MX2012013369A - Anticuerpos hacia gdf8 humano. - Google Patents

Anticuerpos hacia gdf8 humano.

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Esther Latres
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Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos humanos o humanizados aislados o fragmentos de unión al antígeno de de los mismos que se unen de manera específica al factor-8 de crecimiento y diferenciación (GDF8) y bloquean la actividad de GDF8. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la presente invención se pueden usar en métodos terapéuticos para tratar enfermedades o trastornos que son aliviados o mejorados por la inhibición de GDF8.

Description

ANTICUERPOS HACIA GDF8 HUMANO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos, y a los fragmentos de unión al antígeno de los mismos, que son específicos del factor de crecimiento y diferenciación 8 (GDF8).
ANTECEDENTES El factor de crecimiento y diferenciación 8 (GDF8), también conocido como miostatina, es un miembro de la superfamilia TGF-ß de factores de crecimiento. GDF8 es un regulador negativo de la masa muscular esquelética, sumamente expresado en el músculo esquelético en desarrollo y adulto.
GDF8 está sumamente conservado entre especies, y las secuencias de aminoácidos de GDF8 murino y humano son idénticas (secuencia de ácido nucleico de GDF8 humano y secuencia de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO:338-339) (McPherron et al. 1977 Nature 387:83-90).
Varias enfermedades humanas están asociadas a la pérdida o al deterioro del tejido muscular, por ejemplo, la distrofia muscular, atrofia muscular, síndrome de debilitación muscular, sarcopenia y caquexia, y los inhibidores de GDF8 son aplicables al tratamiento de estas enfermedades o trastornos.
Se describen anticuerpos hacia GDF8 y métodos terapéuticos, p.ej., en los documentos US 6.096.506, US 7.320.789, US 7.807.159, WO 2007/047112, WO 2005/094446, US 2007/0087000, US 7.261.893, y WO 2010/070094.
BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona anticuerpos humanos o humanizados y fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos humanos o humanizados que se unen de manera específica al factor de crecimiento y diferenciación 8 humano (GDF8). Estos anticuerpos se caracterizan por unirse a GDF8 con una gran afinidad y por su capacidad de neutralizar la actividad de GDF8. Los anticuerpos pueden ser de tamaño completo (por ejemplo, un anticuerpo lgG1 o lgG4) o pueden comprender solamente una porción de unión al antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv), y pueden modificarse para influir en la funcionalidad, p.ej., para eliminar las funciones efectoras residuales (Reddy et al. 2000, J. Immunol. 164:1925-1933).
En una realización, el anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada (HCVR) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 360, y 376, o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma.
En una realización, el anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena ligera (LCVR) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 322, 368, y 384 o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma.
En una realización, el anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de HCVR y una secuencia de aminoácidos de LCVR, en el que las secuencias del par HCVR/LCVR se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO:2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 114/322, 360/368, y 376/384.
La presente invención también se refiere a un anticuerpo humano o humanizado o un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada 3 (HCDR3) y una secuencia de aminoácidos de una CDR3 de la cadena ligera (LCDR3), en la que la secuencia de aminoácidos de HCDR3 se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 366, y 382, o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma, y la secuencia de aminoácidos de LCDR3 se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 328, 374, y 390, o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma. En otra realización, el anticuerpo o el fragmento del mismo comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160, 168/176, 184/192, 200/208, 216/224, 232/240, 248/256, 264/272, 280/288, 296/304, 312/320, 120/328, 366/374, y 382/390.
En una realización relacionada, el anticuerpo o el fragmento del mismo comprende además secuencias de aminoácidos de CDR1 de la cadena pesada (HCDR1 ) y de CDR2 de la cadena pesada (HCDR2) y secuencias de aminoácidos de CDR1 de la cadena ligera (LCDR1 ) y de CDR2 de la cadena ligera (LCDR2), en las que las secuencias de aminoácidos de HCDR1 se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 1 16, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 362, y 378, o una secuencia sustancialmente idéntica a las mismas; la secuencia de aminoácidos de HCDR2 se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 364, y 380, o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma; la secuencia de aminoácidos de LCDR1 se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 324, 370, y 386 o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma; y la secuencia de aminoácidos de LCDR2 se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 326, 372, y 388 o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma. En otra realización, HCDR1 , HCDR2 y HCDR3 se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO:36/38/40, 116/118/120, 228/230/232, 362/364/366, y 378/380/382; y LCDR1 , LCDR2 y LCDR3 se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO:44/46/48, 124/126/128, 236/238/240, 370/372/374, y 386/388/390. Aún en otra realización, las CDRs de las cadenas pesada y ligera se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO: 36/38/40/44/46/48 (p.ej. 21-E5), 1 16/118/120/124/126/128 (p.ej. 8D12), 228/230/232/236/238/240 (p.ej. 1A2), 362/364/366/370/372/374 (p.ej. H4H1657N2), y 378/380/382/386/388/390 (p.ej. H4H1669P).
En una realización relacionada, la invención incluye un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a GDF8, en el que el anticuerpo o el fragmento comprende los dominios de CDR de las cadenas pesada y ligera contenidos en las secuencias de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID N°: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 114/322, 360/368, y 376/384. Se conocen en la técnica métodos y técnicas para identificar CDRs dentro de secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR y pueden usarse para identificar CDRs dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR descritas en la presente memoria. Las convenciones ejemplares que se pueden usar para identificar los límites de las CDRs incluyen, p.ej., la definición de Kabat, la definición de Chothia, y la definición AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la localización de las regiones de bucle estructural y la definición de AbM es una solución intermedia entre los enfoques de Kabat y Chothia. Véase, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); y Martin et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). También hay bases de datos públicas disponibles para la identificación de secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.
La presente invención proporciona además moléculas de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno de la invención. Los vectores de expresión recombinantes que portan los ácidos nucleicos de la invención, y las células hospedadoras en las que dichos vectores han sido introducidos, también son abarcados por la invención, así como los métodos para producir los anticuerpos mediante cultivo de las células hospedadoras de la invención.
En una realización, el anticuerpo de la invención comprende una HCVR codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 , 17, 33, 49, 65, 81 , 97, 113, 129, 145, 161 , 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 359, y 375, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos un 95% de homología con la misma.
En una realización, el anticuerpo de la invención comprende una LCVR codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:9, 25, 41 , 57, 73, 89, 105, 121 , 137, 153, 169, 185, 201 , 217, 233, 249, 265, 281 , 297, 313, 321 , 367, y 383 o una secuencia sustanciaimente similar que tiene al menos un 95% de homología con la misma.
En una realización, el anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de HCVR y una secuencia de aminoácidos de LCVR, en la que las secuencias del par HCV/LCVR están codificadas por un par de moléculas de ácidos nucleicos seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1/9, 17/25, 33/41 , 49/57, 65/73, 81/89, 97/105, 113/121 , 129/137, 145/153, 161/169, 177/185, 193/201 , 209/217. 225/233, 241/249, 257/265, 273/281 , 289/297, 305/313, 113/321 , 359/367, y 375/383.
La presente invención se refiere además a un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo humano o humanizado que comprende una HCDR3 codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:7. 23, 39, 55, 71 , 87, 103, 119, 135, 151. 167, 183, 199, 215, 231 , 247, 263, 279, 295, 31 1 , 365, y 381 , o una secuencia sustanciaimente similar que tiene al menos un 95% de homología con la misma, y una LCDR3 codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15, 31 , 47, 63, 79, 95, 111 , 127, 143, 159, 175, 191 , 207, 223, 239, 255, 271 , 287, 303, 319, 327, 373, y 389, o una secuencia sustanciaimente similar que tiene al menos un 95% de homología con la misma. En una realización, el grupo HCDR3/LCDR3 está codificado por un par de secuencias de nucleótidos seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:7/15, 23/31 , 39/47, 55/63, 71/79, 87/95, 103/111 , 1 19/127, 135/143, 151/159, 167/175, 183/191 , 199/207. 215/223, 231/239. 247/255. 263/271 , 279/287, 295/303, 311/319, 119/327, 365/373, y 381/389.
En una realización relacionada, el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo comprende además una HCDR1 y HCDR2, y una LCDR1 y LCDR2, en el que la HCDR1 está codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:3, 19, 35, 51 , 67, 83, 99, 115, 131 , 147. 163. 179. 195, 211 , 227, 243, 259, 275, 291 , 307, 361 , y 377, o una secuencia sustanciaimente similar que tiene al menos un 95% de homología con la misma, la HCDR2 está codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:5, 21 , 37, 53, 69, 85, 101 , 1 17, 133, 149, 165, 181 , 197, 213, 229, 245, 261 , 277, 293, 309, 363, y 379, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos un 95% de homología con la misma, la LCDR1 está codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:11 , 27, 43, 59, 75, 91 , 107, 123, 139, 155, 171 , 187, 203, 219, 235, 251 , 267, 283, 299, 315, 323, 369, y 385 o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos un 95% de homología con la misma, y la LCDR2 está codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:13, 29, 45, 61 , 77, 93, 109, 125, 141 , 157, 173, 189, 205, 221 , 237, 253, 269, 285, 301 , 317, 325, 371 , y 387, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos un 95% de homología con la misma. En una realización, el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo comprende CDRs de las cadenas pesada y ligera codificadas por un grupo de secuencias de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:35/37/39/43/45/47, 115/117/119/123/125/127, 227/229/231/235/237/239, 361/363/365/369/371/373, o 377/379/381/385/387/389.
La presente invención se refiere además a un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo aislado que se une de manera específica a GDF8, que comprende CDRs de las cadenas pesada y ligera seleccionadas del grupo que consiste en (a) una HCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - Xs - X6 - X7 - X8 (SEQ ID NO:329), en la que X1 es Gly; X2 es Phe; X3 es Thr; X4 es Phe; X5 es Ser; X6 es Ala o Ser; X7 es Phe o Tyr; X8 es Gly o Ala; (b) una HCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 (SEQ ID NO:330), en la que X1 es He; X2 Gly o Ser; X3 es Tyr o Gly; X4 Ser o Asp; X5 es Gly; X6 es Gly; X7 es Ser o Asn; y X8 es Ala o Glu; (c) una HCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 - X9 - X10 - X11 - X12 - X13 - X14 (SEQ ID NO:331), en la que X1 es Ser o Ala; X2 es Thr o Lys; X3 es Asp o He; X4 es Gly o Ser; X5 es Ala o His; X6 es Trp o Tyr; X7 es Lys o Asp; X8 es Met o He; X9 es Ser o Leu; X10 es Gly o Ser; X11 es Leu o Gly; X12 es Asp o Met; X13 es Val o Asp; X14 es Val o no está; (d) una LCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 (SEQ ID NO:332), en la que X1 es Gln; X2 es Asp o Gly; X3 es He; X4 es Ser; Xs es Asp o Asn; y X6 es Tyr o Trp; (e) una LCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 - X2 - X3 (SEQ ID NO:333), en la que X1 es Thr o Ala; X2 es Thr o Ala; y X3 es Ser; y (f) una región LCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 - X9 (SEQ ID NO:334), en la que X1 es Gln; X2 es Lys o Gln; X3 es Ala o Tyr; X4 es Asp o Asn; X5 es Ser; X6 es Ala o Phe; X7 es Pro; X8 es Leu; y X9 es Thr.
La metodología para derivar las secuencias consenso mencionadas anteriorment (SEQ ID NOs: 329-334) se ilustra en las figuras 4A y 4B.
La presente invención se refiere además a un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo completamente humano o humanizado que se une a GDF8 con una afinidad (expresada como una constante de disociación, "KD") de alrededor de 1 nM o menos, tal como se mide mediante un ensayo de resonancia de plasmones superficiales (por ejemplo, BIACORE™). En ciertas realizaciones, el anticuerpo de la invención muestra una KD de aproximadamente 700 pM o menos; aproximadamente 500 pM o menos; aproximadamente 320 pM o menos; aproximadamente 160 pM o menos; aproximadamente 100 pM o menos; aproximadamente 50 pM o menos; aproximadamente 0 pM o menos; o aproximadamente 5 pM o menos.
En una realización, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal (mAb) completamente humano o humanizado que se une específicamente e inhibe el GDF8 humano, y que exhibe una Cl50 menor o igual a alrededor de 10 nM; de aproximadamente 5 nM o menos; de aproximadamente 3 nM o menos; de aproximadamente 2 nM o menos; de aproximadamente 1 nM o menos; aproximadamente 500 pM o menos; o alrededor de 200 pM o menos, tal como se mide mediante un ensayo de luciferasa inducible por GDF8. Tal como se demuestra en la sección experimental más adelante, algunos de los anticuerpos anti-GDF8 de la invención bloquean la actividad de proteínas estrechamente relacionadas, tales como GDF11 , con una CI50 mucho mayor que GDF8 en un bioensayo de luciferasa. En una realización, la invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que exhibe al menos una Cl50 alrededor de 10 veces, al menos alrededor de 50 veces, al menos alrededor de 100 veces, al menos alrededor de 200 veces, al menos alrededor de 500 veces, al menos alrededor de 1000 veces, o al menos alrededor de 1500 veces mayor para el bloqueo de la actividad de GDF11 respecto de GDF8.
La invención abarca anticuerpos anti-GDF8 que tienen un patrón de glicosilación modificado. En algunas aplicaciones, puede resultar útil una modificación para eliminar los sitios de glicosilación no deseados, o un anticuerpo que carezca del resto fucosa, presente en la cadena de oligosacárido, por ejemplo para incrementar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (véase Shieid et al. (2002) JBC 277:26733). En otras aplicaciones, se puede hacer una modificación de una galactosilación a fin de modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
La invención incluye anticuerpos anti-GDF8 que se unen a epítopos específicos de GDF8 y que son capaces de bloquear la actividad biológica de GDF8. En una primera realización, el anticuerpo de la invención se une a un epítopo de la proteína GDF8 madura (SEQ ID NO:340) en los aminoácidos de alrededor del 1 a alrededor del 109; de alrededor del 1 a alrededor del 54; de alrededor del 1 a alrededor del 44; de alrededor del 1 a alrededor del 34; de alrededor del 1 a alrededor del 24; y de alrededor del 1 a alrededor del 14. En una segunda realización, el anticuerpo de la invención se une a uno o más de un epítopo de la proteína GDF8 madura (SEQ ID NO:340) en los aminoácidos de alrededor del 35 a alrededor del 109; de alrededor del 45 a alrededor de 109; de alrededor del 55 a alrededor del 109; de alrededor del 65 a alrededor del 109; de alrededor del 75 a alrededor del 109; de alrededor del 85 a alrededor del 109; de alrededor del 92 a alrededor del 109; o de alrededor del 95 a alrededor del 109. En una tercera realización, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del anticuerpo se une en un epítopo de la proteína GDF8 humana madura de alrededor del residuo de aminoácido 48 a alrededor del 72; de alrededor del 48 a alrededor del 69; de alrededor del 48 a alrededor del 65; de alrededor del 52 a alrededor del 72; de alrededor del 52 a alrededor del 65; o de alrededor del 56 a alrededor del 65.
En una realización relacionada, la invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que compite por la unión específica a GDF8 con otro anticuerpo que comprende una combinación de secuencias de aminoácidos HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 de SEQ ID NO:36/38/40/44/46/48, 116/118/120/124/ 26/128, 228/230/232/236/238/240, 362/364/366/370/372/374, o 378/380/382/386/388/390. En una realización, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de la invención compite por la unión especifica a GDF8 con otro anticuerpo que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de SEQ ID NO:2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 114/322, 360/368, o 376/384. Aún en otra realización relacionada, la invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que reconoce el epítopo en GDF8 que es reconocido por otro anticuerpo que comprende una combinación de secuencias de aminoácidos de HCDRs/LCDRs de SEQ ID NO: 36/38/40/44/46/48, 116/118/120/124/126/128, 228/230/232/236/238/240, 362/364/366/370/372/374, o 378/380/382/386/388/390. En una realización, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de la invención reconoce el epítopo en GDF8 que es reconocido por otro anticuerpo que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de SEQ ID NO-.2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 1 14/322, 360/368, o 376/384.
La presente invención se refiere además a una composición que comprende un anticuerpo humano o humanizado recombinante anti-GDF8 humano y un vehículo aceptable. La invención incluye, además, vectores y células hospedadoras que comprenden vectores que contienen moléculas de ácido nucleico que codifican el anticuerpo humano anti-GDF8 de la invención, así como métodos para producir estos nuevos anticuerpos, que comprenden cultivar células hospedadoras que comprenden ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo anti-GDF8 de la invención, o un fragmento de anticuerpo, en condiciones que permiten la producción de la proteína y la recuperación de la proteína producida de esta forma.
La presente invención se refiere además a métodos para la inhibición de la actividad de GDF8 mediante el uso de un anticuerpo, o una porción de unión al antígeno del mismo, de la invención. En una realización, el método comprende administrar un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de la invención a un sujeto humano que padece un trastorno que mejora por la inhibición de la actividad de GDF8. En las realizaciones preferidas, el sujeto humano tratado con el anticuerpo o con el fragmento de anticuerpo de la invención tiene la necesidad de mejorar la homeostasis de la glucosa, disminuir la masa de grasa, incrementar la sensibilidad a la insulina, mejorar la función renal y/o disminuir la acumulación de grasas. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de la invención es útil para el tratamiento, la prevención o la inhibición de una enfermedad o afección caracterizada por la pérdida ósea, que incluye osteoporosis, osteopenia, osteoartritis y fracturas óseas, el tratamiento del síndrome metabólico, contrarrestar la debilitación muscular por la administración mantenida de un glucocorticoide o una hormona esteroide o la pérdida muscular relacionada con la distrofia muscular, atrofia muscular, síndrome de debilitación muscular, sarcopenia y caquexia.
A partir de una revisión de la siguiente descripción detallada se evidenciarán otros objetos y ventajas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Fig. 1. Inmunotransferencia de la Proteolisis Limitada de GDF8 Humano con Proteinasa K. Los geles fueron SDS-PAGE al 18% no reductora con 0,2 µg de GDF8 cargados en cada carril, y 2 µg/m\ de anticuerpos de control I (A), 1A2 (B) o 21 -E9 (C). Carril 1 : tiempo de digestión 10 min, 1 9 de GDF8, 0 µ9 de Proteinasa K; Carril 2: tiempo de digestión 10 min, 1 µ9 de GDF8, 1 µ9 de Proteinasa K; Carril 3: tiempo de digestión 10 min, 1 g de GDF8, 6 g de Proteinasa K; Carril 4: tiempo de digestión 45 min, 1 µg de GDF8, 0 µg de Proteinasa K; Carril 5: tiempo de digestión 45 min, 1 µg de GDF8, 1 µg de Proteinasa K; Carril 6: tiempo de digestión 45 min, 1 µg de GDF8, 6 µg de Proteinasa K.
Fig. 2. Inmunotransferencia de la Proteolisis Limitada de GDF8 Humano con Dosis Elevadas de Proteinasa K. Los geles fueron SDS-PAGE al 18% no reductora con 0,2 µ9 de GDF8 cargados en cada carril, y 2 µg/ml de control I (A) o 1A2 (B). Carril 1 : tiempo de digestión 16 hr, 0 µg de GDF8, 96 g de Proteinasa K; Carril 2: tiempo de digestión 16 hr, 4 µg de GDF8, 0 µg de Proteinasa K; Carril 3: tiempo de digestión 16 hr, 4 µ9 de GDF8, 24 µg de Proteinasa K; Carril 4: tiempo de digestión 16 hr, 4 µ9 de GDF8, 96 µg de Proteinasa K; Carril 5: tiempo de digestión 1 hr, 4 g de GDF8, 24 g de Proteinasa K; Carril 6: tiempo de digestión 1 hr, 4 µ9 de GDF8, 96 µ9 de Proteinasa K; Carril 7: tiempo de digestión 10 min, 0 9 de GDF8, 0 µ9 de Proteinasa K; Carril 8: tiempo de digestión 10 min, 4 µ9 de GDF8, 24 µg de Proteinasa K.
Figs. 3A y 3B. Gráficos que ilustran los niveles de glucosa iniciales en porcentaje a lo largo del tiempo en ratones sometidos a un ensayo de tolerancia a la insulina antes (Fig. 3A) y después (Fig. 3B) del tratamiento con anticuerpos.
Figs. 4A y 4B. La alineación de las secuencias de aminoácidos de las CDRs de cadena pesada (Fig. 4A) y CDRs de cadena ligera (Fig. 4B) de los anticuerpos ejemplares anti-GDF8 H4H1657N2 y H4H1669P, ilustrando las secuencias consenso compartidas entre estas secuencias.
DESCRIPCIÓN DETALLADA Antes de describir los presentes métodos, se debe entender que esta invención no está limitada a los métodos particulares y condiciones experimentales descritas, puesto que tales métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente descripción es únicamente para el propósito de describir realizaciones particulares, y no pretende ser limitante, puesto que el alcance de la presente invención sólo estará limitado por las reivindicaciones adjuntas.
Como se usa en esta memoria y en las reivindicaciones anejas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias en plural, salvo que el contexto indique claramente otra cosa. De este modo, por ejemplo, una referencia a "un método" incluye uno o más métodos y/o etapas del tipo descrito en este documento, y/o que resultarán evidentes para las personas expertas en la técnica tras leer esta descripción.
Salvo que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente descripción tienen el significado habitualmente asignado por los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Tal como se emplea en la presente, el término "aproximadamente", cuando se emplea haciendo referencia a un valor numérico citado concreto, significa que el valor puede variar desde el valor citado en no más del 1%. Por ejemplo, tal como se emplea en la presente, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101, y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1 , 99,2, 99,3, 99,4, etc.).
Aunque se pueden usar cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción para la práctica o ensayo de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen a continuación.
Definiciones Se usa de manera intercambiable "factor de crecimiento y diferenciación 8 humano", "GDF8" y "miostatina" para referirse a la proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID N0.338 y la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:339 (propéptido) y 340 (proteína madura).
El término "anticuerpo", como se usa en la presente memoria, pretende hacer referencia a moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de la cadena pesada (que se abrevia en la presente memoria como HCVR o VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1 , CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de la cadena ligera (que se abrevia en la presente memoria como LCVR o VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio (CL1 ). Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDRs), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL consta de tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxílico en el siguiente orden: FR1 , CDR1. FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En las diferentes realizaciones de la invención, las FRs del anticuerpo anti-GDF8 (o la porción de unión al antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o pueden modificarse de forma natural o artificial. Una secuencia de aminoácidos consenso puede definirse basándose en un análisis de dos o más CDR conjuntamente.
El término "anticuerpo," como se usa en la presente memoria, también incluye fragmentos de unión al antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Las expresiones "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, tal como se utilizan en la presente memoria, incluyen cualquier pollpéptido o glucoproteína que aparece en la naturaleza, obtenible enzimáticamente, sintético o tratado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Fragmentos de unión a antígenos de un anticuerpo pueden derivar, p.ej., de moléculas de anticuerpo completas, utilizando cualesquiera técnicas convencionales adecuadas, tales como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante, que implican la manipulación y expresión de ADN que codifican dominios variables y, opcionalmente constantes de anticuerpos. Un ADN de este tipo es conocido y/o está fácilmente disponible, p.ej., de fuentes comerciales, genotecas de ADN (incluidas, p.ej., genotecas de fago-anticuerpos), o se puede sintetizar. El ADN se puede secuenciar y manipular químicamente o utilizando técnicas de biología molecular, por ejemplo para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear residuos de cisteína, modificar, añadir o suprimir aminoácidos, etc.
Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión al antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vií) unidades de reconocimiento mínimas que consisten en los residuos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada). Otras moléculas tratadas mediante ingeniería, tales como diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y minicuerpos, están también abarcadas por la expresión "fragmento de unión a antígeno," tal como se utiliza en la presente memoria.
Un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo comprenderá, típicamente, al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y comprenderá, en general, al menos una CDR que es adyacente a, o está en fase con, una o más secuencias estructurales. En fragmentos de unión al antígeno con un dominio VH asociado con un dominio VL, los dominios VH y VL se pueden situar uno con relación a otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y puede contener dímeros VH-VH, VH-VL o VL-VL. Como alternativa, el fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio VH o VL monomérico.
En determinadas realizaciones, un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable, enlazado covalentemente a al menos un dominio constante. Las configuraciones no limitantes de dominios variables y constantes ejemplares que se pueden encontrar dentro de un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de la presente invención incluyen: (i) VH-CH1 ; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (¡v) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH 1 -CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1 ; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; y (xiv) VL-CL. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluida cualquiera de las configuraciones enumeradas anteriormente a modo de ejemplo, los dominios variables y constantes pueden estar enlazados directamente uno con otro o pueden estar enlazados por una región de bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región de bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo., 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos, lo cual da como resultado un enlace flexible o semi-flexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una molécula de polipéptido sencilla. Además de ello, un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de la presente invención puede comprender un homo-dímero o hetero-dímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en una asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios VH o VL monoméricos (por ejemplo, mediante enlace(s) disulfuro).
Al igual que con moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión al antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión al antígeno multiespecífico de un anticuerpo comprenderá, típicamente, al menos dos dominios variables diferentes, siendo cada dominio variable capaz de unirse específicamente a un antígeno separado o a un epítopo diferente en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluidos los formatos de anticuerpos biespecíficos a modo de ejemplo descritos en la presente memoria, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de la presente invención utilizando técnicas rutinarias disponibles en la técnica.
Los anticuerpos de la presente invención pueden funcionar por medio de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). La "citotoxicidad dependiente del complemento" (CDC) se refiere a la lisis de células que expresan antígenos por un anticuerpo de la invención en presencia del complemento. La "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" (ADCC) se refiere a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fe (FcR) (por ejemplo, células Asesinas Naturales (NK), neutrofilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y por lo tanto conducen a la lisis de la célula diana. La CDC y la ADCC pueden medirse usando ensayos que son bien conocidos y están disponibles en la técnica. (Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.500.362 y 5.821.337, y Clynes er a/., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998)).
La expresión "se une de manera específica", o similares, significa que un anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica se puede caracterizar por una constante de disociación de 1x10"6 M o menos. En la técnica se conocen bien métodos para determinar si dos moléculas se unen específicamente e incluyen, por ejemplo, diálisis en equilibrio, resonancia de plasmones superficiales, y similares. Por ejemplo, un anticuerpo que "se une de manera específica" a GDF8 humano, tal como se usa en el contexto de la presente invención, incluye los anticuerpos que se unen a GDF8 humano o las porciones de los mismos (p.ej., un péptido que comprende al menos 6 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:340) con una KD de menos de alrededor de 1000 nM, menos de alrededor de 500 nM, menos de alrededor de 300 nM, menos de alrededor de 200 nM, menos de alrededor de 100 nM, menos de alrededor de 90 nM, menos de alrededor de 80 nM, menos de alrededor de 70 nM, menos de alrededor de 60 nM, menos de alrededor de 50 nM, menos de alrededor de 40 nM, menos de alrededor de 30 nM, menos de alrededor de 20 nM, menos de alrededor de 10 nM, menos de alrededor de 5 nM, menos de alrededor de 4 nM, menos de alrededor de 3 nM, menos de alrededor de 2 nM, menos de alrededor de 1 nM o menos de alrededor de 0,5 nM, tal como se mide en un ensayo de resonancia de plasmones superficiales. (Véase, p.ej., el Ejemplo 3, en la presente memoria). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a GDF8 humano, sin embargo, puede tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de GDF8 de otras especies.
La expresión anticuerpo de "afinidad elevada" se refiere a aquellos anticuerpos capaces de unirse a GDF8 con una constante de disociación (KD) de alrededor de 10"8 M o menos, alrededor de 10"9 M o menos, alrededor de 10'10 M o menos, alrededor de 10"1 M o menos, o alrededor de 10"12 M o menos, tal como se mide mediante resonancia de plasmones superficiales, p.ej., BIACORE™ o mediante un ELISA de afinidad en disolución.
La expresión "constante de disociación lenta" o "Koff indica que un anticuerpo se disocia de GDF8 con una constante de disociación de 1 x 10"3 s"1 o menos, preferiblemente 1 x lO^ s'1 o menos, según se determina por resonancia de plasmones superficiales, p.ej., BIACORE™.
Un anticuerpo "neutralizante" o "bloqueante" pretende hacer referencia a un anticuerpo cuya unión a GDF8 da como resultado la inhibición de la actividad biológica de GDF8. Esta inhibición de la actividad biológica de GDF8 se puede determinar midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de GDF8. Estos indicadores de la actividad biológica de GDF8 se pueden determinar mediante uno o más de varios ensayos estándar in vitro o in vivo conocidos en la técnica (véanse los ejemplos más adelante).
Los anticuerpos anti-GDF8 totalmente humanos descritos en la presente memoria pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones estructurales y/o CDR de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera en comparación con las secuencias correspondientes de la línea germinal. Mutaciones de este tipo se pueden fácilmente determinar comparando las secuencias de aminoácidos descritas en la presente memoria con las secuencias de la línea germinal, disponibles, por ejemplo, de bases de datos públicas de la secuencias de anticuerpos. La presente invención incluye anticuerpos, y fragmentos de unión al antígeno de los mismos, que se derivan de cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en la presente memoria, en los que uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones estructurales y/o CDR se retro-mutan al o a los correspondientes residuos de la línea germinal o a una sustitución conservativa de aminoácidos (natural o no natural) del o de los correspondientes residuos de la línea germinal (a cambios de este tipo en la secuencia se alude en la presente memoria como "retro-mutaciones de la línea germinal"). Un experto habitual en la materia, partiendo de las secuencias de la región variable de las cadenas pesada y ligera descritas en la presente memoria, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que comprende retro-mutaciones de la línea germinal individuales o combinaciones de las mismas. En determinadas realizaciones, todos los residuos estructurales y/o CDR dentro de los dominios VH y/o VL se retro-mutan a la secuencia de la línea germinal. En otras realizaciones, solamente determinados residuos se retro-mutan a la secuencia de la linea germinal, p.ej., sólo los residuos mutados que se encuentran dentro de los primeros 8 aminoácidos de FR1 o dentro de los últimos 8 aminoácidos de FR4, o solamente los residuos mutados que se encuentran dentro de CDR1 , CDR2 o CDR3. Además, los anticuerpos de la presente invención puede contener cualquier combinación de dos o más retro-mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones estructurales y/o CDR, es decir, en los que determinados residuos individuales se retro-mutan a la secuencia de la línea germinal, mientras que se mantienen otros residuos determinados que difieren de la secuencia de la línea germinal. Una vez obtenidos, anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno que contienen una o más retro-mutaciones de la línea germinal se pueden ensayar fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas, tales como especificidad de unión mejorada, afinidad de unión incrementada, propiedades biológicas antagonistas o agonistas (según sea el caso) mejoradas o reforzadas, inmunogenicidad reducida, etc. Anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno obtenidos de esta manera general quedan abarcados dentro de la presente invención.
La presente invención también incluye anticuerpos anti-GDF8 que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR descritas en la presente memoria que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-GDF8 que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR, p.ej., con 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones de aminoácidos conservativas con respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR descritas en la presente memoria. En una realización, el anticuerpo comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:360 y 376 con 8 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas. En otra realización, el anticuerpo comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:360 y 376 con 6 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas. En otra realización, el anticuerpo comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO.360 y 376 con 4 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas. En otra realización, el anticuerpo comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:360 y 376 con 2 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas. En una realización, el anticuerpo comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:368 y 384 con 8 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas. En otra realización, el anticuerpo comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:368 y 384 con 6 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas. En otra realización, el anticuerpo comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:368 y 384 con 4 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas. En otra realización, el anticuerpo comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:368 y 384 con 2 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento del anticuerpo de la invención pueden conjugarse con un resto terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunosupresor o un radioisótopo.
Un "anticuerpo aislado", tal como se usa en la presente memoria, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de al menos un componente de su medio natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o extraído de al menos un componente de un organismo, tejido o célula en el que el anticuerpo existe de manera natural o se produce de manera natural es un "anticuerpo aislado" para los fines de la presente invención. Un anticuerpo aislado incluye también un anticuerpo in situ dentro de una célula recombinante, así como un anticuerpo que se ha sometido a al menos una etapa de purificación o aislamiento. Según ciertas realizaciones, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente exento de otro material celular y/o de productos químicos.
La expresión "resonancia de plasmones superficiales", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis en tiempo real de interacciones bioespecíficas, por medio de la detección de alteraciones de las concentraciones de proteínas dentro de una matriz de biosensores, usando, por ejemplo, el sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.).
El término "KD", como se usa en la presente memoria, pretende hacer referencia a la constante de disociación en equilibrio de una interacción de anticuerpo-antígeno particular.
El término "epítopo" incluye cualquier determinante, preferiblemente un determinante polipéptido, capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o un receptor de células T. En determinadas realizaciones, los determinantes epítopos incluyen agrupamientos de moléculas superficiales químicamente activas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o grupos sulfonilo, y, en determinadas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno que está unida a un anticuerpo. En determinadas realizaciones, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando reconoce preferentemente a su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. Por ejemplo, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la KD es menor o igual a 10"8 M, menor o igual a 10"9 M, o menor o igual a 10'10 M.
Una proteína o polipéptido es "sustancialmente puro", "sustancialmente homogéneo" o "sustancialmente purificado" cuando al menos aproximadamente 60 a 75% de una muestra exhibe una especie única de polipéptido. El polipéptido o proteína puede ser monomérico o multimérico. Un polipéptido o proteína sustancialmente puro comprenderá, en general, alrededor de un 50%, 60%, 70%, 80% o 90% p/p de una muestra de proteína, normalmente alrededor de un 95%, y preferentemente una pureza mayor del 99%. La pureza u homogeneidad de una proteína se pude indicar por una serie de medios bien conocidos en la técnica tales como la electroforesis sobre gel de poliacrilamida de una muestra de proteína, seguida de la visualización de una única banda polípeptídica tras teñir el gel con una tinción bien conocida en la técnica. A ciertos propósitos, se puede obtener una resolución mayor usando HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica de purificación.
La expresión "análogo o variante polipeptídica", tal como se usa en este documento, se refiere a un polipéptido que está compuesto por un segmento de al menos 25 aminoácidos que exhibe un identidad sustancial con una porción de una secuencia de aminoácidos y que posee al menos una de las propiedades siguientes: (1 ) unión especifica a GDF8 en condiciones de unión adecuadas, o (2) capacidad de bloquear la actividad biológica de GDF8. Típicamente, los análogos o variantes polipeptídicos comprenden una sustitución conservativa de aminoácido (o inserción o deleción) con respecto a la secuencia de origen natural. Los análogos tienen en general una longitud de al menos 20 aminoácidos, una longitud de al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ó 200 aminoácidos o más, y a menudo pueden ser tan largos como el polipéptido natural de tamaño completo.
Las sustituciones preferidas de aminoácidos son aquellas que: (1 ) reducen la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de fijación para formar complejos de proteínas, (4) alteran las afinidades de fijación, y (4) confieren o modifican otras propiedades físico-químicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir diversas mutaciones de una secuencia diferente de una secuencia peptídica de origen natural. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo sustituciones únicas o múltiples de aminoácidos (preferentemente, sustituciones conservativas de aminoácidos) en la secuencia de origen natural (preferentemente, en la porción del polipéptido que queda fuera del o de los dominios que forman contactos intermoleculares). Una sustitución conservativa de aminoácido no debería modificar de manera sustancial las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de sustitución no debería tender a romper una hélice que se produzca en la secuencia parental, o degradar otros tipos de estructura secundaria característica de la secuencia parental). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos, reconocidas en la técnica, se describen en la obra "Proteins, Structures and Molecular Principies" (Creighton 1984 W. H. Freeman and Company, Nueva York; "Introduction to Protein Structure" (Branden & Tooze, eds., 1991 , Garland Publishing, NY); y Thornton et at. 1991 Nature 354:105.
En la industria farmacéutica se utilizan habitualmente análogos no peptídicos como medicamentos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan "compuestos peptido-m iméticos" o "compuestos peptidomiméticos" (véase, por ejemplo, Fauchere (1986) J. Adv. Drug Res. 15:29; y Evans et al. (1987) J. Med. Chem. 30:1229. También se puede usar la sustitución sistemática de uno o múltiples aminoácidos de una secuencia de consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) para generar péptidos más estables. Además, se pueden generar péptidos con movilidad limitada que comprenden una secuencia consenso o una variación de la secuencia consenso sustancialmente idéntica mediante métodos conocidos en la técnica (Rizo et al. (1992) Ann. Rev. Biochem. 61:387), por ejemplo, mediante la adición de residuos de cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.
La expresión "identidad porcentual de secuencia", en el contexto de secuencias de ácido nucleico, se refiere a los residuos en dos secuencias que son idénticos cuando están alineados para alcanzar la máxima correspondencia. La comparación de la longitud de la identidad de secuencia puede efectuarse sobre un tramo de al menos aproximadamente nueve nucleótidos. o más, habitualmente al menos aproximadamente 18 nucleótidos, más habitualmente al menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más típicamente al menos aproximadamente 32 nucleótidos y, preferentemente, al menos aproximadamente 36, 48 o más nucleótidos. En la técnica se conoce una serie de diferentes algoritmos que se pueden usar para medir la identidad de secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, se pueden comparar secuencias de polinucleótidos usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas incluidos en Wisconsin Package Versión 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wis. FASTA, que incluye, p.ej., los programas FASTA2 y FASTA3, proporciona alineaciones e identidad de secuencias en porcentaje de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias problema y de búsqueda (Pearson (1990) Methods Enzymol. 183:63-98 y (2000) Methods Mol. Biol. 132:185-219). Excepto que se especifique lo contrario, se utilizan parámetros por defecto para un programa o algoritmo particular. Por ejemplo, se puede determinar la identidad porcentual de secuencia entre secuencias de ácidos nucleicos usando FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación), o usando Gap con sus parámetros por defecto, según se ofrece en GCG Versión 6.1.
Salvo que se especifique lo contrario, una referencia a una secuencia de ácidos nucleicos incluye su complemento. De esta forma, se debe entender que una referencia a una molécula de ácido nucleico que tenga una secuencia particular tiene que incluir su cadena complementaria, con su secuencia complementaria. Por lo general, la técnica utiliza las expresiones "identidad porcentual de secuencia", "similitud porcentual de secuencia" y "homología porcentual de secuencia" de manera intercambiable. En esta solicitud, estas expresiones tendrán el mismo significado con respecto a secuencias de ácidos nucleicos.
La expresión "similitud sustancial", o "similitud sustancial de secuencias", cuando se refiere a un ácido nucleico o un fragmento del mismo, indica que, cuando está alineado de manera óptima con las inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencias nucleotídicas en al menos alrededor de un 90%, al menos alrededor de un 95%, al menos alrededor de un 96%, al menos alrededor de un 97%, al menos alrededor de un 98% o al menos alrededor de un 99% de las bases nucleotídicas, tal como se mide mediante cualquier algoritmo de identidad de secuencias bien conocido, tal como FASTA, BLAST o Gap, tal como se ha mencionado anteriormente.
Tal como se aplica a los polipéptidos, la expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico" significa que dos secuencias peptídicas, cuando están alineadas de manera óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT mediante el uso de los pesos de los huecos por defecto, comparten al menos alrededor de un 80% de identidad de secuencias, al menos alrededor de un 90%, al menos alrededor de un 95%, al menos alrededor de un 98% o al menos alrededor de un 99% de identidad de secuencias. Preferiblemente, las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren en sustituciones conservativas de aminoácidos. Una "sustitución conservativa de aminoácidos" es aquella en la que se sustituye un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobia). En general, una sustitución conservativa de aminoácidos no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína.
En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, la identidad porcentual de secuencia o el grado de similitud se puede ajustar de forma ascendente para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, p.ej., Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1 ) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales hidroxi-alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amidas: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; y 6) las cadenas laterales que contienen azufre son cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones conservativas de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-vaiina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. De manera alternativa, una sustitución conservativa es cualquier cambio que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad log PAM250 que se describe en Gonnet et al. (1992) Science 256: 443-45. Un reemplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de similitud PAM250 log.
La similitud de secuencia para polipéptidos, también denominada identidad de secuencia, se mide típicamente usando software de análisis de secuencias. El software de análisis de proteínas busca secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a varias sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones, que incluyen sustituciones acídicas conservativas de aminoácidos. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como "Gap" y "Bestfit", que se pueden utilizar con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos, o entre una proteína natural y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. También se pueden comparar secuencias polipeptídicas usando FASTA, empleando parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (p.ej., FASTA2 y FASTA3) proporciona alineamientos y el porcentaje de identidad de secuencias de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias problema y de búsqueda (Pearson (2000), anteriormente mencionado). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un número elevado de secuencias de diferentes organismos, es el programa informático BLAST, en especial blastp o tbiastn, usando parámetros por defecto. Véase, p.ej., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402.
La longitud de las secuencias polipeptídicas comparadas en busca de homología será generalmente de al menos alrededor de 16 residuos de aminoácidos, al menos alrededor de 20 residuos, al menos alrededor de 24 residuos, al menos alrededor de 28 residuos, o al menos alrededor de 35 residuos. Cuando se analiza una base de datos que contiene secuencias de un número elevado de organismos diferentes, es preferible comparar secuencias de aminoácidos.
La expresión "cantidad eficaz" es una concentración o una cantidad de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que produce un objetivo particular mencionado. Una "cantidad eficaz" de un anticuerpo anti-GDF8 o un fragmento de unión al antígeno de este anticuerpo puede determinarse de forma empírica. Además, una "cantidad terapéuticamente eficaz" es una concentración o cantidad de un anticuerpo anti-GDF8 o un fragmento de unión al antígeno del mismo que es eficaz para alcanzar un efecto terapéutico indicado. Esta cantidad también se puede determinar empíricamente.
Preparación de Anticuerpos Humanos En la técnica se conocen métodos para generar anticuerpos monoclonales, incluyendo anticuerpos monoclonales completamente humanos. Cualquiera de dichos métodos conocidos se puede usar en el contexto de la presente invención para preparar anticuerpos humanos que se unen específicamente a GDF8.
Usando la tecnología VELOCIMMUNE™ o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, se aislan inicialmente anticuerpos quiméricos de alta afinidad por GDF8 que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la sección experimental presentada más adelante, los anticuerpos se caracterizan y se seleccionan por características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se reemplazan por una región constante humana deseada para generar el anticuerpo completamente humano de la invención, por ejemplo lgG1 o lgG4 modificada o de tipo silvestre. Aunque la región constante seleccionada puede variar según el uso específico, las características de unión al antígeno de alta afinidad y de especificidad de diana residen en la región variable.
En general, los anticuerpos de la presente invención poseen afinidades muy elevadas, presentando habitualmente una KD de entre aproximadamente 10"12 y aproximadamente 10"9 M, cuando se mide a través de la unión al antígeno, ya sea inmovilizado en fase sólida o en disolución. Las regiones constantes de ratón se reemplazan con regiones constantes humanas deseadas para generar los anticuerpos completamente humanos de la invención, por ejemplo, lgG1 de tipo natural (SEQ ID N°:335) o lgG4 (SEQ ID N°:336) o lgG1 o lgG4 modificadas (por ejemplo, SEQ ID N°:337). Aunque la región constante seleccionada puede variar según el uso específico, las características de unión al antígeno de alta afinidad y de especificidad de diana residen en la región variable.
Bioequivalentes Los anticuerpos anti-GDF8 y fragmentos de anticuerpo de la presente invención abarcan proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las de los anticuerpos descritos, pero que mantienen la capacidad para unirse a GDF8 humano. Estos anticuerpos variantes y fragmentos de anticuerpo comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con una secuencia parental, pero presentan una actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. De forma similar, las secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-GDF8 de la presente invención abarcan las secuencias que comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos en comparación con la secuencia descrita, pero que codifican un anticuerpo anti-GDF8 o un fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo anti-GDF8 o un fragmento de anticuerpo de la invención. Anteriormente se han analizado ejemplos de dichas variantes de secuencias de aminoácidos y de ADN.
Dos proteínas de unión al antígeno o anticuerpos se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya velocidad y grado de absorción no muestra una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, en una sola dosis o en dosis múltiples. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en su grado de absorción pero no en su velocidad de absorción y pueden seguir considerándose bioequivalentes debido a que dichas diferencias en la velocidad de absorción son intencionadas y se reflejan en la etiqueta, no son esenciales para conseguir las concentraciones corporales de fármaco eficaces por ejemplo, en el uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el producto farmacéutico particular estudiado.
En una realización, dos proteínas de unión al antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente significativas en su seguridad, pureza y potencia.
En una realización, dos proteínas de unión al antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiar una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en inmunogenicidad, o una menor eficacia en comparación con una terapia continuada sin dicho cambio.
En una realización, dos proteínas de unión al antígeno son bioequivalentes si las dos actúan por un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la afección o afecciones de uso, en la medida en la que se conocen dichos mecanismos.
La bioequivalencia puede demostrarse por métodos in vivo e in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo (a) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en el que la concentración del anticuerpo o sus metabolitos se mide en sangre, plasma, suero u otro fluido biológico en función del tiempo; (b) un ensayo in vitro que se ha correlacionado y que es razonablemente predictivo de datos de biodisponibilidad humana in vivo; (c) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos en el que se mide el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su diana) en función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.
Las variantes bioequivalentes de los anticuerpos anti-GDF8 de la invención se pueden construir, por ejemplo, realizando diversas sustituciones de residuos o secuencias o delecionando residuos o secuencias terminales o internas que no son necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, los residuos de cisteína no esenciales para la actividad biológica pueden delecionarse o reemplazarse por otros aminoácidos para prevenir la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos después de la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpos anti-GDF8 que comprenden cambios de aminoácidos que modifican las características de glicosilación de los anticuerpos, p.ej., mutaciones que eliminan o retiran la glicosilación.
Cartografía de Epítopos y Tecnologías Relacionadas Para rastrear los anticuerpos que se unen a un epítopo particular (por ejemplo, los que bloquean la unión de IgE a su receptor de alta afinidad), se puede llevar a cabo un ensayo convencional de bloqueo cruzado tal como el que se describe en Harlow y Lañe (1990) véase más arriba. Oros métodos incluyen mutantes por barrido de alanina, transferencias de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), o el análisis de escisión de péptidos. Además, se pueden emplear métodos tales como la escisión de epítopos, la extracción de epítopos y la modificación química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science 9:487-496).
El término "epítopo" hace referencia a un sitio de un antígeno al que responden las células B y/o T. Los epítopos de células B pueden formarse a partir de aminoácidos contiguos o no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos habitualmente se mantienen tras exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por el plegamiento terciario normalmente se pierden tras tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Típicamente, un epítopo incluye al menos 3, y más comúnmente al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una única conformación espacial.
El Análisis de Perfil Asistido por Modificación (" Modification-Assisted Profiling" (MAP)), conocido también como Análisis de Perfil de Anticuerpos basado en la Estructura del Antígeno ("Antigen Structure-based Antibody Profiling" (ASAP)), es un método que categoriza elevados números de anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos contra el mismo antígeno, de acuerdo con las similitudes del perfil de fijación de cada anticuerpo frente a superficies antigénicas química o enzimáticamente modificadas (Documento US 2004/0101920). Cada categoría puede reflejar un único epítopo distintivamente diferente o parcialmente solapado con el epítopo representado por otra categoría. Esta tecnología permite un rápido filtrado de anticuerpos genéticamente idénticos, de tal modo que la caracterización puede focalizarse en anticuerpos genéticamente distintos. Cuando se aplica a exploración de hibridomas, el MAP puede facilitar la identificación de clones de hibridoma raros que producen mAb que tienen las características deseadas. Se puede utilizar MAP para clasificar los anticuerpos anti-GDF8 de la invención en grupos de anticuerpos que se unen a epítopos diferentes.
La invención incluye anticuerpos anti-GDF8 y fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos que se unen a epítopos específicos de GDF8 humano (SEQ ID NO:340) y que son capaces de bloquear la actividad biológica de GDF8. En una realización, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une en un epítopo que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 109; 1 a 54; 1 a 44; 1 a 34; 1 a 24; y 1 a 14. En otra realización, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une en un epítopo que comprende los residuos de aminoácidos 65 a 72; 35 a 109; 45 a 109; 55 a 109; 65 a 109; 75 a 109; 85 a 109; 92 a 109; o 95 a 109. En otra realización, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo se une en un epítopo que comprende los residuos de aminoácidos 48 a 72; 48 a 69; 48 a 65; 52 a 72; 52 a 65; o 56 a 65. En realizaciones específicas, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo se puede unir en 2 o más epítopos.
La presente invención incluye también anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen a GDF8 maduro de tipo natural (SEQ ID NO:340), pero que no se unen a péptidos aislados que tienen menos de la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:340. Por ejemplo, la invención incluye anticuerpos anti-GDF8 que se unen a GDF8 maduro de tipo natural (SEQ ID NO:340), pero que no se unen a péptidos aislados que consisten en 10 a 40 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:340. La invención también incluye anticuerpos anti-GDF8 que no se unen a ningún epítopo lineal dentro del GDF8 humano maduro de tipo natural. En ciertas realizaciones de la presente invención, los anticuerpos anti-GDF8 se unen a GDF8 humano maduro de tipo natural que comprende SEQ ID NO:340, pero no se unen a uno o más péptidos GDF8 aislados que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 1-14, 1-18, 17-42, 48-65, 48-69, 48-72, 52-65, 52-72, 56-65, 56-72, 65-72, 73-90, 75-105 y 91-105 de SEQ ID NO:340. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GDF8 no se unen a ninguno de los péptidos de GDF8 anteriormente mencionados. Las personas de experiencia habitual en la técnica conocen los métodos para determinar si un anticuerpo dado es capaz de unirse a un péptido GDF8 particular. Un método ejemplar se ilustra en el Ejemplo 7 en la presente memoria, en el que los péptidos de GDF8 se unen a microesferas, se añaden anticuerpos a las microesferas conjugadas a los péptidos, y, tras las etapas de lavado, se detectan las microesferas unidas a los anticuerpos. La ausencia de anticuerpos unidos indica que los anticuerpos no se unen a los péptidos particulares que se están analizando.
La presente invención incluye además anticuerpos humanos aislados, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, que se unen específicamente a GDF8 humano maduro de tipo natural (p.ej., una proteína o polipéptido que comprende SEQ ID NO:340), pero que no se unen a una construcción de GDF8 quimérica en la que ciertos aminoácidos de GDF8 están sustituidos con la(s) secuencia(s) de aminoácidos correspondiente(s) de una proteína no idéntica pero relacionada tal como TGFp-1. En un ejemplo, la construcción quimérica es una quimera GDF8 TGFp-1 en la que los aminoácidos 48-72 de GDF8 maduro están sustituidos por la secuencia de aminoácidos correspondiente de TGF0-1 (p.ej., los aminoácidos 49-76 de TGFp-1 ). Un ejemplo de tal quimera está representado por SEQ ID NO:352 (véanse los Ejemplos 4 y 6 en la presente memoria). Así, en ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención se unen específicamente a GDF8 humano maduro de tipo natural (SEQ ID NO:340), pero no se unen a la construcción quimérica GDF8/TGFP-1 de SEQ ID NO:352, lo que indica que el epítopo al que se unen tales anticuerpos incluye o abarca los aminoácidos localizados en los residuos 48 a 72 de SEQ ID NO:340. También se pueden usar bioensayos de bloqueo, tales como el ensayo expuesto en el Ejemplo 4 en la presente memoria, para determinar indirectamente si un anticuerpo se une a GDF8 humano maduro de tipo natural (SEQ ID NO.340) y no se une a una construcción quimérica GDF8/TGFp-1 , p.ej., la construcción de SEQ ID NO:352. Por ejemplo, se considera que un anticuerpo que bloquea la bioactividad de GDF8 humano maduro de tipo natural, pero que no bloquea la bioactividad de una quimera GDF8/TGFp-1 , se une a la porción de GDF8 que está sustituida por la secuencia de TGFp-1 correspondiente en la construcción quimérica.
De manera similar, la presente invención incluye también anticuerpos humanos aislados, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, que bloquean la actividad mediada por GDF8 maduro de tipo natural en un bioensayo, pero que no bloquean la actividad de una construcción quimérica de GDF8 (p.ej., una quimera GDF8 TGF -1 en la que los aminoácidos 48-72 de GDF8 maduro están sustituidos por la secuencia de aminoácidos correspondiente de TGFp-1 (p.ej., SEQ ID NO:352)). Un bioensayo de GDF8 ejemplar que se puede usar en el contexto de este aspecto de la invención es el ensayo de luciferasa inducible por GDF8 expuesto en el Ejemplo 4 en la presente memoria, aunque también se contemplan en la presente memoria otros bioensayos similares capaces de medir la actividad celular de GDF8.
La presente invención incluye anticuerpos anti-GDF8 que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos ejemplares específicos descritos en la presente memoria. De forma similar, la presente invención incluye también anticuerpos anti-GDF8 que compiten de manera cruzada por la unión a GDF8 o a un fragmento de GDF8 con cualquiera de los anticuerpos ejemplares específicos descritos en la presente memoria.
Se puede determinar fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, un anticuerpo anti-GDF8 de referencia mediante el uso de métodos rutinarios conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-GDF8 de referencia de la invención, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína o péptido de GDF8 en condiciones de saturación. A continuación, se determina la capacidad de un anticuerpo de ensayo de unirse a la molécula de GDF8. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse a GDF8 después de la unión en saturación con el anticuerpo anti-GDF8 de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente que el anticuerpo anti-GDF8 de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de ensayo no es capaz para unirse a la molécula de GDF8 después de la unión de saturación con el anticuerpo anti-GDF8 de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo que el epítopo al que se une el anticuerpo anti-GDF8 de referencia de la invención. Después puede realizarse una experimentación rutinaria adicional (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la falta de unión observada del anticuerpo de ensayo se debe efectivamente a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la ausencia de unión observada. Pueden realizarse experimentos de este tipo usando ELISA, RIA, Biacore, citometría de flujo o cualquier otro ensayo de unión a anticuerpo cuantitativo o cualitativo disponible en la técnica. De acuerdo con ciertas realizaciones de la presente invención, dos anticuerpos se unen al mismo epítopo (o a un epítopo solapante) si, por ejemplo, un exceso de 1, 5, 10, 20 o 100 veces de un anticuerpo inhibe la unión del otro al menos 50%, pero preferiblemente 75%, 90% o incluso 99%, como se mide en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cáncer Res. 1990:50:1495-1502). Como alternativa, se considera que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Se considera que dos anticuerpos tienen "epítopos solapantes" si sólo una subserie de las mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.
Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo anti-GDF8 de referencia, se realiza la metodología de unión anteriormente descrita en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una molécula de GDF8 en condiciones de saturación, seguido de la determinación de la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula de GDF8. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a una molécula de GDF8 en condiciones de saturación, seguido de la determinación de la unión del anticuerpo de referencia a la molécula de GDF8. Si, en ambas orientaciones, sólo el primer anticuerpo (saturante) es capaz de unirse a la molécula de GDF8, entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a GDF8. Como apreciará una persona de experiencia habitual en la técnica, es posible que un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia no se una necesariamente al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, pero puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia por unión a un epítopo solapante o adyacente.
Selectividad de Especie y Reactividad Cruzada de Especie Según ciertas realizaciones de la invención, los anticuerpos anti-GDF8 se unen a GDF8 humano, pero no a GDF8 de otras especies. De manera alternativa, los anticuerpos anti-GDF8 de la invención, en ciertas realizaciones, se unen a GDF8 humano y a GDF8 de una o más especies no humanas. Por ejemplo, los anticuerpos anti-GDF8 de la invención pueden unirse a GDF8 humano y pueden unirse o no, según sea el caso, a uno o más GDF8 de ratón, rata, cobaya, hámster, jerbo, cerdo, gato, perro, conejo, cabra, oveja, vaca, caballo, camello, mono cynomolgus, tití, mono rhesus o chimpancé.
Inmunoconjugados La invención abarca un anticuerpo monoclonal anti-GDF8 humano o humanizado conjugado con un resto terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunosupresor o un radioisótopo. Los agentes de citotoxinas incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. Los ejemplos de agentes de citotoxinas y de agentes quimioterapéuticos adecuados para formar inmunoconjugados son conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, el documento WO 05/103081.
Anticuerpos Multiespecíficos Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión al antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, por ejemplo, Tutt et al., 1991 , J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Los anticuerpos anti-GDF8 de la presente invención pueden unirse o co-expresarse con otra molécula funcional, p.ej., otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo puede unirse funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra forma) con una o más entidades moleculares distintas, tal como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo, para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos bi-específicos en los que un brazo de una inmunoglobulina es específico para GDF8 humano o un fragmento del mismo, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para un segundo objetivo terapéutico o está conjugado a un resto terapéutico.
Un formato de anticuerpo biespecífico ejemplar que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio CH3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio CH3 de Ig, en el que el primer y segundo dominios CH3 de Ig difieren entre sí por al menos un aminoácido, y donde al menos una diferencia de un aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la Proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácidos. En una realización, el primer dominio CH3 de Ig se une a la Proteína A y el segundo dominio CH3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión de la Proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo CH3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Otras modificaciones que pueden encontrarse dentro del segundo CH3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos lgG1 ; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos lgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M. R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos lgG4. Dentro del alcance de la presente invención se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente.
Administración Terapéutica y Formulaciones La invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la presente invención. La administración de composiciones terapéuticas de acuerdo con la invención se realizará con vehículos, excipientes y otros agentes que se incorporan en formulaciones para proporcionar una mejor transferencia, liberación, tolerancia y similares. Se puede encontrar una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invención, siempre que el ingrediente activo en la formulación no sea inactivado por la formulación y que la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la ruta de administración. Véase también Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52: 238-311.
La dosis puede variar dependiendo de la edad y las dimensiones del sujeto que va a recibir la administración, la enfermedad diana, las afecciones, la vía de administración y similares. Cuando el anticuerpo de la presente invención se usa para el tratamiento de diversas afecciones y enfermedades asociadas a GDF8, por ejemplo, distrofia muscular, atrofia muscular, síndrome de debilitación muscular, sarcopenia y caquexia, en un paciente adulto, es ventajoso administrar de manera intravenosa el anticuerpo de la presente invención normalmente en una dosis única de alrededor de 0,01 a alrededor de 20 mg/kg de peso corporal, alrededor de 0,1 a alrededor de 10 mg/kg de peso corporal, o alrededor de 0,1 a alrededor de 5 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, puede ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. En otras administraciones parenterales y orales, el anticuerpo puede administrarse en una dosis que corresponde a la dosis mencionada anteriormente. Cuando la afección es especialmente grave, la dosis se puede incrementar según la afección hasta la cantidad que provoca efectos secundarios significativos, si los hay.
Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, p.ej., encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, p.ej., Wu et al. (1987), J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a la vía intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse mediante cualquier vía conveniente, por ejemplo medíante infusión o inyección en embolada, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, la mucosa oral, la mucosa rectal e intestinal, etc.), y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos.
La administración puede ser sistémica o local.
La composición farmacéutica también puede transportarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer (1990), Science, 249:1527-1533).
Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía subcutánea o intravenosa con una aguja y jeringa convencional. Además, con respecto a la administración subcutánea, un dispositivo de liberación de tipo pluma tiene aplicaciones fácilmente para administrar una composición farmacéutica de la presente invención. Un dispositivo de suministro de pluma de este tipo se puede volver a utilizar o es desechable. Un dispositivo de suministro de pluma reutilizable utiliza, generalmente, un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica que hay dentro del cartucho y éste está vacío, el cartucho vacío se puede desechar fácilmente y reemplazar por un cartucho nuevo que contenga la composición farmacéutica. Después, el dispositivo de suministro de pluma se puede reutilizar. En un dispositivo de suministro de pluma desechable, no hay cartucho reemplazable. Más bien, el dispositivo de suministro de pluma desechable se precarga con la composición farmacéutica contenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que se ha vaciado el depósito de la composición farmacéutica, se desecha el dispositivo entero.
Numerosos dispositivos de suministro de pluma y autoinyectores reutilizables tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, GB), pluma DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Berghdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar sólo algunos. Los ejemplos de dispositivos de administración de tipo pluma desechables que tienen aplicaciones en la administración subcutánea y una composición de la presente invención incluyen, pero sin limitación, la pluma SOLOSTAR™ (sanofi- aventis), el FLEXPEN™ (Novo Nordisk), y el KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), el PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), el EPIPEN (Dey, L.P.), y la pluma HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), por nombrar sólo algunos.
En ciertas situaciones, la composición farmacéutica se puede administrar en un sistema de liberación controlada, por ejemplo, con el uso de una bomba o de materiales poliméricos. En otra realización, se puede colocar un sistema de liberación controlada cerca del objetivo de la composición, por lo que se requiere así solamente una fracción de la dosis sistémica.
Los ejemplos de la composición para administración oral incluyen formas farmacéuticas sólidas o líquidas, concretamente, comprimidos (que incluyen grageas y comprimidos revestidos con película), pildoras, gránulos, preparaciones en polvo, cápsulas (que incluyen cápsulas blandas), jarabes, emulsiones, suspensiones, etc. Tal composición se fabrica mediante métodos conocidos públicamente, y contiene un vehículo, un diluyente o un excipiente usado de manera convencional en el campo de las preparaciones farmacéuticas. Los ejemplos del vehículo o excipiente para comprimidos son lactosa, almidón, sacarosa, estearato magnésico, y similares.
Las preparaciones inyectables pueden incluir formas de dosificación para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones de goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse mediante métodos de conocimiento público. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal, descritos anteriormente, en un medio acuoso estéril o un medio oleoso que se emplee habitualmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones se encuentran, por ejemplo, la solución salina fisiológica, una solución isotónica que contenga glucosa y otros agentes auxiliares, que puede utilizarse en combinación con un agente solubilizante apropiado, como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensoactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) del aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleoso se emplea, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que puede utilizarse en combinación con un agente solubilizante, tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección preparada de esta manera se introduce preferiblemente en una ampolla apropiada.
De forma ventajosa, las composiciones farmacéuticas para el uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas de dosificación en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los ingredientes activos. Estas formas de dosificación en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, pildoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad contenida del anticuerpo mencionado anteriormente es, en general, de aproximadamente 5 a 500 mg por forma de dosificación en una dosis unitaria; especialmente, cuando está en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo mencionado anteriormente esté contenido en aproximadamente 5 a 100 mg, y en aproximadamente 10 a 250 mg para las otras formas de dosificación.
Usos Terapéuticos de los Anticuerpos Los anticuerpos de la presente invención son útiles, entre otros, para el tratamiento, la prevención y/o y la mejora de cualquier enfermedad o trastorno asociado a la actividad de GDF8. Más específicamente, los anticuerpos de la presente invención son útiles para el tratamiento de cualquier afección o padecimiento que se puede mejorar incrementando la fuerza/potencia muscular y/o la masa muscular y/o la función muscular en un individuo, o alterando de manera favorable el metabolismo (procesamiento de hidratos de carbono, lípidos y proteínas) bloqueando la actividad de GDF8. Las enfermedades, trastornos y afecciones ejemplares que se pueden tratar con los anticuerpos anti-GDF8 de la presente invención incluyen, pero sin limitación, sarcopenia, caquexia (idiopática o secundaria a otras afecciones, p.ej., cáncer, insuficiencia renal crónica, o enfermedad pulmonar obstructiva crónica), lesión muscular, debilitación muscular y atrofia muscular, p.ej., atrofia o debilitación muscular provocada o asociada a inactividad, inmobilización, reposo en cama, lesión, tratamiento médico o intervención quirúrgica (p.ej., fractura de cadera, artroplastia de cadera, artroplastia de rodilla, etc.) o por la necesidad de ventilación mecánica. Los anticuerpos anti-GDF8 de la invención se puede usar también para tratar, prevenir o mejorar enfermedades tales como cáncer, obesidad, diabetes, artritis, esclerosis múltiple, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, osteoporosis, osteoartritis, osteopenia, síndrome metabólico (que incluye, pero sin limitación, diabetes, obesidad, trastornos nutricionales, atrofia de órganos, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y anorexia).
La presente invención incluye regímenes de administración terapéutica que comprenden administrar un anticuerpo anti-GDF8 de la presente invención en combinación con al menos un componente terapéuticamente activo adicional. Los ejemplos no limitantes de tales componentes terapéuticamente activos adicionales incluyen otros antagonistas de GDF8 (p.ej., moléculas pequeñas inhibidoras de GDF8 u otros anticuerpos o moléculas de unión hacia GDF8), inhibidores de factores de crecimiento, inmunosupresores, agentes anti-inflamatorios, inhibidores metabólicos, inhibidores enzimáticos, y agentes citotóxicos/citostáticos. El/los componente(s) terapéuticamente activo(s) adicional(es) se puede(n) administrar antes, al mismo tiempo, o después de la administración del anticuerpo anti-GDF8 de la presente invención.
Usos de Diagnóstico de los Anticuerpos Los anticuerpos anti-GDF8 de la presente invención se pueden usar también para detectar y/o medir GDF8 en una muestra, p.ej., para fines de diagnóstico. Por ejemplo, un anticuerpo anti-GDF8, o un fragmento del mismo, se puede usar para diagnosticar una afección o enfermedad caracterizada por una expresión anormal (p.ej., sobre-expresión, infra-expresión, ausencia de expresión, etc.) de GDF8. Los ensayos de diagnóstico ejemplares para GDF8 pueden comprender, p.ej., poner en contacto una muestra, obtenida a partir de un paciente, con un anticuerpo anti-GDF8 de la invención, donde el anticuerpo anti-GDF8 está marcado con un marcador o molécula indicadora detectable. De manera alternativa, se puede usar un anticuerpo anti-GDF8 sin marcar en aplicaciones de diagnóstico en combinación con un anticuerpo secundario que está marcado de forma detectable. El marcador o molécula indicadora detectable puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 1 C, 32P, 35S o 125l; un resto fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, peroxidasa de rábano o luciferasa. Los ensayos ejemplares específicos que se pueden usar para detectar o medir GDF8 en una muestra incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), y separación de células activada por fluorescencia (FACS).
Las muestras que se pueden usar en ensayos de diagnóstico de GDF8 de acuerdo con la presente invención incluyen cualquier muestra de tejido o fluido que puede obtenerse a partir de un paciente que contiene cantidades detectables de proteína GDF8, o fragmentos de la misma, en condiciones normales o patológicas. En general, se medirán los niveles de GDF8 en una muestra particular obtenida a partir de un paciente sano (p.ej., un paciente que no está afectado por una enfermedad o afección asociada con niveles o actividad anormales de GDF8) para establecer inicialmente un nivel basal o estándar de GDF8. Este nivel basal de GDF8 se puede comparar después con los niveles de GDF8 medidos en muestras obtenidas a partir de individuos que se sospecha que tienen una enfermedad o afección relacionada con GDF8.
EJEMPLOS Ejemplo 1. Generación de anticuerpos humanos contra GDF8 humano.
Los ratones pueden inmunizarse por cualquier método conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, anteriormente mencionados). En una realización, el antígeno de GDF8 se administra directamente, con un adyuvante para estimular la respuesta inmunitaria, a un ratón VELOCIMMUNE® que comprende ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesada y ligera kappa de Ig humana. Los adyuvantes adecuados incluyen adyuvante completo e incompleto de Freund, sistema adyuvante de MPL+TDM (Sigma), o RIBI (dipéptidos de muramilo) (véase O'Hagan 2000, Vaccine Adjuvant, by Human Press, Totawa, NJ). La respuesta inmune de anticuerpo se controla por inmunoensayo específico de antígeno convencional. Cuando se consigue una respuesta inmune deseada, en una realización, se recogen células B que expresan anticuerpo y se fusionan con células de mieloma de ratón para preservar su viabilidad y formar líneas celulares de hibridoma. Las líneas celulares de hibridoma se exploran y seleccionan para identificar líneas celulares que producen anticuerpos con especificidad de antígeno.
De manera alternativa, se pueden aislar células de hibridoma específicas para el antígeno por citometría de flujo. En resumen, después de la fusión a células de mieloma, se cultivan células de hibridoma reunidas durante 10 días en medio HAT. Después, las células se cosechan y se tiñen con GDF8 marcado con biotina a 2 mg/ml durante una hora, seguido por la adición de ficoeritrina-estreptavidina. Las células marcadas con fluorescencia se clasifican por citometría de flujo (una sola célula por pocilio en placas de 96 pocilios que contienen medio de crecimiento de hibridoma), se cultivan durante 8-10 días y el medio de acondicionamiento se explora con respecto a la presencia de anticuerpos monoclonales funcionalmente deseables.
En otra realización, se generan anticuerpos anti-GDF8 por medio del aislamiento directo de esplenocitos. Los anticuerpos específicos del antígeno se aislan directamente a partir de las células B inmunizadas con el antígeno sin la fusión con células de mieloma, tal como se describe en el documento U.S. 2007/0280945A1. Se establecen líneas de células CHO que expresan anticuerpos recombinantes estables a partir de los recombinantes apropiados aislados.
Ejemplo 2. Análisis de la Utilización de Genes Para analizar la estructura de los anticuerpos producidos, se clonaron y secuenciaron los ácidos nucleicos que codificaban regiones variables de anticuerpo. A partir de la secuencia de ácido nucleico y de la secuencia de aminoácidos predicha de los anticuerpos, se identificó el uso de genes para cada cadena de anticuerpo. La Tabla 1 expone el uso de genes para anticuerpos seleccionados de acuerdo con la invención. Identificador del anticuerpo (HCVR/LCVR): 21-E5 (SEQ ID NO:34/42); 21-B9 (SEQ ID NO:18/26); 21-E9 (SEQ ID NO:98/106); 21-A2 (SEQ ID NO:2/10); 22-D3 (SEQ ID NO:50/58); 22-E6 (SEQ ID NO:66/74); 22-G10 (SEQ ID NO:82/90); 1A2 (SEQ ID NO:226/234); 20B12 (SEQ ID NO:274/282); 58C8 (SEQ ID NO:242/250); 19F2 (SEQ ID NO:258/266); 8D12-1 (SEQ ID NO:114/122); 4E3-7 (SEQ ID NO:194/202); 9B11-12 (SEQ ID NO:162 170); 4B9 (SEQ ID NO:226/234); 1 H4-5 (SEQ ID NO:210/218); 9B4-3 (SEQ ID NO: 178/186); 3E2-1 (SEQ ID NO:290/298); 4G3-25 (SEQ ID NO:306/314); 4B6-6 (SEQ ID NO:130/138); H4H1657N2 (SEQ ID NO:360/368); H4H1669P (SEQ ID NO:376/384).
Tabla 1 Construcciones de Control Usadas en los Ejemplos Siguientes Se incluyeron diversas construcciones de control (anticuerpos anti-GDF8 y otros antagonistas de GDF8) en los experimentos siguientes con fines comparativos. Las construcciones de control se denominan como sigue: Control I: un anticuerpo anti-GDF8 humano con regiones variables de las cadenas pesada y ligera que tienen las secuencias de aminoácidos de los dominios correspondientes de "Myo29" (es decir, SEQ ID NOs: 16 y 18) como se expone en el documento US 7.261.893; Control II un anticuerpo anti-GDF8 humano con regiones variables de las cadenas ligera y pesada que tienen la secuencia de aminoácidos de los dominios correspondientes de "2_112_K" (es decir, SEQ ID NOs: 118 y 120) como se expone en el documento US 2006/0263354; Control III: Construcción de fusión ActRIIB-Fc que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:391 ; v Control IV: construcción de fusión variante ActRIIB-Fc, idéntica al Control III excepto en que la alanina de la posición 64 de SEQ ID NO:391 [A64] está sustituida con una arginina [R64]. (No se usaron todas las construcciones de control en cada Ejemplo).
Ejemplo 3. Determinación de la Afinidad de Fijación de Antígeno.
Se determinaron las constantes de disociación en equilibrio (valores de KD) para la unión del antígeno a anticuerpos seleccionados por cinética de superficie usando un ensayo de biosensor de resonancia de plasmones superficiales en tiempo real (BIACORE™ 2000). Cada anticuerpo seleccionado se capturó en una superficie de anticuerpos policlonales anti-lgG de ratón o en una superficie de anticuerpos policlonales anti-hFc de cabra (Jackson Immuno Research Lab) creadas por medio del acoplamiento químico directo a un chip de BIACORE™ para formar una superficie de anticuerpos capturados. Se inyectó homodímero de GDF8 humano, homodímero de hGDF11, u homodímero de hGDF5 a 25 nM sobre las superficies de anticuerpos capturados, y se monitorizó la unión antígeno-anticuerpo y la disociación en tiempo real a temperatura ambiente. Se llevó a cabo el análisis cinético para calcular la KD, la constante de velocidad de disociación (kd), la constante de velocidad de asociación (ka) y la semivida de disociación del complejo antígeno/anticuerpo (Tabla 2).
Tabla 2 El experimento anterior se llevó a cabo también con GDF8 aplicado sobre una superficie de anticuerpos capturados de anticuerpos candidatos H4H1669P o H4H1657N2. Los datos preliminares mostraron una velocidad de disociación muy lenta para ambos anticuerpos, lo que indica una KD de 1-2 pM o menos.
También se determinaron los valores de KD para el antígeno que se une a los anticuerpos seleccionados como se describió anteriormente con un tampón de ensayo modificado que no contenía BSA.
Tabla 3 También se llevaron a cabo experimentos de unión de antígenos adicionales en los que se aplicaron GDF8 y GDF11 sobre una superficie de anticuerpos anti-GDF8 seleccionados y anticuerpos de control a 25°C y 37°C. Se determinaron las constantes de disociación en equilibrio (valores de KD) para la unión de antígeno a anticuerpos seleccionados por cinética de superficie usando un ensayo de biosensor de resonancia de plasmones superficiales en tiempo real (BIACORE™ T100). Cada anticuerpo seleccionado o control se capturó en una superficie de anticuerpos policlonales anti-hFc de cabra (Jackson Immuno Research Lab Cat# 109-005-098) creada por medio del acoplamiento químico directo a un chip sensor BIACORE™ CM5 para formar una superficie de anticuerpos capturados. Se inyectaron diversas concentraciones (2,5-0,625 nM, diluciones a un medio) de homodímero de hGDF8 u homodímero de hGDF1 1 (o en algunos experimentos, Activina A) sobre las superficies de anticuerpos capturados, y se monitorizó la unión antígeno-anticuerpo y la disociación en tiempo real. Se llevó a cabo el análisis cinético para calcular la KD, la constante de velocidad de disociación (kd), la constante de velocidad de asociación (ka) y la semivida de disociación del complejo antígeno/anticuerpo. Los resultados se resumen en la Tabla 4. (NB = no se observó unión).
Tabla 4 Tal como se mostró anteriormente, los anticuerpos H4H1669P, H4H1657N2, y 1A2-hlgG1 de la presente invención exhibieron todos una unión intensa a GDF8, pero no exhibieron unión a GDF1 1 . En contraste, las moléculas de control mostraron unión hacia GDF8 y GDF1 1.
Ejemplo 4. Bloqueo Mediante Anticuerpos de la Respuesta Smad2/Luciferasa Ensayo de Luciferasa Inducible por GDF8. Se desarrolló un bioensayo para determinar la capacidad de los anticuerpos anti-GDF8 seleccionados de neutralizar la función celular mediada por GDF8 o GDF1 1 in vitro mediante el uso de una línea celular A204 modificada (células de rabdomiosarcoma humano, ATCC) que contiene un promotor que responde a GDF8 o GDF1 1 que controla la expresión de la luciferasa. La inhibición de la actividad de luciferasa inducible por GDF8 o GDF1 1 se determinó como sigue: Las células se sembraron en una placa de 96 pocilios a 2 x104 células/pocilio en los medios y se incubaron durante la noche a 37°C, 5% de C02. Se añadió el anticuerpo (en diluciones en serie partiendo de 25 nM en los medios celulares) a los pocilios de células A204/Smad2 por triplicado en dos placas; se añadió GDF8 o GDF1 1 (0,8 nM) a cada pocilio. Las placas se incubaron a 37°C, 5% de C02 durante 6 horas. Se determinó la actividad de luciferasa añadiendo sustrato BRIGHT-GLO® (Promega) y se determinaron los valores de Cl50 (Tabla 5).
Tabla 5 También se analizó la capacidad de los anticuerpos anti-GDF8 seleccionados de neutralizar la función celular mediada por GDF8 o GDF11 tal como se describió anteriormente con concentraciones variables de GDF8 o GDF11. (Tabla 6). (nd = no determinado; NB = sin unión).
Tabla 6 El bioensayo descrito anteriormente se repitió mediante el uso de una construcción quimérica GDF8/TGFp-1 como péptido de activación. En particular, se usó una quimera que consistía en GDF8 maduro con los aminoácidos 48-72 sustituidos por los aminoácidos correspondientes de TGFp-1 en este experimento (SEQ ID NO:352, también denominado en la presente memoria "GDF8/TGFp[48-72]"). Esto se produjo a partir de una construcción de expresión que codificaba el precursor de GDF8 humano completo con la secuencia de TGFp-1 humano sustituyendo la secuencia de GDF8 correspondiente. La bioactividad se ensayó en un medio condicionado producido mediante la transfección transitoria de la construcción GDF8 TGFp[48-72] en células CHO. La expresión y el procesamiento se estudiaron mediante transferencia de Western. El medio condicionado se concentró 20 veces, se calentó a 80°C durante 5 minutos para inactivar el propéptido de GDF8 unido, y se estudió la actividad en una dilución en serie en el bioensayo. Aunque la concentración exacta de la proteína quimérica no se determinó en estos experimentos, la concentración típica estuvo en el intervalo de 1 - 10 ug/ml antes de la concentración. Tal como se describió anteriormente, se sembraron células que contenían un promotor que respondía a GDF8 que controlaba la expresión de la luciferasa en una placa de 96 pocilios. Se añadieron los anticuerpos seleccionados (en diluciones en serie partiendo de 100 nM en los medios celulares) a una cantidad del medio condicionado con proteína quimérica GDF8/TGFp[48-72] determinada para proporcionar la respuesta máxima. Esta mezcla se preincubó durante 45 minutos y se añadió a las células indicadoras. Se midió la actividad de la luciferasa y se calcularon los valores aproximados de Cl50, tal como se muestra en la Tabla 7 siguiente. (NB = no bloqueante).
Tabla 7 Anticuerpo que Bloquea la Bioactividad de GDF8/TGF [48-72] La construcción quimérica GDF8/TGFp[48-72] fue capaz de activar la expresión de la luciferasa en este ensayo, y 1A2-hFc y Control I fueron capaces de bloquear la bioactividad de esta construcción. Sin embargo, los anticuerpos H2M1657N2 y H1 H1669P no pudieron bloquear la bioactividad de la construcción quimérica GDF8/TGFp[48-72]. Debido a que se demostró que estos dos anticuerpos bloqueaban la bioactividad de GDF8 este sistema de ensayo (véase la Tabla 6), se puede concluir que H2M1657N2 y H1 H1669P ejercen su efecto biológico muy probablemente interaccionando con un epítopo en los aminoácidos 48-72 de GDF8.
Ejemplo 5. Inmunotransferencia de Fragmentos de HGDF8 Generados Mediante Digestión con Proteinasa K Se usó un análisis de transferencia de Western para determinar la inmunorreactividad de los mAbs de ensayo y de control hacia GDF8 humano digerido proteolíticamente con Proteinasa K. Las reacciones enzimáticas que contenían 1 pg de GDF8 humano y 0, 1 ó 6 pg de Proteinasa K se incubaron durante 10 ó 45 min en tampón de digestión. Se cargaron alícuotas iguales que contenían un 20% de la cantidad de GDF8 presente en la mezcla de reacción (200 ng) en 3 geles'distintos de un 18% de SDS-PAGE no reductores y electrotransfirieron a membranas de PVDF. Cada membrana se incubó con anticuerpo primario a 2 pg/ml seguido por el anticuerpo secundario adecuado conjugado a HRP. En la Fig. 1A-C se muestra la inmunorreactividad resultante detectada para el mAb de control I, mAb 1A2 y mAb 21-E9, respectivamente. Los resultados muestran una pérdida de reactividad hacia GDF8 para el mAb de control (A) en los carriles 3 y 6. En notable contraste, el anticuerpo 1A2 mantiene la inmunorreactividad hacia un fragmento de GDF8 más pequeño de aproximadamente un peso molecular de 17-19 kD (Fig. 1 B).
El experimento se repitió con tiempos de digestión de hasta 10 min, 1 hr o 16 hr, en presencia de 0 ó 4 pg de GDF8, y 0, 24 ó 96 pg de Proteinasa K. Los resultados (Fig. 2A-B) demuestran que en ausencia de Proteinasa K, tanto los mAbs de control como 1A2 fueron inmunorreactivos con GDF8 maduro de tamaño completo (sin digerir) (véase la Fig. 2A-B, carriles 2 y 7). En presencia de Proteinasa K, la inmunorreactividad se pierde para el mAb de control I en todos los puntos de tiempo. En notable contraste, el mAb 1A2 siguió siendo inmunorreactivo con un fragmento de GDF8 humano digerido (Fig. 2B, carriles 3-6 y 8). Estos resultados indican que el mAb 1A2 es inmunorreactivo con un fragmento menor de GDF8 que permanece intacto en presencia de Proteinasa K, mientras el mAb de control pierde la inmunorreactividad hacia el fragmento menor (17-19 kD).
Se usó un análisis de transferencia de Western modificado para determinar adicionalmente el epítopo de hGDF8 para los anticuerpos anti-hGDF8 seleccionados. La modificación fue que antes de incubar el anticuerpo primario específico de hGDF8 con la membrana, cada anticuerpo anti-hGDF8 se pre-incubó con un exceso molar de 1000 veces o 50 veces de fragmentos peptídicos de hGDF8 de 1-14 aminoácidos, 17-42 aminoácidos, 48-72 aminoácidos, o 75-105 aminoácidos. Los resultados demuestran que la pre-incubación del fragmento peptídico de 48-72 aminoácidos en un exceso molar de 50 veces fue capaz de bloquear la unión del anticuerpo 8D12 a hGDF8.
Ejemplo 6. Unión de Anticuerpos a Quimeras de GDF8 Se hicieron doce pro-proteínas GDF8 quiméricas. La Tabla 8 muestra las estructuras de las proteínas GDF8 quiméricas maduras. Las proteínas GDF8 quiméricas comprendieron dos grupos: un grupo que tenía diversas sustituciones de secuencias de GDF8 con secuencias de BMP2, y el otro grupo que tenía diversas sustituciones de secuencias de GDF8 con secuencias de TGF 1. Estas proteínas quiméricas se usaron para ensayar y localizar la unión del anticuerpo.
Tabla 8 Las diversas pro-proteínas GDF8 quiméricas se transfectaron de manera transitoria en una línea celular CHO.hFurin estable modificada. Se usó un análisis de transferencia de Western similar al descrito anteriormente para detectar la unión de diversos anticuerpos anti-hGDF8 a cada GDF8 quimérico. Brevemente, se cargaron 10 µg de sobrenadante de CHO en cada carril de un gel de SDS-PAGE (reductor o no reductor) y se electrotransfirió a una membrana de PVDF. La membrana se incubó después con un anticuerpo anti-GDF8 a 2 pg/ml seguido por la exposición al anticuerpo secundario adecuado conjugado a HRP. Tal como se muestra en la Tabla 9, el anticuerpo 8D12 no fue capaz de unirse a B48 o T48. El resultado indicó que los aminoácidos 48 a 72 de GDF8 maduro participan en la unión del anticuerpo 8D12 a GDF8.
Tabla 9 Ejemplo 7. Unión de Anticuerpos a Péptidos HGDF8 Se generaron catorce péptidos (Tabla 10) a partir de hGDF8 maduro (SEO. ID NO:340). Se usaron péptidos sin modificar, péptidos biotinilados en posición N-terminal (N-term), o péptidos biotinilados en posición C-terminal (C-term) para ensayar y localizar la unión de los anticuerpos. Se acoplaron mediante amina hGDF8 de tamaño completo, hGDF11 y péptidos sin modificar individualmente a microesferas xMAP® Multi-Analyte COOH (o esferas). Cada uno de los péptidos biotinilados se unió a microesferas xMAP® Multi-Analyte LumAvidin. La suspensión de esferas unidas a los péptidos se mezcló después con un volumen igual de tampón de bloqueo (PBS, 1% de BSA, 0,05% de Tween20, 0,05% de azida sódica) y después se distribuyó en una placa de 96 pocilios con filtro (Millipore, MULTISCREEN® BV). Después se añadieron los anticuerpos de control y de ensayo anti-hGDF8, a 2,5 µg/ml a la suspensión de esferas unidas a péptidos y se dejaron unir a las esferas a TA durante la noche. Las esferas incubadas con anticuerpos se lavaron después dos veces con PBST (PBS + 0,05% de Tween20) y se incubaron con anticuerpos anti-hFC conjugado a ficoeritrina (PE) o anti-mFC conjugado a PE a TA durante 45 min. Las esferas se lavaron de nuevo y se detectaron las señales de unión de anticuerpos a diversos péptidos con instrumentos LUMINEX® 100™ o 200™. Tal como se muestra en la Tabla 10, el anticuerpo anti-hGDF8 8D12 es capaz de unirse a los péptidos 4, 5, 6, 7, 8, y 9. En contraste, el anticuerpo anti-hGDF8 H4H1657N2 no se unió a ninguno de los péptidos (no se muestran los datos).
Tabla 10 Ejemplo 8. Efecto de los Anticuerpos Anti-GDF8 Humanos sobre la Unión de GDF8 a Activina RIIB Primero se acopló mediante amina hGDF8 maduro a esferas de Luminex®. Las esferas de Luminex® revestidas con hGDF8 se incubaron después con diversos anticuerpos anti-hGDF8, a 1 ,25 µ?/???, durante 2 hr a temperatura ambiente. Después se añadió Activina RIIB-mFc humana a la mezcla esferas-anticuerpo y se incubó durante otras 2 hr a temperatura ambiente. Las esferas se lavaron después y se tiñeron con anticuerpo policlonal anti-mFc conjugado a R-ficoeritrina (R-PE) y se midió la intensidad de fluorescencia media (MFI). Tal como se muestra en la Tabla 11 , aunque el mAb de Control I y el anticuerpo 21-E5 fueron ambos capaces de bloquear la unión entre hGDF8 y hActivina RIIB, el mAb de Control II solamente fue capaz de bloquear parcialmente la unión. El anticuerpo 1A2 no fue capaz de bloquear la unión de hGDF8 a su receptor, Activina RIIB (Tabla 11, n = 3).
Tabla 11 Ejemplo 9. Variantes del Anticuerpo 8D12 Se generaron variantes del anticuerpo 8D12 con LCVR modificadas modificando uno o más de los siguientes aminoácidos de la LCVR de 8D12: A7S o T, A8P, 9PL, S18P, V19A, M21 I, K27Q, F41Y, V42L, R44K, R55L o T, M56G o L, N58Y, L59R, A75D, R79K, A105G, L109V, y L1111.
Se determinó la afinidad de unión (KD) de las variantes del anticuerpo con respecto a hGDF8 mediante el uso de un ensayo con biosensor de resonancia de plasmones superficiales en tiempo real (BIAcore™3000) descrito anteriormente en tampón de ensayo modificado que no contenía BSA (Tabla 12).
Tabla 12 La unión entre las variantes de anticuerpos y los péptidos hGDF8 se ensayó también como se describió anteriormente en el Ejemplo 7. Las variantes de anticuerpos 8D12-v2 y 8D12-V3 mostraron una unión intensa a los péptidos 4, 5, 7, y 10 biotinilados en posición C-terminal.
Ejemplo 10. Efecto de los Anticuerpos Anti-GDF8 sobre la Masa de Músculo Esquelético Se determinó la eficacia in vivo de los mAbs anti-GDF8 seleccionados en la inducción de hipertrofia muscular esquelética. Brevemente, se dividieron uniformemente 20 ratones macho CB17 SCID, de aproximadamente 9 semanas de edad, según su peso corporal en 4 grupos. Se inyectó un mAb seleccionado (Control I, 1A2, 21 -E5, 8D12, 1A2-hlgG, o Control II) a tres dosis crecientes de 2,5 mg/kg/dosis, 5 mg/kg/dosis, y 10 mg/kg/dosis. Se usó el fragmento Fe de IgG humana como control negativo. Los anticuerpos se administraron de manera intraperitoneal dos veces durante la primera semana y una vez por semana durante las tres semanas siguientes. En el día 28, los ratones se sacrificaron y se pesaron, y se disecaron y se pesaron los músculos tibiales anteriores (TA), los músculos gastroenemios (GA), y los músculos cuádriceps (Quad), corazón, bazo, y riñon. Los tejidos se normalizaron respecto del peso corporal inicial, y se calculó el cambio en porcentaje del peso respecto del control negativo. Se repitieron seis experimentos distintos con anticuerpos: Control I, 1A2, 21-E5, 8D12, 1A2-hlgG, y Control II (Tabla 13-18). Además, el experimento también se repitió con dosis crecientes superiores de anticuerpo de control I a 10 mg/kg/dosis, 30 mg/kg/dosis, y 50 mg/kg/dosis (Tabla 9). Los resultados se expresan como incremento en porcentaje sobre el control negativo ± desviación estándar.
Tabla 13 Tabla 14 Tabla 15 Tabla 16 Tabla 17 Anticuerpo 1A2-hlgG Control Negativo Tabla 8 Tabla 19 Se llevó a cabo un experimento similar mediante el uso de los anticuerpos H4H1657N2 y H4H1669P y controles administrados a ratones SCID. En particular, se administró a ratones macho SCID de 10 semanas de edad anticuerpo de manera subcutánea a 10 mg/kg según el siguiente calendario de dosificación: 2x en la semana 1 y 1x/semana en las semanas 2 y 3. El tiempo de tratamiento total fue de 28 días. Para este experimento, se administró a 5 ratones un anticuerpo de control negativo de isotipo; se administró a 5 ratones el Control I (Myo29); se administró a 6 ratones H4H1657N2; y se administró a 6 ratones H4H1669P. Los resultados se resumen en la Tabla 20 y se expresan como el incremento en porcentaje respecto del control negativo ± desviación estándar.
Tabla 20 También se llevó a cabo un experimento similar mediante el uso de los anticuerpos H4H1657N2 y H4H1669P y controles administrados a ratones C57. En particular, se administró a ratones macho C57 de 10 semanas de edad anticuerpo de manera subcutánea a 10 mg/kg según el siguiente calendario de dosificación: 2x por semana durante dos semanas. Para este experimento, se administró a 5 ratones un anticuerpo de control negativo de isotipo; se administró a 5 ratones el Control I (Myo29); se administró a 5 ratones H4H1657N2; y se administró a 6 ratones H4H1669P. Los resultados se resumen en la Tabla 21 y se expresan como el incremento en porcentaje respecto del control negativo ± desviación estándar.
Tabla 21 A continuación, se llevaron a cabo experimentos de respuesta a dosis mediante el uso de los anticuerpos H4H1657N2 y H4H1669P en ratones SCID. En particular, se administraron a ratones macho SCID de 10 semanas de edad anticuerpos de control de manera subcutánea a 30 mg/kg, y H4H1657N2 o H4H1669P a 2,5, 10 ó 30 mg/kg, según el siguiente calendario de dosificación: 2x por semana en la semana 1 y 1x por semana posteriormente. Los resultados se resumen en las Tablas 22 y 23 y se expresan como el incremento en porcentaje respecto del control negativo ± desviación estándar.
Tabla 22 En un experimento diferente, se administró a 5 grupos de 6 ratones macho SCID de 10 semanas de edad un anticuerpo de control negativo de isotipo de manera subcutánea a 10 mg/kg, y H4H1657N2 a 0,1 , 0,75, 2,5, o 10 mg/kg, según el siguiente calendario de dosificación: 2x por semana en la semana 1 y 1x por semana posteriormente durante un total de 28 días de tratamiento. Los resultados se resumen en la Tabla 24, y se expresan como el incremento en porcentaje respecto del control negativo ± desviación estándar.
Tabla 24 Tal como se demuestra en este Ejemplo, los anticuerpos H4H1657N2 y H4H1669P produjeron incrementos significativos de la masa muscular al administrarlos a los ratones en un intervalo de dosis.
Ejemplo 11. Efecto de los Anticuerpos Anti-GDF8 sobre la Homeostasis de la Glucosa Se ensayó el efecto de los anticuerpos anti-GDF8 de la invención sobre la homeostasis de la glucosa y la sensibilidad a la insulina en un modelo de ratón de obesidad inducida por la dieta (DIO). En este experimento, se obtuvieron ratones DIO alimentando a ratones C57BL6 con una dieta de contenido elevado en grasas (45% de kcal de grasas) durante 7 siete semanas comenzando a las 9 semanas de edad. Comenzando en la semana 8, se administraron los anticuerpos a 30 mg/kg dos veces por semana durante dos semanas más, y el estudio se terminó una semana más tarde (21 días post-tratamiento). Los anticuerpos usados en este experimento fueron H4H1669P y H4H1657N2, así como un anticuerpo de control negativo de isotipo y Control I (anticuerpo anti-GDF8 correspondiente a Myo29). Los ensayos de tolerancia a la insulina se llevaron a cabo antes y después del tratamiento con los anticuerpos. Se administró insulina (2 Ul/kg) mediante inyección intraperitoneal tras un ayuno de 4 horas y se midieron los niveles de glucosa. Los resultados se ilustran en las Figuras 3A (antes del tratamiento con anticuerpos) y 3B (después del tratamiento con anticuerpos).
Como se demuestra en este experimento, la inhibición de la miostatina mediante la administración de un anticuerpo anti-GDF8 mejoró la homeostasis de la glucosa en ratones DIO. Se observó una diferencia significativa en la disminución de la glucosa en respuesta a una inyección rápida de insulina entre los grupos de anticuerpos anti-GDF8 (H4H1669P, H4H1657N2 o Control I), y el grupo de anticuerpos de control de isotipo.
Ejemplo 12. Bloqueo In Vivo de la Atrofia Muscular Mediante la Administración de H4H1657N2 Se usaron ratones C57 para determinar las propiedades in vivo de H4H1657N2 en la prevención de la atrofia muscular inducida por el escayolado/inmovilización y la administración de dexametasona.
En el ejemplo de escayolado, se anestesió a tres grupos de 8 ratones C57, y la articulación del tobillo se movilizó en un ángulo de 90° con un material de escayolado durante 14 días. Un cuarto grupo se dejó sin tratamiento, y se usó como grupo de control sin inmovilizar. Durante los 14 días de inmovilización, se administró a los ratones un anticuerpo de control negativo de isotipo; Control I (Myo29); o H4H1657N2. Se inyectó a los tres grupos de manera subcutánea un anticuerpo a 30 mg/kg, 2x por semana durante dos semanas, comenzando en el momento de la inmovilización. Los resultados se resumen en la Tabla 25, y se expresan como el cambio en porcentaje respecto del control negativo ± desviación estándar. Los resultados demostraron que después de 14 días de inmovilización, el grupo que recibió tratamiento con el anticuerpo H4H1657N2 mostró una reducción significativa en la pérdida de músculo esquelético frente al grupo de control de isotipo.
Tabla 25 (Atrofia Muscular Inducida Mediante Inmovilización) En el ejemplo de dexametasona, se anestesiaron dos grupos de 5 ratones C57 y se les implantaron de manera subcutánea bombas osmóticas que administraban 1 µg/g/día de dexametasona. Se implantaron a dos grupos adicionales bombas osmóticas que administraban solución salina y se usaron como controles. Durante los 14 días de tratamiento, se administró a dos grupos de ratones (uno de solución salina y uno de dexametasona) un anticuerpo de control negativo de isotipo; y se administró a dos grupos de ratones (uno de solución salina y uno de dexametasona) el anticuerpo H4H1657N2. Los anticuerpos se inyectaron de manera subcutánea a 30 mg/kg, 2x por semana durante dos semanas. El tratamiento con anticuerpos comenzó en el momento de la implantación de la bomba. Los resultados se resumen en la Tabla 26, y se expresan como el cambio en porcentaje respecto del control negativo ± desviación estándar. La comparación del grupo de dexametasona que recibió el anticuerpo H4H1657N2 respecto del grupo que recibió el control de isotipo indica que el tratamiento con el anticuerpo H4H1657N2 previene la pérdida de peso muscular inducida por el tratamiento con dexametasona.
Tabla 26 (Atrofia Muscular Inducida por Dexametasona) Ejemplo 13. Especificidad de H4H1657N2 in vivo Para examinar la especificidad de H4H1657N2 in vivo, se inyectó fármaco a ratones C57BL6, y el suero de los ratones tratados se sometió a un experimento de "pesca" de ligandos basado en espectrometría de masas. Brevemente, se inyectó fármaco (H4H1657N2, Control IV o control negativo de isotipo) en varios momentos (Día 0, D3, D7, D10) a lo largo de un período de 14 días en ratones C57BL6. Los animales se sacrificaron en D14 y el suero se incubó con microesferas de anti-Fc humano. Las microesferas se lavaron y el material unido se eluyó con tampón de carga de SDS-PAGE. El material eluido se sometió a SDS-PAGE y se extrajeron los fragmentos del gel que correspondían a un intervalo de pesos moleculares de 5-20 kDa. Se procesaron las muestras para la espectrometría de masas mediante el uso de condiciones estándar de reducción, alquilación y tripsinización. Las digestiones se separaron en una columna nano C18 y se transfirieron automáticamente a objetivos de placas Bruker Anchor. Se llevó a cabo el análisis MALDI-MS (MS/MS) (Bruker Ultraflextreme) de forma automatizada, mediante el uso de LC-WARP (Bruker Daltonics). Los espectros de masas se investigaron mediante el uso de MASCOT (Matrix Science) y los resultados se estudiaron con respecto al control de isotipo. Las proteínas eluidas se enumeran en la Tabla 27.
Tabla 27 Tal como se muestra en la Tabla 27, solamente se identificó GDF8 de ratón como molécula de unión para H4H1657N2 mediante este experimento. (Las secuencias de GDF8 de ratón y humano son idénticas). En contraste, el Control IV unió otros miembros de la familia de ligandos de TGF beta además de GDF8, lo que incluye, entre otros, GDF11. Este experimento confirma la especificidad de H4H1657N2 hacia GDF8 en un contexto in vivo.
La presente invención no debe limitarse en alcance por las realizaciones específicas descritas en la presente memoria. De hecho, para los expertos en la técnica serán evidentes diversas modificaciones de la invención, además de las descritas en la presente memoria, a partir de la descripción anterior y de las figuras adjuntas. Estas modificaciones se pretenden incluir dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo humano aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a, o bloquea la actividad biológica de, GDF8 humano maduro de tipo natural que comprende SEQ ID NO:340, pero que no se une a, o bloquea la actividad biológica de, una construcción quimérica GDF8 TGFP1 que tiene los aminoácidos 48-72 de GDF8 humano maduro sustituidos por la secuencia de aminoácidos correspondiente de TGF i .
2. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1 , en el que la construcción quimérica GDF8/TGFpi comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0.352.
3. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno comprende: (a) CDRs de la cadena pesada (HCDR1 , HCDR2 y HCDR3) de una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs:114, 360 y 376; y (b) CDRs de la cadena ligera (LCDR1 , LCDR2 y LCDR3) de una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 122, 368 y 384.
4. Un anticuerpo humano aislado, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une específicamente a GDF8 humano maduro de tipo natural que comprende la SEC ID N°:340, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende: (a) CDRs de la cadena pesada (HCDR1 , HCDR2 y HCDR3) de una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 114, 360 y 376; y (b) CDRs de la cadena ligera (LCDR1 , LCDR2 y LCDR3) de una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 122, 368 y 384.
5. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno comprende: (a) las secuencias de aminoácidos de HCDR1/HCDR2/HCDR3 seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 16/1 18/120; 362/364/366; y 376/380/382; y (b) las secuencias de aminoácidos de LCDR1/LCDR2/LCDR3 seleccionadas del grupo de consiste en SEQ ID NOs: 124/126/128; 370/372/374; y 386/388/390.
6. El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende las secuencias de aminoácidos de CDRs de las cadenas pesada y ligera seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 116/118/120/124/126/128; 362/364/366/370/372/374; y 376/380/382/386/388/390.
7. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno comprende un par de secuencias de aminoácidos de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera (HCVR/LCVR) seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 14/122; 360/368; y 376/384.
8. Un anticuerpo humano aislado o el fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende SEQ ID NO:340, donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende secuencias de aminoácidos de HDCR1 , HCDR2, HCDR3, LCDR1 , LCDR2 y LCDR3, donde: (a) la HCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 (SEQ ID NO:329), en la que X1 es Gly; X2 es Phe; X3 es Thr; X4 es Phe; X5 es Ser; X6 es Ala o Ser; X7 es Phe o Tyr; X8 es Gly o Ala; (b) la HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 - X2 - X3 -X4 - X5 - X6 - X7 - X8 (SEQ ID NO:330), en la que X1 es He; X2 Gly o Ser; X3 es Tyr o Gly; X4 Ser o Asp; X5 es Gly; X6 es Gly; X7 es Ser o Asn; y X8 es Ala o Glu; (c) la HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 - X2 - X3 -X4 - Xs - X6 - X7 - X8 - X9 - X10 - X11 - X12 - X13 - X14 (SEQ ID NO:331 ), en la que X1 es Ser o Ala; X2 es Thr o Lys; X3 es Asp o He; X4 es Gly o Ser; X5 es Ala o His; X6 es Trp o Tyr; X7 es Lys o Asp; X8 es et o He; X9 es Ser o Leu; X10 es Gly o Ser; X11 es Leu o Gly; X12 es Asp o Met; X13 es Val o Asp; X14 es Val o no está; (d) la LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 (SEQ ID NO:332), en la que X1 es Gln; X2 es Asp o Gly; X3 es He; X4 es Ser; X5 es Asp o Asn; y X6 es Tyr o Trp; (e) la LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 - X2 - X3 (SEQ ID N0.333), en la que X1 es Thr o Ala; X2 es Thr o Ala; y X3 es Ser; y (f) la LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 - X9 (SEQ ID NO:334), en la que X1 es Gln; X2 es Lys o Gln; X3 es Ala o Tyr; X4 es Asp o Asn; X5 es Ser; X6 es Ala o Phe; X7 es Pro; X8 es Leu; y X9 es Thr.
9. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno no se une a un epítopo lineal dentro de GDF8 maduro de tipo natural (SEQ ID NO:340).
10. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno no se une a péptidos GDF8 aislados que tiene secuencias de aminoácidos de aminoácidos 1-14, 1-18, 17-42, 48-65, 48-69, 48-72, 52-65, 52-72, 56-65, 56-72, 65-72, 73-90, 75-105 y 91-105, de SEQ ID NO:340.
11. Un anticuerpo humano aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une al mismo epítopo en GDF8 humano maduro de tipo natural (SEQ ID NO:340) que el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Un anticuerpo humano aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que compite por la unión a GDF8 humano maduro de tipo natural (SEQ ID NO:340) con el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
13. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
14. El anticuerpo asilado o el fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o la composición farmacéutica de la reivindicación 13, para usar en medicina.
15. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o la composición farmacéutica de la reivindicación 13, para el uso en el tratamiento de un paciente que padece, al que se le ha diagnosticado, o que corre el riesgo de padecer una enfermedad o trastorno que es tratable mediante la inhibición de la actividad de GDF8.
16. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno, o la composición farmacéutica de la reivindicación 15, en el que la enfermedad o el trastorno que es tratable mediante la inhibición de la actividad de GDF8 es una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en sarcopenia, caquexia, y atrofia muscular debida a inactividad o inmovilización.
17. Uso del anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o la composición farmacéutica de la reivindicación 13, en la fabricación de un medicamento para el uso en el tratamiento de un paciente que padece, al que se le ha diagnosticado, o que corre el riesgo de padecer una enfermedad o trastorno que es tratable mediante la inhibición de la actividad de GDF8.
18. El uso como se definió en la reivindicación 17, en el que la enfermedad o el trastorno que es tratable mediante la inhibición de la actividad de GDF8 es una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en sarcopenia, caquexia, y atrofia muscular debida a inactividad o inmovilización.
19. Un método terapéutico para inhibir la actividad de GDF8 en un paciente, y dicho método comprende administrar a un paciente que lo necesita el anticuerpo aislado o el fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o la composición farmacéutica de la reivindicación 13.
20. El método de la reivindicación 19, en el que el paciente padece, se le ha diagnosticado, o corre el riesgo de padecer una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en sarcopenia, caquexia, y atrofia muscular debida a inactividad o inmovilización. RESUMEN La presente invención proporciona anticuerpos humanos o humanizados aislados o fragmentos de unión al antígeno de de los mismos que se unen de manera específica al factor-8 de crecimiento y diferenciación (GDF8) y bloquean la actividad de GDF8. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la presente invención se pueden usar en métodos terapéuticos para tratar enfermedades o trastornos que son aliviados o mejorados por la inhibición de GDF8.
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