ES2647389T3 - Anticuerpos para GDF8 humano - Google Patents

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ES2647389T3
ES2647389T3 ES11726005.9T ES11726005T ES2647389T3 ES 2647389 T3 ES2647389 T3 ES 2647389T3 ES 11726005 T ES11726005 T ES 11726005T ES 2647389 T3 ES2647389 T3 ES 2647389T3
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Esther Latres
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Abstract

Un anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a, o bloquea la actividad biológica de GDF8 humano maduro natural que comprende la SEQ ID NO: 340, pero no se une a, o bloquea la actividad biológica de un constructo GDFB/TGFß1 quimérico que tiene los aminoácidos 48-72 de GDF8 humano maduro reemplazados con la secuencia de aminoácidos correspondiente de TGFß1, en donde el constructo GDF8/TGF1 quimérico comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 352, y en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: (a) secuencias de aminoácidos de HCDR1/HCDR2/HCDR3 que consisten en las SEQ ID NOs: 362/364/366, respectivamente y (b) secuencias de aminoácidos de LCDR1/LCDR2/LCDR3 que consisten en las SEQ ID NOs: 370/372/374, respectivamente.

Description

imagen1
DESCRIPCIÓN
Anticuerpos para GDF8 humano
Campo de la invención
5 La presente invención se refiere a anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que son específicos para el factor 8 de crecimiento y diferenciación (GDF8).
Antecedentes
El factor 8 de crecimiento y diferenciación (GDF8), también conocido como miostatina, es un miembro de la superfamilia de factores de crecimiento TGF-β. GDF8 es un regulador negativo de la masa del músculo esquelético, altamente expresado en el músculo esquelético en desarrollo y adulto.
15 GDF8 está altamente conservado en todas las especies, y las secuencias de aminoácidos de GDF8 murino y humano son idénticas (secuencia de ácido nucleico de GDF8 humano y secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 338-339) (McPherron et al., 1977 Nature 387: 83-90).
Una cantidad de enfermedades humanas están asociadas con pérdida o deterioro del tejido muscular, por ejemplo, distrofia muscular, atrofia muscular, síndrome de pérdida muscular, sarcopenia y caquexia, e inhibidores de GDF8 son aplicables al tratamiento de estas enfermedades o trastornos.
Los anticuerpos para GDF8 y los métodos terapéuticos se describen, por ejemplo, en los documentos US 6.096.506, US 7.320.789, US 7.807.159, WO 2007/047112, WO 2005/094446, US 2007/0087000, US 7.261.893 y WO 2010/070094.
25 Los documentos WO 2007/044411 y WO 2005/094446 describen anticuerpos antimiostatina.
Breve resumen de la invención
En el presente documento se describen anticuerpos humanos o humanizados y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos humanos o humanizados que se unen específicamente al factor 8 de crecimiento y diferenciación (GDF8) humano. Estos anticuerpos se caracterizan por unirse a GDF8 con alta afinidad y por la capacidad de neutralizar la actividad de GDF8. Los anticuerpos pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden comprender solo una porción de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv), y pueden modificarse para afectar la funcionalidad, por ejemplo, para eliminar las funciones efectoras residuales (Reddy et al., 35 (2000) J. Immunol., 164: 1925-1933). La presente invención proporciona un anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a, o bloquea la actividad biológica del GDF8 humano maduro natural que comprende la SEQ ID NO: 340, pero no se une a, o bloquea la actividad biológica de un constructo quimérico de GDF8/TGFβ1 que tiene los aminoácidos 48-72 de GDF8 humano maduro reemplazado con la secuencia de aminoácidos correspondiente de TGFβ1, en donde el constructo quimérico de GDF8/TGFβ1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 352, y en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: (a) secuencias de aminoácidos de HCDR1/HCDR2/HCDR3 que consisten en las SEQ ID NOs: 362/364/366, respectivamente y (b) secuencias de aminoácidos de LCDR1/LCDR2/LCDR3 que consisten en las SEQ ID NOs: 370/372/374, respectivamente. La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente 45 aceptable. La presente invención proporciona adicionalmente el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la invención, o la composición farmacéutica de la invención, para uso en medicina. Además, la presente invención proporciona el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la invención, o la composición farmacéutica de la invención, para su uso en el tratamiento de un paciente afectado, diagnosticado o con riesgo de sufrir una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en sarcopenia, caquexia y atrofia muscular debido a desuso o inmovilización. La presente invención también proporciona el uso del anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la invención, o la composición farmacéutica de la invención, en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de un paciente afectado, diagnosticado o en riesgo de ser afectado con una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en sarcopenia, caquexia, pérdida muscular, atrofia muscular, cáncer, artritis, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, osteoporosis, osteoartritis, osteopenia,
55 fracturas óseas incluyendo fracturas de cadera, síndromes metabólicos, homeostasis de la glucosa y sensibilidad a la insulina.
En un aspecto descrito en este documento, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 360 y 376, o una secuencia sustancialmente idéntica de las mismas.
En un aspecto descrito en este documento, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122,
65 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 322, 368 y 384 o una secuencia sustancialmente idéntica de las mismas.
imagen2
En un aspecto descrito en este documento, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de HCVR y una secuencia de aminoácidos de LCVR, en donde las secuencias de pares de HCVR/LCVR se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 114/322, 360/368 y 376/384.
5 También se describe en este documento un anticuerpo humano o humanizado o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de la región 3 determinante de la complementariedad de cadena pesada (HCDR3) y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena ligera (LCDR3), donde la secuencia de aminoácidos de HCDR3 se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296 , 312, 366 y 382, o una secuencia sustancialmente idéntica de las mismas, y la secuencia de aminoácidos de LCDR3 se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 328, 374 y 390, o una secuencia sustancialmente idéntica de las mismas. En otro aspecto descrito en este documento, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8/16,
15 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160, 168/176, 184/192, 200/208, 216/224, 232/240, 248/256, 264/272, 280/288, 296/304, 312/320, 120/328, 366/374 y 382/390.
En un aspecto relacionado descrito en este documento, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende además secuencias de aminoácidos de CDR1 (HCDR1) y CDR2 (HCDR2) de cadena pesada y secuencias de aminoácidos de CDR1 (LCDR1) y CDR2 (LCDR2) de cadena ligera, en donde la secuencia de aminoácidos de HCDR1 se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 362 y 378, o una secuencia sustancialmente idéntica de las mismas; la secuencia de aminoácidos de HCDR2 se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 364 y 380, o una secuencia sustancialmente idéntica de las mismas; la secuencia de 25 aminoácidos de LCDR1 se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 324, 370 y 386 o una secuencia sustancialmente idéntica de las mismas; y la secuencia de aminoácidos de LCDR2 se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270 , 286, 302, 318, 326, 372 y 388 o una secuencia sustancialmente idéntica de las mismas. En otro aspecto descrito en este documento, las HCDR1, HCDR2 y HCDR3 se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO: 36/38/40, 116/118/120, 228/230/232, 362/364/366 y 378/380/382; y LCDR1, LCDR2 y LCDR3 se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO: 44/46/48, 124/126/128, 236/238/240, 370/372/374 y 386/388/390. En otro aspecto más descrito en este documento, las CDR de cadena pesada y ligera se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO: 36/38/40/44/46/48 (por ejemplo, 21-E5), 116/118/120/124/126/128 (por ejemplo, 8D12), 228/230/232/236/238/240 (por ejemplo, 1A2), 362/364/366/370/372/374 (por ejemplo, H4H1657N2)
35 y 378/380/382/386/388/390 (por ejemplo, H4H1669P).
En un aspecto relacionado descrito en este documento, la invención incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a GDF8, donde el anticuerpo o fragmento comprende los dominios de CDR de cadena pesada y ligera contenidos en secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 114/322, 360/368 y 376/384. Los métodos y técnicas para identificar las CDR dentro de secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR son bien conocidos en la técnica y se pueden usar para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR especificadas descritas en este documento. Los ejemplos de convenciones que se
45 pueden usar para identificar los límites de las CDR incluyen, por ejemplo, la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucle estructural, y la definición de AbM es un compromiso entre los enfoques de Kabat y Chothia. Véase, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273: 927-948 (1997); y Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9268-9272 (1989). Las bases de datos públicas también están disponibles para identificar secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.
También se describen en la presente memoria las moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos en la presente memoria. Los vectores de expresión recombinante que portan
55 los ácidos nucleicos que codifican anticuerpos descritos en la presente memoria, y las células huésped en las que se han introducido dichos vectores, también se describen en la presente memoria, como son los métodos para preparar los anticuerpos descritos en este documento cultivando las células huésped descritas aquí.
En un aspecto descrito en este documento, el anticuerpo de la invención comprende una HCVR codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 359 y 375, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos un 95% de homología con las mismas.
En un aspecto descrito en la presente memoria, el anticuerpo de la invención comprende una LCVR codificada por una 65 secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 321, 367 y 383 o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos un 95% de homología con las mismas.
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En un aspecto descrito en la presente memoria, el anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos
5 de HCVR y una secuencia de aminoácidos de LCVR, en la que las secuencias pares de HCV/LCVR están codificadas por un par de moléculas de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1/9, 17/25, 33/41, 49/57, 65/73, 81/89, 97/105, 113/121, 129/137, 145/153, 161/169, 177/185, 193/201, 209/217, 225/233, 241/249, 257/265, 273/281, 289/297, 305/313, 113/321, 359/367 y 375/383.
También se describe aquí un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano o humanizado que comprende una HCDR3 codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135 , 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 365 y 381, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos un 95% de homología con las mismas y una LCDR3 codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191,
15 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 327, 373 y 389, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos un 95% de homología con las mismas. En un aspecto descrito en este documento, el conjunto de HCDR3/LCDR3 está codificado por un par de secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7/15, 23/31, 39/47, 55/63, 71/79, 87/95, 103/111, 119/127, 135/143, 151/159, 167/175, 183/191, 199/207, 215/223, 231/239, 247/255, 263/271, 279/287, 295/303, 311/319, 119/327, 365/373 y 381/389.
En un aspecto relacionado descrito en este documento, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende además una HCDR1 y HCDR2, y una LCDR1 y LCDR2, en donde la HCDR1 está codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 19 , 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 361 y 377, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos 95% de homología con 25 las mismas, la HCDR2 está codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 363 y 379, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos un 95% de homología con las mismas, la LCDR1 está codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11 , 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 323, 369 y 385 o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos un 95% de homología con las mismas, y la LCDR2 codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 325, 371 y 387, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos un 95% de homología con las mismas. En un aspecto descrito en este documento, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende CDR de cadena pesada y ligera codificadas por un conjunto de secuencias de ácido nucleico de la SEQ ID
35 NO: 35/37/39/43/45/47, 115/117/119/123/125/127, 227/229/231/235/237/239, 361/363/365/369/371/373, o 377/379/381/ 385/387/389.
Se describe adicionalmente aquí un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado que se une específicamente a GDF8, que comprende CDR de cadena pesada y ligera seleccionadas del grupo que consiste en (a) una HCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 -X8 (SEQ ID NO: 329), en donde X1 es Gly; X2 es Phe; X3 es Thr; X4 es Phe; X5 es Ser; X6 es Ala o Ser; X7 es Phe o Tyr; X8 es Gly o Ala; (b) una HCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 -X8 (SEQ ID NO: 330), en donde X1 es Ile; X2 Gly o Ser; X3 es Tyr o Gly; X4 Ser o Asp; X5 es Gly; X6 es Gly; X7 es Ser o Asn; y X8 es Ala o Glu; (c) una HCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 -X8 -X9 -X10 45 X11 -X12 -X13 -X14 (SEQ ID NO: 331), en donde X1 es Ser o Ala; X2 es Thr o Lys; X3 es Asp o Ile; X4 es Gly o Ser; X5 es Ala o His; X6 es Trp o Tyr; X7 es Lys o Asp; X8 es Met o Ile; X9 es Ser o Leu; X10 es Gly o Ser; X11 es Leu o Gly; X12 es Asp o Met; X13 es Val o Asp; X14 es Val o ausente; (d) una LCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 (SEQ ID NO: 332), en donde X1 es Gln; X2 es Asp o Gly; X3 es Ile; X4 es Ser; X5 es Asp
o Asn; y X6 es Tyr o Trp; (e) una LCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula X1 -X2 -X3 (SEQ ID NO: 333), en donde X1 es Thr o Ala; X2 es Thr o Ala; y X3 es Ser; y (f) una región LCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 -X8 -X9 (SEQ ID NO: 334), en donde X1 es Gln; X2 es Lys o Gln; X3 es Ala o Tyr; X4 es Asp o Asn;X5 es Ser;X6 es Ala oPhe; X7 es Pro; X8es Leu; y X9 es Thr.
La metodología para derivar las secuencias de consenso antes mencionadas (SEQ ID NOs: 329-334) se ilustra en las 55 Figs. 4A y 4B.
También se describe aquí un anticuerpo o fragmento de anticuerpo completamente humano o humanizado que une GDF8 con una afinidad (expresada como una constante de disociación, "KD") de aproximadamente 1 nM o menos, medida mediante un ensayo de resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, BIACOREMR). En ciertos aspectos descritos en este documento, el anticuerpo de la invención exhibe una Kdisociación de aproximadamente 700 pM o menos; de aproximadamente 500 pM o menos; de aproximadamente 320 pM o menos; de aproximadamente 160 pM o menos; de aproximadamente 100 pM o menos; de aproximadamente 50 pM o menos; de aproximadamente 10 pM o menos; o de aproximadamente 5 pM o menos.
65 Un aspecto descrito en la presente memoria proporciona un anticuerpo monoclonal (mAb) completamente humano o humanizado que se une e inhibe específicamente a GDF8 humano y exhibe una IC50 de menos de o igual a
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5 estrechamente relacionadas, tales como GDF11, con una IC50 mucho mayor que GDF8 en un bioensayo de luciferasa. Un aspecto descrito en este documento proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que exhibe una IC50 al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 500 veces, al menos aproximadamente 1.000 veces, o al menos aproximadamente 1.500 veces mayor para bloquear la actividad de GDF11 con respecto a GDF8.
La invención abarca anticuerpos anti-GDF8 que tienen un patrón de glicosilación modificado. En algunas aplicaciones, la modificación para eliminar sitios de glicosilación indeseables puede ser útil, o un anticuerpo que carece de una fracción de fucosa presente en la cadena de oligosacáridos, por ejemplo, para aumentar la función de citotoxicidad
15 celular dependiente de anticuerpos (véase Shield et al. (2002) JBC 277: 26733). En otras aplicaciones, la modificación de una galactosilación puede realizarse para modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
La invención incluye anticuerpos anti-GDF8 que se unen a epítopos específicos de GDF8 y son capaces de bloquear la actividad biológica de GDF8. Un primer aspecto descrito en este documento proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo de la proteína GDF8 madura (SEQ ID NO: 340) dentro de aminoácidos de aproximadamente 1 a aproximadamente 109; de aproximadamente 1 a aproximadamente 54; de aproximadamente 1 a aproximadamente 44; de aproximadamente 1 a aproximadamente 34; de aproximadamente 1 a aproximadamente 24; y de aproximadamente 1 a aproximadamente 14. Un segundo aspecto descrito en este documento proporciona un anticuerpo que se une a uno
o más de un epítopo de la proteína GDF8 madura (SEQ ID NO: 340) dentro de aminoácidos de aproximadamente 35 a
25 aproximadamente 109; de aproximadamente 45 a aproximadamente 109; de aproximadamente 55 a aproximadamente 109; de aproximadamente 65 a aproximadamente 109; de aproximadamente 75 a aproximadamente 109; de aproximadamente 85 a aproximadamente 109; de aproximadamente 92 a aproximadamente 109; o de aproximadamente 95 a aproximadamente 109. Un tercer aspecto descrito en este documento proporciona un anticuerpo
o fragmento de unión a antígeno del anticuerpo que se une dentro de un epítopo de la proteína GDF8 humano madura desde aproximadamente el residuo de aminoácido 48 hasta aproximadamente 72; de aproximadamente 48 a aproximadamente 69; de aproximadamente 48 a aproximadamente 65; de aproximadamente 52 a aproximadamente 72; de aproximadamente 52 a aproximadamente 65; o de aproximadamente 56 a aproximadamente 65.
Un aspecto relacionado descrito en este documento proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del
35 mismo que compite por la unión específica a GDF8 con otro anticuerpo que comprende una combinación de secuencia de aminoácidos HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 de la SEQ ID NO: 36/38/40/44/46/48, 116/118/120/124/ 126/128, 228/230/232/236/238/240, 362/364/366/370/372/374, o 378/380/382/386/388/390. En un aspecto descrito en este documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno compite por la unión específica a GDF8 con otro anticuerpo que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de la SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 114/322, 360/368 o 376/384. Todavía otro aspecto relacionado descrito en este documento proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que reconoce el epítopo en GDF8 que es reconocido por otro anticuerpo que comprende una combinación de secuencia de aminoácidos de HCDR/LCDR de la SEQ ID NO: 36/38/40/44/46/48, 116/118/120/124/126/128, 228/230/232/236/238/240,
45 362/364/366/370/372/374, o 378/380/382/386/388/390. En un aspecto descrito en este documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención reconoce el epítopo en GDF8 que es reconocido por otro anticuerpo que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de la SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 114/322, 360/368 o 376/384.
Se describe aquí una composición que comprende un anticuerpo GDF8 antihumano humano o humanizado recombinante y un vehículo aceptable. Se describen adicionalmente vectores y células huésped que comprenden vectores que contienen moléculas de ácido nucleico que codifican el anticuerpo anti-GDF8 humano descrito aquí, así como métodos para producir estos anticuerpos novedosos, que comprenden cultivar una célula huésped que
55 comprende ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-GDF8 descrito en la presente memoria o un fragmento de anticuerpo, en condiciones que permitan la producción de la proteína y la recuperación de la proteína así producida.
También se describen en la presente memoria métodos para inhibir la actividad de GDF8 usando un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, descritos en este documento. En un aspecto descrito en la presente memoria, el método comprende administrar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo descrito en la presente memoria, a un sujeto humano que padece un trastorno que se mejora mediante la inhibición de la actividad de GDF8. En aspectos preferidos descritos en este documento, el sujeto humano tratado con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención necesita mejorar la homeostasis de glucosa, disminuir la masa de grasa, aumentar la sensibilidad a la insulina, mejorar la función renal y/o disminuir la acumulación de grasa. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención es útil 65 para tratar, prevenir o inhibir una enfermedad o condición caracterizada por pérdida ósea, incluyendo osteoporosis, osteopenia, osteoartritis y fracturas óseas, tratar el síndrome metabólico, contrarrestar la pérdida muscular por la
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administración sostenida de un glucocorticoide o un pérdida de hormonas esteroideas o de músculo relacionada con distrofia muscular, atrofia muscular, síndrome de pérdida muscular, sarcopenia y caquexia.
Otros objetos y ventajas se pondrán de manifiesto a partir de una revisión de la siguiente descripción detallada. 5 Breve descripción de las figuras
Figura 1. Inmunotransferencia de proteólisis limitada de GDF8 humano con proteinasa K. Los geles fueron SDS-PAGE al 18% no reductora con 0,2 µg de GDF8 cargados en cada carril, y 2 µg/mL de anticuerpos de control I (A), 1A2 (B) o 21-E9 (C). Carril 1: tiempo de digestión 10 min, 1 µg de GDF8, 0 µg de proteinasa K; Carril 2: tiempo de digestión 10 min, GDF8 1 µg, 1 µg de proteinasa K; Carril 3: tiempo de digestión 10 min, 1 µg de GDF8, 6 µg de proteinasa K; Carril
4: tiempo de digestión 45 min, 1 µg de GDF8, 0 µg de proteinasa K; Carril 5: tiempo de digestión 45 min, 1 µg de GDF8, 1 µg de proteinasa K; Carril 6: tiempo de digestión 45 min, 1 µg de GDF8, 6 µg de proteinasa K. Figura 2. Inmunotransferencia de proteólisis limitada de GDF8 humano con altas dosis de proteinasa K. Los geles
15 fueron SDS-PAGE 18% no reductores con 0 o 4 µg de GDF8 cargado en cada carril, y 2 µg/mL de control I (A) o 1A2 (B). Carril 1: tiempo de digestión 16 h, 0 µg de GDF8, 96 µg de proteinasa K; Carril 2: tiempo de digestión 16 h, 4 µg de GDF8, 0 µg de proteinasa K; Carril 3: tiempo de digestión 16 h, 4 µg de GDF8, 24 µg de proteinasa K; Carril 4: tiempo de digestión 16 h, 4 µg de GDF8, 96 µg de proteinasa K; Carril 5: tiempo de digestión 1 hora, 4 µg GDF8, 24 µg de proteinasa K; Carril 6: tiempo de digestión 1 hora, 4 µg de GDF8, 96 µg de proteinasa K; Carril 7: tiempo de digestión 10 min, 0 µg GDF8, 0 µg de proteinasa K; Carril 8: tiempo de digestión 10 min, 4 µg de GDF8, 24 µg de proteinasa K. Figuras 3A y 3B. Gráficos que ilustran el porcentaje de niveles iniciales de glucosa a lo largo del tiempo en ratones sometidos a una prueba de tolerancia a la insulina antes (Figura 3A) y después (Figura 3B) de tratamiento con anticuerpos. Figuras 4A y 4B. Alineación de las secuencias de aminoácidos de las CDR de cadena pesada (Figura 4A) y las CDR de
25 cadena ligera (Figura 4B) de ejemplos de anticuerpos anti-GDF8 H4H1657N2 y H4H1669P, que ilustran las secuencias consenso compartidas entre estas secuencias.
Descripción detallada
Antes de que se describan los presentes métodos, debe entenderse que esta invención no se limita a métodos particulares, y se describen las condiciones experimentales, ya que tales métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente memoria tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente invención estará limitado solo por las reivindicaciones adjuntas.
35 Como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referencias al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a "un método" incluye uno o más métodos, y/o etapas del tipo descrito en este documento y/o que serán evidentes para aquellos expertos en la técnica después de leer esta memoria descriptiva.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" cuando se usa en referencia a un valor numérico particular mencionado, significa que el valor puede variar desde el valor indicado en no más del 1%. Por ejemplo, como
45 se usa en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, etc.).
Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria en la práctica o prueba de la presente invención, se describen a continuación los métodos y materiales preferidos.
Definiciones
"Factor 8 de diferenciación de crecimiento humano", "GDF8" y "miostatina" se usan indistintamente para referirse a la proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 338 y la proteína que tiene la secuencia de
55 aminoácidos dela SEQ ID NO: 339 (propéptido) y 340 (proteína madura).
El término "anticuerpo", tal como se usa en la presente memoria, pretende referirse a moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en este documento como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en este documento como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (CL1). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR),
65 intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesto por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo terminal amino hasta el extremo terminal carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En diferentes realizaciones de la invención, las FR del anticuerpo anti-GDF8 (o porción del mismo de unión a antígeno) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o pueden modificarse natural o artificialmente. Una secuencia consenso de aminoácidos se puede definir basándose en un análisis lado a lado de dos o más CDR.
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5 El término "anticuerpo", como se usa en este documento, también incluye fragmentos de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Los términos "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se usan en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glicoproteína de origen natural, enzimáticamente obtenible, sintético o genéticamente modificado que se una específicamente a un antígeno para formar un complejo. Los fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo pueden derivarse, por ejemplo, de moléculas de anticuerpo completas usando cualquier técnica estándar adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica una variable de anticuerpo y opcionalmente dominios constantes. Dicho ADN es conocido y/o está disponible fácilmente a partir de, por ejemplo, fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (que incluyen, por ejemplo, bibliotecas de anticuerpos de
15 fagos), o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o usando técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear residuos de cisteína, modificar, agregar o eliminar aminoácidos, etc.
Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) Fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los residuos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región aislada determinante de complementariedad (CDR)). Otras moléculas modificadas genéticamente, tales como diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y minicuerpos, también están abarcadas dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", como se usa en la presente memoria.
25 Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo comprenderá típicamente al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR que sea adyacente o en el marco con una o más secuencias marco. En los fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio VH asociado con un dominio VL, los dominios VH y VL pueden estar situados uno con relación al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener dímeros VH-VH, VH-VL
o VL-VL. Alternativamente, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio VH o VL monomérico.
En ciertas realizaciones, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio
35 variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Ejemplos, no limitantes de configuraciones de dominios variable y constante que se pueden encontrar dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención incluyen: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; y (xiv) VL-
CL. En cualquier configuración de dominios variable y constante, que incluye cualquiera de las configuraciones a modo de ejemplo enumeradas anteriormente, los dominios variable y constante pueden estar directamente enlazados entre sí
o pueden estar enlazados mediante una región enlazadora o bisagra total o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que dan como resultado un enlace flexible o semiflexible entre dominios variable y/o constante adyacentes en una única molécula polipeptídica. Además, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención puede comprender un homodímero o
45 heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios VH o VL monoméricos (por ejemplo, mediante enlace o enlaces disulfuro).
Como con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento multiespecífico de unión a antígeno de un anticuerpo comprenderá típicamente al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno separado o a un epítopo diferente en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, que incluye los ejemplos de formatos de anticuerpos biespecíficos aquí descritos, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención
55 usando técnicas de rutina disponibles en el arte.
Los anticuerpos de la presente invención pueden funcionar a través de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC). "Citotoxicidad dependiente del complemento" (CDC) se refiere a la lisis de células que expresan antígeno mediante un anticuerpo de la invención en presencia de complemento. "Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" (ADCC) se refiere a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas inespecíficas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, células asesinas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen anticuerpos unidos en una célula objetivo y por lo tanto conduce a la lisis de la célula objetivo. CDC y ADCC pueden medirse usando ensayos que son bien conocidos y disponibles en la técnica. (Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos. 5.500.362 y 5.821.337, y Clynes et
65 cal., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95: 652 -656 (1998)).
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El término "se une específicamente", o similar, significa que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica se puede caracterizar por una constante de disociación de 1x10-6 M o menos. Los métodos para determinar si dos moléculas se unen específicamente son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, diálisis de equilibrio, 5 resonancia de plasmón superficial y similares. Por ejemplo, un anticuerpo que "se une específicamente" a GDF8 humano, como se usa en el contexto de la presente invención, incluye anticuerpos que se unen a GDF8 humano o a una porción del mismo (por ejemplo, un péptido que comprende al menos 6 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 340) con una KD menor que aproximadamente 1.000 nM, menor que aproximadamente 500 nM, menor que aproximadamente 300 nM, menor que aproximadamente 200 nM, menor que aproximadamente 100 nM, menor que aproximadamente 90 nM, menor que aproximadamente 80 nM, menor que aproximadamente 70 nM, menor que aproximadamente 60 nM, menor que aproximadamente 50 nM, menor que aproximadamente 40 nM, menor que aproximadamente 30 nM, menor que aproximadamente 20 nM, menor que aproximadamente 10 nM, menor que aproximadamente 5 nM, menor que aproximadamente 4 nM, menor que aproximadamente 3 nM, menor que aproximadamente 2 nM, menor que aproximadamente 1 nM o menor que aproximadamente 0,5 nM, tal como se midió
15 en un ensayo de resonancia de plasmón superficial. (Véase, por ejemplo, el Ejemplo 3, en este documento). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a GDF8 humano puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de GDF8 de otras especies.
El término anticuerpo de "alta afinidad" se refiere a aquellos anticuerpos capaces de unirse a GDF8 con una constante de disociación (KD) de aproximadamente 10-8 M o menos, aproximadamente 10-9 M o menos, aproximadamente 10-10 M
o menos, aproximadamente 10-11 M o menos, o aproximadamente 10-12 M o menos, tal como se midio mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIACOREMR o ELISA de afinidad en solución.
El término "reducción de velocidad" o "Kdisociación" significa un anticuerpo que se disocia de GDF8 con una constante
25 de velocidad de 1 x 10-3 s-1 o menos, preferiblemente 1 x 10-4 s-1 o menos, como se determina por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIACOREMR.
Un anticuerpo "neutralizante" o "bloqueador" se entiende que se refiere a un anticuerpo cuya unión a GDF8 da como resultado la inhibición de la actividad biológica de GDF8. Esta inhibición de la actividad biológica de GDF8 puede evaluarse midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de GDF8. Estos indicadores de actividad biológica de GDF8 pueden evaluarse mediante uno o más de varios ensayos estándar in vitro o in vivo conocidos en la técnica (véanse los ejemplos a continuación).
Los anticuerpos anti-GDF8 completamente humanos descritos en este documento pueden comprender una o más
35 sustituciones, inserciones y/o supresiones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de línea germinal correspondientes. Tales mutaciones se pueden determinar fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos descritas en la presente memoria con las secuencias de la línea germinal disponibles en, por ejemplo, bases de datos públicas de secuencias de anticuerpos. En este documento se describen anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en la presente memoria, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están retromutadas al residuo o residuos germinal correspondientes o a una sustitución de aminoácidos conservadora (natural o no natural) del residuo o residuos de la línea germinal correspondiente (tales cambios de secuencia se denominan en el presente documento "retromutaciones de línea germinal"). Una persona experta en la técnica, comenzando con las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera descritas aquí,
45 puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprenden una o más retromutaciones de la línea germinal individual o combinaciones de las mismas. En ciertos aspectos descritos en este documento, todos los residuos del marco y/o CDR dentro de los dominios VH y/o VL se mutan de nuevo a la secuencia de la línea germinal. En otros aspectos descritos en este documento, solo ciertos residuos se mutan de nuevo a la secuencia de la línea germinal, por ejemplo, solo los residuos mutados encontrados dentro de los primeros 8 aminoácidos de FR1 o dentro de los últimos 8 aminoácidos de FR4, o solo los residuos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. Además, los anticuerpos de la presente invención pueden contener cualquier combinación de dos o más retromutaciones de la línea germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, es decir, en donde ciertos residuos individuales mutan nuevamente a la secuencia de la línea germinal, mientras que otros residuos que difieren de la secuencia germinal se mantienen. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que
55 contienen una o más retromutaciones de la línea germinal pueden probarse fácilmente para una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, afinidad de unión incrementada, propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o aumentadas (según el caso), inmunogenicidad reducida, etc. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general se describen en este documento.
Se describen en la presente memoria anticuerpos anti-GDF8 que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR descritas en este documento que tienen una o más sustituciones conservadoras. Por ejemplo, anticuerpos anti-GDF8 que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc. sustituciones conservadoras de aminoácidos relativas a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR divulgadas en este documento como 65 se describe aquí. En un aspecto descrito en este documento, el anticuerpo comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 360 y 376 con 8 o menos sustituciones conservadoras de
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aminoácidos. En otro aspecto descrito en este documento, el anticuerpo comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 360 y 376 con 6 o menos sustituciones conservadoras de aminoácidos. En otro aspecto descrito en este documento, el anticuerpo comprende un HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 360 y 376 con 4 o menos sustituciones conservadoras de aminoácidos. En
5 otro aspecto descrito en este documento, el anticuerpo comprende un HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 360 y 376 con 2 o menos sustituciones conservadoras de aminoácidos. En un aspecto descrito en este documento, el anticuerpo comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 368 y 384 con 8 o menos sustituciones conservadoras de aminoácidos. En otro aspecto descrito en este documento, el anticuerpo comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 368 y 384 con 6 o menos sustituciones conservadoras de aminoácidos. En otro aspecto descrito en este documento, el anticuerpo comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 368 y 384 con 4 o menos sustituciones conservadoras de aminoácidos. En otro aspecto descrito en este documento, el anticuerpo comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 368 y 384 con 2 o menos sustituciones conservadoras de aminoácidos.
15 En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención se puede conjugar con una fracción terapéutica ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, e inmunosupresor o un radioisótopo.
Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o eliminado de al menos un componente de un organismo, tejido o célula en el que el anticuerpo existe de manera natural o se produce naturalmente es un "anticuerpo aislado" para los fines de la presente invención. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpo in situ dentro de una célula recombinante, así como un anticuerpo que
25 se ha sometido a al menos una etapa de purificación o aislamiento. De acuerdo con ciertas realizaciones, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos.
El término "resonancia de plasmón superficial", como se usa en este documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas dentro de una matriz biosensora, por ejemplo, usando el sistema BIACOREMR (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ).
El término "KD", como se usa en el presente documento, se entiende que se refiere a la constante de disociación de equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno particular.
35 El término "epítopo" incluye cualquier determinante, preferiblemente un determinante polipeptídico, capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de células T. En ciertas realizaciones, los determinantes de epítopos incluyen agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo o grupos sulfonilo, y, en ciertas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno que está unido por un anticuerpo. En ciertas realizaciones, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando reconoce preferiblemente su antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. Por ejemplo, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la KD es inferior o igual a 10-8 M, inferior o igual a 10-9 M, o inferior o igual a 10-10 M.
45 Una proteína o polipéptido es "sustancialmente puro", "sustancialmente homogéneo" o "sustancialmente purificado" cuando al menos aproximadamente 60 a 75% de una muestra exhibe una única especie de polipéptido. El polipéptido o proteína puede ser monomérico o multimérico. Un polipéptido o proteína sustancialmente puro comprenderá típicamente aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80% o 90% p/p de una muestra de proteína, habitualmente aproximadamente 95%, y preferiblemente más de 99% pura. La pureza o homogeneidad de la proteína puede indicarse mediante varios medios bien conocidos en la técnica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de proteína, seguido de visualización de una única banda polipeptídica después de teñir el gel con un colorante bien conocido en la técnica. Para ciertos propósitos, se puede proporcionar una resolución más alta usando HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica para la purificación.
55 El término "análogo o variante polipeptídico" como se usa en la presente memoria se refiere a un polipéptido que está compuesto por un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene identidad sustancial con una porción de una secuencia de aminoácidos y que tiene al menos una de las siguientes propiedades: (1) unión específica a GDF8 en condiciones de unión adecuadas, o (2) capacidad para bloquear la actividad biológica de GDF8. Típicamente, los análogos o variantes polipeptídicas comprenden una sustitución conservadora de aminoácidos (o inserción o supresión) con respecto a la secuencia que se produce naturalmente. Los análogos típicamente tienen al menos 20 aminoácidos de longitud, al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o 200 aminoácidos de longitud o más, y a menudo pueden ser tan largos como un polipéptido de longitud completa que se produce en la naturaleza.
65 Las sustituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos, (4) alteran las
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afinidades de unión, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir diversas mutaciones de una secuencia distinta de la secuencia peptídica de origen natural. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos simples o múltiples (preferiblemente sustituciones conservadoras de aminoácidos) en la secuencia de origen natural (preferiblemente en la porción del polipéptido fuera del dominio o dominios que forman contactos intermoleculares. Una sustitución conservadora de aminoácidos no debería cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia original (por ejemplo, un reemplazo de aminoácido no tiende a romper una hélice que se produce en la secuencia original o interrumpir otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia original). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias polipeptídicas reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton 1984 WH Freeman and Company, Nueva York; Introduction to Protein Structure (Branden & Tooze, editores, 1991, Garland Publishing, NY); y Thornton et al., 1991 Nature 354: 105.
Los análogos no peptídicos se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos con propiedades análogas a aquellas del péptido molde. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan "miméticos de péptidos"
o "peptidomiméticos" (véase, por ejemplo, Fauchere (1986) J. Adv. Drug Res. 15:29; y Evans et al., (1987) J. Med. Chem. 30: 1229. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un Daminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) también se puede usar para generar péptidos más estables. Además, los péptidos constreñidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de secuencia consenso sustancialmente idéntica se pueden generar mediante métodos conocidos en la técnica (Rizo et al., (1992) Ann. Rev. Biochem. 61: 387), por ejemplo, mediante la adición de residuos internos de cisteína capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.
El término "porcentaje de identidad de secuencia" en el contexto de las secuencias de ácidos nucleicos se refiere a los residuos en dos secuencias que son iguales cuando se alinean para máxima correspondencia. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser sobre un tramo de al menos aproximadamente nueve nucleótidos o más, usualmente al menos aproximadamente 18 nucleótidos, más usualmente al menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más típicamente al menos aproximadamente 32 nucleótidos, y preferiblemente al menos aproximadamente 36, 48 o más nucleótidos. Existen varios algoritmos diferentes conocidos en la técnica que pueden usarse para medir la identidad de secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos se pueden comparar usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas en Wisconsin Package Versión 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wis. FASTA, que incluye, por ejemplo, los programas FASTA2 y FASTA3, proporciona alineaciones y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de la mejor superposición entre las secuencias de consulta y búsqueda (Pearson (1990) Methods Enzymol. 183: 63-98 y (2000) Methods Mol. Biol. 132: 185-219). A menos que se especifique lo contrario, se utilizan los parámetros predeterminados para un programa o algoritmo en particular. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico puede determinarse usando FASTA con sus parámetros predeterminados (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) o usando Gap con sus parámetros predeterminados como se proporciona en GCG versión 6.1.
Una referencia a una secuencia de ácido nucleico abarca su complemento a menos que se especifique lo contrario. Por lo tanto, debe entenderse que una referencia a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia particular abarca su cadena complementaria, con su secuencia complementaria. Generalmente, la técnica usa los términos "porcentaje de identidad de secuencia", "porcentaje de similitud de secuencia" y "porcentaje de homología de secuencia" de manera intercambiable. En esta solicitud, estos términos tendrán el mismo significado con respecto a las secuencias de ácido nucleico.
El término "similitud sustancial", o "similitud sustancial de secuencia", cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea de manera óptima con las inserciones o supresiones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), hay identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98% o al menos aproximadamente 99% de las bases de nucleótidos, según lo medido por cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST
o GAP, como se discutió anteriormente.
Como se aplica a polipéptidos, el término "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico" significa que dos secuencias peptídicas, cuando están óptimamente alineadas, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando pesos de hueco predeterminados, comparten al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 98% o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia. Preferiblemente, las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren por sustituciones conservadoras de aminoácidos. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la que un residuo de aminoácido se sustituye por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución conservadora de aminoácidos no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud se puede ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales alifáticas con hidroxilo: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina;
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5 y 6) cadenas laterales que contienen azufre son cisteína y metionina. Los grupos preferidos de sustitución conservadora de aminoácidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, y asparagina-glutamina. Alternativamente, un reemplazo conservador es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 descrita en Gonnet et al., (1992) Science 256: 1443-45. Un reemplazo "moderadamente conservador" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, se mide típicamente usando un software de análisis de secuencia. El software de análisis de proteínas hacer coincidir secuencias similares utilizando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, supresiones y otras modificaciones, incluidas las 15 sustituciones conservadoras de aminoácidos. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como "Gap" y "Bestfit" que se pueden usar con parámetros predeterminados para determinar la homología de secuencia o identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína natural y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también se pueden comparar usando FASTA usando parámetros predeterminados o recomendados, un programa en GCG versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de la mejor superposición entre las secuencias de consulta y búsqueda (Pearson (2000), citado más arriba). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente blastp o tblastn, usando parámetros predeterminados. Véase, por ejemplo, Altschul et al., (1990)
25 J. Mol. Biol. 215: 403-410 y Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-402.
La longitud de las secuencias polipeptídicas comparadas para homología generalmente será al menos aproximadamente de 16 residuos de aminoácidos, al menos aproximadamente 20 residuos, al menos aproximadamente 24 residuos, al menos aproximadamente 28 residuos, o al menos aproximadamente 35 residuos. Cuando se busca una base de datos que contiene secuencias de un gran número de organismos diferentes, es preferible comparar secuencias de aminoácidos.
El término "cantidad efectiva" es una concentración o cantidad de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que da como resultado el logro de un objetivo particular indicado. Una "cantidad efectiva" de un anticuerpo
35 anti-GDF8 o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo del mismo se puede determinar empíricamente. Además, una "cantidad terapéuticamente efectiva" es una concentración o cantidad de un anticuerpo anti-GDF8 o fragmento de unión a antígeno del mismo que es efectiva para lograr un efecto terapéutico establecido. Esta cantidad también puede determinarse empíricamente.
Preparación de anticuerpos humanos
Se conocen en la técnica métodos para generar anticuerpos monoclonales, que incluyen anticuerpos monoclonales completamente humanos. Cualquiera de tales métodos conocidos puede usarse para producir anticuerpos humanos que se unen específicamente a GDF8.
45 Usando tecnología VELOCIMMUNEMR o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, los anticuerpos quiméricos de alta afinidad para GDF8 se aíslan inicialmente teniendo una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la sección experimental siguiente, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan por las características deseables, que incluyen afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se reemplazan con una región constante humana deseada para generar el anticuerpo completamente humano de la invención, por ejemplo, IgG1 o IgG4 modificados o natural. Si bien la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de alta afinidad de unión a antígeno y especificidad de objetivo residen en la región variable.
55 En general, los anticuerpos descritos en este documento poseen afinidades muy altas, que típicamente poseen KD de aproximadamente 10-12 a aproximadamente 10-9 M, cuando se miden uniéndose al antígeno ya sea inmovilizado en fase sólida o en fase de solución. Las regiones constantes de ratón se reemplazan con regiones constantes humanas deseadas para generar los anticuerpos completamente humanos de la invención, por ejemplo, IgG1 natural (SEQ ID NO: 335) o IgG4 (SEQ ID NO: 336), o IgG1 o IgG4 modificado (por ejemplo, SEQ ID NO: 337). Si bien la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de alta afinidad de unión a antígeno y especificidad objetivo residen en la región variable.
Bioequivalentes
65 Los anticuerpos anti-GDF8 y los fragmentos de anticuerpos descritos en la presente memoria abarcan proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían desde aquellas de los anticuerpos descritos, pero que retienen la capacidad de unirse a GDF8 humano. Tales variantes de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos comprenden una o más adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia original, pero exhiben una actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. Del mismo modo, las secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-GDF8 descritas en este documento abarcan secuencias que
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5 comprenden una o más adiciones, supresiones o sustituciones de nucleótidos cuando se comparan con la secuencia descrita, pero que codifican un anticuerpo anti-GDF8 o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo anti-GDF8 o fragmento de anticuerpo de la invención. Los ejemplos de tales variantes de secuencias de aminoácidos y ADN se discutieron anteriormente.
Dos proteínas de unión a antígeno o anticuerpos se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya velocidad y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, ya sea dosis única o dosis múltiple. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en la medida de su absorción, pero no en su velocidad de absorción y, sin embargo, pueden considerarse bioequivalentes
15 porque tales diferencias en la velocidad de absorción son intencionales y se reflejan en el etiquetado, no son esenciales para la consecución de concentraciones efectivas de fármaco corporal en, por ejemplo, uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el producto de farmacológico particular estudiado.
En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no existen diferencias clínicamente significativas en su seguridad, pureza y potencia.
En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluido un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad, o disminución de la efectividad, en comparación
25 con la terapia continua sin dicho cambio.
En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan mediante un mecanismo común o mecanismos de acción para la condición o condiciones de uso, en la medida en que tales mecanismos sean conocidos.
La bioequivalencia se puede demostrar mediante métodos in vivo e in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) una prueba in vivo en humanos u otros mamíferos, en la que la concentración del anticuerpo o sus metabolitos se mide en sangre, plasma, suero u otro fluido biológico en función del tiempo; (b) una prueba in vitro que se ha correlacionado con y es razonablemente predictiva de datos de biodisponibilidad in vivo en humanos; (c) una
35 prueba in vivo en humanos u otros mamíferos en la que se mide el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su objetivo) como una función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establezca la seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.
Las variantes bioequivalentes de anticuerpos anti-GDF8 de la invención se pueden construir, por ejemplo, realizando diversas sustituciones de residuos o secuencias o eliminando residuos o secuencias terminales o internas no necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, los residuos de cisteína no esenciales para la actividad biológica pueden eliminarse o reemplazarse por otros aminoácidos para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpo anti-GDF8 que comprenden cambios de aminoácidos que modifican las características de
45 glicosilación de los anticuerpos, por ejemplo, mutaciones que eliminan o suprimen la glicosilación.
Mapeo de epítopos y tecnologías relacionadas
Para detectar anticuerpos que se unen a un epítopo particular (por ejemplo, aquellos que bloquean la unión de IgE a su receptor de alta afinidad), puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como el descrito en Harlow y Lane (1990) citado más arriba. Otros métodos incluyen mutantes de barrido de alanina, transferencias de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248: 443-63), o análisis de escisión de péptidos. Además, se pueden emplear métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496).
55 El término "epítopo" se refiere a un sitio sobre un antígeno al que responden las células B y/o T. Los epítopos de células B pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos se retienen típicamente en la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario se pierden típicamente en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo típicamente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.
El perfil de modificación asistida (MAP), también conocido como perfil de anticuerpos basado en la estructura de antígenos (ASAP) es un método que clasifica grandes cantidades de anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos contra 65 el mismo antígeno de acuerdo con las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo para superficies de antígenos modificadas química o enzimáticamente (US 2004/0101920). Cada categoría puede reflejar un epítopo único,
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claramente distinto de, o superpuesto parcialmente, con un epítopo representado por otra categoría. Esta tecnología permite el filtrado rápido de anticuerpos genéticamente idénticos, de modo que la caracterización puede enfocarse en anticuerpos genéticamente distintos. Cuando se aplica para detectar hibridomas, MAP puede facilitar la identificación de clones de hibridomas raros que producen mAb que tienen las características deseadas. MAP se puede usar para
5 clasificar los anticuerpos anti-GDF8 descritos en este documento en grupos de anticuerpos que se unen a diferentes epítopos.
Se describen en la presente memoria anticuerpos anti-GDF8 y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos que se unen a epítopos específicos de GDF8 humano (SEQ ID NO: 340) y son capaces de bloquear la actividad biológica de GDF8. En un aspecto descrito en la presente memoria, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une dentro de un epítopo que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 109; 1 a 54; 1 a 44; 1 a 34; 1 a 24; y 1 a 14. En otro aspecto descrito en este documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une dentro de un epítopo que comprende los residuos de aminoácidos 65 a 72; 35 a 109; 45 a 109; 55 a 109; 65 a 109; 75 a 109; 85 a 109; 92 a 109; o 95 a 109. En otro aspecto descrito en este documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno
15 del mismo se une dentro de un epítopo que comprende el residuo de aminoácido 48 a 72; 48 a 69; 48 a 65; 52 a 72; 52 a 65; o 56 a 65. En aspectos específicos descritos en este documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede unir dentro de 2 o más epítopos.
También se describen en la presente memoria anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a GDF8 maduro natural (SEQ ID NO: 340) pero no se unen a péptidos aislados que tienen menos que la secuencia de aminoácidos completa de la SEQ ID NO: 340. Por ejemplo, se describen en la presente memoria los anticuerpos anti-GDF8 que se unen a GDF8 maduro natural (SEQ ID NO: 340) pero que no se unen a péptidos aislados que consisten en 10 a 40 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 340. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la invención pueden no unirse a ningún epítopo lineal dentro de GDF8 maduro natural. Los anticuerpos o
25 fragmentos que contienen antígeno de la presente invención pueden no unir uno o más péptidos GDF8 aislados que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 1-14, 1-18, 17-42, 48-65, 48-69, 48-72, 52-65, 52-72, 56-65, 56-72, 65-72, 73-90, 75-105 y 91-105, de la SEQ ID NO: 340. En ciertos aspectos descritos en este documento, los anticuerpos anti-GDF8 no se unen a ninguno de los péptidos GDF8 mencionados anteriormente. Los expertos en la materia conocen métodos para determinar si un anticuerpo dado es capaz de unirse a un péptido GDF8 particular. Un ejemplo de un método se ilustra en el Ejemplo 7 de este documento, en el que los péptidos GDF8 están unidos a microesferas, se añaden anticuerpos a las microesferas conjugadas con péptido y, después de las etapas de lavado, se detectan microesferas unidas a anticuerpo. La ausencia de anticuerpos unidos indica que los anticuerpos no se unen a los péptidos particulares que se prueban.
35 Se describen adicionalmente en la presente memoria anticuerpos humanos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a GDF8 humano maduro natural (por ejemplo, una proteína o polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 340), pero no se unen a un constructo GDF8 quimérico en el que ciertos aminoácidos de GDF8 se reemplazan con las correspondientes secuencias de aminoácidos de una proteína relacionada pero no idéntica tal como TGFβ-1. En la presente invención, el constructo quimérico es una quimera GDF8/TGFp-1 en la que los aminoácidos 48-72 de GDF8 maduro se reemplazan con la secuencia de aminoácidos correspondiente de TGFβ-1 (por ejemplo, aminoácidos 49-76 de TGFβ-1). La quimera está representada por la SEQ ID NO: 352 (véanse los Ejemplos 4 y 6 en este documento). Por lo tanto, en ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención se unen específicamente a GDF8 humano maduro natural (SEQ ID NO: 340) pero no se unen al constructo quimérico GDF8/TGFβ-1 de la SEQ ID NO: 352, lo que indica que el epítopo al que se unen tales anticuerpos incluye o abarca aminoácidos localizados
45 dentro de los residuos 48 a 72 de la SEQ ID NO: 340. Los bioensayos de bloqueo, tales como el ensayo expuesto en el Ejemplo 4 de este documento, también pueden usarse para determinar indirectamente si un anticuerpo se une a GDF8 humano maduro natural (SEQ ID NO: 340) y no se une al constructo quimérico GDF8/TGFβ-1, por ejemplo, la construcción de la SEQ ID NO: 352. Por ejemplo, un anticuerpo que bloquea la bioactividad del GDF8 humano maduro natural pero no bloquea la bioactividad de un GDF8/TGFβ-1 quimérico se considera que se une a la porción de GDF8 que se reemplaza por la secuencia de TGFβ-1 correspondiente en el constructo quimérico.
De manera similar, también se describen aquí anticuerpos humanos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que bloquean la actividad mediada por GDF8 maduro natural en un bioensayo, pero no bloquean la actividad de un constructo GDF8 quimérico (una quimera GDF8/TGFβ-1 en la que los aminoácidos 48-72 de GDF8 maduro se
55 reemplazan con la secuencia de aminoácidos correspondiente de TGFβ-1 (SEQ ID NO: 352)). Un ejemplo de un bioensayo de GDF8 que se puede usar en el contexto de este aspecto es el ensayo de luciferasa inducible por GDF8 expuesto en el Ejemplo 4, en el presente documento, aunque también se contemplan aquí otros bioensayos similares capaces de medir la actividad celular de GDF8.
Se describen en la presente memoria anticuerpos anti-GDF8 que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos específicos que sirven de ejemplo descritos en este documento. También se describen en la presente memoria los anticuerpos anti-GDF8 que compiten de forma cruzada por la unión a GDF8 o un fragmento de GDF8 con cualquiera de los anticuerpos específicos que sirven de ejemplo descritos en este documento.
65 Se puede determinar fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite para unirse con, un anticuerpo anti-GDF8 de referencia usando métodos rutinarios conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un
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anticuerpo de prueba se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-GDF8 de referencia descrito en la presente memoria, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína o péptido de GDF8 en condiciones de saturación. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de prueba para unirse a la molécula de GDF8. Si el anticuerpo de prueba es capaz de unirse a GDF8 después de la unión de saturación con el anticuerpo de referencia 5 anti-GDF8, se puede concluir que el anticuerpo de prueba se une a un epítopo diferente que el anticuerpo de referencia anti-GDF8. Por otro lado, si el anticuerpo de prueba no puede unirse a la molécula de GDF8 después de la unión de saturación con el anticuerpo anti-GDF8 de referencia, entonces el anticuerpo de prueba se puede unir al mismo epítopo que el epítopo unido por el anticuerpo de referencia anti-GDF8 descrito en la presente memoria. Se puede llevar a cabo una experimentación rutinaria adicional (por ejemplo, mutación peptídica y análisis de unión) para confirmar si la falta observada de unión del anticuerpo de prueba se debe en realidad a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la falta de unión observada. Los experimentos de este tipo se pueden realizar usando ELISA, RIA, Biacore, citometría de flujo o cualquier otro ensayo de unión a anticuerpo cuantitativo o cualitativo disponible en la técnica. De acuerdo con ciertos aspectos descritos en este documento, dos anticuerpos se unen al mismo epítopo (o solapamiento) si, por ejemplo, un exceso de 1, 5, 10, 20 o 100
15 veces de un anticuerpo inhibe la unión del otro mediante al menos 50%, pero preferiblemente 75%, 90% o incluso 99% medido en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990; 50: 1495-1502). Alternativamente, se considera que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Se considera que dos anticuerpos tienen "epítopos solapantes" si solo un subconjunto de las mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.
Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo anti-GDF8 de referencia, la metodología de unión descrita anteriormente se realiza en dos orientaciones: en una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una molécula de GDF8 en condiciones de saturación seguido por la evaluación de la unión del
25 anticuerpo de prueba a la molécula de GDF8. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de prueba se una a una molécula de GDF8 en condiciones de saturación seguido por la evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la molécula de GDF8. Si, en ambas orientaciones, solo el primer anticuerpo (de saturación) es capaz de unirse a la molécula de GDF8, entonces se concluye que el anticuerpo de prueba y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a GDF8. Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede no unirse necesariamente al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, pero puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia uniendo un epítopo de superposición o adyacente.
Selectividad de especies y reactividad cruzada de especies
35 De acuerdo con ciertas realizaciones descritas en este documento, los anticuerpos anti-GDF8 se unen a GDF8 humano, pero no a GDF8 de otras especies. Alternativamente, los anticuerpos anti-GDF8 se unen a GDF8 humano y a GDF8 de una o más especies no humanas. Por ejemplo, los anticuerpos anti-GDF8 descritos en este documento pueden unirse a GDF8 humano y pueden unirse o no según sea el caso, a uno o más GDF8 de, ratón, rata, conejillo de indias, hámster, jerbo, cerdo, gato, perro, conejo, cabra, oveja, vaca, caballo, camello, mono cynomologous, tití, mono Rhesus o chimpancé.
Inmunoconjugados
También se describe en la presente memoria un anticuerpo monoclonal anti-GDF8 humano o humanizado conjugado
45 con una fracción terapéutica ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunosupresor o un radioisótopo. Los agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. En la técnica se conocen ejemplos de agentes citotóxicos adecuados y agentes quimioterapéuticos para formar inmunoconjugados, véase, por ejemplo, el documento WO 05/103081.
Anticuerpos multiespecíficos
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido objetivo o pueden contener dominios de unión a antígeno específico para más de un polipéptido objetivo. Véase, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol.
55 147: 60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22: 238-244. Los anticuerpos anti-GDF8 de la presente invención se pueden unirse o coexpresarse con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo se puede unir funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro tipo) a una o más entidades moleculares, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos biespecíficos en la que un brazo de una inmunoglobulina es específico para GDF8 humano o un fragmento del mismo, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para un segundo objetivo terapéutico o está conjugado con una fracción terapéutica.
Un ejemplo de un formato de anticuerpo biespecífico que puede usarse en el contexto de la presente invención implica
65 el uso de un primer dominio CH3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio CH3 de Ig, en los que el primero y segundo dominios CH3 de Ig difieren de entre sí en al menos un aminoácido, y en el que al menos una diferencia de
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aminoácidos reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la Proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácidos. En una realización, el primer dominio CH3 de Ig se une a la Proteína A y el segundo dominio CH3 de Ig contiene una mutación que reduce o elimina la unión a Proteína A tal como una modificación H95R (mediante numeración del exón IMGT; H435R por numeración EU). El segundo CH3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Otras modificaciones que pueden encontrarse dentro del segundo CH3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V821 (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V4221 por EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V821 (IMGT; N384S, K392N y V4221 por EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V821 (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V4221 por parte de la UE) en el caso de anticuerpos IgG4. Las variaciones en el formato de anticuerpos biespecíficos descritos anteriormente se contemplan dentro del alcance de la presente invención.
Administración terapéutica y formulaciones
La invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención. La administración de composiciones terapéuticas de acuerdo con la invención se administrará con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan en formulaciones para proporcionar una transferencia, suministro, tolerancia y similares mejorados. Se puede encontrar una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTINMR), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidra, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invención, con la condición de que el ingrediente activo en la formulación no se inactive por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también Powell et al., "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52: 238-311.
La dosis puede variar dependiendo de la edad y el tamaño del sujeto al que se va a administrar, la enfermedad objetivo, condiciones, vía de administración y similares. Cuando el anticuerpo de la presente invención se usa para tratar diversas afecciones y enfermedades asociadas con GDF8, por ejemplo, distrofia muscular, atrofia muscular, síndrome de pérdida muscular, sarcopenia y caquexia, en un paciente adulto, es ventajoso administrar por vía intravenosa el anticuerpo de la presente invención normalmente con una sola dosis de aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la severidad de la condición, se puede ajustar la frecuencia y la duración del tratamiento. En otra administración parenteral y administración oral, el anticuerpo puede administrarse en una dosis correspondiente a la dosis proporcionada anteriormente. Cuando la condición es especialmente severa, la dosis puede aumentarse de acuerdo con la condición hasta la cantidad que cause efectos secundarios significativos, si corresponde.
Se conocen varios sistemas de administración y se pueden usar para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al., (1987) J. Biol. Chem. 262: 4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero no están limitados a, rutas intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición se puede administrar mediante cualquier ruta conveniente, por ejemplo, mediante infusión o inyección en bolo, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se puede administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
La composición farmacéutica puede administrarse también en una vesícula, en particular un liposoma (véase, Langer (1990) Science 249: 1527-1533).
Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía subcutánea o intravenosa con una aguja y una jeringa estándar. Además, con respecto a la administración subcutánea, un dispositivo de administración con depósito tiene fácilmente aplicaciones para administrar una composición farmacéutica de la presente invención. Tal dispositivo de administración con depósito puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo de administración con depósito reutilizable generalmente utiliza un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que toda la composición farmacéutica dentro del cartucho ha sido administrada y el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y reemplazarse por un nuevo cartucho que contenga la composición farmacéutica. El dispositivo de administración con depósito se puede reutilizar. En un dispositivo de administración con depósito desechable, no hay un cartucho reemplazable. Por el contrario, el dispositivo de administración con depósito desechable viene prellenado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, se descarta todo el dispositivo.
Numerosos dispositivos de administración autoinyectores y con depósito reutilizables tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a AUTOPENMR (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), depósito DISETRONICMR (Disetronic Medical

Claims (10)

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    REIVINDICACIONES
    1.
    Un anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a, o bloquea la actividad biológica de GDF8 humano maduro natural que comprende la SEQ ID NO: 340, pero no se une a, o bloquea la actividad biológica de un constructo GDFB/TGFβ1 quimérico que tiene los aminoácidos 48-72 de GDF8 humano maduro reemplazados con la secuencia de aminoácidos correspondiente de TGFβ1, en donde el constructo GDF8/TGF1 quimérico comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 352, y en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: (a) secuencias de aminoácidos de HCDR1/HCDR2/HCDR3 que consisten en las SEQ ID NOs: 362/364/366, respectivamente y (b) secuencias de aminoácidos de LCDR1/LCDR2/LCDR3 que consisten en las SEQ ID NOs: 370/372/374, respectivamente.
  2. 2.
    El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: (a) CDR de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) de una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 360 y (b) CDR de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) a partir de una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 368.
  3. 3.
    El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno no se une a
    (a)
    un epítopo lineal dentro de GDF8 maduro natural (SEQ ID NO: 340); y/o
    (b)
    péptidos GDF8 aislados que tienen secuencias de aminoácidos de los aminoácidos 1-14, 1-18, 17-42, 48-65, 48-69, 48-72, 52-65, 52-72, 56-65, 56-72, 65-72, 73-90, 75-105 y 91-105, de la SEQ ID NO: 340.
  4. 4.
    Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
  5. 5.
    El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la composición farmacéutica de la reivindicación 4, para uso en medicina.
  6. 6.
    El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la composición farmacéutica de la reivindicación 4, para uso en el tratamiento de un paciente afectado con, diagnosticado con o en riesgo de ser afectado con una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en sarcopenia, caquexia y atrofia muscular debida a desuso o inmovilización.
  7. 7.
    Uso del anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la composición farmacéutica de la reivindicación 4, en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de un paciente afectado con, diagnosticado con o en riesgo de estar afectado con una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en sarcopenia, caquexia, pérdida muscular, atrofia muscular, cáncer, artritis, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, osteoporosis, osteoartritis, osteopenia, fracturas óseas incluyendo fracturas de cadera, síndromes metabólicos, homeostasis de la glucosa y sensibilidad a la insulina.
  8. 8.
    El uso de la reivindicación 7, en donde la caquexia es idiopática o secundaria a otras condiciones.
  9. 9.
    El uso de la reivindicación 7, en donde la pérdida o atrofia muscular es causada por o está asociada con el desuso, inmovilización, reposo en cama, lesión, tratamiento médico o intervención quirúrgica.
  10. 10.
    El uso de la reivindicación 7, en donde el síndrome metabólico se selecciona del grupo que consiste en diabetes, obesidad, trastornos nutricionales, atrofia de órganos, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y anorexia.
    137
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