BR112020016049A2

BR112020016049A2 - Anticorpos anti-cd73 e seus usos

Info

Publication number: BR112020016049A2
Application number: BR112020016049-0A
Authority: BR
Inventors: Minghan Wang; Hui Zou; Fen PEI
Original assignee: Phanes Therapeutics, Inc.
Priority date: 2018-03-09
Filing date: 2019-03-05
Publication date: 2020-12-08
Also published as: WO2019173291A1; US11299550B2; JP7334177B2; US20200399389A1; EP3762030A4; SG11202007199XA; KR20200128542A; MX2020009366A; AU2019231172A1; CA3090008A1; CN111867628A; JP2021516057A; ZA202004827B; JP2023162257A; EP3762030A1; IL276950A; AU2019231172B2

Abstract

a presente invenção refere-se a anticorpos anti-cd73 e fragmentos de ligação a antígenos dos mesmos. também são descritos ácidos nucleicos que codificam os anticorpos, composições que compreendem os anticorpos e métodos de produção dos anticorpos e uso dos anticorpos para tratamento ou prevenção de doenças como câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPOS ANTI-CD73 E SEUS USOS".

[0001] REFERÊNCIA REMISSIVA PARA PEDIDOS DE DEPÓSITO

CORRELATOS

[0002] Este pedido reivindica a prioridade do pedido provisório de patente US nº 62/640.955 depositado em 9 de março de 2018, do pe- dido provisório de patente US nº 62/721.044, depositado em 22 de agosto de 2018 e do pedido provisório de patente US nº 62/786.598, depositado em 31 de dezembro de 2018. Cada revelação é aqui incor- porada na íntegra, a título de referência.

[0003] CAMPO DA INVENÇÃO

[0004] Esta invenção refere-se a anticorpos monoclonais anti- CD73, ácidos nucleicos e vetores de expressão codificando os anticor- pos, células recombinantes contendo os vetores e composições com- preendendo os anticorpos. Também são fornecidos métodos para pro- duzir os anticorpos e métodos para usar os anticorpos para tratar doen- ças associadas com CD73 como câncer e doenças inflamatórias e/ou complicações associadas.

[0005] REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS ENVIADA

ELETRONICAMENTE

[0006] Este pedido contém uma listagem de sequências, que é en- viada eletronicamente via EFS-Web como uma listagem de sequências formatada em ASCII com um nome de arquivo "689204.10WO Se- quence Listing" e uma data de criação de domingo, 24 de fevereiro de 2019 e com um tamanho de 114 kb. A listagem de sequências enviada via EFS-Web faz parte do relatório descritivo e é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0007] ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0008] A CD73, também conhecida como ecto-5'-nucleotidase (ecto-5'-NT ou EC 3.1.3.5), é uma fosfatase de superfície celular que catalisa a desfosforilação de AMP extracelular para produzir adenosina. Embora seja uma proteína ancorada com glicofosfatidilinositol (GPI), a CD73 também pode ser vertida para produzir uma forma cataliticamente ativa (Arias et al., J Cell Biol. 1997; 136(2):421-31). Fisiologicamente, a CD73 é induzida por hipóxia para controlar a inflamação em locais de lesão (Bours et al., Pharmacisol Ther 2006; 112:358-404). Patologica- mente, a CD73 é frequentemente encontrada superexpressada em cé- lulas T regulatórias (Tregs) e células tumorais (Paul et al., Trends Immu- nol 2012; 33:231-237). A atividade elevada da CD73 leva ao acúmulo de adenosina no microambiente tumoral (TME).

[0009] Evidências acumuladas indicam que a atividade da CD73 em locais tumorais é um dos principais fatores que moldam um TME pró- tumor que é fundamental para o crescimento e a sobrevivência do tumor (Whiteside, Expert Rev. Antancer Ther. 2017; 17(6):527-35). A homeos- tase extracelular de ATP-adenosina é determinada pelas atividades do CD39, que converte ATP em AMP, e CD73, que usa AMP para produzir adenosina. Através da ligação aos receptores de adenosina A2a e A2b, a adenosina suprime as imunidades inatas e adaptativas regulando mui- tas células imunes, como macrófagos (Csoka et al., FASEB J 2012; 26:376-386), células dendríticas (Panther et al., Blood 2003; 101:3985- 3990), células natural killer (Hausler et al., Cancer Immunol Immunother 2011; 60:1405-1418) e células efetoras T (Hoskin et al., Int J Oncol 2008; 32:527-535). Portanto, foi levantada a hipótese de que a imunos- supressão por adenosina pode ser aliviada pela inibição da atividade enzimática da CD73 na TME. Na verdade, estudos in vivo em animais (Jin et al., Cancer Res 2010; 70:2245-2255; Stagg et al., Cancer Res 2011; 71:2890-2900) indicam que a inibição da atividade enzimática da CD73 suprime a formação e o crescimento do tumor, sugerindo que a CD73 é um alvo promissor para a terapia do câncer. Os anticorpos mo- noclonais que inibem a atividade enzimática da CD73 e/ou reduzem o teor de CD73 na superfície celular (ou seja, induzindo a internalização de CD73) podem ser eficazes no tratamento isolado do câncer como monoterapia ou em combinação com outros fármacos imuno-oncológi- cos e/ou outros tipos de terapias anti-câncer.

[0010] BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0011] Em um aspecto geral, a invenção refere-se a anticorpos mo- noclonais isolados ou fragmentos de ligação a antígenos do mesmo que se ligam à CD73.

[0012] São fornecidos anticorpos monoclonais isolados ou fragmen- tos de ligação a antígeno dos mesmos compreendendo uma região de- terminante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2 e LCDR3, com as sequências de poli- peptídeos de:

[0013] (1) SEQ ID NOs:89, 90, 91, 149, 150 e 151, respectivamente;

[0014] (2) SEQ ID NOs:41, 42, 43, 101, 102 e 103, respectivamente;

[0015] (3) SEQ ID NOs:44, 45, 46, 104, 105 e 106, respectivamente;

[0016] (4) SEQ ID NOs:47, 48, 49, 107, 108 e 109, respectivamente;

[0017] (5) SEQ ID NOs:50, 51, 52, 110, 111 e 112, respectivamente;

[0018] (6) SEQ ID NOs:53, 54, 55, 113, 114 e 115, respectivamente;

[0019] (7) SEQ ID NOs:56, 57, 58, 116, 117 e 118, respectivamente;

[0020] (8) SEQ ID NOs:59, 60, 61, 119, 120 e 121, respectivamente;

[0021] (9) SEQ ID NOs:62, 63, 64, 122, 123 e 124, respectivamente;

[0022] (10) SEQ ID NOs:65, 66, 67, 125, 126 e 127, respectiva- mente;

[0023] (11) SEQ ID NOs:68, 69, 70, 128, 129 e 130, respectiva- mente;

[0024] (12) SEQ ID NOs:71, 72, 73, 131, 132 e 133, respectiva- mente;

[0025] (13) SEQ ID NOs:74, 75, 76, 134, 135 e 136, respectiva- mente;

[0026] (14) SEQ ID NOs:77, 78, 79, 137, 138 e 139, respectiva- mente;

[0027] (15) SEQ ID NOs:80, 81, 82, 140, 141 e 142, respectiva- mente;

[0028] (16) SEQ ID NOs:83, 84, 85, 143, 144 e 145, respectiva- mente;

[0029] (17) SEQ ID NOs:86, 87, 88, 146, 147 e 148, respectiva- mente;

[0030] (18) SEQ ID NOs:92, 93, 94, 152, 153 e 154, respectiva- mente;

[0031] (19) SEQ ID NOs:95, 96, 97, 155, 156 e 157, respectiva- mente; ou

[0032] (20) SEQ ID NOs:98, 99, 100, 158, 159 e 160, respectiva- mente;

[0033] em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga especificamente à CD73, de preferência a CD73 hu- mana.

[0034] São fornecidos anticorpos monoclonais isolados ou fragmen- tos de ligação a antígeno dos mesmos compreendendo uma região de- terminante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2 e LCDR3, com as sequências de poli- peptídeos de:

[0035] (1) SEQ ID NOs:209, 210, 211, 269, 270 e 271, respectiva- mente;

[0036] (2) SEQ ID NOs:161, 162, 163, 221, 222 e 223, respectiva- mente;

[0037] (3) SEQ ID NOs:164, 165, 166, 224, 225 e 226, respectiva- mente;

[0038] (4) SEQ ID NOs:167, 168, 169, 227, 228 e 229, respectiva- mente;

[0039] (5) SEQ ID NOs:170, 171, 172, 230, 231 e 232, respectiva- mente;

[0040] (6) SEQ ID NOs:173, 174, 175, 233, 234 e 235, respectiva- mente;

[0041] (7) SEQ ID NOs:176, 177, 178, 236, 237 e 238, respectiva- mente;

[0042] (8) SEQ ID NOs:179, 180, 181, 239, 240 e 241, respectiva- mente;

[0043] (9) SEQ ID NOs:182, 183, 184, 242, 243 e 244, respectiva- mente;

[0044] (10) SEQ ID NOs:185, 186, 187, 245, 246 e 247, respectiva- mente;

[0045] (11) SEQ ID NOs:188, 189, 190, 248, 249 e 250, respectiva- mente;

[0046] (12) SEQ ID NOs:191, 192, 193, 251, 252 e 253, respectiva- mente;

[0047] (13) SEQ ID NOs:194, 195, 196, 254, 255 e 256, respectiva- mente;

[0048] (14) SEQ ID NOs:197, 198, 199, 257, 258 e 259, respectiva- mente;

[0049] (15) SEQ ID NOs:200, 201, 202, 260, 261 e 262, respectiva- mente;

[0050] (16) SEQ ID NOs:203, 204, 205, 263, 264 e 265, respectiva- mente;

[0051] (17) SEQ ID NOs:206, 207, 208, 266, 267 e 268, respectiva- mente;

[0052] (18) SEQ ID NOs:212, 213, 214, 272, 273 e 274, respectiva- mente;

[0053] (19) SEQ ID NOs:215, 216, 217, 275, 276 e 277, respectiva- mente; ou

[0054] (20) SEQ ID NOs:218, 219, 220, 278, 279 e 280, respectiva- mente;

[0055] em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga especificamente à CD73, de preferência a CD73 hu- mana.

[0056] Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO:33, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35, 37 ou 39, ou uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 95%, pelo me- nos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idên- tica à SEQ ID NO:34, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 36, 38 ou 40.

[0057] Em determinadas modalidades, o anticorpo monoclonal iso- lado ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende:

[0058] (a) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:33 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:34;

[0059] (b) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:1 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:2;

[0060] (c) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:3 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:4;

[0061] (d) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:5 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:6;

[0062] (e) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:7 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:8;

[0063] (f) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:5 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:10;

[0064] (g) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:11 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:12;

[0065] (h) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:13 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:14;

[0066] (i) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:15 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:16;

[0067] (j) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:17 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:18;

[0068] (k) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:19 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:20;

[0069] (l) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:21 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:22;

[0070] (m) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:23 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:24;

[0071] (n) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:25 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:26;

[0072] (o) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:27 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:28;

[0073] (p) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:29 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:30;

[0074] (q) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:31 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:32;

[0075] (r) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:35 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:36;

[0076] (s) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:37 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:38; ou

[0077] (t) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:39 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:40.

[0078] Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo inibe a atividade enzimática da CD73 solúvel e/ou de superfície celular.

[0079] Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo previne a dimerização da CD73.

[0080] Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo induz a internalização da CD73.

[0081] Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo é quimérico.

[0082] Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo é humano ou humanizado.

[0083] Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal humanizado ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende:

[0084] (1) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:286 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:293;

[0085] (2) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:282 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:290;

[0086] (3) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:282 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:291;

[0087] (4) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:282 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:292;

[0088] (5) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:283 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:290;

[0089] (6) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:283 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:291;

[0090] (7) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:283 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:292;

[0091] (8) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:290;

[0092] (9) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:291;

[0093] (10) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:292;

[0094] (11) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:285 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:290;

[0095] (12) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:285 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:291;

[0096] (13) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:285 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:292;

[0097] (14) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:283 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:293;

[0098] (15) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:293;

[0099] (16) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:285 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:293;

[0100] (17) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:286 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:290;

[0101] (18) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:286 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:291;

[0102] (19) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:286 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:292;

[0103] (20) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:287 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:294;

[0104] (21) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:288 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:294;

[0105] (22) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:289 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:294;

[0106] (23) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:299;

[0107] (24) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:295 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:299;

[0108] (25) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:296 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:299;

[0109] (26) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:297 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:299; ou

[0110] (27) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:298 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:299.

[0111] Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo é capaz de ativar as células T.

[0112] Também são fornecidos ácidos nucleicos isolados que codi- ficam os anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo da invenção descritos aqui.

[0113] Também são fornecidos vetores compreendendo os ácidos nucleicos isolados que codificam um anticorpo monoclonal ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo da invenção.

[0114] Também são fornecidas células hospedeiras que compreen- dem os vetores compreendendo os ácidos nucleicos isolados que codi- ficam o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção.

[0115] Em certas modalidades, é fornecida uma composição farma- cêutica compreendendo o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção e um veículo farmaceuti- camente aceitável.

[0116] Também são fornecidos métodos para inibir a atividade da nucleotidase da CD73 em um indivíduo que precisa do mesmo, compre- endendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica da invenção.

[0117] Também são fornecidos métodos para prevenir a dimeriza- ção da CD73 em um indivíduo que precisa do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica da in- venção.

[0118] Também são fornecidos métodos para induzir a internaliza- ção da CD73 em um indivíduo que precisa do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica da in- venção.

[0119] Também são fornecidos métodos de tratamento do câncer em um indivíduo que precisa do mesmo, compreendendo a administra- ção ao indivíduo da composição farmacêutica da invenção. O câncer pode ser qualquer câncer líquido ou sólido, por exemplo, pode ser sele- cionado a partir de, mas não limitado a, câncer de pulmão, câncer gás- trico, câncer do cólon, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células renais, carcinoma urotelial da bexiga, melanoma metastático, câncer de mama, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, câncer pancreático, glioma, glioblastoma e outros tumores sólidos, e lin- foma não-Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia lin- focítica crônica (CLL), leucemia mieloide crônica (CML), mieloma múlti- plo (MM), leucemia mieloide aguda (AML) e outros tumores líquidos.

[0120] Também são fornecidos métodos para produzir o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção, compreendendo a cultura de uma célula compreendendo um ácido nu- cleico que codifica o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em condições para produzir o anticorpo monoclo- nal ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, e recuperando o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo da célula ou da cultura.

[0121] Também são fornecidos métodos para produção de uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção, compreen- dendo a combinação do anticorpo monoclonal ou do fragmento de liga- ção a antígeno do mesmo com um veículo farmaceuticamente aceitável para obter a composição farmacêutica.

[0122] Também são fornecidos métodos para determinar um nível de CD73 em um indivíduo. Os métodos compreendem (a) obter uma amostra do indivíduo; (b) colocar a amostra em contato com um anti- corpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção; e (c) determinar o nível de CD73 no indivíduo. Em certas modalidades, a amostra é uma amostra de tecido. A amostra de tecido pode, por exem- plo, ser uma amostra de tecido de câncer. Em certas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue.

[0123] Também são fornecidos métodos para determinar a ativi- dade da ecto-5'-nucleotidase da CD73 em um indivíduo, em que a ativi- dade enzimática pode ser totalmente inibida pelo anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção. Os métodos compreendem (a) obter uma amostra do indivíduo; (b) colocar a amostra em contato com um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção; e (c) determinar a atividade da ecto-5'-nucleoti- dase da CD73 no indivíduo. Em certas modalidades, a amostra é uma amostra de tecido. A amostra de tecido pode, por exemplo, ser uma amostra de tecido de câncer. Em certas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue.

[0124] BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0125] O sumário supracitado, bem como a descrição detalhada a seguir das modalidades preferenciais do presente pedido, serão melhor compreendidos quando lidos em conjunto com os desenhos anexados. No entanto, deve-se entender que o pedido não se limita às modalida- des precisas mostradas nos desenhos.

[0126] As Figs. 1A e 1B mostram a inibição da atividade da nucleo- tidase da CD73 humana imobilizada em uma placa por meio de mAbs anti-CD73 quiméricos. Nenhum anticorpo, reação enzimática sem adi- ção de anticorpo; AMPCP (difosfato de adenosina 5'(α,β-metil) foi usado como um controle para inibição da atividade enzimática.

[0127] As Figs. 2A-2E mostram a ligação de mAbs anti-CD73 qui- méricos para CD73 humana em ensaio Elisa.

[0128] A Fig. 3 mostra a inibição da atividade da nucleotidase da CD73 humana solúvel por mAbs quiméricos 60A9A/IgG4 e 39G8A/IgG4. Sem mAb, reação enzimática sem adição de anticorpo; sem CD73, reação de controle negativo sem adição de anticorpo nem CD73.

[0129] As Figs. 4A-4D mostram a ligação à CD73 humano e a inibi- ção da atividade da nucleotidase da CD73 humana pelo mAb humani- zado 60A9-H5L4/IgG4. A Fig. 4A mostra a ligação de mAb humanizado 60A9-H5L4/IgG4 à CD73 humana em um ensaio ELISA; o mAb quimé- rico 60A9A/IgG4 foi usado como controle. A Fig. 4B mostra a inibição da atividade da nucleotidase da CD73 humana solúvel por mAb huma- nizado 60A9-H5L4/IgG4. Sem mAb, reação enzimática sem adição de mAb; sem CD73, reação de enzima sem adição de CD73. A Fig. 4C mostra a inibição da atividade da nucleotidase da CD73 humana expres- sada na superfície das células A375 por mAb humanizado 60A9- H5L4/IgG4; o mAb quimérico 60A9A/IgG4 foi usado como controle. Sem mAb, reação enzimática sem adição de mAb; sem AMP, reação enzi- mática sem adição de AMP; sem células, reação enzimática sem células adicionadas. A Fig. 4D mostra a inibição da atividade da nucleotidase da CD73 humana expressada na superfície das células A375 por mAbs humanizados 60A9-H3L5/IgG4, 60A9-H5L5/IgG4, 60A9-H6L5/IgG4, 60A9-H7L5/IgG4, 60A9-H8L5/IgG4 e 60A9-H9L5/IgG4; o mAb quimé- rico 60A9A/IgG4 foi usado como controle. Sem mAb, reação enzimática sem adição de mAb; sem AMP, reação enzimática sem adição de AMP; sem células, reação enzimática sem células adicionadas.

[0130] A Fig. 5 mostra a inibição da atividade da nucleotidase da CD73 nas amostras de soro de pacientes por mAb humanizado anti- CD73 60A9-H5L4/IgG4. Sem mAb, reação enzimática sem adição de anticorpo; fundo de ensaio, reação enzimática com adição de 100 µm AMP e 100 µm ATP; cps, contagens/segundo.

[0131] A Fig. 6 mostra a ativação da proliferação de célula T por mAb humanizado anti-CD73 60A9-H5L4/IgG4.

[0132] DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0133] Várias publicações, artigos e patentes são citados ou descri- tos nos antecedentes e em todo o relatório descritivo; cada uma dessas referências é aqui incorporada a título de referência, em sua totalidade. A discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou si- milares que foram incluídos no presente relatório descritivo tem como objetivo fornecer contexto para a invenção. Tal discussão não é uma admissão que qualquer ou todos esses assuntos fazem parte da técnica anterior com relação a quaisquer invenções reveladas ou reivindicadas.

[0134] A menos que definidos de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos utilizados aqui terão o mesmo significado que normal- mente entendido pelo versado na técnica a que a presente invenção pertence. Caso contrário, determinados termos usados neste docu- mento têm os significados definidos no relatório descritivo.

[0135] Deve ser observado que, conforme usado aqui e nas reivin- dicações em anexo, as formas singulares “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referências no plural, a menos que o contexto determine claramente o contrário.

[0136] Exceto onde especificado em contrário, quaisquer valores numéricos, como uma concentração ou uma faixa de concentração aqui descrita, devem ser compreendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Portanto, um valor numérico normal- mente inclui ± 10% do valor recitado. Por exemplo, uma concentração de 1 mg/mL inclui 0,9 mg/mL a 1,1 mg/mL. Da mesma forma, um inter- valo de concentração de 1% a 10% (p/v) inclui 0,9% (p/v) a 11% (p/v). Como usado aqui, o uso de uma faixa numérica inclui expressamente todas as possíveis subfaixas, todos os valores numéricos individuais dentro dessa faixa, incluindo número inteiro, dentro de tais faixas e fra- ções de valores a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0137] Salvo indicação em contrário, o termo "pelo menos" que pre- cede uma série de elementos deve ser entendido para se referir a todos os elementos da série. Os versados na técnica reconhecerão ou serão capazes de usar com determinação não mais do que a rotina de expe- rimentação, muitos equivalentes das modalidades específicas da inven- ção descritas aqui. Tais equivalentes são destinados a ser englobados pela invenção.

[0138] Conforme usado aqui, os termos "compreende", "compreen- dendo", "inclui", "incluindo", "tem", "tendo", "contém" ou "contendo", ou qualquer outra variação destes, serão entendidos como implicando a inclusão de um número inteiro ou grupo de números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros e se destinam a ser não-exclusivos ou abertos. Por exemplo, uma com- posição, uma mistura, um processo, um método, um artigo ou um apa- relho que compreende uma lista de elementos não é necessariamente limitada apenas a esses elementos, mas pode incluir outros elementos não expressamente listados ou inerentes a tal composição, mistura, pro- cesso, método, artigo ou aparelho. Além disso, a não ser que seja indi- cado expressamente ao contrário, "ou" refere-se a um inclusivo ou e não a um exclusivo ou. Por exemplo, uma condição A ou B é satisfeita por qualquer um dos seguintes: A é verdadeiro (ou presente) e B é falso (ou não presente), A é falso (ou não presente) e B é verdadeiro (ou pre- sente), e A e B são verdadeiros (ou presentes).

[0139] Como usado aqui, o termo conjuntivo "e/ou" entre vários ele- mentos recitados é entendido como abrangendo ambas opções indivi- duais e combinadas. Por exemplo, onde dois elementos são unidos por "e/ou", uma primeira opção se refere à aplicabilidade do primeiro ele- mento sem o segundo. Uma segunda opção se refere à aplicabilidade do segundo elemento sem o primeiro. Uma terceira opção se refere à aplicabilidade do primeiro e do segundo elementos juntos. Qualquer uma dessas opções é entendida como se enquadrando no significado e, portanto, atende ao requisito do termo "e/ou", conforme usado aqui.

A aplicabilidade simultânea de mais de uma das opções também é en- tendida como se enquadrando no significado e, portanto, satisfaz a exi- gência do termo "e/ou".

[0140] Conforme usado aqui, o termo "consiste em" ou variações, como "consistir em" ou "consistindo em", conforme usado em toda a especificação e reivindicações, indicam a inclusão de qualquer número inteiro ou grupo de números inteiros mencionados, mas nenhum número inteiro ou grupo adicional de números inteiros pode ser adicionado ao método, estrutura ou composição especificados.

[0141] Como usado aqui, o termo "consiste essencialmente em", e variações como "consistem essencialmente de" ou "consistindo essen- cialmente de", como usado em toda a especificação e reivindicações, indicam a inclusão de qualquer número inteiro ou grupo de números in- teiros mencionados, e a inclusão opcional de qualquer número inteiro ou grupo de números inteiros, que não altere substancialmente as pro- priedades básicas ou novas do método ou composição especificados. Ver M.P.E.P. § 2111.03.

[0142] Conforme usado aqui, "indivíduo" significa qualquer animal, de preferência um mamífero, com mais preferência um ser humano. O termo "mamífero", conforme usado aqui, abrange qualquer mamífero. Exemplos de mamíferos incluem, mas não se limitam a, vacas, cavalos, ovelhas, porcos, gatos, cães, camundongos, ratos, coelhos, cobaias, macacos, seres humanos, etc., com mais preferência um ser humano.

[0143] As palavras "direita", "esquerda", "inferior" e "superior" desig- nam direções nos desenhos aos quais é feita referência.

[0144] Também deve ser entendido que os termos "cerca de", "aproximadamente", "geralmente", "substancialmente" e termos seme- lhantes, usados aqui quando se referem a uma dimensão ou caracterís- tica de um componente da invenção preferida, indica que a dimen- são/característica descrita não é um limite ou parâmetro rigoroso e não exclui variações menores que sejam funcionalmente iguais ou seme- lhantes, como seria entendido por um versado na técnica. No mínimo, tais referências que incluem um parâmetro numérico incluiriam varia- ções que, usando princípios matemáticos e industriais aceitos na téc- nica (por exemplo, arredondamento, medição ou outros erros sistemáti- cos, tolerâncias de fabricação, etc), não variariam o dígito menos signi- ficativo.

[0145] Os termos "idêntica" ou "identidade" percentual, no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídeos (por exemplo, anticorpos anti-CD73 e polinucleotídeos que os codificam, po- lipeptídeos CD73 e polinucleotídeos CD73 que os codificam), referem- se a duas ou mais sequências ou subsequências que sejam iguais ou tenham uma percentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos iguais, quando comparadas e alinhadas para correspon- dência máxima, tal como medidas usando um dos seguintes algoritmos de comparação sequencial ou por inspeção visual.

[0146] Para comparação de sequência, normalmente uma sequên- cia atua como uma sequência de referência, à qual as sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de se- quência, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computador, as coordenadas de subsequência são designadas, se ne- cessário, e os parâmetros do programa de algoritmo de sequência são designados. O algoritmo de comparação de sequência calcula a porcen- tagem da identidade da sequência para as sequências de teste em re- lação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa designado.

[0147] O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser realizado, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinha- mento de homologia de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443

(1970), pela busca pelo método de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementações com- putadorizadas usando esses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Software de Genética de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspeção visual (ver em geral, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, uma joint venture entre a Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley e Sons, Inc., (Suplemento 1995) (Ausu- bel)).

[0148] Exemplos de algoritmos adequados para determinar a per- centagem de identidade da sequência e a similaridade da sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, descritos em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, respectivamente. O software para realizar análise de BLAST está disponível publicamente através do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Esse algoritmo envolve primeiro identificar pares de sequência de pontuação alta (HSPs) identificando palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, que cor- respondem ou satisfazem uma pontuação de limite de valor positivo T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de banco de dados. T é chamado de limite de pontuação da palavra de vizinhança (Altschul et al, supra). Essas ocorrências iniciais de palavras de vizinhança agem como sementes para iniciar pesquisas para encontrar HSPs mais longos que as contenham. As ocorrências de palavras são então estendidas em ambas as direções ao longo de cada sequência até que a pontuação de alinhamento cumulativa possa ser aumentada.

[0149] As pontuações cumulativas são calculadas usando, para se- quências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade para resíduos com erro de correspondência; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é usada para calcular a pontuação cumulativa. A extensão das ocorrências de palavras em cada direção é interrompida quando: a pontuação de ali- nhamento cumulativa cai pela quantidade X de seu valor máximo atin- gido; a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo, devido ao acú- mulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa; ou o final de qualquer sequência é atingido. Os parâmetros do algoritmo de BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do ali- nhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambas as fitas. Para se- quências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).

[0150] Além de calcular a percentagem de identidade da sequência, o algoritmo BLAST também executa uma análise estatística da seme- lhança entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin e Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Uma medida de seme- lhança fornecida pelo algoritmo de BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoáci- dos ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado semelhante a uma sequência de referência se a probabilidade de soma menor numa comparação do ácido nucleico de teste com o ácido nu- cleico de referência for menor que cerca de 0,1, com mais preferência menor que cerca de 0,01 e com a máxima preferência menor que cerca de 0,001.

[0151] Uma outra indicação de que duas sequências de ácido nu- cleico ou polipeptídeos são substancialmente idênticas é que o polipep- tídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico é imunologicamente rea- tivo cruzado com o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico, conforme descrito abaixo. Assim, um polipeptídeo é tipicamente subs- tancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, onde os dois peptídeos diferem apenas por substituições conservadoras. Outra indicação de que duas sequências de ácido nucleico são substancial- mente idênticas é que as duas moléculas se hibridizam entre si em con- dições rigorosas.

[0152] Conforme usado aqui, os termos "inibir", "inibindo" e "inibi- ção" significam diminuir uma atividade, resposta, condição, doença ou outro parâmetro biológico. Isso pode incluir, mas não se limita a, ablação completa da atividade, resposta, condição ou doença. Isso também pode incluir, por exemplo, uma redução de 10% na atividade, resposta, condição ou doença em comparação com o nível nativo ou de controle. Assim, a redução pode ser de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% ou qualquer redução entre, em comparação aos níveis nativos ou de controle. Por meio de um exemplo não limitante, um anticorpo da inven- ção pode inibir a atividade da nucleotidase de uma proteína CD73. A atividade da proteína CD73 pode ser reduzida ou sofrer ablação em re- lação à atividade da proteína CD73 nativa. Por meio de outro exemplo não limitante, um anticorpo da invenção pode inibir ou prevenir a dime- rização de uma proteína CD73 em um indivíduo. A dimerização da CD73 pode ser reduzida ou sofrer ablação em relação à dimerização da CD73 nativa.

[0153] Anticorpos

[0154] A invenção refere-se geralmente a anticorpos anti-CD73 iso- lados, ácidos nucleicos e vetores de expressão codificando os anticor-

pos, células recombinantes contendo os vetores e composições com- preendendo os anticorpos. A invenção também geralmente refere-se aos métodos de fazer os anticorpos e métodos de usar os anticorpos para tratar doenças, incluindo câncer. Os anticorpos da invenção pos- suem uma ou mais propriedades funcionais desejáveis, incluindo, mas não se limitando a, ligação de alta afinidade a CD73, alta especificidade a CD73, a capacidade de prevenir a dimerização de CD73, a capaci- dade de induzir a internalização de CD73 nas células, que resulta em uma diminuição no teor da superfície celular de CD73, e a capacidade de inibir o crescimento tumoral em indivíduos que precisam dos mesmos e modelos animais quando administrados isoladamente ou em combi- nação com outras terapias anticâncer.

[0155] Em um aspecto geral, a invenção refere-se a anticorpos mo- noclonais isolados ou fragmentos de ligação a antígenos do mesmo que se ligam especialmente à CD73.

[0156] Conforme aqui usado, o termo "anticorpo" é usado em um sentido amplo e inclui moléculas de imunoglobulina ou anticorpo, inclu- indo anticorpos e fragmentos de anticorpo humanos, humanizados, compostos e quiméricos que são monoclonais ou policlonais. Em geral, os anticorpos são proteínas ou cadeias peptídicas que apresentam es- pecificidade de ligação a um antígeno específico. As estruturas de anti- corpos são bem conhecidas. As imunoglobulinas podem ser atribuídas a cinco classes principais (IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) dependendo da se- quência de aminoácidos de domínio constante de cadeia pesada. IgA e IgG são sub-classificadas ainda como isotipos IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Assim, os anticorpos da invenção podem ser de qualquer uma das cinco classes principais ou subclasses correspondentes. De preferência, os anticorpos da invenção são IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. As cadeias leves do anticorpo de espécies vertebradas podem ser atri-

buídas a um dos dois tipos claramente distintos, kappa e lambda, base- adas nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes. Consequentemente, os anticorpos da invenção podem conter um domí- nio constante de cadeia leve kappa ou lambda. De acordo com modali- dades específicas, os anticorpos da invenção incluem regiões constan- tes de cadeia pesada e/ou leve de anticorpos humanos ou de ratos. Além dos domínios constantes pesados e leves, os anticorpos contêm uma região de ligação a antígeno que é constituída por uma região va- riável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, cada uma das quais contém três domínios (ou seja, regiões determinantes da com- plementaridade 1-3; CDR1, CDR2 e CDR3). Os domínios da região va- riável de cadeia leve são alternativamente referidos como LCDR1, LCDR2 e LCDR3, e os domínios da região variável de cadeia pesada são alternativamente referidos como HCDR1, HCDR2 e HCDR3.

[0157] Conforme usado aqui, o termo "anticorpo isolado" refere-se a um anticorpo substancialmente livre de outros anticorpos com especi- ficidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a CD73 está substancialmente livre de anticor- pos que não se ligam a CD73). Além disso, um anticorpo isolado está substancialmente livre de outros materiais celulares e/ou produtos quí- micos.

[0158] Como usado aqui, o termo "anticorpo monoclonal” refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substan- cialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compre- endem a população são idênticos, exceto para possíveis mutações que ocorrem naturalmente que pode estar presente em pequenas quantida- des. Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser feitos pelo mé- todo de hibridoma, tecnologia de exibição de fago, tecnologia de clona- gem de genes de linfócitos simples ou por métodos de DNA recombi- nante. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos por uma hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano transgênico, como um camundongo ou rato transgênico, com um genoma compreendendo um transgene humano de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve.

[0159] Conforme usado aqui, o termo "fragmento de ligação a antí- geno" refere-se a um fragmento de anticorpo, como, por exemplo, um diabody, um Fab, um Fab', um F(ab')2, um fragmento Fv, um fragmento Fv estabilizado de dissulfeto (dsFv), um (dsFv)2, um dsFv biespecífico (dsFv-dsFv'), um diabody estabilizado por dissulfeto (diabody ds), uma molécula de anticorpo de cadeia única (scFv), uma molécula de domínio único (sdab), um dímero scFv (diabody bivalente), um anticorpo multi- específico formado a partir de uma parte de um anticorpo compreen- dendo uma ou mais CDRs, um anticorpo de domínio único camelizado, um nanocorpo, um anticorpo de domínio, um anticorpo de domínio biva- lente, ou qualquer outro fragmento de anticorpo que se liga a um antí- geno, mas não compreende uma estrutura completa de anticorpos. Um fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar ao mesmo antígeno ao qual o anticorpo original ou um fragmento de anticorpo original se liga. De acordo com modalidades específicas, o fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve, uma região constante de cadeia leve e um segmento Fd de cadeia pesada. De acordo com outras modalidades específicas, o fragmento de ligação a antígeno compreende Fab e F(ab').

[0160] Conforme usado aqui, o termo "anticorpo de cadeia única" refere-se a um anticorpo convencional de cadeia única no campo, que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variá- vel de cadeia leve conectada por um peptídeo curto de cerca de 15 a cerca de 20 aminoácidos. Conforme usado aqui, o termo "anticorpo de domínio único" refere-se a um anticorpo convencional de domínio único no campo, que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada ou que compreende apenas uma região variável de cadeia pesada.

[0161] Conforme usado aqui, o termo "anticorpo humano" refere-se a um anticorpo produzido por um ser humano ou um anticorpo tendo uma sequência de aminoácidos correspondente a um anticorpo produ- zido por um ser humano usando qualquer técnica conhecida no campo. Esta definição de um anticorpo humano inclui anticorpos intactos ou de comprimento completo, fragmentos dos mesmos e/ou anticorpos com- preendendo pelo menos um polipeptídeo humano de cadeia pesada e/ou de cadeia leve.

[0162] Conforme usado aqui, o termo "anticorpo humanizado" re- fere-se a um anticorpo não humano modificado para aumentar a homo- logia da sequência em relação à de um anticorpo humano, de modo que as propriedades de ligação a antígeno do anticorpo sejam mantidas, mas a sua antigenicidade no corpo humano seja reduzida.

[0163] Conforme usado aqui, o termo "anticorpo quimérico" refere- se a um anticorpo em que a sequência de aminoácidos da molécula de imunoglobulina é derivada de duas ou mais espécies. A região variável das cadeias leves e pesadas corresponde frequentemente à região va- riável de um anticorpo derivado de uma espécie de mamífero (por exem- plo, camundongo, rato, coelho, etc) com a especificidade, afinidade e capacidade desejada, enquanto as regiões constantes correspondem às sequências de um anticorpo derivado de outra espécie de mamífero (por exemplo, ser humano) para evitar a obtenção de uma resposta imune nessa espécie.

[0164] Tal como usado aqui, o termo "anticorpo multiespecífico" re- fere-se a um anticorpo que compreende uma pluralidade de sequências de domínios variáveis de imunoglobulina, em que uma primeira sequên- cia de domínio variável de imunoglobulina da pluralidade tem especifici- dade de ligação para um primeiro epítopo e uma segunda sequência de domínio variável de imunoglobulina da pluralidade tem especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos estão no mesmo antígeno, por exemplo, a mesma proteína (ou subunidade de uma proteína multimérica). Em uma moda- lidade, o primeiro e o segundo epítopos se sobrepõem ou se sobrepõem substancialmente. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epíto- pos não se sobrepõem ou não se sobrepõem substancialmente. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos estão em antígenos diferentes, por exemplo, proteínas diferentes (ou subunidade diferentes de uma proteína multimérica). Em uma modalidade, um anticorpo mul- tiespecífico compreende um terceiro, quarto ou quinto domínio variável de imunoglobulina. Em uma modalidade, um anticorpo multiespecífico é uma molécula de anticorpo biespecífico, uma molécula de anticorpo tri- específico ou uma molécula de anticorpo tetraespecífico.

[0165] Conforme usado aqui, o termo "anticorpo biespecífico" re- fere-se a um anticorpo multiespecífico que liga não mais do que dois epítopos ou dois antígenos. Um anticorpo biespecífico é caracterizado por uma primeira sequência de domínio variável de imunoglobulina que tem especificidade de ligação para um primeiro epítopo e uma segunda sequência de domínio variável de imunoglobulina que tem especifici- dade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modalidade, o pri- meiro e o segundo epítopos estão no mesmo antígeno, por exemplo, a mesma proteína (ou subunidade de uma proteína multimérica). Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos se sobrepõem ou se so- brepõem substancialmente. Em uma modalidade, o primeiro e o se- gundo epítopos estão em antígenos diferentes, por exemplo, proteínas diferentes (ou subunidade diferentes de uma proteína multimérica). Em uma modalidade, um anticorpo biespecífico compreende uma sequên- cia de domínio variável de cadeia pesada e uma sequência de domínio variável de cadeia leve que tem especificidade de ligação para um pri- meiro epítopo e uma sequência de domínio variável de cadeia pesada e uma sequência de domínio variável de cadeia leve que tem especifi- cidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modalidade, um anticorpo biespecífico compreende um meio anticorpo, ou fragmento do mesmo, tendo especificidade de ligação para um primeiro epítopo e meio anticorpo, ou fragmento do mesmo, tendo especificidade de liga- ção para um segundo epítopo. Em uma modalidade, um anticorpo bies- pecífico compreende um scFv, ou fragmento do mesmo, tendo especi- ficidade de ligação para um primeiro epítopo, e um scFv, ou fragmento do mesmo, tendo especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modalidade, o primeiro epítopo está localizado no CD73 e o segundo epítopo está localizado em PD-1, PD-L1, TIM-3, LAG-3, CD47, CD3, apelina, claudina18.2, DLL3, receptor de folato alfa (FR), TIP-1, CTLA-4, EGFR, HER-2, CD19, CD20, CD33 ou outros supressores imu- nes associados ao tumor ou antígenos de superfície.

[0166] Conforme usado aqui, o termo "CD73" refere-se à ecto-5'- nucleotidase (ecto-5'-NT ou EC 3.1.3.5), uma fosfatase de superfície ce- lular que catalisa a desfosforilação de AMP extracelular para produzir adenosina. Fisiologicamente, a CD73 é induzida por hipóxia para con- trolar a inflamação em locais de lesão (Bours et al., Pharmacisol Ther 2006; 112:358-404). Patologicamente, a CD73 é frequentemente en- contrada superexpressada em células T regulatórias (Tregs) e células tumorais (Paul et al., Trends Immunol 2012; 33:231-237). A atividade elevada da CD73 leva ao acúmulo de adenosina no microambiente tu- moral (TME). Através da ligação aos receptores de adenosina A2a e A2b, a adenosina suprime as imunidades inatas e adaptativas regulando muitas células imunes, como macrófagos (Csoka et al., FASEB J 2012; 26:376-386), células dendríticas (Panther et al., Blood 2003; 101:3985- 3990), células natural killer (Hausler et al., Cancer Immunol Immunother

2011; 60:1405-1418) e células efetoras T (Hoskin et al., Int J Oncol 2008; 32:527-535). Portanto, foi postulado que a imunossupressão por adenosina pode ser aliviada pela inibição da atividade da CD73 na TME. Na verdade, estudos in vivo em animais (Jin et al., Cancer Res 2010; 70:2245-2255; Stagg et al., Cancer Res 2011; 71:2890-2900) indicam que a inibição da atividade da CD73 inibe a formação e o crescimento do tumor, sugerindo que a CD73 é um alvo promissor para a terapia do câncer. O termo "CD73 humana" refere-se a uma CD73 originada de um ser humano. Uma sequência exemplar de aminoácidos de uma CD73 humana é representada no Genbank, nº de acesso P21589.1 (SEQ ID NO:281).

[0167] Conforme usado aqui, um anticorpo que "se liga especifica- mente a CD73" refere-se a um anticorpo que se liga a uma CD73, de preferência uma CD73 humana, com um KD de 1×10-7 M ou menos, de preferência 1×10-8 M ou menos, de preferência 5×10-9 M ou menos, 1×10-9 M ou menos, 5×10-10 M ou menos, ou 1×10-10 M ou menos. O termo "KD" refere-se à constante de dissociação, que é obtida da razão de Kd para Ka (isto é, Kd/Ka) e é expressada como uma concentração molar (M). Os valores de KD para os anticorpos podem ser determina- dos usando métodos na técnica tendo em vista a presente revelação. Por exemplo, a KD de um anticorpo pode ser determinada usando a ressonância de plasmon de superfície, como por exemplo, usando um sistema de biosensor, por exemplo, um sistema Biacore®, ou usando tecnologia de interferometria de bio-camada, como um sistema Octet RED96.

[0168] Quanto menor o valor de KD de um anticorpo, maior a afini- dade que o anticorpo se liga a um antígeno alvo.

[0169] De acordo com um aspecto específico, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região determinante de complementa- ridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), uma HCDR2, uma HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma LCDR2 e uma LCDR3, com as sequências de polipeptídeos de:

[0170] (1) SEQ ID NOs:89, 90, 91, 149, 150 e 151, respectivamente;

[0171] (2) SEQ ID NOs:41, 42, 43, 101, 102 e 103, respectivamente;

[0172] (3) SEQ ID NOs:44, 45, 46, 104, 105 e 106, respectivamente;

[0173] (4) SEQ ID NOs:47, 48, 49, 107, 108 e 109, respectivamente;

[0174] (5) SEQ ID NOs:50, 51, 52, 110, 111 e 112, respectivamente;

[0175] (6) SEQ ID NOs:53, 54, 55, 113, 114 e 115, respectivamente;

[0176] (7) SEQ ID NOs:56, 57, 58, 116, 117 e 118, respectivamente;

[0177] (8) SEQ ID NOs:59, 60, 61, 119, 120 e 121, respectivamente;

[0178] (9) SEQ ID NOs:62, 63, 64, 122, 123 e 124, respectivamente;

[0179] (10) SEQ ID NOs:65, 66, 67, 125, 126 e 127, respectiva- mente;

[0180] (11) SEQ ID NOs:68, 69, 70, 128, 129 e 130, respectiva- mente;

[0181] (12) SEQ ID NOs:71, 72, 73, 131, 132 e 133, respectiva- mente;

[0182] (13) SEQ ID NOs:74, 75, 76, 134, 135 e 136, respectiva- mente;

[0183] (14) SEQ ID NOs:77, 78, 79, 137, 138 e 139, respectiva- mente;

[0184] (15) SEQ ID NOs:80, 81, 82, 140, 141 e 142, respectiva- mente;

[0185] (16) SEQ ID NOs:83, 84, 85, 143, 144 e 145, respectiva- mente;

[0186] (17) SEQ ID NOs:86, 87, 88, 146, 147 e 148, respectiva- mente;

[0187] (18) SEQ ID NOs:92, 93, 94, 152, 153 e 154, respectiva- mente;

[0188] (19) SEQ ID NOs:95, 96, 97, 155, 156 e 157, respectiva- mente; ou

[0189] (20) SEQ ID NOs:98, 99, 100, 158, 159 e 160, respectiva- mente;

[0190] em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga especificamente à CD73, de preferência a CD73 hu- mana.

[0191] De acordo com um aspecto específico, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região determinante de complementa- ridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), uma HCDR2, uma HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), uma LCDR2 e uma LCDR3, com as sequências de polipeptídeos de:

[0192] (1) SEQ ID NOs:209, 210, 211, 269, 270 e 271, respectiva- mente;

[0193] (2) SEQ ID NOs:161, 162, 163, 221, 222 e 223, respectiva- mente;

[0194] (3) SEQ ID NOs:164, 165, 166, 224, 225 e 226, respectiva- mente;

[0195] (4) SEQ ID NOs:167, 168, 169, 227, 228 e 229, respectiva- mente;

[0196] (5) SEQ ID NOs:170, 171, 172, 230, 231 e 232, respectiva- mente;

[0197] (6) SEQ ID NOs:173, 174, 175, 233, 234 e 235, respectiva- mente;

[0198] (7) SEQ ID NOs:176, 177, 178, 236, 237 e 238, respectiva- mente;

[0199] (8) SEQ ID NOs:179, 180, 181, 239, 240 e 241, respectiva- mente;

[0200] (9) SEQ ID NOs:182, 183, 184, 242, 243 e 244, respectiva- mente;

[0201] (10) SEQ ID NOs:185, 186, 187, 245, 246 e 247, respectiva- mente;

[0202] (11) SEQ ID NOs:188, 189, 190, 248, 249 e 250, respectiva- mente;

[0203] (12) SEQ ID NOs:191, 192, 193, 251, 252 e 253, respectiva- mente;

[0204] (13) SEQ ID NOs:194, 195, 196, 254, 255 e 256, respectiva- mente;

[0205] (14) SEQ ID NOs:197, 198, 199, 257, 258 e 259, respectiva- mente;

[0206] (15) SEQ ID NOs:200, 201, 202, 260, 261 e 262, respectiva- mente;

[0207] (16) SEQ ID NOs:203, 204, 205, 263, 264 e 265, respectiva- mente;

[0208] (17) SEQ ID NOs:206, 207, 208, 266, 267 e 268, respectiva- mente;

[0209] (18) SEQ ID NOs:212, 213, 214, 272, 273 e 274, respectiva- mente;

[0210] (19) SEQ ID NOs:215, 216, 217, 275, 276 e 277, respectiva- mente; ou

[0211] (20) SEQ ID NOs:218, 219, 220, 278, 279 e 280, respectiva- mente;

[0212] em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga especificamente à CD73, de preferência a CD73 hu- mana.

[0213] De acordo com outro aspecto específico, a invenção refere-

se a um anticorpo monoclonal isolado ou o fragmento de ligação a antí- geno do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica às SEQ ID NOs:33, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35, 37 ou 39, ou uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NOs:34, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 36, 38 ou 40. De acordo com uma modalidade prefe- rencial, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo da invenção compreende uma região variável de cadeia pe- sada com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de pre- ferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:33, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35, 37 ou 39, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de prefe- rência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:34, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 36, 38 ou 40, respectivamente.

[0214] De acordo com outro aspecto específico, a invenção refere- se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antí- genos do mesmo da invenção compreendendo:

[0215] (1) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:33 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:34;

[0216] (2) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:1 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:2;

[0217] (3) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:3 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:4;

[0218] (4) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:5 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:6;

[0219] (5) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:7 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:8;

[0220] (6) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:9 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:10;

[0221] (7) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:11 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:12;

[0222] (8) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:13 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:14;

[0223] (9) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:15 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:16;

[0224] (10) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:17 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:18;

[0225] (11) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:19 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:20;

[0226] (12) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:21 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:22;

[0227] (13) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:23 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:24;

[0228] (14) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:25 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:26;

[0229] (15) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:27 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:28;

[0230] (16) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:29 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:30;

[0231] (17) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:31 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:32;

[0232] (18) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:35 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:36;

[0233] (19) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:37 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:38; ou

[0234] (20) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:39 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:40.

[0235] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 41, 42, 43, 101, 102 e 103, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:1, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:2. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:1; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:2.

[0236] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 104, 105 e 106, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:3, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:4. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:3; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:4.

[0237] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 47, 48, 49, 107, 108 e 109, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:5, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:6. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:5; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:6.

[0238] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 50, 51, 52, 110, 111 e 112, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:7, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:8. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:7; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:8.

[0239] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 53, 54, 55, 113, 114 e 115, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:9, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:10. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:9; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:10.

[0240] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 56, 57, 58, 116, 117 e 118, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:11, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:12. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:11; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:12.

[0241] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 59, 60, 61, 119, 120 e 121, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:13, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:14. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:13; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:14.

[0242] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 62, 63, 64, 122, 123 e 124, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:15, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:16. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:15; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:16.

[0243] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 65, 66, 67, 125, 126 e 127, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:17, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:18. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:17; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:18.

[0244] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 68, 69, 70, 128, 129 e 130, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:19, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:20. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:19; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:20.

[0245] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 71, 72, 73, 131, 132 e 133, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:21, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:22. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:21; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:22.

[0246] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 74, 75, 76, 134, 135 e 136, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:23, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:24. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:23; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:24.

[0247] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 77, 78, 79, 137, 138 e 139, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:25, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:26. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:25; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:26.

[0248] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 80, 81, 82, 140, 141 e 142, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:27, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:28. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:27; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:28.

[0249] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 83, 84, 85, 143, 144 e 145, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:29, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:30. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:29; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:30.

[0250] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 86, 87, 88, 146, 147 e 148, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:31, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:32. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:31; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:32.

[0251] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 89, 90, 91, 149, 150 e 151, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:33, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:34. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:33; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:34.

[0252] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 92, 93, 94, 152, 153 e 154, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:35, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:36. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:35; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:36.

[0253] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 95, 96, 97, 155, 156 e 157, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:37, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:38. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:37; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:38.

[0254] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 98, 99, 100, 158, 159 e 160, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mono- clonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:39, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:40. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:39; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:40.

[0255] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 161, 162, 163, 221, 222 e 223, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compre- ende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:1, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:2. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:1; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:2.

[0256] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 164, 165, 166, 224, 225 e 226, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mo-

noclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compre- ende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:3, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:4. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:3; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:4.

[0257] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 167, 168, 169, 227, 228 e 229, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compre- ende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:5, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:6. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:5; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:6.

[0258] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 170, 171, 172, 230, 231 e 232, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compre- ende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:7, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:8. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:7; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:8.

[0259] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 173, 174, 175, 233, 234 e 235, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compre- ende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:9, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:10. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:9; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:10.

[0260] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 176, 177, 178, 236, 237 e 238, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compre- ende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:11, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:12. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:11; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:12.

[0261] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 179, 180, 181, 239, 240 e 241, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compre- ende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:13, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:14. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:13; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:14.

[0262] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 182, 183, 184, 242, 243 e 244, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compre- ende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:15, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:16. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:15; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:16.

[0263] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 185, 186, 187, 245, 246 e 247, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mo-

noclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compre- ende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:17, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:18. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:17; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:18.

[0264] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 188, 189, 190, 248, 249 e 250, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compre- ende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:19, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:20. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:19; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:20.

[0265] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 191, 192, 193, 251, 252 e 253, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compre- ende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:21, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:22. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:21; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:22.

[0266] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 194, 195, 196, 254, 255 e 256, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compre- ende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:23, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:24. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:23; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:24.

[0267] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 197, 198, 199, 257, 258 e 259, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compre- ende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:25, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:26. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:25; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:26.

[0268] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 200, 201, 202, 260, 261 e 262, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compre- ende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:27, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:28. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:27; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:28.

[0269] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 203, 204, 205, 263, 264 e 265, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compre- ende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:29, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:30. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:29; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:30.

[0270] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 206, 207, 208, 266, 267 e 268, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mo-

noclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compre- ende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:31, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:32. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:31; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:32.

[0271] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 209, 210, 211, 269, 270 e 271, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compre- ende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:33, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:34. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:33; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:34.

[0272] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 212, 213, 214, 272, 273 e 274, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compre- ende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:35, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:36. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:35; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:36.

[0273] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 215, 216, 217, 275, 276 e 277, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compre- ende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:37, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:38. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:37; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:38.

[0274] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com- preendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeo das SEQ ID NOs: 218, 219, 220, 278, 279 e 280, respectivamente. Em outra modalidade, o anticorpo mo- noclonal isolado ou fragmento ligação a antígeno do mesmo compre- ende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de po- lipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais preferên- cia 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:39, e uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 85%, de preferência 90%, com mais prefe- rência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:40. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:39; e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:40.

[0275] De acordo com outro aspecto específico, a invenção refere- se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antí- genos do mesmo da invenção, em que o anticorpo ou fragmento de li- gação a antígeno do mesmo inibe a atividade enzimática da CD73 so- lúvel e/ou da superfície celular. A CD73 é uma proteína ancorada com glicofosfatidilinositol (GPI) em uma superfície celular, também pode ser vertida para produzir uma forma cataliticamente ativa em solução (Arias et al., J Cell Biol. 1997; 136(2):421-31). Aqui, a superfície celular CD73 refere-se a CD73 na superfície celular ancorada pelo GPI; a CD73 so-

lúvel refere-se àqueles que são vertidas da superfície celular e cataliti- camente ativa na solução.

[0276] De acordo com outro aspecto específico, a invenção refere- se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antí- genos do mesmo da invenção, em que o anticorpo ou fragmento de li- gação a antígeno do mesmo previne a dimerização da CD73. Conforme usado aqui, "dimerização" refere-se à formação de um dímero de CD73 por duas subunidades. Prevenir a dimerização da CD73 refere-se ao bloqueio ou inibição da formação de um dímero de CD73.

[0277] De acordo com outro aspecto específico, a invenção refere- se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antí- genos do mesmo da invenção, em que o anticorpo ou fragmento de li- gação a antígeno do mesmo induz a internalização de CD73. Conforme usado aqui, "internalização de CD73" refere-se ao movimento de uma proteína CD73 da superfície de uma célula para as áreas internas da célula.

[0278] De acordo com outro aspecto específico, a invenção refere- se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antí- genos do mesmo da invenção, em que o anticorpo ou fragmento de li- gação a antígeno do mesmo é capaz de ativar células T pela inibição da atividade da nucleotidase da CD73 e portanto reduzir o nível de adeno- sina.

[0279] De acordo com outro aspecto específico, a invenção refere- se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antí- genos do mesmo da invenção, em que o anticorpo ou fragmento de li- gação a antígeno do mesmo é quimérico.

[0280] De acordo com outro aspecto específico, a invenção refere- se a um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antí- genos do mesmo da invenção, em que o anticorpo ou fragmento de li- gação a antígeno do mesmo é humano ou humanizado.

[0281] De acordo com outro aspecto específico, a invenção refere- se a um anticorpo monoclonal humanizado isolado ou fragmento de li- gação a antígeno do mesmo, em que o anticorpo humanizado isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende:

[0282] (1) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:286 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:293;

[0283] (2) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:282 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:290;

[0284] (3) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:282 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:291;

[0285] (4) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:282 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:292;

[0286] (5) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:283 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:290;

[0287] (6) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:283 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:291;

[0288] (7) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:283 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:292;

[0289] (8) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:290;

[0290] (9) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:291;

[0291] (10) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:292;

[0292] (11) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:285 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:290;

[0293] (12) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:285 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:291;

[0294] (13) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:285 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:292;

[0295] (14) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:283 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:293;

[0296] (15) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:293;

[0297] (16) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:285 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:293;

[0298] (17) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:286 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:290;

[0299] (18) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:286 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:291;

[0300] (19) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:286 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:292;

[0301] (20) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:287 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:294;

[0302] (21) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:288 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:294;

[0303] (22) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:289 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:294;

[0304] (23) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:299;

[0305] (24) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:295 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:299;

[0306] (25) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:296 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:299;

[0307] (26) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:297 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:299; ou

[0308] (27) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:298 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:299.

[0309] Em outro aspecto geral, a invenção refere-se a um ácido nu- cleico isolado codificando um anticorpo monoclonal ou fragmento de li- gação a antígeno do mesmo da invenção. Será entendido por aqueles versados na técnica que a sequência de codificação de uma proteína pode ser alterada (por exemplo, substituída, excluída, inserida, etc) sem alterar a sequência de aminoácidos da proteína. Assim, será entendido por aqueles versados na técnica que as sequências de ácido nucleico codificando anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação a antí- geno do mesmo da invenção podem ser alteradas sem mudar as se- quências de aminoácidos das proteínas.

[0310] Em outro aspecto geral, a invenção refere-se a um vetor compreendendo um ácido nucleico isolado codificando um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção. Qualquer vetor conhecido por aqueles versados na técnica em vista da presente revelação pode ser usado, como um plasmídeo, um cosmídeo, um vetor de fago ou um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão recombinante como um plasmídeo. O vetor pode incluir qualquer elemento para estabelecer uma função convencional de um vetor de expressão, por exemplo, um promotor, elemento de ligação ao ribossomo, terminador, potencializador, marcador de seleção e ori- gem da replicação. O promotor pode ser um promotor constitutivo, indu- zível ou repressível. Vários vetores de expressão capazes de fornecer ácidos nucleicos a uma célula são conhecidos na técnica e podem ser usados aqui para a produção de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo na célula. Técnicas de clonagem convencionais ou síntese de genes artificiais podem ser usadas para gerar um vetor de expressão recombinante de acordo com as modalidades da inven- ção.

[0311] Em outro aspecto geral, a invenção refere-se a uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico isolado codificando um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção. Qualquer célula hospedeira conhecida por aqueles versados na técnica em vista da presente revelação pode ser usada para a ex- pressão recombinante de anticorpos ou fragmentos de ligação a antí-

geno do mesmo da invenção. Em algumas modalidades, as células hos- pedeiras são as células de E. coli TG1 ou BL21 (para expressão de, por exemplo, um anticorpo scFv ou Fab), células CHO-DG44 ou CHO-K1 ou células HEK293 (para expressão de, por exemplo, um anticorpo IgG de comprimento total). De acordo com modalidades específicas, o vetor de expressão recombinante é transformado em células hospedeiras por métodos convencionais, como transfecção química, choque térmico ou eletroporação, onde é integrado de forma estável no genoma da célula hospedeira, de modo que o ácido nucleico recombinante seja efetiva- mente expressado.

[0312] Em outro aspecto geral, a invenção refere-se a um método para produzir um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antí- geno do mesmo da invenção, compreendendo a cultura de uma célula compreendendo um ácido nucleico que codifica o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em condições para produzir um anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção, e recuperando o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo da célula ou da cultura da célula (por exemplo, do sobrenadante). Os anticorpos expressados ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo podem ser colhidos a partir das células e purificados de acordo com as técnicas convencionais conhecidas na área e descritas aqui.

[0313] Composições farmacêuticas

[0314] Em outro aspecto geral, a invenção refere-se a uma compo- sição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal isolado ou um fragmento de ligação a antígeno da invenção e um veículo far- maceuticamente aceitável. O termo "composição farmacêutica", tal como é usada aqui, significa um produto compreendendo um anticorpo da invenção junto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Os an- ticorpos da invenção e as composições que os compõem também são úteis na fabricação de um medicamento para aplicações terapêuticas mencionadas aqui.

[0315] Conforme usado aqui, o termo "veículo" refere-se a qualquer excipiente, diluente, carga, sal, tampão, estabilizador, solubilizador, óleo, lipídio, vesícula contendo lipídeos, microesfera, encapsulamento lipossômico ou outro material bem conhecido na técnica para uso em formulações farmacêuticas. Será entendido que as características do veículo, excipiente ou diluente dependerão da via de administração de uma aplicação específica. Conforme usado aqui, o termo "veículo far- maceuticamente aceitável" refere-se a um material não tóxico que não interfere na eficácia de uma composição de acordo com a invenção ou a atividade biológica de uma composição de acordo com a invenção. De acordo com as modalidades específicas, tendo em conta a presente re- velação, qualquer veículo farmaceuticamente aceitável adequado para uso numa composição farmacêutica de anticorpos pode ser usado na invenção.

[0316] A formulação de ingredientes farmaceuticamente ativos com veículos farmaceuticamente aceitáveis é conhecida na técnica, por exemplo, Remington: he Science and Practice of Pharmacy (por exem- plo, 21a edição (2005) e qualquer edição posterior). Exemplos não limi- tantes de ingredientes adicionais incluem: tampões, diluentes, solven- tes, agentes reguladores de tonicidade, conservantes, estabilizadores e agentes quelantes. Um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser usados na formulação das composições farmacêuticas da invenção.

[0317] Em uma modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica é uma formulação líquida. Um exemplo preferido de uma formulação líquida é uma formulação aquosa, ou seja, uma formulação composta por água. A formulação líquida pode compreender uma solução, uma suspensão, uma emulsão, uma microemulsão, um gel e outros. Uma formulação aquosa geralmente compreende pelo menos 50% de água p/p, ou pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou pelo menos 95% p/p de água.

[0318] Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode ser formulada como injetável que pode ser injetada, por exemplo, por meio de um dispositivo de injeção (por exemplo, uma seringa ou uma bomba de infusão). A injeção pode ser administrada por via subcutânea, intra- muscular, intraperitoneal, intravítrea ou intravenosa, por exemplo.

[0319] Em outra modalidade, a composição farmacêutica é uma for- mulação sólida, por exemplo, uma composição secada por congela- mento ou secada por atomização, que pode ser usada como está, ou para a qual o médico ou o paciente adiciona solventes e/ou diluentes antes do uso. As formas farmacêuticas sólidas podem incluir comprimi- dos, como comprimidos prensados e/ou comprimidos revestidos e cáp- sulas (por exemplo, cápsulas duras ou de gelatina mole). A composição farmacêutica também pode estar na forma de sachês, dragas, pós, grâ- nulos, pastilhas ou pós para reconstituição, por exemplo.

[0320] As formas farmacêuticas podem ser de liberação imediata, caso em que podem compreender um veículo solúvel ou dispersível em água, ou podem ser de liberação atrasada, liberação sustentada ou li- beração modificada, nesse caso elas podem incluir polímeros insolúveis em água que regulam a taxa de dissolução da forma farmacêutica no trato gastrointestinal ou sob a pele.

[0321] Em outras modalidades, a composição farmacêutica pode ser aplicada intranasalmente, intrabucalmente ou sublingualmente.

[0322] O pH em uma formulação aquosa pode estar entre pH 3 e pH 10. Em uma modalidade da invenção, o pH da formulação é de cerca de 7,0 a cerca de 9,5. Em outra modalidade da invenção, o pH da for- mulação é de cerca de 3,0 a cerca de 7,0.

[0323] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um tampão. Exemplos não limitantes de tampões in- cluem: arginina, ácido aspártico, bicina, citrato, fosfato de hidrogênio dissódico, ácido fumárico, glicina, glicilglicina, histidina, lisina, ácido ma- leico, ácido málico, acetato de sódio, carbonato de sódio, di-hidrogeno- fosfato de sódio, fosfato de sódio, succinato, ácido tartárico, tricina e tris(hidroximetil)-aminometano e suas misturas. O tampão pode estar presente individualmente ou no agregado, nem uma concentração de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml. Composições farmacêuticas compreen- dendo cada um desses tampões específicos constituem modalidades alternativas da invenção.

[0324] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um conservante. Exemplos não limitantes de conser- vantes incluem: cloreto de benzetônio, ácido benzóico, álcool benzílico, bronopol, butil 4-hidroxibenzato, clorobutanol, clorocresol, clorohexi- dina, clorfenesina, o-cresol, m-cresol, p-cresol, etil 4-hidroxibenzoato, imidureia, metil 4-hidroxibenzoato, fenol, 2-fenoxietanol, 2-feniletanol, 4- hidroxibenzoato de propila, desidroacetato de sódio, tiomerosal, e suas misturas. O conservante pode estar presente individualmente ou no agregado, nem uma concentração de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml. Composições farmacêuticas compreendendo cada um desses conser- vantes específicos constituem modalidades alternativas da invenção.

[0325] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um agente isotônico. Exemplos não limitantes de agen- tes isotônicos incluem um sal (como cloreto de sódio), um aminoácido (como glicina, histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, trip- tofano e trionina), um alditol (como glicerol, 1,2-propanediol propilenigli- col), 1,3-propanodiol, e 1,3-butanodiol), polietilenoglicol (por exemplo,

PEG400) e suas misturas. Outro exemplo de um agente isotônico inclui um açúcar. Exemplos não limitantes de açúcares podem ser mono, di ou polissacarídeos, ou glucanos solúveis em água, incluindo, por exem- plo, frutose, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose, lactose, saca- rose, trealose, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, alfa e beta- HPCD, amido solúvel, amido hidroxietila e carboximetilcelulose de só- dio. Outro exemplo de um agente isotônico é um álcool de açúcar, no qual o termo "álcool de açúcar" é definido como um hidrocarboneto C(4- 8) com pelo menos um grupo -OH. Exemplos não limitantes de alcoóis de açúcar incluem manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol e arabitol. O agente isotônico pode estar presente individualmente ou no agregado, nem uma concentração de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml. Composições farmacêuticas compreendendo cada um desses agentes isotônicos específicos constituem modalidades alternativas da inven- ção.

[0326] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um agente quelante. Exemplos não limitantes de agen- tes quelantes incluem ácido cítrico, ácido aspártico, sais de ácido etile- nodiaminetetraacético (EDTA) e suas misturas. O agente quelante pode estar presente individualmente ou no agregado, nem uma concentração de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml. Composições farmacêuticas compreen- dendo cada um desses agentes quelantes específicos constituem mo- dalidades alternativas da invenção.

[0327] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um estabilizante. Exemplos não limitantes de estabili- zantes incluem um ou mais inibidores de agregação, um ou mais inibi- dores de oxidação, um ou mais tensoativos e/ou um ou mais inibidores de protease.

[0328] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um estabilizante, em que o referido estabilizante é car- boxi/hidroxiculose e seus derivados (como HPC, HPC-SL, HPC-L e HPMC), ciclodextrinas, 2-metiltioetanol, polietilenoglicol (como PEG 3350), álcool polivinílico (PVA), polivinil pirrolidona, sais (como cloreto de sódio), substâncias contendo enxofre, como monotioglicerol, ou ácido tioglicólico. O estabilizante pode estar presente individualmente ou no agregado, nem uma concentração de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml. Composições farmacêuticas compreendendo cada um desses estabili- zantes específicos constituem modalidades alternativas da invenção.

[0329] Em modalidades adicionais da invenção, a composição far- macêutica compreende um ou mais tensoativos, preferencialmente um tensoativo, pelo menos um tensoativo, ou dois tensoativos diferentes. O termo "tensoativo" refere-se a quaisquer moléculas ou íons que sejam compostos de uma parte solúvel em água (hidrofílica) e uma parte solú- vel em gordura (lipofílica). O tensoativo pode, por exemplo, ser selecio- nado no grupo que consiste em tensoativos aniônicos, tensoativos ca- tiônicos, tensoativos não iônicos e/ou tensoativos zwiteriônicos. O ten- soativo pode estar presente individualmente ou no agregado em uma concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml. Composições farmacêuticas compreendendo cada um desses tensoativos específicos constituem modalidades alternativas da invenção.

[0330] Em uma modalidade adicional da invenção, a composição farmacêutica compreende um ou mais inibidores de protease, como, por exemplo, EDTA e/ou ácido clorídrico de benzamidina (HCl). O inibidor de protease pode estar presente individualmente ou no agregado em uma concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml. Compo- sições farmacêuticas compostas por cada um desses inibidores especí- ficos de protease constituem modalidades alternativas da invenção.

[0331] Em outro aspecto geral, a invenção refere-se a um método para produção de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção, compreendendo a combinação um anticorpo monoclonal ou do fragmento de ligação a antígeno do mesmo com um veículo far- maceuticamente aceitável para obter a composição farmacêutica.

[0332] Métodos de uso

[0333] Em outro aspecto geral, a invenção refere-se a um método para inibir a atividade da nucleotidase de CD73 em um indivíduo que precisa do mesmo, o método compreendendo administrar ao indivíduo um anticorpo monoclonal isolado ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD73 ou uma composição far- macêutica da invenção.

[0334] Em outro aspecto geral, a invenção refere-se a um método para prevenir a dimerização de CD73 em um indivíduo que precisa do mesmo, o método compreendendo administrar ao indivíduo um anti- corpo monoclonal isolado ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD73 ou uma composição farma- cêutica da invenção.

[0335] Em outro aspecto geral, a invenção refere-se a um método para induzir a internalização da CD73 em um indivíduo que precisa do mesmo, o método compreendendo administrar ao indivíduo um anti- corpo monoclonal isolado ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD73 ou uma composição farma- cêutica da invenção. A internalização da CD73 na célula resulta em uma redução do teor da superfície celular da CD73. Os níveis de CD73 na superfície celular podem ser medidos por métodos conhecidos na téc- nica, por exemplo, métodos imunoistoquímicos.

[0336] A atividade funcional de anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno do mesmo que ligam a CD73 pode ser caracterizada por métodos conhecidos na técnica e como descrito aqui. A célula expres- sando CD73 pode ser pré-incubada com o anticorpo seguido da medi- ção da atividade da nucleotidase CD73 na superfície celular na pre- sença do anticorpo. Os métodos de caracterização de anticorpos e fra- gmentos de ligação a antígenos que ligam a CD73 incluem, mas não se limitam a, ensaios de afinidade e especificidade, incluindo a análise Bi- acore, ELISA e OctetRed; a atividade funcional de um mAb anti-CD73 também pode ser avaliada num ensaio de atividade da nucleotidase. De acordo com as modalidades específicas, os métodos para caracterizar anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno do mesmo que ligam CD73 incluem os descritos abaixo.

[0337] Em outro aspecto geral, a invenção refere-se a um método para tratar um câncer em um indivíduo que precisa do mesmo, compre- endendo administrar ao indivíduo um anticorpo monoclonal isolado ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especifica- mente à CD73 ou uma composição farmacêutica da invenção. O câncer pode, por exemplo, ser selecionado a partir de, mas não limitado a, cân- cer de pulmão, câncer gástrico, câncer do esôfago, câncer do ducto bi- liar, colangiocarcinoma, câncer do cólon, carcinoma hepatocelular, car- cinoma de células renais, carcinoma urotelial da bexiga, melanoma me- tastático, câncer de mama, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, câncer pancreático, glioma, glioblastoma e outros tumores sólidos, e linfoma não-Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mieloide crô- nica (CML), mieloma múltiplo (MM), leucemia mieloide aguda (AML) e outros tumores líquidos.

[0338] Em outro aspecto geral, a invenção refere-se a um método para tratar uma doença inflamatória a um indivíduo que precisa do mesmo, compreende administrar ao indivíduo um anticorpo monoclonal isolado ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à CD73 ou uma composição farmacêutica da invenção.

[0339] De acordo com as modalidades da invenção, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapêutica eficaz de um an- ticorpo anti-CD73 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Como usado aqui, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um ingrediente ou componente ativo que suscita a resposta biológica ou medicinal desejada em um indivíduo. A quanti- dade terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente e de maneira rotineira, em relação ao objetivo declarado.

[0340] Conforme usado aqui com referência a anticorpos anti-CD73 ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, uma quantidade tera- peuticamente eficaz significa uma quantidade do anticorpo anti-CD73 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que modula uma res- posta de redução tumoral em um indivíduo que necessita do mesmo. Além disso, conforme usado aqui com referência a anticorpos anti-CD73 ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, uma quantidade te- rapeuticamente eficaz significa uma quantidade do anticorpo anti-CD73 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que resulta no tratamento de uma doença, um distúrbio ou uma condição; previne ou retarda a progressão da doença, do distúrbio ou da condição; ou reduz ou alivia completamente os sintomas associados à doença, ao distúrbio ou à con- dição.

[0341] De acordo com modalidades específicas, a doença, o trans- torno ou a condição a ser tratado é o câncer, de preferência um câncer selecionado do grupo consistindo em câncer de pulmão, câncer gás- trico, câncer do cólon, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células renais, carcinoma urotelial da bexiga, melanoma metastático, câncer de mama, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de cabeça e pescoço, câncer pancreático, glioma, glioblastoma e outros tumores sólidos, e lin-

foma não-Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia lin- focítica crônica (CLL), leucemia mieloide crônica (CML), mieloma múlti- plo (MM), leucemia mieloide aguda (AML) e outros tumores líquidos. De acordo com outras modalidades específicas, a doença, o distúrbio ou a condição a ser tratado é uma doença inflamatória.

[0342] De acordo com as modalidades específicas, uma quantidade terapeuticamente eficaz se refere à quantidade de terapia que é sufici- ente para atingir um, dois, três, quatro ou mais dos seguintes efeitos: (i) reduzir ou melhorar a gravidade da doença, do distúrbio ou da condição a ser tratada ou um sintoma associado a ela; (ii) reduzir a duração da doença, do distúrbio ou da condição a ser tratada ou um sintoma asso- ciado a ela; (iii) prevenir a progressão da doença, do distúrbio ou da condição a ser tratada, ou um sintoma associado a ela; (iv) provocar a regressão da doença, do distúrbio ou da condição a tratar, ou um sin- toma associado a ela; (v) prevenir o desenvolvimento ou o aparecimento da doença, do distúrbio ou da condição a ser tratada, ou de um sintoma associado a ela; (vi) prevenir a recorrência da doença, do distúrbio ou da condição a ser tratada, ou de um sintoma associado a ela; (vii) redu- zir a hospitalização de um indivíduo que tenha a doença, o distúrbio ou a condição a ser tratada, ou um sintoma associado a ela; (viii) reduzir o tempo de internação de um indivíduo que tenha a doença, o distúrbio ou a condição a ser tratada, ou um sintoma associado a ela; (ix) aumen- tar a sobrevivência de um indivíduo com a doença, o distúrbio ou a con- dição a ser tratada, ou um sintoma associado a ela; (xi) inibir ou reduzir a doença, o distúrbio ou a condição a ser tratada, ou um sintoma asso- ciado a ela; e/ou (xii) melhorar ou acentuar o(s) efeito(s) profilático(s) ou terapêutic(s) de outra terapia.

[0343] A quantidade ou dosagem terapeuticamente eficaz pode va- riar de acordo com vários fatores, como a doença, o distúrbio ou a con- dição a ser tratada, os meios de administração, o local-alvo, o estado fisiológico do indivíduo (incluindo, por exemplo, idade, peso corporal, saúde), se o indivíduo é humano ou animal, outros medicamentos ad- ministrados e se o tratamento é profilático ou terapêutico. As dosagens de tratamento são tituladas de forma ideal para otimizar a segurança e a eficácia.

[0344] De acordo com modalidades específicas, as composições descritas aqui são formuladas para serem adequadas à via de adminis- tração pretendida para um indivíduo. Por exemplo, as composições des- critas aqui podem ser formuladas para serem adequadas para adminis- tração intravenosa, subcutânea ou intramuscular.

[0345] Conforme usado aqui, os termos "tratar", "tratando" e "trata- mento" destinam-se a se referir a uma melhoria ou reversão de pelo menos um parâmetro físico mensurável relacionado a um câncer e/ou uma doença inflamatória, um distúrbio ou uma condição, que não é ne- cessariamente perceptível no indivíduo, mas pode ser perceptível no in- divíduo. Os termos "tratar", "tratando e "tratamento" também podem se referir a causar regressão, prevenir a progressão ou, pelo menos, retar- dar a progressão da doença, do distúrbio ou da condição. Em uma mo- dalidade particular, "tratar", "tratando” e "tratamento” referem-se a um alívio, prevenção do desenvolvimento ou início, ou redução na duração de um ou mais sintomas associados à doença, ao distúrbio ou à condi- ção, como um tumor ou mais preferencialmente um câncer. Em uma incorporação específica, "tratar", "tratando” e "tratamento” referem-se à prevenção da recorrência da doença, do distúrbio ou da condição. Em uma modalidade específica, "tratar", "tratando" e "tratamento" referem- se a um aumento na sobrevivência de um indivíduo que tem a doença, o distúrbio ou a condição. Em uma modalidade específica, "tratar", "tra- tando” e "tratamento” referem-se à eliminação da doença, do distúrbio ou da condição no indivíduo.

[0346] De acordo com as modalidades específicas, a composição da invenção é usada no tratamento de um câncer e/ou uma doença in- flamatória, um distúrbio ou uma condição. Para terapia de câncer, pode ser usada em combinação com outro tratamento, incluindo, mas não li- mitada a, uma quimioterapia, um mAb anti-CD20, um mAb anti-TIM-3, um mAb anti-LAG-3, um mAb anti-CD47, um mAb anti-apelina, um mAb anti-claudina18.2, um mAb anti-FRα (receptor de folato alfa), um mAb anti-TIP-1, um anticorpo anti-CTLA-4, um anticorpo anti-PD-L1, um an- ticorpo anti-PD-1, uma terapia PD-1/PD-L1, outros fármacos imuno-on- cológicos, um agente antiangiogênico, uma terapia de radiação, um con- jugado de anticorpo-fármaco (ADC), uma terapia direcionada ou outros fármacos anticâncer. Anticorpos anti-CD73 podem ser usados para construir anticorpos biespecíficos com mAbs parceiros contra PD-1, PD- L1, LAG3, TIM-3, CTLA-4, EGFR, HER-2, CD19, CD20, CD33, CD47, CD3, CD3, apelina, claudina18.2, DLL3, TIP-1, receptor de folato alfa (FRα) e/ou outros antígenos de superfície tumoral para tratar cânce- res/tumores que expressam tanto a CD73 quanto o antígeno tumoral específico associado.

[0347] Conforme usado aqui, o termo "em combinação", no con- texto da administração de duas ou mais terapias a um indivíduo, refere- se ao uso de mais de uma terapia. O uso do termo "em combinação" não restringe a ordem em que as terapias são administradas a um indi- víduo. Por exemplo, uma primeira terapia (por exemplo, uma composi- ção descrita aqui) pode ser administrada antes de (por exemplo, 5 mi- nutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas antes), concomitantemente com, ou subse- quente a (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas após) a administra- ção de uma segunda terapia a um indivíduo.

[0348] Em outro aspecto geral, a invenção refere-se a um método de determinação de um nível de CD73 em um indivíduo. Os métodos compreendem (a) obter uma amostra do indivíduo; (b) colocar a amostra em contato com um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção; e (c) determinar um nível de CD73 no indivíduo.

[0349] Em outro aspecto geral, a invenção refere-se a um método para determinar a atividade da ecto-5'-nucleotidase da CD73 em um in- divíduo, em que a atividade enzimática pode ser totalmente inibida pelo anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção. Os métodos compreendem (a) obter uma amostra do indiví- duo; (b) colocar a amostra em contato com um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção; e (c) determinar a ativi- dade da ecto-5'-nucleotidase da CD73 no indivíduo.

[0350] Conforme usado aqui, "amostra" refere-se a uma amostra bi- ológica isolada de um indivíduo e pode incluir, mas não se limita a, san- gue total, soro, plasma, células sanguíneas, células endoteliais, bióp- sias de tecido (por exemplo, um tecido de câncer), fluido linfático, líquido ascite, fluido intersticial, medula óssea, fluido cérebro-espinhal, saliva, muco, escarro, suor, urina, ou qualquer outra secreção, excreção ou ou- tros fluidos corporais. Uma "amostra de sangue" refere-se ao sangue total ou a qualquer fração dele, incluindo células sanguíneas, soro e plasma.

[0351] Em certas modalidades, o nível de CD73 no indivíduo pode ser determinado usando ensaios selecionados de, mas não limitados a, um ensaio Western blot, um ensaio ELISA e/ou imuno-histoquímica (IHC). Os níveis relativos de proteína podem ser determinados usando a análise Western blot e IHC, e os níveis absolutos de proteína podem ser determinados usando um ensaio ELISA. Ao determinar os níveis re- lativos de CD73, os níveis de CD73 podem ser determinados entre pelo menos duas amostras, por exemplo, entre amostras do mesmo indiví- duo em diferentes pontos de tempo, entre amostras de diferentes teci- dos no mesmo indivíduo e/ou entre amostras de diferentes indivíduos. Alternativamente, ao determinar os níveis absolutos de CD73, como por um ensaio ELISA, o nível absoluto de CD73 na amostra pode ser deter- minado criando um padrão para o ensaio ELISA antes de testar a amos- tra. Um versado na técnica entenderá quais técnicas analíticas usar para determinar o nível de CD73 em uma amostra do indivíduo usando os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo da in- venção.

[0352] Em certas modalidades, a atividade da ecto-5'-nucleotidase da CD73 no indivíduo pode ser determinada usando ensaios conheci- dos na técnica, por exemplo, ver Geoghegan et al., MAbs 8:454-67 (2016) e Hay et al., Oncoimunologia Aug. 5(8):e1208875 (2016). Um versado na técnica entenderá quais técnicas analíticas utilizar para de- terminar a atividade da ecto-5'-nucleotidase da CD73 em uma amostra do indivíduo.

[0353] O uso de métodos para determinar um nível de CD73 ou um nível da atividade da ecto-5'-nucleotidase da CD73 em uma amostra de um indivíduo pode levar ao diagnóstico de níveis e/ou atividades anor- mais (elevados, reduzidos ou insuficientes) de CD73 em uma doença e tomar decisões terapêuticas apropriadas. Essa doença pode ser seleci- onada, mas não se limita a, um câncer e/ou uma doença inflamatória. Além disso, através do monitoramento dos níveis e/ou atividade de CD73 em um indivíduo, o risco de desenvolver uma doença conforme indicado acima pode ser determinado com base no conhecimento do nível e/ou atividade de CD73 em uma doença específica e/ou durante a progressão da doença específica.

[0354] MODALIDADES

[0355] A invenção também fornece as seguintes modalidades não limitantes.

[0356] Modalidade 1 é um anticorpo monoclonal isolado ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região de- terminante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2 e LCDR3, com as sequências de poli- peptídeos de:

[0357] a. SEQ ID NOs:89, 90, 91, 149, 150 e 151, respectivamente;

[0358] b. SEQ ID NOs:41, 42, 43, 101, 102 e 103, respectivamente;

[0359] c. SEQ ID NOs:44, 45, 46, 104, 105 e 106, respectivamente;

[0360] d. SEQ ID NOs:47, 48, 49, 107, 108 e 109, respectivamente;

[0361] e. SEQ ID NOs:50, 51, 52, 110, 111 e 112, respectivamente;

[0362] f. SEQ ID NOs:53, 54, 55, 113, 114 e 115, respectivamente;

[0363] g. SEQ ID NOs:56, 57, 58, 116, 117 e 118, respectivamente;

[0364] h. SEQ ID NOs:59, 60, 61, 119, 120 e 121, respectivamente;

[0365] i. SEQ ID NOs:62, 63, 64, 122, 123 e 124, respectivamente;

[0366] j. SEQ ID NOs:65, 66, 67, 125, 126 e 127, respectivamente;

[0367] k. SEQ ID NOs:68, 69, 70, 128, 129 e 130, respectivamente;

[0368] l. SEQ ID NOs:71, 72, 73, 131, 132 e 133, respectivamente;

[0369] m. SEQ ID NOs:74, 75, 76, 134, 135 e 136, respectivamente;

[0370] m. SEQ ID NOs:77, 78, 79, 137, 138 e 139, respectivamente;

[0371] o. SEQ ID NOs:80, 81, 82, 140, 141 e 142, respectivamente;

[0372] p. SEQ ID NOs:83, 84, 85, 143, 144 e 145, respectivamente;

[0373] q. SEQ ID NOs:86, 87, 88, 146, 147 e 148, respectivamente;

[0374] r. SEQ ID NOs:92, 93, 94, 152, 153 e 154, respectivamente;

[0375] s. SEQ ID NOs:95, 96, 97, 155, 156 e 157, respectivamente; ou

[0376] t. SEQ ID NOs:98, 99, 100, 158, 159 e 160, respectivamente;

[0377] em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga especificamente à CD73, de preferência a CD73 hu- mana.

[0378] Modalidade 2 é um anticorpo monoclonal isolado ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região de- terminante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2 e LCDR3, com as sequências de poli- peptídeos de:

[0379] a. SEQ ID NOs:209, 210, 211, 269, 270 e 271, respectiva- mente;

[0380] b. SEQ ID NOs:161, 162, 163, 221, 222 e 223, respectiva- mente;

[0381] c. SEQ ID NOs:164, 165, 166, 224, 225 e 226, respectiva- mente;

[0382] d. SEQ ID NOs:167, 168, 169, 227, 228 e 229, respectiva- mente;

[0383] e. SEQ ID NOs:170, 171, 172, 230, 231 e 232, respectiva- mente;

[0384] f. SEQ ID NOs:173, 174, 175, 233, 234 e 235, respectiva- mente;

[0385] g. SEQ ID NOs:176, 177, 178, 236, 237 e 238, respectiva- mente;

[0386] h. SEQ ID NOs:179, 180, 181, 239, 240 e 241, respectiva- mente;

[0387] i. SEQ ID NOs:182, 183, 184, 242, 243 e 244, respectiva- mente;

[0388] j. SEQ ID NOs:185, 186, 187, 245, 246 e 247, respectiva- mente;

[0389] k. SEQ ID NOs:188, 189, 190, 248, 249 e 250, respectiva- mente;

[0390] l. SEQ ID NOs:191, 192, 193, 251, 252 e 253, respectiva- mente;

[0391] m. SEQ ID NOs:194, 195, 196, 254, 255 e 256, respectiva- mente;

[0392] n. SEQ ID NOs:197, 198, 199, 257, 258 e 259, respectiva- mente;

[0393] o. SEQ ID NOs:200, 201, 202, 260, 261 e 262, respectiva- mente;

[0394] p. SEQ ID NOs:203, 204, 205, 263, 264 e 265, respectiva- mente;

[0395] q. SEQ ID NOs:206, 207, 208, 266, 267 e 268, respectiva- mente;

[0396] r. SEQ ID NOs:212, 213, 214, 272, 273 e 274, respectiva- mente;

[0397] s. SEQ ID NOs:215, 216, 217, 275, 276 e 277, respectiva- mente; ou

[0398] t. SEQ ID NOs:218, 219, 220, 278, 279 e 280, respectiva- mente;

[0399] em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga especificamente à CD73, de preferência a CD73 hu- mana.

[0400] Modalidade 3 é o anticorpo monoclonal isolado ou o frag- mento de ligação a antígeno da modalidade 1 ou 2, compreendendo uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipep- tídeo de pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:33, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35, 37 ou 39, ou uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo de pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:34, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26,

28, 30, 32, 36, 38 ou 40.

[0401] Modalidade 4 é o anticorpo monoclonal isolado ou o frag- mento de ligação a antígeno de qualquer uma das modalidades 1 ou 3, compreendendo:

[0402] (a) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:33 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:34;

[0403] (b) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:1 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:2;

[0404] (c) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:3 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:4;

[0405] (d) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:5 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:6;

[0406] (e) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:7 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:8;

[0407] (f) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:5 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:10;

[0408] (g) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:11 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:12;

[0409] (h) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:13 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:14;

[0410] (i) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:15 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:16;

[0411] (j) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:17 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:18;

[0412] (k) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:19 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:20;

[0413] (l) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:21 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:22;

[0414] (m) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:23 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:24;

[0415] (n) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:25 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:26;

[0416] (o) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:27 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:28;

[0417] (p) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:29 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:30;

[0418] (q) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:31 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:32;

[0419] (r) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:35 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:36;

[0420] (s) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:37 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:38; ou

[0421] (t) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:39 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:40.

[0422] Modalidade 5 é o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo inibe a atividade enzimática da CD73 solúvel e/ou de superfície celular.

[0423] Modalidade 6 é o anticorpo monoclonal isolado ou o frag- mento de ligação a antígeno do mesmo de qualquer uma das modalida- des 1 a 4, em que o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo previne a dimerização da CD73.

[0424] Modalidade 7 é o anticorpo monoclonal isolado ou o frag- mento de ligação a antígeno do mesmo de qualquer uma das modalida- des 1 a 4, em que o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo induz a internalização da CD73.

[0425] A modalidade 8 é o anticorpo monoclonal isolado ou o frag- mento de ligação a antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno é quimérico.

[0426] A modalidade 9 é o anticorpo monoclonal isolado ou o frag- mento de ligação a antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 8, em que o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo é humano ou humanizado.

[0427] Modalidade 10 é o anticorpo monoclonal isolado ou o frag- mento de ligação a antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 9, em que o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende:

[0428] (1) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:286 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:293;

[0429] (2) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:282 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:290;

[0430] (3) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:282 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:291;

[0431] (4) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:282 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:292;

[0432] (5) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:283 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:290;

[0433] (6) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:283 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:291;

[0434] (7) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:283 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:292;

[0435] (8) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:290;

[0436] (9) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:291;

[0437] (10) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:292;

[0438] (11) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:285 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:290;

[0439] (12) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:285 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:291;

[0440] (13) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:285 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:292;

[0441] (14) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:283 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:293;

[0442] (15) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:293;

[0443] (16) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:285 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:293;

[0444] (17) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:286 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:290;

[0445] (18) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:286 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:291;

[0446] (19) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:286 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:292;

[0447] (20) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:287 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:294;

[0448] (21) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:288 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:294;

[0449] (22) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:289 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:294;

[0450] (23) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:299;

[0451] (24) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:295 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:299;

[0452] (25) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:296 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:299;

[0453] (26) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:297 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:299; ou

[0454] (27) uma região variável de cadeia pesada tendo a sequên- cia de polipeptídeo da SEQ ID NO:298 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:299.

[0455] A modalidade 11 é o anticorpo monoclonal isolado ou o fra- gmento de ligação a antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 10, em que o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo é capaz de ativar as células T.

[0456] Modalidade 12 é um ácido nucleico isolado codificando o an- ticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 11.

[0457] Modalidade 13 é um vetor compreendendo o ácido nucleico isolado da modalidade 12.

[0458] Modalidade 14 é uma célula hospedeira compreendendo o vetor da modalidade 13.

[0459] Modalidade 15 é uma composição farmacêutica compreen- dendo o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antí- geno de qualquer uma das modalidades 1 a 11 e um veículo farmaceu- ticamente aceitável.

[0460] Modalidade 16 é um método para inibir a atividade de nucle- otidase da CD73 em um indivíduo que precisa do mesmo, compreen- dendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica da modalidade 15.

[0461] Modalidade 17 é um método para prevenir a dimerização da CD73 em um indivíduo que precisa do mesmo, compreendendo a admi- nistração ao indivíduo de uma composição farmacêutica da modalidade

15.

[0462] Modalidade 18 é um método para induzir a internalização da CD73 em um indivíduo que precisa do mesmo, compreendendo a admi- nistração ao indivíduo de uma composição farmacêutica da modalidade

15.

[0463] Modalidade 19 é um método para tratar o câncer em um in- divíduo que precisa do mesmo, compreendendo a administração ao in- divíduo da composição farmacêutica da modalidade 15.

[0464] Modalidade 20 é um método para produzir o anticorpo mo- noclonal ou fragmento de ligação a antígeno de qualquer uma das mo- dalidades 1 a 11, compreendendo a cultura de uma célula compreen- dendo um ácido nucleico que codifica o anticorpo monoclonal ou o fra- gmento de ligação a antígeno, em condições para produzir o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação a antígeno, e recuperando o an- ticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno da célula ou da cultura.

[0465] Modalidade 21 é um método para produção de uma compo- sição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal ou um fra- gmento de ligação a antígeno das modalidades 1 a 11, compreendendo a combinação do anticorpo monoclonal ou do fragmento de ligação a antígeno com um veículo farmaceuticamente aceitável para obter a composição farmacêutica.

[0466] Modalidade 22 é um método para determinar um nível de CD73 em um indivíduo, o método compreendendo:

[0467] a. obter uma amostra do indivíduo;

[0468] b. colocar a amostra em contato com o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de qualquer uma das modalidades 1 a 11; e

[0469] c. determinar um nível de CD73 no indivíduo.

[0470] Modalidade 23 é o método da modalidade 22, em que a amostra é uma amostra de tecido.

[0471] Modalidade 24 é o método da modalidade 23, em que a amostra de tecido é uma amostra de tecido de câncer.

[0472] Modalidade 25 é o método da modalidade 22, em que a amostra é uma amostra de sangue.

[0473] Modalidade 26 é um método para determinar a atividade de ecto-5'-nucleotidase da CD73 em um indivíduo, o método compreen- dendo:

[0474] a. obter uma amostra do indivíduo;

[0475] b. colocar a amostra em contato com um anticorpo monoclo- nal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de qualquer uma das modalidades 1 a 11; e

[0476] c. determinar a atividade de ecto-5'-nucleotidase da CD73 no indivíduo.

[0477] Modalidade 27 é o método da modalidade 26, em que a amostra é uma amostra de tecido.

[0478] Modalidade 28 é o método da modalidade 27, em que a amostra de tecido é uma amostra de tecido de câncer.

[0479] Modalidade 29 é o método da modalidade 26, em que a amostra é uma amostra de sangue.

[0480] EXEMPLOS

[0481] Exemplo 1: Identificação de anticorpos monoclonais anti-CD73

[0482] Camundongos foram imunizados com uma mistura de prote- ínas de fusão CD73 humana (huCD73-HIS; contendo 27-547 resíduos) e CD73 de camundongo (mCD73-HIS; contendo 29-549 resíduos), am- bos com o marcador HIS no C-terminal. A titulação do plasma foi deter- minada por ELISA. Após a eutanásia, foram coletados baços e linfono- dos para produzir hibridomas. Os hibridomas foram cultivados em pla- cas de cultura de tecidos de 384 poços e os sobrenadantes de poços individuais foram triados por ELISA usando HUCD73-HIS e seleção de células ativadas por fluorescência (FACS) usando células MDA-MB-

231. Os clones positivos foram analisados mais detalhadamente por um ensaio de atividade de nucleotidase com CD73 imobilizada na placa. Os clones positivos superiores que apresentaram inibição da atividade da nucleotidase foram isolados e sequenciados.

[0483] As sequências de regiões variáveis de cadeia pesada e leve para anticorpos monoclonais anti-CD73 são fornecidas nas Tabelas 1 e 2, e as regiões CDR para anticorpos monoclonais anti-CD73 são forne- cidas nas Tabelas 3-6. Tabela 1: Sequências de regiões variáveis de cadeia pesada para mAbs anti-CD73 clones de

VH ID mAb QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTFGMGVTWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDMYYN- 37C7A 1

PALKSRLTISKDTSKNQVFLKIANVDTADTATYYCARSPITTVVADYWGQGSTLTVSS QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEIL- 38C16A 3

PGSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGDYFGSSYRGPYWGQGTLVTVSA QVQLQQPGAELVMPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIDPSGGYTNYN- 39G8A 5

QKFKGKSTLTVDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYYCARNYYYGSSGTMDYWGQGTSVTVSS QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSNYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGNVIT- 43E8A 7

NYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARRGDDGYLYAMDYWGQGTSVTVSS EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMHWVKQKPGQGLEWI- 46J3A GEIYPGSGNTYYNEKFKGKATLTADRSSSTVYMLLSSLTSEDSAVYFCARYWDYYGSTYGYFDVWGAGTT 9

VTVSS EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKSLEWIGYINPNNGGTSYN- 46O19A 11

QKFKGKATLTVNKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARDYFWYFDVWGTGTTVTVSS

QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAA- 47H24A 13

FISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCASQYVAYWGQGTLVTVST QVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGG- 49O5A 15

TNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSKSNYGYYAMDYWGQGTSVTVSS QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKSSGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSN- 50B10A 17

GRTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSEGRVYYDYFYAMDYWGQGTSVTVSS QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSGG- 50H17A 19

TNYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDYYWYFDVWGTGTTVTVSS ELARPWASVKISCQAFYTFSRRMHFAIRDTNYWMQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYN- 50E16A 21

QKFKVKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCATYYSNYGGAMDYWGQGTSVTVSS QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEP- 50F1A 23

TYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARDIFWAMDYWGQGTSVTVSS QAYLQQSGAELVRPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSYN- 54I14A 25

QKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARYDYDAMDYWGQGTSVTVSS EIQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYSFTGYNMNWVKQSHGKSLEWIGNINPYYGSTSYN- 52K11A 27

QKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSKDSAVYYCAGSSYVDYAMDYWGQGTSVTVSS EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYIIPYNDGT- 53H21A 29

KYNEKFEGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARWGNWDYFDYWGQGTTLTVSS QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKAPGYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNI- 53I12A 31

YAGSSSSNYNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYYCARSGHGYDGFAYWGQGTLVTVSA QVQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGKGLEWIGQIYPGD- 60A9A 33

GDTYYSGKFKGKATLTAAKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREAIYYGNYVFTYWGQGTLVTVSA QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWIKQRPGQGLEWIGLINPGSGG- 39J9A 35

TNYIEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARRGDYYGNPFDYWGQGTTLTVSS QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWMQWVRQRPGQGLEWIGEIDPSDNYTHYN- 49H8A 37

QKFKGEATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGYYGYSPSWFAYWGQGTLVTVSA EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSHVKSLEWIGRINPYSGATNSN- 51B10A 39

QNFKDKASLTVDKSSSTAYMELHSLTSEDSAVYYCARSYYGAMDYWGQGTSVTVSS VH: região variável de cadeia pesada Tabela 2: Sequências de regiões variáveis de cadeia leve para mAbs anti-CD73 mAb VL ID DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQNLVHSYGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSN- 37C7A 2

RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPWTFGGGTKLEIQ DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGRTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKL- 38C16A 4

DSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPHTFGGGTKLEIK DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRES- 39G8A 6

GVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPYTFGGGTKLEIK DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGV- 43E8A 8

PARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPFTFGSGTKLEIK DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKNISKYLAWYQEIPGKTYNLLIYSGSTLQSGIPS- 46J3A 10

RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPFTFGSGTKLEIK DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQEKPGQPPKVLIYWASTRES- 46O19A 12

GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLELK DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSRLTWLQQEPDGTIKRLIYATSSLDSGV- 47H24A 14

PKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYFCLQYASSPFTFGSGTKLEIK DIQMTQSSSYLSVSLGGRVTITCEASDHIDNWLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPS- 49O5A 16

RFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDVATYYCQQYWSSPFTFGSGTKLEIK DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPS- 50B10A 18

RFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKVLIYWASTRES- 50H17A 20

GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLELK

DIVMTQFHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVP- 50E16A 22

DRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPYTFGGGTKLEIK DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRES- 50F1A 24

GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLELK DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYFAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPS- 54I14A 26

RFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPFTFGSGTKLEIK DIVMTQAAISNPVTLGTSASISCSSNKSLLHSNDITYLYWYLQRPGQSPQLLIYRMSNLAS- 52K11A 28

GVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQMLERPWTFGGGTKLEIK QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPAR- 53H21A 30

FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPWTFGGGTKLEIK DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPS- 53I12A 32

RFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPRTFGGGTKLEIK DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFAS- 60A9A 34

TRDSGVPDRFIGGGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPLTFGAGTKLELK DIQMTQSPASLAASVGETVTITCRASENIYYSLAWYQQKQGKSPQLLIYNADTLEDGVPS- 39J9A 36

RFSGSGSGTQYSMKINSMQPEDTATYFCKQAYDVPLTFGAGTKLELK QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPAR- 49H8A 38

FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGSGTKLEIK DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPS- 51B10A 40

RFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK VL: região variável de cadeia leve Tabela 3: Regiões de CDR 1-3 de cadeia pesada para mAbs anti- CD73 mAb HC CDR1 ID HC CDR2 ID HC CDR3 ID 37C7A GFSLSTFGMG 41 IWWDDDM 42 ARSPITTVVADY 43 38C16A GYTFSSYW 44 ILPGSGST 45 ARGDYFGSSYRGPY 46 39G8A GYTFTSYW 47 IDPSGGYT 48 ARNYYYGSSGTMDY 49 43E8A GYTFSNYW 50 ILPGNVIT 51 ARRGDDGYLYAMDY 52 46J3A GYTFTDYY 53 IYPGSGNT 54 ARYWDYYGSTYGYFDV 55 46O19A GYTFTDYN 56 INPNNGGT 57 ARDYFWYFDV 58 47H24A GFSLTSYG 59 IWSGGST 60 ASQYVAY 61 49O5A GYTFTSYW 62 INPSNGGT 63 ARSKSNYGYYAMDY 64 50B10A GYTFTSYW 65 INPSNGRT 66 ARSEGRVYYDYFYAMDY 67 50H17A GYAFTNYL 68 INPGSGGT 69 ARDYYWYFDV 70 50E16A AIRDTNYW 71 IYPGNGDT 72 ATYYSNYGGAMDY 73 50F1A GYTFTDYS 74 INTETGEP 75 ARDIFWAMDY 76 54I14A GYTFTSYN 77 IYPGNGDT 78 ARYDYDAMDY 79 52K11A GYSFTGYN 80 INPYYGST 81 AGSSYVDYAMDY 82 53H21A GYTFTSYV 83 IIPYNDGT 84 ARWGNWDYFDY 85 53I12A GYTFTSYW 86 IYAGSSSS 87 ARSGHGYDGFAY 88 60A9A GYAFSSYW 89 IYPGDGDT 90 AREAIYYGNYVFTY 91 39J9A GYAFTNYL 92 INPGSGGT 93 ARRGDYYGNPFDY 94 49H8A GYTFTNYW 95 IDPSDNYT 96 ARGYYGYSPSWFAY 97 51B10A GYSFTGYY 98 INPYSGAT 99 ARSYYGAMDY 100 HC: cadeia pesada; CDR: região determinante de complementaridade; ID: SEQ ID NO

[0484] As CDRs de HC para mAbs anti-CD73 foram determinadas usando o método IMGT (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Res. 1999;

27:209-212). Tabela 4: Regiões de CDR 1-3 de cadeia leve para mAbs anti-CD73 mAb LC CDR1 ID LC CDR2 ID LC CDR3 ID 37C7A QNLVHSYGNTY 101 KVS 102 SQNTHVPWT 103 38C16A QSLLDSDGRTY 104 LVS 105 WQGTHFPHT 106 39G8A QSLLNSSNQKNY 107 FAS 108 QQHYSTPYT 109 43E8A ESVDNYGISF 110 AAS 111 QQSKEVPFT 112 46J3A KNISKY 113 SGS 114 QQHNEYPFT 115 46O19A QSLLNSGNQKNY 116 WAS 117 QNDYSYPLT 118 47H24A QDIGSR 119 ATS 120 LQYASSPFT 121 49O5A DHIDNW 122 GAT 123 QQYWSSPFT 124 50B10A QDISNY 125 YTS 126 QQGNTLPWT 127 50H17A QSLLNSGNQKNY 128 WAS 129 QNDYSYPLT 130 50E16A QDVGTAVA 131 WAS 132 QQYSSYPYT 133 50F1A QSLLNSGNQKNY 134 WAS 135 QNDYSYPLT 136 54I14A ENIYSY 137 NAK 138 QHHYGTPFT 139 52K11A KSLLHSNDITY 140 RMS 141 AQMLERPWT 142 53H21A SSVSY 143 LTS 144 QQWSSNPWT 145 53I12A QGISNY 146 YTS 147 QQYSKLPRT 148 60A9A QSLLNSSNQKNY 149 FAS 150 QQHYSTPLT 151 39J9A ENIYYS 152 NAD 153 KQAYDVPLT 154 49H8A SSVSY 155 LTS 156 QQWSSNPPT 157 51B10A QDINSY 158 RAN 159 LQYDEFPLT 160 LC: cadeia leve; CDR: região determinante de complementaridade

[0485] As CDRs de LC para mAbs anti-CD73 foram determinadas usando o método IMGT (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Res. 1999; 27:209-212). Tabela 5: Regiões de CDR 1-3 de cadeia pesada para mAbs anti- CD73 mAb HC CDR1 ID HC CDR2 ID HC CDR3 ID 37C7A GFSLSTFGMGVT 161 HIWWDDDMYYNPALKS 162 ARSPITTVVADY 163 38C16A GYTFSSYWIE 164 EILPGSGSTNYNEKFKG 165 ARGDYFGSSYRGPY 166 39G8A GYTFTSYWMH 167 EIDPSGGYTNYNQKFKG 168 ARNYYYGSSGTMDY 169 43E8A GYTFSNYWIE 170 EILPGNVITNYNEKFKG 171 ARRGDDGYLYAMDY 172 46J3A GYTFTDYYMH 173 EIYPGSGNTYYNEKFKG 174 ARYWDYYGSTYGYFDV 175 46O19A GYTFTDYNMH 176 YINPNNGGTSYNQKFKG 177 ARDYFWYFDV 178 47H24A GFSLTSYGVH 179 VIWSGGSTDYNAAFISR 180 ASQYVAY 181 49O5A GYTFTSYWMH 182 NINPSNGGTNYNEKFKS 183 ARSKSNYGYYAMDY 184 50B10A GYTFTSYWMH 185 EINPSNGRTNYNEKFKS 186 ARSEGRVYYDYFYAMDY 187 50H17A GYAFTNYLIE 188 VINPGSGGTNYNEKFKG 189 ARDYYWYFDV 190 50E16A AIRDTNYWMQ 191 AIYPGNGDTSYNQKFKV 192 ATYYSNYGGAMDY 193 50F1A GYTFTDYSMH 194 WINTETGEPTYADDFKG 195 ARDIFWAMDY 196 54I14A GYTFTSYNMH 197 AIYPGNGDTSYNQKFKG 198 ARYDYDAMDY 199 52K11A GYSFTGYNMN 200 NINPYYGSTSYNQKFKG 201 AGSSYVDYAMDY 202 53H21A GYTFTSYVMH 203 YIIPYNDGTKYNEKFEG 204 ARWGNWDYFDY 205 53I12A GYTFTSYWIN 206 NIYAGSSSSNYNEKFKS 207 ARSGHGYDGFAY 208

60A9A GYAFSSYWMN 209 QIYPGDGDTYYSGKFKG 210 AREAIYYGNYVFTY 211 39J9A GYAFTNYLIE 212 LINPGSGGTNYIEKFKG 213 ARRGDYYGNPFDY 214 49H8A GYTFTNYWMQ 215 EIDPSDNYTHYNQKFKG 216 ARGYYGYSPSWFAY 217 51B10A GYSFTGYYMH 218 RINPYSGATNSNQNFKD 219 ARSYYGAMDY 220 HC: cadeia pesada; CDR: região determinante de complementaridade

[0486] As CDRs de HC para mAbs anti-CD73 foram determinadas usando uma combinação de métodos IMGT (Lefranc, M.-P. et al., Nu- cleic Acids Res. 1999; 27:209-212) e Kabat (Elvin A. Kabat et al., Se- quences of Proteins of Immunological Interest 5a ed. (1991)). Tabela 6: Regiões de CDR 1-3 de cadeia leve para mAbs anti-CD73 mAb LC CDR1 ID LC CDR2 ID LC CDR3 ID 37C7A RSSQNLVHSYGNTYLH 221 KVSNRFS 222 SQNTHVPWT 223 38C16A KSSQSLLDSDGRTYLN 224 LVSKLDS 225 WQGTHFPHT 226 39G8A KSSQSLLNSSNQKNYLA 227 FASTRES 228 QQHYSTPYT 229 43E8A RASESVDNYGISFMN 230 AASNQGS 231 QQSKEVPFT 232 46J3A RASKNISKYLA 233 SGSTLQS 234 QQHNEYPFT 235 46O19A KSSQSLLNSGNQKNYLT 236 WASTRES 237 QNDYSYPLT 238 47H24A RASQDIGSRLT 239 ATSSLDS 240 LQYASSPFT 241 49O5A EASDHIDNWLA 242 GATSLET 243 QQYWSSPFT 244 50B10A RASQDISNYLN 245 YTSRLHS 246 QQGNTLPWT 247 50H17A KSSQSLLNSGNQKNYLT 248 WASTRES 249 QNDYSYPLT 250 50E16A KASQDVGTAVA 251 WASTRHT 252 QQYSSYPYT 253 50F1A KSSQSLLNSGNQKNYLT 254 WASTRES 255 QNDYSYPLT 256 54I14A RASENIYSYFA 257 NAKTLAE 258 QHHYGTPFT 259 52K11A SSNKSLLHSNDITYLY 260 RMSNLAS 261 AQMLERPWT 262 53H21A SASSSVSYMY 263 LTSNLAS 264 QQWSSNPWT 265 53I12A SASQGISNYLN 266 YTSSLHS 267 QQYSKLPRT 268 60A9A KSSQSLLNSSNQKNYLA 269 FASTRDS 270 QQHYSTPLT 271 39J9A RASENIYYSLA 272 NADTLED 273 KQAYDVPLT 274 49H8A SASSSVSYMY 275 LTSNLAS 276 QQWSSNPPT 277 51B10A KASQDINSYLS 278 RANRLVD 279 LQYDEFPLT 280 LC: cadeia leve; CDR: região determinante de complementaridade

[0487] As CDRs de LC para mAbs anti-CD73 foram determinadas usando uma combinação de métodos IMGT (Lefranc, M.-P. et al., Nu- cleic Acids Res. 1999; 27:209-212) e Kabat (Elvin A. Kabat et al., Se- quences of Proteins of Immunological Interest 5a ed. (1991)).

[0488] Exemplo 2: Produção e purificação de mAbs a partir de meios de cultura de células 293E transfectadas

[0489] Para a obtenção de mAbs quiméricos recombinantes anti-

CD73, os vetores de expressão contendo as regiões variáveis do ca- mundongo (VH e VL) fundidas às regiões constantes da cadeia pesada de IgG1 humana com mutações LALA (L234A/L235A) e da cadeia leve kappa, respectivamente, foram transfectados transientemente para cé- lulas 293E. Os anticorpos recombinantes produzidos na suspensão das células 293E foram purificados por cromatografia de afinidade de prote- ína A.

[0490] Exemplo 3: Inibição da atividade da nucleotidase da CD73 imobilizada por mAbs quiméricos anti-CD73 purificados

[0491] A CD73 humana marcada por HIS (huCD73-HIS, 60 µL/poço a 0,15 µg/mL) em tampão de ensaio (25 mm Tris-HCl, pH 7,5 e 5 mm MgCl2) foi revestida em placas revestidas de níquel (ThermoFisher Sci- entific, cat. n° 15242) a 4°C durante a noite. Após a lavagem, foram adi- cionados mAbs quiméricos anti-CD73 e incubados em temperatura am- biente por 1 hora. A reação enzimática que mediu a atividade da nucle- otidase da CD73 foi iniciada pela adição de 100 µm AMP à placa. A reação prosseguiu por 20 minutos a 37 °C. O fosfato livre foi detectado e quantificado pelo kit de detecção de fosfato verde Malaquite (R&D Systems, Cat#: DY996). A inibição da atividade da nucleotidase da CD73 imobilizada por mAbs quiméricos anti-CD73 é mostrada nas Figs. 1A e 1B. Nenhum anticorpo, reação enzimática sem inibidor; AMPCP (difosfato de adenosina 5'(α,β-metil) foi usado como um controle para inibição da atividade enzimática.

[0492] Exemplo 4: Ensaio de ligação ELISA com mAbs quiméri- cos

[0493] A CD73 humana marcada por HIS (huCD73-HIS, 50 µL/poço a 5 µg/mL (85 Nm)) (BPS Bioscience, cat. n° 71184) em tampão de re- vestimento de carbonato foi revestida em uma placa ELISA a 4 °C du- rante a noite. Após lavagem por tampão TBST (tampão TBS com 0,05%

Tween 20), a placa ELISA foi bloqueada por 5% BSA em TBST em tem- peratura ambiente durante 1 hora e lavada novamente. Os anticorpos anti-CD73 quiméricos foram adicionados, misturados e incubados du- rante 1 hora à temperatura ambiente. A placa foi lavada e a ligação de anticorpos anti-CD73 à huCD73-HIS imobilizada foi detectada pela adi- ção de IgG anti-humana conjugada à peroxidase de rábano (anti-hIgG- HRP) (ThermoFisher Scientific, cat. n° H10007) e incubar por 1 hora. A placa foi lavada, e ELISA foi desenvolvido usando uma solução de de- tecção em uma etapa (ThermoFisher Scientific, cat. n° 34029) e medido como a absorbância a 450 nm. Os resultados da ligação de mAbs anti- CD73 à CD73 são mostrados nas Figs. 2A-2E.

[0494] Exemplo 5: Inibição da atividade da nucleotidase da CD73 solúvel por mAbs anti-CD73

[0495] Este ensaio foi realizado usando a CD73 humana recombi- nante em solução, em vez de imobilizada em uma placa. CD73 humana marcada por His (huCD73-HIS) (BPS Bioscience, cat. n° 71184) na con- centração final de 0,5 nM e várias concentrações de anticorpos anti- CD73 foram incubadas em tampão de ensaio (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mm MgCl2, 140 mm NaCl e 0,1% BSA) por 20 minutos a 37 oC. A reação enzimática foi iniciada pela adição de AMP (Sigma Aldrich, cat. n° A2252) até a concentração final de 400 µM. Depois de incubar a placa a 37 oC por 20 min, a concentração de fosfato inorgânico foi determinada pelo kit de detecção de fosfato verde Malaquita (R&D Systems, Cat#: DY996). Dois mAbs anti-CD73 quiméricos 60A9A/IgG4 e 39G8A/IgG4 foram feitos fundindo as regiões VH e VL de mAbs de camundongo 60A9A e 39G8A às regiões constantes da cadeia pesada da IgG4 hu- mana e da cadeia leve kappa, respectivamente. Os anticorpos quiméri- cos foram expressados em células CHO e purificados por cromatografia de afinidade de Proteína A e testados neste ensaio. Os resultados para inibição da atividade da nucleotidase da CD73 solúvel por 60A9A/IgG4 e 39G8A/IgG4 são mostrados na Fig. 3.

[0496] Exemplo 6: Humanização de mAbs anti-CD73

[0497] Os mAbs anti-CD73 do camundongo 60A9A e 39G8A foram humanizados para reduzir o potencial de imunogenicidade quando usa- dos em pacientes humanos. As sequências das regiões variáveis das cadeias pesada e leve (VH e VL) foram comparadas com as sequências de anticorpos humanos no banco de dados do Protein Data Bank (PDB) e foram construídos modelos de homologia. As CDRs, tanto nas cadeias pesada quanto nas leves dos mAbs de camundongo, foram enxertadas em estruturas humanas que têm a maior possibilidade de manter a es- trutura adequada, provavelmente necessária para a ligação do antí- geno. As sequências das regiões VH e VL humanizadas são apresen- tadas nas Tabelas 7 e 8.

[0498] As regiões de VH e VL humanizadas foram fundidas às regi- ões constantes da cadeia pesada de IgG1 humana com mutações LALA (L234A/L235A) e da cadeia leve kappa, respectivamente. Construções correspondentes às sequências de mAb foram usadas para transfecção transitória em células 293E e os mAbs humanizados foram purificados por cromatografia de Proteína A. Os mAbs humanizados foram testados em um ensaio de atividade enzimática com CD73 humana solúvel. Neste ensaio, 0,4 nM huCD73 foi incubado com mAbs por 1 hora em gelo antes que a reação enzimática fosse iniciada adicionando AMP a uma concentração final de 100 µM. Os valores de IC50 para os mAbs humanizados são mostrados na Tabela 9.

[0499] O mAb humanizado 60A9-H5L4 na cadeia principal da IgG4/kappa humana (60A9-H5L4/IgG4) foi analisado no ensaio de liga- ção ELISA; a versão quimérica da IgG4 do 60A9A (60A9A/IgG4) foi usada como controle. Os resultados de ligação ELISA são mostrados na Fig. 4A. 60A9-H5L4/IgG4 também foi analisado para sua capacidade de inibir a atividade da nucleotidase da CD73 solúvel nas condições no

Exemplo 5. O resultado é mostrado na Fig. 4B. Tabela 7: Sequências de regiões variáveis de cadeia pesada humani- zada para mAbs anti-CD73 VH Sequência ID EVQLVESGGGLVQPGQSLKLSCKASGYAFSSYWMNWVRQAPGKGLEWMGQIYPGDGDTYYN- 60A9-H1 282

PSVKGRFTISADTSKNTAYLQLNNLRAEDTAVYYCAREAIYYGNYVFTYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKASGYAFSSYWMNWVRQAPGKGLEWVGQIYPGDGDTYYN- 60A9-H2 283

PSVKGRFTISADTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREAIYYGNYVFTYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGQSLKLSCKASGYAFSSYWMNWVRQAPGKGLEWIGQIYPGDGDTYYN- 60A9-H3 284

PSVKGRATLSADKSKNTAYLQLNNLRAEDTAVYYCAREAIYYGNYVFTYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGQSLKLSCKASGYAFSSYWMNWVRQAPGKGLEWIGQIYPGD- 60A9-H4 285

GDTYYSGSVKGRATLSADKSKNTAYLQLNNLRAEDTAVYYCAREAIYYGNYVFTYWGQGTLVTVSS EVQLVESGGGLVQPGQSLKLSCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGKGLEWIGQIYPGD- 60A9-H5 286

GDTYYSGKFKGRATLSADKSKNTAYLQLNNLRAEDTAVYYCAREAIYYGNYVFTYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKRPGSSVTVSCKASGYAFSSYWMNWVRQAPGRGLEWIGQIYPGDGDTYYA- 60A9-H6 295

PRFQGRATLTADKSTSTAYLELNSLRPEDTAVYFCAREAIYYGNYVFTYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGSSVTVSCKASGYAFSSYWMNWVRQAPGRGLEWIGQIYPGD- 60A9-H7 296

GDTYYAPKFQGRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAREAIYYGNYVFTYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGSSVTVSCKASGYAFSSYWMNWVRQAPGRGLEWIGQIYPGD- 60A9-H8 297

GDTYYSGKFQGRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAREAIYYGNYVFTYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKRPGSSVTVSCKASGYAFSSYWMNWVRQAPGRGLEWIGQIYPGD- 60A9-H9 298

GDTYYSGKFKGRATLSADKSKNTAYLQLNNLRAEDTAVYYCAREAIYYGNYVFTYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGEID- 39G8-H1 287

PSGGYTNYAQKFQGRSTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARNYYYGSSGTMDYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGEID- 39G8-H2 288

PSGGYTNYAQKFQGRSTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARNYYYGSSGTMDYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGEIDPSGGYTNYN- 39G8-H3 289

QKFQGRSTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARNYYYGSSGTMDYWGQGTLVTVSS Tabela 8: Sequências de regiões variáveis de cadeia leve humaniza- das para mAbs anti-CD73 VL Sequência ID DIQMTQSPSLLSASLGDRVTITCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYFAS- 60A9-L1 290

TRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQHYSTPLTFGGGTKLEIK DIVMTQSPSSLSASLGDRVTITCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYFAS- 60A9-L2 291

TRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQHYSTPLTFGGGTKLEIK DIQMTQSPSLLSASLGDRVTITCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFAS- 60A9-L3 292

TRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQHYSTPLTFGGGTKLEIK DIVMTQSPSLLSASLGDRVTISCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFAS- 60A9-L4 293

TRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYFCQQHYSTPLTFGAGTKLEIK EIVMTQSPGTQSLSPGERATLSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQRPGQAPRLLVYFAS- 60A9-L5 299

TRDSGVADRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYFCQQHYSTPLTFGQGTKVEVK DIVMTQSPDSLAVSLGERATMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLVYFASTRES- 39G8-L3 294

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[0500] Tabela 9: Valores de IC50 para mAbs humanizados em en- saio enzimático huCD73 em solução Nome IC50 (nM) 60A9-H1L1 3,34 60A9-H1L2 6,17

60A9-H1L3 4,96 60A9-H2L1 4,13 60A9-H2L2 11,20 60A9-H2L3 4,57 60A9-H3L1 2,94 60A9-H3L2 4,97 60A9-H3L3 2,09 60A9-H4L1 3,10 60A9-H4L2 4,97 60A9-H4L3 2,74

[0501] O nome 60A9-H1L1 refere-se ao mAb construído usando VH 60A9-H1 e VL 60A9-L1. Todos os outros mAbs humanizados adotam a mesma regra de nomenclatura.

[0502] Exemplo 7: Inibição da atividade da nucleotidase da CD73 de superfície celular por mAbs anti-CD73

[0503] As células A375 foram colhidas com PBS-EDTA (2 mM EDTA em PBS) e lavadas duas vezes em tampão PBS suplementado com 0,1% BSA. 100,000 células foram revestidas na presença de várias concentrações de anticorpos anti-CD73 e incubadas por 20 min a 37°C. O AMP foi então adicionado à concentração final de 125 µM (Sigma Aldrich, cat. n° A2252) em um volume final de 60 µL e a reação foi man- tida a 37°C durante 60 min. As placas foram então centrifugadas e 40 µL de sobrenadante foi transferido para uma nova placa. ATP (Sigma Aldrich, cat. n° A9187) foi adicionado para fazer a concentração final de 100 µM em um volume final de 50 µL e a mistura foi incubada a 37°C por 15 min. Reagente CellTiter-Glo® 2.0 (Promega, cat. n° G9242) foi adicionado em uma proporção de 1:1 para determinar o nível de AMP na mistura e a atividade enzimática em uma determinada reação foi cal- culada com base na concentração de AMP no final da reação. Os resul- tados para inibição da atividade de CD73 pelos mAbs anti-CD73 huma- nizados (na cadeia principal LALA/kappa da IgG1 humana) no ensaio baseado em célula são mostrados na Tabela 10.

[0504] Os mAb anti-CD73 humanizados 60A9-H5L4/IgG4, 60A9- H3L5/IgG4, 60A9-H5L5/IgG4, 60A9-H6L5/IgG4, 60A9-H7L5/IgG4, 60A9-H8L5/IgG4 e 60A9-H9L5/IgG4 também foram testados em um en- saio baseado em células usando um método de detecção de fosfato. Neste ensaio, 50.000 células A375 foram lavadas e revestidas em tam- pão de ensaio (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 140 mM NaCl e 0,1% BSA) e a reação enzimática com uma concentração final de AMP de 400 µM durou 20 min a 37°C. O fosfato livre produzido pela hidrólise de AMP foi quantificado usando o kit de detecção de fosfato verde Ma- laquite (R&D Systems, cat. n° DY996). Os resultados do ensaio são mostrados nas Figs. 4C e 4D.

[0505] Tabela 10: Valores IC50 para mAbs humanizados em ensaio de atividade da CD73 baseado em célula Nome IC50 (nM) 60A9-H2L4 46,03 60A9-H3L4 133,67 60A9-H3L3 65,65 60A9-H4L4 134,67 60A9-H5L1 61,02 60A9-H5L2 57,31 60A9-H5L3 36,41 60A9-H5L4 30,12 39G8-H1L3 49,62 39G8-H2L3 66,33 39G8-H3L3 56,12

[0506] Exemplo 8: Inibição da atividade da nucleotidase da CD73 em amostras de soro de pacientes por mAbs anti-CD73

[0507] Amostras de soro de pacientes com câncer colorretal foram usadas para avaliar a atividade inibitória do mAb anti-CD73 humanizado 60A9-H5L4/IgG4. 20 µL de soro e 10 µL de mAb anti-CD73 em tampão PBS suplementado com 0,1% BSA foram incubados a 37 °C por 30 min. 10 µL de 500 µM AMP (Sigma Aldrich, cat. n° A2252) foi adicionado e a mistura de reação foi incubada a 37°C por 30 min. ATP (Sigma Aldrich,

cat. n° A9187) foi então adicionado até a concentração final de 100 µM. 25 µL da mistura de reação foi transferida para uma placa de 96 poços de meia área branca. Reagente CellTiter-Glo® 2.0 (Promega, cat. n° G9242) foi adicionado em uma proporção de 1:1 à mistura e o nível de AMP residual foi determinado pela medição de seu efeito inibitório na detecção de ATP. Amostras contendo 100 µm AMP e 100 µm ATP fo- ram usadas para estabelecer o fundo do ensaio e amostras contendo apenas 100 µM ATP foram usadas como controle positivo.

[0508] A inibição da atividade da nucleotidase da CD73 nas amos- tras de soro de pacientes por mAb humanizado anti-CD73 60A9- H5L4/IgG4 foi analisada a 1000 nM. Os resultados são mostrados na Fig. 5.

[0509] Exemplo 9: Ativação da proliferação de célula T por mAb humanizado anti-CD73 60A9-H5L4/IgG4

[0510] As células T CD4+ humanas primárias foram isoladas de cé- lulas mononucleares de sangue periférico congeladas usando o kit de isolamento de células T CD4+ (Miltenyi Biotec, cat. n° 130-096-533). Células T CD4+ isoladas a uma densidade de 1.000.000 células por mL em DPBS foram marcadas usando o kit de proliferação celular CFSE CellTrace™ (Invitrogen, cat. n° C34554) a 37°C por 30 min. As células foram lavadas três vezes com DPBS frio e ressuspensas em meio AIM V (Gibco, cat. n° 12055083). 100,000 células por poço foram pré-incu- badas com várias concentrações de 60A9-H5L4/IgG4 por 1 hora a 37 °C. As células T foram ativadas pela adição de reagentes de ativação de células T, uma combinação de ativador T humano Dynabeads CD3/CD28 (Gibco, cat. n° 11131D) na proporção de 1:1 de microesfera para célula e IL-2 humana na concentração final de 60 IU/mL. Depois disso, AMP (Sigma Aldrich, cat. n° A2252) foi adicionado à concentra- ção final de 100 µM. Após 72 horas de incubação a 37 °C, as células foram manchadas com anticorpo CD4 anti-humano PE/Cy7 (BioLegend,

cat. n° 357409). Os sinais de PE/Cy7 e CFSE foram analisados em um citômetro de fluxo Attune NxT. Para a janela do ensaio, as células CD4+ CFSE na ausência dos reagentes de ativação das células T não tinham sido submetidas a divisões celulares e, portanto, foram usadas para de- finir a linha de base enquanto as células CD4+ CFSE ativadas (tratadas com os reagentes de ativação das células T) na ausência de AMP ha- viam sido submetidas a divisão celular não inibida e, portanto, foram usadas para definir a proliferação máxima. O efeito da 60A9-H5L4/IgG4 na ativação da proliferação de células T é mostrado na Fig. 6. As células tratadas com AMP foram suprimidas como esperado, presumivelmente devido à produção de adenosina pela superfície celular CD73, e a adi- ção do mAb anti-CD73 60A9-H5L4/IgG4 a 75 nM ativou as células, su- gerindo que o mAb tem atividade funcional na ativação das células T.

[0511] Será entendido por aqueles versados na técnica que as mu- danças poderiam ser feitas nas modalidades descritas acima sem se afastar do amplo conceito inventivo das mesmas. Entende-se, portanto, que esta invenção não se limita às modalidades específicas reveladas, mas tem por objetivo cobrir as modificações dentro do espírito e do es- copo da presente invenção, conforme definido pela presente descrição.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região determinante de com- plementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2 e LCDR3, com as sequências de polipeptídeos de: a. SEQ ID NOs:89, 90, 91, 149, 150 e 151, respectivamente, ou SEQ ID NOs:209, 210, 211, 269, 270 e 271, respectivamente; b. SEQ ID NOs:41, 42, 43, 101, 102 e 103, respectivamente, ou SEQ ID NOs:161, 162, 163, 221, 222 e 223, respectivamente; c. SEQ ID NOs:44, 45, 46, 104, 105 e 106, respectivamente, ou SEQ ID NOs:164, 165, 166, 224, 225 e 226, respectivamente; d. SEQ ID NOs:47, 48, 49, 107, 108 e 109, respectivamente, ou SEQ ID NOs:167, 168, 169, 227, 228 e 229, respectivamente; e. SEQ ID NOs:50, 51, 52, 110, 111 e 112, respectivamente, ou SEQ ID NOs:170, 171, 172, 230, 231 e 232, respectivamente; f. SEQ ID NOs:53, 54, 55, 113, 114 e 115, respectivamente, ou SEQ ID NOs:173, 174, 175, 233, 234 e 235, respectivamente; g. SEQ ID NOs:56, 57, 58, 116, 117 e 118, respectivamente, ou SEQ ID NOs:176, 177, 178, 236, 237 e 238, respectivamente; h. SEQ ID NOs:59, 60, 61, 119, 120 e 121, respectivamente, ou SEQ ID NOs:179, 180, 181, 239, 240 e 241, respectivamente; i. SEQ ID NOs:62, 63, 64, 122, 123 e 124, respectivamente, ou SEQ ID NOs:182, 183, 184, 242, 243 e 244, respectivamente; j. SEQ ID NOs:65, 66, 67, 125, 126 e 127, respectivamente, ou SEQ ID NOs:185, 186, 187, 245, 246 e 247, respectivamente; k. SEQ ID NOs:68, 69, 70, 128, 129 e 130, respectivamente, ou SEQ ID NOs:188, 189, 190, 248, 249 e 250, respectivamente; l. SEQ ID NOs:71, 72, 73, 131, 132 e 133, respectivamente, ou SEQ ID NOs:191, 192, 193, 251, 252 e 253, respectivamente;

m. SEQ ID NOs:74, 75, 76, 134, 135 e 136, respectivamente, ou SEQ ID NOs:194, 195, 196, 254, 255 e 256, respectivamente; n. SEQ ID NOs:77, 78, 79, 137, 138 e 139, respectivamente, ou SEQ ID NOs:197, 198, 199, 257, 258 e 259, respectivamente; o. SEQ ID NOs:80, 81, 82, 140, 141 e 142, respectivamente, ou SEQ ID NOs:200, 201, 202, 260, 261 e 262, respectivamente; p. SEQ ID NOs:83, 84, 85, 143, 144 e 145, respectivamente, ou SEQ ID NOs:203, 204, 205, 263, 264 e 265, respectivamente; q. SEQ ID NOs:86, 87, 88, 146, 147 e 148, respectivamente, ou SEQ ID NOs:206, 207, 208, 266, 267 e 268, respectivamente; r. SEQ ID NOs:92, 93, 94, 152, 153 e 154, respectivamente, ou SEQ ID NOs:212, 213, 214, 272, 273 e 274, respectivamente; s. SEQ ID NOs:95, 96, 97, 155, 156 e 157, respectivamente, ou SEQ ID NOs:215, 216, 217, 275, 276 e 277, respectivamente; ou t. SEQ ID NOs:98, 99, 100, 158, 159 e 160, respectivamente, ou SEQ ID NOs:218, 219, 220, 278, 279 e 280, respectivamente; caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga especificamente à CD73, de preferência a CD73 humana.

2. Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de polipeptídeo pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:286, 33, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35, 37, 39, 282, 283, 284, 285, 287, 288, 289, 295, 296, 297 ou 298, ou uma região variável de cadeia leve com uma sequência de polipeptídeo pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:293, 34, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 36, 38, 40, 290, 291, 292, 294 ou 299.

3. Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que compreende: a. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:286 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:293; b. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipéptido da SEQ ID NO:33 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipéptido da SEQ ID NO:34; c. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipéptido da SEQ ID NO:1 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipéptido da SEQ ID NO:2; d. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:3 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:4; e. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:5 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:6; f. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:7 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:8; g. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:9 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:10; h. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:11 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:12; i. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:13 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:14; j. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:15 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:16; k. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:17 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:18; l. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:19 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:20; m. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:21 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:22; n. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:23 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:24; o. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:25 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:26; p. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:27 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:28; q. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:29 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:30; r. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:31 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:32; s. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:35 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:36; t. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:37 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:38; u. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:39 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:40; v. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:282 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:290; w. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:282 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:291; x. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:282 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:292; y. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:283 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:290; z. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:283 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:291; aa. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:283 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:292; bb. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:290; cc. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:291; dd. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:292; ee. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:285 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:290; ff. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:285 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:291; gg. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:285 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:292; hh. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:283 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:293; ii. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:293; jj. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:285 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:293; kk. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:286 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:290; ll. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:286 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:291; mm. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:286 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:292; nn. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:287 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:294; oo. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:288 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:294; pp. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:289 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:294; qq. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:299; rr. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:295 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:299; ss. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:296 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:299; tt. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:297 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:299; ou uu. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:298 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO:299.

4. Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou o frag- mento de ligação a antígeno do mesmo inibe a atividade enzimática da CD73 solúvel ou de superfície celular, previne a dimerização da CD73, induz a internalização da CD73 e/ou é capaz de ativar as células T.

5. Anticorpo monoclonal isolado ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo é quimérico ou humano ou humanizado.

6. Anticorpo biespecífico, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

7. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que co- difica o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou o anticorpo biespecífico, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender o ácido nu- cleico isolado, como definido na reivindicação 7.

9. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de compreen- der o vetor, como definido na reivindicação 8.

10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender o anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou o anticorpo biespecífico, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

11. Método para inibir a atividade da nucleotidase de CD73, prevenir a dimerização da CD73, induzir a internalização da CD73 ou tratar um câncer em um indivíduo que precisa do mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a administração ao indivíduo da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 10.

12. Método para produzir o anticorpo monoclonal ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo ou o anticorpo biespecífico, como definidos em com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, carac- terizado pelo fato de compreender a cultura de uma célula compreen-

dendo um ácido nucleico que codifica o anticorpo monoclonal ou o fra- gmento de ligação a antígeno do mesmo ou o anticorpo biespecífico, em condições para produzir o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou o anticorpo biespecífico, e recuperando o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou o anticorpo biespecífico da célula ou da cultura.

13. Método para produzir uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou o anticorpo biespecífico, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de com- preender a combinação do anticorpo monoclonal ou do fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou o anticorpo biespecífico com um veí- culo farmaceuticamente aceitável para obter a composição farmacêu- tica.

14. Método para determinar o nível da CD73 ou a atividade de ecto-5'-nucleotidase da CD73 em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: a. obter uma amostra do indivíduo; b. colocar a amostra em contato com um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5; e c. determinar um nível da CD73 ou a atividade de ecto-5'-nu- cleotidase da CD73 no indivíduo; opcionalmente, a amostra é uma amostra de tecido ou de sangue, em que a amostra de tecido é opcionalmente uma amostra de tecido de câncer.