ES2822561T3 - Direccionamiento a enfermedad por aneurisma modulando las vías de fagocitosis - Google Patents

Abstract

Un agente que aumenta la eferocitosis y/o la fagocitosis de los componentes de una pared vascular enferma para su uso en un método para tratar a un sujeto con enfermedad por aneurisma; en donde el aneurisma se previene o estabiliza, en donde el agente es un agente anti-Cd47 que reduce la unión de CD47 en una célula apoptópica a la proteína alfa reguladora de la señal (SIRPα) en una célula fagocítica, y en donde el agente anti-CD47 se selecciona de un anticuerpo anti-CD47, un anticuerpo anti-SIRPα, un polipéptido de SIRPα soluble o un polipéptido de SIRPα soluble unido a un dominio de inmunoglobulina.

Description

DESCRIPCIÓN

Direccionamiento a enfermedad por aneurisma modulando las vías de fagocitosis

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Puede producirse un defecto vascular grave cuando un área de la pared del vaso debilitada provoca que un abultamiento, o burbuja, sobresalga en dirección radial del vaso. Tales aneurismas pueden producirse en varias posiciones dentro de la vasculatura. Los aneurismas aórticos abdominales se desarrollan con mayor frecuencia en el segmento relativamente largo de la aorta entre las arterias renales y la bifurcación de la aorta en las arterias ilíacas derecha e izquierda. Los aneurismas aórticos abdominales se agrandan progresivamente a tasas variables e impredecibles, y a medida que lo hacen, la pared del aneurisma implicado se debilita y adelgaza, y finalmente se rompe. La ruptura es relativamente poco frecuente en los aneurismas aórticos abdominales de menos de cinco centímetros de diámetro transversal máximo, pero el riesgo aumenta con el aumento del tamaño. La ruptura de los aneurismas aórticos abdominales ha sido responsable de aproximadamente 15.000 muertes por año en los Estados Unidos.

La reparación endovascular de aneurismas aórticos ha demostrado ser eficaz para prevenir la ruptura de aneurismas aórticos abdominales y torácicos y ha reducido la morbilidad en comparación con la reparación quirúrgica abierta. En consecuencia, la reparación endovascular se ha extendido ahora a muchos pacientes que no fueron considerados candidatos para la reparación de aneurismas en el pasado. Sin embargo, a pesar de los claros beneficios de la cirugía endovascular en el período perioperatorio temprano, existen preocupaciones importantes con respecto a la estabilidad a largo plazo y la durabilidad de la reparación endovascular. A pesar de estos avances quirúrgicos, la enfermedad del aneurisma sigue siendo una enfermedad mortal importante y no se ha demostrado de manera convincente que ninguna terapia médica disminuya la progresión del aneurisma o prevenga la ruptura.

Los métodos para tratar y prevenir la enfermedad por aneurisma son de gran interés y se abordan en la presente invención.

Publicaciones

Las publicaciones de patentes relacionadas con aneurismas aórticos incluyen, entre otras, USRE38146 "Method and apparatus for bilateral intra-aortic bypass"; US5578072, "Aortic graft and apparatus for repairing an abdominal aortic aneurysm"; US5522880, "Method for repairing an abdominal aortic aneurysm"; US5489295, "Endovascular graft having bifurcation and apparatus and method for deploying the same"; US6475466, "Methods for treating endoleaks during endovascular repair of abdominal aortic aneurysms"; US6409756, "Endovascular aortic graft"; US6767359 "Prosthesis for the repair of thoracic or abdominal aortic aneurysms and method therefore"; US5643208, "Balloon device for use in repairing an abdominal aortic aneurysm"; US4577631 , "Aneurysm repair apparatus and method"; US71 12217, "Biluminal endovascular graft system"; US7004964, "Apparatus and method for deployment of an endoluminal device"; US6814748, "Intraluminal grafting system"; US6303100, "Methods for inhibiting the formation of potential endoleaks associated with endovascular repair of abdominal aortic aneurysms"; US5681346, "Expandable stent forming projecting barbs and method for deploying"; US5207695, "Aortic graft, implantation device, and method for repairing aortic aneurysm"; US4313231 , "Vascular prosthesis"

La US 2008/267909 describe terapia de mejora de fagocitos para la aterosclerosis. La WO 2013/109752 describe reactivos SIRP-alfa de alta afinidad. La WO 20015/041978 describe la modulación de vías de eferocitosis para el tratamiento de la enfermedad aterosclerótica. Leeper et al. (2013) Arteiscler Thromb Vasc Biol. 2013;33:e1-e10 analiza como la pérdida de DCKN2B promueve la apoptosis de células del músculo liso dependiente de p53 y aneurisma. La publicación de patente en trámite WO 2015/041987 analiza el papel de la modulación de la eferocitosis en la enfermedad aterosclerótica.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un agente que aumenta la eferocitosis y/o la fagocitosis de componentes de una pared del vaso enferma para su uso en un método para tratar a un sujeto para la enfermedad del aneurisma, en donde el aneurisma se previene o estabiliza,

en donde el agente es un agente anti-Cd47 que reduce la unión de CD47 en una célula apoptópica a SIRPa en una célula fagocítica,

y en donde el agente anti-CD47 se selecciona de un anticuerpo anti-CD47, un anticuerpo anti-SIRPa, un polipéptido de SIRPa soluble o un polipéptido de SIRPa soluble unido a un dominio de inmunoglobulina.

Se divulgan métodos para la modulación de las rutas de eferocitosis/fagocitosis (a las que se hace referencia en la presente como rutas de EP) para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad por aneurisma en un sujeto. Mediante la administración de un agente que se dirige a la ruta de EP que incluye CDKN2B, calreticulina y CD47, la ruta de EP puede normalizarse y reducir el riesgo de aneurisma. La enfermedad por aneurisma, como se usa en la presente, incluye, sin limitación, aneurismas aórticos abdominales (enfermedad AAA), aneurisma aórtico torácico, aneurismas intracraneales (aneurismas 'de bayas'), dilatación post-estenótica, disección aórtica, etc. Los aneurismas aórticos abdominales son de particular interés.

En algunas realizaciones, el sujeto es homocigoto o heterocigoto para un alelo de riesgo 9p21. En algunas de tales realizaciones, los métodos incluyen pruebas genéticas del sujeto para detectar la presencia de un alelo de riesgo 9p21. En otras de tales realizaciones, al sujeto se le ha diagnosticado anteriormente la presencia de un alelo de riesgo 9p21. Tales métodos de diagnóstico pueden incluir, sin limitación, analizar una muestra de ADN genómico del individuo para detectar la presencia de secuencias del cromosoma humano 9p21 asociado con el riesgo de CAD, incluyendo los SNP asociados con el locus de riesgo.

En algunas realizaciones, al sujeto se le ha diagnosticado un aneurisma, por ejemplo, un aneurisma mayor que el diámetro normal de la arteria. Un aneurisma aórtico mayor que el diámetro normal puede ser, por ejemplo, de más de aproximadamente 2 cm de diámetro de la aorta, y puede ser menor de aproximadamente el tamaño de un aneurisma para el que está indicada la cirugía, por ejemplo, menos de aproximadamente 6 cm de diámetro, menos d aproximadamente 5,5 cm de diámetro, menos de aproximadamente 5 cm de diámetro. El tratamiento puede iniciarse cuando un aneurisma incluyendo, entre otros, un aneurisma aórtico, es mayor de aproximadamente 2 cm, mayor de aproximadamente 2,5 cm, mayor de aproximadamente 3 cm, mayor de aproximadamente 3,5 cm, mayor de aproximadamente 4 cm, mayor de aproximadamente 4,5 cm, y puede ser menor de aproximadamente 6 cm, menor de aproximadamente 5,5 cm, menor de aproximadamente 5 cm de diámetro. Los métodos de la divulgación también pueden incluir monitorizar un aneurisma conocido a través de técnicas de imagenología durante el tratamiento para cambios en el tamaño.

En los métodos de la divulgación, un agente de EP que aumenta la fagocitosis de los componentes del vaso sanguíneo enfermo, incluyendo la fagocitosis de macrófagos y la eferocitosis de las células apoptóticas del músculo liso, se administra al sujeto en una dosis y durante un período de tiempo efectivo para estabilizar, prevenir o reducir la enfermedad por aneurisma en el individuo. Los objetivos moleculares para aumentar la eferocitosis y la fagocitosis de macrófagos incluyen, sin limitación, agentes que activan o aumentan la expresión de CDKN2B o Retinoblastoma (Rb), o disminuyen la expresión de E2F4; agentes que aumentan la actividad o expresión de calreticulina; agentes que bloquean la interacción de CD47 y SIRPa; y similares. Los agentes pueden potenciar la expresión de CDKN2B en células cardiovasculares, incluyendo, por ejemplo, células de músculo liso. Tales agentes pueden incluir, por ejemplo, palbociclib; 5-aza-2'- desoxicitidina en ausencia o presencia de fenilbutirato; etc.

El agente que aumenta la actividad de la ruta de EP reduce la interacción de CD47 y SIRPa, a tal agente puede hacerse referencia en la presente como un agente anti-CD47. En algunas realizaciones, tales agentes no interfieren con la interacción entre CD47 y trombospondina, el agente anti-CD47 se selecciona de un anticuerpo anti-CD47, un anticuerpo anti-SIRPa, un polipéptido de SIRPa soluble o un polipéptido de SIRPa soluble unido a un dominio de inmunoglobulina. Los agentes anti-CD47 preferidos incluyen SIRPa soluble, por ejemplo un SIRPa soluble de alta afinidad; anticuerpos anti-CD47, anticuerpos anti-SIRPa, etc.

Un agente de EP puede imitar o mejorar la calreticulina. Los ''miméticos'' y "agonistas" de calreticulina incluyen moléculas que funcionan de manera similar a, o potencian, la CRT al unirse y activar el receptor de LRP. Las moléculas útiles como miméticos de CRT incluyen derivados, variantes y fragmentos biológicamente activos de CRT de origen natural. Las moléculas útiles como agonistas incluyen anticuerpos y otros agentes que actúan para mejorar la actividad profagocítica de la CRT.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere al uso de un agente estimulante de EP en la fabricación de un medicamento para estabilizar, prevenir o reducir la enfermedad por aneurisma, en donde el medicamento se administra a un individuo que tiene o está en riesgo de tener enfermedad por aneurisma.

Otro aspecto más de la presente divulgación proporciona un kit para estabilizar, prevenir o reducir la enfermedad por aneurisma. El kit incluye un agente estimulante de la fagocitosis, en una cantidad suficiente para estabilizar, prevenir o reducir la enfermedad por aneurisma. El kit también puede incluir reactivos para genotipar en el cromosoma humano 9p21, incluyendo los alelos de rs10757278 y rs1333049. El kit también puede incluir instrucciones de uso, reactivos para monitorizar la enfermedad del aneurisma y similares.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Descripción general del estudio de prevención de la aterosclerosis, que muestra la línea de tiempo para una inyección de Ab anti-Cd47, medición de la presión arterial y administración de una dieta alta en grasas (arriba). Cambios de la presión arterial a lo largo del tiempo durante el período de tratamiento (abajo). Figura 2. Las aortas explantadas representativas de ratones tratados con Ab de control (IgG) revelan una alta incidencia de aneurismas después de la infusión de angiotensina. El recuadro revela un sistema de puntuación de aneurisma (0-4, donde 0 no tiene aneurisma y 4 representa un ratón que murió de rotura aórtica durante el período de tratamiento).

Figura 3. Las aortas explantadas representativas de ratones tratados con Ab antiCD47 (MIAP410) revelan una baja incidencia de aneurismas después de la infusión de angiotensina. El recuadro revela un sistema de puntuación de aneurisma (0-4, donde 0 no tiene aneurisma y 4 representa un ratón que murió de rotura aórtica durante el período de tratamiento).

Figura 4. La comparación de los ratones tratados con Ab de control (IgG) y Ab antiCD47 (MIAP410) revela que el tratamiento con Ab antiCD47 previene el desarrollo de aneurismas (parte superior izquierda), reduce el tamaño del aneurisma (parte superior derecha) y reduce la gravedad del aneurisma (parte inferior, la escala es como en paneles anteriores). Todas las diferencias son significativas con un valor de p<0,01.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a métodos para tratar a un sujeto para la enfermedad por aneurisma, mediante la administración de un agente que aumenta la fagocitosis del tejido vascular enfermo, incluyendo la eferocitosis y/o la fagocitosis de las células apoptóticas del músculo liso, que en la presente pueden ser referidas como agente de EP. En algunas realizaciones, el sujeto es homocigoto o heterocigoto para un alelo de riesgo 9p21. En algunas realizaciones, el agente de EP proporciona una o más de las siguientes actividades: reduce la unión de CD47 a SIRPa; aumenta o imita la actividad de la calreticulina, incluyendo la unión de calreticulina a LRP; o aumenta la expresión de CDKN2B.

El aneurisma es una dilatación en la pared de una arteria, como la aorta. Los aneurismas pueden desarrollarse en cualquier parte de la aorta, incluyendo la aorta abdominal y la aorta torácica. Los aneurismas también pueden desarrollarse en arterias poplíteas, arterias femorales, arterias carótidas, arterias cerebrales y arterias coronarias. Los aneurismas pueden ser saculares o fusiformes. Los aneurismas aórticos abdominales son una manifestación importante de la aterosclerosis, un proceso de enfermedad que afecta a todo el sistema vascular. A menudo se desarrollan trombos en el aneurisma porque el flujo sanguíneo dentro del aneurisma es lento. El coágulo puede extenderse a lo largo de toda la pared del aneurisma.

La presencia de aneurismas puede ser difícil de diagnosticar, ya que muchas personas con aneurismas no tienen síntomas y se diagnostican por casualidad cuando se realiza un examen físico de rutina o un procedimiento de imagenología. Habitualmente, la ultrasonografía puede mostrar claramente el tamaño de un aneurisma. Si se detecta un aneurisma, puede repetirse la ultrasonografía cada pocos meses para determinar si el aneurisma se está agrandando y con qué rapidez. La tomografía computarizada (TC) del abdomen, particularmente si se realiza después de inyectar un tinte radioopaco por vía intravenosa, puede determinar el tamaño y la forma de un aneurisma con mayor precisión que la ultrasonografía. La imagenología por resonancia magnética (MRI) también es precisa.

Los aneurismas que son más anchos de aproximadamente 5 cm pueden romperse, y a menudo se tratan insertando un injerto sintético para reparar el aneurisma. Por lo general, con el injerto de stent endovascular, se guía un catéter que contiene el injerto de stent sobre el cable y se coloca dentro del aneurisma. Luego se abre el injerto de stent, formando un canal estable para el flujo sanguíneo. Si las arterias ilíacas están involucradas, el injerto debe extenderse para incluirlas. Si el aneurisma se extiende sobre las arterias renales, las arterias renales deben reimplantarse en el injerto o deben crearse injertos de derivación. La ruptura o la amenaza de ruptura de un aneurisma aórtico abdominal requiere una cirugía abierta de emergencia o la colocación de un injerto de stent endovascular. Los aneurismas aórticos rotos abdominales no tratados son siempre fatales.

La reparación quirúrgica de aneurismas de <5 cm no parece aumentar la supervivencia, lo que puede deberse en parte a las complicaciones de la cirugía. Sin embargo, tales aneurismas deben monitorizarse con una ultrasonografía cada 6 a 12 meses para una expansión que justifique el tratamiento. El control de los factores de riesgo aterosclerótico es importante y puede incluir el tratamiento por los métodos divulgados en la presente. Si un aneurisma de tamaño pequeño o moderado llega a ser de >5,5 cm y el riesgo de complicaciones perioperatorias es menor que el riesgo estimado de ruptura, puede estar indicada la reparación quirúrgica de AAA.

La cirugía se realiza típicamente a través de una incisión abdominal, donde se corta el saco del aneurisma y se cose un tubo sintético en su lugar para conectar los 2 extremos de la aorta de tamaño más normal. A veces, la reparación tiene que incluir una o ambas ramas terminales de la aorta (arterias ilíacas) que también pueden haberse vuelto aneurismáticas. También puede requerirse la derivación de ramas aórticas estrechas o bloqueadas a los riñones u órganos abdominales. Después de que el tubo se ha conectado en ambos extremos, la pared del aneurisma se enrolla alrededor del tubo. Las posibles complicaciones de dicha cirugía incluyen sangrado, infección y daño renal o intestinal. Además, debido a que la enfermedad de la arteria coronaria es tan común entre los pacientes con AAA, una preocupación importante es el riesgo de problemas cardíacos postoperatorios. Como alternativa, puede colocarse un stent a través de una arteria, por ejemplo la arteria femoral. El stent cubre todo el aneurisma, y las paredes de los vasos eventualmente se encogen alrededor del stent. Por ejemplo, ver Blum et al. (1997) N Engl J Med. 336: 13-20.

Riesgo 9p21. Como se usa en la presente, el término "un individuo que lleva por lo menos un factor de riesgo 9p21" se refiere a humanos en los que uno o más alelos de riesgo en el locus 9p21 están presentes en el genoma. Se ha demostrado que tales individuos tienen un mayor riesgo de: infarto de miocardio de inicio temprano, aneurisma aórtico abdominal, ataque cerebral, enfermedad arterial periférica e infarto de miocardio/enfermedad coronaria. Este riesgo es independiente de los factores de riesgo tradicionales, como diabetes, hipertensión, colesterol y obesidad. Ver, por ejemplo, Helgadottir et al. Science. 2007; 316 (5830): 1491-1493; Helgadottir et al. Nat Genet. 2008; 40(2): 217-224; Palomaki et al. JAMA 2010; 303(7):648-656; y Roberts et al. Curr Opin Cardiol.

2008;23:629-633.

El locus 9p21 está en el LD estrecho (desequilibrio de enlace), y se ha demostrado que una serie de marcadores de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) son útiles en el diagnóstico. Los SNP representativos incluyen, sin limitación, rs10757278; rs3217992; rs4977574; rs1333049; rs10757274; rs2383206; rs2383207; Rs3217989; rs1333040; rs2383207; rs101 16277; rs7044859; rs1292136; rs7865618; rs1333045; rs9632884; rs10757272; rs4977574; rs2891168; rs6475606; rs1333048; rs1333049; Rs1333045; etc.

Eferocitosis y fagocitosis. El proceso mediante el cual los fagocitos profesionales y no profesionales eliminan las células apoptóticas de manera rápida y eficiente. La eferocitosis implica una serie de moléculas, que incluyen ligandos en las células apoptóticas, por ejemplo, fosfatidilserina; receptores en el eferocito; moléculas puente de ligando-receptor solubles; y las denominadas moléculas "encuéntrame" y "no me comas", por ejemplo, lisosfosfolípidos y CD47, cuya expresión al morir las células se altera para atraer a los fagocitos cercanos. Al depurar las células apoptóticas en una etapa relativamente temprana de la muerte celular, cuando el plasma celular y las membranas de los orgánulos aún están intactos, se evita la necrosis postapoptótica o "secundaria". La prevención de la necrosis celular, a su vez, evita la liberación de moléculas intracelulares potencialmente dañinas en el medio extracelular, incluyendo moléculas que estimulan las respuestas inflamatorias, proateroscleróticas y/o autoinmunes.

La eficacia de la depuración eferocítica en las lesiones ateroscleróticas desempeña un papel clave en el desarrollo de la enfermedad. Se sabe que la eferocitosis está alterada en la placa aterosclerótica humana. Una característica destacada de las lesiones ateroscleróticas avanzadas es el núcleo necrótico, o núcleo lipídico, que es una colección de macrófagos muertos y necróticos rodeados de células inflamatorias. Se cree que los núcleos necróticos son una característica principal responsable de la "vulnerabilidad" de la placa, es decir, placas capaces de sufrir alteraciones y desencadenar trombosis luminal aguda. La alteración de la placa y la trombosis aguda son los eventos que desencadenan los síndromes coronarios agudos, incluyendo infarto de miocardio, angina inestable, muerte cardíaca súbita y ataque cerebral.

Por "manipulación de la fagocitosis" se entiende una regulación por incremento o una regulación por disminución en la fagocitosis de una célula objetivo, por ejemplo, SMC apoptótica, en por lo menos aproximadamente un 10%, o hasta un 20%, o 50%, o 70% o 80% o hasta aproximadamente un 90% en comparación con el nivel de fagocitosis observado en ausencia de intervención.

Los términos "células fagocíticas" y "fagocitos" se usan indistintamente en la presente para referirse a una célula que es capaz de fagocitosis. Hay tres categorías principales de fagocitos: macrófagos, células mononucleares (histiocitos y monocitos); leucocitos polimorfonucleares (neutrófilos) y células dendríticas. Sin embargo, también se sabe que células "no profesionales" participan en la eferocitosis, como las SMC colindantes en la pared de los vasos sanguíneos.

“Tratamiento”, “tratando, “tratar” y similares se usan en la presente para referirse de manera general a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una estabilización parcial o completa o cura para una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. “Tratamiento” como se usa en la presente cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente un humano, e incluye: (a) prevenir que se produzca la enfermedad o síntoma en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o síntoma pero al que todavía no se le ha diagnosticado que la tiene; (b) inhibir el síntoma de la enfermedad, es decir deteniendo su desarrollo; o (c) aliviar el síntoma de la enfermedad, es decir, provocando la regresión de la enfermedad o síntoma. Aquellos con necesidad de tratamiento incluyen individuos a los que ya se les ha diagnosticado un aneurisma, así como aquellos en los que se debe prevenir la enfermedad.

Los términos "receptor", "individuo", "sujeto", "huésped" y "paciente", se usan indistintamente en la presente y se refieren a cualquier sujeto mamífero para el que se desea diagnóstico, tratamiento o terapia, particularmente humanos. "Mamífero" para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportivos o mascotas, como perros, caballos, gatos, vacas, ovejas, cabras, cerdos, etc. Preferiblemente, el mamífero es un humano.

Una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para efectuar resultados clínicos beneficiosos o deseados. Puede administrarse una cantidad eficaz en una o más administraciones. Para los propósitos de esta invención, una cantidad eficaz de un agente de EP es una cantidad que es suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, revertir, prevenir, ralentizar o retrasar la progresión del estado de la enfermedad, por ejemplo, un aneurisma, aumentando la fagocitosis de una célula objetivo.

Por ejemplo, en un modelo animal, la incidencia de muerte en una muestra de población debido a aneurisma puede reducirse con respecto a un animal tratado con control en un 25%, 50%, 75%. Alternativamente, el tratamiento con los métodos de la divulgación puede monitorizarse mediante la reducción o estabilización de un aneurisma existente, por ejemplo, cuando el tamaño de un aneurisma existente se estabiliza con el tiempo en relación con un sujeto no tratado, por ejemplo, cuando se reduce un aumento del tamaño con el tiempo hasta aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más con respecto a un individuo no tratado. Dicha monitorización puede realizarse en una población, por ejemplo, en un estudio de cohorte de ensayo clínico.

En algunas realizaciones, al sujeto que se está tratando se le ha diagnosticado un aneurisma, por ejemplo, un aneurisma mayor que el diámetro normal de la aorta, que puede ser, por ejemplo, mayor de aproximadamente 2 cm de diámetro, y puede ser menor que aproximadamente el tamaño de un aneurisma para el que está indicada la cirugía, por ejemplo, menos de aproximadamente 6 cm de diámetro, menos de aproximadamente 5,5 cm de diámetro, menos de aproximadamente 5 cm de diámetro. El tratamiento puede iniciarse cuando un aneurisma, incluyendo sin limitación, un aneurisma aórtico, es mayor de aproximadamente 2 cm, mayor de aproximadamente 2,5 cm, mayor de aproximadamente 3 cm, mayor de aproximadamente 3,5 cm, mayor de aproximadamente 4 cm, mayor de aproximadamente 4,5 cm, y puede ser menor de aproximadamente 6 cm, menor de aproximadamente 5,5 cm, menor de aproximadamente 5 cm de diámetro.

El término "muestra" con respecto a un paciente abarca muestras de sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido como una muestra de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas de los mismos y la progenie de los mismos. La definición también incluye muestras que han sido manipuladas de cualquier manera después de su adquisición, como por ejemplo con tratamiento con reactivos; lavado; o enriquecimiento para ciertas poblaciones celulares. La definición también incluye muestras que se han enriquecido para tipos particulares de moléculas, por ejemplo, ácidos nucleicos, polipéptidos, etc.

Los términos "unión específica", "se une específicamente" y similares, se refieren a la unión preferencial no covalente o covalente a una molécula con respecto a otras moléculas o fracciones en una solución o mezcla de reacción (por ejemplo, un anticuerpo se une específicamente a un polipéptido o epítopo particular con respecto a otros polipéptidos disponibles; unión de alta afinidad de un polipéptido SIRPa a CD47; etc.) En algunas realizaciones, la afinidad de una molécula por otra molécula a la que se une específicamente se caracteriza por una K^d (constante de disociación) de 10-5 M o menos (por ejemplo, 10-6 M o menos, 107 M o menos, 10-8 M o menos, 10-9 M o menos, 10-10 M o menos, 10-11 M o menos, 10-12 M o menos, 10-13 M o menos, 10-14 M o menos, 10-15 M o menos, o 10-16 M o menos). "Afinidad" se refiere a la fuerza de la unión, el aumento de la afinidad de unión estando correlacionado con una K^d menor.

El término "miembro de unión específica" como se usa en la presente se refiere a un miembro de una pareja de unión específica (es decir, dos moléculas, habitualmente dos moléculas diferentes, donde una de las moléculas, por ejemplo, un primer miembro de unión específica, a través de medios covalentes se une específicamente a la otra molécula, por ejemplo, un segundo miembro de unión específica). Los miembros de unión específica adecuados incluyen agentes que se unen específicamente a CD47 (es decir, agentes anti-CD47), o que bloquean de otro modo la interacción entre CD47 y SIRPa, los agentes que se unen a la calreticulina o su receptor LRP, etc.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos también se aplican a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos no naturales.

Un polipéptido "variante" significa un polipéptido biológicamente activo como se define a continuación que tiene menos de un 100% de identidad de secuencia con un polipéptido de secuencia nativa. Tales variantes incluyen polipéptidos en los que se añaden uno o más residuos de aminoácidos en el extremo N- o C-terminal, o dentro de la secuencia nativa; se eliminan de aproximadamente uno a cuarenta residuos de aminoácidos, y opcionalmente se sustituyen con uno o más residuos de aminoácidos; y derivados de los polipéptidos anteriores, en donde un residuo de aminoácidos se ha modificado covalentemente de tal manera que el producto resultante tenga un aminoácido que no se produce de manera natural. Normalmente, una variante biológicamente activa tendrá una secuencia de aminoácidos que tenga por lo menos aproximadamente un 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con un polipéptido de secuencia nativa, preferiblemente por lo menos aproximadamente un 95%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 99%. Los polipéptidos variantes pueden estar glicosilados de manera natural o no natural, es decir, el polipéptido tiene un patrón de glicosilación que difiere del patrón de glicosilación encontrado en la proteína natural correspondiente. Los polipéptidos variantes pueden tener modificaciones postraduccionales que no se encuentran en la proteína natural.

Un polipéptido de "fusión" es un polipéptido que comprende un polipéptido o porción (por ejemplo, uno o más dominios) del mismo fusionada o unida al polipéptido heterólogo. Una proteína CRT soluble de fusión, por ejemplo, compartirá por lo menos una propiedad biológica en común con un polipéptido CRT soluble de la secuencia nativa. Los ejemplos de polipéptidos de fusión incluyen inmunoadhesinas, como se ha descrito anteriormente, que combinan una porción del polipéptido de interés con una secuencia de inmunoglobulina, y polipéptidos etiquetados con epítopo, que comprenden un polipéptido soluble de interés o una porción del mismo fusionado a un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el cual puede hacerse un anticuerpo, pero es lo suficientemente corto como para que no interfiera con la actividad biológica del polipéptido de interés. Los polipéptidos etiqueta adecuados tienen generalmente por lo menos seis residuos de aminoácidos y habitualmente entre aproximadamente 6-60 residuos de aminoácidos.

Un "derivado funcional" de un polipéptido de secuencia nativa es un compuesto que tiene una propiedad biológica cualitativa en común con un polipéptido de secuencia nativa. Los "derivados funcionales" incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de una secuencia nativa y derivados de un polipéptido de secuencia nativa y sus fragmentos, siempre que tengan una actividad biológica en común con un polipéptido de secuencia nativa correspondiente. El término "derivado" abarca tanto las variantes de secuencias de aminoácidos del polipéptido como modificaciones covalentes del mismo. Por ejemplo, los derivados y la fusión de CRT soluble encuentran uso como moléculas miméticas de CRT.

Molécula pequeña: como se usa en la presente, el término "molécula pequeña" se refiere a compuestos orgánicos, ya sean de origen natural o creados artificialmente (por ejemplo, mediante síntesis química) que tienen un peso molecular relativamente bajo y que no son proteínas, polipéptidos o ácidos nucleicos. Típicamente, las moléculas pequeñas tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 1500 g/mol. Además, las moléculas pequeñas tienen típicamente múltiples enlaces carbono-carbono.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa), los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos) y los fragmentos de anticuerpos siempre que muestran la actividad biológica deseada. Los "anticuerpos" (Abs) y las "inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos muestran especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad de antígeno. Los polipéptidos de esto último tipo, por ejemplo, son producidos en niveles bajos por el sistema linfático y en niveles elevados por mielomas.

El "fragmento de anticuerpo", y todas las variantes gramaticales del mismo, como se usa en la presente, se definen como una porción de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto, en donde la porción está libre de los dominios constantes de la cadena pesada (es decir, CH2, CH3 y CH4, dependiendo del isotipo del anticuerpo) de la región Fc del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 y Fv; diacuerpos; cualquier fragmento de anticuerpo que sea un polipéptido que tenga una estructura primaria que consista de una secuencia ininterrumpida de residuos de aminoácidos contiguos (referido en la presente como "fragmento de anticuerpo de cadena sencilla" o "polipéptido de cadena sencilla"), incluyendo sin limitación (1) moléculas de cadena sencilla Fv (scFv) (2) polipéptidos de cadena sencilla que contienen solo un dominio variable de la cadena ligera, o un fragmento del mismo que contiene las tres CDR del dominio variable de la cadena ligera, sin una fracción de la cadena pesada asociada (3) polipéptidos de cadena sencilla que contienen solo una región variable de la cadena pesada, o un fragmento de los mismos que contiene las tres CDR de la región variable de la cadena pesada, sin una fracción de la cadena ligera asociada y (4) nanocuerpos que comprenden dominios de Ig individuales de especies no humanas u otros módulos de unión de dominio único específicos; y estructuras multiespecíficas o multivalentes formadas a partir de fragmentos de anticuerpos. En un fragmento de anticuerpo que comprende una o más cadenas pesadas, las cadenas pesadas pueden contener cualquier secuencia de dominio constante (por ejemplo, CH1 en el isotipo IgG) encontradas en una región no Fc de un anticuerpo intacto, y/o pueden contener cualquier secuencia de región bisagra encontrada en un anticuerpo intacto, y/o pueden contener una secuencia de cremallera de leucina fusionada o situada en la secuencia de región bisagra o la secuencia de dominio constante de las cadenas pesadas.

Como se usa en la presente, el término "epítopo" significa cualquier determinante antigénico en un antígeno al que se une el parátopo de un anticuerpo. Los determinantes epitópicos consisten habitualmente de agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.

El inhibidor de quinasa dependiente de ciclina 2B (CDKN2B) también se conoce como supresor tumoral múltiple 2 (MTS-2) o p15INK4B. La referencia de secuencia de Genbank para el ARNm humano tiene el número de registro NM_004936 y la referencia de secuencia de la proteína tiene el número de registro NP_004927. Este gen se encuentra adyacente al gen supresor tumoral CDKN2A en una región que con frecuencia está mutada y eliminada en una amplia variedad de tumores.

El CDKN2B forma un complejo con CDK4 o CDK6, y evita la activación de las quinasas CDK por la ciclina D, por lo que la proteína codificada funciona como un regulador del crecimiento celular que inhibe la progresión del ciclo celular G1.

En la presente se muestra que la expresión de CDKN2B disminuida asociada con los alelos de riesgo 9p21 altera la expresión de calreticulina, un ligando requerido para la activación de los receptores de envoltura en las células fagocíticas. Como resultado, los cuerpos apoptóticos deficientes en cdkn2B, por ejemplo, las células apoptóticas del músculo liso, se vuelven resistentes a la eferocitosis y las células fagocíticas no los depuran eficientemente. Los agentes que activan o regulan por incremento la expresión de CDKN2B son conocidos en la técnica incluyendo, por ejemplo, palbociclib (ver Toogood et al. (2005) J Med Chem. 48(7):2388-406); 5-aza-2'-desoxicitidina en ausencia o presencia de fenilbutirato (ver Lemaire et al. (2004) Leuk Lymphoma. 45(1):147-54); factores inducibles por hipoxia-1a y -2a (ver Aesoey et al. (2013) Endocr Rev, Vol. 34(03_Meeting Abstracts): SUN-303; etc. Los agentes que activan o regulan por incremento CDKN2B pueden determinarse mediante métodos de detección como se conoce en la técnica.

Calreticulina. La calreticulina es una proteína multifuncional de 417 aminoácidos, con un peso molecular de 48 kDa, que se une a los iones de Ca2+, dejándolos inactivos. El Ca2+ se une con baja afinidad, pero alta capacidad, y puede liberarse en una señal. La calreticulina puede estar localizada en compartimentos de almacenamiento asociados con el retículo endoplásmico, donde se une a proteínas mal plegadas y evita que se exporten al aparato de Golgi. La calreticulina también se encuentra en el núcleo, lo que sugiere que puede tener un papel en la regulación de la transcripción. La calreticulina se une al péptido sintético KLGFFKR, que es casi idéntico a una secuencia de aminoácidos en el dominio de unión al ADN de la superfamilia de receptores nucleares. El símbolo génico para calreticulina es CALR, y puede accederse a las secuencias humanas en Pubmed de la siguiente manera: N° de registro de proteínas NP_004334; N° de registro de nucleótidos: NM_004343.

La calciticulina en la superficie de las células apoptóticas sirve como ligando de reconocimiento y depuración activando el receptor de internalización LRP en la superficie de la célula fagocítica que responde. La expresión superficial de calreticulina aumenta y la calreticulina se redistribuyó durante la apoptosis, posiblemente mejorando la estimulación de LRP en el fagocito.

La proteína relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP) es una proteína de 4.544 aminoácidos que contiene un único segmento transmembrana, con un alto grado de identidad de secuencia con el receptor de l Dl . Puede accederse a las secuencias genéticas humanas en Pubmed como sigue: N° de registro de nucleótidos*: NM_002332.2 Gl:126012561.

Los agentes que se unen específicamente a la calreticulina (CRT) son de interés como agonistas para potenciar la actividad pro-fagocítica de la CRT. Los agentes de unión a CRT útiles en los métodos de la divulgación incluyen análogos, derivados y fragmentos del miembro de unión específico original, por ejemplo, fragmentos Fab de anticuerpos, etc. Los “miméticos” y “agonistas” de la calreticulina incluyen moléculas que funcionan de manera similar a o potencian CRT uniéndose y activando el receptor de LRP. Las moléculas útiles como miméticos de CRT incluyen derivados, variantes y fragmentos biológicamente activos de CRT natural. Las moléculas útiles como agonistas incluyen anticuerpos y otros agentes que actúan para mejorar la actividad pro-fagocítica de CRT.

Los fragmentos de CRT solubles, particularmente fragmentos biológicamente activos y/o fragmentos correspondientes a dominios funcionales, son de interés. Los fragmentos de interés típicamente tendrán por lo menos de aproximadamente 10 aa a por lo menos aproximadamente 15 aa de longitud, generalmente por lo menos aproximadamente 50 aa de longitud, pero habitualmente no excederán de aproximadamente 142 aa de longitud, donde el fragmento tendrá una extensión de aminoácidos eso es idéntica a la de CRT. Un fragmento de "por lo menos 20 aa de longitud", por ejemplo, se pretende que incluya 20 o más aminoácidos contiguos de, por ejemplo, el polipéptido codificado por un ADNc para CRT. En este contexto, "aproximadamente" incluye el valor particularmente enumerado o un valor mayor o menor por varios (5, 4, 3, 2 o 1) aminoácidos.

Los ensayos in vitro para la actividad biológica de la calreticulina incluyen, por ejemplo, fagocitosis de células porcinas por macrófagos humanos, unión a LRP, etc. Un agente candidato útil como un mimético agonista de calreticulina da como resultado una regulación por disminución de la fagocitosis en por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un 80% o hasta aproximadamente un 90% en comparación con el nivel de fagocitosis observado en ausencia del agente candidato.

La CD47, también conocida como proteína asociada a la integrina (IAP,) es un receptor de membrana de 50 kDa que tiene un dominio extracelular de IgV N-terminal, cinco dominios transmembrana y una transmembrana de cola intracelular C-terminal corta, perteneciente a la superfamilia de las inmunoglobulinas, que interactúa con las integrinas, más comúnmente con la integrina avp3, la trombospondina-1 (TSP-1) y la proteína alfa reguladora de señal (SIRPa). La secuencia de referencia para el ARNm humano tiene el número de registro Genbank NM_001025079, y la secuencia de referencia de la proteína es NP_001768.

La interacción CD47/SIRPa lleva a una señalización bidireccional, que da como resultado diferentes respuestas de célula a célula que incluyen la inhibición de la fagocitosis, la estimulación de la fusión célula-célula y la activación de células T.

Como se usa en la presente, el término "agente anti-CD47" se refiere a cualquier agente que reduce la unión de CD47 (por ejemplo, en una célula afectada) a SIRPa (por ejemplo, en una célula fagocítica). En algunas realizaciones, el agente anti-CD47 no interfiere ni se une a las regiones de CD47 que se unen a la trombospondina. En algunas realizaciones, el agente anti-CD47 no activa CD47 tras la unión. Cuando se activa CD47, se produce un proceso similar a la apoptosis (es decir, muerte celular programada) (Manna y Frazier, Cancer Research, 64, 1026­ 1036, 1 de febrero de 2004). Por tanto, en algunas realizaciones, el agente anti-CD47 no induce directamente la muerte celular apoptótica de una célula que expresa CD47.

Ejemplos no limitativos de reactivos anti-CD47 adecuados incluyen un polipéptido de SIRPa soluble, que puede ser un polipéptido de SIRPa de alta afinidad, y que está opcionalmente unido a un dominio de inmunoglobulina, por ejemplo, una región Fc, etc., anticuerpos anti-SIRPa, y anticuerpos anti-CD47 o fragmentos de anticuerpos. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 adecuado (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD47, un reactivo de SIRPa de alta afinidad, etc.) se une específicamente a CD47 para reducir la unión de CD47 a SIRPa. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 adecuado (por ejemplo, un anticuerpo anti-SIRPa, etc.) se une específicamente a SIRPa para reducir la unión de CD47 a SIRPa. Un agente anti-CD47 adecuado que se une a SIRPa no activa SIRPa (por ejemplo, en la célula fagocítica que expresa SIRPa).

La eficacia de un agente anti-CD47 adecuado puede evaluarse analizando el agente. Un agente para su uso en los métodos de la invención regulará la fagocitosis por lo menos en un 10% (por ejemplo, por lo menos un 20%, por lo menos un 30%, por lo menos un 40%, por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 90%, por lo menos un 100%, por lo menos un 120%, por lo menos un 140%, por lo menos un 160%, por lo menos un 160% o por lo menos un 200%) en comparación con la fagocitosis en ausencia del agente. De manera similar, un ensayo in vitro para los niveles de fosforilación de tirosina de SIRPa mostrará una disminución de la fosforilación de por lo menos un 5% (por ejemplo, por lo menos un 10%, por lo menos un 15%, por lo menos un 20%, por lo menos un 30%, por lo menos un 40 %, por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 90% o un 100%) en comparación con la fosforilación observada en ausencia del agente candidato.

En una realización de la invención, el agente anti-CD47, o una composición farmacéutica que comprende el agente, se proporciona en una cantidad eficaz para inhibir detectablemente la unión de CD47 a SIRPa presente en la superficie de las células fagocíticas. La cantidad eficaz se determina mediante pruebas empíricas rutinarias en la técnica, por ejemplo, en una muestra biológica tomada de un individuo infectado. La cantidad eficaz puede variar dependiendo de la cantidad de células que se dirigen, la localización de las células y los factores específicos del sujeto.

Reactivo de SIRPa de alta afinidad. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 sujeto es un "reactivo SIRPa de alta afinidad", que incluye polipéptidos derivados de SIRPa y análogos de los mismos. Los reactivos SIRPa de alta afinidad se describen en la publicación internacional WO/2013/109752. Los reactivos de SIRPa de alta afinidad son variantes de la proteína SIRPa nativa. En algunas realizaciones, un reactivo de SIRPa de alta afinidad es soluble, donde el polipéptido carece del dominio transmembrana de SIRPa y comprende por lo menos un cambio de aminoácidos con respecto a la secuencia de SIRPa de tipo salvaje, y en donde el cambio de aminoácidos aumenta la afinidad del polipéptido de SIRPa que se une a CD47, por ejemplo disminuyendo la constante de disociación en por lo menos 10 veces, por lo menos 20 veces, por lo menos 50 veces, por lo menos 100 veces, por lo menos 500 veces, o más.

Un reactivo de SIRPa de alta afinidad comprende la porción de SIRPa que es suficiente para unirse a CD47 a una afinidad reconocible, por ejemplo, alta afinidad, que normalmente se encuentra entre la secuencia señal y el dominio transmembrana, o un fragmento de la misma que retiene la actividad de unión. El reactivo de SIRPa de alta afinidad habitualmente comprenderá por lo menos el dominio d1 de SIRPa con residuos de aminoácidos modificados para aumentar la afinidad. En algunas realizaciones, una variante de SIRPa de la presente invención es una proteína de fusión, por ejemplo, fusionada en marco con un segundo polipéptido. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es capaz de aumentar el tamaño de la proteína de fusión, por ejemplo, de tal manera que la proteína de fusión no se elimine de la circulación rápidamente. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es parte o la totalidad de una región de Fc de inmunoglobulina. En otras realizaciones, el segundo polipéptido es cualquier polipéptido adecuado que sea sustancialmente similar a Fc, por ejemplo, proporcionando un tamaño aumentado, dominios de multimerización, y/o unión o interacción adicional con moléculas de Ig.

Un reactivo de SIRPa de alta afinidad adecuado reduce (por ejemplo, bloquea, previene, etc.) la interacción entre las proteínas nativas de SIRPa y CD47. Los cambios de aminoácidos que proporcionan una afinidad aumentada se localizan en el dominio d1 y, por tanto, los reactivos de SIRPa de alta afinidad comprenden un dominio di de SIRPa humano, con por lo menos un cambio de aminoácidos con respecto a la secuencia de tipo salvaje dentro del dominio d1. Tal reactivo de SIRPa de alta afinidad opcionalmente comprende secuencias de aminoácidos adicionales, por ejemplo secuencias de Fc de anticuerpos; porciones de la proteína SIRPa humana de tipo salvaje distintas del dominio d1 incluyendo, sin limitación, los residuos 150 a 374 de la proteína nativa o fragmentos de la misma, habitualmente fragmentos contiguos al dominio d1; y similares. Los reactivos de SIRPa de alta afinidad pueden ser monoméricos o multiméricos, es decir, dímero, trímero, tetrámero, etc.

Anticuerpos anti-CD47. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 en cuestión es un anticuerpo que se une específicamente a CD47 (es decir, un anticuerpo anti-CD47) y reduce la interacción entre CD47 en una célula (por ejemplo, una célula infectada) y SIRPa en otra célula (por ejemplo, una célula fagocítica). En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD47 adecuado no activa CD47 tras la unión. Ejemplos no limitativos de anticuerpos adecuados incluyen los clones B6H12, 5F9, 8B6 y C3 (por ejemplo, como se describe en la Publicación de Patente Internacional WO 2011/143624.

Anticuerpos anti-SIRPa. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 en cuestión es un anticuerpo que se une específicamente a SIRPa (es decir, un anticuerpo anti-SIRPa) y reduce la interacción entre CD47 en una célula (por ejemplo, una célula infectada) y SIRPa en otra célula (por ejemplo, una célula fagocítica). Los anticuerpos anti-SIRPa adecuados pueden unirse a SIRPa sin activar o estimular la señalización a través de SIRPa porque la activación de SIRPa inhibiría la fagocitosis. En cambio, los anticuerpos anti-SIRPa adecuados facilitan la fagocitosis preferencial de las células infectadas sobre las células no infectadas. Las células que expresan niveles más altos de CD47 (por ejemplo, células infectadas) con respecto a otras células (células no infectadas) se fagocitarán preferentemente. Por tanto, un anticuerpo anti-SIRPa adecuado se une específicamente a SIRPa sin activar/estimular lo suficiente una respuesta de señalización suficiente para inhibir la fagocitosis.

Los anticuerpos adecuados incluyen versiones completamente humanas, humanizadas o quiméricas de tales anticuerpos. Los anticuerpos humanizados son especialmente útiles para aplicaciones in vivo en humanos debido a su baja antigenicidad. De manera similar, los anticuerpos caninizados, felinizados, etc., son especialmente útiles para aplicaciones en perros, gatos y otras especies, respectivamente.

Métodos

Se proporcionan métodos para tratar o reducir la enfermedad por aneurisma mediante la administración de un agente a un individuo que aumenta la eferocitosis y/o la fagocitosis de los componentes celulares (actividad de la ruta de EP); reduciendo el riesgo de aneurisma o enfermedad. La enfermedad por aneurisma puede estar presente en una arteria del individuo, incluyendo sin limitación, arterias cerebrales, aorta abdominal, aorta torácica, etc. En algunas realizaciones, el individuo es homocigoto o heterocigoto para un alelo de riesgo 9p21. En algunas realizaciones, el agente que aumenta la actividad de la ruta de EP proporciona una o más de las siguientes actividades: reduce la unión de CD47 a SIRPa; aumenta o imita la actividad de la calreticulina, incluyendo la unión de calreticulina a LRP; o aumenta la expresión de CDKN2B. Tales métodos incluyen administrar a un sujeto con necesidad de tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz o una dosis eficaz de un agente estimulante de la ruta de EP, incluyendo sin limitación, combinaciones del agente con otro fármaco. Los métodos de administración al sistema cardiovascular son de interés, aunque las formulaciones orales también pueden ser útiles.

Las dosis eficaces de la entidad terapéutica de la presente invención varían dependiendo de muchos factores diferentes, que incluyen la naturaleza del agente, los medios de administración, el sitio objetivo, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o un animal, otros medicamentos administrados, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Habitualmente, el paciente es un humano, pero también pueden tratarse mamíferos no humanos, por ejemplo, animales de compañía como perros, gatos, caballos, animales de laboratorio, como conejos, ratones, ratas, animales y similares. Las dosificaciones de tratamiento pueden ajustarse para optimizar la seguridad y la eficacia.

En algunas realizaciones, la dosificación terapéutica puede variar de aproximadamente 0,0001 a 500 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 a 100 mg/kg, del peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-50 mg/kg. La dosificación puede ajustarse para el peso molecular del reactivo. Un régimen de tratamiento ejemplar implica la administración diaria, semisemanal, semanal, una vez cada dos semanas, una vez al mes, etc. En otro ejemplo, el tratamiento puede administrarse como una infusión continua. Las entidades terapéuticas de la presente invención se administran habitualmente en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones individuales pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares como se indica midiendo los niveles en sangre de la entidad terapéutica en el paciente. Alternativamente, las entidades terapéuticas de la presente invención pueden administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían dependiendo de la vida media del polipéptido en el paciente. Un experto en la técnica entenderá que dichas pautas se ajustarán al peso molecular del agente activo, por ejemplo, en el uso de fragmentos de polipéptidos, en el uso de conjugados de anticuerpos, en el uso de reactivos de SIRPa de alta afinidad, etc. La dosificación también puede variarse para administración localizada, por ejemplo, intranasal, inhalación, etc., o para administración sistémica, por ejemplo, i.m., i.p., i.v. y similares.

Para el tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada del agente dependerá de la gravedad y el curso de la enfermedad, si el agente se administra con propósitos preventivos, terapia previa, el historial clínico del paciente y la respuesta al anticuerpo, y discreción del médico tratante. El agente se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos.

Pueden proporcionarse agentes adecuados en composiciones farmacéuticas adecuadas para uso terapéutico, por ejemplo, para tratamiento humano. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación incluyen una o más entidades terapéuticas o sales, ésteres o solvatos farmacéuticamente aceptables de las mismas. El uso de un agente estimulante de la eferocitosis incluye el uso en combinación con otro agente terapéutico, por ejemplo, fármacos útiles en el tratamiento de la aterosclerosis. Tales combinaciones pueden incluir, sin limitación, estatinas. Las estatinas son inhibidores de la enzima reductasa HMG-CoA. Estos agentes se describen con detalle; por ejemplo, la mevastatina y compuestos relacionados como se divulga en la Patente de Estados Unidos N° 3.983.140; la iovastatina (mevinolina) y compuestos relacionados como se divulga en la Patente de Estados Unidos N° 4.231.938; la pravastatina y compuestos relacionados como se divulga en la Patente de Estados Unidos N° 4.346.227; la simvastatina y compuestos relacionados como se divulga en las Patentes de Estados Unidos N° 4.448.784 y 4.450.171; la fluvastatina y compuestos relacionados como se divulga en la Patente de Estados Unidos N° 5.354.772; la atorvastatina y compuestos relacionados como se divulga en las Patentes de Estados Unidos N° 4.681.893, 5.273.995 y 5.969.156; y la cerivastatina y compuestos relacionados como se divulga en las Patentes de Estados Unidos N° 5.006.530 y 5.177.080. Agentes y compuestos adicionales se divulgan en las Patente de Estados Unidos N° 5.208.258, 5.130.306, 5.116.870, 5.049.696, RE 36.481 y RE 36.520. Las estatinas incluyen las sales y/o ésteres de las mismas.

Otros fármacos útiles en combinación incluyen, por ejemplo, fibratos como gemfibrozilo, fenofibrato, etc.; niacina; zetia; secuestrantes de ácidos biliares, por ejemplo, colestiramina, colestipol, colesevelam; lovaza, vascepa; medicamentos para reducir la hipertensión, etc.

Las formulaciones terapéuticas que comprenden uno o más agentes de la invención se preparan para el almacenamiento mezclando el agente que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. La composición del agente se formulará, dosificará y administrará de manera consistente con la buena práctica médica. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, la programación de la administración, y otros factores conocidos por los practicantes médicos. La "cantidad terapéuticamente eficaz” del agente a administrar se regirá por tales consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para tratar o prevenir la aterosclerosis.

El agente puede administrarse mediante cualquier medio adecuado, incluyendo tópico, oral, parenteral, subcutáneo, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal o subcutánea. Además, el agente puede administrarse adecuadamente mediante infusión de pulso, particularmente con dosis decrecientes del agente.

El agente no necesita ser, pero está formulado opcionalmente con uno o más agentes que potencian la actividad, o que de otro modo aumentan el efecto terapéutico. Estos se usan generalmente en las mismas dosificaciones y con las vías de administración que se usaron anteriormente o aproximadamente del 1 al 99% de las dosificaciones empleadas hasta ahora.

A menudo, un agente se administra como una composición farmacéutica que comprende un agente terapéutico activo y otro excipiente farmacéuticamente aceptable. La forma preferida depende del modo pretendido de administración y la aplicación terapéutica. Las composiciones también pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, portadores o diluyentes no tóxicos farmacéuticamente aceptables, que se definen como vehículos comúnmente usados para formular composiciones farmacéuticas para administración animal o humana. El diluyente se selecciona para no afectar a la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solución salina fisiológica tamponada con fosfato, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros portadores, adyuvantes, o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares.

Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir macromoléculas metabolizadas lentamente grandes como proteínas, polisacáridos como quitosano, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos y copolímeros (como Sepharose™ funcionalizado de látex, agarosa, celulosa y similares), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y agregados lipídicos (como gotitas de aceite o liposomas).

Un portador puede llevar los agentes de varias maneras, incluyendo enlaces covalentes, ya sea directamente o mediante un grupo conector, y asociaciones no covalentes. Los portadores de enlace covalente adecuados incluyen proteínas como albúminas, péptidos y polisacáridos como aminodextrano, cada uno de los cuales tiene múltiples sitios para la unión de fracciones. Un portador también puede llevar un agente anti-CD47 mediante asociaciones no covalentes como enlaces no covalentes o por encapsulación. La naturaleza del portador puede ser soluble o insoluble para los propósitos de la invención. Los expertos en la técnica conocerán otros portadores adecuados para unir agentes anti-CD47, o podrán determinarlos, usando experimentación rutinaria.

Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (como el cloruro de octadecidimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquil parabenos como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales como el sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Las formulaciones a usar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Los ingredientes activos también pueden quedar atrapados en una microcápsula preparada, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsula de gelatina y microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (para ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)

Los portadores y conectores específicos para agentes de radionúclidos incluyen moléculas pequeñas radiohalogenadas y compuestos quelantes. Se puede formar un quelato de radionúclidos a partir de compuestos quelantes que incluyen aquellos que contienen átomos de nitrógeno y azufre como átomos donantes para unir el radionúclido metálico u óxido de metal.

Las fracciones radiográficas para su uso como fracciones para imagenología incluyen compuestos y quelatos con átomos relativamente grandes como oro, iridio, tecnecio, bario, talio, yodo y sus isótopos. Se prefiere utilizar fracciones de imagenología menos tóxicas como yodo o isótopos de yodo. Tales fracciones pueden conjugarse con el agente anti-CD47 a través de un conector químico o portador de quelación aceptable. Las fracciones emisoras de positrones incluyen ¹⁸F, que pueden conjugarse fácilmente mediante una reacción de fluoración con el agente.

Típicamente, las composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas o micropartículas como polilactida, poliglicólido o copolímero para un efecto adyuvante mejorado, como se ha analizado anteriormente. Langer, Science 249: 1527, 1990 y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997. Los agentes de esta invención pueden administrarse en forma de inyección de depósito o preparación de implante que puede formularse de tal manera que permita una liberación sostenida o pulsátil del ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas se formulan generalmente como estériles, sustancialmente isotónicas en conformidad con las regulaciones de las Prácticas de Buena Fabricación (GMP) de la U.S. Food and Drug Administration.

La toxicidad de los agentes puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, determinando la LD⁵⁰ (la dosis letal para el 50% de la población) o la LD¹⁰⁰ (la dosis letal para el 100% de la población). La proporción de dosis entre el efecto tóxico y terapéutico es el índice terapéutico. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación que no sea tóxico para uso en humanos. La dosificación de las proteínas descritas en la presente se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la dosis eficaz con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación pueden ser elegidas por el médico individual en vista de la condición del paciente.

Selección genética

En un aspecto de la presente invención, se hacen pruebas a un individuo para determinar la presencia de un alelo de riesgo 9p21 antes del tratamiento. Tales métodos comprenden un análisis de ADN genómico en un individuo para un alelo 9p21 que confiere una mayor susceptibilidad a la aterosclerosis y la enfermedad por aneurisma. Los individuos se seleccionan analizando su secuencia genómica en 9p21, por ejemplo, rs10757278 o rs1333049 u otras secuencias de SNP 9p21 representativas para detectar la presencia de un alelo predisponente, en comparación con una secuencia normal.

Se usan varios métodos para determinar la presencia de una variante predisponente en un individuo. El ADN genómico se aísla del individuo o individuos que se van a analizar. El ADN puede aislarse de cualquier fuente celular nucleada como sangre, hebras capilares, saliva, mucosa, biopsia, heces, etc. Los métodos que usan la amplificación por PCR pueden realizarse en el ADN de una célula individual, aunque es conveniente usar por lo menos aproximadamente 105 células. Cuando hay grandes cantidades de ADN disponibles, el ADN genómico se usa directamente. Alternativamente, la región de interés se clona en un vector adecuado y se cultiva en cantidad suficiente para el análisis, o se amplifica mediante técnicas convencionales. De particular interés es el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el ADN que se encuentra entre dos cebadores específicos. El uso de la reacción en cadena de la polimerasa se describe en Saiki et al. (1985) Science 239:487, y una revisión de las técnicas actuales puede encontrarse en McPherson et al. (2000) PCR (Basics: From Background to Bench) Springer Verlag; ISBN: 0387916008. En la reacción de amplificación puede incluirse un marcador detectable. Los marcadores adecuados incluyen fluorocromos, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, rojo Texas, ficoeritrina, aloficocianina, 6-carboxifluoresceína (6-FAM), 2',7’-dimetoxi-4’,5’-dicloro-6carboxifluoresceína (JOE), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-2’,4’,7’,4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), 5-caeboxifluoresceína (5-FAM) o N,N,N’,N’-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA, marcadores radioactivos, por ejemplo, 32P, 35S, 3H; etc. El marcador puede ser un sistema de dos etapas, donde el ADN amplificado se conjuga con biotina, haptenos, etc. teniendo un compañero de unión de alta afinidad, por ejemplo, avidina, anticuerpos específicos, etc., donde el compañero de unión se conjuga con un marcador detectable. El marcador puede conjugarse con uno o ambos cebadores. Alternativamente, la agrupación de nucleótidos usada en la amplificación se marca, para incorporar el marcador en el producto de amplificación.

Las parejas de cebadores se seleccionan de la secuencia genómica usando criterios convencionales para la selección. Los cebadores en una pareja se hibridarán con cadenas opuestas y flanquearán colectivamente la región de interés. Los cebadores se hibridarán con la secuencia complementaria en condiciones rigurosas, y generalmente tendrán por lo menos aproximadamente 16 nt de longitud y pueden tener 20, 25 o 30 nucleótidos de longitud. Los cebadores se seleccionarán para amplificar la región específica sospechosa de contener la mutación predisponente. Típicamente, la longitud del fragmento amplificado se seleccionará para permitir la discriminación entre repeticiones de 3 a 7 unidades. Puede realizarse amplificación multiplex en la que varios conjuntos de cebadores se combinan en el mismo tubo de reacción, para analizar múltiples exones simultáneamente. Cada cebador puede conjugarse con un marcador diferente.

La composición exacta de las secuencias de cebadores no es crítica para la invención, pero deben hibridarse con las secuencias flanqueantes en condiciones rigurosas. Los criterios para la selección de cebadores de amplificación son como se ha analizado anteriormente. Para maximizar la resolución de las diferencias de tamaño en el locus, es preferible elegir una secuencia de cebador que esté cerca de la secuencia de SNP, de tal manera que el producto de la amplificación total tenga por lo menos aproximadamente 30, más habitualmente por lo menos aproximadamente 50, preferiblemente por lo menos aproximadamente 100 o 200 nucleótidos de longitud, que variarán con el número de repeticiones que están presentes, a no más de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud. Se ha descubierto que el número de repeticiones es polimórfico, como se ha descrito anteriormente, generando de este modo diferencias individuales en la longitud del ADN que se encuentra entre los cebadores de amplificación. Convenientemente, se incluye un marcador detectable en la reacción de amplificación. Puede realizarse amplificación multiplex en la que varios conjuntos de cebadores se combinan en el mismo tubo de reacción. Esto es particularmente ventajoso cuando hay cantidades limitadas de muestra de ADN disponibles para el análisis. Convenientemente, cada uno de los conjuntos de cebadores se marca con un fluorocromo diferente.

Después de la amplificación, los productos pueden fraccionarse por tamaño. El fraccionamiento puede realizarse mediante electroforesis en gel, particularmente desnaturalizando geles de acrilamida o agarosa. Un sistema conveniente usa geles de poliacrilamida desnaturalizantes en combinación con un secuenciador de ADN automatizado, ver Hunkapillar et al. (1991) Science 254:59-74. El secuenciador automático es particularmente útil con la amplificación multiplex o productos agrupados de reacciones de PCR separadas. También puede usarse electroforesis capilar para fraccionamiento. Una revisión de la electroforesis capilar puede encontrarse en Landers, et al. (1993) BioTechniques 14:98-111. El tamaño del producto de amplificación es proporcional al número de repeticiones (n) que están presentes en el locus especificado por los cebadores. El tamaño será polimórfico en la población y, por lo tanto, es un marcador alélico para ese locus. El fragmento amplificado o clonado se secuencia alternativamente mediante varios métodos altos conocidos en la técnica.

La presencia de un alelo de riesgo predisponente es indicativa de que un individuo tiene un mayor riesgo de desarrollar aterosclerosis y puede beneficiarse del tratamiento con los métodos de la divulgación, aunque los métodos pueden encontrar uso adicional en individuos sin un factor de riesgo genético 9p21. El diagnóstico de una predisposición a la enfermedad permite al individuo afectado buscar tratamiento antes de posibles lesiones y evitar actividades que aumentan el riesgo de enfermedad cardiovascular.

Selección de fármacos

Los ensayos de selección identifican compuestos que modulan la expresión o actividad de proteínas implicadas en la ruta de EP incluyendo, sin limitación, CDKN2B, calreticulina, CD47, SIRPa, etc. Un agente estimulante de la ruta de EP puede actuar como la base para mejorar el aneurisma, particularmente aneurisma aórtico abdominal. Tales compuestos pueden incluir, pero no están limitados a, péptidos, anticuerpos o compuestos orgánicos o inorgánicos pequeños. Los métodos para la identificación de tales compuestos se describen a continuación.

Los sistemas basados en células y animales pueden actuar como modelos para enfermedades cardiovasculares y son útiles en dicha selección de fármacos. Los modelos basados en animales y células pueden usarse para identificar fármacos, productos farmacéuticos, terapias e intervenciones que son eficaces en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. Además, tales modelos animales pueden usarse para determinar la LD⁵⁰ y la ED⁵⁰ en sujetos animales, y dichos datos pueden usarse para determinar la eficacia in vivo de posibles tratamientos para enfermedades cardiovasculares. Los sistemas de modelos basados en animales de enfermedad cardiovascular pueden incluir, pero no están limitados a, animales transgénicos no recombinantes y modificados genéticamente. Los modelos animales no recombinantes y no genéticos de aterosclerosis pueden incluir, por ejemplo, modelos de cerdo, conejo o rata en los que el animal ha estado expuesto a lesiones químicas a través de suplementos dietéticos de LDL, o lesiones mecánicas a través de angioplastia con catéter con balón, por ejemplo. Adicionalmente, pueden diseñarse modelos animales que muestran síntomas de enfermedades cardiovasculares mediante, por ejemplo, el marcado de células del músculo liso, la eliminación de CDKN2B, etc. secuencias de genes junto con técnicas para producir animales transgénicos que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de genes objetivo pueden introducirse y eliminarse o sobreexpresarse en el genoma del animal de interés. Pueden usarse animales de cualquier especie, incluyendo pero no limitado a, ratones, ratas, conejos, cobayas, cerdos, microcerdos, cabras y primates no humanos, por ejemplo, babuinos, monos y chimpancés para generar modelos animales de enfermedades cardiovasculares.

Puede usarse cualquier técnica conocida en la técnica para introducir un transgen del gen objetivo en animales para producir las líneas fundadoras de animales transgénicos. Tales técnicas incluyen, pero no están limitadas a, microinyección pronuclear (Hoppe, P.C. y Wagner, T.E., 1989, Patente de Estados Unidos N° 4.873.191); transferencia génica mediada por retrovirus en líneas germinales (Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152); direccionamiento de genes en células madre embrionarias (Thompson et al., 1989, Cell 56:313-321); electroporación de embriones (Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803-1814); y transferencia génica mediada por esperma (Lavitrano et al., 1989, Cell 57:717-723); etc.

Pueden analizarse y ensayarse tipos celulares específicos dentro de los animales para determinar los fenotipos celulares característicos de la enfermedad cardiovascular. En el caso de los monocitos, tales fenotipos pueden incluir, pero no están limitados a, aumentos en las tasas de captación de LDL, adhesión a las células endoteliales, transmigración, formación de células espumosas, formación de estrías grasas, y producción de productos específicos de células espumosas. Además, tales fenotipos celulares pueden incluir un patrón de expresión de huellas de un tipo de célula particular en comparación con los perfiles de expresión de huellas conocidos del tipo de célula particular en animales que muestran síntomas de enfermedad cardiovascular. La capacidad de las células del músculo liso para ser absorbidas por los fagocitos es de particular interés.

Pueden utilizarse células que están reguladas por disminución en la actividad de CDKN2B para identificar compuestos que muestran actividad de enfermedad anti-cardiovascular. En el caso de los monocitos, tales fenotipos pueden incluir, pero no están limitados a, aumentos en las tasas de captación de LDL, adhesión a las células endoteliales, transmigración, formación de células espumosas, formación de estrías grasas y producción por las células espumosas de factores de crecimiento como bFGF, IGF-I, VEGF, IL-1, M-CSF, TGFp, TGFa, TNFa, HB-EGF, PDGF, IFN-y y GM-CSF. Las tasas de transmigración, por ejemplo, pueden medirse usando un sistema in vitro para cuantificar el número de monocitos que migran a través de la monocapa endotelial y hacia la capa de colágeno del espacio subendotelial.

Pueden diseñarse sistemas in vitro para identificar compuestos capaces de activar la eferocitosis. Tales compuestos pueden incluir, pero no están limitados a, péptidos hechos de aminoácidos de configuración D y/o L, fosfopéptidos, anticuerpos y moléculas orgánicas o inorgánicas pequeñas. El principio de los ensayos usados para identificar compuestos que regulan por incremento CDKN2B o calreticulina implica la preparación de una mezcla de reacción de la proteína y un compuesto de prueba en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que los dos componentes interactúen y detectar el cambio resultante en la actividad biológica deseada. Alternativamente, puede usarse un ensayo de unión simple como método de selección inicial. Estos ensayos pueden realizarse de varias maneras. Por ejemplo, un método para realizar dicho ensayo implicará anclar una proteína o una sustancia de prueba sobre una fase sólida y detectar complejos anclados sobre la fase sólida al final de la reacción.

En un ensayo de unión, la reacción puede realizarse en una fase sólida o en una fase líquida. En un ensayo en fase sólida, el componente no inmovilizado se añade a la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Una vez que se ha completado la reacción, los componentes sin reaccionar se eliminan en condiciones tales que cualquier complejo formado permanecerá inmovilizado en la superficie sólida. La detección de complejos anclados en la superficie sólida puede lograrse de varias maneras. Cuando el componente previamente no inmovilizado está previamente marcado, la detección del marcado inmovilizado en la superficie indica que se formaron complejos. Cuando el componente previamente no inmovilizado no está previamente marcado, puede usarse un marcador indirecto para detectar complejos anclados en la superficie; por ejemplo, usando un anticuerpo marcado específico para el componente no inmovilizado previamente (el anticuerpo, a su vez, puede marcarse directamente o indirectamente con un anticuerpo anti-lg marcado).

Alternativamente, puede llevarse a cabo una reacción de unión en una fase líquida, los productos de la reacción separados de los componentes sin reaccionar y los complejos detectados; por ejemplo, usando un anticuerpo inmovilizado específico para el producto génico objetivo o el compuesto de prueba para anclar cualquier complejo formado en la solución, y un anticuerpo marcado específico para el otro componente del posible complejo para detectar complejos anclados.

Pueden usarse sistemas basados en células como los descritos anteriormente para identificar compuestos que actúan para mejorar los síntomas de la enfermedad cardiovascular. Por ejemplo, tales sistemas celulares pueden exponerse a un compuesto de prueba a una concentración suficiente y durante un tiempo suficiente para provocar tal mejora de los síntomas de la enfermedad cardiovascular en las células expuestas. Después de la exposición, se examinan las células para determinar si uno o más de los fenotipos celulares de la enfermedad cardiovascular han sido alterados para parecerse a un fenotipo de enfermedad no cardiovascular más normal o más del tipo salvaje.

Además, pueden usarse sistemas de enfermedades de origen animal, como los descritos anteriormente, para identificar compuestos capaces de mejorar los síntomas de la enfermedad. Tales modelos animales pueden usarse como sustratos de prueba para la identificación de fármacos, productos farmacéuticos, terapias e intervenciones, que pueden ser eficaces en el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, los modelos animales pueden exponerse a un compuesto, sospechoso de mostrar una capacidad para mejorar los síntomas de la enfermedad cardiovascular, a una concentración suficiente y durante un tiempo suficiente para provocar tal mejora de los síntomas de la enfermedad en los animales expuestos. La respuesta de los animales a la exposición puede monitorizarse evaluando la reversión de los trastornos asociados con la enfermedad, por ejemplo, contando el número de placas ateroscleróticas y/o midiendo su tamaño antes y después del tratamiento.

Con respecto a la intervención, cualquier tratamiento que revierta cualquier aspecto de los síntomas de la enfermedad cardiovascular debe considerarse como candidato para la intervención terapéutica de la enfermedad humana. Las dosificaciones de los agentes de prueba pueden determinarse derivando curvas de respuesta a la dosis.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD⁵⁰ (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED⁵⁰ (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción de LD⁵⁰/ED⁵⁰. Se prefieren los compuestos que muestran índices terapéuticos grandes. Aunque pueden usarse compuestos que muestran efectos secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado al diseñar un sistema de administración que dirija tales compuestos al sitio del tejido afectado para minimizar el daño potencial a las células no infectadas y, por lo tanto, reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para uso en humanos. La dosificación de tales compuestos está preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la ED⁵⁰ con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el método de la divulgación, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante que incluya la IC⁵⁰ (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición de síntomas semimáxima) como se determina en cultivo celular. Dicha información puede usarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto rendimiento.

EXPERIMENTAL

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo hacer y usar la presente invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran como su invención ni se pretende que representen que los experimentos siguientes son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular medio en peso, la temperatura está en grados centígrados, y la presión es igual o cercana a la atmosférica.

La presente invención se ha descrito en términos de realizaciones particulares encontradas o propuestas por el presente inventor para comprender modos preferidos para poner en práctica de la invención.

Ejemplo 1

Ratones. Se criaron ratones macho apoE-/-(retrocruzados en un fondo C57BL/6) por nuestro laboratorio como se ha descrito anteriormente y se alojaron en un entorno específico libre de patógenos. Dieta de laboratorio esterilizada estándar y agua estaban disponibles a voluntad. En el día 0, los animales iniciaron una dieta occidental rica en grasas (21% de grasa de leche anhidra, 19% de caseína y 0,15% de colesterol, colorantes N° 101511) durante las semanas siguientes.

Infusión de Angll. A los ratones (de 8 a 10 semanas de edad) se les implantaron minibombas que liberaron Angll por vía subcutánea a una dosis de 1000 ng/kg-1/min-1, como se ha descrito anteriormente (ver Daugherty et al. (1999) Ann NY Acad Sci. 892: 108-118.

Anticuerpos. El anticuerpo monoclonal de lgG2a de rata miap301 (ver Jiang et al. (1999) J Biol Chem.

274(2):559-62) reacciona con CD47 de ratón. Se usó IgG de rata normal como control. El anticuerpo se inyectó en los animales a 200 gg/día i.p. con el programa mostrado en la Figura 1.

Tejido. Los ratones anestesiados se abrieron ventralmente. Se perfundieron los ventrículos cardíacos izquierdos con solución salina tamponada con fosfato (20 ml) bajo presión fisiológica con una salida a través de las aurículas derechas cortadas. Se identificaron regiones suprarrenales de aorta abdominal entre el último par de arterias intercostales y la rama renal derecha. Las ramas mesentérica y renal y la aorta distal a la rama renal derecha se ligaron con suturas de seda, y se recogió la aorta suprarrenal. Esta porción de aorta, que mide =5 mm de longitud, se infundió con =0,3 ml de compuesto OCT con una aguja de calibre 21 para lograr la distensión completa. También se recogieron aortas torácicas entre la arteria subclavia izquierda y el último par de arterias intercostales. Se observó la orientación de las aortas y los tejidos se congelaron de inmediato.

Patología e inmunocitoquímica. Las aortas se obtuvieron a intervalos seleccionados después del inicio de las infusiones de Angll y el tratamiento con anticuerpos, y se seccionaron longitudinalmente o por secciones transversales (7 gm de espesor). Para la caracterización de las secciones transversales, las secciones aórticas se recogieron en serie desde la aorta proximal a la distal. La histología se determinó en secciones que se tomaron a intervalos de 200 gm. Para el examen longitudinal de los tejidos, también se colocaron secciones de 7 gm a intervalos de 200 gm en los portaobjetos. Se realizó tinción histológica estándar.

Se realizó una tinción inmunocitoquímica para identificar macrófagos (MAC3) y músculo liso (actina anti­ músculo liso (a-SMA)). Se examinaron por lo menos 2 portaobjetos, que contenían =15 secciones de tejido, de cada animal para cada tipo de célula. Se usaron un sistema ABC basado en peroxidasa y el AEC de cromógeno rojo para detectar la reacción antígeno-anticuerpo. Los controles incluyeron anticuerpos coincidentes con isotipo y sueros no inmunes.

Resultados

En el día 30, la mortalidad para el grupo control de IgG era del 25%, 3 de 12. Todos tenían una disección aórtica. El grupo tratado con anti-CD47 tuvo una tasa de mortalidad del 16,6% (2 de 12), y un animal tuvo una disección aórtica.

La aorta disecada de los animales de prueba del grupo de control (Figura 2) y el grupo tratado con anti-CD47 (Figura 3) muestra las diferencias en el tamaño y la gravedad del aneurisma, cuyos datos se resumen en la Figura 4.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un agente que aumenta la eferocitosis y/o la fagocitosis de los componentes de una pared vascular enferma para su uso en un método para tratar a un sujeto con enfermedad por aneurisma; en donde el aneurisma se previene o estabiliza,

en donde el agente es un agente anti-Cd47 que reduce la unión de CD47 en una célula apoptópica a la proteína alfa reguladora de la señal (SIRPa) en una célula fagocítica,

y en donde el agente anti-CD47 se selecciona de un anticuerpo anti-CD47, un anticuerpo anti-SIRPa, un polipéptido de SIRPa soluble o un polipéptido de SIRPa soluble unido a un dominio de inmunoglobulina.

2. El agente para el uso de la reivindicación 1, en donde al sujeto se la ha diagnosticado que tiene por lo menos un alelo de riesgo 9p21 para aterosclerosis.

3. El agente para el uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además el paso de genotipar al sujeto para la presencia de por lo menos un alelo de riesgo 9p21.

4. El agente para el uso de la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en donde el alelo de riesgo 9p21 se genotipó mediante la determinación de la presencia de una variante de SNP en 9p21 asociado con el riesgo.

5. El agente para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el sujeto es un humano, opcionalmente en donde al sujeto se le ha diagnosticado un aneurisma., opcionalmente además en donde el aneurisma es: (a) un aneurisma aórtico o (b) tiene de 2 a 6 cm. diámetro.

6. El agente para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el agente anti-CD47 es un anticuerpo anti-CD47.

7. El agente para el uso de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo no activa CD47 tras la unión.

8. El agente para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el agente anti-CD47 es un anticuerpo anti-SIRPa.

9. El agente para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el agente anti-CD47 es un polipéptido de SIRPa soluble.

10. El agente para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el agente anti-CD47 es un polipéptido de SIRPa soluble unido a un dominio de inmunoglobulina.

11. El agente para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la enfermedad por aneurisma es aneurisma aórtico abdominal.