BR112020001679A2

BR112020001679A2 - anticorpos anti-cd47 e usos dos mesmos

Info

Publication number: BR112020001679A2
Application number: BR112020001679-9A
Authority: BR
Inventors: Minghan Wang; Hui Zou; Joshua OAKS; Haiqun Jia
Original assignee: Phanes Therapeutics, Inc.
Priority date: 2017-08-02
Filing date: 2018-07-30
Publication date: 2020-07-21
Also published as: US11401329B2; CN111183155A; JP2020536488A; EP3661965A1; US20200207853A1; WO2019027903A1; IL272330A; ZA202000373B; SG11202000053TA; KR102646468B1; MX2020001309A; CA3071860A1; KR20200033948A; AU2018312222A1; EP3661965A4; JP7262440B2; CN111183155B; NZ761568A

Abstract

A presente invenção se refere a anticorpos anti-CD47 e seus fragmentos de ligação ao antígeno. A invenção também se refere a ácidos nucleicos que codificam os anticorpos, composições compreendendo os anticorpos, e métodos de produção dos anticorpos e uso dos anticorpos para tratamento ou prevenção de doenças como câncer, doenças inflamatórias, doenças infecciosas, aterosclerose, doenças cardiovasculares, doenças metabólicas, lesão induzida por radiação e/ou doenças autoimunes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPOS ANTI-CD47 E USOS DOS MESMOS".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este Pedido de Patente reivindica o benefício do Pedido de Patente US nº 62/540,118, depositado em 02 de agosto de 2017, e Pedido de Patente US nº 62/657,094, depositado em 13 de abril de

2018. Cada um dos documentos acima é aqui incorporado por refe- rência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção se refere a anticorpos monoclonais anti-CD47, ácidos nucleicos e vetores de expressão que codificam os anticorpos, células recombinantes contendo os vetores e a composi- ções compreendendo os anticorpos. Também são fornecidos métodos de fabricação dos anticorpos, e métodos de uso dos anticorpos para o tratamento de doenças, incluindo câncer, doenças inflamatórias, doen- ças infecciosas, aterosclerose, doença cardiovascular, doenças meta- bólicas, lesão induzida por radiação e/ou doenças autoimunes. REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA APRESENTADA ELE-

TRONICAMENTE

[003] Este pedido de patente contém uma listagem de sequência, que é apresentada eletronicamente via EFS-Web como uma listagem de sequência de formatada em ASCII com um nome de arquivo "689204.2WO Sequence Listing", uma data de criação de 05 de Julho de 2018 e com um tamanho de 95 kb. A listagem de sequência apre- sentada via EFS-Web é parte do relatório descritivo e é aqui incorpo- rada por referência em sua totalidade.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[004] As células cancerosas podem desenvolver várias capaci- dades de conservação para evitar o ataque pelo hospedeiro, incluindo o ataque do sistema imunológico. Ou elas adotam a aparência nativa na superfície celular como células humanas normais ou elas interrom- pem o ataque imunológico após a captura por células imunológicas. Esse último mecanismo tem sido solidamente justificado pelo incrível sucesso de anticorpos monoclonais terapêuticos que visam os imu- nossupressores CTLA-4, PD-1 e PD-L1. Esses anticorpos inativam o checkpoint imunológico e permitem que as células-T organizem ata- ques eficazes a células cancerosas, resultando em eficácia duradoura em alguns pacientes. O sucesso inicial desses anticorpos renovou o campo da imuno-oncologia e inspirou a pesquisa e o desenvolvimento de outras terapias para mobilizar o sistema imunológico humano no combate ao câncer.

[005] O sistema imunológico humano consiste em imunidades inatas e adaptativas. Os atuais bloqueadores do checkpoint e modula- dores do microambiente tumoral na prática clínica ou em desenvolvi- mento farmacêutico visam a imunidade adaptativa. Os bloqueadores do checkpoint e moduladores do microambiente tumoral mobilizam as células-T, salvando as células T auxiliares e as células T assassinas da exaustão, esgotando as células T reguladoras imunossupressoras, ou bloqueando a formação do microambiente tumoral imunossupres- sor. Mais recentemente, novas evidências indicam que as células tu- morais também suprimem a imunidade inata, e a suavização dessa supressão demonstrou grande potencial terapêutico in vitro e in vivo no tratamento de cânceres.

[006] A imunidade inata é a primeira linha de defesa contra agen- tes patogênicos invasores. Ela é feita de mecanismos defensivos e leucócitos que envolvem antígenos. Entre eles, os macrófagos remo- vem por fagocitose as células hospedeiras disfuncionais, envelhecidas e infectadas. As células tumorais também evitam o ataque de macró- fagos por superexpressão do agrupamento de diferenciação 47 (CD47) (também conhecido como proteína associada à integrina), um marcador que também é expresso de forma onipresente na superfície de células normais. Curiosamente, na presença de anticorpos que blo- queiam especificamente o CD47, os macrófagos atacam as células tumorais in vitro no ensaio da fagocitose e eliminam tumores in vivo em modelos de xenoenxerto. Atualmente, vários agentes terapêuticos que visam o CD47 entraram na fase clínica do desenvolvimento de fármacos.

[007] O CD47, identificado pela primeira vez como uma proteína associada à integrina, é um receptor-ligante e interage com muitas proteínas. O CD47 é o receptor da trombospondina-1 (TSP1), um dos ligantes secretados com melhor caracterização. Por outro lado, o CD47 é o ligante para proteína reguladora de sinal alfa (SIRPα), um receptor inibitório expresso na superfície de macrófagos. É a última ligação que impede os macrófagos de ingerirem células cancerosas.

[008] Como todas as imunoterapias para o câncer, o bloqueio do CD47 pode induzir o ataque imune não intencional em células nor- mais, causando uma toxicidade limitante da dose. De fato, um anticor- po de bloqueio do CD47, o B6H12, causa hemaglutinação, presumi- velmente por ligação ao CD47 nos glóbulos vermelhos. Surpreenden- temente, esse anticorpo bloqueia a ligação tanto do TSP1 quanto da SIRPα ao CD47. Não é claro, porém, se o bloqueio da interação do TSP1 por B6H12 é responsável pela hemaglutinação. Além disso, pro- põe-se que os macrófagos podem atacar as células normais quando suas moléculas CD47 superficiais são mascaradas por anticorpos anti- CD47 administrados sistematicamente. Portanto, é de grande impor- tância o desenvolvimento de anticorpos anti-CD47 que tenham maior especificidade a células tumorais e reduzida toxicidade a células nor- mais.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] Em um aspecto geral, a invenção se refere a anticorpos monoclonais isolados ou seus fragmentos de ligação a antígenos que se ligam ao CD47. São fornecidos anticorpos monoclonais isolados ou seus fragmentos de ligação ao antígeno compreendendo uma região determinante da complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, uma região determinante da complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências polipeptídicas de: (1) SEQ ID NOs: 177, 46, 47, 178, 112 e 179, respectivamente; (2) SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 117, 118 e 119, respectivamente; (3) SEQ ID NOs: 54, 55, 56, 120, 121 e 122, respectivamente; (4) SEQ ID NOs: 57, 58, 59, 123, 124 e 125, respectivamente; (5) SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 126, 127 e 128, respectivamente; (6) SEQ ID NOs: 180, 181, 182, 129, 130 e 131, respectivamente; (7) SEQ ID NOs: 72, 73, 74, 138, 139 e 140, respectivamente; (8) SEQ ID NOs: 78, 79, 80, 144, 145 e 146, respectivamente; (9) SEQ ID NOs: 81, 82, 83, 147, 148 e 149, respectivamente; (10) SEQ ID NOs: 84, 85, 86, 150, 151 e 152, respectivamente; (11) SEQ ID NOs: 87, 88, 89, 153, 154 e 155, respectivamente; (12) SEQ ID NOs: 90, 91, 92, 156, 157 e 158, respectivamente; (13) SEQ ID NOs: 93, 94, 95, 159, 160 e 161, respectivamente; (14) SEQ ID NOs: 96, 97, 98, 162, 163 e 164, respectivamente; (15) SEQ ID NOs: 99, 100, 101, 165, 166 e 167, respectivamente; (16) SEQ ID NOs: 102, 103, 104, 168, 169 e 170, respectivamente; (17) SEQ ID NOs: 105, 106, 107, 171, 172 e 173, respectivamente; (18) SEQ ID NOs: 108, 109, 110, 174, 175 e 176, respectivamente; ou (19) SEQ ID NOs: 201, 202, 203, 204, 205 e 206, respectivamente; em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga especificamente ao CD47, de preferência o CD47 humano.

A SEQ ID NO: 177 é representada pela sequência de aminoácidos GYTFTX1YY, em que X1 é um aminoácido selecionado a partir de D ou A.

A SEQ ID

NO: 178 é representada pela sequência de aminoácidos X1NVGTY, em que X1 é um aminoácido selecionado a partir D ou E. A SEQ ID NO: 179 é representada pela sequência de aminoácidos GQX1YSYPLT, em que X1 é um aminoácido selecionado a partir de S ou T. A SEQ ID NO: 180 é representada pela sequência de aminoáci- dos GYTFTSX1W, em que X1 é um aminoácido selecionado a partir de S ou Y. A SEQ ID NO: 181 é representada pela sequência de ami- noácidos IDPSDSEX1, em que X1 é um aminoácido selecionado a partir de T ou A. A SEQ ID NO: 182 é representada pela sequência de aminoácidos X1RWGYYGKSAX2DY, em que X1 é um aminoácido se- lecionado a partir de A ou S e X2 é um aminoácido selecionado a partir de I ou M.

[0010] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variá- vel da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo me- nos 95% idêntica à SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 ou 43, ou uma região variável da ca- deia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 95% idên- tica à SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 ou 44.

[0011] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno compreende: (a) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 1; e/ou uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 2; (b) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 3; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 4; (c) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 5; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 6; (d) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 7; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 8; (e) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 9; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 10; (f) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 11; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 12; (g) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 13; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 14; (h) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 15; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 16; (i) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 17; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 18; (j) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 19; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 20; (k) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 21; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 22; (l) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 23; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 24; (m) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 25; e uma região variável da ca-

deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 26; (n) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 27; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 28; (o) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 29; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 30; (p) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 31; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 32; (q) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 33; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 34; (r) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 35; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 36; (s) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 37; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 38; (t) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 39; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 40; (u) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 41; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 42; ou (v) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 43; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 44.

[0012] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno é quimérico.

[0013] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno é humano ou humanizado.

Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal humanizado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende: a. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 183; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 191; b. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 183; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 192; c. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 183; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 193; d. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 184; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 190; e. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 184; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 192; f. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 184; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 193; g. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 185; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 190; h. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 185; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 191; i. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 185; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 193; j. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 185; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 198; k. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 187; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 194; l. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 188; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 194; m. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 188; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 196; n. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 188; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 197; ou o. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 199; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 200.

[0014] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno é capaz de bloquear a liga- ção do CD47 à trombospondina-1 (TSP1) e/ou à proteína reguladora de sinal alfa (SIRPα).

[0015] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno é capaz de induzir a fagoci- tose mediada por macrófagos de células cancerosas.

[0016] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno é capaz de ligar células cancerosas com ligação mínima a não detectável aos glóbulos verme- lhos.

[0017] Também são fornecidos ácidos nucleicos isolados que codi- ficam os anticorpos monoclonais ou seus fragmentos de ligação ao antígeno da invenção.

[0018] Também são fornecidos vetores compreendendo os ácidos nucleicos isolados que codificam os anticorpos monoclonais ou os seus fragmentos de ligação ao antígeno da invenção.

[0019] Também são fornecidas células hospedeiras compreen- dendo os vetores compreendendo os ácidos nucleicos isolados que codificam os anticorpos monoclonais ou os seus fragmentos de ligação ao antígeno da invenção.

[0020] Em algumas modalidades, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção e um carreador farma- ceuticamente aceitável.

[0021] Também são fornecidos métodos de bloqueio da ligação do CD47 à trombospondina-1 (TSP1) e/ou CD47 à proteína reguladora de sinal alfa (SIRPα) em um indivíduo em sua necessidade, compreen- dendo administrar ao indivíduo as composições farmacêuticas da in- venção.

[0022] Também são fornecidos métodos de tratamento de câncer em um indivíduo em sua necessidade, compreendendo administrar ao indivíduo as composições farmacêuticas da invenção. O câncer pode ser qualquer câncer líquido ou sólido, por exemplo, ele pode ser sele- cionado a partir de, mas não se limita a, um câncer de pulmão, um câncer gástrico, um câncer de cólon, um carcinoma hepatocelular, um carcinoma de células renais, um carcinoma urotelial da bexiga, um me- lanoma metastático, um câncer de mama, um câncer de ovário, um câncer do colo do útero, um câncer de cabeça e pescoço, um câncer pancreático, um glioma, um glioblastoma e outros tumores sólidos, e um linfoma não Hodgkin (NHL), uma leucemia linfocítica aguda (ALL),

uma leucemia linfocítica crônica (CLL), uma leucemia mieloide crônica (CML), um mieloma múltiplo (MM), uma leucemia mieloide aguda (AML) e outros tumores líquidos.

[0023] Também são fornecidos métodos de tratamento de uma doença inflamatória em um indivíduo em sua necessidade, compreen- dendo administrar ao indivíduo as composições farmacêuticas da in- venção.

[0024] Também são fornecidos métodos de tratamento de uma doença infecciosa em um indivíduo em sua necessidade, compreen- dendo administrar ao indivíduo as composições farmacêuticas da in- venção.

[0025] Também são fornecidos métodos de tratamento de ateros- clerose em um indivíduo em sua necessidade, compreendendo admi- nistrar ao indivíduo as composições farmacêuticas da invenção.

[0026] Também são fornecidos métodos de tratamento de uma doença cardiovascular em um indivíduo em sua necessidade, compre- endendo administrar ao indivíduo as composições farmacêuticas da invenção.

[0027] Também são fornecidos métodos de tratamento de uma doença metabólica em um indivíduo em sua necessidade, compreen- dendo administrar ao indivíduo as composições farmacêuticas da in- venção.

[0028] Também são fornecidos métodos de tratamento de uma lesão induzida por radiação em um indivíduo em sua necessidade, compreendendo administrar ao indivíduo as composições farmacêuti- cas da invenção.

[0029] Também são fornecidos métodos de tratamento de uma doença autoimune em um indivíduo em sua necessidade, compreen- dendo administrar ao indivíduo as composições farmacêuticas da in- venção.

[0030] Também são fornecidos métodos de determinação de um nível do CD47 em um indivíduo. Os métodos compreendem (a) obter uma amostra do indivíduo; b) colocar a amostra em contato com um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção; e (c) determinar um nível do CD47 no indivíduo. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de tecido ou de sangue. A amostra de tecido pode ser, por exemplo, uma amostra de tecido com câncer. A amostra de sangue pode, por exemplo, compreender células cancerosas.

[0031] Também são fornecidos métodos de produção do anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção, compreendendo a cultura de uma célula compreendendo um ácido nu- cleico que codifica o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno sob condições para produzir o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno, e recuperar o anticorpo ou o frag- mento de ligação ao antígeno da célula ou cultura.

[0032] Também são fornecidos métodos de produção de uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal ou o seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção, compreendendo combinar o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antíge- no com um carreador farmaceuticamente aceitável para obter a com- posição farmacêutica.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0033] O sumário acima, bem como a descrição detalhada a seguir das modalidades preferidas do presente pedido de patente serão me- lhor compreendidos quando lidos em conjunto com os desenhos ane- xos. Deve ser entendido, no entanto, que o pedido de patente não é limitado às modalidades precisas indicadas nos desenhos.

[0034] A figura 1 mostra um gráfico da ligação de mAbs anti-CD47 a células RAJI por análise FACS. Os grupos de controle "CTL Mu 2º Ab" e "CTL Hu 2º Ab" não foram tratados com anticorpos primários,

mas foram tratados com Abs secundários IgG anti-humano e antica- mundongo conjugados a AlexaFluor488, respectivamente.

[0035] As figuras 2A-2P mostram gráficos da atividade dos mAbs anti-CD47 que bloqueiam a interação entre CD47(ECD)-HIS e SIRPα- huFc, como analisado por ELISA. As curvas foram produzidas e os valores IC50 foram calculados com o software Prism GraphPad, v7. A figura 2A mostra um gráfico da atividade do mAb anti-CD47 15G23A. A figura 2B mostra um gráfico da atividade do mAb anti-CD47 17C6A. A figura 2C mostra um gráfico da atividade do mAb anti-CD47 13B18A. A figura 2D mostra um gráfico da atividade do mAb anti-CD47 4M8A. A figura 2E mostra um gráfico da atividade do mAb anti-CD47 14D18A. A figura 2F mostra um gráfico da atividade do mAb anti-CD47 11G2A. A figura 2G mostra um gráfico da atividade do mAb anti-CD47 13C4A. A figura 2H mostra um gráfico da atividade do mAb anti-CD47 5D24A. A figura 2I mostra um gráfico da atividade do mAb anti-CD47 9O23A. A figura 2J mostra um gráfico da atividade do mAb anti-CD47 17N8A. A figura 2K mostra um gráfico da atividade do mAb anti-CD47 14P6A. A figura 2L mostra um gráfico da atividade do mAb anti-CD47 19L14A. A figura 2M mostra um gráfico da atividade do mAb anti-CD47 14O18A. A figura 2N mostra um gráfico da atividade do mAb anti-CD47 1J7A. A figura 2O mostra um gráfico da atividade do mAb anti-CD47 16M17A. A figura 2P mostra um gráfico da atividade do mAb anti-CD47 18M19A (quimérico com cadeia pesada do IgG4 humano e cadeia leve Capa).

[0036] As figuras 3A-3B mostram a avaliação dos mAbs anti-CD47 em um ensaio de hemaglutinação usando sangue fresco de um doa- dor. O tampão de purificação, B6H12, e PBS foram usados como con- troles. As concentrações de anticorpos são indicadas acima do painel. A figura 3A mostra os resultados do ensaio de hemaglutinação para mAbs anti-CD47 14P6A, 11F6A, 18M19A, 19L14A, 3O5A, 10I23A, 14N13A, 14O18A, 13C4A, 16M17A e 17O12A. A figura 3B mostra os resultados do ensaio de hemaglutinação para mAbs anti-CD47 12B18A, 4M8A, 13B18A, 11G2A, 5D24A, 14D18A, 17C6A, 17N8A, 9O23A, 15G23A e 1J7A, e os controles PBS e B6H12.

[0037] As figuras 4A-4C mostram gráficos da atividade antitumoral in vivo, peso corporal e a exposição sérica em camundongos tratados com o mAb anti-CD47 13B18A-huIgG1. A figura 4A mostra a atividade antitumoral in vivo do 13B18A-huIgG1 em um modelo de camundongo de xenoenxerto RAJI heteróloga; rituximabe foi usado como controle positivo. A figura 4B mostra os dados relativos ao peso corporal dos animais em diferentes grupos durante o estudo. A figura 4C mostra a exposição sérica do 13B18A-huIgG1 nos grupos tratados com mAb 2 dias após a última dose.

[0038] As figuras 5A e 5B mostram a atividade do mAbs anti-CD47 humanizado H3L9 (figura 5A) e H5L5 (figura 5B) no bloqueio da inte- ração entre o CD47(ECD)-HIS humano e huSIRPα-muFc, como anali- sado por ELISA.

[0039] A figura 6 mostra os resultados para o ensaio de hemaglu- tinação com mAbs humanizado H3L9, H55L e H8L10. O mAb de ca- mundongo 15G23A foi usado como controle positivo.

[0040] As figuras 7A-7B mostram os resultados para os ensaios de ligação dosa glóbulos vermelhos (RBC) (figura 7A) e célula RAJI (figu- ra 7B) com mAbs humanizados H3L9, H55L e H8L10.

[0041] A figura 8 mostra a atividade dos mAbs anti-CD47 humani- zados H3L9, H5L5 e H8L10 no bloqueio da ligação do huSIRPα-muFc a células RAJI. "2nd Ab apenas" e "controle sem mAb/sem 2nd Ab" são controles negativos.

[0042] A figura 9 mostra a atividade dos mAbs anti-CD47 humani- zados H3L9, H5L5 e H8L10 na indução da fagocitose mediada por macrófagos de células RAJI.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0043] Várias publicações, artigos e patentes são citados ou des- critos nos fundamentos e ao longo do pedido de patente; cada uma dessas referências é aqui incorporada por referência em sua totalida- de. A discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou similares que foi incluída no presente pedido de patente tem a fina- lidade de fornecer contexto para a invenção. Essa discussão não é uma declaração de que qualquer ou todas essas matérias fazem parte da técnica anterior em relação a quaisquer invenções reveladas ou reivindicadas.

[0044] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que comumente entendido por aqueles especialistas na técnica à qual pertence esta invenção. Caso contrário, alguns termos aqui usados têm os significados conforme definidos no relatório descritivo.

[0045] Deve ser notado que, como usado aqui e nas reivindica- ções anexas, as formas singulares "uma", "uma" e/ou "o", "a" incluem as referências plurais, a menos que o contexto determine claramente o contrário.

[0046] Salvo disposição em contrário, quaisquer valores numéri- cos, como uma concentração ou uma faixa de concentrações descrita neste documento, devem ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Assim, um valor numérico inclui normalmente ± 10% do valor indicado. Por exemplo, uma concentra- ção de 1 mg/mL inclui 0,9 mg/mL a 1,1 mg/mL. Da mesma forma, uma faixa de concentração de 1% a 10% (p/v) inclui 0,9% (p/v) a 11% (p/v). Como usado neste documento, o uso de um intervalo numérico inclui expressamente todos os possíveis subintervalos, todos os valores nu- méricos individuais dentro desse intervalo, incluindo números inteiros dentro desses intervalos e frações dos valores, a menos que o contex- to indique claramente o contrário.

[0047] Salvo indicação em contrário, a expressão "pelo menos" antes de série de elementos anteriores deve ser entendida como se referindo a cada elemento na série. Aqueles com conhecimento na técnica irão reconhecer, ou serem capazes de avaliar usando apenas a experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades da invenção descritas neste documento. Esses equivalentes devem ser abrangidos pela invenção.

[0048] Como usado neste documento, os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "tem", "tendo", "contém" ou "contendo", ou qualquer outra variação, devem ser entendidos como implicando a inclusão de um número inteiro ou grupo de números intei- ros declarado, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros, e serão não exclusivos ou abrangentes. Por exemplo, uma composição, uma mistura, um processo, um méto- do, um artigo ou um aparelho que compreende uma lista de elementos não é necessariamente limitado a apenas os elementos, mas pode in- cluir outros elementos não expressamente listados ou inerentes a essa composição, mistura, processo, método, artigo ou aparelhos. Além disso, a menos que expressamente indicado em contrário, "ou" deve ser considerado em termo inclusivo, não exclusivo. Por exemplo, uma condição A ou B é satisfeita por qualquer uma das seguintes: A é ver- dadeira (ou presente) e B é falsa (ou ausente), A é falsa (ou ausente) e b é verdadeira (ou presente), e ambas A e B são verdadeiras (ou presentes).

[0049] Como usado neste documento, o termo conjuntivo "e/ou" entre vários elementos enumerados é entendido como abrangendo tanto as opções individuais quanto conjuntas. Por exemplo, quando dois elementos são combinados por "e/ou", a primeira opção se refere à aplicabilidade do primeiro elemento sem o segundo. Uma segunda opção se refere à aplicabilidade do segundo elemento sem o primeiro.

Uma terceira opção se refere à aplicabilidade dos primeiro e segundo elementos juntos. Qualquer uma dessas opções deve ser entendida como abrangida pelo significado, e, portanto, satisfaz o requisito do termo "e/ou", como usado neste documento. A aplicabilidade simultâ- nea de mais de uma das opções é também entendida como abrangida pelo significado, e, portanto, satisfaz o requisito do termo "e/ou".

[0050] Como usado neste documento, o termo "consiste em", ou variações como "consistem em" ou "consistindo em", como usado ao longo do relatório descritivo e reivindicações, indica a inclusão de qualquer número inteiro enumerado ou grupo de números inteiros, po- rém números inteiros adicionais ou grupos de números inteiros podem ser adicionados ao método, estrutura ou composição especificada.

[0051] Como usado neste documento, o termo "consiste essenci- almente em", ou variações como "consistem essencialmente em" ou "consistindo essencialmente em", como usados ao longo do relatório descritivo e reivindicações, indica a inclusão de qualquer número intei- ro enumerado ou grupo de números inteiros, e a inclusão opcional de qualquer número inteiro enumerado ou grupos que números inteiros que não mudem essencialmente as propriedades básicas ou novas do método, estrutura ou composição especificada. Veja M.P.E.P. §

2111.03.

[0052] Neste documento, "indivíduo" significa qualquer animal, de preferência um mamífero, mais preferivelmente um ser humano. O termo "mamífero", como usado neste documento, abrange qualquer mamífero. Exemplos de mamíferos incluem, mas não se limitam a, va- cas, cavalos, ovelhas, porcos, gatos, cães, camundongos, ratos, coe- lhos, porquinhos-da-índia, macacos, seres humanos, etc., de preferên- cia um ser humano.

[0053] As palavras "direita" e "esquerda", "inferior" e "superior" de- signam direções nos desenhos aos quais se faz referência.

[0054] Também deve ser entendido que os termos "cerca de", "aproximadamente", "geralmente", "substancialmente" e termos simila- res aqui usados, quando se referem a uma dimensão ou característica de um componente da invenção preferida, indicam que a dimen- são/característica descrita não é um limite ou parâmetro estrito e não exclui pequenas variações resultantes que sejam funcionalmente iguais ou semelhantes, como seria entendido por aquele com conhe- cimento na técnica. No mínimo, essas referências que incluem um pa- râmetro numérico incluiriam variações que, usando princípios matemá- ticos e industriais aceitos na técnica (por exemplo, arredondamento, medições ou outros erros sistemáticos, tolerâncias de fabricação, etc.), não variariam o dígito menos significativo.

[0055] Os termos "idêntico" e "identidade" percentual, no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos (por exemplo, anticorpos anti-CD47, polipeptídeos CD47 e polinucleotídeos que os codificam), se referem a duas ou mais sequências ou subse- quências que sejam as mesmas ou tenham um determinado percentu- al de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que sejam os mesmos, quando comparadas e alinhadas para a máxima correspondência, co- mo medido usando um dos algoritmos de comparação de sequência a seguir ou por inspeção visual.

[0056] Para comparação de sequência, normalmente uma se- quência atua como uma sequência de referência com a qual as se- quências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de compa- ração de sequência, sequências de teste e de referência são alimen- tadas a um computador, coordenadas de subsequência são designa- dos, se necessário, e são designados os parâmetros do programa de algoritmo de sequência. O algoritmo de comparação de sequência, então, calcula o percentual da identidade de sequência para a(s) se- quência(s) de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros designados para o programa.

[0057] O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser feito, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinha- mento por homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método de busca por similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementações com- putadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA em Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspeção visual (veja, em geral, os Protocolos Atuais em Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, uma investida conjunta entre a Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (1995 Suplemento) (Ausu- bel)).

[0058] Exemplos de algoritmos que são adequados para determi- nar o percentual da identidade de sequência e a similaridade entre se- quências são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 e Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, respectivamente. O software para realização de análises com BLAST está disponível ao público através do National Center for Biotechnology Information. Esse algoritmo en- volve, primeiro, a identificação de pares de sequência com alta pontu- ação (HSPs) pela identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, que correspondem ou satisfazem uma pon- tuação limite de valor positivo T, quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de dados. T é referido como o limite de pontuação da palavra vizinha (Altschul et al, supra). Esses acertos iniciais de palavras vizinhas agem como sementes para iniciar buscas para encontrar HSPs mais longos que os contenham. Os acertos das palavras são, então, estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência, até o ponto em que a pontuação de ali- nhamento cumulativa puder ser aumentada.

[0059] Pontuações cumulativas são calculadas usando, para se- quências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontuação de recompen- sa para um par de resíduos correspondentes; sempre > 0) e N (pontu- ação de penalidade para resíduos não correspondentes; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é usada para calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos acertos da pa- lavra em cada direção é interrompida quando: a pontuação de alinha- mento cumulativa diminui na quantidade X de seu máximo valor alcan- çado; a pontuação cumulativa vai a zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos com pontuação negativa; ou quando o fim de uma sequência é atingido. Os parâmetros do algorit- mo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do ali- nhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expec- tativa (E) de 10, M=5, N=-4, e a comparação de ambas as vertentes. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como pa- drões um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (veja Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:10915 (1989)).

[0060] Além do cálculo do percentual da identidade de sequência, o algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similari- dade entre duas sequências (veja, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. EUA 90:5873-5787 (1993)). Uma medida de si- milaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual ocorreria por acaso uma correspondência entre duas sequências de aminoácidos e nucleotídeos. Por exemplo, um ácido nucléico é consi- derado semelhante a uma sequência de referência se a menor proba-

bilidade de soma em uma comparação do ácido nucleico de teste ao ácido nucleico de referência for inferior a cerca de 0,1, mais preferi- velmente inferior a cerca de 0,01, e ainda mais preferivelmente inferior a 0,001.

[0061] Outra indicação de que duas sequências de ácidos nuclei- cos ou polipeptídeos são substancialmente idênticos é que o polipeptí- deo codificado pelo primeiro ácido nucléico é imunologicamente reati- vo com o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico, como descrito abaixo. Assim, um polipeptídeo normalmente é substancial- mente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem apenas em substituições conservativas. Outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substanci- almente idênticas é que as duas moléculas hibridizam entre si sob condições rigorosas.

[0062] Como usado neste documento, os termos "inibem", "inibir" e "inibição" significam diminuição na atividade, resposta, condição, do- ença ou outros parâmetros biológicos. Isso pode incluir, mas não se limita a, eliminação completa da atividade, resposta, condição ou do- ença. Isso também pode incluir, por exemplo, uma redução de 10% na atividade, resposta, condição ou doença em comparação ao nível ori- ginal ou de controle. Dessa forma, a redução pode ser de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100%, ou qualquer quantidade de redução in- termediária, em comparação aos níveis originais ou de controle. Por meio de um exemplo não limitante, um anticorpo da invenção pode inibir a atividade de uma proteína CD47. A atividade da proteína CD47 pode ser reduzida ou eliminada em relação à atividade original da pro- teína CD47.

ANTICORPOS

[0063] A invenção se refere a anticorpos anti-CD47 isolados, áci- dos nucleicos e vetores de expressão que codificam os anticorpos, cé-

lulas recombinantes contendo os vetores e a composições compreen- dendo os anticorpos. Também são fornecidos métodos de fabricação dos anticorpos, e métodos de uso dos anticorpos para o tratamento de doenças, incluindo câncer, doenças inflamatórias, doenças autoimu- nes, aterosclerose, doença cardiovascular, doenças metabólicas, le- são induzida por radiação e/ou doenças infecciosas. Os anticorpos da invenção possuem um ou mais propriedades funcionais desejáveis, incluindo, mas não limitadas a, ligação de alta afinidade a CD47, alta especificidade a CD47, a capacidade e/ou incapacidade de bloquear a ligação do CD47 à trombospondina-1 (TSP1), a capacidade de blo- quear a ligação do CD47 à proteína reguladora de sinal alfa (SIRP), a capacidade de induzir a fagocitose de células que expressam o CD47 associadas a doenças ou distúrbios (incluindo, mas não limitados a, câncer e aterosclerose), e a capacidade de inibir o crescimento tumo- ral em modelos animais e indivíduos, quando administrados isolada- mente ou em combinação com outras terapias anticâncer, e a incapa- cidade de induzir a hemaglutinação.

[0064] Em um aspecto geral, a invenção se refere a anticorpos monoclonais isolados ou seus fragmentos de ligação a antígenos que se ligam ao CD47.

[0065] Como usado neste documento, o termo "anticorpo" é usado em um sentido amplo e inclui moléculas de imunoglobulina ou anticor- po, incluindo anticorpos humanos, humanizados, compostos e anticor- pos quiméricos e fragmentos de anticorpos que sejam monoclonais ou policlonais. Em geral, os anticorpos são cadeias de proteínas ou pep- tídeos que apresentam especificidade de ligação a um antígeno espe- cífico. As estruturas dos anticorpos são bem conhecidas. As imuno- globulinas podem ser atribuídas a cinco classes principais (ou seja, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM), dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante da cadeia pesada. As IgA e IgG são ainda sub-

classificadas como os isotipos IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Assim, os anticorpos da invenção podem ser de qualquer uma das cinco principais classes ou subclasses correspondentes. De preferên- cia, os anticorpos da invenção são IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. As ca- deias leves de anticorpos de espécies vertebradas podem ser atribuí- das a um de dois tipos claramente distintos, chamados capa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constan- tes. Assim, os anticorpos da invenção podem conter um domínio cons- tante de cadeia leve capa ou lambda. De acordo com as modalidades particulares, os anticorpos da invenção incluem regiões constantes de cadeias pesadas e/ou leves de anticorpos humanos ou de ratos. Além dos domínios constantes de cadeias leves e pesadas, os anticorpos contêm uma região de ligação ao antígeno que é composta de uma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada, cada uma delas contém três domínios (ou seja, as regiões determinan- tes de complementaridade 1-3; (CDR1, CDR2 e CDR3)). Os domínios da região variável de cadeia leve são alternativamente referidos como LCDR1, LCDR2 e LCRD3, e os domínios da região variável de cadeia pesada são alternativamente referidos como HCDR1, HCRD2 e HCDR3.

[0066] Como usado neste documento, o termo um "anticorpo iso- lado" se refere a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos com diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente ao CD47 é substan- cialmente isento de anticorpos que não se ligam ao CD47). Além dis- so, um anticorpo isolado é substancialmente isento de outro material celular e/ou substâncias químicas.

[0067] Como usado neste documento, o termo "anticorpo mono- clonal" se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos indi-

viduais que compõem a população são idênticos, exceto para possí- veis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais da invenção po- dem ser produzidos pelo método do hibridoma, tecnologia exibição de fago, tecnologia de clonagem de genes de linfócito único, ou por mé- todos de DNA recombinante. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal não humano transgênico, como um camundongo ou rato transgênico, tendo um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve humanos.

[0068] Como usado neste documento, o termo "fragmento de liga- ção ao antígeno" se refere a um fragmento de anticorpo tal como, por exemplo, um diacorpo, a fragmento Fab, um Fab’, um F(ab’)2, um Fv, um fragmento Fv estabilizado com bissulfeto (dsFv), um (dsFv)2, um dsFv biespecífico (dsFv-dsFv’), um um diacorpo estabilizado com bis- sulfeto (diacorpo ds), uma molécula de anticorpos de cadeia única (scFv), um anticorpo de domínio único (sdab), um dímero scFv (dia- corpo bivalente), um anticorpo multiespecífico formado de uma parte de um anticorpo que compreende um ou mais CDRs, um anticorpo de domínio único camelizado, um nanocorpo, um anticorpo de domínio, um anticorpo de domínio bivalente ou qualquer outro fragmento de an- ticorpo que se ligue a um antígeno, mas não compreende uma estrutu- ra completa de anticorpo. Um fragmento de ligação ao antígeno é ca- paz de se ligar ao mesmo antígeno ao qual se liga o anticorpo de ori- gem ou um fragmento de anticorpo de origem. De acordo com as mo- dalidades particulares, o fragmento de ligação ao antígeno compreen- de uma região variável da cadeia leve, uma constante região da ca- deia leve e um segmento Fd da cadeia pesada. De acordo com outras modalidades particulares, o fragmento de ligação ao antígeno compre- ende Fab e F(ab’).

[0069] Como usado neste documento, o termo "anticorpo de ca- deia única" se refere a um anticorpo de cadeia única convencional no campo, que compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve ligadas por um peptídeo curto de cerca de 15 a cerca de 20 aminoácidos. Como usado neste documento, o termo "anticorpo de domínio único" se refere a um anticorpo de domí- nio único convencional no campo, que compreende uma região variá- vel da cadeia pesada e uma região constante da cadeia pesada, ou que compreende apenas uma região variável da cadeia pesada.

[0070] Como usado neste documento, o termo "anticorpo humano" se refere a um anticorpo produzido por um ser humano ou um anticor- po com uma sequência de aminoácidos correspondente a um anticor- po produzido por um ser humano, feito usando qualquer técnica co- nhecida na arte. Essa definição de um anticorpo humano inclui anti- corpos intactos ou de comprimento total, seus fragmentos, e/ou anti- corpos humanos compreendendo pelo menos um polipeptídeo de ca- deia pesada e/ou leve.

[0071] Como usado neste documento, o termo "anticorpo humani- zado" se refere a um anticorpo humano que é modificado para aumen- tar a homologia de sequência a sequência de um anticorpo humano, de tal forma que as propriedades de ligação ao antígeno do anticorpo são mantidas, mas sua antigenicidade no corpo humano é reduzida.

[0072] Como usado neste documento, o termo "anticorpo quiméri- co" se refere a um anticorpo em que a sequência de aminoácidos da molécula de imunoglobulina é derivada de duas ou mais espécies. A região variável de ambas as cadeias leve e pesada muitas vezes cor- responde à região variável de um anticorpo derivado de uma espécie de mamífero (por exemplo, camundongo, rato, coelho, etc.) tendo a especificidade, a afinidade e a capacidade desejadas, enquanto as regiões constantes correspondem às sequências de um anticorpo de-

rivado de outra espécie de mamífero (por exemplo, o ser humano) pa- ra evitar a estimulação de uma resposta imune nessa espécie.

[0073] Como usado neste documento, o termo "anticorpo multies- pecífico" se refere a um anticorpo que compreende uma pluralidade de sequências de domínio variável da imunoglobulina, em que uma pri- meira sequência de domínio variável da imunoglobulina da pluralidade tem especificidade de ligação para um primeiro epítopo, e uma segun- da sequência de domínio variável da imunoglobulina da pluralidade tem especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma mo- dalidade, o primeiro e o segundo epítopos estão no mesmo antígeno, por exemplo, a mesma proteína (ou subunidade de uma proteína mul- timérica). Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos se sobrepõem ou se sobrepõem substancialmente. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos não se sobrepõem ou não se sobre- põem substancialmente. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos estão em antígenos diferentes, por exemplo, proteínas dife- rentes (ou subunidade de uma proteína multimérica). Em uma modali- dade, um anticorpo multiespecífico compreende um terceiro, quarto ou quinto domínio variável da imunoglobulina. Em uma modalidade, um anticorpo multiespecífico é uma molécula de anticorpo biespecífico, um anticorpo triespecífico, ou uma molécula de anticorpo tetraespecífi- co.

[0074] Como usado neste documento, o termo "anticorpo biespecí- fico" se refere a um anticorpo multiespecífico que se liga a mais do de dois epítopos ou dois antígenos. Um anticorpo biespecífico é caracte- rizado por uma primeira sequência de domínio variável da imunoglobu- lina que tem especificidade de ligação para um primeiro epítopo e um segunda sequência de domínio variável da imunoglobulina que tem especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modali- dade, o primeiro e o segundo epítopos estão no mesmo antígeno, por exemplo, a mesma proteína (ou subunidade de uma proteína multimé- rica). Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos se sobre- põem ou se sobrepõem substancialmente. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos estão em antígenos diferentes, por exemplo, proteínas diferentes (ou subunidade de uma proteína multi- mérica). Em uma modalidade, um anticorpo biespecífico compreende uma sequência de domínio variável da cadeia pesada e uma sequên- cia de domínio variável da cadeia leve que têm especificidade de liga- ção para um primeiro epítopo e uma sequência de domínio variável da cadeia pesada e uma sequência de domínio variável da cadeia leve que têm especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modalidade, um anticorpo biespecífico compreende um meio anticor- po, ou um anticorpo dele, tendo especificidade de ligação para um primeiro epítopo, e um meio anticorpo, ou fragmento dele, tendo espe- cificidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modalidade, um anticorpo biespecífico compreende um scFv, ou seu fragmento, tendo especificidade de ligação para um primeiro epítopo, e um ScFv, ou um seu fragmento, tendo uma especificidade de ligação para um epítopo. Em uma modalidade, o primeiro epítopo está localizado no CD47 e o segundo epítopo está localizado no PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, EGFR, HER-2, CD19, CD20, CD33, CD73, apelina, DLL3, claudina18.2, TIP-1, receptor de folato alfa, CD3 e/ou outros imunossupressores associados ao tumor ou antígenos de superfície.

[0075] Como usado neste documento, o termo "CD47" se refere a um receptor transmembrana de múltipla abrangência pertencente à superfamília de imunoglobulinas, que tem sido indicado como envolvi- do em vários processos celulares, incluindo a migração, aderência ce- lular e a função de células T. O CD47, também conhecido como prote- ína associada à integrina (IAP), antígeno de câncer de ovário (OA3), Rh, antígeno relacionado ao Rh e MER6, foi originalmente identificado como um antígeno tumoral no câncer de ovário humano e, posterior- mente, se mostrou como expresso em vários tipos de tumores huma- nos, incluindo tumores hematológicos e sólidos. A interação entre o CD47 e a proteína reguladora de sinal alfa (SIRP), uma proteína inibi- tória expressa em macrófagos, impede a fagocitose de células que ex- pressam o CD47. O CD47 é adicionalmente expresso em níveis baixos em praticamente todas as células não malignas. O termo "CD47 hu- mano" se refere ao um CD47 originado de um ser humano. A sequên- cia de aminoácidos exemplificativa de um CD47 humano está repre- sentada no GenBank como número de acesso NP_001768.1 (SEQ ID NO: 207).

[0076] Como usado neste documento, um anticorpo que "se liga especificamente ao CD47" se refere a um anticorpo que se liga a um CD47, de preferência um CD47 humano, com um KD de 1×10-7 M ou menos, de preferência 1×10-8 M ou menos, de preferência 5×10-9 M ou menos, 1×10-9 M ou menos, 5×10-10 M ou menos, ou 1×10-10 M ou me- nos. O termo "KD" se refere à constante de dissociação, que é obtida a partir da razão de Kd para Ka (ou seja, Kd/Ka), e é expressa como uma concentração molar (M). Os valores de Kd para anticorpos podem ser determinados usando os métodos na técnica, tendo em vista a presente invenção. Por exemplo, o KD de um anticorpo pode ser de- terminado usando ressonância plasmônica de superfície, tal como usando um sistema de biossensor, por exemplo, um sistema Biacore®, ou usando tecnologia de interferometria de biocamada, tal como um sistema Octet RED96.

[0077] Quanto menor o valor da Kd de um anticorpo, maior a afini- dade com que o anticorpo se liga ao antígeno-alvo. De acordo com um aspecto particular, a invenção se refere a um anti- corpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região determinante da complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), uma HCDR2, uma HCDR3, uma região determinante da complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma LCDR2 e uma LCDR3, tendo as sequências polipeptídicas das: (1) SEQ ID NOs: 177, 46, 47, 178, 112 e 179, respectivamente; (2) SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 117, 118 e 119, respectivamente; (3) SEQ ID NOs: 54, 55, 56, 120, 121 e 122, respectivamente; (4) SEQ ID NOs: 57, 58, 59, 123, 124 e 125, respectivamente; (5) SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 126, 127 e 128, respectivamente; (6) SEQ ID NOs: 180, 181, 182, 129, 130 e 131, respectivamente; (7) SEQ ID NOs: 72, 73, 74, 138, 139 e 140, respectivamente; (8) SEQ ID NOs: 78, 79, 80, 144, 145 e 146, respectivamente; (9) SEQ ID NOs: 81, 82, 83, 147, 148 e 149, respectivamente; (10) SEQ ID NOs: 84, 85, 86, 150, 151 e 152, respectivamente; (11) SEQ ID NOs: 87, 88, 89, 153, 154 e 155, respectivamente; (12) SEQ ID NOs: 90, 91, 92, 156, 157 e 158, respectivamente; (13) SEQ ID NOs: 93, 94, 95, 159, 160 e 161, respectivamente; (14) SEQ ID NOs: 96, 97, 98, 162, 163 e 164, respectivamente; (15) SEQ ID NOs: 99, 100, 101, 165, 166 e 167, respectivamente; (16) SEQ ID NOs: 102, 103, 104, 168, 169 e 170, respectivamente; (17) SEQ ID NOs: 105, 106, 107, 171, 172 e 173, respectivamente; (18) SEQ ID NOs: 108, 109, 110, 174, 175 e 176, respectivamente; ou (19) SEQ ID NOs: 201, 202, 203, 204, 205 e 206, respectivamente; em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga especificamente ao CD47, de preferência o CD47 humano.

[0078] A SEQ ID NO: 177 é representada pela sequência de ami- noácidos 1 GYTFTX1YY, em que X1 é um aminoácido selecionado a partir de D ou A.

[0079] A SEQ ID NO: 178 é representada pela sequência de ami- noácidos X1NVGTY, em que X1 é um aminoácido selecionado a partir D ou E.

[0080] A SEQ ID NO: 179 é representada pela sequência de ami- noácidos GQX1YSYPLT, em que X1 é um aminoácido selecionado a partir de S ou T.

[0081] A SEQ ID NO: 180 é representada pela sequência de ami- noácidos 1 GYTFTSX1W, em que X1 é um aminoácido selecionado a partir de S ou Y.

[0082] A SEQ ID NO: 181 é representada pela sequência de ami- noácidos IDPSDSEX1, em que X1 é um aminoácido selecionado a par- tir de T ou A.

[0083] A SEQ ID NO: 182 é representada pela sequência de ami- noácidos X1RWGYYGKSAX2DY, em que X1 é um aminoácido selecio- nado a partir de A ou S, e X2 é um aminoácido selecionado a partir de I ou M.

[0084] De acordo com outro aspecto particular, a invenção se refe- re a um anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 ou 43, ou uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptí- deos pelo menos 85%, de preferência pelo menos 90%, mais preferi- velmente 95% idêntica a uma dentre SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 ou 44. De acordo com uma modalidade preferida, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variá- vel da cadeia pesada com a sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 ou 43, e uma região variável da cadeia leve com uma sequên- cia de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais prefe-

rivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 ou 44, respectivamente.

[0085] De acordo com outro aspecto particular, a invenção se refe- re a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção, compreendendo: a. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 1; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 2; b. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 3; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 4; c. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 5; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 6; d. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 7; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 8; e. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 9; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 10; f. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 11; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 12; g. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 13; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 14; h. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 15; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 16; i. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 17; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 18; j. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 19; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 20; k. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 21; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 22; l. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 23; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 24; m. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 25; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 26; n. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 27; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 28; o. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 29; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 30; p. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 31; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 32; q. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 33; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 34; r. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 35; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 36; s. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 37; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 38; t. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 39; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 40; u. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 41; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 42; ou v. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 43; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 44.

[0086] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 45, 46, 47, 111, 112 e 113, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idên- tica à SEQ ID NO: 1, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 2. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 1; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 2.

[0087] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 48, 49, 50, 114, 115 e 116, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idên- tica à SEQ ID NO: 3, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 4. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 3; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 4.

[0088] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 117, 118 e 119, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idên- tica à SEQ ID NO: 5, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 6. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 5; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 6.

[0089] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 54, 55, 56, 120, 121 e 122, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idên- tica à SEQ ID NO: 7, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 8. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 7; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 8.

[0090] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 57, 58, 59, 123, 124 e 125, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idên- tica à SEQ ID NO: 9, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 10. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 9; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 10.

[0091] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 126, 127 e 128, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idên- tica à SEQ ID NO: 11, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 12. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 11; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 12.

[0092] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 63, 64, 65, 129, 130 e 131, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idên- tica à SEQ ID NO: 13, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 14. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 13; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 14.

[0093] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 66, 67, 68, 132, 133 e 134, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idên- tica à SEQ ID NO: 15, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 16. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 15; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 16.

[0094] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 69, 70, 71, 135, 136 e 137, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idên- tica à SEQ ID NO: 17, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 18. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 17; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 18.

[0095] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 72, 73, 74, 138, 139 e 140, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idên- tica à SEQ ID NO: 19, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 20. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 19; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 20.

[0096] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 75, 76, 77, 141, 142 e 143, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idên- tica à SEQ ID NO: 21, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 22. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 21; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 22.

[0097] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 78, 79, 80, 144, 145 e 146, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idên- tica à SEQ ID NO: 23, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 24. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 23; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 24.

[0098] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 81, 82, 83, 147, 148 e 149, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idên- tica à SEQ ID NO: 25, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 26. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 25; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 26.

[0099] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 84, 85, 86, 150, 151 e 152, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idên- tica à SEQ ID NO: 27, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 28. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 27; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 28.

[00100] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 87, 88, 89, 153, 154 e 155, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idên- tica à SEQ ID NO: 29, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 30. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 29; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 30.

[00101] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 90, 91, 92, 156, 157 e 158, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idên- tica à SEQ ID NO: 31, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 32. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 31; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 32.

[00102] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 93, 94, 95, 159, 160 e 161, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idên- tica à SEQ ID NO: 33, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 34. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 33; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 34.

[00103] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 96, 97, 98, 162, 163 e 164, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idên- tica à SEQ ID NO: 35, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 36. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 35; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 36.

[00104] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 99, 100, 101, 165, 166 e 167, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 37, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 38. De prefe- rência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 37; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 38.

[00105] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 102, 103, 104, 168,

169 e 170, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 39, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 40. De prefe- rência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 39; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 40.

[00106] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 105, 106, 107, 171, 172 e 173, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 41, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 42. De prefe- rência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 41; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 42.

[00107] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 108, 109, 110, 174,

175 e 176, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 43, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 44. De prefe- rência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 43; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 44.

[00108] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compre- endendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 201, 202, 203, 204, 205 e 206, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 199, e uma região variável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 85%, de preferência 90%, mais preferivelmente 95% idêntica à SEQ ID NO: 200. De prefe- rência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 199; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:

200.

[00109] De acordo com outro aspecto particular, a invenção se refe- re a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção da invenção, em que o anticorpo ou seu frag-

mento de ligação ao anticorpo é quimérico.

[00110] De acordo com outro aspecto particular, a invenção se refe- re a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é humano ou humanizado.

[00111] De acordo com outro aspecto particular, a invenção se refe- re a um anticorpo monoclonal humanizado isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, em que o anticorpo humanizado isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende: a. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 183; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 191; b. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 183; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 192; c. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 183; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 193; d. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 184; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 190; e. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 184; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 192; f. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 184; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 193; g. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 185; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 190;

h. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 185; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 191; i. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 185; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 193; j. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 185; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 198; k. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 187; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 194; l. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 188; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 194; m. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 188; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 196; n. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 188; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 197; ou o. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 199; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 200.

[00112] De acordo com outro aspecto particular, a invenção se refe- re a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é capaz de bloquear a ligação do CD47 à trombospondina-1 (TSP1) e/ou à proteína reguladora de sinal alfa (SIRP).

[00113] De acordo com outro aspecto particular, a invenção se refe-

re a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é capaz de induzir a fagocitose mediada por macrófagos de células cancerosas.

[00114] De acordo com outro aspecto particular, a invenção se refe- re a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é capaz de ligar as células cancerosas com ligação mínima a não de- tectável aos glóbulos vermelhos. A ligação de células cancerosas pelo anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção pode ser determinada usando métodos conhecidos na arte.

[00115] Em outro aspecto geral, a invenção se refere a um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo monoclocal ou seu frag- mento de ligação ao antígeno da invenção. Será apreciado por aque- les versados na técnica que a sequência de codificação de uma prote- ína pode ser alterada (por exemplo, substituída, excluída, inserida, etc.) sem alterar a sequência de aminoácidos da proteína. Por conse- guinte, será compreendido por aqueles versados na técnica que as sequências de ácidos nucleicos que codificam anticorpos monoclonais ou seus fragmentos de ligação ao antígeno da invenção podem ser alteradas sem modificação das sequências de aminoácidos das prote- ínas.

[00116] Em outro aspecto geral, a invenção se refere a um vetor compreendendo um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo monoclocal ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção. Qualquer vetor conhecido por aqueles versados na técnica, tendo em vista a presente invenção, pode ser usado, como um plasmídeo, um cosmídeo, um vetor fago ou um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão recombinante, tal como um plasmí-

deo. O vetor pode incluir qualquer elemento para estabelecer uma fun- ção convencional de um vetor de expressão, por exemplo, um promo- tor, elemento de ligação ribossômica, terminador, potenciador, marca- dor de seleção e origem de replicação. O promotor pode ser um pro- motor constitutivo, induzível ou repressível. Vários vetores de expres- são capazes de fornecer ácidos nucleicos a uma célula são conheci- dos na técnica e podem ser usados aqui para a produção de um anti- corpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno na célula. As técnicas de clonagem convencionais ou a síntese de genes artificiais pode ser usada para gerar um vetor de expressão recombinante de acordo com as modalidades da invenção.

[00117] Em outro aspecto geral, a invenção se refere a uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo monoclocal ou seu fragmento de ligação ao antígeno da in- venção. Qualquer célula hospedeira conhecida para aqueles versados na técnica, tendo em vista presente invenção, pode ser usada para expressão recombinante de anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno da invenção. Em algumas modalidades, as células hospe- deiras são células TG1 ou BL21 de E. coli (para a expressão de, por exemplo, um anticorpo scFv ou Fab), células CHO-DG44 ou CHO-K1 ou células HEK293 (para expressão de, por exemplo, um anticorpo IgG de comprimento total). De acordo com modalidades particulares, o vetor de expressão recombinante é transformado em células hospedei- ras por métodos convencionais, como transfecção química, choque térmico ou eletroporação, onde ele é integrado de forma estável ao genoma da célula hospedeira, de modo que o ácido nucleico recombi- nante é expresso de forma eficaz.

[00118] Em outro aspecto geral, a invenção se refere a um método de produção de um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção, compreendendo a cultura de uma célula compreendendo um ácido nucleico que codifica o anticorpo monoclo- nal ou o seu fragmento de ligação ao antígeno sob condições para produzir o anticorpo monoclonal ou o seu fragmento de ligação ao an- tígeno, e recuperar o anticorpo ou o seu fragmento de ligação ao antí- geno da célula ou cultura de células (por exemplo, a partir do sobrena- dante). Os anticorpos expressos ou seus fragmentos de ligação ao an- tígeno podem ser colhidos das células e purificados de acordo com as técnicas convencionais conhecidas na arte e como aqui descrito.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[00119] Em outro aspecto geral, a invenção se refere a uma com- posição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal isola- do ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção e um carrea- dor farmaceuticamente aceitável. O termo "composição farmacêutica", como aqui usado, significa um produto compreendendo um anticorpo da invenção juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitá- vel. Os anticorpos da invenção e as composições que os contêm tam- bém são úteis na fabricação de um medicamento para as aplicações terapêuticas aqui mencionadas.

[00120] Como usado neste documento, o termo "carreador" se refe- re a qualquer excipiente, diluente, enchimento, sal, tampão, estabili- zante, solubilizante, óleo, lipídio, vesícula contendo lipídios, microesfe- ras, encapsulação lipossomal ou outro material bem conhecido na téc- nica para uso em formulações farmacêuticas. Será entendido que as características do carreador, excipiente ou diluente dependerão da via de administração para uma aplicação particular. Como usado neste documento, o termo "carreador farmaceuticamente aceitável" se refere a um material não tóxico que não interfere com a eficácia de uma composição de acordo com a invenção ou a atividade biológica de uma composição de acordo com a invenção. De acordo com modali- dades particulares, tendo em vista a presente invenção, qualquer car-

reador farmaceuticamente aceitável adequado para uso em uma com- posição farmacêutica de anticorpo pode ser usado na invenção.

[00121] A formulação de ingredientes farmaceuticamente ativos com carreadores farmaceuticamente aceitáveis é conhecida na técni- ca, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (por exemplo, 21º edição (2005), qualquer edição posterior). Exemplos não limitantes de ingredientes adicionais incluem: tampões, diluentes, solventes, agentes de regulação da tonicidade, conservantes, estabili- zantes e agentes quelantes. Um ou mais carreadores farmaceutica- mente aceitáveis podem ser usados na formulação das composições farmacêuticas da invenção.

[00122] Em uma modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica é uma formulação líquida. Um exemplo preferido de uma formula- ção líquida é uma formulação aquosa, ou seja, uma formulação con- tendo água. A formulação líquida pode compreender uma solução, uma suspensão, uma emulsão, uma microemulsão, um gel e similares. Uma formulação aquosa normalmente compreende pelo menos 50% (p/p) de água, ou pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou pe- lo menos 95% (p/p) de água.

[00123] Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode ser formulada como uma solução injetável que pode ser injetada, por exemplo, através de um dispositivo de injeção (por exemplo, uma se- ringa ou uma bomba de infusão). A injeção pode ser entregue por via subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravitral ou intravenosa, por exemplo.

[00124] Em outra modalidade, a composição farmacêutica é uma formulação sólida, por exemplo, uma composição liofilizada ou seca por pulverização, que pode ser usada na forma que se apresenta, ou à qual o médico ou o paciente adiciona solventes e/ou diluentes antes do uso. Formas de dosagem sólidas podem incluir comprimidos, como comprimidos prensados, e/ou comprimidos revestidos e cápsulas (por exemplo, cápsulas de gelatina de consistência mole ou dura). A com- posição farmacêutica também pode ser sob a forma de sachês, drá- geas, pós, grânulos, pastilhas ou pós para reconstituição, por exemplo.

[00125] As formas de dosagem podem ser de liberação imediata, caso em que elas podem compreender um carreador solúvel em água ou dispersível, ou elas podem ser de liberação retardada, liberação prolongada ou liberação modificada, caso em que elas podem conter polímeros insolúveis em água que regulam a taxa de dissolução da forma de dosagem no trato gastrintestinal ou sob a pele.

[00126] Em outras modalidades, a composição farmacêutica pode ser entregue por via intranasal, intraoral ou sublingual.

[00127] O pH de uma solução aquosa pode ser entre pH 3 e pH 10. Em uma modalidade da invenção, o pH da formulação é de cerca de 7,0a cerca de 9,5. Em outra modalidade da invenção, o pH da formu- lação é de cerca de 3,0 a cerca de 7,0.

[00128] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica contém um tampão. Exemplos não limitantes de tampões incluem: arginina, ácido aspártico, bicina, citrato, fosfato dissódico hidrogenado, ácido fumárico, glicina, glicilglicina, histidina, lisina, ácido maleico, áci- do málico, acetato de sódio, carbonato de sódio, fosfato de sódio hi- drogenado, fosfato de sódio, succinato, ácido tartárico, tricina e tris(hidroximetil)-aminometano e suas misturas. O tampão pode estar presente, individualmente ou em combinação, em uma concentração de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml. Composições farmacêuticas com- preendendo cada um desses tampões específicos constituem modali- dades alternativas da invenção.

[00129] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica contém um conservante. Exemplos não limitantes de conservantes incluem cloreto de benzetônio, ácido benzoico, álcool benzílico, brono- pol, 4-hidroxibenzoato de butila, clorobutanol, clorocresol, cloro- hexidina, clorofenesina, o-cresol, m-cresol, p-cresol, 4-hidroxibenzoato de etila, imidureia, 4-hidroxibenzoato de metila, fenol, 2-fenoxietanol, 2-feniletanol, 4-hidroxibenzoato de propila, de-hidroacetato de sódio, timerosal e suas misturas. O conservante pode estar presente, indivi- dualmente ou em combinação, em uma concentração de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/ml a cer- ca de 20 mg/ml. Composições farmacêuticas compreendendo cada um desses conservantes específicos constituem modalidades alternativas da invenção.

[00130] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica contém um agente isotônico. Exemplos não limitantes da modali- dade incluem um sal (como cloreto de sódio), um aminoácido (como glicina, histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano e treonina), um alditol (como glicerol, 1,2-propanodiol propilenoglicol), 1,3-propanodiol e 1,3-butanodiol), polietilenoglicol (por exemplo, PEG400) e suas misturas. Outro exemplo de um agente isotônico in- clui um açúcar. Exemplos não limitantes de açúcares podem ser mo- no-, di- ou polissacarídeos, ou glucanos solúveis em água, incluindo, por exemplo, frutose, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose, lacto- se, sacarose, trealose, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, alfa e beta- HPCD, amido solúvel, hidroxietil amido, carboximetilcelulose de sódio. Outro exemplo de um agente isotônico é um álcool de açú- car, onde o termo "álcool de açúcar" é definido como um hidrocarbone- to C(4-8) com pelo menos um grupo -OH. Exemplos não limitantes de álcoois de açúcar incluem manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol e arabitol. Composições farmacêuticas compreendendo cada agente isotônico listado neste parágrafo constituem modalidades alter- nativas da invenção. O agente isotônico pode estar presente, individu-

almente ou em combinação, em uma concentração de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/ml a cer- ca de 20 mg/ml. Composições farmacêuticas compreendendo cada um desses agentes isotônicos específicos constituem modalidades alter- nativas da invenção.

[00131] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica contém um agente quelante. Exemplos não limitantes de agentes quelantes incluem ácido cítrico, ácido aspártico, sais do ácido etileno- diaminotetra-acético (EDTA) e suas misturas. O agente quelante pode estar presente, individualmente ou em combinação, em uma concen- tração de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml. Composições farmacêuticas compreendendo cada um desses agentes quelantes específicos cons- tituem modalidades alternativas da invenção.

[00132] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica contém um estabilizante. Exemplos não limitantes de estabilizan- tes incluem um ou mais inibidores de agregação, um ou mais inibido- res de oxidação, um ou mais tensoativos e/ou um ou mais inibidores da protease.

[00133] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um estabilizante, em que o dito estabilizante é carbó- xi-/hidroxicelulose e seus derivados (como HPC, HPC-SL, HPC-L e HPMC), ciclodextrinas, 2-metiltioetanol, polietileno glicol (como PEG 3350), álcool polivinílico (PVA), polivinil pirrolidona, sais (como cloreto de sódio), substâncias contendo enxofre, como monotioglicerol), ou ácido tioglicólico. O estabilizante pode estar presente, individualmente ou em combinação, em uma concentração de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml. Composições farmacêuticas compreendendo cada um desses estabilizantes específicos constituem modalidades alternativas da in-

venção.

[00134] Em outras modalidades da invenção, a composição farma- cêutica compreende um ou mais tensoativos, de preferência um ten- soativo, pelo menos um tensoativo ou dois tensoativos diferentes. O termo "tensoativo" se refere a quaisquer moléculas ou íons que sejam compostos de uma parte solúvel em água (hidrofílica) e uma parte so- lúvel em gordura (lipofílica). O tensoativo pode, por exemplo, ser sele- cionado do grupo que consiste em tensoativos aniônicos, tensoativos catiônicos, tensoativos não iônicos e/ou tensoativos zwiteriônicos. O tensoativo pode estar presente, individualmente ou em combinação, em uma concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml. Composições farmacêuticas compreendendo cada um desses tensoa- tivos específicos constituem modalidades alternativas da invenção.

[00135] Em mais uma modalidade da invenção, a composição far- macêutica compreende um ou mais inibidores da protease, tal como, por exemplo, EDTA, e/ou ácido clorídrico de benzamidina (HCl). O ini- bidor da protease pode estar presente individualmente ou em conjunto, em uma concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml. Composições farmacêuticas compreendendo cada um desses inibido- res da protease específicos constituem modalidades alternativas da invenção.

[00136] Em outro aspecto geral, a invenção se refere a um método de produção de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal ou o seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção, compreendendo combinar um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno com um carreador farmaceuticamen- te aceitável para obter a composição farmacêutica.

MÉTODOS DE USO

[00137] Em outro aspecto geral, a invenção se refere a um método de bloqueio da ligação do CD47 à trombospondina-1 (TSP1), ou um método de bloqueio da ligação do CD47 à proteína reguladora de sinal alfa (SIRP), o método compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica da invenção.

[00138] A atividade funcional de anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno que ligam o CD47 pode ser caracterizada pelos métodos conhecidos na técnica e como aqui descrito. Métodos de ca- racterização de anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno que ligam o CD47 incluem, mas não se limitados a, ensaios de afini- dade e especificidade incluindo Biacore, ELISA e análise OctetRed; ensaios de ligação receptor ligante para detectar o bloqueio da ligação do CD47 a TSP1 e/ou SIRP; ensaios de fagocitose onde células que expressam o CD47 são marcadas de forma fluorescente e incubadas com macrófagos para detectar o efeito do bloqueio da ligação do CD47 a SIRP sobre a fagocitose das células que expressam o CD47 por macrófagos; ensaios de hemaglutinação para detectar o efeito do anti-CD47 sobre os glóbulos vermelhos, e ensaios baseados em célu- las para detectar o efeito do bloqueio da interação TSP1-CD47 sobre a sinalização eNOS/NO/cGMP a jusante em células endoteliais. De acordo com modalidades particulares, os métodos de caracterização de anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno que ligam o CD47 incluem os descritos abaixo.

[00139] Em outro aspecto geral, a invenção se refere a um método de tratamento de um câncer em um indivíduo em sua necessidade, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêuti- ca da invenção. O câncer pode ser qualquer câncer líquido ou sólido, por exemplo, ele pode ser selecionado a partir de, mas não se limita a, um câncer de pulmão, um câncer gástrico, um câncer de cólon, um carcinoma hepatocelular, um carcinoma de células renais, um carci- noma urotelial da bexiga, um melanoma metastático, um câncer de mama, um câncer de ovário, um câncer do colo do útero, um câncer de cabeça e pescoço, um câncer pancreático, um glioma, um glioblas- toma e outros tumores sólidos, e um linfoma não Hodgkin (NHL), uma leucemia linfocítica aguda (ALL), uma leucemia linfocítica crônica (CLL), uma leucemia mieloide crônica (CML), um mieloma múltiplo (MM), uma leucemia mieloide aguda (AML) e outros tumores líquidos.

[00140] Em outro aspecto geral, a invenção se refere a um método de tratamento de uma doença inflamatória em um indivíduo em sua necessidade, compreendendo administrar ao indivíduo uma composi- ção farmacêutica da invenção.

[00141] Em outro aspecto geral, a invenção se refere a um método de tratamento de uma doença infecciosa em um indivíduo em sua ne- cessidade, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica da invenção.

[00142] Em outro aspecto geral, a invenção se refere a um método de tratamento de aterosclerose em um indivíduo em sua necessidade, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêuti- ca da invenção.

[00143] Em outro aspecto geral, a invenção se refere a um método de tratamento de uma doença cardiovascular em um indivíduo em sua necessidade, compreendendo administrar ao indivíduo uma composi- ção farmacêutica da invenção.

[00144] Em outro aspecto geral, a invenção se refere a um método de tratamento de uma doença metabólica em um indivíduo em sua ne- cessidade, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica da invenção.

[00145] Em outro aspecto geral, a invenção se refere a um método de tratamento de uma lesão induzida por radiação em um indivíduo em sua necessidade, compreendendo administrar ao indivíduo uma com- posição farmacêutica da invenção.

[00146] Em outro aspecto geral, a invenção se refere a um método de tratamento de uma doença autoimune em um indivíduo em sua ne- cessidade, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica da invenção.

[00147] De acordo com as modalidades da invenção, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD47 ou seu fragmento de ligação ao antígeno. Como usado neste documento, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade de um ingrediente ou componente que provoca a resposta biológica ou medicinal desejada em um indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser determinada empi- ricamente e de forma rotineira, em relação à finalidade determinada.

[00148] Conforme usado neste documento com referência aos anti- corpos anti-CD47 ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade do anti- corpo anti-CD47 ou seu fragmento de ligação ao antígeno que modula uma resposta imune em um indivíduo em sua necessidade. Como usado neste documento com referência aos anticorpos anti-CD47 ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, uma quantidade terapeutica- mente eficaz significa uma quantidade do anticorpo anti-CD47 ou seu fragmento de ligação ao antígeno que resulta no tratamento de uma doença, distúrbio ou condição; impede ou retarda o avanço da doença, distúrbio ou condição; ou reduz ou alivia completamente os sintomas associados à doença, distúrbio ou condição.

[00149] De acordo com modalidades particulares, a doença, distúr- bio ou condição a ser tratada é o câncer, de preferência um câncer selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de pulmão, cân- cer gástrico, câncer de cólon, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células renais, carcinoma urotelial da bexiga, melanoma metastático, câncer de mama, câncer de ovário, câncer do colo do útero, câncer de cabeça e pescoço, câncer pancreático, glioma, glioblastoma e outros tumores sólidos, e linfoma não Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mieloide crô- nica (CML), mieloma múltiplo (MM), leucemia mieloide aguda (AML) e outros tumores líquidos. De acordo com outras modalidades particula- res, a doença, distúrbio ou condição a ser tratada é uma doença infla- matória, uma doença infecciosa, aterosclerose, doença cardiovascular, doenças metabólicas, lesão induzida por radiação, uma doença imune e/ou uma doença autoimune.

[00150] De acordo com modalidades particulares, uma quantidade terapeuticamente eficaz se refere à quantidade de terapia que é sufici- ente para alcançar um, dois, três, quatro ou mais dos seguintes efei- tos: (i) reduzir ou atenuar a gravidade da doença, distúrbio ou condi- ção a ser tratada ou um sintoma a ela associado; (ii) reduzir a duração da doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma a ela associado; (iii) impedir o avanço da doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma a ela associado; (iv) causar a regressão da doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma a ela as- sociado; (v) prevenir o desenvolvimento ou o início da doença, distúr- bio ou condição a ser tratada, ou um sintoma a ela associado; (vi) pre- venir a recorrência da doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma a ela associado; (vii) reduzir a hospitalização de um indiví- duo com a doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma a ela associado; (viii) reduzir o tempo de internação de um indivíduo com a doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma a ela associado; (ix) aumentar a sobrevida de um indivíduo com a doen- ça, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma a ela associado; (xi) inibir ou amenizar a doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma a ela associado em um indivíduo; e/ou (xii) melhorar ou intensificar o(s) efeito(s) profilático(s) ou terapêutico(s) de outra tera- pia.

[00151] A quantidade ou dosagem terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com vários fatores, como a doença, distúrbio ou con- dição a ser tratada, a forma de administração, o sítio-alvo, o estado fisiológico do indivíduo (incluindo, por exemplo, idade, peso corporal, saúde), se o indivíduo é um ser humano ou um animal, outras medica- ções administradas, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. As dosagens de tratamento são tituladas de forma ideal para otimizar a segurança e a eficácia.

[00152] De acordo com modalidades particulares, as composições descritas aqui são formuladas para serem adequadas para a via de administração a um indivíduo. Por exemplo, as composições descritas aqui podem ser formuladas para serem adequadas para administração intravenosa, subcutânea ou intramuscular.

[00153] Como usados neste documento, os termos "tratar", "tratan- do" e "tratamento" são todos para referência a uma melhora ou rever- são de pelo menos um parâmetro físico mensurável relacionado a um câncer, uma doença, distúrbio ou condição imune, uma doença, dis- túrbio ou condição autoimune, ou uma doença, distúrbio ou condição inflamatória, uma doença, distúrbio ou condição infecciosa, uma ate- rosclerose, distúrbio ou condição relacionada, uma doença, distúrbio ou condição cardiovascular, uma doença, distúrbio ou condição meta- bólica, uma lesão, distúrbio ou condição induzida por radiação, que não seja necessariamente perceptível no indivíduo, mas que possa ser perceptível no indivíduo. Os termos "tratar", "tratando" e "tratamento" também podem se referir a causar regressão, prevenir o avanço ou pelo menos retardar o avanço da doença, distúrbio ou condição. Em uma determinada modalidade, "tratar", "tratando" e "tratamento" se re- ferem a uma atenuação, prevenção do desenvolvimento ou apareci- mento, ou redução na duração de um ou mais sintomas associados à doença, distúrbio ou condição, como um tumor ou preferivelmente um câncer. Em uma determinada modalidade, "tratar", "tratando" e "trata- mento" se referem à prevenção da recorrência da doença, distúrbio ou condição. Em uma determinada modalidade, "tratar", "tratando" e "tra- tamento" se referem a um aumento na sobrevida de um indivíduo com a doença, distúrbio ou condição. Em uma determinada modalidade, "tratar", "tratando" e "tratamento" se referem à eliminação da doença, distúrbio ou condição do indivíduo.

[00154] De acordo com modalidades particulares, uma composição usada no tratamento de um câncer, uma doença, distúrbio ou condição imune, uma doença, distúrbio ou condição autoimune, uma doença, distúrbio ou condição inflamatória, uma doença, distúrbio ou condição infecciosa, uma aterosclerose, distúrbio ou condição relacionada, do- ença, distúrbio ou condição cardiovascular, uma doença, distúrbio ou condição metabólica, uma lesão, distúrbio ou condição induzida por radiação, pode ser usada em combinação com outro tratamento. Para tratamento do câncer, a composição pode ser usada em combinação com outro tratamento, incluindo, mas não limitado a, uma quimiotera- pia, um mAb anti-CD20, um anticorpo anti-CTLA-4, um mAb anti-LAG- 3, um mAb anti-EGFR, um mAb anti-HER-2, um mAb anti-CD19, um mAb anti-CD33, um mAb anti-CD73, um mAb anti-CD47, um mAb anti- DLL-3, um mAb antiapelina, um mAb anti-TIP-1, um mAb anti- CLDN18.2, um mAb anti-FOLR1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticor- po anti-PD-1, uma terapia com PD-1/PD-L1, ou outro fármaco de imu- no-oncologia, uma terapia direcionada, um agente antiangiogênica, uma terapia de radiação, ou outros fármacos anticancerígenos. Os an- ticorpos anti-CD47 podem ser usados para construir anticorpos bies- pecíficos com o parceiro mAbs parceiro com contra PD-1, PD-L1, LAG3, TIM-3, CTLA-4, EGFR, HER-2, CD19, CD20, CD33, CD73, apelina, DLL3, claudina18.2, TIP-1, CD3, receptor de folato alfa e/ou outros antígenos da superfície do tumor para tratar cânceres/tumores que expressam tanto o CD47 quanto o antígeno associado ao tumor específico.

[00155] Como usado neste documento, o termo "em combinação", no contexto da administração de duas ou mais terapias a um indivíduo, se refere ao uso de mais de uma terapia. O uso do termo "em combi- nação" não restringe a ordem em que as terapias são administras a um indivíduo. Por exemplo, uma primeira terapia (por exemplo, uma composição descrita neste documento) pode ser administrada antes (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 se- manas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas antes), simultanea- mente a, ou subsequentemente a (por exemplo, 5 minutos, 15 minu- tos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 ho- ras, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semana, ou 12 semanas após) a administração de uma segunda terapia a um indivíduo.

[00156] Em outro aspecto geral, a invenção se refere a um método de determinação de um nível do CD47 em um indivíduo. Os métodos compreendem (a) obter uma amostra do indivíduo; b) colocar a amos- tra em contato com um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antí- geno da invenção; e (c) determinar um nível do CD47 no indivíduo.

[00157] Neste documento, "amostra" se refere a uma amostra bio- lógica isolada de um indivíduo e pode incluir, mas não se limita a, san- gue total, soro, plasma, células do sangue, células endoteliais, bióp- sias teciduais (por exemplo, um tecido com câncer, um tecido hepáti- co, etc.), líquido linfático, líquido ascítico, líquido intersticial, medula óssea, líquido cefalorraquidiano, saliva, muco, escarro, suor, urina ou qualquer outra secreção, excreção, ou outros fluidos corporais. Uma

"amostra de sangue" se refere ao sangue total ou qualquer fração de- le, incluindo células do sangue, soro e plasma. Uma "amostra de san- gue" pode, por exemplo, compreender células cancerosas.

[00158] Em algumas modalidades, o nível do CD47 no indivíduo pode ser determinado usando ensaios selecionados a partir de, mas não limitados a, um ensaio de Western blot, um ensaio ELISA, um en- saio FACS e/ou uma imuno-histoquímica (IHQ). Níveis de proteína relativos podem ser determinados usando análise Western blot, ensaio FACS e imuno-histoquímica (IHQ) e níveis de proteína absolutos po- dem ser determinados usando um ensaio ELISA. Ao determinar os ní- veis relativos do CD47, os níveis do CD47 podem ser determinados entre pelo menos duas amostras, por exemplo, entre amostras do mesmo indivíduo em diferentes momentos, entre as amostras de teci- dos diferentes no mesmo indivíduo e/ou entre amostras de diferentes indivíduos. Alternativamente, ao determinar níveis absolutos do CD47, como por um ensaio ELISA, o nível absoluto do CD47 na amostra po- de ser determinado criando um padrão para o ensaio ELISA antes de testar a amostra. Uma pessoa com conhecimento na técnica entende- ria quais técnicas analíticas usar para determinar o nível do CD47 em uma amostra do indivíduo, usando os anticorpos ou fragmentos de li- gação ao antígeno da invenção.

[00159] O uso de métodos de determinação de um nível do CD47 em uma amostra de um indivíduo pode levar ao diagnóstico de níveis anormais (elevados, reduzidos ou insuficientes) do CD47 em uma do- ença e a tomada de decisões terapêuticas adequadas. Uma doença desse tipo pode ser selecionada a partir de, mas não se limita a, um câncer, de preferência um câncer selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer de cólon, car- cinoma hepatocelular, carcinoma de células renais, carcinoma urotelial da bexiga, melanoma metastático, câncer de mama, câncer de ovário,

câncer do colo do útero, câncer de cabeça e pescoço, câncer pancreá- tico, glioma, glioblastoma e outros tumores sólidos, e linfoma não Ho- dgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crô- nica (CLL), leucemia mieloide crônica (CML), mieloma múltiplo (MM), leucemia mieloide aguda (AML) e outros tumores líquidos, uma doen- ça inflamatória, uma doença infecciosa, aterosclerose, doença cardio- vascular, doenças metabólicas, lesão induzida por radiação, uma do- ença imune e/ou uma doença autoimune.

MODALIDADES

[00160] A invenção também fornece as seguintes modalidades não limitantes.

[00161] A modalidade 1 é um anticorpo monoclonal isolado ou seus fragmentos de ligação ao antígeno compreendendo uma região deter- minante da complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, uma região determinante da complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de po- lipeptídeos de: (1) SEQ ID NOs: 177, 46, 47, 178, 112 e 179, respectivamente; (2) SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 117, 118 e 119, respectivamente; (3) SEQ ID NOs: 54, 55, 56, 120, 121 e 122, respectivamente; (4) SEQ ID NOs: 57, 58, 59, 123, 124 e 125, respectivamente; (5) SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 126, 127 e 128, respectivamente; (6) SEQ ID NOs: 180, 181, 182, 129, 130 e 131, respectivamente; (7) SEQ ID NOs: 72, 73, 74, 138, 139 e 140, respectivamente; (8) SEQ ID NOs: 78, 79, 80, 144, 145 e 146, respectivamente; (9) SEQ ID NOs: 81, 82, 83, 147, 148 e 149, respectivamente; (10) SEQ ID NOs: 84, 85, 86, 150, 151 e 152, respectivamente; (11) SEQ ID NOs: 87, 88, 89, 153, 154 e 155, respectivamente; (12) SEQ ID NOs: 90, 91, 92, 156, 157 e 158, respectivamente; (13) SEQ ID NOs: 93, 94, 95, 159, 160 e 161, respectivamente;

(14) SEQ ID NOs: 96, 97, 98, 162, 163 e 164, respectivamente; (15) SEQ ID NOs: 99, 100, 101, 165, 166 e 167, respectivamente; (16) SEQ ID NOs: 102, 103, 104, 168, 169 e 170, respectivamente; (17) SEQ ID NOs: 105, 106, 107, 171, 172 e 173, respectivamente; (18) SEQ ID NOs: 108, 109, 110, 174, 175 e 176, respectivamente; ou (19) SEQ ID NOs: 201, 202, 203, 204, 205 e 206, respectivamente; em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga es- pecificamente o CD47, de preferência o CD47 humano.

[00162] A modalidade 2 é o anticorpo monoclonal isolado ou o fra- gmento de ligação ao antígeno da modalidade 1, compreendendo uma região variável da cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 ou 43, ou uma região va- riável da cadeia leve com uma sequência de polipeptídeos pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 ou 44.

[00163] A modalidade 3 é o anticorpo monoclonal isolado ou o fra- gmento de ligação ao antígeno da modalidade 1 ou 2, compreenden- do: (a) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 1; e/ou uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 2; (b) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 3; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 4; (c) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 5; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 6; (d) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 7; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 8; (e) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 9; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 10; (f) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 11; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 12; (g) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 13; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 14; (h) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 15; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 16; (i) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 17; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 18; (j) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 19; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 20; (k) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 21; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 22; (l) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 23; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 24; (m) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 25; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 26; (n) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 27; e uma região variável da ca-

deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 28; (o) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 29; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 30; (p) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 31; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 32; (q) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 33; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 34; (r) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 35; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 36; (s) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 37; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 38; (t) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 39; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 40; (u) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 41; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 42; ou (v) uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 43; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 44.

[00164] A modalidade 4 é o anticorpo monoclonal isolado ou o fra- gmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno inibe a interação do CD47 e trombospondina-1 (TSP-1) e/ou CD47 e SIRP.

[00165] A modalidade 5 é o anticorpo monoclonal isolado ou o fra-

gmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é qui- mérico.

[00166] A modalidade 6 é o anticorpo monoclonal isolado ou o fra- gmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é hu- mano ou humanizado.

[00167] A modalidade 7 é o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno da modalidade 6, em que o anticor- po ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende: a. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 183; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 191; b. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 183; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 192; c. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 183; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 193; d. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 184; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 190; e. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 184; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 192; f. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 184; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 193; g. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 185; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 190; h. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 185; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 191; i. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 185; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 193; j. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 185; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 198; k. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 187; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 194; l. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 188; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 194; m. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 188; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 196; n. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 188; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 197; ou o. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 199; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 200.

[00168] A modalidade 8 é o anticorpo monoclonal isolado ou o fra- gmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é ca- paz de bloquear a ligação do CD47 à trombospondina-1 (TSP1) e/ou à proteína reguladora de sinal alfa (SIRP).

[00169] A modalidade 9 é o anticorpo monoclonal isolado ou o fra- gmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é ca- paz de induzir a fagocitose mediada por macrófagos de células cance- rosas.

[00170] A modalidade 10 é o anticorpo monoclonal isolado ou o fra- gmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é ca- paz de ligar células cancerosas com ligação mínima a não detectável aos glóbulos vermelhos.

[00171] A modalidade 11 é um ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno de qual- quer uma das modalidades 1 a 10.

[00172] A modalidade 12 é um vetor compreendendo o ácido nu- cleico isolado da modalidade 11.

[00173] A modalidade 13 é uma célula hospedeira compreendendo o vetor da modalidade 12.

[00174] A modalidade 14 é uma composição farmacêutica compre- endendo o anticorpo monoclonal isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 10 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00175] A modalidade 15 é um método de bloqueio da ligação do CD47 à trombospondina-1 (TSP1) em um indivíduo em sua necessi- dade, compreendendo administrar ao indivíduo a composição farma- cêutica da modalidade 14.

[00176] A modalidade 16 é um método de bloqueio da ligação do CD47 à proteína reguladora de sinal alfa (SIRP) em um indivíduo em sua necessidade, compreendendo administrar ao indivíduo as compo- sições farmacêuticas da modalidade 14.

[00177] A modalidade 17 é um método de tratamento de câncer em um indivíduo em sua necessidade, compreendendo administrar ao in- divíduo a composição farmacêutica da modalidade 14.

[00178] A modalidade 18 é um método de tratamento de uma doen- ça inflamatória em um indivíduo em sua necessidade, compreendendo administrar ao indivíduo a composição farmacêutica da modalidade 14.

[00179] A modalidade 19 é um método de tratamento de uma doen- ça infecciosa em um indivíduo em sua necessidade, compreendendo administrar ao indivíduo a composição farmacêutica da modalidade 14.

[00180] A modalidade 20 é um método de tratamento de ateroscle- rose em um indivíduo em sua necessidade, compreendendo adminis- trar ao indivíduo a composição farmacêutica da modalidade 14.

[00181] A modalidade 21 é um método de tratamento de uma doen- ça cardiovascular em um indivíduo em sua necessidade, compreen- dendo administrar ao indivíduo a composição farmacêutica da modali- dade 14.

[00182] A modalidade 22 é um método de tratamento de uma doen- ça metabólica em um indivíduo em sua necessidade, compreendendo administrar ao indivíduo a composição farmacêutica da modalidade 14.

[00183] A modalidade 23 é um método de tratamento de uma lesão induzida por radiação em um indivíduo em sua necessidade, compre- endendo administrar ao indivíduo a composição farmacêutica da mo- dalidade 14.

[00184] A modalidade 24 é um método de tratamento de uma doen- ça autoimune em um indivíduo em sua necessidade, compreendendo administrar ao indivíduo a composição farmacêutica da modalidade 14.

[00185] A modalidade 25 é um método de determinação de um ní- vel do CD47 em um indivíduo, o método compreendendo (a) obter uma amostra do indivíduo; b) colocar a amostra em contato com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 10; e (c) determinar de um nível do CD47 no indiví-

duo.

[00186] A modalidade 26 é o método da modalidade 25, em que a amostra é uma amostra de tecido.

[00187] A modalidade 27 é o método da modalidade 26, em que a amostra de tecido é uma amostra de tecido com câncer.

[00188] A modalidade 28 é o método da modalidade 25, em que a amostra é uma amostra de sangue.

[00189] A modalidade 29 é um método de produção do anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 10, compreendendo a cultura de uma célula compreendendo um ácido nucleico que codifica o anticorpo monoclo- nal ou o fragmento de ligação ao antígeno sob condições para produzir o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno, e re- cuperar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno da célula ou cultura.

[00190] A modalidade 30 é um método de produção de uma com- posição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 10, compreendendo combinar o anticorpo monoclonal ou o fragmen- to de ligação ao antígeno com um carreador farmaceuticamente acei- tável para obter a composição farmacêutica.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-CD47

[00191] Anticorpos monoclonais anti-CD47 (mAbs) foram gerados a partir de camundongos imunizados com CD47-HIS recombinante de cynomolgus e ser humano. Resumidamente, após a imunização, a titu- lação de anticorpos no soro foi estimada por ELISA usando placas re- vestidas com huCD47-HIS e cyCD47-HIS. Células B foram colhidas e fundidas com uma linhagem de células do mieloma para a produção de hibridomas. Os hibridomas foram plaqueados em placas de 20 x 384 poços e os sobrenadantes de cada poço foram triados por ELISA quanto à sua ligação a ambos CD47 de seres humanos e cynomolgus. Quatrocentos hibridomas foram ampliados e foram posteriormente analisados quanto à ligação a células RAJI por FACS, bloqueio da in- teração CD47/SIRPα, ligação cinética a huCD47 recombinante em um Octeto, e testados quanto à atividade de hemaglutinação com sangue humano. Os hibridomas positivos superiores foram, então, clonados por plaqueamento de hibridomas parentais a 1 célula por poço em 384 placas de poços e triagem de sobrenadantes clonais por ELISA quanto à ligação ao huCD47. As regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de hibridomas clonais foram amplificadas por 5’ RACE e sequen- ciadas. Os sobrenadantes desses clones da cultura de expansão fo- ram usados para purificar os anticorpos com a proteína A para maior caracterização.

[00192] As sequências de regiões variáveis das cadeias pesada e leve para os anticorpos monoclonais anti-CD47 são fornecidas nas Tabelas 1 e 2, respectivamente, e as regiões CDR para os anticorpos monoclonais anti-CD47são fornecidas nas Tabelas 3 e 4. As CDR re- giões para os anticorpos monoclonais anti-CD47 foram determinadas usando o método IMGT. TABELA 1: SEQUÊNCIAS DE REGIÕES VARIÁVEIS DA CADEIA PESADA PARA ANTICORPOS MONOCLONAIS (MABS) ANTI-CD47 Clones VH do mAb 9O23A QIQLQQSGPELVRPGASVKISCKASGYTFTDYYINWVKQRPGQGLEWIGWIYPGSGNT-

KYNEKFKGKATLTVDSSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARRGPWYFDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 1) 14P6A QIQLQQSGPELVRPGASVKISCKASGYTFTAYYINWVKQRPGQGLEWIGWIYPGSGNT-

KYNEKFKGKATLTVDTSSSTAYIQLSSLTSEDSAVYFCARRGPWYFDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 3) 4M8A QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKTSGYTFTSYWIHWVNQRPGQGLEWIGNIDPS- DSETHYNPKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWGGWLPLDYWGQGT- TLTVSS (SEQ ID NO: 5) 16M17A QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIDPS- DSETHYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARMAFITTVVDYWGQGT- TLTVSS (SEQ ID NO: 7) 13C4A QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIDPS- DSETHYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWGYYGRSPLDHWGQGT-

TLTVSS (SEQ ID NO: 9) 14O18A QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIDPS- DSETHYNQKFKDKATLTLDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWYYGGSGAMDYWGQG- TSVTVSS (SEQ ID NO: 11) 5D24A QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSSWMHWVKQRPGQGLEWIGNIDPS- DSETHYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWGYYGKSAIDYWGQG- TSVTVSS (SEQ ID NO: 13) 11G2A QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIDPS- DSEAHYNQKFRDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWGYYGKSAMDYWGQG- TSVTVSS (SEQ ID NO: 15) 13B18A QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIDPS- DSETHYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCSRWGYYGKSAMDYWGQG- TSVTVSS (SEQ ID NO: 17) 1J7A QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIDPS- DSETHYNQKFRDKATLTVDKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWGLRGAMDYWGQG- TSVTVS (SEQ ID NO: 19) 14D18A QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIDPS- DSETHYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWGYYGRSPLDHWGQGT- TLTVSS (SEQ ID NO: 21) 3O5A EVKLVESGGGLVQSGRSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQAPGKGLEWIAASRNKANDYT- TEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCARDTAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 23) 17C6A QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIDPS-

DSETHYNQKFKDKATLTVDKSSSTAHMQLSSLTSEDSAVYYCAGTDLAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 25) 14N13A QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYIFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIDPS-

DSETHYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAKGFSDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 27) 10I23A EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDSLMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPEDGETK-

CAPKFQDKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAIYYCAVISTVVAPDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 29) 12B18A EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMNWVKQSHGKSLEWIGRINPYNGDT-

FYNQKFKGKATLTVDKSSSTAHMELRSLTSEDSAIYYCARGGVVATDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 31) 17O12A EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMHWVKQSHGKSLEWIGRINPYNGDT-

FNNQKFKGKATLAVDKSSSTAHMELRSLTSEDSTVYYCARGGYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 33) 15G23A EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYVIHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGT-

KYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCAKGGTGTGDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 35) 17N8A EVKLEESGGGMVQPGGSMKVSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRLKS- DNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGGGKGGFAYWGQG- TLVTVSA (SEQ ID NO: 37) 18M19A EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGT-

KYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCAKGGYYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 39) 11F6A EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDSLMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPEDGETK-

CAPKFQDKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAIYYCARITTVVATDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 41) 19L14A QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNSN- PGSSSTNYNEKFKSKAILTVDKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYYCAREGLRRFAYWGQG- TLVTVSA (SEQ ID NO: 43) VH: Região variável da cadeia pesada TABELA 2: SEQUÊNCIAS DE REGIÕES VARIÁVEIS DA CADEIA LEVE PARA MABS ANTI-CD47 Clones VL do mAb 9O23A NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASDNVGTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVP- DRFTGSGSARDFTLTITSVQAEDLADYHCGQSYSYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 2)

14P6A NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGTYVSWYQQKPEQSPNLLIYGASNRYTGVP- DRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQTYSYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 4) 4M8A DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKNISKYLAWFQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPS- RFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 6) 16M17A DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPS- RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 8) 13C4A DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSSLQSGIPS- RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 10) 14O18A DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPS- RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 12) 5D24A DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPS- RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 14) 11G2A DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPS- RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 16) 13B18A AVQITQFPSYLAASPGQTITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPS- RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 18) 1J7A DVQITQSPTYLTASPGETITINCRANKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPS- RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 20) 14D18A DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPS- RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 22) 3O5A DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSN- LASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 24) 17C6A DIQMNQSPSSLSASLGDTITITCHASQNINVWLSWYQQKPGNIPKLLIYKASNLHTGVPS- RFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQSYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 26) 14N13A DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKVLIYWAS- TRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 28) 10I23A DVVMTQTPLSLPVSLGVQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSN- RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 30) 12B18A DVVMTQTPVSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQRPGQSPKLLIYKVSN- RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGSGTKLEIK (SEQ

ID NO: 32) 17O12A DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLYWYLQKPGQSPKLLIYRVSN- RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCFQSTHVPHTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 34) 15G23A DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSN- RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 36) 17N8A DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSTQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSN- RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 38) 18M19A DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSN- RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 40) 11F6A DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSN- RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 42) 19L14A ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKLWIYSTSNLASGV- PARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 44)

VL: Região variável da cadeia leve TABELA 3: REGIÕES CDR 1-3 DA CADEIA PESADA PARA O MABS ANTI-CD47 Clones HC o mAb CDR1 (SEQ ID NO:) CDR2 (SEQ ID NO:) CDR3 (SEQ ID NO:) 9O23A GYTFTDYY (45) IYPGSGNT (46) ARRGPWYFDV (47) 14P6A GYTFTAYY (48) IYPGSGNT (49) ARRGPWYFDV (50) 4M8A GYTFTSYW (51) IDPSDSET (52) ARWGGWLPLDY (53) 16M17A GYTFTNYW (54) IDPSDSET (55) ARMAFITTVVDY (56) 13C4A GYTFTSYW (57) IDPSDSET (58) ARWGYYGRSPLDH (59) 14O18A GYTFTSYW (60) IDPSDSET (61) ARWYYGGSGAMDY (62) 5D24A GYTFTSSW (63) IDPSDSET (64) ARWGYYGKSAIDY (65) 11G2A GYTFTSYW (66) IDPSDSEA (67) ARWGYYGKSAMDY (68) 13B18A GYTFTSYW (69) IDPSDSET (70) SRWGYYGKSAMDY (71) 1J7A GYTFTSYW (72) IDPSDSET (73) ARWGLRGAMDY (74) 14D18A GYTFTSYW (75) IDPSDSET (76) ARWGYYGRSPLDH (77) 3O5A GFTFSDFY (78) SRNKANDYTT (79) ARDTAY (80) 17C6A GYTFTSYW (81) IDPSDSET (82) AGTDLAY (83) 14N13A GYIFTSYW (84) IDPSDSET (85) AKGFSDY (86) 10I23A GFNIKDSL (87) IDPEDGET (88) AVISTVVAPDY (89) 12B18A GYSFTGYF (90) INPYNGDT (91) ARGGVVATDY (92) 17O12A GYSFTGYF (93) INPYNGDT (94) ARGGYAMDY (95) 15G23A GYTFTNYV (96) INPYNDGT (97) AKGGTGTGDY (98)

17N8A GFTFSNYW (99) IRLKSDNYAT (100) TGGGKGGFAY (101) 18M19A GYTFTSYV (102) INPYNDGT (103) AKGGYYAMDY (104) 11F6A GFNIKDSL (105) IDPEDGET (106) ARITTVVATDY (107) 19L14A GYTFTSYW (108) SNPGSSST (109) AREGLRRFAY (110) HC: cadeia pesada; CDR: região determinante da complementaridade

[00193] As CDRs da HC para os mAbs anti-CD47 foram determina- das usando o método IMGT (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Res. 1999; 27:209-212). TABELA 4: REGIÕES CDR 1-3 DA CADEIA LEVA PARA OS MABS ANTI-CD47 Clones LC do mAb CDR1 (SEQ ID NO:) CDR2 (SEQ ID NO:) CDR3 (SEQ ID NO:) 9O23A DNVGTY (111) GAS (112) GQSYSYPLT (113) 14P6A ENVGTY (114) GAS (115) GQTYSYPLT (116) 4M8A KNISKY (117) SGS (118) QQHNEYPWT (119) 16M17A KSISKY (120) SGS (121) QQHNEYPWT (122) 13C4A KSISKY (123) SGS (124) QQHNEYPWT (125) 14O18A KSISKY (126) SGS (127) QQHNEYPWT (128) 5D24A KSISKY (129) SGS (130) QQHNEYPWT (131) 11G2A KSISKY (132) SGS (133) QQHNEYPWT (134) 13B18A KSISKY (135) SGS (136) QQHNEYPWT (137) 1J7A KSISKY (138) SGS (139) QQHNEYPWT (140) 14D18A KSISKY (141) SGS (142) QQHNEYPWT (143) 3O5A KSLLHSNGNTY (144) RMS (145) MQHLEYPFT (146) 17C6A QNINVW (147) KAS (148) QQGQSYPWT (149) 14N13A QSLLYSSNQKNY (150) WAS (151) QQYYSYPLT (152) 10I23A QSLVHSNGNTY (153) KVS (154) SQSTHVPWT (155) 12B18A QSLVHSNGNTY (156) KVS (157) SQSTHVPFT (158) 17O12A QSLVHSNGNTY (159) RVS (160) FQSTHVPHT (161) 15G23A QSLVHSNGNTY (162) KVS (163) SQSTHVPPLT (164) 17N8A QSLVHSNGNTY (165) KVS (166) SQSTHVPLT (167) 18M19A QSLVHSNGNTY (168) KVS (169) SQSTHVPWT (170) 11F6A QSLVHSNGNTY (171) KVS (172) SQSTHVPLT (173) 19L14A SSVSSSY (174) STS (175) QQYSGYPFT (176) LC: cadeia leve; CDR: região determinante da complementaridade

[00194] As CDRs da LC para os mAbs anti-CD47 foram determina- das usando o método IMGT (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Res. 1999; 27:209-212).

EXEMPLO 2: DETECÇÃO DA LIGAÇÃO DOS MABS CD47 A CÉLU-

LAS RAJI USANDO FACS

[00195] Os mAbs anti-CD47 foram analisados por citometria de flu- xo quanto à sua capacidade de ligar o CD47 da superfície de células. As células RAJI (ATCC#CCL-86) 20.000 (células) cultivadas em Solu- ção Salina Balanceada de Hanks (HBSS) foram incubadas com uma solução de mAb purificado (1 μg/ml) em HBSS ou em HBSS apenas. Com o uso de Ab secundário IgG anticamundongo conjugado a Alexa- Fluor488, a presença de mAbs anti-CD47 de camundongo em células RAJI foi medida por FACS (IntelliCyt iQue® Screener; Albuquerque, NM). Os resultados da análise da ligação por FACS dos mAbs anti- CD47 são fornecidos na figura 1. EXEMPLO 3: AVALIAÇÃO DE MABS CD47 QUANTO À SUA CAPA- CIDADE DE BLOQUEAR A INTERAÇÃO CD47/SIRP

[00196] A atividade de sobrenadantes do hibridoma ou mAbs anti- CD47 purificados no bloqueio da interação SIRPα/CD47 foi medida por um ensaio ELISA. CD47(ECD)-HIS humano recombinante (1 μg/ml) foi imobilizado em uma placa ELISA de 384 poços. A ligação do hu- SIRP-huFc-Biotina recombinante (0,5 μg/ml de concentração final) foi avaliada na presença de quantidades crescentes de mAbs anti-CD47 de camundongo em triplicado. SIRPα ligada foi determinada usando um anticorpo secundário de estreptavidina conjugado a HRP (Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA). Etapas de lavagem usando PBS su- plementado com Tween-20 a 0,1% foram realizadas após a adição do CD47, solução de bloqueio, proteína SIRPα, anticorpo secundário e reagentes de detecção. Os resultados dos ensaios ELISA são forneci- dos nas figuras 2A-2O. Para o anticorpo quimérico 18M19A (em IgG4 e estrutura kapa) (figura 2P), a atividade de bloqueio foi medida em uma placa ELISA de 96 poços. CD47(ECD)-HIS (1µg/mL) humano re- combinante (1 µg/mL) foi imobilizado em uma placa. A ligação de hu-

SIRPα-muFc recombinante (0,5 µg/mL de concentração final) foi medi- da na presença de quantidades crescentes do mAb anti-CD47 humano em duplicado. SIRPα ligada foi medida usando um anticorpo secundá- rio anti-muFc conjugado a HRP (Jackson; ImmunoResearch West Grove, PA). As placas foram lavadas como descrito acima. A detecção foi feita com substrato de detecção TMB (Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA). O resultado do ensaio ELISA é fornecido na figura 2P. EXEMPLO 4: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DOS MABS ANTI-CD47

QUANTO À INDUÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO

[00197] Para avaliar a capacidade de hemaglutinação dos mAbs anti-CD47, mAbs purificados, a duas diluições em série, foram adicio- nados a uma placa de 96 poços de fundo claro e redondo, e incubados com uma suspensão de glóbulos vermelhos humanos (huRBC) a 2,5% em PBS (concentração final a 0,25% de RBC) à temperatura ambiente por 1 hora. A falta de hemaglutinação foi evidenciada pela presença de pontos no centro das placas de fundo redondo. A evidência de hema- glutinação foi demonstrada pela presença de uma cor uniforme em to- do o poço. Os resultados para o ensaio de hemaglutinação são forne- cidos nas figuras 3A-3B. EXEMPLO 5: AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA IN VIVO DO 13B18A QUI-

MÉRICO EM MODELO DE XENOENXERTO DE CÉLULAS RAJI

[00198] Uma versão quimérica do anticorpo 13B18A ( 13B18A- huIgG1) foi construída por fusão das regiões variáveis (VH e VL) do 13B18A às regiões constantes da cadeia pesada e cadeia leva capa do IgG1 humano, respectivamente. O anticorpo resultante foi expresso de forma estável em pools estáveis de CHO e purificado por coluna de afinidade com Proteína A. Para testar a eficácia do 13B18A-huIgG1, células RAJI foram inoculadas por via subcutânea no flanco direito de cada camundongo NOD/SCID (fêmeas, n=10/grupo). Os camundon- gos foram tratados com doses indicadas de artigos de teste quando o tamanho médio do tumor alcançou 100 mm3. As doses foram adminis- tradas por via intravenosa 3 vezes por semana do dia 6 ao dia 27, e os volumes tumorais foram medidos no mesmo dia em duas dimensões, usando uma pinça. Para análise farmacocinética (PK), o soro foi cole- tado 48 horas após a última dose e os níveis séricos de 13B18A- huIgG1 foram medidos por detecção do Fc humano ligado sobre pla- cas ELISA revestidas com CD47(ECD)-HIS humano recombinante. A curva padrão foi construída usando soro enriquecido com um padrão do 13B18A-huIgG1 de concentração conhecida. Após lavagem com PBS suplementado com 0,1% de Tween-20, o anticorpo ligado foi de- tectado por anticorpo secundário anti-huFc conjugado a HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) seguido pelo substrato de detec- ção TMB (Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA). As curvas do cres- cimento do tumor são mostradas na figura 4A. Os dados do peso cor- poral são mostrados na figura 4B. Os dados farmacocinéticos (PK) são mostrados na figura 4C. EXEMPLO 6: HUMANIZAÇÃO DOS MABS ANTI-CD47

[00199] Os mAbs anti-CD47 de camundongo 13B18A, 14P6A e 17C6A foram humanizados para reduzir o potencial de imunogenicida- de quando usados em pacientes humanos. As sequências das regiões variáveis das cadeias pesada e leve (VH e VL) foram comparadas com as sequências de anticorpo humano no banco de dados Protein Data Bank (PDB) e foram construídos modelos de homologia. As CDRs em ambas as cadeias pesada e leve dos mAbs de camundongo foram en- xertadas em estruturas humanas que têm a maior possibilidade de manter a estrutura ideal provavelmente necessária para ligação ao an- tígeno. Reversões de mutações de resíduos humanos em resíduos de camundongos ou outras mutações foram concebidas quando necessá- rio. As sequências das regiões VH e VL humanizadas são mostradas na Tabela 5 e Tabela 6, respectivamente. As regiões VH e VL humani-

zadas foram fundidas às regiões constantes da pesada cadeia e ca- deia leve Capa do IgG4 humano, respectivamente. Construtos corres- pondentes às sequências do mAb foram usados para transfecção de curta duração em células 293E e mAbs purificados foram analisados quanto à sua capacidade de bloquear a interação SIRPα/CD47 usando ELISA. Os resultados são apresentados como absorvância, em que um absorvância mais elevada indica maior nível de interação SIR- Pα/CD47. Os valores de IC50 para mAbs humanizados são fornecidos na Tabela 7. As curvas de IC50 para os mAbs humanizados H3L9 e H5L5 são mostradas nas figuras 5A-5B. Os resultados para o ensaio de hemaglutinação são fornecidos na figura 6. As regiões CDR para o mAb humanizado H8L10 são fornecidas na Tabela 8. TABELA 5: SEQUÊNCIAS DE REGIÕES VARIÁVEIS DA CADEIA PESADA DE MABS ANTI-CD47 HUMANIZADOS Projeto VH SEQ ID NO: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNIDPS- H1 DSETHYNQKFKDRVTLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCSRWGYYGKSAM- 183

DYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNIDPS- H2 DSETHYNQKFKDRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSRWGYYGKSAM- 184

DYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNIDPS- H3 DSETHYNQKFKDRATLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSRWGYYGKSAM- 185

DYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVRQRPGQGLEWIGNIDPS- H4 DSETHYNQKFKDRATLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSRWGYYGKSAM- 186

DYWGQGTLVTVSS QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTAYYINWVRQAPGQRLE- H5 WIGWIYPGSGNTKYNEKFKGRVTLTVDTSASTAYIELSSLRSEDTAVYYCARRG- 187

PWYFDVWGQGTTVTVSS QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTAYYINWVRQAPGQRLE- H6 WIGWIYPGSGNTKYNEKFKGRVTLTVDTSASTAYIELSSLRSEDTAVYFCARRG- 188

PWYFDVWGQGTTVTVSS QIQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFTAYYINWVRQAPGQGLE- H7 WIGWIYPGSGNTKYNEKFKGRATLTVDTSASTAYIELSSLRSEDTAVYFCARRG- 189

PWYFDVWGQGTTVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNIDPS- H8 DSETHYAQKFQGRVTLTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAGTDLAYWGQG- 199

TLVTVSS

TABELA 6: SEQUÊNCIAS DE REGIÕES VARIÁVEIS DA CADEIA LEVE DE MABS ANTI-CD47 HUMANIZADOS Projeto VL SEQ ID NO: L1 AVQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASKSISKYLAWYQQKPGKANKLLIYSGSTLQ 190

SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKVEIK L2 AVQLTQSPSFLSASVGQRITINCRASKSISKYLAWYQQKPGKANKLLIYSGS 191

TLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKVEIK L3 AVQLTQSPSFLSASVGQRITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKANKLLIYSGSTLQ 192

SGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKVEIK L4 AVQITQSPSFLSASVGQTITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKANKLLIYSGSTLQSG 193

IPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKVEIK L5 EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASENVGTYVSWYQQKPGQAPNLLIYGASNRYTG 194

IPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYHCGQTYSYPLTFGQGTKLEIK L6 EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASENVGTYVSWYQQKPGQSPNLLIYGASN- 195

RYTGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYHCGQTYSYPLTFGQGTKLEIK L7 EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCKASENVGTYVSWYQQKPGQSPNLLIYGASN- 196

RYTGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYHCGQTYSYPLTFGQGTKLEIK L8 NIVMTQSPATLSLSPGERATLSCKASENVGTYVSWYQQKPGQSPNLLIYGASN- 197

RYTGVPDRFSGSGSATDFTLTISSLQPEDFADYHCGQTYSYPLTFGQGTKLEIK L9 DVQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASKSISKYLAWYQQKPGKANKLLIYSGST 198

LQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKVEIK L10 EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCHASQNINVWLSWYQQKPGQAPRLLIYKASN- 200

LHTGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQSYPFTFGQGTKVEIK TABELA 7: VALORES DE IC50 PARA MABS ANTI-CD47 NO ENSAIO DE INTERAÇÃO SIRPα/CD47 ID mAb IC50 (nM) H1L2 6,80 H1L3 7,43 H1L4 8,09 H2L1 4,73 H2L3 9,56 H2L4 6,52 H3L1 5,62 H3L2 7,88 H3L4 5,35 H3L9 9,60 H5L5 15,06 H6L5 9,67 H6L7 39,16 H6L8 13,20 H8L10 1,05

[00200] H1L2 se refere ao mAb com a região variável da cadeia pe- sada H1 e a região variável da cadeia leve L2; todos os outros mAbs humanizados na tabela adotam a mesma regra de nomenclatura.

TABELA 8: REGIÕES CDR 1-3 DAS CADEIAS PESADA E LEVE PA- RA O MAB HUMANIZADO H8L10 CDR1 (SEQ ID NO:) CDR2 (SEQ ID NO:) CDR3 (SEQ ID NO:) HC GYTFTSYW (201) IDPSDSET (202) AGTDLAY (203) LC QNINVW (204) KAS (205) QQGQSYPFT (206) EXEMPLO 7: GLÓBULOS VERMELHOS (RBC) E ENSAIOS DE LI-

GAÇÃO DE CÉLULAS RAJI

[00201] Os mAbs anti-CD47 H3L9, H5L5 e H8L10 foram analisados por citometria de fluxo quanto à sua capacidade de ligar o CD47 da superfície de células. MAbs purificados foram diluídos em série (1:3) em tampão de FACS (Solução Salina Balanceada de Hanks (HBSS) contendo BSA a 0,1% e azida de sódio a 0,05%). A concentração su- perior do mAb purificado foi de 190 µg/ml. Os glóbulos vermelhos ou células RAJI (ATCC#CCL-86) (14.000 células) foram peletizados em placas de fundo em U por centrifugação a 600 RPM (62 x g) por 5 mi- nutos. As células foram ressuspensas em 20 µL de anticorpos purifi- cados em tampão de FACS e incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, as células foram lavadas três vezes por tampão de FACS. Usando Ab secundário de IgG anti-humano conju- gado a PE/Cy7 (Biolegend, Cat #409316), a presença de mAbs anti- CD47 nos glóbulos vermelhos e células RAJI foi medida por FACS (Attune NxT Flow Cytometer; Carlsbad, CA). Os resultados da análise da ligação por FACS dos mAbs anti-CD47 são fornecidos na figura 7A- 7B. EXEMPLO 8: ENSAIO DE LIGAÇÃO DA SIRPΑ COM BASE NAS CÉ-

LULAS

[00202] Células RAJI foram cultivadas em RPMI+10% de FBS. A proteína SIRPα (ECD)-mFc humana (huSIRPα-muFc) (ECD SIRPα humana fundida ao Fc de camundongo) à concentração final de 30 nM foi incubada com mAbs anti-CD47 humanizados purificados a 30, 90 e 300 nM. A mistura foi, então, adicionada a 14.000 células RAJI em uma placa de fundo redondo de 96 poços, misturada e incubada no nutador por 30 minutos à temperatura ambiente. As células foram, en- tão, centrifugadas a 600 rpm por 5 minutos e lavadas com tampão de FACS (HBSS suplementado com 0,1% de BSA e 0,05% de azida de sódio) três vezes. As células foram, então, incubadas com anticorpos policlonais Fc anticamundongo de jumento conjugados a FITC (Jack- son, ImmunoResearch: Cat: 715-095-150) no nutador por 15 minutos à temperatura ambiente, lavadas com tampão de FACS três vezes e, em seguida, ressuspensas em tampão de FACS. As células foram, então, executadas através do instrumento Attune NxT e os dados foram ana- lisados pelo software NxT Attune. Os resultados dos mAbs anti-CD47 humanizados H3L9, H5L5 e H8L10 no bloqueio da ligação do huSIR- Pα-muFc a células RAJI estão mostrados na figura 8. EXEMPLO 9: ENSAIO DA FAGOCITOSE MEDIADA POR MACRÓ-

FAGOS

[00203] Monócitos humanos foram induzidos por 6 dias em meio AIM-V (Thermo Fisher, CAT: 12055091) contendo 50 ng/ml de GM- CSF (Shenandoah, Cat: 100-08-20 ug). Os macrófagos foram, então, polarizados com 100 ng/ml de INF-gama (Shenandoah, Cat: 100-77- 100 ug) por mais 2 dias. Os macrófagos M1 foram definidos como a população CD14+, CD80+, CD163- e CD206+. Depois de separado das placas de cultura de tecidos, os macrófagos foram lavados uma vez com RPMI-1640 contendo FBA a 10% e, em seguida, duas vezes com HBSS gelado. O número de células foi ajustado para 2 x 106 cé- lulas/mL em meio AIM-V. 25 μL de mAbs de teste e 25 µl da suspen- são de células de macrófagos (50.000 células ) foram adicionados a 50 μL de células RAJI (100.000 células) marcadas com CFSE (Thermo Fisher, Cat: 34570) em cada poço de uma placa de 96 poços e incu- bados por 2 horas a 37°C. A concentração final do mAb foi de 10 ug/ml. Após a co-cultura, as misturas de células foram coradas com mAb CD14 anti-humano conjugado a PE-Cy7, (Biolegend, Cat: 367111). Após a coração, as células foram analisadas por citometria de fluxo. O percentual de macrófagos positivos tanto para CFSE quan- to PE-Cy7 na população de macrófagos positivos para PE-Cy7 é apre- sentado como a fagocitose. Os resultados dos mAbs anti-CD47 huma- nizados H3L9, H5L5 e H8L10 na indução da fagocitose mediada por macrófagos de células RAJI estão mostrados na figura 9.

[00204] Será apreciado por aqueles com conhecimento na técnica que alterações poderiam ser feitas às modalidades descritas acima, sem afastamento do seu amplo conceito inventivo. Fica entendido, portanto, que esta invenção não se limita às modalidades particulares descritas, mas pretende cobrir as modificações dentro do espírito e do âmbito de aplicação da presente invenção, tal como definidos pela presente descrição.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de liga- ção ao antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende uma re- gião determinante da complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, uma região determinante da complemen- taridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2 e LCDR3, tendo as se- quências de polipeptídeos de: (1) SEQ ID NOs: 177, 46, 47, 178, 112 e 179, respectivamente; (2) SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 117, 118 e 119, respectivamente; (3) SEQ ID NOs: 54, 55, 56, 120, 121 e 122, respectivamente; (4) SEQ ID NOs: 57, 58, 59, 123, 124 e 125, respectivamente; (5) SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 126, 127 e 128, respectivamente; (6) SEQ ID NOs: 180, 181, 182, 129, 130 e 131, respectivamente; (7) SEQ ID NOs: 72, 73, 74, 138, 139 e 140, respectivamente; (8) SEQ ID NOs: 78, 79, 80, 144, 145 e 146, respectivamente; (9) SEQ ID NOs: 81, 82, 83, 147, 148 e 149, respectivamente; (10) SEQ ID NOs: 84, 85, 86, 150, 151 e 152, respectivamente; (11) SEQ ID NOs: 87, 88, 89, 153, 154 e 155, respectivamente; (12) SEQ ID NOs: 90, 91, 92, 156, 157 e 158, respectivamente; (13) SEQ ID NOs: 93, 94, 95, 159, 160 e 161, respectivamente; (14) SEQ ID NOs: 96, 97, 98, 162, 163 e 164, respectivamente; (15) SEQ ID NOs: 99, 100, 101, 165, 166 e 167, respectivamente; (16) SEQ ID NOs: 102, 103, 104, 168, 169 e 170, respectivamente; (17) SEQ ID NOs: 105, 106, 107, 171, 172 e 173, respectivamente; (18) SEQ ID NOs: 108, 109, 110, 174, 175 e 176, respectivamente; ou (19) SEQ ID NOs: 201, 202, 203, 204, 205 e 206, respectivamente; em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga es- pecificamente o CD47, de preferência o CD47 humano.

2. Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia pesada com uma se- quência de polipeptídeos pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 ou 43, ou uma região variável da cadeia leve com uma sequência de poli- peptídeos pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 ou 44.

3. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de liga- ção ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende: a. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 1; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 2; b. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 3; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 4; c. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 5; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 6; d. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 7; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 8; e. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 9; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 10; f. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 11; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 12; g. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 13; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 14;

h. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 15; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 16; i. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 17; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 18; j. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 19; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 20; k. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 21; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 22; l. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 23; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 24; m. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeos da SEQ ID NO: 25; e uma região variável da ca- deia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 26; n. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 27; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 28; o. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 29; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 30; p. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 31; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 32; q. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 33; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 34;

r. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 35; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 36; s. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 37; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 38; t. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 39; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 40; u. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 41; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 42; ou v. uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 43; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 44.

4. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de liga- ção ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de liga- ção ao antígeno inibe a interação do CD47 e trombospondina-1 (TSP- 1) e/ou do CD47 e SIRP.

5. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de liga- ção ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de liga- ção ao antígeno é quimérico.

6. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de liga- ção ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de liga- ção ao antígeno é humano ou humanizado.

7. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de liga- ção ao antígeno, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno com- preende: uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 183; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 191; uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 183; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 192; uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 183; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 193; uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 184; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 190; uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 184; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 192; uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 184; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 193; uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 185; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 190; uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 185; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 191; uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 185; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 193; uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 185; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 198; uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 187; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 194; uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 188; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 194; uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 188; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 196; ou uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 188; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 197 uma região variável da cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 199; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 200.

8. Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ca- racterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é capaz de bloquear a ligação do CD47 à trombospondi- na-1 (TSP1) e/ou à proteína reguladora de sinal alfa (SIRPα).

9. Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ca- racterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é capaz de induzir a fagocitose mediada por macrófagos de células cancerosas.

10. Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é capaz de ligar células cancerosas com ligação mínima a não detectável aos glóbulos vermelhos.

11. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo monocolonal ou seu fragmento de ligação ao antí- geno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

12. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico isolado conforme definido na reivindicação 11.

13. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende o vetor conforme definido na reivindicação 12.

14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 10, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

15. Método de bloqueio da ligação do CD47 à trombospon- dina-1 (TSP1) em um indivíduo em sua necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 14.

16. Método de bloqueio da ligação do CD47 à proteína re- guladora de sinal alfa (SIRPα) em um indivíduo em sua necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 14.

17. Método de tratamento de câncer em um indivíduo em sua necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende adminis- trar ao indivíduo a composição farmacêutica conforme definida na rei- vindicação 14.

18. Método de tratamento de uma doença inflamatória em um indivíduo em sua necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica con- forme definida na reivindicação 14.

19. Método de tratamento de uma doença infecciosa em um indivíduo em sua necessidade, caracterizado pelo fato de que com- preende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 14.

20. Método de tratamento da aterosclerose em um indiví- duo em sua necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 14.

21. Método de tratamento de uma doença cardiovascular em um indivíduo em sua necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica con- forme definida na reivindicação 14.

22. Método de tratamento de uma doença metabólica em um indivíduo em sua necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica con- forme definida na reivindicação 14.

23. Método de tratamento de uma lesão induzida por radia- ção em um indivíduo em sua necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 14.

24. Método de tratamento de uma doença autoimune em um indivíduo em sua necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica con- forme definida na reivindicação 14.

25. Método de determinação de um nível do CD47 em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: a. obter uma amostra do indivíduo; b. colocar a amostra em contato com um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10; c. determinar um nível do CD47 no indivíduo

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracteriza- do pelo fato de que a amostra é uma amostra de tecido.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracteriza- do pelo fato de que a amostra de tecido é uma amostra de tecido com câncer.

28. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracteriza- do pelo fato de que a amostra é uma amostra de sangue.

29. Método de produção do anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura de uma célula compreendendo um ácido nucleico que codifica o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno sob condições para produzir o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno, e a recuperação do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno da célula ou cultura.

30. Método de produção de uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende combinar o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno com um carrea- dor farmaceuticamente aceitável para obter a composição farmacêuti- ca.