ES2898627T3 - Uso de agentes anti-CD47 para mejorar la inmunización - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para inducir una respuesta inmunitaria a una célula tumoral de mamífero que expresa CD47, el método comprendiendo: (a) poner en contacto un macrófago o célula dendrítica con una célula tumoral de mamífero que expresa CD47 en presencia de una dosis eficaz de un agente anti-CD47 in vitro para generar un macrófago o célula dendrítica cargados; y (b) poner en contacto una población de células T con el macrófago o la célula dendrítica cargados in vitro; en donde la población de células T genera una respuesta específica para la célula tumoral de mamífero que expresa CD47.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de agentes anti-CD47 para mejorar la inmunización

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presentación de antígenos es el proceso mediante el cual las células inmunes innatas como los macrófagos y las células dendríticas (células presentadoras de antígenos, APC) adquieren antígenos y los presentan a las células T para iniciar la respuesta inmunitaria adaptativa. La forma en que las APC dan forma a la respuesta inmunitaria degradando los antígenos y conservando los antígenos para la presentación a las células T ha sido un área de interés desde hace mucho tiempo. Recientemente, se ha demostrado que el mecanismo de reconocimiento de antígenos por APC afecta a la preferencia de las vías de presentación de antígenos MHC I frente a MHC II. Por ejemplo, se ha demostrado que la endocitosis mediada por el receptor de manosa en las células dendríticas encamina los antígenos hacia la presentación de antígenos de MHC I, mientras que la endocitosis mediada por el receptor eliminador se ha asociado con la presentación de MHC II (Burgdorf et al (2007) Science 316(5824):612-616).

Además, se ha demostrado que los resultados funcionales de la presentación de antígenos dependen del contexto. Por ejemplo, dirigir antígenos a DEC-205 usando anticuerpos monoclonales indujo tolerancia en condiciones no inflamatorias, pero en su lugar mediaba inmunogenicidad en condiciones de activación por CD40L (Bonifaz et al. (2004) J Exp Med 199(6):815-824). Aprovechar las APC para mejorar la respuesta de las células T antitumorales ofrece una estrategia interesante para la inmunoterapia contra el cáncer. La capacidad de la respuesta inmunitaria de las células T para movilizarse con éxito contra el cáncer se ha demostrado mediante estudios preclínicos y clínicos del anticuerpo anti-CTLA4 para la activación de las células T (Callahan et al. (2010) Semin Onco/37(5) :473-484).

Barrio et al. (2012) PLoS ONE 7(7):e40311 informa que los macrófagos humanos y las células dendríticas pueden presentar igualmente el antígeno MART-1 a las células T CD8+ después de la fagocitosis de células de melanoma irradiadas con rayos gamma. Lei et al. (2000) Gene Therapy 7(8):707-713 describe la inducción de una potente respuesta antitumoral mediante vacunación con macrófagos pulsados por lisado tumoral manipulados para secretar factor estimulante de colonias de macrófagos e interferón-Y.

La CD47 es una glicoproteína transmembrana ampliamente expresada con un único dominio similar a Ig y cinco regiones que abarcan la membrana, que funciona como un ligando celular para SIRPa con unión mediada a través del dominio tipo V NH2-terminal de SIRPa. SIRPa se expresa principalmente en células mieloides, incluyendo macrófagos, granulocitos, células dendríticas mieloides (DC), mastocitos y sus precursores, incluyendo las células madre hematopoyéticas. Los determinantes estructurales en SIRPa que median CD47 unión son analizados por Lee et al. (2007) J. Immunol. 179:7741-7750; Hatherley et al. (2007) JBC 282:14567-75; y el papel de la dimerización cis de SIRPa en la unión de CD47 es analizado por Lee et al. (2010) JBC 285:37953-63. De acuerdo con el papel de CD47 para inhibir la fagocitosis de células normales, hay evidencias de que se regula por incremento transitoriamente en células madre hematopoyéticas (HSC) y progenitores justo antes y durante su fase migratoria, y que el nivel de CD47 en estas células determina la probabilidad de que sean envueltas in vivo.

La fagocitosis por macrófagos se basa en el reconocimiento celular de señales profagocíticas ("cómeme") y antifagocíticas ("no me comas") en una célula objetivo. El bloqueo del anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CD47 induce la fagocitosis de macrófagos de las células cancerosas inhibiendo una importante señal antifagocítica ("no me comas"), lo que permite que dominen las señales profagocíticas (Majeti et al. (2009) Cell 138(2):286-299; Willingham et al. (2012) P.N.A.S. 109(17):6662-6667). CD47 se expresa altamente en células cancerosas y células infectadas con patógenos en comparación con las células normales e interactúa con el ligando SIRPa en los macrófagos. Esto da como resultado la fosforilación de motivos ITIM en la cola citoplásmica de SIRPa y el reclutamiento de fosfatasas SHP-1 y SHP-2, que se cree que bloquea la fagocitosis evitando la acumulación de miosina-IIA en la sinapsis fagocítica.

Se ha demostrado la eficacia terapéutica del bloqueo de mAbs anti-CD47 contra cánceres humanos de xenoinjerto que crecen en ratones inmunodeficientes, incluyendo cánceres como leucemia, linfoma, mieloma múltiple y tumores sólidos, incluyendo cánceres de mama, colon, próstata, vejiga y sarcomas. No se ha determinado si la respuesta inmunitaria adaptativa también puede reclutarse contra el cáncer después del tratamiento con mAb anti-CD47.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un método in vitro para inducir una respuesta inmunitaria a una célula tumoral de mamífero que expresa CD47, el método comprendiendo:

(a) poner en contacto un macrófago o célula dendrítica con una célula tumoral de mamífero que expresa CD47 en presencia de una dosis eficaz de un agente anti-CD47 in vitro para generar un macrófago o célula dendrítica cargados; y

(b) poner en contacto una población de células T con el macrófago o la célula dendrítica cargados in vitro; en donde la población de células T genera una respuesta específica para la célula tumoral de mamífero que expresa CD47.

La invención proporciona además un macrófago cargado para su uso en un método de tratamiento del cáncer, en donde el método comprende:

generar el macrófago cargado poniendo en contacto un macrófago con una célula tumoral de mamífero que expresa CD47 en presencia de una dosis eficaz de un agente anti-CD47 in vitro, y

poner en contacto una población de células T con el macrófago cargado in vivo; en donde la población de células T genera una respuesta específica para la célula tumoral de mamífero que expresa CD47.

Se proporcionan métodos para mejorar las estrategias de inmunización mediante manipulación, por ejemplo, manipulación in vitro, de células presentadoras de antígenos fagocíticos. En los métodos in vitro de la invención, las células presentadoras de antígenos fagocíticos son macrófagos o células dendríticas. Tales células presentadoras de antígeno fagocítico (phAPC) se incuban con un antígeno particulado en presencia de un agente anti-CD47 en una dosis y durante un período de tiempo suficiente para permitir que phAPC fagocite el antígeno particulado, proceso que genera una phAPC "cargada". La phAPC cargada se pone en contacto con una población de células T emparejadas para por lo menos un locus de histocompatibilidad principal con la phAPC, donde las células T se estimulan después del contacto para generar una respuesta efectora contra un epítopo o epítopos presentes en el antígeno particulado.

El antígeno particulado es una célula (a la que puede hacerse referencia en la presente como una célula objetivo), específicamente una célula tumoral de mamífero como carcinoma, glioma, sarcoma, melanoma, mieloma, leucemia, linfoma, etc., incluyendo, sin limitación, los cánceres hematológicos AML, CML, ALL, NHL, mieloma múltiple, etc., y tumores sólidos, incluyendo cánceres de mama, colon, próstata, vejiga, gliomas, sarcomas y similares. La célula objetivo expresa CD47 o un imitador de CD47.

Un agente anti-CD47 útil en los métodos de la invención interfiere con la unión entre CD47 presente en la célula objetivo y SIRPa presente en phAPC. Los agentes anti-CD47 adecuados incluyen polipéptidos de SIRPa solubles; CD47 soluble; anticuerpos anti-CD47, anticuerpos anti-SIRPa y similares, donde el término anticuerpos abarca fragmentos de anticuerpos y variantes de los mismos, como se conoce en la técnica.

Las células presentadoras de antígeno fagocítico adecuadas tienen las características de ser (a) capaces de fagocitosis del antígeno particulado, particularmente cuando el antígeno particulado es una célula de mamífero; (b) expresar SIRPa; (c) capaz de presentar antígeno a una célula T incluyendo, sin limitación, la capacidad de estimular directa o indirectamente una respuesta específica de antígeno por células T citotóxicas. En el contexto de los métodos in vitro de la invención, las phAPC son células dendríticas o macrófagos. La invención proporciona además un macrófago cargado para su uso en un método de tratamiento del cáncer como se define en la reivindicación 2. La phAPC puede aislarse de un donante de mamífero o madurar in vitro a partir de una célula progenitora, por ejemplo, de monocitos, células mononucleares de sangre periférica y similares como se conoce en la técnica.

La phAPC se selecciona para compartir por lo menos una proteína del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) con la población deseada de células T. En algunas realizaciones, la phAPC es autóloga para la población de células T pretendida. En algunas realizaciones, la phAPC es alogénica, pero comparte por lo menos una proteína de MHC, por ejemplo, por lo menos una proteína de MHC de Clase II incluyendo, sin limitación, las proteínas humanas HLA-DM; HlA-DO; HLA-DP; HLA-Dq ; HLA-DR. Alternativamente o en combinación, la phAPC y las células T objetivo comparten por lo menos un alelo de MHC Clase I incluyendo, sin limitación, HLA-A, HLA-B. En ciertas de tales realizaciones, phAPC se empareja por lo menos con un alelo de HLA-DR, y puede emparejarse con ambos alelos de HLA-DR. En algunas realizaciones, la phAPC se empareja con 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 proteínas de HLA. Es conocido por los expertos en la técnica que cada proteína de HLA de Clase II está compuesta de dos polipéptidos, cada uno de los cuales puede tener secuencia polimórfica.

Las células T que responden a phAPC pueden ser células T auxiliares, por ejemplo, TH1, TH2, TH17, etc., células T reguladoras, por ejemplo, células FoxP3+; o células T citotóxicas (CTL), por ejemplo, células T CD8+. Las células T preferidas son las células CTL efectoras. Las células T pueden ponerse en contacto in vitro o in vivo. Cuando el contacto es in vitro, la población de phAPC cargada se mezcla con una población de células T candidatas, que se enriquece opcionalmente para el subconjunto de células T de interés y se incuba durante un período de tiempo suficiente para activar las células T. Cuando el contacto se realiza in vivo, la población de phAPC se inyecta en el mamífero receptor en un sitio que proporciona acceso a los ganglios linfáticos, por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intratumoral y similares. Cuando el contacto se realiza in vitro, se usa un medio de cultivo adecuado, incluyendo opcionalmente citoquinas.

También se divulgan kits para la puesta en práctica de la invención. Tales kits pueden comprender uno o más de un agente anti-CD47; reactivos para la selección o maduración in vitro de phAPC; antígeno particulado o reactivos para la selección de células objetivo; además de tampones, medio de cultivo celular, factores de crecimiento y desechables como jeringuillas, placas de cultivo de tejidos y similares. Los kits también pueden incluir instrucciones de uso.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Fig. 1. Los macrófagos fagocitan eficazmente las células cancerosas en presencia de anticuerpo anti-CD47 B6H12. (A) Los macrófagos RFP+ se cocultivaron con células cancerosas DLD1-cOVA-GFP en presencia de mAbs de IgG o anti-CD47 B6H12 (bloqueantes) o 2D3 (no bloqueantes). El porcentaje de fagocitosis se determinó mediante %GFP+ dentro de la compuerta celular de macrófagos RFP+. (B) Se cocultivaron macrófagos RFP+ frente a células dendríticas con células cancerosas DLD1 -cOVA-GFP en presencia de mAb de IgG, anti-CD47 B6H12 o anti-CD472D3. El experimento se realizó tres veces con resultados similares.

Fig. 2. Los macrófagos ceban eficazmente las células T CD8+ para que proliferen después de la fagocitosis de las células cancerosas por el anticuerpo anti-CD47 B6H12. (A) Los macrófagos RFP+ se cocultivaron con células DLD1-cOVA-GFP humanas en presencia de mAbs anti-CD47 B6H12 (bloqueantes) o anti-CD47 2D3 (no bloqueantes) de IgG. Al día siguiente, las células T CD8+ se enriquecieron magnéticamente de ratones transgénicos OTI y se marcaron con CFSE (0,5 uM). El análisis se realizó el día 3 y se determinó el % de células en proliferación. Los macrófagos se pulsaron con péptido OT-I (SIINFEKL), OVA257-264 como control positivo. El experimento se realizó tres veces con resultados similares. (B) los macrófagos RFP+ se cocultivaron con células cancerosas DLD1-cOVA-GFP o células cancerosas DLD1-GFP que no expresaban cOVA. (Izquierda) La fagocitosis se determinó por % FP+ dentro de la compuerta celular de macrófagos RFP+. (Derecha) Se añadieron a los cultivos células T CD8+ marcadas con CFSE de ratones OT-I y se determinó el % de células en proliferación.

Fig. 3. Después de la fagocitosis de las células cancerosas por anti-CD47, los macrófagos no ceban las células T CD4+ para que proliferen. (A) Se cocultivaron macrófagos RFP+ con células cancerosas DLD1-cOVA-GFP en presencia de mAbs anti-CD47 B6H12 (bloqueantes) o anti-CD47 2D3 (no bloqueantes). Al día siguiente, se aislaron células T CD4+ de ratones transgénicos OT-II y se marcaron con CFSE (0,5 pM). El análisis se realizó el día 4 y se determinó el % de células en proliferación. Los macrófagos se pulsaron con péptido OVA 323-339 como control positivo. (B) Los macrófagos RFP+ se estimularon con IFN-y para regular por incremento los niveles de MHC II. La fagocitosis y el cebado de las células OT-II CD4+ se determinaron en presencia de mAbs anti-CD47.

Fig. 4. Se produce una reducción de las células T reguladoras Foxp3+ después de la fagocitosis mediada por anti-CD47 B6H12 del cáncer por macrófagos. Los macrófagos RFP+ se cocultivaron con células cancerosas DLD1-cOVA-GFP en presencia de mAbs de IgG o anti-CD47 B6H12 (bloqueantes) o 2D3 (no bloqueantes). Al día siguiente, las células T CD4+ se enriquecieron magnéticamente de ratones transgénicos OT-II/Foxp3-GFP+ y se añadieron a los cultivos. El día 4, se cuantificó el % de células CD4+ Foxp3-GFP+.

Fig. 5. Después de la fagocitosis mediada por anti-CD47 de células cancerosas, los macrófagos ceban las células T CD8+ in vivo. (A) Configuración experimental. (B) Se analizaron células T CFSE+ OT-I transferidas de manera adoptiva en el ganglio linfático de drenaje cerrando las células CD45.2+. El % de células en proliferación se determinó mediante la activación de la población con bajo contenido de CFSE. N = 5 ratones por grupo. Fig. 6. Después de la fagocitosis mediada por anti-CD47 de células cancerosas, los macrófagos ceban una respuesta de células T CD8+ antitumorales in vivo. (A) Después de la fagocitosis mediada por anti-CD47 de células cancerosas, los macrófagos ceban las células T citotóxicas efectoras. Se aislaron células T CD8+ de ratones transgénicos OT-I y se transfirieron iv a ratones receptores. Los macrófagos se cocultivaron con tumores DLD1-cOVA-GFP in vitro en presencia de mAbs de IgG o anti-CD47 B6H12 bloqueantes. Los macrófagos se aislaron mediante separación magnética y luego se transfirieron por vía subcutánea al día siguiente. Después de cuatro días, las células objetivo (esplenocitos CD45.1) se marcaron con CFSE alto (10 pM) o bajo (1 pM). Se pulsaron células con alto contenido de CFSE con péptido restringido de clase I OVA 1 pM (SIINFEKL) para convertirlas en objetivos para la función de las células T citotóxicas OT-I. Se mezclaron células con alto contenido (pulsadas con péptidos) y bajo contenido (no pulsadas) de CFSE en una proporción de 1:1 y se transfirieron por vía intravenosa. Los ganglios linfáticos de drenaje se analizaron 16 horas después para determinar el porcentaje de células con alto contenido de CFSE frente a bajo contenido de CFSE. El porcentaje de muerte celular se determinó de acuerdo con los materiales y métodos. N=10 ratones. (B) Después de la fagocitosis mediada por anti-CD47de tumores, los macrófagos ceban una respuesta de células T CD8 antitumorales. Las células T OT-I CD8+ se transfirieron por vía intravenosa a los ratones receptores. Los macrófagos se cocultivaron con células cancerosas DLD1-cOVA-GFP in vitro en presencia de mAbs de IgG o anti-CD47 B6H12, y luego los macrófagos se transfirieron subQ los días 1 y 10. Los animales se desafiaron con células cancerosas EG.7 el día 14 y se monitorizó el crecimiento tumoral a lo largo del tiempo. N=5 ratones por grupo.

Figura 7: Generación de la línea celular de cáncer de colon DLD1-cOVA-GFP. (A) La línea celular de macrófagos IC-21 se transfectó con un lentivirus que expresaba ovoalbúmina citoplasmática y GFP del promotor de EF-1.

Los macrófagos se perfilaron para la expresión de SIINFEKL-H2kb. (B) Se transfectaron líneas celulares DLD1 con lentivirus que expresaban GFP solamente u ovoalbúmina citoplásmica y GFP. La expresión de la proteína ovoalbúmina se confirmó mediante transferencia Western. (C) Ambos mAbs anti-CD47, clones B6H12 (bloqueantes) y 2D3 (no bloqueantes), se unen a la superficie celular de las células cancerosas DLD1-cOVA-GFP.

Figura 8: El mAb anti-CD47 B6H12 media la fagocitosis del cáncer por macrófagos. (A) Los macrófagos generados a partir de ratones C57BL/6 de tipo salvaje y los macrófagos RFP generados a partir de ratones transgénicos C57BL/Ka Rosa26-mRFP1 fagocitan tumores en presencia de anti-CD47 B6H12 a niveles similares. (B) Se muestra la fagocitosis representativa de macrófagos de tumores en presencia de anticuerpo anti-CD47 usando tinción de Wright-Giemsa.

Figura 9: Después de la fagocitosis mediada por anti-CD47 B6H12, los macrófagos secretan cantidades aumentadas de citoquinas proinflamatorias. Los macrófagos RFP+ se cocultivaron con células cancerosas DLD1 -cOVA-GFP (designado tumor M+) en presencia de mAbs de IgG o anti-CD47 B6H12 (bloqueantes) o 2D3 (no bloqueantes). Además, también se cultivaron macrófagos RFP+ solos en el contexto de mAb B6H12 (M solo B6H12) para distinguir entre las citoquinas liberadas debido a la fagocitosis de macrófagos frente a las citoquinas liberadas por la estimulación por mAb de los macrófagos. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron para el análisis de los niveles de citoquinas mediante el ensayo Luminex.

Figura 10. Caracterización de macrófagos y células dendríticas derivados in vitro. (A) Los macrófagos y las morfologías de las células dendríticas se muestran usando tinción de Wright-Giemsa. (B) Los macrófagos son predominantemente Mac1+ F4/80+. Las células dendríticas son predominantemente CD11c+. (C) Las células dendríticas expresan niveles más altos de moléculas coestimuladoras CD80 y CD86 que los macrófagos. (D) Los macrófagos expresan SIRPa en niveles altos, mientras que las células dendríticas expresan SIRPa en niveles más bajos.

Figura 11. Los macrófagos regulan por incremento el MHC II y la molécula coestimuladora CD86 después de la fagocitosis de tumores por el anticuerpo anti-CD47. (A) Después de la fagocitosis de tumores por el anticuerpo anti-CD47, los macrófagos regulan por incremento los niveles de expresión de MHC II (I-Ab) (B) Después de la fagocitosis de los tumores por el anticuerpo anti-CD47, los macrófagos aumentan los niveles de la molécula coestimuladora CD86, pero no la molécula coinhibidora B7-H1.

Figura 12. Validación de ratones transgénicos dobles OT-II/Foxp3-GFP. (A) Izquierda: OT-II/Foxp3-GFP expresan GFP dentro de la compuerta CD4+CD25+ en la sangre periférica. Derecha: Los ratones OT-II/Foxp3-GFP expresan una frecuencia aumentada de TCR restringido por Va2. (B) Las células T CD4+ se enriquecieron de los ganglios linfáticos periféricos de ratones OT-II/Foxp3-GFP y se cocultivaron en presencia de macrófagos RFP. Se indujeron células Foxp3-GFP+ en presencia de TGF-p (20 ng/ml) y ácido todo-trans-retinoico (RA) (1 nM).

Figura 13. Los macrófagos son más eficientes para fagocitar objetivos en comparación con las células dendríticas. Los macrófagos y las células dendríticas se compararon lado a lado por su capacidad para fagocitar objetivos. Se probó la fagocitosis mediada por anti-CD47 de células de cáncer de colon DLD1 -cOVA-GFP junto con perlas de látex de color amarillo verdoso recubiertas de ovoalbúmina.

Figura 14. Después de la fagocitosis mediada por anti-CD47, los macrófagos y las células dendríticas ceban una respuesta de células T CD8+. Se cocultivaron macrófagos y células dendríticas con objetivos (células de cáncer de colon DLD1-cOVA-GFP o perlas de látex recubiertas de ovoalbúmina) y se midió el cebado de células T CD8+ mediante el % de proliferación de células T OT-I (CD8+).

Figura 15. Después de la fagocitosis mediada por anti-CD47, los macrófagos y las células dendríticas no ceban una respuesta de las células T CD4+. Se cocultivaron macrófagos y células dendríticas con objetivos (células de cáncer de colon DLD1-cOVA-GFP o perlas de látex recubiertas de ovoalbúmina) y se midió el cebado de células T CD4+ mediante el % de proliferación de células T OT-II (CD4+).

Figura 16. Los anticuerpos anti-CD47, cetuximab (anti-EGFR) y anti-Epcam inducen la fagocitosis de las células cancerosas in vitro por macrófagos. Los macrófagos RFP+ se cocultivaron con células cancerosas DLD1 -cOVA-GFP en presencia de mAbs de IgG, anti-CD47 B6H12 (bloqueantes) o anti-CD47 2D3 (no bloqueantes), anti-EGFR y anti-Epcam.

Figura 17. La fagocitosis de las células cancerosas por macrófagos a través de anti-CD47, pero no anti-EGFR o anti-Epcam, lleva a un cebado aumentado de las células T CD8+. Los macrófagos RFP+ se cocultivaron con células cancerosas DLD1-cOVA-GFP en presencia de mAbs de IgG, anti-CD47 B6H12 (bloqueantes) o anti-CD47 2D3 (no bloqueantes), anti-EGFR y anti-Epcam. Al día siguiente, las células T CD8+ se enriquecieron magnéticamente de ratones transgénicos OT-I y se marcaron con CFSE (0,5 pM). El análisis se realizó el día 3 y se determinó el % de células en proliferación. Este resultado demuestra que la fagocitosis mediada por anti-CD47 proporciona una ruta única para cebar una respuesta de células T citotóxicas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Antes de que se describan los presentes métodos y composiciones, debe entenderse que esta invención no se limita al método o composición particular descritos, ya que tales pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente tiene el propósito de describir solamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de ese intervalo también se divulga específicamente. Cada intervalo más pequeño entre cualquier valor establecido o valor intermedio en un intervalo establecido y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido está incluido dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse o excluirse independientemente en el intervalo, y cada intervalo en el que ninguno o ambos límites están incluidos en los intervalos más pequeños también se incluye dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de esos límites incluidos también están incluidos en la invención.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque en la puesta en práctica o ensayo de la presente invención puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente, ahora se describen algunos métodos y materiales potenciales y preferidos.

Cualquier método enumerado puede llevarse a cabo en el orden de los eventos enumerados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.

Debe observarse que, como se usa en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de tales células y la referencia al "péptido" incluye la referencia a uno o más péptidos y equivalentes de los mismos, por ejemplo polipéptidos, conocidos por los expertos en la técnica, y demás.

Las publicaciones analizadas en la presente se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a ser anterior a dicha publicación en virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden necesitar ser confirmadas independientemente.

Definiciones

Agente anti-CD47.Como se usa en la presente, el término "agente anti-CD47" se refiere a cualquier agente que reduce la unión de CD47 (por ejemplo, en una célula objetivo) a SIRPa (por ejemplo, en una célula fagocítica). Los ejemplos no limitativos de reactivos anti-CD47 adecuados incluyen reactivos de SIRPa, que incluyen, sin limitación, polipéptidos de SIRPa de alta afinidad, anticuerpos anti-SIRPa, polipéptidos de CD47 solubles y anticuerpos anti-CD47, fragmentos de anticuerpos, péptidos, moléculas pequeñas, peptidomiméticos y similares. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 adecuado (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD47, un reactivo de SIRPa, etc.) se une específicamente a CD47 para reducir la unión de CD47 a SIRPa. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 adecuado (por ejemplo, un anticuerpo anti-SIRPa, un polipéptido de CD47 soluble, etc.) se une específicamente a SIRPa para reducir la unión de CD47 a SIRPa. Un agente anti-CD47 adecuado que se une a SIRPa no activa SIRPa (por ejemplo, en la célula fagocítica que expresa SIRPa).

La eficacia de un agente anti-CD47 adecuado puede evaluarse probando el agente. En un ensayo ejemplar, las células objetivo se incuban en presencia o ausencia del agente candidato. Un agente para su uso en los métodos de la invención regulará por incremento la fagocitosis y la activación posterior de las células T en por lo menos un 10% (por ejemplo, por lo menos un 20%, por lo menos un 30%, por lo menos un 40%, por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 90%, por lo menos un 100%, por lo menos un 120%, por lo menos un 140%, por lo menos un 160%, por lo menos un 180% o por lo menos un 200%) en comparación a la fagocitosis y la activación posterior de las células T en ausencia del agente. De manera similar, un ensayo in vitro para los niveles de fosforilación de tirosina de SIRPa mostrará una disminución en la fosforilación de por lo menos un 5% (por ejemplo, por lo menos un 10%, por lo menos un 15%, por lo menos un 20%, por lo menos un 30%, por lo menos un 40%, por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 90% o 100%) en comparación con la fosforilación observada en ausencia del agente candidato.

En algunas realizaciones, el agente anti-CD47 no activa CD47 tras unirse. Cuando se activa CD47, puede producirse un proceso similar a la apoptosis (es decir, muerte celular programada) (Manna y Frazier (2004) Cancer Research 64:1026-1036). Por tanto, en algunas realizaciones, el agente anti-CD47 no induce directamente la muerte celular de una célula que expresa CD47.

Algunos patógenos (por ejemplo, virus de la viruela, virus del mixoma, virus de la viruela del ciervo, virus de la viruela porcina, virus de la viruela caprina, virus de la viruela ovina, etc.) expresan un análogo de CD47 (es decir, un imitador de CD47) (por ejemplo, la proteína M128L) que actúa como un factor de virulencia para permitir la infección (Cameron et al., Virology. 20 de junio de 2005; 337(1):55-67), y algunos patógenos inducen la expresión de CD47 endógeno en la célula huésped. Por tanto, las células infectadas con un patógeno que expresa un análogo de CD47 pueden expresar el análogo de CD47 proporcionado por el patógeno o de manera exclusiva o en combinación con CD47 endógeno. Este mecanismo permite que el patógeno aumente la expresión de CD47 (a través de la expresión del análogo de CD47) en la célula infectada con o sin aumentar el nivel de CD47 endógeno. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 (por ejemplo, anticuerpo anti-CD47, un reactivo de SIRPa, un anticuerpo de SIRPa, un polipéptido de CD47 soluble, etc.) puede reducir la unión de un análogo de CD47 (es decir, un imitador de CD47) a SIRPa.. En algunos casos, un agente anti-CD47 adecuado (por ejemplo, un reactivo de SIRPa, un anticuerpo anti-CD47, etc.) puede unirse a un análogo de CD47 (es decir, un imitador de CD47) para reducir la unión del análogo de CD47 a SIRPa. En algunos casos, un agente anti-CD47 adecuado (por ejemplo, un anticuerpo anti-SIRPa, un polipéptido de CD47 soluble, etc.) puede unirse a SIRPa. Un agente anti-CD47 adecuado que se une a SIRPa no activa SIRPa (por ejemplo, en la célula fagocítica que expresa SIRPa). Puede usarse un agente anti-CD47 en cualquiera de los métodos proporcionados en la presente cuando el patógeno es un patógeno que proporciona un análogo de CD47. En otras palabras, el término "CD47", como se usa en la presente, abarca tanto CD47 como análogos de CD47 (es decir, imitadores de CD47).

Reactivo de SIRPa. Un reactivo de SIRPa comprende la porción de SIRPa que es suficiente para unirse a CD47 con una afinidad reconocible, que normalmente se encuentra entre la secuencia señal y el dominio transmembrana, o un fragmento del mismo que retiene la actividad de unión. Un reactivo de SIRPa adecuado reduce (por ejemplo, bloquea, previene, etc.) la interacción entre las proteínas nativas de SIRPa y CD47. El reactivo de SIRPa comprenderá habitualmente por lo menos el dominio d1 de SIRPa. En algunas realizaciones, un reactivo de SIRPa es una proteína de fusión, por ejemplo, fusionada en marco con un segundo polipéptido. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es capaz de aumentar el tamaño de la proteína de fusión, por ejemplo, de modo que la proteína de fusión no se depure rápidamente de la circulación. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es parte o la totalidad de una región Fc de inmunoglobulina. La región Fc ayuda en la fagocitosis al proporcionar una señal de "cómeme", que mejora el bloqueo de la señal de "no me comas" proporcionada por el reactivo de SIRPa de alta afinidad. En otras realizaciones, el segundo polipéptido es cualquier polipéptido adecuado que sea sustancialmente similar a Fc, por ejemplo, que proporcione dominios de multimerización de tamaño aumentado y/o unión o interacción adicionales con las moléculas de Ig.

En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 sujeto es un "reactivo de SIRPa de alta afinidad", que incluye polipéptidos derivados de SIRPa y análogos de los mismos. Los reactivos de SIRPa de alta afinidad se describen en solicitud internacional WO 2013/109752. Los reactivos de SIRPa de alta afinidad son variantes de la proteína de SIRPa nativa. En algunas realizaciones, un reactivo de SIRPa de alta afinidad es soluble, donde el polipéptido carece del dominio transmembrana de SIRPa y comprende por lo menos un cambio de aminoácidos con respecto a la secuencia de SIRPa de tipo salvaje, y en donde el cambio de aminoácidos aumenta la afinidad de unión del polipéptido de SIRPa a CD47, por ejemplo, disminuyendo la tasa de disociación en por lo menos 10 veces, por lo menos 20 veces, por lo menos 50 veces, por lo menos 100 veces, por lo menos 500 veces o más.

Un reactivo de SIRPa de alta afinidad comprende la porción de SIRPa que es suficiente para unirse a CD47 con una afinidad reconocible, por ejemplo, alta afinidad, que normalmente se encuentra entre la secuencia señal y el dominio transmembrana, o un fragmento de la misma que retiene la actividad de unión. El reactivo de SIRPa de alta afinidad comprenderá habitualmente por lo menos el dominio d1 de SIRPa con residuos de aminoácidos modificados para aumentar la afinidad. En algunas realizaciones, una variante de SIRPa de la presente invención es una proteína de fusión, por ejemplo, fusionada en marco con un segundo polipéptido. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es capaz de aumentar el tamaño de la proteína de fusión, por ejemplo, de tal manera que la proteína de fusión no se depure rápidamente de la circulación. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es parte o la totalidad de una región Fc de inmunoglobulina. La región Fc ayuda en la fagocitosis al proporcionar una señal de "cómeme", que mejora el bloqueo de la señal de "no me comas" proporcionada por el reactivo de SIRPa de alta afinidad. En otras realizaciones, el segundo polipéptido es cualquier polipéptido adecuado que sea sustancialmente similar a Fc, por ejemplo, que proporcione un tamaño aumentado, dominios de multimerización y/o unión o interacción adicional con moléculas de Ig. Los cambios de aminoácidos que proporcionan una afinidad aumentada se localizan en el dominio d1 y, por tanto, los reactivos de SIRPa de alta afinidad comprenden un dominio d1 de SIRPa humano, con por lo menos un cambio de aminoácidos con respecto a la secuencia de tipo salvaje dentro del dominio d1. Dicho reactivo de SIRPa de alta afinidad comprende opcionalmente secuencias de aminoácidos adicionales, por ejemplo, secuencias Fc de anticuerpos; porciones de la proteína de SIRPa humana de tipo salvaje distintas del dominio d1, incluyendo, sin limitación, los residuos 150 a 374 de la proteína nativa o fragmentos de los mismos, habitualmente fragmentos contiguos al dominio d1; y similares. Los reactivos de SIRPa de alta afinidad pueden ser monoméricos o multiméricos, es decir, dímero, trímero, tetrámero, etc.

Anticuerpos anti-CD47. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 sujeto es un anticuerpo que se une específicamente a CD47 (es decir, un anticuerpo anti-CD47) y reduce la interacción entre CD47 en una célula (por ejemplo, una célula infectada) y SIRPa en otra célula (por ejemplo, una célula fagocítica). En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD47 adecuado no activa CD47 tras unirse. Los ejemplos no limitativos de anticuerpos adecuados incluyen los clones B6H12, 5F9, 8B6 y C3 (por ejemplo, como se describe en la Publicación de patente internacional WO 2011/143624). Los anticuerpos anti-CD47 adecuados incluyen versiones completamente humanas, humanizadas o quiméricas de tales anticuerpos. Los anticuerpos humanizados (por ejemplo, hu5F9-G4) son especialmente útiles para aplicaciones in vivo en humanos debido a su baja antigenicidad. De manera similar, los anticuerpos caninizados, felinizados, etc. son especialmente útiles para aplicaciones en perros, gatos y otras especies, respectivamente. Los anticuerpos de interés incluyen anticuerpos humanizados o anticuerpos caninizados, felinizados, equinizados, bovinizados, porcinizados, etc., y variantes de los mismos.

Anticuerpos anti-SIRPa.En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 sujeto es un anticuerpo que se une específicamente a SIRPa (es decir, un anticuerpo anti-SIRPa) y reduce la interacción entre CD47 en una célula y SIRPa en otra célula. Los anticuerpos anti-SIRPa adecuados pueden unirse a SIRPa sin activar o estimular la señalización a través de SIRPa, porque la activación de SIRPa inhibiría la fagocitosis. En cambio, los anticuerpos anti-SIRPa adecuados facilitan la fagocitosis de las células objetivo. Por tanto, un anticuerpo anti-SIRPa adecuado se une específicamente a SIRPa (sin activar/estimular una respuesta de señalización suficiente para inhibir la fagocitosis) y bloquea una interacción entre SIRPa y CD47. Los anticuerpos anti-SIRPa adecuados incluyen versiones completamente humanas, humanizadas o quiméricas de tales anticuerpos. De manera similar, los anticuerpos caninizados, felinizados, etc. son especialmente útiles para aplicaciones en perros, gatos, y otras especies respectivamente. Los anticuerpos de interés incluyen anticuerpos humanizados o anticuerpos caninizados, felinizados, equinizados, bovinizados, porcinizados, etc., y variantes de los mismos.

Polipéptidos de CD47 solubles. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 sujeto es un polipéptido de CD47 soluble que se une específicamente a SIRPa y reduce la interacción entre CD47 en una célula y SIRPa en otra célula. Un polipéptido de CD47 soluble adecuado puede unirse a SIRPa sin activar o estimular la señalización a través de SIRPa. Los polipéptidos de CD47 solubles adecuados facilitan la fagocitosis de las células objetivo. Por tanto, un polipéptido de CD47 soluble adecuado se une específicamente a SIRPa sin activar/estimular una respuesta de señalización suficiente para inhibir la fagocitosis.

En algunos casos, un polipéptido de CD47 soluble adecuado puede ser una proteína de fusión (por ejemplo, como se describe estructuralmente en la Publicación de Patente de Estados Unidos US20100239579). Sin embargo, solo las proteínas de fusión que no activan/estimulan SIRPa son adecuadas para los métodos proporcionados en la presente. Los polipéptidos de CD47 solubles adecuados también incluyen cualquier péptido o fragmento de péptido que comprenda secuencias de CD47 variantes o existentes de forma natural (por ejemplo, secuencias de dominio extracelular o variantes de dominio extracelular) que puedan unirse específicamente a SIRPa e inhibir la interacción entre CD47 y SIRPa sin estimular suficiente actividad de SIRPa para inhibir la fagocitosis.

En ciertas realizaciones, el polipéptido de CD47 soluble comprende el dominio extracelular de CD47, incluyendo el péptido señal, de tal manera que la porción extracelular de CD47 tiene típicamente 142 aminoácidos de longitud. Los polipéptidos solubles de CD47 descritos en la presente también incluyen variantes de dominio extracelular de CD47 que comprenden una secuencia de aminoácidos de por lo menos un 65%-75%, 75%-80%, 80-85%, 85%-90% o 95%-99% (o cualquier porcentaje de identidad no enumerado específicamente entre el 65% y el 100%), cuyas variantes retienen la capacidad de unirse a SIRPa sin estimular la señalización de SIRPa.

En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del péptido señal puede sustituirse por una secuencia de aminoácidos del péptido señal que se deriva de otro polipéptido (por ejemplo, una inmunoglobulina o CTLA4). Por ejemplo, a diferencia del CD47 de longitud completa, que es un polipéptido de la superficie celular que atraviesa la membrana celular externa, los polipéptidos de CD47 solubles se secretan; por consiguiente, un polinucleótido que codifica un polipéptido de CD47 soluble puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal que está asociado con un polipéptido que normalmente se secreta de una célula.

En otras realizaciones, el polipéptido de CD47 soluble comprende un dominio extracelular de CD47 que carece del péptido señal. Como se describe en la presente, los péptidos señal no se exponen en la superficie celular de una proteína secretada o transmembrana porque o el péptido señal se escinde durante la translocación de la proteína o el péptido señal permanece anclado en la membrana celular externa (dicho péptido también se denomina anclaje de señal). Se cree que la secuencia del péptido señal de CD47 se escinde del polipéptido precursor de CD47 in vivo.

En otras realizaciones, un polipéptido de CD47 soluble comprende una variante de dominio extracelular de CD47. Dicho polipéptido de CD47 soluble conserva la capacidad de unirse a SIRPa sin estimular la señalización de SIRPa.

Célula presentadora de antígenos fagocíticos. Los términos "células fagocíticas" y "fagocitos" se usan indistintamente en la presente para referirse a una célula que es capaz de fagocitosis, es decir, que engulle una gran masa de partículas, por ejemplo, desde aproximadamente 0,1 pm de diámetro hasta aproximadamente 2 mm o aproximadamente 1 mm de diámetro; desde aproximadamente 0,5 pm de diámetro hasta aproximadamente 1 mm de diámetro, etc., incluyendo particularmente hasta el tamaño de una célula de mamífero, por ejemplo, una célula tumoral. La fagocitosis en este contexto se define por la absorción de células, patógenos y varias partículas rodeándola con la membrana de la célula efectora.

Hay varias categorías de fagocitos: macrófagos; células mononucleares (histiocitos y monocitos); leucocitos polimorfonucleares; (neutrófilos) y células dendríticas. Los macrófagos son de particular interés. Las respuestas celulares asociadas con la fagocitosis incluyen respuestas inmunomoduladoras como la generación y liberación de mediadores proinflamatorios y antiinflamatorios, y también respuestas celulares de naturaleza destructiva como el estallido respiratorio y la liberación de moléculas tóxicas y microbicidas por desgranulación. Los fagocitos profesionales son capaces de reconocer una amplia variedad de objetivos fagocíticos y de ingerirlos a un ritmo mayor que las células no fagocíticas.

Los neutrófilos y los macrófagos son representativos de fagocitos completamente diferenciados. Mientras que los neutrófilos que abandonan la médula ósea están completamente diferenciados, los macrófagos se diferencian de los monocitos circulantes en los tejidos extravasculares. Los monocitos muestran una respuesta fagocítica más baja, en comparación con los neutrófilos y macrófagos, y deben responder a señales de activación y diferenciación para lograr una capacidad fagocítica óptima. El proceso de diferenciación de monocitos a macrófagos se ha caracterizado bien y puede realizarse in vitro o in vivo.

Célula dendrítica (DC) se refiere a cualquier miembro de una población diversa de tipos de células morfológicamente similares que se encuentran en tejidos linfoides o no linfoides. A las DC se hace referencia como células presentadoras de antígenos "profesionales" y tienen una alta capacidad para sensibilizar a las células T restringidas por MHC. Las DC pueden reconocerse por función, fenotipo y/o patrón de expresión génica, particularmente por fenotipo de superficie celular. Estas células se caracterizan por su morfología distintiva, altos niveles de expresión de MHC de clase II de superficie y capacidad para presentar antígeno a células T CD4+ y/o CD8+, particularmente a células T vírgenes (Steinman et al. (1991) Ann. Rev Immunol. 9:271).

Las DC inmaduras expresan niveles bajos de MHC de clase II, pero son capaces de endocitosar proteínas antigénicas y procesarlas para su presentación en un complejo con moléculas de MHC de clase II. Las DC activadas expresan niveles altos de MHC de clase II, ICAM-1 y CD86, y son capaces de estimular la proliferación de células T alogénicas vírgenes, por ejemplo, en una reacción de leucocitos mixtos (MLR). Funcionalmente, las DC pueden identificarse mediante cualquier ensayo conveniente para la determinación de la presentación de antígenos. Dichos ensayos pueden incluir probar la capacidad de estimular células T cebadas con antígeno y/o vírgenes mediante la presentación de un antígeno de prueba, seguido de la determinación de la proliferación de células T, liberación de IL-2 y similares.

Los protocolos típicos para la diferenciación in vitro de macrófagos o células dendríticas de monocitos se describen, por ejemplo, en Davies y Gordon, Methods in Molecular Biology vol. 290: Basic Cell Culture Protocols, tercera edición; y Zhang et al. (2008) Curr. Protoc. Immunology noviembre. Tales métodos generalmente utilizan células mononucleares de sangre periférica (PBMC), que pueden enriquecerse mediante la selección de células que portan marcadores de monocitos o mediante la adherencia, por ejemplo, a una placa de cultivo, aunque no se requiere tal enriquecimiento. Los marcadores para macrófagos incluyen F4/80, CD11b y CD68. Tales métodos habitualmente aprovechan el uso del factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y/o IL-4 para diferenciar las células progenitoras de macrófagos de la médula ósea o sangre periférica en macrófagos maduros en cultivo, proporcionando una población homogénea de macrófagos en un estado relativamente inactivo que responde a los estímulos de activación in vitro.

Por ejemplo, las células de la médula ósea o las células de la sangre periférica se recogen y cultivan en el medio que contiene M-CSF. Después de 7 días en cultivo, se eliminan las células no adherentes contaminantes y se recogen las células adherentes para los ensayos. Los macrófagos adherentes derivados de médula ósea o de sangre periférica suelen tener una pureza superior al 90%. Alternativamente, los monocitos pueden derivarse de progenitores más primitivos, como células madre hematopoyéticas, células ES, células iPS y similares.

Las células presentadoras de antígenos (APC) especializadas absorben proteínas externas, digieren esas proteínas en péptidos cortos y presentan los péptidos unidos a moléculas de MHC, por ejemplo, HLA de clase I o clase II. Las células T se unen a los complejos péptido-MHC presentados en las superficies de las APC si tienen TCR coincidentes. Pueden estar implicadas varias moléculas coestimuladoras, por ejemplo, CD80 y CD86, y/o ICOS-L expresadas por APC. Una característica de las APC es que estimulan una respuesta específica de antígeno por las células T, particularmente por las células T vírgenes.

En ciertas realizaciones, la phAPC o precursores de la misma se congelan en nitrógeno líquido (o equivalente) antes de su uso. Por ejemplo, la fuente de tejido (por ejemplo, Médula ósea, sangre periférica) puede recogerse, congelarse y almacenarse hasta que se necesite. De igual manera, la phAPC derivada in vitro de precursores puede congelarse y almacenarse hasta su uso. Si se congelan, las células se almacenarán habitualmente en un medio DMSO al 10%, FCS al 50%, RPMI 1640 al 40% en nitrógeno líquido.

Las phAPC y las células T que son de interés para el cebado se seleccionan para compartir por lo menos un antígeno de MHC. Los antígenos del complejo principal de histocompatibilidad (también llamados antígenos leucocitarios humanos, HLA) son moléculas de proteínas expresadas en la superficie de las células que confieren una identidad antigénica única a estas células. Los antígenos de MHC/HLA son moléculas objetivo que son reconocidas por las células T y las células asesinas naturales (NK) como derivadas de la misma fuente de células que las células efectoras inmunes ("propias"). Se reconocen dos clases principales de antígenos de HLA: HLA clase I y HLA clase II. Los antígenos de HLA de clase I (A, B y C en humanos) hacen que cada célula sea reconocible como "propia", mientras que los antígenos de HLA de clase II (DR, DP y DQ en humanos) están implicados en reacciones entre linfocitos y células presentadoras de antígenos.

Un aspecto importante del sistema génico de HLA es su polimorfismo. Cada gen, MHC clase I (A, B y C) y MHC clase II (DP, DQ y DR) existe en diferentes alelos. Los alelos de HLA se designan con números y subíndices. Por ejemplo, dos individuos no relacionados pueden ser portadores de HLA-B de clase I, genes B5 y Bw41, respectivamente. Los productos génicos alélicos difieren en uno o más aminoácidos en el o los dominios a y/o p. Se usan grandes paneles de anticuerpos específicos o reactivos de ácido nucleico para tipificar haplotipos de HLA de individuos, usando leucocitos que expresan moléculas de clase I y clase II. Los genes más importantes para la tipificación de HLA son las seis proteínas de MHC de clase I y clase II, dos alelos para cada uno de HLA-A; HLA-B y HLA-DR.

Los genes del antígeno leucocitario humano (HLA) están agrupados en un "super-locus" presente en la posición 6p21 del cromosoma, que codifica los seis genes de HLA de trasplante clásico y por lo menos 132 genes codificadores de proteínas que tienen funciones importantes en la regulación del sistema inmunitario así como algunos otros procesos moleculares y celulares fundamentales. El locus completo mide aproximadamente 3,6 Mb, con por lo menos 224 loci de genes. Un efecto de esta agrupación es que los "haplotipos", es decir, el conjunto de alelos presentes en un solo cromosoma, que se hereda de uno de los padres, tienden a heredarse como grupo. El conjunto de alelos heredados de cada padre forma un haplotipo, en el que algunos alelos tienden a asociarse entre sí. Identificar los haplotipos de un paciente puede ayudar a predecir la probabilidad de encontrar donantes coincidentes y ayudar a desarrollar una estrategia de búsqueda, ya que algunos alelos y haplotipos con más comunes que otros y se distribuyen a frecuencias diferentes en diferente grupos raciales y étnicos.

Los alelos de HLA típicamente se anotan con una variedad de niveles de detalle. La mayoría de las designaciones comienzan con HLA- y el nombre del locus, luego * y algún número (par) de dígitos que especifican el alelo. Los dos primeros dígitos especifican un grupo de alelos. Las metodologías de tipificación más antiguas a menudo no podían distinguir completamente los alelos y, por lo tanto, se detuvieron en este nivel. Los dígitos tercero a cuarto especifican un alelo sinónimo. Los dígitos del cinco al seis denotan cualquier mutación sinónima dentro del marco de codificación del gen. Los dígitos séptimo y octavo distinguen mutaciones fuera de la región codificante. Las letras como L, N, Q o S pueden seguir la designación de un alelo para especificar un nivel de expresión u otros datos no genómicos conocidos sobre él. Por tanto, un alelo completamente descrito puede tener hasta 9 dígitos, sin incluir el prefijo HLA y la notación de locus.

Puede usarse opcionalmente cualquier método conocido en la técnica para tipificar las células. Por ejemplo, actualmente se usan tres procesos principales para realizar la tipificación de HLA. El primero es el método de citotoxicidad serológica convencional, en el que se añaden muestras de linfocitos (extraídos de la sangre o del bazo) a las placas de Terasaki. Estas placas contienen pocillos individuales que contienen diferentes anticuerpos específicos (ya sea de sueros maternos o anticuerpos monoclonales fabricados). Las mejores células para la tipificación de clase II son los linfocitos B, y la tipificación de clase I puede realizarse con los leucocitos restantes. Las perlas magnéticas se usan para purificar las células necesarias de la sangre o el bazo. Si el antígeno de HLA y el anticuerpo específico se unen y se añade complemento, las células de ese pocillo mueren. El patrón de los pocillos que muestran esta muerte celular permite la deducción de que combinación de antígenos de HLA estaba presente en las células tisulares originales.

Otro método usado para la tipificación de HLA es la citometría de flujo, especialmente cuando se buscan alelos específicos. Los leucocitos se añaden a anticuerpos monoclonales marcados detectables específicos para los tipos de HLA de interés. Luego, la muestra se analiza mediante citometría de flujo para determinar qué anticuerpos se han unido a las células.

Se está usando la tipificación del ADN cada vez más para la tipificación de HLA. Este proceso implica extraer el ADN de las células y amplificar los genes que codifican los péptidos de HLA usando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa. Los genes pueden coincidir con secuencias de nucleótidos de HLA conocidas que se encuentran almacenadas en varias bases de datos de bancos de genes, incluyendo la base de datos IMGT/HLA.

Una "dosis terapéuticamente eficaz" o "dosis terapéutica" es una cantidad suficiente para lograr los resultados clínicos deseados (es decir, lograr la eficacia terapéutica). Para algunos propósitos de la presente invención, una dosis eficaz de un agente anti-CD47 es la dosis que mejora la capacidad de una phAPC para cargarse con un antígeno particulado, por ejemplo, aumentando la fagocitosis en por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 75%, por lo menos aproximadamente un 100%, hasta 2 veces, 3 veces o más. Por ejemplo, la phAPC puede combinarse con antígeno particulado en un medio que comprende por lo menos 0,01 pg/ml, por lo menos 0,1 pg/ml, por lo menos 1 pg/ml, por lo menos 10 pg/ml o más de un agente anti-CD47. Una población de phAPC cargada puede haber fagocitado de madia por lo menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,5, 0,75, 1 partículas de antígeno, por ejemplo, células tumorales, células infectadas con virus, etc. por APC.

Una dosis terapéuticamente eficaz de phAPC cargada es aquella dosis eficaz para aumentar la respuesta dirigida, es decir, específica de antígeno por las células T in vivo. La respuesta puede, en algunos casos, estar dirigida contra diversos epítopos de antígenos específicos de tumores, específicos de virus, específicos de bacterias, etc. Como tal, puede ser más conveniente determinar la dosis en términos de destrucción de las células objetivo.

Para los propósitos de esta invención, una dosis terapéuticamente eficaz de un agente anti-CD47 es una cantidad que es suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, revertir, prevenir, ralentizar o retrasar la progresión del estado patológico (por ejemplo, cáncer o infección crónica) aumentando la muerte mediada por células T de una célula objetivo (por ejemplo, una célula objetivo) o el daño mediado por células T que eventualmente da como resultado la muerte celular. Por tanto, una dosis terapéuticamente eficaz de un agente anti-CD47 puede disminuir la población de células objetivo a través de una respuesta inmunitaria in vivo en por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 75%, por lo menos aproximadamente un 90% o más, con respecto al efecto en ausencia de administración de una población cargada de phAPC.

Los términos "tratamiento", "tratando", "tratar" y similares se usan en la presente para referirse de manera general a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir total o parcialmente una enfermedad o síntomas de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de estabilización o curación parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. El término "tratamiento" abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente un humano, e incluye: (a) prevenir que se produzcan la enfermedad y/o síntomas en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o síntoma pero aún no se le ha diagnosticado que lo tenga; (b) inhibir la enfermedad y/o los síntomas, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar los síntomas de la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad y/o síntomas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos ya infligidos (por ejemplo, aquellos con cáncer, etc.) así como aquellos en los que se desea prevención (por ejemplo, aquellos con mayor susceptibilidad al cáncer, aquellos que se sospecha que tienen cáncer, etc.).

Un tratamiento terapéutico es aquel en el que se inflige al sujeto antes de la administración y un tratamiento profiláctico es aquel en el que no se inflige al sujeto antes de la administración. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mayor probabilidad de sufrir o se sospecha que se le ha infligido antes del tratamiento. En algunas realizaciones, se sospecha que el sujeto tiene una mayor probabilidad de sufrir una enfermedad.

Como se usa en la presente, el término "epítopo" significa cualquier determinante antigénico en un antígeno al que se une un anticuerpo, o contra el cual se dirige una respuesta de células T a través de la unión del receptor de antígeno de células T. Los determinantes epitópicos habitualmente consisten de agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.

Antígeno particulado. Como se usa en la presente, un antígeno particulado es un antígeno de un tamaño que requiere una célula fagocítica para engullir, por ejemplo, perlas grandes, etc. En la mayoría de los casos, el antígeno particulado es una célula, particularmente una célula de mamífero e incluye células humanas así como otros mamíferos. Por ejemplo, una célula puede ser una célula tumoral, una célula infectada, etc. En la invención, el antígeno particulado es una célula tumoral de mamífero que expresa CD47. En algunas realizaciones, la célula se obtiene o se deriva del receptor, por ejemplo, una biopsia de tumor, etc. La respuesta de las células T se dirige en última instancia a los epítopos asociados con la célula, por ejemplo, proteínas específicas del tumor.

Los ejemplos de células tumorales incluyen, pero no se limitan a, AML, ALL, CML, cáncer cortical adrenal, cáncer de ano, anemia aplásica, cáncer de los conductos biliares, cánceres de cerebro, cánceres de sistema nervioso central (SNC), cánceres del sistema nervioso periférico (SNP), cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, linfoma no Hodgkin infantil, cáncer de colon y recto, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, familia de Ewing de tumores (por ejemplo, sarcoma de Ewing), cáncer de ojo, cáncer de vesícula biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, tumores estromales gastrointestinales, enfermedad trofoblástica gestacional, linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe e hipofaringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, tumores carcinoides de pulmón, linfoma no Hodgkin, cáncer de mama masculino, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, trastornos mieloproliferativos, cáncer de cavidad nasal y paranasal, cáncer de nasofaringe, neuroblastoma, cáncer de cavidad oral y orofaringe, osteosarcoma, cáncer de ovarios, cáncer de páncreas, cáncer de pene, tumor pituitario, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcomas, cáncer de piel melanoma, cánceres de piel no melanoma, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cáncer de útero (por ejemplo, sarcoma de útero), carcinoma de células de transición, cáncer de vagina, cáncer de vulva, mesotelioma, carcinoma epidermoide o de células escamosas, adenoma bronquial, coriocarinoma, cánceres de cabeza y cuello, teratocarcinoma o macroglobulinemia de Waldenstrom. Cualquier cáncer, donde las células cancerosas muestren una mayor expresión de CD47 en comparación con las células no cancerosas, es un cáncer adecuado para ser tratado por los presentes métodos y composiciones,

Los términos "receptor", "individuo", "sujeto", "huésped" y "paciente" se usan indistintamente en la presente y se refieren a cualquier sujeto mamífero para el que se desea diagnóstico, tratamiento o terapia, particularmente humanos. "Mamífero" para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportivos o de compañía, como perros, caballos, gatos, vacas, ovejas, cabras, cerdos, etc. Preferiblemente, el mamífero es un humano.

El término "muestra" con respecto a un paciente incluye sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido como un espécimen de biopsia o cultivos de tejido o células derivadas o aisladas de los mismos y la progenie de los mismos. La definición también incluye muestras que hayan sido manipuladas de cualquirr manera después de su obtención, como por tratamiento con reactivos; lavado; o enriquecimiento para determinadas poblaciones de células, como las células cancerosas. La definición también incluye muestras que se han enriquecido para tipos particulares de moléculas, por ejemplo, ácidos nucleicos, polipéptidos, etc.

El término "muestra biológica" abarca una muestra clínica, y también incluye tejido obtenido por resección quirúrgica, tejido obtenido por biopsia, células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, muestras de tejido, órganos, médula ósea, sangre, plasma, suero y similares. Una "muestra biológica" incluye una muestra que comprende células objetivo o células de control normales o que se sospecha que comprende dichas células o fluidos biológicos derivados de las mismas (por ejemplo, célula cancerosa, célula infectada, etc.), por ejemplo, una muestra que comprende polinucleótidos y/o polipéptidos que se obtiene a partir de tales células (por ejemplo, un lisado celular u otro extracto celular que comprende polinucleótidos y/o polipéptidos). Una muestra biológica que comprende una célula infligida de un paciente también puede incluir células no infligidas.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos siempre que presenten la actividad biológica deseada. Los "anticuerpos" (Abs) e "inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos muestran especificidad de unión para un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos sin especificidad antigénica conocida. Los polipéptidos de este último tipo se producen, por ejemplo, en niveles bajos por el sistema linfático y en niveles elevados por los mielomas.

"Fragmento de anticuerpo", y todas las variantes gramaticales del mismo, como se usa en la presente, se definen como una porción de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto, en donde la porción está libre de los dominios de la cadena pesada constante (es decir, CH2, CH3 y CH4, dependiendo del isotipo del anticuerpo) de la región Fc del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 y Fv; diacuerpos; cualquier fragmento de anticuerpo que sea un polipéptido que tenga una estructura primaria que consista de una secuencia ininterrumpida de residuos de aminoácidos contiguos (referidos en la presente como un "fragmento de anticuerpo de cadena sencilla" o "polipéptido de cadena sencilla"), incluyendo sin limitación, (1) moléculas de Fv de cadena sencilla (scFv) (2) polipéptidos de cadena sencilla que contienen sólo un dominio variable de cadena ligera, o un fragmento del mismo que contiene las tres CDR del dominio variable de cadena ligera, sin una fracción de cadena pesada asociada (3) polipéptidos de cadena sencilla que contienen sólo una región variable de cadena pesada, o un fragmento de la misma que contiene las tres CDR de la región variable de cadena pesada, sin una fracción de cadena ligera asociada y (4) nanocuerpos que comprenden dominios de Ig individuales de especies no humanas u otros módulos de unión de dominio único específicos; y estructuras multiespecíficas o multivalentes formadas a partir de fragmentos de anticuerpos. En un fragmento de anticuerpo que comprende una o más cadenas pesadas, la cadena o cadenas pesadas pueden contener cualquier secuencia de dominio constante (por ejemplo, CH1 en el isotipo IgG) que se encuentra en una región no Fc de un anticuerpo intacto, y/o pueden contener cualquier secuencia de región bisagra encontrada en un anticuerpo intacto, y/o pueden contener una secuencia de cremallera de leucina fusionada o situada en la secuencia de región bisagra o la secuencia de dominio constante de la o las cadenas pesadas.

El término células T se refiere a células efectoras inmunes de mamíferos que pueden caracterizarse por la expresión de CD3 y/o receptor de antígeno de células T, células que pueden responder a phAPC cebando una respuesta de células efectoras apropiada para el subconjunto de células T. En algunas realizaciones, las células T son células T citotóxicas (CTL), que pueden caracterizarse como células T CD8+.

En algunas realizaciones se ponen en contacto las células T con phAPC in vivo, es decir, donde se inyecta una dosis eficaz de la phAPC en el receptor y se deja interactuar con las células T en su entorno nativo, por ejemplo, en los ganglios linfáticos, etc. En otras realizaciones la puesta en contacto se realiza in vitro.

Las células T recogidas del sujeto pueden separarse de una mezcla de células mediante técnicas que enriquecen las células deseadas. Puede usarse una solución apropiada para dispersión o suspensión. Dicha solución generalmente será una solución salina equilibrada, por ejemplo, solución salina normal, PBS, solución salina equilibrada de Hank, etc., convenientemente suplementada con suero de ternero fetal u otros factores de origen natural, junto con un tampón aceptable a baja concentración, generalmente de 5-25 mM. Los tampones convenientes incluyen HEPES, tampones de fosfato, tampones de lactato, etc.

Las técnicas para la separación por afinidad pueden incluir separación magnética, usando perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos, cromatografía de afinidad, agentes citotóxicos unidos a un anticuerpo monoclonal o usados junto con un anticuerpo monoclonal, por ejemplo, complemento y citotoxinas, y "cribado" con anticuerpo unido a una matriz sólida, por ejemplo, placa u otra técnica conveniente. Las técnicas que proporcionan una separación precisa incluyen clasificadores celulares activados por fluorescencia, que pueden tener varios grados de sofisticación, como múltiples canales de color, canales de detección de dispersión de luz obtusa y de ángulo bajo, canales de impedancia, etc. Las células pueden seleccionarse contra células muertas empleando colorantes asociados con células muertas (por ejemplo, yoduro de propidio). Puede emplearse cualquier técnica que no sea excesivamente perjudicial para la viabilidad de las células seleccionadas. Los reactivos de afinidad pueden ser receptores o ligandos específicos para las moléculas de la superficie celular indicadas anteriormente. Además de los reactivos de anticuerpos, pueden usarse parejas de receptores de células T y antígenos de péptidos-MHC; ligandos y receptor de péptidos; moléculas efectoras y receptoras, y similares.

Las células separadas pueden recogerse en cualquier medio apropiado que mantenga la viabilidad de las células, habitualmente con una almohadilla de suero en el fondo del tubo de recogida. Hay varios medios disponibles comercialmente y pueden usarse de acuerdo con la naturaleza de las células, incluyendo dMEM, HBSS, dPBS, RPMI, medio de Iscove, etc., frecuentemente suplementado con suero de ternero fetal.

La población de células recogida y opcionalmente enriquecida puede usarse inmediatamente, o puede congelarse a temperaturas de nitrógeno líquido y almacenarse, descongelarse y ser reutilizada. Las células se almacenarán habitualmente en medio DMSO al 10%, FCS al 50%, RPMI 1640 al 40%.

Las células T pueden reinfundirse al sujeto en cualquier medio fisiológicamente aceptable, normalmente por vía intravascular, aunque también pueden introducirse en cualquier otro sitio conveniente, donde las células pueden encontrar un sitio apropiado para el crecimiento. Habitualmente, se administrarán por lo menos 1x106 células/kg, por lo menos 1x107 células/kg, por lo menos 1x108 células/kg, por lo menos 1x109 células/kg, por lo menos 1x1010 células/kg, o más, habitualmente estando limitado por el número de células T que se obtienen durante la recogida. Métodos

Se proporcionan métodos para potenciar la respuesta inmune mediada por células T para un antígeno, particularmente a un antígeno particulado y más particularmente para una célula objetivo. Los presentes métodos incluyen un paso de obtención de células presentadoras de antígenos fagocíticos, que pueden aislarse de una muestra biológica, o pueden derivarse in vitro de una fuente de células progenitoras incluyendo, sin limitación, monocitos de sangre o médula ósea; seguido de un paso de poner en contacto phAPC con un antígeno particulado en presencia de una dosis eficaz de un agente anti-CD47. El contacto puede realizarse en cualquier medio de cultivo adecuado. La phAPC fagocita el antígeno particulado, generalmente de aproximadamente una a aproximadamente 4 horas es suficiente para la fagocitosis. La phAPC cargada procesa las proteínas de la célula objetivo y las presenta en la superficie celular. La phAPC cargada se pone en contacto con una población de células T in vivo o in vitro.

Cuando el contacto se realiza in vitro, se añade una población de células T aislada a la phAPC en una dosis y durante un período de tiempo suficiente para cebar las células T. Generalmente, la proporción de células T a APC es de 1:10 a 10:1, y no es crítica siempre que el número de phAPC no sea limitativo. Puede usarse cualquier medio de cultivo adecuado. Puede ser suficiente un período de hasta 8 días, hasta 10 días, hasta 12 días, hasta 14 días (ver, por ejemplo, Dudley et al, JCO 2005; 23(10):2346-2357). Las células T así cebadas pueden usarse para cualquier propósito deseado, incluyendo propósitos experimentales relacionados con la determinación de la especificidad del antígeno, la realización de perfiles de citoquinas y similares, y para la administración in vivo.

Cuando el contacto se realiza in vivo, se administra al receptor una dosis eficaz de phAPC cargada. La dosificación y la frecuencia pueden variar dependiendo del agente anti-CD47; modo de administración; naturaleza del antígeno; y similares. Un experto en la técnica entenderá que tales pautas se ajustarán a las circunstancias individuales. La dosificación también puede variarse para la administración localizada, por ejemplo, intranasal, inhalación, etc., o para la administración sistémica, por ejemplo, i.m., i.p., i.v., y similares. Generalmente se administran por lo menos aproximadamente 104 phAPC/kg, por lo menos aproximadamente 105 phAPC/kg; por lo menos aproximadamente 106 phAPC/kg, por lo menos aproximadamente 107 phAPC/kg, o más.

La respuesta inmune mejorada puede manifestarse como un aumento en la respuesta citolítica de las células T hacia las células objetivo presentes en el receptor, por ejemplo, hacia la eliminación de células tumorales, células infectadas; combinar las células T cebadas con objetivos que coinciden con HLA para probar la actividad citotóxica; determinación del análisis de citoquinas intracelulares; y similares.

Kits

También se divulgan en la presente kits para usar en los métodos. Los presentes kits incluyen un agente anti-CD47, por ejemplo en una forma de dosificación (por ejemplo, una forma de dosificación de cebado). En algunas realizaciones, se proporciona un agente anti-CD47 en una forma de dosificación (por ejemplo, una forma de dosificación terapéuticamente eficaz), en forma líquida o sólida en cualquier envase conveniente (por ejemplo, paquete de barra, paquete de dosis, etc.). También pueden proporcionarse reactivos para la selección o derivación in vitro de phAPC, por ejemplo, M-CSF, IL-4, reactivos de cultivo de tejidos; antígeno particulado y similares.

Además de los componentes anteriores, los presentes kits pueden incluir además (en ciertas realizaciones) instrucciones para poner en práctica los presentes métodos. Estas instrucciones pueden estar presentes en los presentes kits en una variedad de formas, una o más de las cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo, una hoja u hojas de papel en las que está impresa la información, en el envase del kit, en un prospecto, y similares. Otra forma más de estas instrucciones es un medio legible por ordenador, por ejemplo, disquete, disco compacto (CD), unidad flash y similares, en el que se ha grabado la información. Otra forma más de estas instrucciones que puede estar presente es la dirección de un sitio web que puede usarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio eliminado.

Utilidad. Los presentes métodos pueden usarse para mejorar una respuesta inmunitaria mediada por células T. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria se dirige hacia una afección en la que las células cancerosas objetivo muestran una expresión aumentada de CD47 con respecto a las células normales del mismo tipo. El agente anti-CD47 inhibe la interacción entre SIRPa (en la phAPC) y CD47 en una célula cancerosa objetivo, aumentando de este modo la fagocitosis de la célula objetivo y la presentación de antígenos de la célula objetivo.

En la invención, la afección es cáncer. Como se ha indicado anteriormente, cualquier cáncer en el que una célula cancerosa exprese un nivel aumentado de CD47 con respecto a una célula no cancerosa del mismo tipo puede tratarse con los presentes métodos.

El término "cáncer", como se usa en la presente, se refiere a una variedad de afecciones provocadas por el crecimiento anormal e incontrolado de células. Las células capaces de provocar cáncer, denominadas "células cancerosas", poseen propiedades características como proliferación incontrolada, inmortalidad, potencial metastásico, crecimiento y tasa de proliferación rápidos y/o ciertas características morfológicas típicas. Un cáncer puede detectarse de cualquiera de varias maneras, que incluyen, pero no se limitan a, la detección de la presencia de un tumor o tumores (por ejemplo, por medios clínicos o radiológicos), el examen de células dentro de un tumor o de otra muestra biológica (por ejemplo, a partir de una biopsia de tejido), midiendo marcadores sanguíneos indicativos de cáncer y detectando un genotipo indicativo de cáncer. Sin embargo, un resultado negativo en uno o más de los métodos de detección anteriores no indica necesariamente la ausencia de cáncer, por ejemplo, un paciente que ha mostrado una respuesta completa a un tratamiento contra el cáncer puede tener todavía cáncer, como se hace evidente por una recaída posterior.

El término "cáncer", como se usa en la presente, incluye carcinomas (por ejemplo, carcinoma in situ, carcinoma invasivo, carcinoma metastásico) y afecciones premalignas, es decir, cambios neomórficos independientes de su origen histológico. El término "cáncer" no se limita a ningún estadio, grado, característica histomorfológica, invasividad, agresividad o malignidad de un tejido afectado o agregación celular. En particular, se incluyen cáncer en estadio 0, cáncer en estadio I, cáncer en estadio II, cáncer en estadio III, cáncer en estadio IV, cáncer de grado I, cáncer de grado II, cáncer de grado III, cáncer maligno y carcinomas primarios.

Los cánceres y las células cancerosas que pueden tratarse incluyen, pero no se limitan a, cánceres hematológicos, incluyendo leucemia, linfoma y mieloma, y cánceres sólidos incluyendo, por ejemplo, tumores del cerebro (glioblastomas, meduloblastoma, astrocitoma, oligodendroglioma, ependimomas), carcinomas, por ejemplo, carcinoma de pulmón, hígado, tiroides, hueso, suprarrenal, bazo, riñón, ganglio linfático, intestino delgado, páncreas, colon, estómago, mama, endometrio, próstata, testículo, ovario, piel, cabeza y cuello y esófago.

En una realización, el cáncer es un cáncer hematológico. En una realización, el cáncer hematológico es una leucemia. En otra realización, el cáncer hematológico es un mieloma. En una realización, el cáncer hematológico es un linfoma.

En una realización, la leucemia se selecciona de leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL) y leucemia mielógena crónica (CML). En una realización, la leucemia es AML. En una realización, la leucemia es ALL. En una realización, la leucemia es CLL. En una realización adicional, la leucemia es CML. En una realización, la célula cancerosa es una célula leucémica, por ejemplo, pero no limitada a, una célula de AML, una célula de ALL, una célula de CLL o una célula de CML.

Los cánceres adecuados incluyen, sin limitación, leucemia; leucemia mieloide aguda (AML); leucemia linfoblástica aguda (ALL); metástasis; enfermedad residual mínima; cánceres de tumores sólidos, por ejemplo, carcinomas de células escamosas de mama, vejiga, colon, ovario, glioblastoma, leiomiosarcoma y cabeza y cuello; etc. Para ver ejemplos, ver: (i) Willingham et al., Proc Natl Acad Sci USA. 24 de abril de 2012; 109(17):6662-7: "La interacción de la proteína reguladora alfa de la señal CD47 (SIRPa) es un objetivo para tumores sólidos humanos"; (ii) Edris et al., Proc Natl Acad Sci USA. 24 de abril de 2012; 109(17):6656-61: "La terapia con anticuerpos dirigida a la proteína CD47 es eficaz en un modelo de leiomiosarcoma metastásico agresivo"; y (iii) Solicitud de Patente de Estados Unidos 20110014119.

Composiciones farmacéuticas. La phAPC cargada o las células T cebadas pueden proporcionarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para uso terapéutico, por ejemplo, para tratamiento en humanos. Las formulaciones terapéuticas que comprenden tales células pueden congelarse o prepararse para la administración con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed. (1980).)), en forma de soluciones acuosas. Las células se formularán, dosificarán y administrarán de manera coherente con las buenas prácticas médicas. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el programa de administración y otros factores conocidos por los practicantes médicos.

Las células pueden administrarse por cualquier medio adecuado, habitualmente parenteral. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa (bolo o goteo lento), intraarterial, intraperitoneal, intratecal o subcutánea.

La forma preferida depende del modo de administración y aplicación terapéutica previstos. Las composiciones también pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, portadores o diluyentes no tóxicos, farmacéuticamente aceptables, que se definen como vehículos usados comúnmente para formular composiciones farmacéuticas para administración animal o humana. El diluyente se selecciona para que no afecte a la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solución salina fisiológica tamponada con fosfato, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros portadores, adyuvantes o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares.

En algunas otras realizaciones más, las composiciones farmacéuticas también pueden incluir macromoléculas grandes, de metabolización lenta como proteínas, polisacáridos como quitosano, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos y copolímeros (como Sepharose™ funcionalizada con látex, agarosa, celulosa y similares), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y agregados de lípidos (como gotitas de aceite o liposomas).

Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecidimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Formulaciones que se usarán para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Típicamente, las composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas o micropartículas como polilactida, poliglicólido o copolímero para un efecto adyuvante mejorado, como se ha analizado anteriormente. Langer, Science 249: 1527, 1990 y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997. Los agentes de esta invención pueden administrarse en forma de una inyección de depósito o preparación de implante que puede formularse de tal manera que permita una liberación sostenida o pulsátil del ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas se formulan generalmente como estériles, sustancialmente isotónicas y en total conformidad con todas las regulaciones de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) de la A U.S. Food and Drug Administration.

EXPERIMENTAL

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo elaborar y usar la presente invención, y no se pretende que limitenr el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni se pretende que representen que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular medio ponderado, la temperatura está en grados centígrados y la presión es igual o cercana a la atmosférica.

Ejemplos

La fagocitosis mediada por anticuerpos anti-CD47 del cáncer por macrófagos ceba una respuesta eficaz de células T antitumorales

La movilización de la respuesta de las células T contra el cáncer tiene el potencial de lograr curas duraderas. Sin embargo, no se sabe cómo aprovechar óptimamente las células presentadoras de antígeno para lograr una respuesta eficaz de células T antitumorales. En este estudio, mostramos que la fagocitosis mediada por anticuerpos anti-CD47 del cáncer por macrófagos puede iniciar una respuesta inmunitaria de células T antitumorales. Usando el sistema de antígeno modelo de ovoalbúmina, la fagocitosis de células cancerosas mediada por anticuerpos anti-CD47 por macrófagos dio como resultado un mayor cebado de las células T OT-I (CD8+), pero no las células T OT-II (CD4+). La respuesta de las células T CD4+ se caracterizó por una reducción de las células T reguladoras Foxp3+. Los macrófagos después de la fagocitosis mediada por anti-CD47 cebó las células T CD8+ para mostrar una función citotóxica in vivo. Esta respuesta protegió a los animales de la exposición al tumor. Concluimos que el tratamiento con anticuerpos anti-CD47 no solo permite la fagocitosis del cáncer por macrófagos, sino que también puede iniciar una respuesta inmunitaria de células T citotóxicas antitumorales.

En este estudio, se probó si la fagocitosis de células cancerosas mediada por anticuerpos anti-CD47 puede facilitar una respuesta inmunitaria de células T antitumorales.

Los macrófagos fagocitan las células cancerosas en presencia de anticuerpo anti-CD47 B6H12. Para seguir la respuesta inmunitaria a un antígeno tumoral modelo, se transfectó la línea celular de cáncer de colon humano DLD1 con un vector lentiviral que expresaba ovoalbúmina citoplasmática y GFP (DLD1-cOVA-GFP) (Figura 7). Las células cancerosas DLD1-cOVA-GFP expresan CD47 y pueden ser reconocidas por tanto mAbs anti-CD47 humanos, clones B6H12 y 2D3 (Figura 7). El anticuerpo anti-CD47 B6H12 bloquea la interacción entre CD47 y SIRPa, mientras que el anticuerpo anti-CD47 2D3 se une a CD47 pero no bloquea su interacción con SIRPa. Los macrófagos fagocitan las células cancerosas DLD1-cOVA-GFP en presencia de mAbs anti-CD47 B6H12, pero no anti-CD472D3, lo que confirma que la fagocitosis mediada por anti-CD47 depende del bloqueo de las interacciones de CD47/SIRPa (Figura 1; Figura 8). La fagocitosis de células cancerosas mediada por anti-CD47 B6H12 lleva a la liberación de macrófagos de citoquinas proinflamatorias. Por ejemplo, los niveles de citoquinas de IL-12p40, TNFa, RANTES y MCP-3 aumentan después de la fagocitosis mediada por B6H12 (Figura 9). Se probó la capacidad de las APC, macrófagos y células dendríticas para determinar la actividad fagocítica en respuesta a mAbs anti-CD47. En comparación con los macrófagos, las células dendríticas no son tan eficaces para fagocitar células cancerosas DLD1-cOVA-GFP en presencia de mAbs anti-CD47 B6H12 (Figura 1). De acuerdo con este resultado, SIRPa, el ligando de CD47, se expresa en niveles altos en macrófagos pero en niveles más bajos en células dendríticas (Figura 10).

Los macrófagos ceban las células T OT-I (CD8+) después de la fagocitosis de las células cancerosas por el anticuerpo anti-CD47 B6H12. Para evaluar la presentación del antígeno a las células T CD8+ después de la fagocitosis mediada por anti-CD47 por macrófagos, se usó un ensayo de dilución de CFSE para medir la respuesta proliferativa de las células T CD8+ específicas de ovoalbúmina (OT-I). Los macrófagos RFP+ se cocultivaron con células cancerosas DLD1 -cOVA-GFP en presencia de IgG, anticuerpos anti-CD47 B6H12 bloqueantes o anti-CD47 2D3 no bloqueantes. Los ganglios linfáticos se extrajeron de ratones transgénicos OT-I (CD8+), marcados con CFSE (0,5 |uM) y células CD8+ enriquecidas por separación magnética. El día 3, se cuantificó el porcentaje de células T OT-I en proliferación en base al porcentaje de células que habían diluido el colorante CFSE (bajo contenido de CFSE). El porcentaje de células T OT-I en proliferación aumentó en presencia de macrófagos que habían fagocitado células cancerosas después del tratamiento con mAb anti-CD47 B6H12 (Figura 2A). Para verificar que la respuesta proliferativa de las células T OT-I era una respuesta específica de antígeno, se permitió a los macrófagos fagocitar células cancerosas DLD1-cOVAGFP frente a DLD1-GFP (esta última sin expresión de ovoalbúmina) en presencia de mAb anti-CD47 B6H12 bloqueante antes de la adición de células T OT-I marcadas con CFSE. Solo se observó un aumento de la proliferación de células T OTI después de la fagocitosis mediada por anti-CD47 de células cancerosas DLD1-cOVA-GFP, pero no células cancerosas DLD1-GFP, lo que indica un efecto específico de antígeno (Figura 2B).

Los macrófagos no ceban las células T OT-II (CD4 ) después de la fagocitosis de las células cancerosas por el anticuerpo anti-CD47 B6H12. Para evaluar la activación de las células T CD4+ después de la fagocitosis mediada por anti-CD47 por macrófagos, se usó un ensayo de dilución de CFSE para medir la respuesta proliferativa de las células T CD4+ específicas de ovoalbúmina (OT-II). Se permitió que los macrófagos fagocitasen células cancerosas DLD1-cOVA-GFP en presencia de mAb anti-CD47 B6H12, y se añadieron células T (CD4+) OT-II marcadas con CFSE a los cultivos. Curiosamente, el porcentaje de células T OT-II en proliferación disminuyó en presencia de macrófagos que habían fagocitado células cancerosas en presencia de mAb anti-CD47 B6H12 bloqueante en comparación con los niveles de referencia (Figura 3A).

Debido a que este resultado podría deberse a la disponibilidad limitada de MHC II (I-Ab+), medimos el porcentaje de macrófagos que expresan MHC II en la superficie celular después de la fagocitosis mediada por anti-CD47 B6H12. Curiosamente, el porcentaje de macrófagos I-Ab+ aumentó después de la fagocitosis de células cancerosas mediada por anti-CD47 B6H12, a pesar de la disminución en la activación de las células T CD4+ (Figura 11) . Para determinar aún más si la disponibilidad de MHC II en macrófagos estaba limitando la respuesta proliferativa a las células T CD4+, se usó IFN-y para regular por incremento los niveles de MHC II de superficie en macrófagos para evaluación en ensayos de presentación de antígeno y fagocitosis. Los macrófagos estimulados con IFN-^y fagocitaron eficazmente el cáncer en presencia de mAb anti-CD47 B6H12 , y la respuesta de las células T CD4+ OT-II todavía estaba disminuida en comparación con el valor de referencia (Figura 3B).

Se produce una reducción de las células T reguladoras Foxp3+ después de que las células T CD4+ se encuentran con macrófagos que experimentan fagocitosisr mediada por anti-CD47 B6H12 de cánce. Para evaluar los efectos funcionales de la fagocitosis mediada por anti-CD47 B6H12 en las células T reguladoras CD4+, cruzamos ratones transgénicos OT-II con ratones informadores Foxp3-GFP para generar ratones transgénicos dobles (Figura 12) . Estos ratones expresan 25% de células Foxp3-GFP+ dentro de la población CD4+ CD25+ y muestran restricción Va2 (Figura 12A). Además, las células T CD4+ Foxp3-GFP+ responden al péptido de ovoalbúmina 323-339 y pueden inducirse a diferenciarse en el contexto de TGF-p y ácido todo-trans-retinoico (Figura 12B). Se cocultivaron macrófagos RFP+ con células cancerosas DLD1-cOVA-GFP en presencia de mAbs de IgG, anti-CD47 B6H12 bloqueantes o anti-CD472D3 no bloqueantes. Al día siguiente, las células T CD4+ se enriquecieron magnéticamente de ratones transgénicos dobles OT-II/Foxp3-GFP+ y se añadieron a los cultivos. Después de 4 días, el porcentaje de células T reguladoras se cuantificó por el porcentaje de células CD4+ Foxp3-GFP+ (Figura 4). Se observó una reducción en las células T reguladoras Foxp3+ después de que las células T CD4+ encontraran macrófagos que fagocitan células cancerosas en presencia de mAb anti-CD47 B6H12.

Después de la fagocitosis mediada por anti-CD47 de células cancerosas, los macrófagos ceban células T (CD8+) OT-I in vivo. Para evaluar los efectos de la fagocitosis mediada por anti-CD47 B6H12 sobre la activación de células T CD8+ in vivo, las células T (CD8+) OT-I (CD45.2) se marcaron con CFSE y se transfirieron adoptivamente a ratones receptores CD45.1 (Figura 5A). Al día siguiente, se cocultivaron macrófagos RFP+ con células tumorales DLD1-cOVA-GFP en presencia de IgG o B6H12 anti-CD47. Los macrófagos se aislaron mediante enriquecimiento magnético y la fagocitosis se verificó mediante análisis FACS antes de la transferencia subcutánea a la almohadilla plantar. Después de 4 días, se analizó el nódulo linfático poplíteo para determinar el porcentaje de células en proliferación (contenido bajo de CFSE) dentro de la compuerta de CD45.2+. Hubo un aumento en la proliferación de células T OT-I en ratones que recibieron macrófagos que tenían cáncer fagocitado por un mecanismo dependiente de anti-CD47 (Figura 5B).

Los macrófagos activan una respuesta de células T CD8 antitumorales in vivo después de la fagocitosis de células cancerosas mediada por anti-CD47. Luego evaluamos los efectos funcionales de la activación de las células T (CD8+) OT-I después de la fagocitosis mediada por anti-CD47 de células cancerosas por macrófagos. Para evaluar la eficiencia de destrucción de células T CD8+ de los objetivos que presentan péptidos de ovoalbúmina, se aislaron células T CD8+ de ratones transgénicos OT I y por vía intravenosa se transfirieron a ratones receptores (Figura 6A). Los macrófagos de RFP+ se cocultivaron con células cancerosas DLD1-cOVA-GFP in vitro en presencia de mAbs anti-CD47 B6H12 o de IgG. Después de una incubación de 2 horas, los macrófagos se aislaron y se inyectaron en la almohadilla plantar. Después de cuatro días, los ratones se expusieron a células objetivo (esplenocitos CD45.1) para evaluar la actividad citotóxica. Los esplenocitos con CFSE alta se pulsaron con péptido restringido de clase I de OVA 1 uM (SIINFEKL) para convertirlos en objetivos para las células T citotóxicas OT-I, y luego se mezclaron en una proporción 1:1 con células con bajo contenido de CFSE no pulsadas con péptidos antes de transferencia intravenosa. El análisis de los ganglios linfáticos de drenaje 16 horas después mostró un aumento de la muerte celular de linfocitos con CFSEalto pulsados con péptidos en ratones que recibieron macrófagos que fagocitaron células cancerosas con mAb anti-CD47 B6H12 (Figura 6A).

Luego, se evaluó la capacidad de las células T efectoras CD8+ para cebar una respuesta inmunitaria antitumoral. Se transfirieron células T CD8+ de ratones OT-I a animales receptores (Figura 6B). Los macrófagos se cocultivaron con células cancerosas DLD1-cOVA-GFP in vitro en presencia de mAbs anti-CD47 B6H12 o de IgG, y luego los macrófagos se transfirieron a la almohadilla plantar los días 1 y 10. Los animales se desafiaron con células cancerosas EG.7 (EL4 que expresa ovoalbúmina) el día 14, y se monitorizó el crecimiento del tumor a lo largo del tiempo. Los ratones que recibieron macrófagos que fagocitaron células cancerosas con mAb anti-CD47 B6H12 demostraron protección frente al desafío tumoral (Figura 6B).

La presente invención se basa en un examen del papel de la fagocitosis habilitada por anti-CD47 sobre la presentación de antígenos de péptidos tumorales para células T del sistema inmunitario adaptativo. Está demostrado que CD47 sirve como un "manto de invisibilidad" tanto para la inmunidad innata como para la adaptativa. El tratamiento con mAbs anti-CD47 bloqueantes llevó a respuestas inmunitarias adaptativas de células T, lo que proporcionó un mecanismo de acción adicional para los anticuerpos anti-CD47.

Se usaron clones de células T (CD8+) OT-I y (CD4+) OTII específicos de ovoalbúmina para seguir los resultados de la presentación de antígenos por macrófagos después de la fagocitosis mediada por anti-CD47 de células cancerosas manipuladas para expresar ovoalbúmina citoplasmática. Usando ensayos in vitro e in vivo, mostramos que los antígenos se presentan eficazmente a las células T CD8+. Por el contrario, el nivel de respuesta proliferativa de las células T CD4+ OT-II a los macrófagos cargados se redujo en comparación con los niveles de referencia. El nivel de referencia de la proliferación de CD8+ OT-I y la proliferación de CD4+ OT-II fue del 20% (Figura 2 y Figura 3), probablemente debido a la ovoalbúmina liberada de las células cancerosas que se vuelven endocitosadas o pinocitadas por los macrófagos, y luego se procesan para su presentación en las vías MHC I y MHC II.

Juntos, estos resultados demuestran que la fagocitosis mediada por anti-CD47 de células cancerosas da como resultado señales negativas presentadas a las células T CD4+ y señales positivas presentadas a las células T CD8+. Además, la respuesta de las células T CD4+ se caracterizó por una reducción de las células T reguladoras. Esto puede atribuirse a una proliferación disminuida de células T reguladoras en respuesta al péptido o debido a una diferenciación de células T reguladoras menos eficaz. El cebado in vivo de una respuesta de células T antitumorales por macrófagos después de la fagocitosis mediada por anti-CD47 del cáncer protege a los ratones de la exposición al tumor. Los mAbs anti-CD47 representan una nueva estrategia terapéutica para superar la contribución de las células T reguladoras a la evasión inmune por parte del cáncer e iniciar una respuesta eficaz de las células T citotóxicas antitumorales.

En este sistema, los macrófagos son más eficaces que las células dendríticas para fagocitar el cáncer en respuesta al anticuerpo anti-CD47. Esto puede deberse a los niveles más altos de SIRPa que se encuentran en los macrófagos en comparación con DC o debido a una fagocitosis más eficiente de células completas por parte de los macrófagos. Debido a que se ha informado que los subconjuntos de células dendríticas varían en sus niveles de expresión de SIRPa, es posible que otros subconjuntos de células dendríticas puedan fagocitar el cáncer de manera más eficaz en respuesta al anticuerpo anti-CD47 in vivo. Sin embargo, mostramos que tanto los macrófagos como las células dendríticas ceban una respuesta de células T CD8+ después de la fagocitosis mediada por anti-CD47. Las funciones detalladas de las DC y los macrófagos específicos de tejido justifican una mayor investigación tanto en sistemas humanos como en ratones.

Estos descubrimientos demuestran una nueva función de los macrófagos en la presentación de antígenos tumorales a las células T CD8+ y en la mediación de la inmunidad antitumoral. La implicación del sistema inmunitario tanto innato como adaptativo en el mecanismo de acción del anticuerpo anti-CD47 tiene implicaciones clínicas. El uso terapéutico con éxito del anticuerpo podría no requerir que los macrófagos asociados a tumores engullan todas las células cancerosas, y puede implicar a las células T CD8+ que matan a las células cancerosas a las que no pueden acceder los macrófagos. Al diseñar protocolos de ensayos clínicos para probar la terapia anti-CD47 en pacientes, la monitorización inmunológica de las células T será importante para comprender la respuesta clínica al tratamiento y los resultados clínicos. Por último, el papel de las células T debe tenerse en cuenta al diseñar terapias de combinación que impliquen anticuerpos anti-CD47. Los mABs anti-CD47 encuentran uso clínico como vacuna contra el cáncer en combinación con terapia de células T adoptiva o anticuerpos activadores de células T para potenciar una respuesta inmune adaptativa contra antígenos tumorales.

Concluimos que la fagocitosis mediada por anti-CD47 del cáncer no solo funciona para depurar directamente las células cancerosas, sino que también inicia una respuesta de células T antitumorales para eliminar los tumores. Los pacientes que reciben terapia anti-CD47 pueden beneficiarse de las respuestas inmunitarias tanto innatas como adaptativas contra el cáncer.

Materiales y métodos

Ratones. Los ratones se criaron y mantuvieron en el Centro de Investigación para Animales de la Universidad de Stanford de acuerdo con el Panel Administrativo sobre Cuidado de Animales de Laboratorio, incluyendo ratones C57BL/Ka (CD45.2), C57BL/Ka (CD45.1) y C57BL/Ka Rosa26-mRFP1. Todos los animales se alojaron en microinsuladores estériles y se les dio agua y comida para roedores ad libitum. Los ratones transgénicos OT-I TCR, los ratones transgénicos OT-II TCR y los ratones Foxp3-GFP se adquirieron del laboratorio de Jackson.

Biología Molecular. La ovoalbúmina citoplasmática se clonó a partir de pCI-neo-cOVA (plásmido 25097, AddGene) y se transportó al vector lentiviral pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP (System Biosciences) usando sitios de restricción EcoRI y BamHI. La producción y concentración de lentivirales se logró usando protocolos estándar.

Generación de macrófagos y células dendríticas. Se aislaron células de médula ósea completas de ratones C57BL/Ka (CD45.2) o C57BL/Ka Rosa26-mRFP1. Los macrófagos se generaron mediante la incubación de la médula ósea completa en MCSF 10 ng/ml durante 7 días y recogiendo la fracción adherente. Se generaron células dendríticas en GM-CSF (1000 U/ml), se lavaron e intercambiaron con medio fresco los días 2 y 4. Las células no adherentes se volvieron a sembrar en placas el día 6 y se recogieron el día 7.

Ensayo de fagocitosis in vitro. Para ensayo in vitro de la fagocitosis, se sembraron en placas 2 x 104 macrófagos o células dendríticas por pocillo en una placa de baja adherencia de 96 pocillos Ultra, junto con 2 x 104 células cancerosas (DLD1-cova-GFP) en medio RPMI libre de suero. Se añadieron los anticuerpos indicados (10 gg/ml) y se incubaron durante 4 h a 37°. Los macrófagos se lavaron repetidamente dos veces y se analizaron usando un analizador BD LSR Fortessa. El % de fagocitosis se calculó como el % de células GFP+ dentro de los macrófagos RFP+ o macrófagos F4/80+. Para ensayos de transferencia in vivo, se cocultivaron 5 x 105 macrófagos y células cancerosas en presencia de mAb de IgG1 de control o anti-CD47 B6H12 (10 gg/ml) y se incubaron durante 2 horas. Luego, los macrófagos se separaron de los cultivos durante perlas magnéticas anti-Mac-1 (Miltenyi Biotec).

Ensayo de presentación de antígenos. Para ensayos de presentación de antígenos in vitro, se cocultivaron 104 macrófagos con un número igual de células de cáncer de DLD1-cova-GFP durante la noche en medio RPMI libre de suero. Al día siguiente, se añadió a los cultivos un volumen igual de RPMI FCS al 20%. Se recogieron ganglios linfáticos periféricos de ratones transgénicos OT-I u OT-II TCR y se marcaron con CFSE 0,5 mM (Molecular Probes). Las células T se aislaron usando anticuerpos anti-CD8 o anti-CD4 biotinilados, seguido de enriquecimiento con perlas magnéticas anti-biotina (Miltenyi Biotec). Se añadieron 5 x 104 células T a los cultivos y se analizaron en el día 3 (para células T OT-I) o el día 4 (para células OT-II T). Para ensayos de presentación de antígenos in vivo, se transfirieron adoptivamente i.v. 2 x 106 células T OT-I marcadas con CFSE (CD45.2) a ratones receptores (CD45.1). Los macrófagos se aislaron del cocultivo con células cancerosas como se ha descrito anteriormente y se inyectaron en la almohadilla plantar de los ratones. Los ganglios linfáticos poplíteos se analizaron el día 4 para determinar la dilución de CFSE dentro de las células CD45.2+.

Preparación de anticuerpos, análisis de citometría de flujo y clasificación celular. Se obtuvo mAb anti-CD47 antihumano de ratón B6H12 (lgG1) de Bio-X-Cell. Se obtuvieron mAb anti-CD47 antihumano 2D3 (lgG 1) y anticuerpos de IgG1 de ratón de ratón de ebiosciences. Para verificar la unión de anti-CD47 B6H12 y 2D3 al cáncer DLD1-cOVA-GFP, las células se marcaron con una concentración de saturación de un anticuerpo anti-CD47 1:1, seguido de IgG antirratón de burro conjugado con PE (H&L) (Ebiosciences). Los datos se adquirieron usando un analizador BD LSR Fortessa y se analizaron con el software FlowJo.

Ensayo de muerte celular in vivo. Brevemente, se marcaron esplenocitos de ratones C57BL/Ka (CD45.1) con CFSE 10 gM (alto contenido de CFSE) y CFSE 1 gM (bajo contenido de CFSE). Luego, se pulsaron esplenocitos con alto contenido de CFSE en una placa de 6 pocillos con péptido SIINFEKL 1 gM durante 1 hora. Luego las células se mezclaron en una proporción 1:1 con células con bajo contenido de CFSE no pulsadas con péptidos antes de la transferencia iv. Para tener en cuenta la variación en la proporción alto/bajo contenido de CFSE en ausencia de lisis específica de péptido, los ratones de control recibieron esplenocitos con alto contenido de CFSE no pulsados con péptido SIINFEKL antes de mezclarlos en una proporción 1:1 con esplenocitos con bajo contenido de CFSE y transferirlos a ratones. Los ganglios linfáticos de drenaje se analizaron 16 horas después. El porcentaje de citotoxicidad se calculó como (1 -%CFSEalto/%CFSEbajo) normalizado a la proporción en ratones de control que recibieron los esplenocitos no pulsados con péptido SIINFEKL.

Desafío tumoral. Se transfirieron adoptivamente 1 x 106 células OT-I T enriquecidas en CD8 iv en ratones C57BL/Ka receptores. Los macrófagos de ratones C57BL/Ka singénicos se cocultivaron con cáncer DLD1-cOVA-GFP como se ha descrito con anteriorid, y luego se aislaron mediante enriquecimiento magnético y se inyectaron en la almohadilla plantar de los ratones. Se usó la línea de células tumorales E.G7 (células EL.4 que expresan el ADNc de OVA de pollo) para la exposición a tumores de ratones (ATCC). Se inyectaron s.c. 1 x 105 células E.G7 en la extremidad trasera derecha de los ratones en una proporción 1:1 con matrigel regular. El tamaño del tumor se midió todos los días usando calibradores finos y el volumen se calculó en base a la longitud * anchura * altura * n/6.

Ensayo Luminex. Los macrófagos se cocultivaron con el mismo número de células cancerosas DLD1-cOVAGFP durante la noche en medio RPMI libre de suero. Al día siguiente, se recogieron los sobrenadantes y se enviaron al Centro de Monitorización Inmunológica Humano de Stanford para el análisis de citoquinas mediante el ensayo de 26-plex luminex de ratón.

Ejemplo 2

Generación de células presentadoras de antígenos humanas

Macrófagos humanos. PBMC o monocitos de leucoforesis (frescos o congelados) (de células CD14+ por selección positiva o negativa, adherencia plástica, Percoll, clasificación de flujo, elutriación centrífuga a contraflujo). Diferenciar en medio solo o M-CSF humano recombinante para generar macrófagos derivados de monocitos, como describen Harding et al, Choosing and Preparing Antigen-Presenting Cells. Current Protocols in Imunology. 2010, 16.1.1-16.1.30.

Células dendríticas humanas. Cultivar monocitos in vitro en presencia de GM-CSF IL-4 para generar CD1 a+ cDC de tipo dérmico, como se describe por (Merad et al, Annu Rev Immunol 2013. 31: 563-604).

Células dendríticas humanas. Cultivar progenitores hematopoyéticos CD34+ en presencia de Flt3L y trombopoyetina para generar pDC, BDCA3+ cDC, BDCA1+ cDC como se describe por (Merad et al, Annu Rev Immunol 2013. 31:563-604). Alternativamente, cultivar en presencia de GM-CSF TNFalfa para generar células similares a LC y células similares a DC dérmicas; o en presencia de GM-CSF TNFalfa TGF-beta para generar células similares a LC. Los monocitos pueden cultivarse con GM-CSF IL-4 TGF-beta para generar células similares a LC.

Células dendríticas humanas. Las PBMC o el paquete de leucoforesis enriquecido con leucocitos (fresco, no congelado) pueden enriquecerse con un kit de enriquecimiento de perlas anti-CD1c (comercial) después del agotamiento de las células B para proporcionar CD1c+ (BDCA1+) DC como se describe por Harding et al, Choosing and Preparing Antigen-Presenting Cells. Current Protocols in Imunology. 2010, 16.1.1-16.1.30. Alternativamente, kit de enriquecimiento de perlas anti-CD141 (comercial) para generar CD141+ (BDCA3 ) DC; o cultivo con GM-CSF IL-4 (puede activarse adicionalmente mediante ligando de TNF-alfa o TLR) para generar DC derivadas de monocitos.

Las PBMC pueden adherirse al plástico durante una hora, luego se pueden cultivar en GM-CSF IL-4 durante 5 días (pueden madurarse adicionalmente en IL-1b, IL-6, TNF-alfa, PGE2) como se describe por O'Neill et Alabama. Current Protocols in Immunology, Differentiation of Peripheral Blood Monocytes into Dendritic Cells, 2005, 22F4.1-22F4.9.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para inducir una respuesta inmunitaria a una célula tumoral de mamífero que expresa CD47, el método comprendiendo:

(a) poner en contacto un macrófago o célula dendrítica con una célula tumoral de mamífero que expresa CD47 en presencia de una dosis eficaz de un agente anti-CD47 in vitro para generar un macrófago o célula dendrítica cargados; y

(b) poner en contacto una población de células T con el macrófago o la célula dendrítica cargados in vitro; en donde la población de células T genera una respuesta específica para la célula tumoral de mamífero que expresa CD47.

2. Un macrófago cargado para su uso en un método de tratamiento del cáncer, en donde el método comprende: generar el macrófago cargado poniendo en contacto un macrófago con una célula tumoral de mamífero que expresa CD47 en presencia de una dosis eficaz de un agente anti-CD47 in vitro, y

poner en contacto una población de células T con el macrófago cargado in vivo; en donde la población de células T genera una respuesta específica para la célula tumoral de mamífero que expresa CD47.

3. El método in vitro de la reivindicación 1, o el macrófago cargado para el uso de la reivindicación 2, en donde el agente anti-CD47 se une específicamente a CD47.

4. El método in vitro, o el macrófago cargado para el uso de la reivindicación 3, en donde el agente anti-CD47 es un anticuerpo.

5. El método in vitro, o el macrófago cargado para el uso de la reivindicación 3, en donde el agente anti-CD47 es un reactivo de SIRPa.

6. El método in vitro de la reivindicación 1, o el macrófago cargado para el uso de la reivindicación 2, en donde el agente anti-CD47 se une específicamente a SIRPa y no activa SIRPa.

7. El método in vitro, o el macrófago cargado para el uso de la reivindicación 6, en donde el agente anti-CD47 es un anticuerpo.

8. El método in vitro, o el macrófago cargado para el uso de la reivindicación 4 o la reivindicación 7, en donde el anticuerpo es un anticuerpo completamente humano, humanizado o quimérico.

9. El método in vitro, o el macrófago cargado para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 4, 7 y 8, en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, opcionalmente en donde el fragmento de anticuerpo es:

(a) un fragmento Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 o Fv; o

(b) un diacuerpo.

10. El método in vitro de la reivindicación 1, o el macrófago cargado para el uso de la reivindicación 2, en donde el agente anti-CD47 es un polipéptido de CD47 soluble.

11. El método in vitro de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o el macrófago cargado para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en donde la célula tumoral de mamífero que expresa CD47 es una célula de carcinoma, glioma, sarcoma, melanoma, mieloma, leucemia o linfoma.

12. El método in vitro, o el macrófago cargado para el uso de la reivindicación 11, en donde la célula tumoral de mamífero que expresa CD47 es:

(a) una célula de AML, CML, ALL, NHL o mieloma múltiple, o

(b) una célula de tumor sólido, como una célula de cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, glioma o sarcoma.

13. El método in vitro, o el macrófago para el uso de la reivindicación 12, en donde la célula tumoral de mamífero que expresa CD47 es una célula de cáncer de colon.