ES2898620T3 - Anticuerpos humanos contra GREM 1 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a gremlin-1 (GREM1) humana y bloquea la inhibición de la señalización de proteínas morfogenéticas óseas (BMP) mediada por GREM1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende seis regiones determinantes de la complementariedad HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, que comprenden, respectivamente, las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4-6-8-12-14-16; 36-38-40- 44-46-48; 68-70-72-76-78-80; 84-86-88-92-94-96; 116-118-120-124-126-128; 132-134-136-140-142-144; 148-150- 152-156-158-160; 164-166-168-172-174-176; 180-182-184-188-190-192; 196-198-200-204-206-208; 212-214-216- 220-222-224; 244-246-248-252-254-256; 260-262-264-268-270-272; 276-278-280-284-286-288; 292-294-296-300- 302-304; 308-310-312-316-318-320; 324-326-328-332-334-336; 340-342-344-348-350-352; 356-358-360-364-366- 368; 372-374-376-380-382-384; 388-390-392-396-398-400; 404-406-408-412-414-416; 420-422-424-428-430-432; 436-438-440-444-446-448; 452-454-456-460-462-464; 468-470-472-476-478-480; 484-486-488-492-494-496; 500- 502-504-508-510-512; 516-518-520-524-526-528; 532-534-536-540-542-544; 548-550-552-556-558-560; y 580-582- 584-588-590-592.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos humanos contra GREM 1

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos humanos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos humanos que se unen específicamente a gremlin-1 humana (GREM1) y su uso en métodos terapéuticos y de diagnóstico.

Exposición de la técnica relacionada

La fibrosis es un proceso de cicatrización que es una característica común de lesión orgánica crónica. Se caracteriza por una actividad elevada del factor de crecimiento transformante-beta (TGF-p) que da como resultado una deposición aumentada y alterada de la matriz extracelular y otras proteínas asociadas a fibrosis.

Las proteínas morfogenéticas óseas (BMP, por sus siglas en inglés) son moléculas de señalización conservadas filogenéticamente que pertenecen a la superfamilia de TGF-p y están implicadas en el crecimiento, desarrollo y diferenciación de diversos tipos celulares (Yanagita, M., 2009, Biofactors DOI: 10:1002/biof.15). Las respuestas biológicas a las BMP están reguladas negativamente por antagonistas de BMP que pueden asociarse directamente con las BMP e inhibir su unión al receptor. Gremlin-1 humana (GREM1), un miembro de la superfamilia de nudos de cisteína, es un antagonista de la señalización de BMP (Hsu, D.R., et al 1998, Mol. Cell 1: 673-683). Se une a BMP2, BMP4 y BMP7. GREM1 bloquea la señalización de BMP, que se cree que es antifibrótico en muchos tejidos al bloquear la unión de BMP a su receptor.

La expresión de GREM1 en riñón, hígado y pulmón de adulto normal es muy baja. Sin embargo, la expresión de GREM1 aumenta tanto en modelos de fibrosis de ratón como en enfermedades fibróticas humanas tal como la nefropatía diabética y la fibrosis pulmonar (Koli et al., 2006, Am. J. Pathol. 169: 61-71; Farkas, et al., 2011, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 44: 870-878; Lappin, et al., 2002, Nephrol. Dial. Transplant. 17: 65-67). El aumento de la expresión de GREM1 da lugar a una reducción de la señalización de BMP antifibrótica. El aumento de la expresión de GREM1 también se correlaciona con el aumento de los niveles de creatinina sérica y las puntuaciones de fibrosis tubulointersticial en estas enfermedades (Dolan, V., et al 2005, Am. J. Kidney Dis. 45: 1034-9). En varios modelos de fibrosis, tal como fibrosis pulmonar y renal, la expresión de GREM1 aumenta en gran medida mientras que la señalización de BMP disminuye (Myllarniemi, et al., 2008, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177: 321-329). La administración de BMP7 puede disminuir la fibrosis en algunos modelos de enfermedad renal, pero no protege contra la fibrosis pulmonar o cutánea inducidas por bleomicina (Weiskirchen, et al., 2009, 14: 4992-5012).

Los ratones heterocigotos para GREM1 muestran cierta protección contra la fibrosis en un modelo experimental de nefropatía diabética (Zhang, et al., 2009, BBRC 383: 1-3). Estos ratones no muestran diferencias en el inicio, la gravedad y la progresión de la diabetes medida por la pérdida de peso y la hiperglucemia. Sí lo hacen, sin embargo, presentan cambios estructurales fibróticos atenuados en el riñón y cambios reducidos en la función renal.

Por tanto, GREM1 puede servir como una posible diana terapéutica para el tratamiento de enfermedades fibróticas. Existe la necesidad de crear inhibidores de GREM1 específicos en el tratamiento de fibrosis que no tengan ningún efecto secundario.

Además, GREM1 es un agonista del principal receptor proangiogénico del receptor-2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR-2) y puede desempeñar un papel oncogénico especialmente en los carcinomas del cuello uterino, pulmón, ovario, riñón, mama, colon, páncreas y sarcoma (Namkoong et al 2006, BMC Cancer 6: 74 doi:10.1186/1471-2407-6-74; Mitola et al 2010; Blood 116: 3677-3680). Se ha demostrado que heparán sulfato (HS) y heparina, glucosaminoglucanos (GAG) conocidos por sus efectos anticoagulantes, se unen a GREM1. GREM1 se une a la heparina y activa VEGFR-2 de una manera independiente de BMP (Chiodelli et al 2011; Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31: e116-e127).

Los anticuerpos policlonales y monoclonales anti-GREM1 están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Sigma-Aldrich, Abnova Corporation, Novus Biologicals, Genway). El documento US 6432410 divulga las secuencias de nucleótidos y proteínas de GREM1 humano, de ratón, de xenopus y de pollo y mutantes por eliminación de los mismos. El documento US20090203041 divulga secuencias peptídicas de GREM1 para su uso como inhibidores de BMP4. Kim et al divulgan anticuerpos contra GREM1 que inhiben GREM1 de una manera independiente de BMP o VEGFR-2 en PLoS One 7(4): e35100. doi:10.1371/journal.pone.0035100 y en el documento WO2013137686. El documento US 7744873 divulga métodos para tratar glaucoma mediante la administración de un antagonista de GREM1, en donde el antagonista es un anticuerpo que se une a GREM1. Se han descrito métodos de tratamiento y formulaciones para glaucoma o cáncer que utilizan antagonistas de GREM1, incluidos anticuerpos, en los documentos EP1440159B1, EP1777519A1, EP2053135A1 y US 20090041757.

Kim et al divulgan anticuerpos contra GREM1 que inhiben GREM1 de una manera independiente de BMP o VEGFR-2 (PLoS One 7(4): e35100. doi:10.1371/journal.pone.0035100).

Mulvihill et al divulgan que Gremlin se sobreexpresa en el adenocarcinoma de pulmón y aumenta el crecimiento y la proliferación celular en las células pulmonares normales (PloS one 7.8 (2012): e42264).

Koli et al divulga que Gremlin se sobreexpresa en la fibrosis pulmonar idiopática (The American journal of patology 169.1 (2006): 61-71).

El documento US 20090041757 divulga el uso de proteínas que se expresan diferencialmente en células del estroma asociadas a tumores como dianas biomoleculares para terapias de tratamiento de tumores.

Wang et al divulga que Gremlin se sobreexpresa en el mesotelioma maligno humano (Oncology reports 27.1 (2011): 58-64).

Mitola et al divulga un papel de Gremlin en la angiogénesis (Blood 116.18 (2010): 3677-3680). Chiodelli et al divulga un papel de Gremlin en la angiogénesis mediada por heparina (Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 31.12 (2011): e116-e127).

Lonberg et al describe el uso de plataformas de presentación en fagos y ratones transgénicos para producir anticuerpos completamente humanos (Current opinion in immunology 20.4 (2008): 450-459).

El documento e P 2826790 divulga anticuerpos anti Gremlin-1.

Sha G et al describe la expresión de Gremlin-1 en pacientes con endometriosis (Fertility and sterility 91.2 (2009): 350-358).

Breve sumario de la invención

La invención se define por las reivindicaciones y cualquier otro aspecto o realización expuesto en el presente documento que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones es para información únicamente. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico)". La invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a gremlin-1 humana (GREM1) y bloquea la inhibición de la señalización de proteínas morfogenéticas óseas (BMP) mediada por GREM1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende seis regiones determinantes de la complementariedad HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, que comprenden, respectivamente, las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4-6-8-12-14-16; 36-38-40-44-46-48; 68-70-72-76-78-80; 84-86-88-92-94­ 96; 116-118-120-124-126-128; 132-134-136-140-142-144; 148-150-152-156-158-160; 164-166-168-172-174-176; 180-182-184-188-190-192; 196-198-200-204-206-208; 212-214-216-220-222-224; 244-246-248-252-254-256; 260­ 262-264-268-270-272; 276-278-280-284-286-288; 292-294-296-300-302-304; 308-310-312-316-318-320; 324-326­ 328-332-334-336; 340-342-344-348-350-352; 356-358-360-364-366-368; 372-374-376-380-382-384; 388-390-392­ 396-398-400; 404-406-408-412-414-416; 420-422-424-428-430-432; 436-438-440-444-446-448; 452-454-456-460­ 462-464; 468-470-472-476-478-480; 484-486-488-492-494-496; 500-502-504-508-510-512; 516-518-520-524-526­ 528; 532-534-536-540-542-544; 548-550-552-556-558-560; y 580-582-584-588-590-592.

La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humano aislado o el fragmento de unión a antígeno de la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La invención además proporciona el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, que bloquea la unión de g Re M1 a BMP4, para su uso en un método para el tratamiento de la fibrosis pulmonar idiopática, comprendiendo dicho método administrar una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno a un paciente que lo necesita.

La divulgación proporciona anticuerpos monoclonales (mAb) completamente humanos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a GREM1 humana. Dichos anticuerpos pueden ser útiles para neutralizar la actividad de GREM1 o para bloquear la unión de GREM1 a una proteína morfogenética ósea (BMP) tal como BMP2, BMP4 o BMP7. En otros determinados aspectos, los anticuerpos pueden ser útiles para neutralizar la actividad o bloquear la unión a heparina o heparán sulfato. Los anticuerpos pueden actuar para detener la progresión o disminuir la gravedad de una afección o enfermedad asociada a fibrosis, o reducir el número, la duración o la gravedad de la recurrencia de la enfermedad, o mejorar al menos un síntoma asociado con fibrosis o cáncer. Dichos anticuerpos pueden usarse solos o junto con un segundo agente útil para tratar fibrosis o cáncer. En determinados aspectos, los anticuerpos específicos para GREM1, se pueden administrar terapéuticamente junto con un segundo agente para disminuir la gravedad de la afección asociada a fibrosis o del cáncer o para reducir el número, la duración o la gravedad de la recurrencia de la enfermedad, o mejorar al menos un síntoma asociado con la afección asociada con fibrosis o cáncer. En determinados aspectos, los anticuerpos pueden usarse profilácticamente como terapia independiente para proteger a los pacientes que están en riesgo de padecer una afección o enfermedad asociada a fibrosis. Por ejemplo, determinadas poblaciones de pacientes pueden estar en riesgo de padecer una afección o enfermedad de fibrosis, incluyendo pacientes de edad avanzada, o pacientes con antecedentes familiares, o pacientes con problemas de abuso de alcohol o drogas, o pacientes que tienen afecciones médicas subyacentes crónicas y/o concomitantes tales como diabetes, trastornos metabólicos, lesión hepática, lesión renal o lesión pulmonar que pueden predisponerlos a la fibrosis. Otras poblaciones de pacientes en riesgo incluyen personas expuestas a sustancias químicas tales como asbesto u otros contaminantes o fumadores. Cualquiera de estas poblaciones de pacientes puede beneficiarse del tratamiento con los anticuerpos de la presente divulgación, cuando se administra solo o junto con un segundo agente.

Los anticuerpos de la presente divulgación pueden usarse para tratar fibrosis en pulmones, hígado, riñón, piel, corazón, intestino o músculo de un paciente. En otros aspectos, los anticuerpos de la divulgación se pueden usar para tratar cáncer, tal como el carcinoma de cuello uterino, pulmón, ovario, riñón, mama, colon o páncreas. Los anticuerpos pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden comprender únicamente una porción de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv), y pueden modificarse para afectar a la funcionalidad, por ejemplo, para eliminar las funciones efectoras residuales (Reddy et al., (2000), J. Immunol.

164:1925-1933).

En consecuencia, en un primer aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal totalmente humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a GREM1 humana.

En un aspecto, el anticuerpo monoclonal humano se une a GREM1 de SEQ ID NO: 594 o SEQ ID NO: 595.

En un aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo bloquea la unión de GREM1 a BMP2, BMP4, BMP7 o heparina.

En un aspecto, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a GREM1 con una K^d igual o menor que 10-7 M medida por resonancia de plasmón superficial.

En un aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo muestra una o más propiedades seleccionadas del grupo que consiste en: (a) se une a GREM1 a 37 °C con una constante de disociación de unión en equilibrio (K^d) de menos de aproximadamente 275 nM medida por resonancia de plasmón superficial; (b) se une a GREM1 a 37 °C con una semivida disociativa (t1^ ) superior a aproximadamente 3 minutos, medida por resonancia de plasmón superficial; (c)se une GREM1 a 25 °C con una K^d de menos de aproximadamente 280 nM medida por resonancia de plasmón superficial; (d) se une a GREM1 a 25 °C con una t1^ superior a aproximadamente 2 minutos medida por resonancia de plasmón superficial; (e) bloquea la unión de GREM1 a BMP4 con una CI50 de menos de aproximadamente 1,9 nM medida en un ensayo ELISA de competición a 25 °C; (f) bloquea la inhibición de la señalización de BMP mediada por GREM1 y promueve la diferenciación celular; y (g) bloquea la unión de GREM1 a heparina.

En un aspecto, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a GREM1 comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (CDR) (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) que se encuentran en una cualquiera de las secuencias de región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 402, 418, 434, 450, 466, 482, 498, 514, 530, 546, 562 y 578; y las tres CDR de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) que se encuentran en una cualquiera de las secuencias de región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 394, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, y 586. Los métodos y técnicas para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR se conocen bien en la técnica y pueden usarse para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de la región o regiones variables de cadena pesada (HCVR) y/o región o regiones variables de cadena ligera (LCVR) específicas divulgadas en el presente documento. Las convenciones ilustrativas que pueden utilizarse para identificar los límites de las CDR incluyen, por ejemplo, la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales y la definición de AbM es un término medio entre los enfoques de Kabat y Chothia. Véanse, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., (1997), J. Mol. Biol.

273:927-948; y Martin et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272. También hay disponibles bases de datos públicas para identificar secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.

En un aspecto, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a GREM1 comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 402, 418, 434, 450, 466, 482, 498, 514, 530, 546, 562, y 578.

En un aspecto, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a GREM1 comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 394, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570 y 586.

En un aspecto, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a GREM1 comprende (a) una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 402, 418, 434, 450, 466, 482, 498, 514, 530, 546, 562 y 578; y (b) una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ iD NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 394, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570 y 586.

En un aspecto, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a GREM1 comprende

(a) un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372, 388, 404, 420, 436, 452, 468, 484, 500, 516, 532, 548, 564 y 580;

(b) un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 374, 390, 406, 422, 438, 454, 470, 486, 502, 518, 534, 550, 566 y 582;

(c) un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 392, 408, 424, 440, 456, 472, 488, 504, 520, 536, 552, 568 y 584;

(d) un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508, 524, 540, 556, 572 y 588;

(e) un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 398, 414, 430, 446, 462, 478, 494, 510, 526, 542, 558, 574 y 590; y

(f) un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512, 528, 544, 560, 576 y 592.

En un aspecto, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a GREM1 comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 370/378, 386/394, 402/410, 418/426, 434/442, 450/458, 466/474, 482/490, 498/506, 514/52, 530/538, 546/554, 562/570 y 578/586.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal totalmente humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a GREM1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo presenta una o más de las siguientes características: (iv) comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 402, 418, 434, 450, 466, 482, 498, 514, 530, 546, 562, y 578, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (ii) comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 394, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, y 586, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iii) comprende un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las Se Q ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 392, 408, 424, 440, 456, 472, 488, 504, 520, 536, 552, 568 y 584, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512, 528, 544, 560, 576 y 592, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iv) comprende una dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372, 388, 404, 420, 436, 452, 468, 484, 500, 516, 532, 548, 564, y 580, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 374, 390, 406, 422, 438, 454, 470, 486, 502, 518, 534, 550, 566 y 582, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508, 524, 540, 556, 572 y 588, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID n O: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 398, 414, 430, 446, 462, 478, 494, 510, 526, 542, 558, 574 y 590, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (v) se une a GREM1 con una K^d igual a o inferior a 10-7 M medida por resonancia de plasmón superficial.

En un segundo aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite por la unión específica a GREM1 humana con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde cada HCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 402, 418, 434, 450, 466, 482, 498, 514, 530, 546, 562 y 578; y las CDR de una región variable de cadena ligera (LCVR), en donde cada LCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 394, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, y 586.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo en GREM1 humana que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende las CDR de una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde cada HCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 402, 418, 434, 450, 466, 482, 498, 514, 530, 546, 562 y 578; y las CDR de una región variable de cadena ligera (LCVR), en donde cada LCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 394, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, y 586.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que bloquea la unión de GREM1 humana a una cualquiera de BMP2, BMP4, BMP7 o heparina, comprendiendo el anticuerpo las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde cada HCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 402, 418, 434, 450, 466, 482, 498, 514, 530, 546, 562 y 578; y las CDR de una región variable de cadena ligera (LCVR), en donde cada LCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 394, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, y 586.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal totalmente humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a GREM1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo presenta una o más de las siguientes características: (iv) comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 402, 418, 434, 450, 466, 482, 498, 514, 530, 546, 562, y 578, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (ii) comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 394, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, y 586, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iii) comprende un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las Se Q ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 392, 408, 424, 440, 456, 472, 488, 504, 520, 536, 552, 568 y 584, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512, 528, 544, 560, 576 y 592, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iv) comprende una dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372, 388, 404, 420, 436, 452, 468, 484, 500, 516, 532, 548, 564, y 580, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 374, 390, 406, 422, 438, 454, 470, 486, 502, 518, 534, 550, 566 y 582, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508, 524, 540, 556, 572 y 588, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID n O: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 398, 414, 430, 446, 462, 478, 494, 510, 526, 542, 558, 574 y 590, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (v) se une a GREM1 con una K^d igual a o inferior a 10-7 M medida por resonancia de plasmón superficial; (vi) bloquea la unión de GREM1 a una de BMP2, BMP4 o BMP7; (vii) bloquea la inhibición de la señalización de BMP por GREM1 y promueve la diferenciación celular; y (viii) bloquea la unión de GREM1 a la heparina.

En un tercer aspecto, la divulgación proporciona moléculas de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti-GREM1 o fragmentos de los mismos. La divulgación también abarca vectores de expresión recombinantes que portan los ácidos nucleicos de la divulgación, y células hospedadoras en donde se han introducido dichos vectores, así como métodos de producción de los anticuerpos mediante el cultivo de las células hospedadoras en condiciones que permiten la producción de los anticuerpos y la recuperación de los anticuerpos producidos.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una HCVR codificada por una secuencia de un ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241,257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369, 385, 401,417, 433, 449, 465, 481, 497, 513, 529, 545, 561 y 577, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología con la misma.

En un aspecto, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende adicionalmente una LCVR codificada por una secuencia de un ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 377, 393, 409, 425, 441, 457, 473, 489, 505, 521, 537, 553, 569 y 585, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología con la misma.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende un dominio HCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359, 375, 391,407, 423, 439, 455, 471,487, 503, 519, 535, 551, 567 y 583, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383, 399, 415, 431,447, 463, 479, 495, 511, 527, 543, 559, 575 y 591, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio HCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371, 387, 403, 419, 435, 451, 467, 483, 499, 515, 531, 547, 563 y 579, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio HCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357, 373, 389, 405, 421, 437, 453, 469, 485, 501, 517, 533, 549, 565 y 581, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio LCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 395, 411, 427, 443, 459, 475, 491, 507, 523, 539, 555, 571 y 587, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381, 397, 413, 429, 445, 461, 477, 493, 509, 525, 541, 557, 573 y 589, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.

En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo contra GREM1 humana, como se describe en el presente documento, se puede unir a un marcador detectable, tal como un marcador de radionúclido o un marcador detectable por MRI.

En un cuarto aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal totalmente humano aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a GREM1 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal totalmente humano aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la forma secretada de GREM1 humana y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal totalmente humano aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la forma asociada a la membrana de GREM1 (proteína GREM1 madura) y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo monoclonal completamente humano que se une a GREM1 que tiene una cualquiera o más de las características descritas en el presente documento. El anticuerpo que se une a GREM1 se une con una K^d igual a o menor que 10-7M.

En un aspecto, la composición comprende un anticuerpo que se une a GREM1 humana y que tiene un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las s Eq ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 370/378, 386/394, 402/410, 418/426, 434/442, 450/458, 466/474, 482/490, 498/506, 514/522, 530/538, 546/554, 562/570 y 578/586.

En un aspecto, la divulgación presenta una composición, que es una combinación de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la divulgación y un segundo agente terapéutico.

El segundo agente terapéutico puede ser un fármaco de molécula pequeña, una proteína/polipéptido, un anticuerpo, una molécula de ácido nucleico, tal como un oligonucleótido antisentido o un ARNip. El segundo agente terapéutico puede ser de origen sintético o natural.

El segundo agente terapéutico puede ser cualquier agente que se combine de forma ventajosa con el anticuerpo o fragmento del mismo de la divulgación, por ejemplo, un fármaco antifibrótico tal como la pirfenidona, un antibiótico, un fármaco antiinflamatorio, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un corticosteroide tal como prednisona, un antagonista del receptor de endotelina tal como bosentán, macitentán o ambrisentán, un suplemento nutricional, un agente antihipertensivo, un antioxidante, un antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [por ejemplo, una "trampa de VEGF" tal como aflibercept u otra proteína de fusión inhibidora de VEGF como se establece en el documento US 7.087.411 o un anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, bevacizumab o ranibizumab)], otro anticuerpo que se una a GREM1 o un anticuerpo contra una quimiocina al como TGF-p, o contra una citocina tal como IL-1, anti-LOXL2, anti-avb6integrin, un fármaco dirigido a galectina-3, imatinib o cualquier otro antagonista de PDGFR y fármacos anti-AOC3.

En determinados aspectos, el segundo agente terapéutico puede ser un agente que ayude a contrarrestar o reducir cualquier posible efecto o efectos secundarios asociados con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la divulgación, si ocurriera dicho efecto o efectos secundarios.

También se apreciará que los anticuerpos y las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente divulgación pueden emplearse en terapias de combinación, es decir, los anticuerpos y las composiciones farmacéuticamente aceptables se pueden administrar simultáneamente con, antes que o después de, uno o más de diferentes agentes terapéuticos o procedimientos médicos deseados. La combinación particular de terapias (agentes terapéuticos o procedimientos) para emplear en un régimen de combinación tendrá en cuenta la compatibilidad de los agentes terapéuticos y/o procedimientos deseados y el efecto terapéutico deseado que se debe lograr. Se apreciará también que las terapias empleadas pueden lograr un efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, un anticuerpo puede administrarse simultáneamente con otro agente utilizado para tratar el mismo trastorno) o pueden lograr efectos diferentes (por ejemplo, control de cualquier efecto adverso). Como se usa en el presente documento, los agentes terapéuticos adicionales que se administran normalmente para tratar o prevenir una enfermedad, o afección, en particular, son adecuados para la enfermedad, o afección, que se van a tratar. Cuando se administran de forma simultánea múltiples agentes terapéuticos, las dosis se pueden ajustar en consecuencia, como se reconoce en el campo pertinente.

Un quinto aspecto de la divulgación implica un método para tratar una enfermedad o trastorno asociado con un aumento de la expresión de GREM1, tal como fibrosis o cáncer. En determinados aspectos, la divulgación proporciona un método para tratar a un paciente que padece cáncer, o para tratar al menos un síntoma o complicación asociados con el cáncer, o detener la progresión del cáncer, comprendiendo el método administrar al paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a GREM1 humana; o una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a GREM1, de manera que la afección o enfermedad asociada con cáncer se prevenga o disminuya en gravedad y/o duración, o se prevenga o mejore al menos un síntoma o complicación asociados con la afección o enfermedad o que la frecuencia y/o duración de, o la gravedad del cáncer se reduzca.

En determinados aspectos, la divulgación proporciona un método para tratar a un paciente que padece fibrosis, o para tratar al menos un síntoma o complicación asociados con fibrosis, o detener la progresión de fibrosis, o para tratar a un paciente con riesgo de padecer fibrosis, comprendiendo el método administrar al paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a GREM1; o una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a GREM1, de manera que la afección o enfermedad asociada con fibrosis se prevenga o disminuya en gravedad y/o duración, o se prevenga o mejore al menos un síntoma o complicación asociados con la afección o enfermedad, o que la frecuencia y/o duración de, o la gravedad de la fibrosis se reduzca. En un aspecto, el anticuerpo se administra terapéuticamente (administrado después de que se haya establecido la fibrosis y se haya administrado durante el transcurso de la afección) a un paciente que padece una afección o enfermedad asociada con fibrosis, o que padece al menos un síntoma o complicación asociados con la afección o enfermedad. En un aspecto, el anticuerpo se administra profilácticamente (administrado antes del desarrollo de la afección) a un paciente con riesgo de desarrollar afección o enfermedad asociada con fibrosis, o con riesgo de presentar al menos un síntoma o complicación asociados con fibrosis. Por ejemplo, dichos "pacientes en riesgo de padecer fibrosis" incluyen ancianos, o pacientes con antecedentes familiares, o fumadores, o pacientes que tienen alguna afección médica subyacente que puede predisponerlos a adquirir fibrosis como diabetes, o pacientes expuestos al asbesto, madera, polvo metálico o productos químicos, infecciones víricas, determinados medicamentos, humo de cigarrillo o pacientes con lesiones hepáticas crónicas como hepatitis vírica, infección parasitaria, enfermedades metabólicas o autoinmunitarias, anomalías congénitas y abuso de drogas y alcohol. Otros pacientes con riesgo de padecer fibrosis incluyen pacientes con enfermedad renal crónica, lesión renal aguda, hipertensión crónica, insuficiencia cardíaca, trasplante de riñón, esclerodermia, exposición a agente de contraste radiológico, alergia crónica, asma crónica o trasplante de pulmón.

En otro aspecto, el al menos un síntoma o complicación asociados con la afección o enfermedad asociada con fibrosis se selecciona del grupo que consiste en dificultad para respirar, tos seca persistente, dolor, pérdida de peso, náuseas, pérdida de apetito, acumulación de líquido en el abdomen, hinchazón en las piernas, cansancio, hipertensión pulmonar, hiperglucemia, lesión renal, infección del tracto urinario, daño hepático, pérdida de la función hepática, pérdida de la función renal, hipertensión, disminución de la calidad de vida, reducción de la esperanza de vida y recaída de una afección o enfermedad asociada con fibrosis. En algunos aspectos, la enfermedad o afección asociada con fibrosis puede estar presente en el hígado, riñón, pulmones, piel, intestino o músculo. En otro aspecto, la afección o enfermedad asociada a fibrosis se selecciona del grupo que comprende fibrosis pulmonar, hipertensión pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis renal, fibrosis hepática, lesión renal isquémica, fibrosis tubulointersticial, nefropatía diabética, nefroesclerosis y nefrotoxicidad.

Los aspectos de la divulgación se refieren a métodos para proteger contra el daño tisular progresivo o inhibir o reducir la degeneración tisular en un paciente que padece fibrosis, comprendiendo los métodos administrar al paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a GREM1; o una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a GREM1, de manera que el tejido del paciente esté protegido del daño progresivo o se inhiba o reduzca la degeneración tisular en un paciente que padece fibrosis. En algunos aspectos de la divulgación, el tejido afectado por el daño fibrótico son los pulmones, en donde la enfermedad fibrótica puede ser una de fibrosis pulmonar, hipertensión pulmonar o fibrosis pulmonar idiopática. En un aspecto, el tejido afectado por el daño fibrótico puede ser el hígado. En algunos aspectos, el tejido afectado por el daño fibrótico puede ser el riñón, en donde la enfermedad fibrótica puede comprender una de fibrosis renal, lesión renal isquémica, fibrosis tubulointersticial, nefropatía diabética, nefroesclerosis o nefrotoxicidad.

En algunos aspectos, la divulgación incluye métodos para tratar cáncer o inhibir el crecimiento tumoral, la proliferación de células tumorales o la metástasis tumoral, comprendiendo los métodos administrar un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación que se une a GREM1. En determinados aspectos, la divulgación incluye métodos para inhibir la angiogénesis, comprendiendo los métodos administrar un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación que se une a GREM1.

En un aspecto, la composición farmacéutica que comprende los anticuerpos de la divulgación se administra al paciente en combinación con un segundo agente terapéutico.

En otro aspecto, el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un agente antifibrótico tal como pirfenidona, un fármaco antiinflamatorio, un AINE, un corticosteroide tal como prednisona, un suplemento nutricional, un antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [por ejemplo, una "trampa de VEGF" tal como aflibercept u otra proteína de fusión inhibidora de VEGF como se establece en el documento US 7.087.411 o un anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, bevacizumab o ranibizumab)], un anticuerpo contra una citocina tal como IL-1, IL-6, IL-13, IL-4, IL-17, IL-25, IL-33 o TGF-p, y cualquier otra terapia paliativa útil para mejorar al menos un síntoma asociado con una afección asociada a fibrosis o cáncer. En algunos aspectos, el segundo agente terapéutico puede administrarse para gestionar o tratar al menos una complicación asociada con fibrosis o cáncer.

En aspectos de la divulgación, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo se administra por vía subcutánea, por vía intravenosa, por vía intradérmica, por vía oral o por vía intramuscular.

En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se administra en dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, más específicamente de aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal.

En aspectos relacionados, la divulgación incluye el uso de un anticuerpo anti-GREM1 aislado o una porción de unión a antígeno de un anticuerpo de la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con o provocado por la actividad de GREM1. En un aspecto, la divulgación incluye un anticuerpo anti-GREM1 aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en la promoción de la señalización de BMP o la diferenciación celular. En un aspecto, la divulgación incluye un anticuerpo anti-GREM1 aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en la inhibición de la angiogénesis mediada por heparina. En un aspecto, la divulgación incluye el uso de un anticuerpo anti-GREM1 de la divulgación en la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente que padece o corre el riesgo de presentar fibrosis. En un aspecto, la divulgación incluye el uso de un anticuerpo anti-GREM1 de la divulgación en la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente que padece o corre el riesgo de presentar cáncer.

Un sexto aspecto de la divulgación proporciona métodos para predecir el pronóstico de fibrosis en un paciente que padece una afección o enfermedad seleccionadas del grupo que comprende fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, hipertensión pulmonar, fibrosis renal, fibrosis hepática y nefropatía diabética, comprendiendo el método hacer reaccionar una proteína GREM1 del paciente con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la divulgación, en donde la unión con GREM1 humana indica un mal pronóstico.

En un aspecto, la divulgación presenta un método para predecir una mala supervivencia en un paciente que padece fibrosis, comprendiendo el método hacer reaccionar una proteína GREM1 del paciente con un anticuerpo aislado de la divulgación como se describe en el presente documento, en donde la unión con GREM1 indica una mala supervivencia.

En un aspecto, la muestra de tejido o célula que contiene una proteína GREM1 de un paciente se obtiene de la sangre, suero, plasma del paciente o biopsia de un tejido del paciente, tal como el hígado, pulmón o riñón.

En un aspecto relacionado, la divulgación presenta un método para diagnosticar fibrosis en un tejido o para monitorizar la actividad fibrótica en un sujeto sospechoso de padecer fibrosis, comprendiendo el método administrar un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la divulgación unido a un marcador detectable tal como un radionúclido o un marcador detectable por MRI y obtener imágenes del sujeto tras dicha administración, en donde la unión y detección de GREM1 en la imagen indica fibrosis.

En un aspecto, la fibrosis es fibrosis pulmonar idiopática. En algunos aspectos, la fibrosis se selecciona del grupo que comprende hipertensión pulmonar, nefropatía diabética, fibrosis renal, fibrosis hepática y fibrosis tubulointersticial. En algunos aspectos, la actividad fibrótica se detecta en pulmones, riñones o hígado.

Otros aspectos resultarán evidentes tras la revisión de la descripción detallada adjunta.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 describe las características estructurales de la proteína GREM1 (de Wordinger, R.J., et al 2008, Exp. Eye Res. 87: 78-79). Se muestran las posiciones predichas de las características estructurales. Signal Seq., secuencia señal (posiciones 1-24); DAN, motivo rico en cisteína (posiciones 69-184) ^ sitio de glucosilación (posición 42); *, ^■f fe

sitios de fosforilación (posiciones 6, 29, 44, 47, 55, 66, 76, 77, 88, 102 y 151); Sitio de fosforilación de proteína eucariota específica de PKC (posición 165); NLS, secuencias señal de localización nuclear (posiciones 145, 166, 163, 164).

Descripción detallada

Antes de describir los presentes métodos, se ha de entender que la presente invención no se limita a los métodos ni a las condiciones experimentales descritos en particular, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, puesto que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la cual pertenece la presente invención. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica o en el ensayo de la presente invención, a continuación, se describen métodos y materiales preferidos.

Definiciones

La expresión "proteína morfogenética ósea" o "BMP" se refiere al grupo de factores de crecimiento que funcionan como señales morfogenéticas fundamentales, organizando la arquitectura de los tejidos en todo el cuerpo. Originalmente se descubrieron por su capacidad para inducir la formación de hueso y cartílago. Sin embargo, las BMP tienen una variedad de funciones diferentes durante el desarrollo embrionario. También están implicadas en el modelado corporal y las cascadas de morfogénesis. Se ha descubierto que las BMPS son esenciales en la homeostasis de los órganos. Adicionalmente, las BMP desempeñan papeles importantes en la fisiopatología de varias enfermedades, incluyendo osteoporosis, artritis, hipertensión pulmonar y enfermedades renales. Las BMP y su implicación en los procesos patológicos se han revisado por Weiskirchen, R., et al in Front. Biosci. 2009, 14: 49925012. Hasta ahora se han descubierto veinte BMP, de las cuales BMP2 a BMP7 pertenecen a la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta.

El término "GREM1" se refiere a gremlin-1 humana, un miembro de la superfamilia de nudos de cisteína. La secuencia de aminoácidos de GREM1 humana se proporciona en GenBank con número de registro NP_037504 y también se hace referencia a ella en el presente documento como SEQ ID NO: 594. GREM1 está codificada por el ácido nucleico proporcionado en el presente documento como SEQ ID NO: 593, y también se encuentra en GenBank como número de registro NM_013372. GREM1 es una proteína de 184 aa altamente conservada que se ha mapeado en el cromosoma 15q13-q15. La proteína contiene un péptido señal (aa 1 - 24) y un sitio de glicosilación predicho (en el aa 42). Además, la proteína contiene una región rica en cisteína y un motivo de nudo de cisteína (aa 94-184) cuya estructura es compartida por miembros de la superfamilia del factor de crecimiento transformante-beta (TGF-p). GREM1 existe tanto en formas secretadas como asociadas a células (por ejemplo, asociadas a membranas). GREM1 también se conoce como gremlin1, superfamilia 1 de nudos de cisteína - antagonista 1 de BMP (CKTSF1B1), miembro 2 de la familia de dominio DAN (DAND2), regulado a la baja en proteínas de células transformadas con Mos (DRM), gremlin, GREMLIN, precursor de Gremlin-1, aumentado en la proteína 2 con alto contenido en glucosa (IHG-2), MGC126660, proteína del gen 2 inductor de la proliferación (PIG2) o proteína similar a Gremlin 1. GREM1 es un antagonista de las proteínas morfogenéticas óseas (BMP). Se une a las BMP e inhibe su unión a sus receptores. La interacción entre GREM1 y BMP ajusta el nivel de BMP disponibles y afecta los procesos de desarrollo y enfermedad. GREM1 puede unirse a e inhibir BMP-2, BMP-4 y BMP-7. Se ha descubierto que GREM1 está regulada positivamente en enfermedades fibróticas, especialmente del riñón, pulmón e hígado.

El término "fibrosis", como se usa en el presente documento se refiere a la formación de exceso de tejido conectivo fibroso en un órgano o tejido en un proceso reparativo o reactivo. Esto se opone a la formación de tejido fibroso como componente normal de un órgano o tejido. La cicatrización es una fibrosis confluente que destruye la arquitectura del órgano o tejido subyacente. La fibrosis puede afectar a muchos órganos del cuerpo. La siguiente tabla muestra algunos ejemplos de fibrosis junto con el órgano afectado:

El término "fibrosis" también comprende trastornos complejos tales como fibrosis pulmonar, por ejemplo, fibrosis pulmonar idiopática, hipertensión pulmonar, nefropatía diabética, lesión renal isquémica, fibrosis renal, fibrosis hepática, fibrosis tubulointersticial, nefroesclerosis y nefrotoxicidad.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a moléculas de inmunoglobulina compuestas por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro (es decir, "moléculas de anticuerpo completo"), así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM) o fragmentos de unión a antígeno de las mismas. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada ("HCVR" o "V^h") y una región constante de cadena pesada (comprendida por los dominios C^h1, C^h2 y C^h3). Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera ("LCVR o "V^l") y una región constante de cadena ligera (C^l). Las regiones V^h y V^l pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada V^h y V^l está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, c DR3, FR4. En determinados aspectos de la divulgación, las FR del anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o pueden modificarse natural o artificialmente. Una secuencia consenso de aminoácidos puede definirse basándose en un análisis paralelo de dos o más CDR.

También es posible la sustitución de uno o más restos de CDR o la omisión de una o más CDR. Se han descrito anticuerpos en la bibliografía científica en los que se puede prescindir de una o dos CDR para la unión. Padlan et al. (FASEB J. 1995, 9:133-139) analizaron las regiones de contacto entre los anticuerpos y sus antígenos, basándose en estructuras cristalinas publicadas, y concluyeron que solo aproximadamente de un quinto a un tercio de los restos de CDR realmente entran en contacto con el antígeno. Padlan también descubrió muchos anticuerpos en los que una o dos CDR no tenían aminoácidos en contacto con un antígeno (véase también, Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428).

Los restos de CDR que no entran en contacto con el antígeno se pueden identificar basándose en estudios anteriores (por ejemplo, los restos H60-H65 en CDRH2 con frecuencia no son necesarios), de regiones de CDR de Kabat que se encuentran fuera de CDR de Chothia, por modelización molecular y/o empíricamente. Si se omite una CDR o uno o más restos de la misma, generalmente se sustituye con un aminoácido que ocupa la posición correspondiente en otra secuencia de anticuerpo humano o un consenso de dichas secuencias. Las posiciones para la sustitución dentro de CDR y los aminoácidos a sustituir también pueden seleccionarse empíricamente. Las sustituciones empíricas pueden ser sustituciones conservativas o no conservativas.

Los anticuerpos monoclonales anti-GREM1 totalmente humanos divulgados en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento con secuencias de la línea germinal disponibles en, por ejemplo, bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se obtienen a partir de cualquiera de las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que se obtiene el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservativa del resto o restos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en el presente documento colectivamente "mutaciones de la línea germinal"). Un experto habitual en la materia, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera divulgadas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprendan una o más mutaciones individuales de la línea germinal o combinaciones de las mismas. En determinados aspectos, todos los restos de región marco y/o CDR dentro de los dominios V^h y/o V^l retromutan a los restos encontrados en la secuencia de la línea germinal original de la que se obtuvo el anticuerpo. En otros aspectos, únicamente determinados restos se retromutan a la secuencia de la línea germinal original, por ejemplo, únicamente los restos mutados encontrados dentro de los 8 primeros aminoácidos de FR1 o dentro de los 8 últimos aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otros aspectos, uno o más del resto o los restos de región marco y/o de CDR están mutados al resto o los restos correspondientes de una secuencia de la línea germinal diferente (es decir, una secuencia de la línea germinal que es diferente de la secuencia de la línea germinal de la que se obtuvo originariamente el anticuerpo). De manera adicional, los anticuerpos de la presente divulgación pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, por ejemplo, en donde determinados restos individuales están mutados al correspondiente resto de una secuencia de la línea germinal particular mientras que otros restos determinados que difieren de la secuencia de la línea germinal original se mantienen o están mutados al correspondiente resto de una secuencia de la línea germinal diferente. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden probarse fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, mayor afinidad de unión, propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), menor inmunogenicidad, etc. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general se abarcan en la presente divulgación.

La presente divulgación también incluye anticuerpos monoclonales anti-GREM1 totalmente humanos que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-GREM1 que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones de aminoácidos conservativas respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR divulgadas en el presente documento.

La expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los mAb humanos de la divulgación pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria y específica de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir mAb en los que las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero (por ejemplo, ratón), se han injertado en secuencias FR humanas.

La expresión "se une específicamente", o "se une específicamente a", o similares, significa que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica puede caracterizarse por una constante de disociación en equilibrio de al menos aproximadamente 1 x 10-6 M o menos (por ejemplo, una K^d menor indica una unión más estrecha). Los métodos para determinar si dos moléculas se unen específicamente son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, diálisis en equilibrio, resonancia de plasmón superficial y similares. Como se describe en el presente documento, los anticuerpos que se unen específicamente a GREM1 humana se han identificado mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIACORE™. Asimismo, los anticuerpos multiespecíficos, que se unen a un dominio en GREM1 y uno o más antígenos adicionales o uno biespecífico que se une a dos regiones diferentes de GREM1 se consideran, no obstante, anticuerpos que se "unen específicamente", como se usa en el presente documento.

La expresión anticuerpo "de alta afinidad" se refiere a aquellos mAb que tienen una afinidad de unión a GREM1, expresada como K^d, de al menos 10-7 M; preferentemente de 10-8 M; más preferentemente de 10-9 M, incluso más preferentemente de 10-10 M, incluso más preferentemente de 10-11 M, según se mide mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIACORE™ o ELISA de afinidad en solución.

Por la expresión "disociación lenta", "Koff' o "kd" se entiende un anticuerpo que se disocia de GREM1, con una constante de velocidad de 1 x 10-3 s-1 o menos, preferentemente 1 x 10-4 s-1 o menos, tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIACORE™.

Las expresiones "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se usa en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, que se puede obtener enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Las expresiones "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo o "fragmento de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse a GREM1.

En aspectos específicos, el anticuerpo o fragmentos de anticuerpo de la divulgación pueden estar conjugados a una resto terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como un antibiótico, un segundo anticuerpo anti-GREM1, o un anticuerpo contra una citocina tal como IL-1, IL-6 o TGF-p, o cualquier otro resto terapéutico útil para tratar una enfermedad o afección que incluye fibrosis pulmonar, fibrosis renal, fibrosis hepática, lesión renal isquémica, fibrosis tubulointersticial, nefropatía diabética, nefroesclerosis o nefrotoxicidad.

Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos (Ab) que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a GREM1 humana o un fragmento del mismo, está sustancialmente libre de Ab que se unen específicamente a antígenos diferentes a GREM1.

Un "anticuerpo de bloqueo" o un "anticuerpo neutralizante", como se usa en el presente documento (o un "anticuerpo que neutraliza la actividad de GREM1"), pretende hacer referencia a un anticuerpo cuya unión a GREM1 da como resultado la inhibición de al menos una actividad biológica de GREM1. Por ejemplo, un anticuerpo de la divulgación puede ayudar a inhibir o prevenir la propagación de la fibrosis. Como alternativa, un anticuerpo de la divulgación puede demostrar la capacidad para tratar la fibrosis o al menos un síntoma causado por la fibrosis, incluyendo tos seca o disnea. Esta inhibición de la actividad biológica de GREM1 se puede evaluar midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de GREM1 mediante uno o más de varios ensayos in vitro convencionales (tal como un ensayo de neutralización, como se describe en el presente documento) o ensayos in vivo conocidos en la técnica (por ejemplo, modelos animales para observar la protección de la actividad de GREM1 después de la administración de uno o más de los anticuerpos descritos en el presente documento).

La expresión "resonancia de plasmón superficial", como se usa en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones biomoleculares en tiempo real mediante la detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz biosensora, por ejemplo, usando el sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.).

El término "K^d", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de disociación en equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno particular.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas en un antígeno y pueden tener diferentes efectos biológicos. El término "epítopo" se refiere también a un lugar en un antígeno al que responden linfocitos B y/o T. También se refiere a una región de un antígeno a la que se une un anticuerpo. Los epítopos pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subconjunto de los epítopos estructurales y tienen aquellos restos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epítopos también pueden ser conformacionales, es decir, compuestos de aminoácidos no lineales. En determinados aspectos, los epítopos pueden incluir determinantes que son agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o grupos sulfonilo y, en determinados aspectos, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas.

La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean de forma óptima con inserciones o eliminaciones de nucleótidos adecuadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente un 90 % y, más preferentemente, al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % de las bases nucleotídicas, según se mide mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o GAP, como se analiza a continuación. Una molécula de ácido nucleico que tiene identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en determinados casos, codificar un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos o una sustancialmente similar que el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.

Aplicada a polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos un 90 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos un 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos, que no son idénticas, difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en la que un resto de aminoácido está sustituido por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobia). En general, una sustitución de aminoácidos conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos donde dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Son grupos de sustitución de aminoácidos conservativa preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalaninatirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un remplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45. Un remplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

La similitud de secuencia para polipéptidos se mide normalmente usando un programa informático de análisis de secuencia. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como GAP y BESTFIT que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA con parámetros por defecto o recomendados; un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) supra). Otro algoritmo preferido al comparar una secuencia de la divulgación con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 y (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.

En aspectos específicos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso en el método de la divulgación puede ser monoespecífico, biespecífico o multiespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para epítopos de más de un polipéptido diana. Un formato de anticuerpo biespecífico ilustrativo que puede usarse en el contexto de la presente divulgación implica el uso de un primer dominio C^h3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio C^h3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominios C^h3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En un aspecto, el primer dominio C^h3 de Ig está unido a proteína A y el segundo dominio C^h3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo C^h3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo C^h3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82l (por IMGT; D356e , L358M, N384S, K392N, V397M y V422l por EU) en el caso de los mAb de IgG1; N44S, K52N y V82l (IMGT; N384S, K392N y V422l por EU) en el caso de los mAb de IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82l (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422l por EU) en el caso de los mAb de IgG4. Dentro del alcance de la presente invención se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente.

Por la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende una cantidad que produce el efecto deseado para el que se administra. La cantidad exacta dependerá del propósito del tratamiento, y un experto en la materia podrá determinarla usando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).

Descripción general

Como antagonista de las proteínas morfogenéticas óseas (BMP), el gen GREM1 desempeña un papel en la regulación de la organogénesis, patrones corporales y diferenciación de tejidos. Se ha descubierto que GREM1 desempeña un papel importante en el desarrollo pulmonar. Sin embargo, la expresión de GREM1 en un pulmón adulto sano es baja. Los niveles aumentados de GREM1 se han correlacionado con la hipertensión pulmonar y la fibrosis pulmonar (Costello, et al., 2010, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 42: 517-523). La fibrosis pulmonar, especialmente del tipo idiopático es una enfermedad progresiva, cicatricial e incapacitante del parénquima pulmonar con mal pronóstico y sin tratamiento eficaz. La expresión elevada de GREM1 se correlaciona negativamente con las pruebas de función pulmonar en la fibrosis pulmonar idiopática, sugiriendo que GREM1 puede ser un marcador importante de fibrosis en estadio avanzado (Costello, et al., 2010, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 42: 517-523).

La expresión de GREM1 también es esencial en la organogénesis renal. Sin embargo, la expresión de GREM1 en un riñón adulto sano es casi indetectable. Los niveles elevados de GREM1 se encuentran en pacientes con hiperglucemia y nefropatía diabética (Lappin, et al., 2002, Nephrol. Dial. Transplant. 17: 65-67). Se observa que GREM1 está aumentado en áreas de fibrosis tubulointersticial en pacientes con nefropatía diabética. La nefropatía diabética es un trastorno complejo caracterizado por esclerosis y aparición de fibrosis tubulointersticial. Es la causa principal de enfermedades renales en estadio terminal y el 20-40 % de los pacientes con diabetes finalmente presentan nefropatía diabética. No se dispone de terapias específicas para revertir o inhibir la progresión de la nefropatía diabética a estadios avanzados y las estrategias de tratamiento actuales se limitan a la gestión de los niveles de glucosa en sangre y el control de la hipertensión (Zhang et al., 2009, BBRC 383: 1-3).

También se ha observado que GREM1 está aumentado en la fibrosis hepática (Boers et al., 2006, J. Biol. Chem. 281: 16289-16295). La fibrosis hepática es una respuesta común a la mayoría de las lesiones hepáticas crónicas como la hepatitis vírica, infección parasitaria, enfermedades metabólicas o autoinmunitarias, anomalías congénitas y abuso de drogas y alcohol. La fibrosis también puede contribuir a la cirrosis hepática progresiva. La detección de la enfermedad hepática con frecuencia se retrasa y no se dispone de un tratamiento médico eficaz.

Los anticuerpos descritos en el presente documento demuestran una unión específica a GREM1 humana y, en algunos aspectos, pueden ser útiles para el tratamiento de pacientes que padecen fibrosis. El uso de dichos anticuerpos puede ser un medio eficaz para tratar a pacientes que padecen fibrosis, o puede usarse para disminuir la gravedad de la tos seca o la dificultad para respirar asociada con la fibrosis. Pueden utilizarse solos o como terapia complementaria con otras modalidades o restos terapéuticos conocidos en la técnica para tratar fibrosis, tales como, pero sin limitación, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un corticosteroide tal como prednisona o cualquier otra terapia paliativa. Pueden usarse junto con un segundo o tercer anticuerpo diferente específico para GREM1, o contra una citocina tal como IL-1, IL-6 o TGF-p.

En algunos aspectos, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser útiles para tratar o controlar una enfermedad o afección de fibrosis que incluye fibrosis pulmonar (idiopática), fibrosis renal, fibrosis hepática, lesión renal isquémica, fibrosis tubulointersticial, nefropatía diabética, nefroesclerosis o nefrotoxicidad.

En determinados aspectos, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser útiles para tratar o controlar un cáncer tal como sarcoma y carcinomas de pulmón, de cuello uterino, colon, mama y páncreas.

En determinados aspectos, los anticuerpos de la divulgación se obtienen de ratones inmunizados con un inmunógeno primario, tal como una GREM1 humana de longitud completa natural (véase el número de registro de GenBank NP_037504 (SEQ ID NO: 594)) o con una forma recombinante de GREM1 (SEQ ID NO: 595) o fragmentos de GREM1, seguido de inmunización con un inmunógeno secundario, o con un fragmento inmunogénicamente activo de GREM1.

El inmunógeno puede ser un fragmento inmunogénico de GREM1 humana o ADN que codifica el fragmento de la misma. El inmunógeno puede acoplarse con GREM1 a una etiqueta de histidina y/o a un fragmento de la región Fc de un anticuerpo.

La secuencia de aminoácidos de GREM1 humana de longitud completa (también conocida por el número de registro de Genbank NP-037504) se muestra como la SEQ ID NO: 594. La secuencia de aminoácidos de longitud completa de GREM1 recombinante (aa 25-184 de GREM1 acoplada a la región Fc y una etiqueta de histidina) se muestra como la SEQ ID NO: 595.

La secuencia de ADN de longitud completa de GREM1 se muestra como la SEQ ID NO: 593.

En determinados aspectos, los anticuerpos que se unen específicamente a GREM1 humana se pueden preparar utilizando fragmentos de las regiones anteriormente mencionadas o péptidos que se extienden más allá de las regiones designadas en aproximadamente 5 a aproximadamente 20 restos de aminoácidos de cualquiera, o ambos, extremos amino o carboxiterminales de las regiones descritas en el presente documento. En determinados aspectos, se puede usar cualquier combinación de las regiones anteriormente mencionadas o fragmentos de las mismas en la preparación de anticuerpos específicos de GREM1 humana. En determinados aspectos, se puede usar una cualquiera o más de las regiones de GREM1 humana anteriormente mencionadas o fragmentos de las mismas, para preparar anticuerpos monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos.

Fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos

A menos que se indique específicamente de otra manera, el término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, debe entenderse que abarca moléculas de anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina (es decir, "moléculas de anticuerpo completo") así como los fragmentos de unión a antígeno de las mismas. Las expresiones "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se usa en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, que se puede obtener enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Las expresiones "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo o "fragmento de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a GREM1 humana. Un fragmento de anticuerpo puede incluir un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento dAb, un fragmento que contiene una CDR, o una CDR aislada. Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo, por ejemplo, de moléculas de anticuerpo completas usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios variables y (opcionalmente) constantes de anticuerpos. Dicho ADN se conoce y/o se puede adquirir fácilmente de, por ejemplo, fuentes comerciales, bibliotecas de a Dn (incluyendo, por ejemplo, fagotecas de anticuerpos) o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o usando técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o eliminar aminoácidos, etc.

Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos de dominio eliminado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP, por sus siglas en inglés) y dominios IgNAR variables de tiburón, también se abarcan dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", como se usa en el presente documento.

Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR, que esté adyacente o en marco con una o más secuencias marco conservadas. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio V^h asociado a un dominio V^l, los dominios V^h y V^l pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros V^h - V^h, V^h - V^l o V^l - V^l. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio V^h o V^l monomérico.

En determinados aspectos, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente con al menos un dominio constante. Configuraciones ilustrativas, no limitantes de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación incluyen: (i) V^h -C^h1; (ii) V^h -Ch2; (iii) V^h -C^h3; (iv) V^h -C^h1-C^h2; (v) V^h -C^h1-C^h2-C^h3; (vi) V^h -C^h2-C^h3; (vii) V^h -C^l; (viii) V^l -Ch1; (ix) V^l -C^h2; (x) V^l -C^h3; (xi) V^l -C^h1-C^h2; (xii) V^l -C^h1-C^h2-C^h3; (xiii) V^l -C^h2-C^h3; y (xiv) V^l -C^l. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones ilustrativas enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos, lo que da como resultado una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Asimismo, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios V^h o V^l monoméricos (p.ej., mediante enlaces disulfuro).

Como ocurre con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno separado o a un epítopo diferente en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico ilustrativos divulgados en el presente documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación usando técnicas habituales disponibles en la técnica.

Preparación de anticuerpos humanos

Los métodos para generar anticuerpos humanos en ratones transgénicos se conocen en la técnica. Cualquiera de dichos métodos conocidos puede usarse en el contexto de la presente divulgación para preparar anticuerpos humanos que se unan específicamente a GREM1 humana.

Usando la tecnología VELOCIMMUNE™ (véanse, por ejemplo, el documento US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, inicialmente se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra GREM1 humana que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. La tecnología VELOCIMMUNE® implica la generación de un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera humanas unidas operativamente a locus endógenos de región constante de ratón de manera que el ratón produce un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a la estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se aísla y se une operativamente al ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas. A continuación, el a Dn se expresa en una célula capaz de expresar el anticuerpo totalmente humano.

Generalmente, un ratón VELOCIMMUNE® se expone al antígeno de interés y se recuperan las células linfáticas (tal como linfocitos B) de los ratones que expresan los anticuerpos. Las células linfáticas se pueden fusionar con una línea celular de mieloma para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales y dichas líneas celulares de hibridoma se detectan de manera sistemática y seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. El ADN que codifica las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera puede aislarse y unirse a regiones constantes isotípicas deseables de la cadena pesada y la cadena ligera. Dicho un anticuerpo puede producirse en una célula, tal como una célula CHO. Como alternativa, el ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas puede aislarse directamente de linfocitos específicos de antígeno.

Inicialmente, se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la siguiente sección experimental, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para las características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se remplazan con una región constante humana deseada para generar el anticuerpo totalmente humano de la divulgación, por ejemplo, IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificada. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.

En general, los anticuerpos de la presente divulgación poseen afinidades muy altas, poseyendo normalmente una K^d de aproximadamente 10-12 a aproximadamente 10-7 M, cuando se miden mediante unión a antígeno inmovilizado sobre fase sólida o en fase en solución. Las regiones constantes de ratón se remplazan con regiones constantes humanas deseadas para generar los anticuerpos totalmente humanos de la divulgación. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.

Bioequivalentes

Los anticuerpos anti-GREM1 humana y fragmentos de anticuerpo de la presente divulgación abarcan proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían respecto a las de los anticuerpos descritos, pero que conservan la capacidad de unión a GREM1 humana. Dichos anticuerpos variantes y fragmentos de anticuerpo comprenden una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia precursora, pero muestran actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. De forma análoga, las secuencias de ADN que codifican anticuerpos de la presente divulgación abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de nucleótidos en comparación con la secuencia divulgada, pero que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la divulgación.

Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya velocidad y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, bien en una sola dosis o en múltiples dosis. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción pero no en su velocidad de absorción y aún pueden considerarse bioequivalentes porque dichas diferencias en la velocidad de absorción son intencionadas y se reflejan en el marcado, no son esenciales para obtener las concentraciones eficaces del fármaco en el organismo en, por ejemplo, el uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el producto farmacológico particular estudiado.

En un aspecto, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente importantes en su seguridad, pureza y potencia.

En un aspecto, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad o eficacia disminuida, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.

En un aspecto, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan mediante un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la condición o condiciones de uso, en la medida en que dichos mecanismos sean conocidos.

La bioequivalencia puede demostrarse por métodos in vivo y/o in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en el que se mide la concentración del anticuerpo o sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro líquido biológico como una función del tiempo; (b) un ensayo in vitro que se ha correlacionado con y es razonablemente predictivo de datos de biodisponibilidad in vivo en seres humanos; (c) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos en el que se mide el efecto farmacológico agudo adecuado del anticuerpo (o su diana) como una función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.

Las variantes bioequivalentes de los anticuerpos de la divulgación pueden construirse, por ejemplo, generando diversas sustituciones de restos o secuencias o eliminando secuencias o restos terminales o internos no necesarios para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden eliminarse restos de cisteína no esenciales para la actividad biológica, o remplazarse con otros aminoácidos, para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpo que comprenden cambios de aminoácidos, los cuales modifican las características de glucosilación de los anticuerpos, por ejemplo, mutaciones que eliminan o suprimen la glucosilación.

Anticuerpos anti-GREMI que comprenden variantes de Fc

De acuerdo con determinados aspectos de la presente divulgación, se proporcionan anticuerpos anti-GREM1 que comprenden un dominio Fc que comprende una o más mutaciones que potencian o reducen la unión del anticuerpo al receptor FcRn, por ejemplo, a pH ácido en comparación con pH neutro. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti- Gr e M1 que comprenden una mutación en la región C^h2 o C^h3 del dominio Fc, en donde la mutación o mutaciones aumentan la afinidad del dominio Fc por FcRn en un entorno ácido (por ejemplo, en un endosoma donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Dichas mutaciones pueden dar como resultado un aumento de la semivida en suero del anticuerpo cuando se administra a un animal. Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones de Fc incluyen, por ejemplo, una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T) y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, H/L/R/S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, A, W, H, F o Y [N434A, N434W, N434H, N434F o N434Y]); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F) y 434. En un aspecto, la modificación comprende una modificación 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación 428L, 2591 (por ejemplo, V259I) y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación 433K (por ejemplo, H433K) y en 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación en 252, 254, y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T y 256E); una modificación 250Q y 428L (por ejemplo,T250Q y M428L); y una modificación en 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P). En otro aspecto más, la modificación comprende una modificación 265A (por ejemplo, D265A) y/o una modificación 297A (por ejemplo, N297A).

Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-GREM1 que comprenden un dominio Fc que comprende uno o más pares o grupos de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: 250Q y 248L (por ejemplo, T250Q y M248L); 252Y, 254T y 256E (por ejemplo, M252Y, S254T y T256E); 428L y 434S (por ejemplo, M428L y N434S); 257l y 3111 (por ejemplo, P257l y Q311l); 257l y 434H (por ejemplo, P257l and N434H); 376V y 434H (por ejemplo, D376V y N434H); 307A, 380A y 434A (por ejemplo, T307A, E380A y N434A); y 433K y 434F (por ejemplo, H433K y N434F). Todas las posibles combinaciones de las mutaciones del dominio Fc anteriores, y otras mutaciones dentro de los dominios variables de anticuerpo divulgados en el presente documento, se contemplan dentro del alcance de la presente divulgación.

La presente divulgación también incluye anticuerpos anti-GREMI que comprenden una región constante de cadena pesada (C^h) quimérica, en donde la región C^h quimérica comprende segmentos procedentes de las regiones C^h de más de un isotipo de inmunoglobulina. Por ejemplo, los anticuerpos de la divulgación pueden comprender una región C^h quimérica que comprende parte o la totalidad de un dominio C^h2 procedente de una molécula de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, en combinación con parte o la totalidad de un dominio C^h3 procedente de una molécula de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. De acuerdo con determinados aspectos, los anticuerpos de la divulgación comprenden una región C^h quimérica que tiene una región bisagra quimérica. Por ejemplo, una bisagra quimérica puede comprender una secuencia de aminoácidos de "bisagra superior" (restos de aminoácidos de las posiciones 216 a 227 de acuerdo con la numeración EU) procedente de una región bisagra de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, en combinación con una secuencia de "bisagra inferior" (restos de aminoácidos de las posiciones 228 a 236 de acuerdo con la numeración EU) procedente de una región bisagra de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. De acuerdo con determinados aspectos, la región bisagra quimérica comprende restos de aminoácidos procedentes de una bisagra superior de IgG1 humana o IgG4 humana y restos de aminoácidos procedentes de una bisagra inferior de IgG2 humana. Un anticuerpo que comprende una región C^h quimérica como se describe en el presente documento puede, en determinados aspectos, presentar funciones efectoras de Fc modificadas sin afectar negativamente a las propiedades terapéuticas o farmacocinéticas del anticuerpo.

Características biológicas de los anticuerpos

En general, los anticuerpos de la presente divulgación pueden funcionar uniéndose a GREM1 humana. En algunos aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación pueden unirse al dominio catalítico de GREM1 humana, o a un fragmento de la misma. En algunos aspectos, los anticuerpos de la divulgación pueden unirse a la forma secretada de GREM1 humana o a la forma asociada a membrana de GREM1 humana. En algunos aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación pueden unirse a más de un dominio (anticuerpos de reactividad cruzada).

En determinados aspectos de la divulgación, los anticuerpos pueden unirse a un epítopo localizado en la región entre los restos de aminoácidos 25-184 de la SEQ ID NO: 594 o s Eq ID NO: 595.

En determinados aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación pueden funcionar bloqueando o inhibiendo la señalización de BMP uniéndose a cualquier otra región o fragmento de la proteína natural de longitud completa, cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 594, que está codificada por la secuencia de un ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 593. En un aspecto, los anticuerpos de la presente divulgación pueden funcionar invirtiendo la inhibición de BMP2, BMP4 o BMP7 uniéndose a GREM1 de longitud completa o a un fragmento de la misma. En algunos aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación pueden funcionar promoviendo la señalización de BMP o pueden bloquear la unión entre GREM1 y BMP, incluyendo BMP2, BMP4 o BMP7.

En determinados aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación pueden funcionar bloqueando la unión de GREM1 a heparina y/o inhibiendo la activación de VEGFR-2 mediada por heparina.

En determinados aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación pueden ser anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos de la divulgación pueden unirse a un epítopo en un dominio y también pueden unirse a un epítopo en un segundo dominio de GREM1 humana. En determinados aspectos, los anticuerpos biespecíficos de la divulgación pueden unirse a dos epítopos diferentes en el mismo dominio.

En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal totalmente humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a GREM1 humana, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo presenta una o más de las siguientes características: (iv) comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 402, 418, 434, 450, 466, 482, 498, 514, 530, 546, 562, y 578, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (ii) comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 394, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, y 586, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iii) comprende un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 392, 408, 424, 440, 456, 472, 488, 504, 520, 536, 552, 568 y 584, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID n O: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512, 528, 544, 560, 576 y 592, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iv) comprende una dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las s Eq ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372, 388, 404, 420, 436, 452, 468, 484, 500, 516, 532, 548, 564, y 580, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 374, 390, 406, 422, 438, 454, 470, 486, 502, 518, 534, 550, 566 y 582, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508, 524, 540, 556, 572 y 588, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 398, 414, 430, 446, 462, 478, 494, 510, 526, 542, 558, 574 y 590, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (v) se une a GREM1 con una K^d igual a o inferior a 10-7; (vi) bloquea la unión de GREM1 a una de BMP2, BMP4 o BMP7; (vii) bloquea la inhibición de la señalización de BMP por GREM1 y promueve la diferenciación celular; y (viii) bloquea la unión de GREM1 a la heparina.

Determinados anticuerpos anti-GREM1 de la presente divulgación son capaces unirse y neutralizar la actividad de GREM1, según lo determinado en ensayos in vitro o in vivo. La capacidad de los anticuerpos de la divulgación para unirse a y neutralizar la actividad de GREM1 puede medirse usando cualquier método convencional conocido por los expertos en la materia, incluyendo ensayos de unión o ensayos de actividad, como se describe en el presente documento.

Configuraciones ilustrativas, no limitantes de ensayos in vitro para medir la actividad de unión se ilustran en el ejemplo 4, en el presente documento. En el ejemplo 4, las afinidades de unión y las constantes cinéticas de los anticuerpos anti-GREM1 humana se determinaron mediante resonancia de plasmón superficial y las mediciones se realizaron en un instrumento T200 Biacore. En el ejemplo 5, se utilizaron ensayos de bloqueo para determinar la capacidad de los anticuerpos anti-GREM1 para bloquear la capacidad de unión de GREM1 a BMP4 in vitro. Los ejemplos 6 y 7 describen la actividad de los anticuerpos anti-GREM1 para promover la señalización de BMP4 y la diferenciación celular. En el ejemplo 6, los anticuerpos anti-GREM1 bloquearon la inhibición de GREM1 de la señalización de BMP4. En el ejemplo 7, los anticuerpos anti-GREM1 promovieron la señalización de BMP4 y la diferenciación celular de las células progenitoras de osteoblastos. El ejemplo 9 describe la inhibición de la interacción de unión de GREM1-heparina usando anticuerpos específicos de GREM1.

La presente divulgación también incluye anticuerpos anti-GREM1 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a al menos un fragmento biológicamente activo de cualquiera de las siguientes proteínas o péptidos: SEQ ID NO: 594 (GREM1 humana de longitud completa natural) o SEQ ID NO: 595 (forma recombinante de GREM1 humana). Cualquiera de los péptidos de GREM1 descritos en el presente documento, o fragmentos de los mismos, se puede usar para generar anticuerpos anti-GREM1.

Los péptidos pueden modificarse para incluir la adición o sustitución de determinados restos para etiquetar o con fines de conjugación con moléculas vehículo, tales como, KLH. Por ejemplo, puede añadirse una cisteína en el extremo aminoterminal o carboxiterminal de un péptido, o puede añadirse una secuencia enlazadora para preparar el péptido para conjugarlo con, por ejemplo, KLH para inmunización.

Los anticuerpos específicos de GREM1 pueden no contener marcadores o restos adicionales, o pueden contener un marcador o resto aminoterminal o carboxiterminal. En un aspecto, el marcador o resto es biotina. En un ensayo de unión, la ubicación de un marcador (si lo hay) puede determinar la orientación del péptido con respecto a la superficie sobre la que se une el péptido. Por ejemplo, si una superficie está recubierta con avidina, un péptido que contiene una biotina aminoterminal se orientará de manera que la porción carboxiterminal del péptido estará distal a la superficie. En un aspecto, el marcador puede ser un radionúclido, un colorante fluorescente o un marcador detectable por MRI. En determinados aspectos, dichos anticuerpos marcados pueden usarse en ensayos de diagnóstico que incluyen ensayos de obtención de imágenes.

Mapeo de epítopos y tecnologías relacionadas

La presente divulgación incluye anticuerpos anti-GREM1 que interactúan con uno o más aminoácidos que se encuentran dentro de una o más regiones de GREM1. El epítopo al que se unen los anticuerpos puede consistir en una sola secuencia contigua de 3 o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 , 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos localizados dentro de cualquiera de las regiones de la molécula de GREM1 anteriormente mencionadas (por ejemplo, un epítopo lineal en un dominio). Como alternativa, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos (o secuencias de aminoácidos) no contiguos localizados dentro de una o ambas de las regiones de la molécula de GREM1 anteriormente mencionadas (por ejemplo, un epítopo conformacional).

Pueden usarse diversas técnicas conocidas por los expertos en la materia para determinar si un anticuerpo "interactúa con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o proteína. Las técnicas ilustrativas incluyen, por ejemplo, ensayos de bloqueo cruzado habituales, tales como los descritos en Antibodies, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Otros métodos incluyen análisis mutacionales de barrido de alanina, análisis de transferencia de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), estudios cristalográficos de análisis de escisión de péptidos y análisis de NMR. Además, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). Otro método que puede usarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interactúa un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio hidrógeno/deuterio implica el marcado con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo proteína/anticuerpo se transfiere al agua y los protones intercambiables dentro de los aminoácidos que están protegidos por el complejo del anticuerpo experimentan un intercambio inverso de deuterio a hidrógeno a una velocidad más lenta que los protones intercambiables dentro de los aminoácidos que no forman parte de la interfaz. Como resultado, los aminoácidos que forman parte de la interfaz proteína/anticuerpo pueden conservar deuterio y, por lo tanto, presentan una masa relativamente mayor en comparación con los aminoácidos no incluidos en la interfaz. Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana se somete a escisión por proteasas y análisis de espectrometría de masas, revelando de esta manera los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interactúa el anticuerpo. Véanse, por ejemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A.

El término "epítopo" se refiere a un lugar sobre un antígeno al que responden linfocitos B y/o T. Los epítopos de linfocitos B pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como a partir de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente se conservan con la exposición con disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario normalmente se pierden al tratarlos con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.

El perfilado asistido por modificación (MAP, por sus siglas en inglés), también conocido como perfilado de anticuerpos basado en la estructura del antígeno (ASAP, por sus siglas en inglés) es un método que categoriza grandes números de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos contra el mismo antígeno según las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo a superficies de antígenos modificadas química o enzimáticamente (véase el documento US 2004/0101920). Cada categoría puede reflejar un epítopo exclusivo diferente o parcialmente superpuesto con el epítopo representado por otra categoría. Esta tecnología permite el filtrado rápido de anticuerpos genéticamente idénticos, de modo que la caracterización puede centrarse en anticuerpos genéticamente distintos. Cuando se aplica a la cribado de hibridomas, MAP puede facilitar la identificación de clones de hibridomas raros que producen mAb que tienen las características deseadas. MAP se puede usar para clasificar los anticuerpos de la divulgación en grupos de anticuerpos que se unen a diferentes epítopos.

En determinados aspectos, los anticuerpos anti-GREM1 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se unen a un epítopo dentro de una o más de las regiones ilustradas en la GREM1, ya sea en forma natural, como se ilustra en la SEQ ID NO: 594, o producida de forma recombinante, como se ilustra en la SEQ ID NO: 595 o en un fragmento de la misma. En determinados aspectos, los anticuerpos de la divulgación, como se muestra en la tabla 1, interactúan con al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 1 hasta aproximadamente la posición 24 de la SEQ ID NO: 594; o restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 25 hasta aproximadamente la posición 184 de la SEQ ID NO: 594. Estas regiones se ilustran adicionalmente en la SEQ ID NO: 595.

La presente divulgación incluye anticuerpos anti-GREM1 humana que se unen al mismo epítopo, o una porción del epítopo, como cualquiera de los anticuerpos específicos ilustrativos descritos en el presente documento en la tabla 1, o un anticuerpo que tiene las secuencias CDR de cualquiera de los anticuerpos ilustrativos descritos en la tabla 1. De forma análoga, la presente divulgación también incluye anticuerpos anti-GREM1 humana que compiten por unirse a GREM1 o a un fragmento de GREM1 con cualquiera de los anticuerpos ilustrativos específicos descritos en el presente documento en la tabla 1, o un anticuerpo que tiene las secuencias CDR de cualquiera de los anticuerpos ilustrativos descritos en la tabla 1.

Puede determinarse fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, un anticuerpo anti-GREM1 de referencia usando métodos habituales conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-GREM1 de referencia de la divulgación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína o péptido GREM1 en condiciones de saturación. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo de unirse a la molécula de GREM1. Si el anticuerpo de ensayo puede unirse a GREM1 después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-GREM1 de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente del anticuerpo anti-GREM1 de referencia. Por otra parte, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de unirse a la proteína GREM1 después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-GREM1 de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo al que se une el anticuerpo anti-GREMI de referencia de la divulgación.

Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo anti-GREM1 de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína GREM1 en condiciones de saturación seguido por evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula de GREM1. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a una molécula GREM1 en condiciones de saturación seguido por evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la molécula de GREM1. Si, en ambas orientaciones, únicamente el primer anticuerpo (de saturación) puede unirse a la molécula de GREM1, entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a GREM1. Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede que no se una necesariamente al epítopo idéntico al anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.

Dos anticuerpos se unen al mismo epítopo o epítopos solapantes si cada uno inhibe (bloquea) competitivamente la unión del otro al antígeno. Es decir, un exceso en un factor de 1, 5, 10, 20 o 100 de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 50 %, pero preferentemente en un 75 %, un 90 % o incluso un 99 %, según se mide en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990 50:1495-1502). Como alternativa, dos anticuerpos tienen el mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Dos anticuerpos tienen epítopos solapantes si algunas mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.

A continuación, puede realizarse experimentación habitual adicional (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la ausencia de unión del anticuerpo de ensayo observada se debe, de hecho, a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la ausencia de la unión observada. Los experimentos de este tipo pueden realizarse usando ELISA, RIA, resonancia del plasmón superficial, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la técnica.

Inmunoconjugados

La divulgación abarca un anticuerpo monoclonal anti-GREM1 humana conjugado con un resto terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como un agente que es capaz de reducir la gravedad de la fibrosis o mejorar al menos un síntoma asociado con fibrosis, incluyendo tos seca persistente y/o dificultad para respirar, o la gravedad de los mismos. Como se usa en el presente documento, el término "inmunoconjugado" se refiere a un anticuerpo que está unido química o biológicamente a un agente radiactivo, una citocina, un interferón, un resto diana o indicador, una enzima, una toxina o un agente terapéutico. El anticuerpo puede estar unido al agente radiactivo, citocina, interferón, resto diana o indicador, enzima, toxina o agente terapéutico en cualquier lugar a lo largo de la molécula siempre que sea capaz de unirse a su diana. Un ejemplo de inmunoconjugado es el conjugado anticuerpo fármaco. En algunos aspectos, el agente puede ser un segundo anticuerpo diferente de GREM1 humana, o de una citocina tal como IL-1, IL-6 o una quimiocina tal como TGF-p. El tipo de resto terapéutico que se puede conjugar con el anticuerpo anti-GREM1 tendrá en cuenta la afección a tratar y el efecto terapéutico deseado a lograr. Por ejemplo, si el efecto terapéutico deseado es tratar las secuelas o síntomas asociados con fibrosis, o cualquier otra afección resultante de la fibrosis, tal como, pero sin limitación, inflamación o pérdida de peso, puede ser ventajoso conjugar un agente apropiado para tratar las secuelas o los síntomas de la afección o para aliviar cualquier efecto secundario de los anticuerpos de la divulgación. En la técnica se conocen ejemplos de agentes adecuados para formar inmunoconjugados; véase, por ejemplo, el documento WO 05/103081. Se conoce generalmente bien en la técnica la preparación de inmunoconjugados e inmunotoxinas (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4340535). Los inmunoconjugados se describen en detalle, por ejemplo, en los documentos US 7250492, US 7420040 y US 7411046.

Anticuerpos multiespecíficos

Los anticuerpos de la presente divulgación pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véanse, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Los anticuerpos de la presente divulgación pueden unirse a o expresarse conjuntamente con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse de forma funcional (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos biespecíficos en donde un brazo de una inmunoglobulina es específico para la región aminoterminal de GREM1 o un fragmento de la misma, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para la región carboxiterminal de GREM1 o una segunda diana terapéutica o está conjugado con un resto terapéutico. Un formato de anticuerpo biespecífico ilustrativo que puede usarse en el contexto de la presente divulgación implica el uso de un primer dominio C^h3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio C^h3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominio C^h3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En un aspecto, el primer dominio C^h3 de Ig está unido a proteína A y el segundo dominio C^h3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo C^h3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo C^h3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82l (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422l por EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82l (IMGT; N384S, K392N y V422l por EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82l (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422l por EU) en el caso de anticuerpos IgG4. Dentro del alcance de la presente divulgación se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente.

Otros formatos biespecíficos ilustrativos que pueden usarse en el contexto de la presente divulgación incluyen, sin limitación, por ejemplo, formatos biespecíficos basados en scFv o de diacuerpo, fusiones IgG-scFv, dominio variable doble (DVD)-Ig, cuadroma, botones en ojales, cadena ligera común (por ejemplo, cadena ligera común con botones en ojales, etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)cuerpo, cremallera de leucina, Duocuerpo, lgG1/lgG2, Fab de acción doble (DAF, por sus siglas en inglés)-IgG y formatos biespecíficos de Mab2 (véase, por ejemplo, Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11, y las referencias citadas en el mismo, para una revisión de los formatos anteriores). También se pueden construir anticuerpos biespecíficos usando conjugación de péptido/ácido nucleico, por ejemplo, en donde se usan aminoácidos no naturales con reactividad química ortogonal para generar conjugados de anticuerpo específico de sitio-oligonucleótido que después se autoensamblan en complejos multiméricos con composición, valencia y geometría definidas. (Véase, por ejemplo, Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Publicación electrónica: 4 de diciembre de 2012]).

Adm inistración terapéutica y formulaciones

La divulgación proporciona composiciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos anti-GREM1 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente divulgación. La administración de composiciones terapéuticas de acuerdo con la divulgación se administrará con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan en las formulaciones para proporcionar una mejor transferencia, suministro, tolerancia y similares. Puede encontrarse una multitud de formulaciones adecuadas en el formulario conocido para todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Véase también Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

La dosis de anticuerpo puede variar dependiendo de la edad y la estatura de un sujeto a recibir la administración, la enfermedad diana, afecciones, vía de administración y similares. Cuando el anticuerpo de la presente divulgación se usa para tratar la fibrosis en un paciente adulto, o para tratar la hipertensión pulmonar, o para disminuir la gravedad de la enfermedad, es ventajoso administrar por vía intravenosa el anticuerpo de la presente divulgación, normalmente en una única dosis de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 100, de aproximadamente 10 a aproximadamente 90, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 70 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la intensidad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. En determinados aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la divulgación puede administrarse como una dosis inicial de al menos aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 800 mg, aproximadamente 1 a aproximadamente 500 mg, aproximadamente 5 a aproximadamente 300 mg, o aproximadamente 10 a aproximadamente 200 mg, hasta aproximadamente 100 mg, o hasta aproximadamente 50 mg. En determinados aspectos, la dosis inicial puede ir seguida de la administración de una segunda o una pluralidad de dosis posteriores del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en una cantidad que puede ser aproximadamente la misma o menor que la de la dosis inicial, en donde las dosis posteriores están separadas por al menos 1 día a 3 días; al menos una semana, al menos 2 semanas; al menos 3 semanas; al menos 4 semanas; al menos 5 semanas; al menos 6 semanas; al menos 7 semanas; al menos 8 semanas; al menos 9 semanas; al menos 10 semanas; al menos 12 semanas; o al menos 14 semanas.

Se conocen varios sistemas de suministro y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la divulgación, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero sin limitación, vías intradérmica, transdérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. La composición farmacéutica también puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase, por ejemplo, Langer (1990) Science 249:1527-1533).

El uso de nanopartículas para suministrar los anticuerpos de la presente divulgación también se contempla en el presente documento. Las nanopartículas conjugadas con anticuerpo pueden usarse tanto para aplicaciones terapéuticas como de diagnóstico. Las nanopartículas conjugadas con anticuerpo y los métodos de preparación y uso se describen en detalle por Arruebo, M., et al. 2009 ("Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications" in J. Nanomat. Volumen 2009, Artículo ID 439389, 24 páginas), doi: 10.1155/2009/439389). También se han descrito nanopartículas para el suministro de fármacos en, por ejemplo, los documentos US 8277812, US 8258256, US 8257740, US 8246995, US 8236330.

En determinadas situaciones, la composición farmacéutica puede suministrarse en un sistema de liberación controlada. En un aspecto, se puede usar una bomba. En otro aspecto, se pueden usar materiales poliméricos. En otro aspecto más, puede ubicarse un sistema de liberación controlada en las proximidades de la diana de la composición, siendo necesaria, por lo tanto, solo una fracción de la dosis sistémica.

Las preparaciones inyectables pueden incluir formas farmacéuticas para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse por métodos conocidos públicamente. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descrita anteriormente en un medio acuoso estéril o un medio oleoso usado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleoso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección preparada de este modo se carga preferentemente en una ampolla adecuada.

Una composición farmacéutica de la presente divulgación puede suministrarse por vía subcutánea o intravenosa con una aguja y jeringa convencionales. Además, con respecto al suministro subcutáneo, un dispositivo inyector de pluma tiene aplicaciones fácilmente en el suministro de una composición farmacéutica de la presente divulgación. Dicho dispositivo inyector de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo inyector de pluma reutilizable utiliza generalmente un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica dentro del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y remplazarse por un nuevo cartucho que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo inyector de pluma puede entonces reutilizarse. En un dispositivo inyector de pluma desechable, no hay cartucho reemplazable. Más bien, el dispositivo inyector de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, se desecha el dispositivo completo.

Numerosos dispositivos inyectores de pluma y autoinyectores reutilizables tienen aplicaciones en el suministro subcutáneo de una composición farmacéutica de la presente divulgación. Los ejemplos incluyen, aunque ciertamente sin limitación, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), pluma DlSETRONlC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma Bd ™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OpT iPEN PRO™, OPTlPEN STARLET™ y OpTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Los ejemplos de dispositivos inyectores de pluma desechables que tienen aplicaciones en el suministro subcutáneo de una composición farmacéutica de la presente divulgación incluyen, aunque ciertamente sin limitación, la pluma SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), la FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y la KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK ™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), el PENLET ™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), el EPIPEN (Dey, L.P.) y la pluma HUMIRA ™ (Abbott Labs, Abbott Park, IL), por nombrar solo algunos.

Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para su uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas farmacéuticas en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas farmacéuticas en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente contenida generalmente es de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma farmacéutica en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo anteriormente mencionado esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas farmacéuticas.

Usos terapéuticos de los anticuerpos

En determinados aspectos de la divulgación, los presentes anticuerpos son útiles para tratar una enfermedad o afección asociada con fibrosis o al menos un síntoma asociado con la enfermedad o afección, tal como tos persistente, disnea, pérdida de peso o pérdida del apetito, o para disminuir la gravedad de la enfermedad. En algunos aspectos, los anticuerpos pueden ser útiles para tratar una afección o síntoma de fibrosis en un estadio posterior de la enfermedad. Los anticuerpos de la divulgación también se contemplan para uso profiláctico en pacientes con riesgo de padecer fibrosis. Estos pacientes incluyen ancianos, o pacientes con antecedentes familiares, o pacientes inmunodeprimidos debido a una enfermedad o tratamiento con terapias inmunosupresoras, o pacientes que pueden tener una afección médica subyacente, tal como diabetes, que los predispone a la fibrosis, o pacientes que pueden estar predispuestos a fibrosis debido a elecciones de estilo de vida, como fumar o el abuso de alcohol. Se contempla que los anticuerpos de la divulgación se pueden usar solos o junto con un segundo agente o un tercer agente para tratar la fibrosis o para aliviar al menos un síntoma o complicación asociados con fibrosis, tal como pérdida de la función renal o de la función hepática asociada o resultante de la fibrosis. El segundo o tercer agentes pueden suministrarse simultáneamente con los anticuerpos de la divulgación, o pueden administrarse por separado, ya sea antes o después de los anticuerpos de la divulgación.

Los síntomas de los trastornos de fibrosis incluyen, pero sin limitación, tos seca, dificultad para respirar, pérdida de apetito, pérdida de peso, cansancio, náuseas, hinchazón y acumulación de líquido, daño hepático, insuficiencia hepática, hipertensión y pérdida de la función renal. Otros signos o síntomas incluyen, pero sin limitación, malestar general, falta de sueño o complicaciones tales como neumonía o infección del tracto urinario, hiperglucemia y proteinuria. Los anticuerpos de la presente divulgación pueden usarse para aliviar o prevenir o disminuir la gravedad de uno o más de los síntomas o afecciones enumerados anteriormente.

En determinados aspectos, los presentes anticuerpos son útiles para tratar una afección o indicación asociada con el cáncer, que incluyen, pero sin limitación, sarcoma o carcinoma de pulmón, ovario, riñón, mama, colon, páncreas y cuello uterino.

En determinados aspectos, se pueden usar uno o más anticuerpos de la presente divulgación solos o en combinación para bloquear la unión de GREM1 a heparina y/o la angiogénesis mediada por heparina.

En un aspecto adicional de la divulgación, los presentes anticuerpos se usan para la preparación de una composición farmacéutica para tratar pacientes que padecen fibrosis o cáncer, o un síntoma asociado con fibrosis o cáncer. En otro aspecto más de la divulgación, los presentes anticuerpos se utilizan para la preparación de una composición farmacéutica para reducir el daño tisular o para prevenir la degeneración progresiva o para proteger la función renal o la función hepática en la fibrosis. En un aspecto de la divulgación, los presentes anticuerpos se usan como terapia adjunta con cualquier otro agente útil para tratar fibrosis o cáncer, incluyendo un analgésico, un AINE, un fármaco antitumoral, quimioterapia, radioterapia, un glucocorticoide, un antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [por ejemplo, una "trampa de VEGF" tal como aflibercept u otra proteína de fusión inhibidora de VEGF como se establece en el documento US 7.087.411 o un anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, bevacizumab o ranibizumab)], un segundo anticuerpo contra GREM1, un anticuerpo contra GREM2 o una citocina inflamatoria tal como IL-1, IL-6 o TGF-p, o cualquier otra terapia paliativa conocida por los expertos en la materia.

Terapias de combinación

Las terapias de combinación pueden incluir un anticuerpo anti-GREMI de la divulgación y cualquier agente terapéutico adicional que pueda combinarse de manera ventajosa con un anticuerpo de la divulgación, o con un fragmento biológicamente activo de un anticuerpo de la divulgación.

Por ejemplo, se puede emplear un segundo o tercer agente terapéutico, tal como un agente antiinflamatorio no esteroideo (AINE) o un analgésico, para ayudar a aliviar los síntomas de la fibrosis tales como tos seca o dificultad para respirar. Un ejemplo de analgésico común es el paracetamol. Los AINE ilustrativos incluyen aspirina, ibuprofeno y naproxeno. El agente terapéutico adicional puede ser un antibiótico para tratar una complicación tal como una infección del tracto urinario. Los anticuerpos de la presente divulgación se pueden combinar con un agente antihipertensivo para ralentizar la aparición de fibrosis. Por ejemplo, para pacientes que padecen nefropatía diabética, los anticuerpos pueden combinarse con un tratamiento tal como los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina para reducir la presión arterial y proteger la función renal.

Los anticuerpos pueden usarse junto con otras terapias, tal como corticosteroides o suplementos nutricionales en el tratamiento de la fibrosis. Se ha descubierto que los fármacos antifibróticos tal como la pirfenidona producen remisiones sintomáticas duraderas y retrasan o detienen la progresión de la fibrosis. Esto es importante ya que dicho daño suele ser irreversible. Los antiinflamatorios y analgésicos mejoran el dolor, pero no previenen el daño tisular ni retrasan la progresión de la enfermedad. En algunos aspectos, se pueden usar segundos o terceros agentes terapéuticos para minimizar los síntomas clínicos tales como náuseas e hinchazón, así como prevenir el daño del tejido fibrótico. Un agente terapéutico adicional puede comprender la terapia con cortisona, por ejemplo, se puede usar una dosis baja de prednisona o prednisolona junto con uno o más anticuerpos de la presente divulgación en un plan de tratamiento a largo plazo para la fibrosis. El uso de uno o más anticuerpos dirigidos a una citocina tal como IL-1, IL-6 o el TGF-p en tratamientos de fibrosis también se contemplan dentro del alcance de la presente divulgación. Los anticuerpos de la presente divulgación se pueden combinar con agentes terapéuticos adicionales para minimizar o prevenir complicaciones tales como infección del tracto urinario, hiperglucemia o presión arterial.

Los anticuerpos de la presente divulgación también se pueden administrar en combinación con otras opciones de tratamiento para la fibrosis que incluyen fisioterapia, cambios en el estilo de vida (incluido el ejercicio y el control de peso), rehabilitación pulmonar, oxigenoterapia y cambios en la dieta. En formas avanzadas de fibrosis puede que se precise cirugía de trasplante de hígado, pulmones o riñones.

Los anticuerpos de la presente divulgación pueden combinarse sinérgicamente con uno o más fármacos contra el cáncer o terapia utilizada para tratar cáncer. Los ejemplos de fármacos y terapias contra el cáncer que se pueden usar incluyen, pero sin limitación, citotoxinas, agentes quimioterapéuticos, radiación y cirugía. En algunos aspectos, uno o más anticuerpos de la presente divulgación se pueden usar en combinación con un fármaco antiinflamatorio (por ejemplo, corticosteroides y antiinflamatorios no esteroideos), un anticuerpo contra un antígeno específico de tumores (por ejemplo, CA9, CA125, antígeno asociado a melanoma (MAGE, por sus siglas en inglés), antígeno carcinoembrionario (CEA, por sus siglas en inglés), vimentina, tumor-M2-PK, antígeno específico de la próstata (PSA, por sus siglas en inglés), MART-1 y CA19-9), un antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [por ejemplo, una "trampa de VEGF" tal como aflibercept u otra proteína de fusión inhibidora de VEGF como se establece en el documento US 7.087.411 o un anticuerpo anti-VEGF o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, bevacizumab o ranibizumab)], un suplemento dietético, tal como antioxidantes o cualquier cuidado paliativo para tratar el cáncer.

El componente o componentes terapéuticamente activos adicionales pueden administrarse antes de, simultáneamente con o después de la administración del anticuerpo anti-GREM1 de la presente divulgación. Para los fines de la presente divulgación, dichos regímenes de administración se consideran la administración de un anticuerpo anti-GREM1 "en combinación con" un segundo componente terapéuticamente activo.

Usos de diagnóstico de los anticuerpos

Los anticuerpos anti-GREM1 de la presente divulgación también pueden usarse para detectar y/o medir GREM1 en una muestra, por ejemplo, a efectos de diagnóstico. Se prevé que se pueda usar uno cualquiera o más de los anticuerpos de la divulgación para detectar la gravedad del daño tisular en la fibrosis. Los ensayos de diagnóstico ilustrativos para GREM1 pueden comprender, por ejemplo, poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti-GREM1 de la divulgación, en donde el anticuerpo anti-GREM1 está marcado con un marcador detectable o molécula indicadora o se usa como un ligando de captura para aislar selectivamente GREM1 de las muestras de pacientes. Como alternativa, puede usarse un anticuerpo anti-GREM1 no marcado en aplicaciones de diagnóstico en combinación con un anticuerpo secundario que está marcado de forma detectable por sí mismo. El marcador detectable o molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I; un resto fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como una fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante o luciferasa. Los ensayos ilustrativos específicos que pueden usarse para detectar o medir GREM1 en una muestra incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés).

Las muestras que pueden usarse en ensayos de diagnóstico de GREM1 de acuerdo con la presente divulgación incluyen cualquier muestra de tejido o fluido que se puede obtener de un paciente, que contiene cantidades detectables de proteína GREM1, o fragmentos de la misma, en condiciones normales o patológicas. Generalmente, se medirán los niveles de GREM1 en una muestra particular obtenida de un paciente sano (por ejemplo, un paciente no afectado por fibrosis) para establecer un nivel de GREM1 inicial o patrón. Este nivel inicial de GREM1 a continuación puede compararse con los niveles de GREM1 medidos en muestras obtenidas de individuos de los que se sospecha que tienen una afección relacionada con fibrosis o síntomas asociados con dicha afección.

Los anticuerpos específicos de GREM1 pueden no contener marcadores o restos adicionales, o pueden contener un marcador o resto aminoterminal o carboxiterminal. En un aspecto, el marcador o resto es biotina. En un ensayo de unión, la ubicación de un marcador (si lo hay) puede determinar la orientación del péptido con respecto a la superficie sobre la que se une el péptido. Por ejemplo, si una superficie está recubierta con avidina, un péptido que contiene una biotina aminoterminal se orientará de manera que la porción carboxiterminal del péptido estará distal a la superficie. En algunos aspectos, el marcador puede ser un marcador detectable, tal como un radionúclido, un colorante fluorescente o un marcador detectable por MRI. Los marcadores detectables pueden unirse a los anticuerpos en donde dichos anticuerpos pueden usarse en ensayos de obtención de imágenes. Los métodos que utilizan ensayos de obtención de imágenes pueden ser útiles para el diagnóstico y pronóstico de la fibrosis, o para controlar la actividad fibrótica.

Los aspectos de la divulgación se refieren al uso de los anticuerpos divulgados como marcadores para predecir el pronóstico de fibrosis en pacientes. Se ha descubierto que GREM1 está aumentado en tejidos fibróticos en, por ejemplo, pulmón o hígado o riñones. Los niveles elevados de GREM1 se han correlacionado con nefropatía diabética o hipertensión pulmonar y podrían usarse para evaluar el pronóstico de los pacientes. Los anticuerpos de la presente divulgación pueden usarse en ensayos de diagnóstico para evaluar el pronóstico de la enfermedad fibrótica en un paciente y predecir la supervivencia.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completas de cómo preparar y usar los métodos y las composiciones de la invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los presentes inventores consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.

Ejemplo 1. Generación de anticuerpos humanos contra GREM1 humana

En determinados aspectos, el inmunógeno puede ser un péptido del extremo aminoterminal o carboxiterminal de GREM1 humana. En determinados aspectos de la divulgación, el inmunógeno es la proteína madura de GREM1 humana que varía desde aproximadamente los restos de aminoácidos 25-184 de la SEQ ID NO: 594. En un aspecto, los anticuerpos de la divulgación se obtuvieron de ratones inmunizados con GREM1 humana recombinante de longitud completa.

En determinados aspectos, los anticuerpos que se unen específicamente a GREM1 humana se pueden preparar utilizando fragmentos de las regiones anteriormente mencionadas o péptidos que se extienden más allá de las regiones designadas en aproximadamente 5 a aproximadamente 20 restos de aminoácidos de cualquiera, o ambos, extremos amino o carboxiterminales de las regiones descritas en el presente documento. En determinados aspectos, se puede usar cualquier combinación de las regiones mencionadas anteriormente o fragmentos de las mismas en la preparación de anticuerpos específicos de GREM1. En determinados aspectos, se puede usar uno cualquiera o más de los dominios de hGREM1 indicados anteriormente, o fragmentos de los mismos, para preparar anticuerpos monoespecíficos, biespecíficos, o multiespecíficos (véase el ejemplo 8 a continuación para más detalles).

Las proteínas de longitud completa, o fragmentos de las mismas, que se usaron como inmunógenos, como se indica anteriormente, se administraron directamente, con un adyuvante para estimular la respuesta inmunitaria, a un ratón VELOCIMMUNE® que comprende ADN que codifica las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana. La respuesta inmunitaria de anticuerpos se controló mediante un inmunoensayo específico deGREM1. Cuando se logró una respuesta inmunitaria deseada, se recogieron los esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad y formar líneas celulares de hibridoma. Las líneas celulares de hibridoma se cribaron y seleccionaron para identificar líneas celulares que producían anticuerpos específicos de GREM1. Utilizando esta técnica y los diversos inmunógenos descritos anteriormente, se obtuvieron varios anticuerpos anti-GREM1quiméricos, así como con reactividad cruzada, (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón); los anticuerpos ilustrativos generados de esta manera se denominaron H1M2907N, H2M2780N, H2M2782N, H2M2783N, H4H2783N2, H2M2784N, H2M2785N, H2M2786N, H2M2889N, H2M2890N, H2M2891N, H2M2892N, H2M2895N, H2M2897N, H2M2898N, H2M2899N, H2M2901N, H2M2906N, H2M2926N, H3M2788N y H3M2929N.

También se aislaron anticuerpos anti-GREM1 directamente de linfocitos B positivos a antígeno sin fusión a células de mieloma, tal como se describe en el documento U.S. 2007/0280945A1. Usando este método, se obtuvieron varios anticuerpos anti-GREM1 completamente humanos (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes humanos); los anticuerpos ilustrativos generados de esta manera se denominaron del siguiente modo: H4H6232P, H4H6233P, H4H6236P, H4H6238P, H4H6240P, H4H6243P, H4H6245P, H4H6246P, H4H6248P, H4H6250P, H4H6251P, H4H6252S, H4H6256P, H4H6260P, H4H6269P y H4H6270P.

Determinadas propiedades biológicas de los anticuerpos ilustrativos generados de acuerdo con los métodos de este ejemplo se describen en detalle en los ejemplos que se exponen a continuación.

Ejemplo 2. Secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y ligera

La tabla 1 expone las parejas de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y ligera de anticuerpos específicos para GREM1 humana seleccionados y sus identificadores de anticuerpo correspondientes. Los anticuerpos se denominan normalmente en el presente documento según la siguiente nomenclatura: prefijo Fc (por ejemplo, "H4H", "H1M, "H2M"), seguido por un identificador numérico (por ejemplo, "2907" como se muestra en la tabla 1), seguido por un sufijo "P" o "N". Por tanto, según esta nomenclatura, un anticuerpo puede denominarse, por ejemplo, "H1H2907". Los prefijos H4H, H1M y H2M en las denominaciones de anticuerpo usadas en el presente documento indican la región Fc particular del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H2M" tiene una Fc de IgG2 de ratón, mientras que un anticuerpo "H4H" tiene una Fc de IgG4 humana. Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo H1M o H2M puede convertirse en un anticuerpo H4H, y viceversa, pero, en cualquier caso, los dominios variables (incluyendo las CDR), los cuales se indican por los identificadores numéricos mostrados en la tabla 1, seguirán siendo los mismos. Anticuerpos que tienen la misma designación numérica de anticuerpo, pero que se diferencian por un sufijo de letra de N, B o P se refieren a anticuerpos que tienen cadenas pesadas y ligeras con secuencias CDR idénticas, pero con variaciones de secuencia en las regiones que están fuera de las secuencias CDR (es decir, en las regiones marco). Por tanto, N, B y P de un anticuerpo particular tienen secuencias CDR idénticas dentro de sus regiones variables de cadena pesada y ligera, pero difieren entre sí dentro de sus regiones marco.

Tabla 1

Ejemplo 3. Análisis de utilización de genes variables

Para analizar la estructura de los anticuerpos producidos, los ácidos nucleicos que codifican las regiones variables del anticuerpo se clonaron y secuenciaron. A partir de la secuencia del ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos predicha de los anticuerpos, se identificó el uso génico para cada región variable de cadena pesada (HCVR) y región variable de cadena ligera (LCVR). La Tabla 2 muestra el uso génico para anticuerpos seleccionados de acuerdo con la divulgación.

Tabla 2

continuación

Ejemplo 4. Unión de anticuerpos a GREM1 humana determinada mediante resonancia de plasmón superficial

Las constantes de velocidad de unión asociativa y disociativa (ka y kd, respectivamente) y las constantes de disociación de equilibrio calculadas y las semividas disociativas (K ^d y t /2, respectivamente) para la unión de antígenos a anticuerpos anti-Gremlin1 (GREM1) purificados se determinaron usando un ensayo de biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real (Biacore T200) a 25 °C y a 37 °C.

Los anticuerpos anti-GREM1 se capturaron en una superficie de anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de ratón (GE Healthcare, número BR-1008-38) o de anticuerpo monoclonal de ratón anti-IgG humana (GE Healthcare, número BR-1008-39) creada a través de acoplamiento de amina directo a un chip sensor CM5 Biacore. Los experimentos cinéticos se llevaron a cabo utilizando h Bs -EP heparina [HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % (v/v), 10 |jg/ml de sal sódica de heparina, pH 7,4] como tanto tampón de ejecución como tampón de muestra.

Las velocidades de asociación antígeno-anticuerpo se midieron inyectando varias concentraciones (que varían de 11 a 100 nM, diluciones de 3 veces) de GREM1 humana (hGREM1-His; SEQ ID NO: 595) sobre la superficie del anticuerpo anti-GREM1 capturado. Se monitorizó la asociación antígeno-anticuerpo durante 150 segundos mientras que se monitorizó la disociación en tampón durante 420 segundos. El análisis cinético se realizó utilizando el programa informático Scrubber versión 2.0a o el programa informático de evaluación Biacore T200 v1.0 para determinar los valores de ka y kd. KD y t /2 se calcularon después a partir de los valores de ka y kd experimental como K^d = kd/ ka y t1/2 = In (2)/kd.

Como se muestra en la tabla 3, treinta y cinco anticuerpos anti-GREM1, cuando se capturaron en el sensor Biacore, mostraron unión a la proteína hGREM1-His inyectada sobre la superficie a 25 °C, con valores de Kd que varían desde

625 pM a 270 nM. Dos de los anticuerpos probados, H2aM2898N y H2bM2785N, no se unieron a hGREM1-His en estas condiciones experimentales. Se volvió a probar un subconjunto de los 37 anticuerpos anti-GREM1 a 37 °C.

Como se muestra en la tabla 4, veinticuatro anticuerpos anti-GREM1, cuando se capturaron en el sensor Biacore, mostraron unión a la proteína hGREM1-His inyectada sobre la superficie a 37 °C, con valores de K ^d que varían desde

1,23 nM a 275 nM.

Tabla 3: Afinidades de Biacore a 25 °C por la unión de hGREM1-His a anticuerpos monoclonales anti-GREMI r

Tabla 4: Afinidades de Biacore a 37 °C por la unión de hGREM1-His a anticuerpos monoclonales anti-GREM1 ca turados

continuación

Ejemplo 5. Determinación de la actividad inhibidora de GREM1 de los anticuerpos anti-hGREM1

Para caracterizar aún más los anticuerpos anti-Gremlin 1 (GREM1) humana, se examinó su capacidad para bloquear la unión de GREM1 a la proteína morfogenética ósea humana 4 (BMP4) mediante ELISA. Las placas se recubrieron con BMP4 humana recombinante (2 ug/ml) (hBMP4; R&D, número 314-BP/CF, restos S293-R408 del número de registro Q53XC5, expresado en células NS0) durante la noche y después se incubaron diluciones en serie de anticuerpos con una cantidad constante (100 pM) de proteína GREM1 humana recombinante (hGREM1-His; SEQ ID NO: 595) modificada con una etiqueta de biotina durante 1 hora a 25 °C antes de que este complejo se añadiera a las placas recubiertas y se dejara incubar durante una hora más a 25 °C. A continuación, se lavaron las placas y se detectó biotina-hGREM1-His unida a la placa con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (Pierce, número N200). A continuación, las placas se revelaron con una solución de TMB (BD Biosciences, número 555214) para producir una reacción colorimétrica y la reacción se inactivó mediante acidificación con ácido sulfúrico antes de leer la absorbancia a 450 nm en un lector de placas PerkinElmer Victor X5. El análisis de los datos usó un modelo de dosisrespuesta sigmoideo dentro del programa informático Prism™. El valor de CI50 calculado, definido como la concentración de anticuerpos necesaria para alcanzar el 50 % del bloqueo máximo, se usó como indicador de la potencia de bloqueo. El valor de CI50 de varias muestras se indicó a un valor límite inferior fijo de 2,5E-11 M, que representa el límite inferior teórico de este ensayo, dada la concentración fija de biotina-hGREM1-His utilizada en el ensayo. El porcentaje de bloqueo se calculó como la relación de la reducción de la señal observada en presencia de anticuerpo en relación con la diferencia entre la señal con GREM1 sola y el fondo (señal del anticuerpo secundario conjugado con HRP solo). La absorbancia medida para la concentración constante de 100 pM de biotina-hGREM1-His sola se define como 0 % de bloqueo y la absorbancia medida sin GREM1 añadida se define como 100 % de bloqueo. Se utilizaron los valores de absorbancia de los pocillos que contenían la concentración más alta para cada anticuerpo para determinar el porcentaje de bloqueo máximo. Los 24 anticuerpos anti-GREM1 probados en este ensayo bloquearon biotina-hGREM1-His con valores de CI50 que varían desde <25 pM a 1,9 nM. A una concentración de 20 nM de anticuerpo, los 24 anticuerpos mostraron de 42 a 96 por ciento de bloqueo de la unión de biotina-hGREM1-His a hBMP4.

Tabla 5: Anticuerpos anti-GREM1 que bloquean la unión de la proteína morfogénica ósea 4 (hBMP4) a biotina-hGREM1-His

continuación

Ejemplo 6. Efecto de GREM1 sobre la señalización de BMP4

Gremlin 1 (GREM1) es un regulador negativo de la señalización de las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) (Walsh et al. 2010). Las BMP pertenecen a la superfamilia TGF-p y están implicadas en la regulación de muchos procesos fisiológicos, incluida la proliferación, diferenciación y determinación del destino celular durante el desarrollo embrionario y posnatal (Hogan, 1996). La activación de los receptores de BMP da lugar a la fosforilación de proteínas SMAD y la activación transcripcional de genes sensibles a BMP. GREM1 se une a BMP2, BMP4 y BMP7 y bloquea la unión a sus receptores. Se desarrolló un bioensayo para detectar la regulación de la señalización de BMP4 por GREM1 en una línea celular de mamífero, W-20-17, una línea de células del estroma de médula ósea de ratón que previamente se demostró que es sensible a BMP2 (Thies et al. 1992). Esta línea celular se modificó para expresar de manera estable un indicador de luciferasa sensible a BMP. La línea celular estable resultante (células W-20-17/BRE-luc) se aisló y se mantuvo en suero bovino fetal al 10 %, DMEM, NEAA, penicilina/estreptomicina y 200 pg/ml de G418.

Para el bioensayo, las células W-20-17/BRE-luc se sembraron en placas de ensayo de 96 pocillos a 10.000 células/pocillo y se incubaron a 37 °C y CO2 al 5 % durante la noche. El día siguiente, se diluyó en serie BMP4 humana recombinante (hBMP4; R&D, número 314-BP/CF, restos S293-R408 del número de registro Q53XC5, expresada en células NS0) a 1:3 y se añadió a las células partiendo desde 100 nM hasta 0,002 nM, sin incluir el control de hBMP4 para la respuesta a la dosis. Para la inhibición de hBMP4 por GREM1, se diluyó en serie GREM1 humana recombinante (hGREM1-His; etiquetada con 10His carboxiterminal, R&D, número 5190-GR, restos K25-D184 del número de registro O60565, expresada en células NS0) a 1:2 partiendo de 400 nM a 0,4 nM sin incluir el control de hGREM1-His y se añadió a las células junto con hBMP4 200 pM o 100 pM. Para la inhibición de hGREM1-His, los anticuerpos se diluyeron en serie a 1:3 partiendo de 100 nM a 0,002 nM sin incluir control de anticuerpo y se añadieron a las células junto con hBMP4 y hGREM1-His a concentraciones finales de 200 pM y 20 nM o 100 pM y 10 nM, respectivamente. La actividad luciferasa se detectó después de 5,5 horas de incubación a 37 °C y CO2 al 5 %.

Treinta y cuatro de los 36 anticuerpos anti-GREM1 probados en el bioensayo W-20-17/BRE-luc bloquearon completamente la inhibición de hGREM1-His de la señalización de hBMP a hGREM1-His 10 nM y hBMP4 100 pM o hGREM1-His 20 nM y hBMP4200 pM. Un anticuerpo, H4H2780N, mostró un bloqueo parcial de hGREM1-His y otro anticuerpo, H4H6269P, no inhibió hGREM1-His. También se incluyeron anticuerpos de control de isotipo (mAb1 de control y mAb2 de control). Los valores de CI50 se muestran en las tablas 6 y 7. hBMP4 activó las células W-20-17/BRE-luc con valores de CE50 de 39 a 116 pM. hGREM1-His inhibió hBMP4 200 pM con un valor de CI50 de 10,3 nM y hBMP4 100 pM con un valor de CI50 de 2,9 - 6,0 nM.

Tabla 6 Inhi i i n h REM-Hi r n i r n i- REM1 h m n n n n n células

Tabla 7: Inhi i i n h REM-Hi r n i r n i- REM1 h m n n n n n células

Ejemplo 7. Efecto de anti-GREM1 sobre la señalización de BMP y la diferenciación celular

Para determinar la potencia de los anticuerpos anti-Gremlin 1 humana (GREM1), se investigó su capacidad para bloquear la inhibición inducida por GREM1 de la señalización de la proteína morfogenética ósea 4 (BMP4). Las células W-20-17 son una línea celular progenitora de osteoblastos y pueden diferenciarse en respuesta a la señalización de BMP4. GREM1, un inhibidor de BMP conocido, bloquea esta diferenciación. El bloqueo de GREM1 da como resultado una inversión de la inhibición de BMP4 en este ensayo. La diferenciación se puede medir colorimétricamente utilizando un sustrato para detectar la expresión endógena de fosfatasa alcalina, un marcador temprano de diferenciación de osteoblastos. Se analizaron un total de 24 anticuerpos anti-GREM1.

Las células W-20-17 se cultivaron en DMEM/suero bovino fetal al 10 %/glutamina/penicilina/estreptomicina (medio completo) hasta una confluencia del 100 % a 37 °C en CO2 al 5 %. Las células se lavaron en PBS 1X, tripsinizado (tripsina que contiene EDTA), en placas a 3000 células/pocillo en placas de plástico transparente de 96 pocillos, y se cultivaron durante la noche en medio completo a un volumen de 100 ul/pocillo. Al día siguiente, se mezcló proteína GREM1 humana recombinante (hGREM1-His; etiquetada con 10His carboxiterminal, R&D, número 5190-GR, restos K25-D184 del número de registro O60565, expresada en células NS0) con anticuerpos anti-GREM1 en medio completo y se incubó a temperatura ambiente (TA) durante 40 minutos. Se añadió BMP4 humana recombinante (hBMP4; R&D, número 314-Bp /CF, restos S293-R408 del número de registro Q53XC5, expresada en células NS0), también diluida en medio completo, a las mezclas de anticuerpos hGREM1-His/GREM1 y después se incubó a TA durante 30 minutos adicionales. Después de la incubación, se añadieron 50 ul de estas mezclas a células W-20-17 sembradas en 100 ul de medio completo. La concentración final de hBMP4 y hGREM1-His en células W-20-17 en cada pocillo fue de 1,5 nM y 6 nM, respectivamente, y la concentración de anticuerpos varió a lo largo de una serie de diluciones de 11 puntos y 2 veces (concentración máxima de anticuerpos de 200 nM). Después de 3 días de cultivo a 37 °C en CO2 al 5 %, se aspiró el medio y se añadieron 50 ul de agua a cada pocillo. Se congelaron placas de noventa y seis pocillos a -80 °C durante 2 horas y después se descongelaron en hielo. Se midió la fosfatasa alcalina usando sustrato de p-nitrofenil fosfato preparado como se indica (Sigma, número N2770-50SET). Se midió la absorbancia a 405 nm en un lector de placas Victor siete minutos después de la adición de 50 ul de sustrato. Los gráficos se representaron en Prisma como media /- SEM (4 réplicas para cada condición).

Veintidós de los 24 anticuerpos anti-GREM1 probados bloquearon la inhibición de hBMP4 por hGREM1-His en este ensayo con valores de CI50 como se muestra en la tabla 8. Dos anticuerpos, H4H6269P y H4H2780N, no mostraron ningún bloqueo medible de la actividad de hGREM1-His en este ensayo.

Tabla 8: s W-20-17

Actividad de hBMP4 y hGREM1-His en el ensayo de diferenciación de células W-20-17:

Ejemplo 8. Generación de un anticuerpo biespecífico

Se generan varios anticuerpos biespecíficos para usar en la práctica de los métodos de la divulgación. Por ejemplo, los anticuerpos específicos de hGREM1 se generan en un formato biespecífico (un "biespecífico") en el que las regiones variables que se unen a regiones distintas de hGREM1 se unen para conferir especificidad de dominio doble dentro de una sola molécula de unión. Los biespecíficos adecuadamente diseñados pueden potenciar la eficacia inhibidora general de GREM1 al aumentar tanto la especificidad como la avidez de unión. Las regiones variables con especificidad para regiones individuales o epítopos de GREM1 se emparejan en un armazón estructural que permite que cada región se una simultáneamente a los epítopos separados. En un ejemplo de un biespecífico, las regiones variables de cadena pesada (V^h) de un aglutinante con especificidad para una región se recombinan con regiones variables de cadena ligera (V^l) a partir de una serie de aglutinantes con especificidad para una segunda región para identificar parejas V^l no afines que se pueden emparejar con una V^h original sin alterar la especificidad original para esa V^h. De esta manera, un único segmento V^l (por ejemplo, V^l1) se puede combinar con dos dominios V^h diferentes (por ejemplo, V^h1 y V^h2) para generar un biespecífico comprendido por dos "brazos" de unión (V^h1-V^l1 y V^h2-V^l1). El uso de un solo segmento V^l reduce la complejidad del sistema y, por lo tanto, simplifica y aumenta la eficacia en los procesos de clonación, expresión y purificación utilizados para generar el biespecífico (véanse, por ejemplo, los documentos US 2011-0195454 A1 y US2010/0331527).

Como alternativa, pueden prepararse anticuerpos que se unen a GREM1 y una segunda diana, tales como, pero sin limitación, por ejemplo, un segundo anticuerpo anti-GREM1 diferente, o un fármaco específico para fibrosis, en un formato biespecífico usando técnicas descritas en el presente documento, u otras técnicas conocidas por los expertos en la materia. Las regiones variables de anticuerpo que se unen a regiones de dominio catalítico distintas pueden unirse junto con regiones variables que se unen a sitios relevantes en, por ejemplo, el dominio del péptido señal, para conferir especificidad de antígeno doble dentro de una única molécula de unión. Los biespecíficos adecuadamente diseñados de esta naturaleza cumplen una doble función. Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo biespecífico que se une a ambos dominios, uno puede ser capaz de neutralizar mejor ambos dominios al mismo tiempo, sin necesidad de administrar una composición que contenga dos anticuerpos separados. Las regiones variables con especificidad para el dominio extracelular se combinan con una región variable con especificidad para el dominio de péptido señal y se emparejan en un armazón estructural que permite que cada región variable se una a los antígenos separados.

Ejemplo 9. Inhibición de la interacción de unión de GREMI-heparina utilizando anticuerpos específicos de GREM1

En el presente estudio, se utilizó interferometría de biocapa para confirmar los resultados anteriores que mostraban la unión de GREM1 a heparina y para evaluar la capacidad de los anticuerpos monoclonales específicos de GREM1 para interferir con esta interacción de unión. También se probaron GREM1 y otras proteínas que contienen nudos de cisteína estructuralmente relacionadas, incluidas GREM2 y cerberus, para determinar su capacidad para unirse a heparina. Usando estas observaciones, los restos de aminoácidos implicados en la unión de GREM1 a heparina se formularon como hipótesis comparando las secuencias y las propiedades de unión a heparina conocidas de otras proteínas de la familia DAN que contienen nudos de cisteína. La unión de GREM1 a heparina se sometió a competición por diferentes GAG, incluyendo heparina, HS y dermatán sulfato (DS) en diversos grados, demostrando la especificidad de la interacción. Por último, se probó la capacidad de los anticuerpos individuales para interferir con la unión de GREM1 a heparina. De los veinticuatro anticuerpos probados, se demostró que cuatro afectan parcialmente aspectos de esta interacción de unión. En un intento de bloquear completamente la interacción, los cuatro anticuerpos que promovían el bloqueo parcial de la interacción de unión de GREM1 y heparina cuando se probaron solos se probaron en combinación. Algunas de las combinaciones, incluidas tres de los anticuerpos y la mezcla que contenía los cuatro anticuerpos, pudieron inhibir completamente la interacción de unión de GREM1 y heparina. Estos resultados dan más información sobre la mecánica de unión de GREM1 y heparina y demuestran un posible método que utiliza combinaciones de anticuerpos para inhibir la interacción angiogénica de GREM1 con HS para el tratamiento terapéutico.

Reactivos e instrumentación

Se obtuvo GREM1 humana recombinante sin vehículo con una etiqueta de decahistidina carboxiterminal de R&D Systems (Minneapolis, MN). La sal sódica de heparina-biotina de la mucosa intestinal porcina y la sal sódica de heparina de la mucosa intestinal porcina se obtuvieron de Millipore (Billerica, MA). La sal sódica de heparán sulfato (HS) de la mucosa intestinal porcina y la sal sódica de dermatán sulfato (DS) de la mucosa intestinal porcina se obtuvieron de Celsus (Cincinnati, Ohio).

Las medidas de unión se realizaron utilizando un instrumento de interacción biomolecular sin marcador Octet Red96 (ForteBio). Todos los experimentos se realizaron a 25 °C usando placa de agitación a 1000 rpm. Las soluciones se prepararon en un tampón acuoso que contenía HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, P20 al 0,05 %, 0,1 mg/ml de BSA y ajustadas a pH 7,4 (tampón HBST).

Cinética de unión de GREM1 que interactúa con heparina capturada

Se cargaron biosensores de súper estreptavidina con soluciones de heparina-biotina 10 pg/ml durante 90 segundos. Después de un lavado de 120 segundos, los biosensores con heparina capturada se sumergieron en pocillos que contenían soluciones de GREM1 11,1 nM, 33,3 nM, 100 nM y 300 nM para medir la asociación durante 240 segundos. A continuación, los biosensores se sumergieron en tampón HBST para medir la disociación durante 240 segundos. Las constantes de velocidad de asociación y disociación medidas (kon = 1,17 x 106 M 'V y koff = 3,27 x 10'3 s_1) demuestran que GREM1 se une a heparina con alta afinidad (KD = koff/kon = 2,8 x 10'9 M).

Inhibición de la unión de GREM1 a heparina capturada por glucosaminoglucanos

Se cargaron biosensores de súper estreptavidina con soluciones de heparina-biotina 10 pg/ml durante 90 segundos. Después de un lavado de 120 segundos, los biosensores con heparina capturada se sumergieron en pocillos que contenían una solución de GREM1 100 nM mezclada previamente con concentraciones crecientes (0 nM, 20 nM, 100 nM, 2 pM) de heparina, heparán sulfato (HS) o dermatán sulfato (DS) para medir la asociación durante 240 segundos.

GREM1 mostró una unión reducida a heparina-biotina capturada en presencia de concentraciones crecientes de heparina, HS y DS, como se refleja en las señales de unión observadas después de 240 segundos de asociación (tabla 9). La heparina añadida exógenamente fue más eficaz en el bloqueo de la unión de GREM1 100 nM a heparinabiotina capturada, mostrando inhibición completa a 100 nM. Se observó una inhibición casi completa de la unión de GREM1 a heparina-biotina capturada cuando se mezcló GREM1 con 2 pM de HS y DS. La inhibición completa de la unión de GREM1 100 nM a heparina-biotina capturada con heparina soluble a 100 nM respalda la especificidad de esta unión. La inhibición parcial con los otros glucosaminoglucanos, que están todos cargados negativamente, sugiere que las interacciones electrostáticas pueden ser importantes en la interacción de unión de GREM1-heparina.

T l Ef l l min l n l l n l in r i n ni n REM1-h rin

Inhibición de la unión de GREM1 a anticuerpos monoclonales específicos de GREM1 por heparina

Se cargaron por separado biosensores de captura de Fc anti-IgG humana (ForteBio) con soluciones de 50 |jg/ml de 24 anticuerpos anti-GREMI diferentes durante 60 segundos. Después de un lavado de 30 segundos, se sumergieron biosensores duplicados para cada anticuerpo en pocilios que contenían soluciones de GREM1 100 nM o soluciones de GREM1 100 nM que contenían 5 jM de heparina, midiendo la asociación durante 300 segundos. La presencia o ausencia de heparina para algunos de los anticuerpos influyó en la velocidad de asociación, y este efecto se resume en la tabla 10 donde se proporcionan las señales observadas tanto a los 30 segundos como a los 300 segundos. La unión de los anticuerpos h 4h 2895N, H4H2780N, H4H6269P y H4H2892N a GREM1 se vio mínimamente afectada por la presencia de heparina (las señales de unión a los 30 segundos se redujeron en 0,05 nm o menos). La unión de ocho anticuerpos (H4H2897N, H4H6252P, H4H6245P, H4H6251P, H4H6232P, H4H2783N2, H4H6236P y H4H6243P) mostró la mayor reducción en la unión a GREM1 en presencia de heparina (las señales de unión se redujeron en 0,19 nm o más a los 30 segundos). Los otros anticuerpos probados mostraron niveles intermedios de inhibición de la unión a GREM1 en presencia de heparina.

Tabla 10: Efecto inhibidor de los glucosaminoglucanos solubles sobre las interacciones de unión GREM1-anticuer o

Inhibición de la unión de GREM1 a heparina mediante combinaciones de anticuerpos contra GREM1

Se cargaron biosensores de súper estreptavidina con soluciones de 10 jg/m l de heparina-biotina durante 60 segundos.

Después de un lavado de 30 segundos, los biosensores se sumergieron en soluciones con GREM1 separadas, conteniendo cada una las 15 posibles combinaciones de cuatro anticuerpos (H4H2783N2, H4H2897N, H4H6243P, H4H6245P) elegidos del grupo en el experimento anterior que mostró la inhibición más fuerte de la unión de GREM1-heparina cuando se probaron solos. Las mezclas incluían anticuerpos individuales y combinaciones de dos, tres o cuatro anticuerpos. Cada anticuerpo tenía una concentración de 600 nM en las mezclas. También se incluyeron un anticuerpo de control de isotipo negativo que se sabe que no se une a GREM1, dos anticuerpos (H4H2892N y H4H2780N) cuya unión a GREM1 se vio mínimamente afectada por la presencia de heparina y la condición de referencia de GREM1 sola. Como se muestra en la tabla 11, los anticuerpos individuales redujeron solo parcialmente la unión de GREM1 a la heparina capturada en este formato de unión. Las combinaciones de anticuerpos redujeron la unión de GREM1 a heparina capturada de manera más eficaz. La solución que contenía H4H2897N, H4H6243P y H4H6245P y la solución que contenía los cuatro anticuerpos inhibieron completamente la unión de GREM1 a la heparina capturada.

La interacción de unión de GREM1 y heparina se inhibió por completo utilizando combinaciones de anticuerpos que se identificaron individualmente como eficaces para interferir parcialmente con esta interacción de unión. Dada la naturaleza altamente cargada negativamente de la heparina, los resultados sugieren que la heparina se une a GREM1 en múltiples restos superficiales cargados positivamente en GREM1. Con esta perspectiva, se propone que para inhibir completamente la interacción de unión de HS inductora de angiogénesis y GREM1, se requieren múltiples anticuerpos que tengan diversos epítopos superpuestos con múltiples sitios de unión a heparina en la estructura de GREM1.

Tabla 11: Efecto inhibidor de los anticuerpos específicos de GREM1 sobre la interacción de unión de REM1-h rin

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a gremlin-1 (GREM1) humana y bloquea la inhibición de la señalización de proteínas morfogenéticas óseas (BMP) mediada por GREM1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende seis regiones determinantes de la complementariedad HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, que comprenden, respectivamente, las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4-6-8-12-14-16; 36-38-40­ 44-46-48; 68-70-72-76-78-80; 84-86-88-92-94-96; 116-118-120-124-126-128; 132-134-136-140-142-144; 148-150­ 152-156-158-160; 164-166-168-172-174-176; 180-182-184-188-190-192; 196-198-200-204-206-208; 212-214-216­ 220-222-224; 244-246-248-252-254-256; 260-262-264-268-270-272; 276-278-280-284-286-288; 292-294-296-300­ 302-304; 308-310-312-316-318-320; 324-326-328-332-334-336; 340-342-344-348-350-352; 356-358-360-364-366­ 368; 372-374-376-380-382-384; 388-390-392-396-398-400; 404-406-408-412-414-416; 420-422-424-428-430-432; 436-438-440-444-446-448; 452-454-456-460-462-464; 468-470-472-476-478-480; 484-486-488-492-494-496; 500­ 502-504-508-510-512; 516-518-520-524-526-528; 532-534-536-540-542-544; 548-550-552-556-558-560; y 580-582­ 584-588-590-592.

2. El anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo bloquea la unión de GREM1 a la proteína morfogenética ósea - 2 (BMP2) o BMP4.

3. El anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo bloquean la unión de GREM1 a BMP4.

4. El anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que se une específicamente a GREM1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo muestra una o más propiedades seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) se une a GREM1 a 37 °C con una constante de disociación de unión en equilibrio (K^d) de menos de 275 nM, medida por resonancia de plasmón superficial;

(b) se une a GREM1 a 37 °C con una semivida disociativa (t1^ ) superior a 3 minutos, medida por resonancia de plasmón superficial;

(c) se une GREM1 a 25 °C con una K^d de menos de 280 nM, medida por resonancia de plasmón superficial; (d) se une a GREM1 a 25 °C con una t1^ superior a 2 minutos, medida por resonancia de plasmón superficial; y (e) bloquea la unión de GREM1 a BMP4 con una CI50 de menos de 1,9 nM, medida en un ensayo ELISA de competición a 25 °C.

5. El anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada/región variable de cadena ligera (HCVR/LCVR) seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 34/42, 66/74, 82/90, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 370/378, 386/394, 402/410, 418/426, 434/442, 450/458, 466/474, 482/490, 498/506, 514/522, 530/538, 546/554 y 578/586.

6. El anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 comprenden, respectivamente, las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 436-438-440-444-446-448.

7. El anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 6, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de las SEQ ID NO: 434/442.

8. El anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 comprenden, respectivamente, las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 132-134-136-140-142-144 o 548-550-552-556-558-560.

9. El anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 8, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de las SEQ ID NO: 130/138 o 546/554.

10. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a GREM1 según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

11. Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 3 para su uso en un método para tratar fibrosis pulmonar idiopática, comprendiendo dicho método administrar una cantidad eficaz del anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o composición a un paciente que lo necesita.

12. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 11, en donde: (a) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, o la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, se administra al paciente en combinación con un segundo agente terapéutico, en donde opcionalmente el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un agente antifibrótico, un fármaco antiinflamatorio, un corticoesteroide, un suplemento nutricional, un agente antihipertensivo, un antibiótico, otro anticuerpo contra GREM1, un anticuerpo contra una citocina, un anticuerpo anti-IL-1, un anticuerpo anti-IL-6 y un anticuerpo anti-TGF-p;

(b) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se administra por vía subcutánea, por vía intravenosa, por vía intradérmica, por vía oral o por vía intramuscular; y/o

(c) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se administra a una dosis de 0,1 mg/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal del paciente.

13. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 11, en donde HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 comprenden, respectivamente, las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 436-438-440-444-446-448.

14. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 11, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de las SEQ ID NO: 434/442.

15. El anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno bloquea la unión de GREM1 a heparina, y en donde (i) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 comprenden, respectivamente, las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 68-70-72-76-78-80; 212-214-216-220-222-224; 420-422-424-428-430-432; y 436-438-440-444-446-448, o (ii) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 66/74, 210/218, 418/426 y 434/442.