACQDLMGNFFCLCKAGWGGRLCDKDVNECSQENGGCLQICHNKPGSFHCSCHSGFELSSDGRTCQDIDECADSEACGEARCKNLPGSYSCLCDEGFAYSSQEKACRDVDECLQGRCEQVCVNSPGSYTCHCDGRGGLKLSQDMDTCEDILPCVPFSVAKSVKSLYLGRMFSGTPVIRLRFKRLQPTRLVAEFDFRTFDPEGILLFAGGHQDSTWIVLALRAGRLELQLRYNGVGRVTSSGPVINHGMWQTISVEELARNLVIKVNRDAVMKIAVAGDLFQPERGLYHLNLTV
GGIPFHEKDLVQPINPRLDGCMRSWNWLNGEDTTIQETVKVNTRMQCFSVTERGSFYPGSGFAFYSLDYMRTPLDVGTESTWEVEVVAHIRPAADTGVLFALWAPDLRAVPLSVALVDYHSTKKLKKQLVVLAVEHTALALMEIKVCDGQEHVVTVSLRDGEATLEVDGTRGQSEVSAAQLQERLAVLERHLRSPVLTFAGGLPDVPVTSAPVTAFYRGCMTLEVNRRLLDLDEAAYKHSDITAHSCPPVEPAAA
配列番号43[Macaca fascicularis由来Axl;本明細書での別称「Cyno Axl」]
MAWRCPRMGRVPLAWCLALCGWVCMAPRGTQAEESPFVGNPGNITGARGLTGTLRCQLQVQGEPPEVHWLRDGQILELADSTQTQVPLGEDEQDDWIVVSQLRIASLQLSDAGQYQCLVFLGHQNFVSQPGYVGLEGLPYFLEEPEDRTVAANTPFNLSCQAQGPPEPVDLLWLQDAVPLATAPGHGPQRNLHVPGLNKTSSFSCEAHNAKGVTTSRTATITVLPQQPRNLHLVSRQPTELEVAWTPGLSGIYPLTHCTLQAVLSDDGMGIQAGEPDPPEEPLTLQASVPPHQLRLGSLHPHTPYHIRVACTSSQGPSSWTHWLPVETPEGVPLGPPENISATRNGSQAFVHWQEPRAPLQGTLLGYRLAYQGQDTPEVLMDIGLRQEVTLELQGDGSVSNLTVCVAAYTAAGDGPWSLPVPLEAWRPGQAQPVHQLVKETSAPAFSWPWWYILLGAVVAAACVLILALFLVHRRKKETRYGEVFEPTVERGELVVRYRVRKSYSRRTTEATLNSLGISEELKEKLRDVMVDRHKVALGKTLGEGEFGAVMEGQLNQDDSILKVAVKTMKIAICTRSELEDFLSEAVCMKEFDHPNVMRLIGVCFQGSERESFPAPVVILPFMKHGDLHSFLLYSRLGDQPVYLPTQMLVKFMADIASGMEYLSTKRFIHRDLAARNCMLNENMSVCVADFGLSKKIYNGDYYRQGRIAKMPVKWIAIESLADRVYTSKSDVWSFGVTMWEIATRGQTPYPGVENSEIYDYLRQGNRLKQPADCLDGLYALMSRCWELNPQDRPSFTELREDLENTLKALPPAQEPDEILYVNMDEGGGYPEPPGAAGGADPPTQLDPKDSCSCLTSAEVHPAGRYVLCPSTAPSPAQPADRGSPAAPGQEDGA
配列番号44[リンカー]
GGGGS
配列番号45[10G5(Q1E)VHドメイン(aa)]
QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTDFYINWVRQRPGQGLEWIARIFPGGDNTYYNEKFKGKATLTAEESSSTAYIQLSSLTSEDSAVYFCARRGLYYAMDYWGQGISVTVSS
配列番号1[10C9 VHドメイン(nt)]
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGACTTCTGACTACAATTTCACACGCTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAACTGGTGATTCTAAATACAATGAGAAGTTCAAGGGCAGGGCCACACTGACGGCAGACACATCCTCCAGCACTGCCTACATGCAGCTCAGCTCCCAAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGGAATGGTAACTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCGCGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCC
配列番号2[10C9 VLドメイン(nt)]
GATATTGTGATGACGCAGGCTGCACCCTCTGGACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGCAATGGCAACACTTACTTATATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAACTCCTGATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTATCTATTACTGTATGCAACATCGAGAATATCCTTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAACTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCC
配列番号3[10C9 VHドメイン(aa)]
QVQLQQPGPELVKPGASVKISCKTSDYNFTRYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGTGDSKYNEKFKGRATLTADTSSSTAYMQLSSQTSEDSAVYFCARNGNYWYFDVWGAGTAVTVSS
配列番号4[10C9 VLドメイン(aa)]
DIVMTQAAPSGPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGIYYCMQHREYPFTFGGGTKLEIK
配列番号5[10C9重鎖CDR1]
DYNFTRYYIH
配列番号6[10C9重鎖CDR2]
WIYPGTGDSKYNEKFKG
配列番号7[10C9重鎖CDR3]
NGNYWYFDV
配列番号8[10C9軽鎖CDR1]
RSSKSLLHSNGNTYLY
配列番号9[10C9軽鎖CDR2]
RMSNLAS
配列番号10[10C9軽鎖CDR3]
MQHREYPFT
配列番号11[10C9重鎖FR1]
QVQLQQPGPELVKPGASVKISCKTS
配列番号12[10C9重鎖FR2]
WVKQRPGQGLEWIG
配列番号13[10C9重鎖FR3]
RATLTADTSSSTAYMQLSSQTSEDSAVYFCAR
配列番号14[10C9重鎖FR4]
WGAGTAVTVSS
配列番号15[10C9軽鎖FR1]
DIVMTQAAPSGPVTPGESVSISC
配列番号16[10C9軽鎖FR2]
WFLQRPGQSPQLLIY
配列番号17[10C9軽鎖FR3]
GVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGIYYC
配列番号18[10C9軽鎖FR4]
FGGGTKLEIK
配列番号19[10G5 VHドメイン(nt)]
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGTTTCACTGACTTCTATATAAACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGCAAGGATTTTTCCTGGAGGTGATAATACTTACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGAAGAATCCTCCAGCACTGCCTACATACAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCAAGACGGGGACTTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAATCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCC
配列番号20[10G5 VLドメイン(nt)]
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTGCACAGTAATGGAATCCCCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACGCTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGTTCTCAAGGTACACATGTTCCTCCGACGTTCGGTGGTGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCC
配列番号21[10G5 VHドメイン(aa)]
QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTDFYINWVRQRPGQGLEWIARIFPGGDNTYYNEKFKGKATLTAEESSSTAYIQLSSLTSEDSAVYFCARRGLYYAMDYWGQGISVTVSS
配列番号22[10G5 VLドメイン(aa)]
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGIPYLHWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQGTHVPPTFGGGTKLEIK
配列番号23[10G5重鎖CDR1]
GYSFTDFYIN
配列番号24[10G5重鎖CDR2]
RIFPGGDNTYYNEKFKG
配列番号25[10G5重鎖CDR3]
RGLYYAMDY
配列番号26[10G5軽鎖CDR1]
RSSQSLVHSNGIPYLH
配列番号27[10G5軽鎖CDR2]
RVSNRFS
配列番号28[10G5軽鎖CDR3]
SQGTHVPPT
配列番号29[10G5重鎖FR1]
QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKAS
配列番号30[10G5重鎖FR2]
WVRQRPGQGLEWIA
配列番号31[10G5重鎖FR3]
KATLTAEESSSTAYIQLSSLTSEDSAVYFCAR
配列番号32[10G5重鎖FR4]
WGQGISVTVSS
配列番号33[10G5軽鎖FR1]
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISC
配列番号34[10G5軽鎖FR2]
WYLQKPGQSPKLLIY
配列番号35[10G5軽鎖FR3]
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC
配列番号36[10G5軽鎖FR4]
FGGGTKLEIK
配列番号37[ヒトAxl]
MGIQAGEPDPPEEPLTSQASVPPHQLRLGSLHPHTPYHIRVACTSSQGPSSWTHWLPVETPEGVPLGPPENISATRNGSQAFVHWQEPRAPLQGTLLGYRLAYQGQDTPEVLMDIGLRQEVTLELQGDGSVSNLTVCVAAYTAAGDGPWSLPVPLEAWRPGQAQPVHQLVKEPSTPAFSWPWWYVLLGAVVAAACVLILALFLVHRRKKETRYGEVFEPTVERGELVVRYRVRKSYSRRTTEATLNSLGISEELKEKLRDVMVDRHKVALGKTLGEGEFGAVMEGQLNQDDSILKVAVKTMKIAICTRSELEDFLSEAVCMKEFDHPNVMRLIGVCFQGSERESFPAPVVILPFMKHGDLHSFLLYSRLGDQPVYLPTQMLVKFMADIASGMEYLSTKRFIHRDLAARNCMLNENMSVCVADFGLSKKIYNGDYYRQGRIAKMPVKWIAIESLADRVYTSKSDVWSFGVTMWEIATRGQTPYPGVENSEIYDYLRQGNRLKQPADCLDGLYALMSRCWELNPQDRPSFTELREDLENTLKALPPAQEPDEILYVNMDEGGGYPEPPGAAGGADPPTQPDPKDSCSCLTAAEVHPAGRYVLCPSTTPSPAQPADRGSPAAPGQEDGA
配列番号38[マウスAxl]
MGRVPLAWWLALCCWGCAAHKDTQTEAGSPFVGNPGNITGARGLTGTLRCELQVQGEPPEVVWLRDGQILELADNTQTQVPLGEDWQDEWKVVSQLRISALQLSDAGEYQCMVHLEGRTFVSQPGFVGLEGLPYFLEEPEDKAVPANTPFNLSCQAQGPPEPVTLLWLQDAVPLAPVTGHSSQHSLQTPGLNKTSSFSCEAHNAKGVTTSRTATITVLPQRPHHLHVVSRQPTELEVAWTPGLSGIYPLTHCNLQAVLSDDGVGIWLGKSDPPEDPLTLQVSVPPHQLRLEKLLPHTPYHIRISCSSSQGPSPWTHWLPVETTEGVPLGPPENVSAMRNGSQVLVRWQEPRVPLQGTLLGYRLAYRGQDTPEVLMDIGLTREVTLELRGDRPVANLTVSVTAYTSAGDGPWSLPVPLEPWRPVSEPPPRAFSWPWWYVLLGALVAAACVLILALFLVHRRKKETRYGEVFEPTVERGELVVRYRVRKSYSRRTTEATLNSLGISEELKEKLRDVMVDRHKVALGKTLGEGEFGAVMEGQLNQDDSILKVAVKTMKIAICTRSELEDFLSEAVCMKEFDHPNVMRLIGVCFQGSDREGFPEPVVILPFMKHGDLHSFLLYSRLGDQPVFLPTQMLVKFMADIASGMEYLSTKRFIHRDLAARNCMLNENMSVCVADFGLSKKIYNGDYYRQGRIAKMPVKWIAIESLADRVYTSKSDVWSFGVTMWEIATRGQTPYPGVENSEIYDYLRQGNRLKQPVDCLDGLYALMSRCWELNPRDRPSFAELREDLENTLKALPPAQEPDEILYVNMDEGGSHLEPRGAAGGADPPTQPDPKDSCSCLTAADVHSAGRYVLCPSTAPGPTLSADRGCPAPPGQEDGA
配列番号39[ヒトTyro3]
MALRRSMGRPGLPPLPLPPPPRLGLLLAALASLLLPESAAAGLKLMGAPVKLTVSQGQPVKLNCSVEGMEEPDIQWVKDGAVVQNLDQLYIPVSEQHWIGFLSLKSVERSDAGRYWCQVEDGGETEISQPVWLTVEGVPFFTVEPKDLAVPPNAPFQLSCEAVGPPEPVTIVWWRGTTKIGGPAPSPSVLNVTGVTQSTMFSCEAHNLKGLASSRTATVHLQALPAAPFNITVTKLSSSNASVAWMPGADGRALLQSCTVQVTQAPGGWEVLAVVVPVPPFTCLLRDLVPATNYSLRVRCANALGPSPYADWVPFQTKGLAPASAPQNLHAIRTDSGLILEWEEVIPEAPLEGPLGPYKLSWVQDNGTQDELTVEGTRANLTGWDPQKDLIVRVCVSNAVGCGPWSQPLVVSSHDRAGQQGPPHSRTSWVPVVLGVLTALVTAAALALILLRKRRKETRFGQAFDSVMARGEPAVHFRAARSFNRERPERIEATLDSLGISDELKEKLEDVLIPEQQFTLGRMLGKGEFGSVREAQLKQEDGSFVKVAVKMLKADIIASSDIEEFLREAACMKEFDHPHVAKLVGVSLRSRAKGRLPIPMVILPFMKHGDLHAFLLASRIGENPFNLPLQTLIRFMVDIACGMEYLSSRNFIHRDLAARNCMLAEDMTVCVADFGLSRKIYSGDYYRQGCASKLPVKWLALESLADNLYTVQSDVWAFGVTMWEIMTRGQTPYAGIENAEIYNYLIGGNRLKQPPECMEDVYDLMYQCWSADPKQRPSFTCLRMELENILGQLSVLSASQDPLYINIERAEEPTAGGSLELPGRDQPYSGAGDGSGMGAVGGTPSDCRYILTPGGLAEQPGQAEHQPESPLNETQRLLLLQQGLLPHSSC
配列番号40[ヒトMer]
MGPAPLPLLLGLFLPALWRRAITEAREEAKPYPLFPGPFPGSLQTDHTPLLSLPHASGYQPALMFSPTQPGRPHTGNVAIPQVTSVESKPLPPLAFKHTVGHIILSEHKGVKFNCSISVPNIYQDTTISWWKDGKELLGAHHAITQFYPDDEVTAIIASFSITSVQRSDNGSYICKMKINNEEIVSDPIYIEVQGLPHFTKQPESMNVTRNTAFNLTCQAVGPPEPVNIFWVQNSSRVNEQPEKSPSVLTVPGLTEMAVFSCEAHNDKGLTVSKGVQINIKAIPSPPTEVSIRNSTAHSILISWVPGFDGYSPFRNCSIQVKEADPLSNGSVMIFNTSALPHLYQIKQLQALANYSIGVSCMNEIGWSAVSPWILASTTEGAPSVAPLNVTVFLNESSDNVDIRWMKPPTKQQDGELVGYRISHVWQSAGISKELLEEVGQNGSRARISVQVHNATCTVRIAAVTRGGVGPFSDPVKIFIPAHGWVDYAPSSTPAPGNADPVLIIFGCFCGFILIGLILYISLAIRKRVQETKFGNAFTEEDSELVVNYIAKKSFCRRAIELTLHSLGVSEELQNKLEDVVIDRNLLILGKILGEGEFGSVMEGNLKQEDGTSLKVAVKTMKLDNSSQREIEEFLSEAACMKDFSHPNVIRLLGVCIEMSSQGIPKPMVILPFMKYGDLHTYLLYSRLETGPKHIPLQTLLKFMVDIALGMEYLSNRNFLHRDLAARNCMLRDDMTVCVADFGLSKKIYSGDYYRQGRIAKMPVKWIAIESLADRVYTSKSDVWAFGVTMWEIATRGMTPYPGVQNHEMYDYLLHGHRLKQPEDCLDELYEIMYSCWRTDPLDRPTFSVLRLQLEKLLESLPDVRNQADVIYVNTQLLESSEGLAQGSTLAPLDLNIDPDSIIASCTPRAAISVVTAEVHDSKPHEGRYILNGGSEEWEDLTSAPSAAVTAEKNSVLPGERLVRNGVSWSHSSMLPLGSSLPDELLFADDSSEGSEVLM
配列番号41[ヒトAkt3]
MSDVTIVKEGWVQKRGEYIKNWRPRYFLLKTDGSFIGYKEKPQDVDLPYPLNNFSVAKCQLMKTERPKPNTFIIRCLQWTTVIERTFHVDTPEEREEWTEAIQAVADRLQRQEEERMNCSPTSQIDNIGEEEMDASTTHHKRKTMNDFDYLKLLGKGTFGKVILVREKASGKYYAMKILKKEVIIAKDEVAHTLTESRVLKNTRHPFLTSLKYSFQTKDRLCFVMEYVNGGELFFHLSRERVFSEDRTRFYGAEIVSALDYLHSGKIVYRDLKLENLMLDKDGHIKITDFGLCKEGITDAATMKTFCGTPEYLAPEVLEDNDYGRAVDWWGLGVVMYEMMCGRLPFYNQDHEKLFELILMEDIKFPRTLSSDAKSLLSGLLIKDPNKRLGGGPDDAKEIMRHSFFSGVNWQDVYDKKLVPPFKPQVTSETDTRYFDEEFTAQTITITPPEKCQQSDCGMLGNWKK
配列番号42[ヒトGas6]
MAPSLSPGPAALRRAPQLLLLLLAAECALAALLPAREATQFLRPRQRRAFQVFEEAKQGHLERECVEELCSREEAREVFENDPETDYFYPRYLDCINKYGSPYTKNSGFATCVQNLPDQCTPNPCDRKGTQACQDLMGNFFCLCKAGWGGRLCDKDVNECSQENGGCLQICHNKPGSFHCSCHSGFELSSDGRTCQDIDECADSEACGEARCKNLPGSYSCLCDEGFAYSSQEKACRDVDECLQGRCEQVCVNSPGSYTCHCDGRGGLKLSQDMDTCEDILPCVPFSVAKSVKSLYLGRMFSGTPVIRLRFKRLQPTRLVAEFDFRTFDPEGILLFAGGHQDSTWIVLALRAGRLELQLRYNGVGRVTSSGPVINHGMWQTISVEELARNLVIKVNRDAVMKIAVAGDLFQPERGLYHLNLTV
GGIPFHEKDLVQPINPRLDGCMRSWNWLNGEDTTIQETVKVNTRMQCFSVTERGSFYPGSGFAFYSLDYMRTPLDVGTESTWEVEVVAHIRPAADTGVLFALWAPDLRAVPLSVALVDYHSTKKLKKQLVVLAVEHTALALMEIKVCDGQEHVVTVSLRDGEATLEVDGTRGQSEVSAAQLQERLAVLERHLRSPVLTFAGGLPDVPVTSAPVTAFYRGCMTLEVNRRLLDLDEAAYKHSDITAHSCPPVEPAAA
配列番号43[Macaca fascicularis由来Axl;本明細書での別称「Cyno Axl」]
MAWRCPRMGRVPLAWCLALCGWVCMAPRGTQAEESPFVGNPGNITGARGLTGTLRCQLQVQGEPPEVHWLRDGQILELADSTQTQVPLGEDEQDDWIVVSQLRIASLQLSDAGQYQCLVFLGHQNFVSQPGYVGLEGLPYFLEEPEDRTVAANTPFNLSCQAQGPPEPVDLLWLQDAVPLATAPGHGPQRNLHVPGLNKTSSFSCEAHNAKGVTTSRTATITVLPQQPRNLHLVSRQPTELEVAWTPGLSGIYPLTHCTLQAVLSDDGMGIQAGEPDPPEEPLTLQASVPPHQLRLGSLHPHTPYHIRVACTSSQGPSSWTHWLPVETPEGVPLGPPENISATRNGSQAFVHWQEPRAPLQGTLLGYRLAYQGQDTPEVLMDIGLRQEVTLELQGDGSVSNLTVCVAAYTAAGDGPWSLPVPLEAWRPGQAQPVHQLVKETSAPAFSWPWWYILLGAVVAAACVLILALFLVHRRKKETRYGEVFEPTVERGELVVRYRVRKSYSRRTTEATLNSLGISEELKEKLRDVMVDRHKVALGKTLGEGEFGAVMEGQLNQDDSILKVAVKTMKIAICTRSELEDFLSEAVCMKEFDHPNVMRLIGVCFQGSERESFPAPVVILPFMKHGDLHSFLLYSRLGDQPVYLPTQMLVKFMADIASGMEYLSTKRFIHRDLAARNCMLNENMSVCVADFGLSKKIYNGDYYRQGRIAKMPVKWIAIESLADRVYTSKSDVWSFGVTMWEIATRGQTPYPGVENSEIYDYLRQGNRLKQPADCLDGLYALMSRCWELNPQDRPSFTELREDLENTLKALPPAQEPDEILYVNMDEGGGYPEPPGAAGGADPPTQLDPKDSCSCLTSAEVHPAGRYVLCPSTAPSPAQPADRGSPAAPGQEDGA
配列番号44[リンカー]
GGGGS
配列番号45[10G5(Q1E)VHドメイン(aa)]
QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTDFYINWVRQRPGQGLEWIARIFPGGDNTYYNEKFKGKATLTAEESSSTAYIQLSSLTSEDSAVYFCARRGLYYAMDYWGQGISVTVSS
生物寄託
本開示は2種類のハイブリドーマ細胞株に関する。「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」に従って、2つのハイブリドーマ細胞株を寄託した。詳細を以下に示す。
本開示は2種類のハイブリドーマ細胞株に関する。「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」に従って、2つのハイブリドーマ細胞株を寄託した。詳細を以下に示す。
UT−10C9−B9
受託機関→European Collection of Cell Cultures(ECACC)
Public Health England
Porton Down
Salisbury
Wiltshire
SP4 OJG
United Kingdom
寄託日→2015年12月16日
アクセッション番号→15121601
特徴→ハイブリドーマ−Bリンパ球;種−M.musculus(マウス);形態−リンパ芽球;免疫原−ヒトAxl細胞外ドメイン;免疫細胞供与体−NMRIマウス;無限分裂パートナーX63.Ag8.653;産物のIgクラス/サブクラス−IgG2b
受託機関→European Collection of Cell Cultures(ECACC)
Public Health England
Porton Down
Salisbury
Wiltshire
SP4 OJG
United Kingdom
寄託日→2015年12月16日
アクセッション番号→15121601
特徴→ハイブリドーマ−Bリンパ球;種−M.musculus(マウス);形態−リンパ芽球;免疫原−ヒトAxl細胞外ドメイン;免疫細胞供与体−NMRIマウス;無限分裂パートナーX63.Ag8.653;産物のIgクラス/サブクラス−IgG2b
WR−10G5−E5
受託機関→European Collection of Cell Cultures(ECACC)
Public Health England
Porton Down
Salisbury
Wiltshire
SP4 OJG
United Kingdom
寄託日→2015年12月16日
アクセッション番号→15121602
特徴→ハイブリドーマ−Bリンパ球;種−M.musculus(マウス);形態−リンパ芽球;免疫原−ヒトAxl細胞外ドメイン;免疫細胞供与体−NMRIマウス;無限分裂パートナーX63.Ag8.653;産物のIgクラス/サブクラス−IgG1
受託機関→European Collection of Cell Cultures(ECACC)
Public Health England
Porton Down
Salisbury
Wiltshire
SP4 OJG
United Kingdom
寄託日→2015年12月16日
アクセッション番号→15121602
特徴→ハイブリドーマ−Bリンパ球;種−M.musculus(マウス);形態−リンパ芽球;免疫原−ヒトAxl細胞外ドメイン;免疫細胞供与体−NMRIマウス;無限分裂パートナーX63.Ag8.653;産物のIgクラス/サブクラス−IgG1
Claims (25)
- 以下のいずれかから得られる抗体が結合するエピトープにおいてAxlと結合する抗体:
A)ハイブリドーマUT−10C9−B9;又は
B)ハイブリドーマWR−10G5−E5。 - Axlを結合する、請求項1に記載の抗体であって、
A)配列番号7のアミノ酸配列を有するVH CDR3と、場合により配列番号6及び配列番号5から選択されるアミノ酸配列を有する1又はそれ以上のVH CDRとを含む抗体VHドメイン;及び/若しくは
配列番号8、配列番号9及び配列番号10から選択されるアミノ酸配列を有する1又はそれ以上のVL CDRを含む抗体VLドメイン;又は
B)配列番号25のアミノ酸配列を有するVH CDR3と、場合により配列番号24及び配列番号23から選択されるアミノ酸配列を有する1又はそれ以上のVH CDRとを含む抗体VHドメイン;及び/若しくは
配列番号26、配列番号27及び配列番号28から選択されるアミノ酸配列を有する1又はそれ以上のVL CDRを含む抗体VLドメインを含む、前記抗体。 - 請求項1又は2に記載の抗体であって、以下のいずれかを含む抗体VHドメインを含む抗体:
A)配列番号5、配列番号6及び配列番号7のアミノ酸配列を有するVH CDRであって、前記抗体が10C9のVHドメイン(配列番号3)及び10C9のVLドメイン(配列番号4)を含む抗体のAxl結合ドメインと、Axlへの結合を競合する、VH CDR;又は
B)配列番号23、配列番号24及び配列番号25のアミノ酸配列を有するVH CDRであって、10G5のVHドメイン(配列番号21)及び10G5のVLドメイン(配列番号22)を含む抗体のAxl結合ドメインと、Axlへの結合を競合する、VH CDR。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体であって、以下のいずれかを含む抗体:
A)10C9のVHドメイン(配列番号3);又は
B)10G5のVHドメイン(配列番号21)。 - 請求項4に記載の抗体であって、以下のいずれかを含む抗体:
A)10C9のVLドメイン(配列番号4);又は
B)10G5のVLドメイン(配列番号22)。 - 当該抗体が、
(i)抗体の重鎖定常領域及び/若しくは抗体の軽鎖定常領域のすべて若しくは部分;
(ii)全抗体であって、場合によって、前記全抗体はigG抗体である全抗体;又は
(iii)抗原結合性抗体断片であって、場合によって、前記抗原結合性抗体断片が、単一ドメイン抗体、Fv、scFv、dsFV、Fd、Fab、F(ab’)2、ミニボディ、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、直列型scFv、TandAb、バイボディ、トリボディ、カッパ(ラムダ)ボディ、BiTE、DVD−Ig、SIP、SMIP又はDARTである抗原結合性抗体断片;
を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体。 - 前記抗体がヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記AxlがヒトAxlである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗体。
- 6×10−10M以下のKDでAxlを結合する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体。
- 8×105M−1s−1以上のkonでAxlを結合する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の抗体。
- 霊長類のAxlを特異的に結合する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の抗体。
- (i)10−3M超のKDでマウスAxlを結合する;
(ii)10−3M超のKDでヒトMerを結合する;及び/又は
(iii)10−3M超のKDでヒトTyro3を結合する;
請求項1〜11のいずれか1項に記載の抗体。 - AxlのGas6への結合を阻害する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体が、Axl受容体の下流シグナル伝達を阻害する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の抗体。
- 細胞死率を増加させる、請求項1〜14のいずれか1項に記載の抗体。
- 腫瘍成長を阻害する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の抗体。
- 検出可能標識、酵素又は毒素と、場合によりペプチジル結合又はリンカーを介して複合体化された、請求項1〜16のいずれか1項に記載の抗体。
- 以下のいずれかから得られる抗体:
A)ハイブリドーマUT−10C9−B9;又は
B)ハイブリドーマWR−10G5−E5。 - 請求項1〜18のいずれか1項に記載の抗体の、抗体又は抗体のVH若しくはVLドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
- 請求項19に記載の核酸で形質転換された宿主細胞。
- 抗体又は抗体のVH若しくはVLドメインの作製方法であって、前記抗体又は抗体のVH若しくはVLドメインの作製条件下で、請求項20に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
- 請求項1〜17のいずれか1項に記載の抗体、又はその免疫複合体を、薬学的に許容される賦形剤とともに含む組成物。
- 免疫チェックポイントモジュレーター及び/又はAxl以外の標的に特異的な抗腫瘍抗体をさらに含む、請求項22に記載の組成物。
- 治療方法で用いる、請求項1〜17のいずれか1項に記載の抗体、又は請求項22若しくは23のいずれか一項に記載の組成物。
- 増殖性疾患の治療方法で用いる、請求項24に記載の抗体又は組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB1422605.4 | 2014-12-18 | ||
GB201422605 | 2014-12-18 | ||
JP2017532709A JP6931609B2 (ja) | 2014-12-18 | 2015-12-18 | 抗Axlアンタゴニスト抗体 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017532709A Division JP6931609B2 (ja) | 2014-12-18 | 2015-12-18 | 抗Axlアンタゴニスト抗体 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021101707A true JP2021101707A (ja) | 2021-07-15 |
Family
ID=55080088
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017532709A Active JP6931609B2 (ja) | 2014-12-18 | 2015-12-18 | 抗Axlアンタゴニスト抗体 |
JP2021033363A Pending JP2021101707A (ja) | 2014-12-18 | 2021-03-03 | 抗Axlアンタゴニスト抗体 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017532709A Active JP6931609B2 (ja) | 2014-12-18 | 2015-12-18 | 抗Axlアンタゴニスト抗体 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US10208121B2 (ja) |
EP (1) | EP3233119A2 (ja) |
JP (2) | JP6931609B2 (ja) |
KR (1) | KR102453227B1 (ja) |
CN (2) | CN116410318A (ja) |
AU (1) | AU2015366213B2 (ja) |
CA (1) | CA2969879A1 (ja) |
MX (1) | MX2017007941A (ja) |
WO (1) | WO2016097370A2 (ja) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201410825D0 (en) * | 2014-06-18 | 2014-07-30 | Bergenbio As | Anti-axl antibodies |
GB201410826D0 (en) | 2014-06-18 | 2014-07-30 | Bergenbio As | Anti-axl antibodies |
WO2016097370A2 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | Bergen Teknologioverføring As | Anti-axl antagonistic antibodies |
GB201506411D0 (en) | 2015-04-15 | 2015-05-27 | Bergenbio As | Humanized anti-axl antibodies |
GB201509338D0 (en) * | 2015-05-29 | 2015-07-15 | Bergenbio As | Combination therapy |
GB201610902D0 (en) | 2016-06-22 | 2016-08-03 | Bergen Teknologioverforing As And Bergenbio As | Anti-Axl Antagonistic Antibodies |
EP3656791A4 (en) * | 2017-07-18 | 2021-03-31 | Kyowa Kirin Co., Ltd. | HUMAN ANTI-CCR1 MONOCLONAL ANTIBODY |
EP3774904A1 (en) * | 2018-04-10 | 2021-02-17 | Genmab A/S | Axl-specific antibodies for cancer treatment |
US20210215697A1 (en) | 2018-05-14 | 2021-07-15 | Bergenbio Asa | Serum Biomarkers |
CN110540592B (zh) * | 2018-05-29 | 2022-08-09 | 杭州尚健生物技术有限公司 | 结合axl蛋白的抗体及其应用 |
CN109206490A (zh) * | 2018-09-29 | 2019-01-15 | 未名生物医药有限公司 | 蛋白序列11b09及其用途 |
CN109206489A (zh) * | 2018-09-29 | 2019-01-15 | 未名生物医药有限公司 | 蛋白序列12g12及其用途 |
WO2020205576A1 (en) * | 2019-03-29 | 2020-10-08 | Celldex Therapeutics, Inc. | Anti-axl antibodies and methods of use thereof |
GB201912059D0 (en) | 2019-08-22 | 2019-10-09 | Bergenbio As | Combaination therapy of a patient subgroup |
WO2021154156A1 (en) * | 2020-01-31 | 2021-08-05 | Agency For Science, Technology And Research | Anti-axl antibody and uses thereof |
CA3170975A1 (en) | 2020-02-28 | 2021-09-02 | Symphogen A/S | Anti-axl antibodies and compositions |
GB202004189D0 (en) | 2020-03-23 | 2020-05-06 | Bergenbio As | Combination therapy |
KR20230013241A (ko) | 2020-04-08 | 2023-01-26 | 베르겐바이오 에이에스에이 | 항바이러스 요법을 위한 axl 억제제 |
GB202006072D0 (en) | 2020-04-24 | 2020-06-10 | Bergenbio Asa | Method of selecting patients for treatment with cmbination therapy |
CN116635064A (zh) | 2020-12-18 | 2023-08-22 | 世纪治疗股份有限公司 | 具有适应性受体特异性的嵌合抗原受体系统 |
GB202104037D0 (en) | 2021-03-23 | 2021-05-05 | Bergenbio Asa | Combination therapy |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011505120A (ja) * | 2007-11-12 | 2011-02-24 | ユー3・ファーマ・ゲーエムベーハー | Axl抗体 |
JP2013538553A (ja) * | 2010-06-18 | 2013-10-17 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 抗axl抗体及び使用方法 |
JP2014522639A (ja) * | 2011-06-22 | 2014-09-08 | インサーム(インスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル) | 抗Axl抗体及びその使用 |
JP2014532687A (ja) * | 2011-11-03 | 2014-12-08 | ピエール、ファーブル、メディカマン | 抗原結合タンパク質および癌の治療のためのアドレッシング産物としてのその使用 |
JP6931609B2 (ja) * | 2014-12-18 | 2021-09-08 | ベルゲン テクノロジオーヴァーフォリング エイエス | 抗Axlアンタゴニスト抗体 |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1382969A1 (en) | 2002-07-17 | 2004-01-21 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Diagnosis and prevention of cancer cell invasion |
CA2706549A1 (en) * | 2007-11-15 | 2009-05-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Monoclonal antibody capable of binding to anexelekto, and use thereof |
JP5909442B2 (ja) | 2009-05-11 | 2016-04-26 | ユー3・ファーマ・ゲーエムベーハー | ヒト化axl抗体 |
TW201106972A (en) | 2009-07-27 | 2011-03-01 | Genentech Inc | Combination treatments |
EP2596136B1 (en) | 2011-05-06 | 2014-07-16 | Zhongshan Hospital Fudan University | Marker consisting of plasma microrna and new method for diagnosis of hepatocellular carcinoma |
US9249228B2 (en) | 2011-06-22 | 2016-02-02 | Oribase Pharma | Anti-Axl antibodies and uses thereof |
US9879061B2 (en) * | 2011-12-15 | 2018-01-30 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Inhibition of AXL/GAS6 signaling in the treatment of liver fibrosis |
KR102048250B1 (ko) | 2012-06-29 | 2019-11-25 | 미쯔비시 가스 케미칼 컴파니, 인코포레이티드 | 알킬 방향족 탄화수소의 분리방법 및 분리장치 |
AR093357A1 (es) | 2012-11-05 | 2015-06-03 | Pf Medicament | Proteinas de union al antigeno y su utilizacion como producto de direccionamiento para el tratamiento del cancer |
GB201410826D0 (en) * | 2014-06-18 | 2014-07-30 | Bergenbio As | Anti-axl antibodies |
GB201410825D0 (en) * | 2014-06-18 | 2014-07-30 | Bergenbio As | Anti-axl antibodies |
US9986723B2 (en) * | 2014-10-22 | 2018-06-05 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Screen and use of therapeutics for pancreatic ductal adenocarcinoma |
GB201610902D0 (en) * | 2016-06-22 | 2016-08-03 | Bergen Teknologioverforing As And Bergenbio As | Anti-Axl Antagonistic Antibodies |
-
2015
- 2015-12-18 WO PCT/EP2015/080654 patent/WO2016097370A2/en active Application Filing
- 2015-12-18 KR KR1020177018063A patent/KR102453227B1/ko active IP Right Grant
- 2015-12-18 JP JP2017532709A patent/JP6931609B2/ja active Active
- 2015-12-18 US US15/533,049 patent/US10208121B2/en active Active
- 2015-12-18 CA CA2969879A patent/CA2969879A1/en active Pending
- 2015-12-18 EP EP15822930.2A patent/EP3233119A2/en active Pending
- 2015-12-18 CN CN202211672522.7A patent/CN116410318A/zh active Pending
- 2015-12-18 MX MX2017007941A patent/MX2017007941A/es unknown
- 2015-12-18 AU AU2015366213A patent/AU2015366213B2/en active Active
- 2015-12-18 CN CN201580069347.4A patent/CN107531786B/zh active Active
-
2018
- 2018-12-19 US US16/224,935 patent/US11584796B2/en active Active
-
2021
- 2021-03-03 JP JP2021033363A patent/JP2021101707A/ja active Pending
-
2023
- 2023-02-17 US US18/170,929 patent/US20230406941A1/en active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011505120A (ja) * | 2007-11-12 | 2011-02-24 | ユー3・ファーマ・ゲーエムベーハー | Axl抗体 |
JP2013538553A (ja) * | 2010-06-18 | 2013-10-17 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 抗axl抗体及び使用方法 |
JP2014522639A (ja) * | 2011-06-22 | 2014-09-08 | インサーム(インスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル) | 抗Axl抗体及びその使用 |
JP2014532687A (ja) * | 2011-11-03 | 2014-12-08 | ピエール、ファーブル、メディカマン | 抗原結合タンパク質および癌の治療のためのアドレッシング産物としてのその使用 |
JP6931609B2 (ja) * | 2014-12-18 | 2021-09-08 | ベルゲン テクノロジオーヴァーフォリング エイエス | 抗Axlアンタゴニスト抗体 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN107531786B (zh) | 2023-01-13 |
JP6931609B2 (ja) | 2021-09-08 |
WO2016097370A3 (en) | 2016-08-11 |
KR102453227B1 (ko) | 2022-10-11 |
US20230406941A1 (en) | 2023-12-21 |
US10208121B2 (en) | 2019-02-19 |
WO2016097370A2 (en) | 2016-06-23 |
KR20170099918A (ko) | 2017-09-01 |
CN116410318A (zh) | 2023-07-11 |
US20170349658A1 (en) | 2017-12-07 |
US11584796B2 (en) | 2023-02-21 |
MX2017007941A (es) | 2018-01-30 |
JP2018506961A (ja) | 2018-03-15 |
US20190177419A1 (en) | 2019-06-13 |
AU2015366213B2 (en) | 2021-10-07 |
EP3233119A2 (en) | 2017-10-25 |
AU2015366213A1 (en) | 2017-06-22 |
CA2969879A1 (en) | 2016-06-23 |
CN107531786A (zh) | 2018-01-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6931609B2 (ja) | 抗Axlアンタゴニスト抗体 | |
JP6787796B2 (ja) | 抗Axl抗体 | |
US11732048B2 (en) | Anti-axl antagonistic antibodies | |
JP6787795B2 (ja) | 抗Axl抗体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210331 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220222 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20221004 |