CN101033464A - 表达人颗粒溶素的重组腺病毒及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种表达人颗粒溶素的重组腺病毒，该重组腺病毒的基因组缺失E1区和E3区，并且在E1区位置插入了人颗粒溶素的表达盒，该表达盒依次包括：启动子序列、人颗粒溶素编码序列和聚腺苷酸化信号序列，腺病毒为腺病毒5型Ad5，其制备方法包括：a.克隆人颗粒溶素基因；b.构建表达人颗粒溶素的腺病毒质粒pAd－GRA；c.将重组腺病毒质粒pAd－GRA用PacI酶切消化，常规酚、氯仿/异戊醇抽提，乙醇洗涤，无菌条件下重悬50μl TE中，转染－293细胞。将其用于细胞内感染性疾病如结核病以及肿瘤的治疗，具有安全、可靠、易保存、成本低、使用方便和效率高等特点。

Description

表达人颗粒溶素的重组腺病毒及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及基因治疗领域，特别涉及表达人颗粒溶素的重组腺病毒和其制备方法，以及含有该重组腺病毒的各种药物组合物。

背景技术

颗粒溶素(颗粒溶素，或519基因，Granulysin)是位于杀伤性T细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)细胞胞浆颗粒中的一种蛋白质，属于SAPLIP(saposin-like protein)家族成员之一^[Pena SV，etal.Semin Immunol，1997，9(2)：117-125^]。在机体免疫应答过程中，颗粒溶素与perforin和granzyme等颗粒分子一起排出胞外，参与抗菌、抗病毒和杀伤肿瘤细胞的免疫过程。

外源性刺激首先作用于CTL表面TCR，TCR传递信号，颗粒溶素随胞内颗粒移位到CTL和靶细胞相接触的部位，并释放出胞外，发挥效应。T细胞被外源性抗原或丝裂原激活后3～5天，519基因开放转录，通过选择性剪接可产生多种转录本，主要为519、520和522mRNA，其中522mRNA含量最高。520mRNA和522mRNA的表达产物分别为18kDa和22kDa蛋白质，半衰期短暂，很快降解转化。519mRNA的表达产物为15kDa和9kDa蛋白质，是目前研究最多的颗粒溶素。15kDa片断很快聚集，因半衰期较短，水平有所降低，而后保持稳定。9kDa片断产生速度最慢，由其他较大片段加工而来，在胞内水平逐渐增多，最终稳定在与15kDa相当的水平上^[Manning WC，et al.J Immunol，1992，148(12)：4036-4042.Pena SV，et al.J Immunol，1997，158：2680.^]。NK细胞的519基因在正常状况下有很低水平的表达，在IL-2等刺激作用下表达水平迅速增高，产物又名NKG5。它与猪T细胞和NK细胞产生的NK-lysin 43％相同[Manning WC，et al.J Immunol，1992，148(12)：4036-4042.^]。研究表明，519mRNA只表达于MHC I类分子限制性的CD8⁺CTL和NK细胞中，而CD4-CD8-(DN)CTL细胞中的杀伤颗粒中无颗粒溶素^[Stenger S，et al.Science，1998；282：121-125.^]。在Vgamma9/Vdelta2T淋巴细胞中也检测到颗粒溶素的活性^[Dieli F，et al.J Infect Dis，2001，184(8)：1082-1085.^]。另外少数与T细胞和NK细胞同源的肿瘤细胞(如HuT-78与YT-2)中也有低水平的519mRNA的表达^[pena SV，et al.J Immunol，1997，158：2680.^]。

不断有研究证据表明，颗粒溶素具广谱抗病原菌、真菌和寄生虫的效应。不仅能直接杀伤胞外致病菌，还可在perforin的协同作用下降低胞内病原菌的生存能力。重组表达的颗粒溶素对伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌等G⁺与G-细菌表现出剂量依赖性增强的抑制效应，高于1000倍的CFU计数减少。此外，还可杀死利什曼原虫和新型隐球菌等^[Stenger S，et al.Immunol today，1999，20(8)：390-394.^]。最近有研究表明，颗粒溶素可进入感染水痘-带状疱疹病毒(VZV)的细胞，加速感染病毒的细胞的凋亡、阻止病毒的复制而发挥抗病毒作用，其抗病毒功能域位于aa23-aa51[Hata A，et al.Viral Immunol，2001，14(2)：125-133.^]。

结核杆菌(MTB)是对单核吞噬细胞抵抗力最强的病原菌之一，将结核杆菌与不同浓度的颗粒溶素共同培养，在五次试验中颗粒溶素对结核杆菌表现出剂量依赖性杀伤作用，在72h内杀灭90％的细菌，CFU呈对数减少。然而对于结核杆菌感染的巨噬细胞，颗粒溶素未发现出抗菌活性。颗粒溶素不能像清除胞外结核杆菌一样有效杀灭寄生于细胞内的结核杆菌，可能是由于纯化的重组颗粒溶素无从达到胞内细菌寄生的部位。足够杀伤胞外细菌浓度的颗粒溶素对感染的巨噬细胞几乎没有溶解作用，纯化的perforin能够溶解感染的巨噬细胞，但无论对培养基中还是胞内的结核杆菌均无杀伤力；而perforin和颗粒溶素的混合物既可溶解被感染的巨噬细胞又可显著减弱细菌的生存能力，因而在perforin或T细胞中其它穿孔蛋白提供入胞通路的前提下，颗粒溶素才可杀伤寄生于细胞内的结核杆菌。扫描电镜下，颗粒溶素可引起结核杆菌表面多处损伤和变形。细菌表面失去了正常细菌单独或成群存在时具有的多种小突起结构，细菌表面变形、变构，表明颗粒溶素对结核杆菌有直接杀伤作用。SAPLIP家族中大部分蛋白质都能够降解脂质，或许可以解释富含脂质的结核杆菌细胞壁被颗粒溶素损伤的机制[Stenger S，et al.Science，1998；282：121-125.]。进一步研究证实，颗粒溶素杀伤病原体的能力取决于与细胞壁的直接作用，导致细胞膜的通透性增加和裂解[Emst WA，et al.J Immunol，2001，165(12)：7102-7108.]。

颗粒溶素对肿瘤细胞包括YAC-1、k562、JY等有裂解能力，但对新鲜的人红细胞无此作用^[Stenger S，et al.Immunol today，1999，20(8)：390-394.^]。其对有核靶细胞的溶解表现为剂量依赖性增强。

鉴于颗粒溶素具有上述生物学特性，可认为颗粒溶素在临床上具有广泛抗病原菌、寄生虫、真菌、病毒和杀伤肿瘤细胞的免疫治疗作用，具有潜在的临床价值。

结核病(TB)是目前传染病中威胁全球人类健康的头号杀手，是严重影响全球人类健康的重要公共卫生问题之一。最近十几年来，TB的发病率呈持续上升趋势。据世界卫生组织(WHO)估计，目前全世界共约有22亿人感染结核分枝杆菌，每年约有5000万人感染MTB，TB新发病例800万，250万人因TB而死亡。我国TB的严重程度居世界第二位，仅次于印度。全国感染MTB的人数达到5.5亿，现有TB患者500万，占全球患者的1/4，其中传染性TB患者达到200万。每年死于TB的人数约13万，是其他所有传染病包括寄生虫病死亡人数总和的两倍。

现有的TB治疗药物联合应用，治疗周期较长，需要6-8个月，治疗费用高，药物副作用大，导致患者的依从性不佳、疗程不能完成产生耐药性。目前针对异烟肼、利副平等常用一线抗痨药物的初始耐药率为18.6％，获得性耐药率高达46.5％，尤其是耐多药TB较为严重。旅游和民工潮等因素进一步促进了人口的流动，导致了耐药和耐多药TB的传播和扩散，已经成为我国TB控制的主要限制性因素。慢性感染和细菌在感染者体内的持续存在是TB的显著特征。慢性患者体内的MTB的代谢状态不一，传统的药物多数针对细胞外生长分裂期细菌有效，对休眠或持留菌作用甚微，这也是TB治疗需时长且难以彻底治愈的根本原因。而且休眠或持留菌也是TB容易恶化和以后复发的根源。因而，研究TB的防治新药或新型防治措施是当前全球和我国紧迫而且重要的问题。

肿瘤也是严重危害我国人民健康的重要医学问题之一，其导致的死亡率在我国疾病死因顺位排第二位。利用颗粒溶素对肿瘤细胞特异性的直接裂解作用，也可将颗粒溶素用于肿瘤的治疗，直接杀死肿瘤细胞。

目前，颗粒溶素在临床治疗方面的应用存在以下障碍：1.制备的成本高导致治疗费用高；2.不能进入胞内杀伤胞内的病原体；3.难以到达治疗的靶点部位。克服以上障碍，研究一种成本低、临床应用方便、靶向性好、能进入病变细胞内的颗粒溶素制剂，是解决颗粒溶素临床应用的关键所在，具有重要的临床价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达人颗粒溶素的重组腺病毒，以提供制备颗粒溶素制剂的活性成分，同时，本发明还提供了这种表达人颗粒溶素的重组腺病毒的制备方法和用途，使其具有成本低、方便、高效，靶向性好、能进入病变细胞内，尤其适用于细胞内感染性疾病如结核病以及肿瘤的免疫治疗。

本发明提供的这种表达人颗粒溶素的重组腺病毒的基因组缺失E1区和E3区，并且在E1区位置插入了人颗粒溶素的表达盒，该表达盒依次包括：启动子序列、人颗粒溶素编码序列和聚腺苷酸化信号序列，此所述及的腺病毒为腺病毒5型Ad5，此所述及的人颗粒溶素表达盒的启动子为巨细胞病毒启动子或人乳头瘤病毒启动子，此所述及的人颗粒溶素编码序列具有序列表中序列1所列的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列为序列表中序列2所列的氨基酸序列。

本发明提供的这种表达人颗粒溶素的重组腺病毒的制备方法，包括以下步骤：a.克隆人颗粒溶素基因；b.构建表达人颗粒溶素的腺病毒质粒pAd-GRA；c.将重组腺病毒质粒pAd-GRA用PacI酶切消化，常规酚、氯仿/异戊醇抽提，乙醇洗涤，无菌条件下重悬50μlTE中，转染-293细胞，得到表达人颗粒溶素的重组腺病毒rAd5-GRA。

本发明提供的表达人颗粒溶素的重组腺病毒可作为药物活性成分，与药学上可接受的载体、添加剂和/或赋形剂配合可用于制药。

参照GenBank NM 012483健康人T淋巴细胞颗粒溶素的cDNA序列，取其核苷酸序列的第419位到640位中间段的结构序列，设计特异性的扩增引物，可利用特异引物RT-PCR扩增获得颗粒溶素的cDNA序列，或人工合成该序列，克隆入pUC57载体。克隆的颗粒溶素的基因序列含ATG起始码、人颗粒溶素基因的成熟蛋白编码区和TAA终止码。序列见序列表序列1：

5’ATGGGCCGTGACTACAGGACCTGTCTGACGATAGTCCAAAAACTGAAGAAGATG

GTGGATAAGCCCACCCAGAGAAGTGTTTCCAATGCTGCGACCCGGGTGTGTAGGAC

GGGGAGGTCACGATGGCGCGACGTCTGCAGAAATTTCATGAGGAGGTATCAGTCTA

GAGTTACCCAGGGCCTCGTGGCCGGAGAAACTGCCCAGCAGATCTGTGAGGACCT

CAGGTAA 3’。此序列与GenBank公布序列相比较，其中173位由T变为C，177位由A变为G，属于同义突变。其表达产物相应的氨基酸序列为(序列表序列2)：

MGRDYRTCLTIVQKLKKMVDKPTQRSVSNAATRVCRTGRSRWRDVCRNFMRRYQSR

VIQGLVAGETAQQICEDLR。

酶切回收特异性片段后亚克隆入腺病毒转移载体pShuttle-CMV(Qbiogene)。阳性转移载体命名为pShuttle-CMV-GRA。PmeI酶线形化pShuttle-CMV-GRA后，与pAdEASY-1(ΔE1/ΔE3)质粒(Qbiogene)电穿孔法共转化E.coli BJ5183菌株(Qbiogene)，卡那霉素抗性筛选和酶切鉴定证实重组腺病毒质粒pAd-GRA。pAd-GRA进一步在E.coli DH5α中传代扩增，质粒提取纯化后，PacI酶线性化后回收。线性化后回收的重组腺病毒质粒pAd-GRA磷酸钙法转染QBI-293A细胞(含腺病毒基因组E1区)，产生完整的病毒颗粒，阳性病毒颗粒命名为rAd5-GRA。rAd5-GRA病毒颗粒进一步大规模感染293A细胞，扩大生产，CsCl梯度离心纯化和TCID50定量。

在制备得到本发明的表达人颗粒溶素的重组腺病毒后，可将所得到的纯化的重组腺病毒与生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，以冻干形式或水溶液形式进行混合，可以制成本发明重组并腺病毒载体的临床治疗制剂。如水或生理盐水，可作为本发明重组腺病毒制剂的载体。

含本发明的新型重组腺病毒的药物制剂，可以常规方式施用于需要治疗的个体，这些方式包括(但不局限于)：静脉注射、肌肉注射、呼吸道吸入、皮下注射等途径。对于局部给药，可以直接将本发明的制剂注射到病变局部或周围，如肿瘤块中或其周围。经实验研究证实，利用腺病毒可以天然感染多种类型细胞的特性，本发明提供的rAd5-GRA腺病毒颗粒可以感染肿瘤细胞或巨噬细胞，并在细胞水平上，可分别杀伤肿瘤细胞或杀伤巨噬细胞内的MTB。

附图说明：

图1是重组人颗粒溶素腺病毒结构示意图；

图2是重组人颗粒溶素腺病毒生产工艺流程图。

具体实施例：

下面结合附图和具体实施例进一步阐述本发明，下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。实施例中未注明实验具体条件的方法，通常按照常规条件进行，如《分子克隆》(第三版，科学出版社)或厂家提供的说明书进行。

实施例1.人颗粒溶素基因的克隆

参照GenBank颗粒溶素cDNA序列，取其核苷酸序列的第419位到640位中间段的结构序列，人工合成该基因片段，并将合成的基因片段，克隆到载体pUC57上，并测序证实。委托上海生物工程公司完成。该颗粒溶素的基因序列如下(序列表序列3)：

5’GGCCGTGACTACAGGACCTGTCTGACGATAGTCCAAAAACTGAAGAAGATGGTG

GATAAGCCCACCCAGAGAAGTGTTTCCAATGCTGCGACCCGGGTGTGTAGGACGGG

GAGGTCACGATGGCGCGACGTCTGCAGAAATTTCATGAGGAGGTATCAGTCTAGAG

TTACCCAGGGCCTCGTGGCCGGAGAAACTGCCCAGCAGATCTGTGAGGACCTCAG

G3’。

实施例2.表达人颗粒溶素的腺病毒载体的构建

设计扩增人颗粒溶素基因片段的引物，上游引物含XhoI和ATG起始码，下游引物含TAA终止码和HindIII。PCR方法扩增目的基因，克隆入pZero-T载体(由北京宝赛生物公司完成)。酶切鉴定证实后，序列测定。克隆和表达的颗粒溶素的基因序列见序列表序列1。其表达产物相应的氨基酸序列见序列表序列2。

XhoI和HindIII酶切回收特异性片段后，亚克隆入腺病毒转移载体pShuttle-CMV(Qbiogene公司提供，6.6kb)相应的酶切位点，酶切鉴定证实并命名为pShullte-CMV-GRA。PmeI酶切pShullte-CMV-GRA，线性化后，胶回收试剂盒回收，重悬于去离子水中，紫外分光光度计定量后，稀释到2μg DNA/10μl H2O。质粒pAdEasy-1(Qbiogene公司)包含腺病毒血清型5(Ad5)基因组，大小33.4kb，缺乏腺病毒血清型5基因组E1区(核苷酸1-3533)和E3区(核苷酸28，130-30，820)。常规方法制备E.coli BJ5183(Qbiogene公司)电穿孔感受态细胞，各取40μl电感受态细胞，分别加入两个2mm电穿孔杯中，各加入上述线性化回收的转移质粒5μl。其中一个杯中再加入1μl质粒pAdEasy-1(100ng/μl)作为实验组。另外一个杯中加入1μl去离子水作为对照组。立即放入Eppendorf电穿孔仪电穿，设置电压2.5kv。电穿后，重悬上述转化物于1ml LB培养液中，37℃振荡培养1小时。按不同量涂布于3个LB平板(kan 50μg/ml)，37℃培养至少24h后，挑取实验平板上的克隆，碱裂解法提取质粒，0.7％琼脂糖凝胶电泳鉴定40kb大小条带。将上述鉴定符合大小的重组质粒，同上法电穿孔转染E.coli DH5α，涂布于LB平板(kan 50μg/ml)，挑取抗性克隆，扩大培养后，提取重组腺病毒质粒并纯化。命名为重组pAd-GRA腺病毒质粒。

实施例3.表达人颗粒溶素的重组腺病毒的制备、扩增和滴度检测(见图2：生产工艺流程图)

20μg重组腺病毒质粒用PacI酶切消化，常规酚、氯仿/异戊醇抽提，乙醇洗涤，无菌条件下重悬50ul TE中，参照说明书磷酸钙法转染-293细胞，得到表达人颗粒溶素的重组腺病毒rAd5-GRA(见图1：重组人颗粒溶素腺病毒结构示意图)。

以该重组腺病毒rAd5-GRA为活性成分，按常规医学方法制成滴鼻剂、喷雾剂、注射剂和口服剂。

实施例4.重组腺病毒的鉴定

重组rAd5-GRA感染293细胞后7天，细胞出现病变，刮下细胞，反复冻融，收获病毒，此为第一代种子病毒，置-80℃保存。取第一代种子病毒上清夜，感染293细胞，待细胞出现病变后，收集细胞进行以下各项鉴定。PCR证实重组腺病毒中确实有颗粒溶素基因的整合、western blot证实重组腺病毒可表达颗粒溶素蛋白。

实施例5重组腺病毒rAd5-GRA的制备、检定

大量培养293细胞，待细胞生长至80-90％时，接种重组腺病毒，3-4d后，待细胞病变达到+++～++++时，收集细胞，反复冻融4次，离心取上清，用PEG6000沉淀，细胞培养上清也同样浓缩，将沉淀悬于生理盐水中，氯化铯密度梯度超速离心，纯化病毒。TCID50测定病毒滴度。-80℃冻存备用。病毒检定结果为：无菌实验阴性，电镜检查无细菌、支原体、真菌和其他微生物污染。病毒可稳定传代20代以上而无滴度下降。

以下为序列表。

                   序列表

<110>华中科技大学

<120>表达人颗粒溶素的重组腺病毒及其制备方法和用途

<130>1

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>222

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(222)

<223>

<400>1

ggc cgt gac tac agg acc tgt ctg acg ata gtc caa aaa ctg aag aag    48

Gly Arg Asp Tyr Arg Thr Cys Leu Thr Ile Val Gln Lys Leu Lys Lys

1               5                   10                  15

atg gtg gat aag ccc acc cag aga agt gtt tcc aat gct gcg acc cgg    96

Met Val Asp Lys Pro Thr Gln Arg Ser Val Ser Asn Ala Ala Thr Arg

            20                  25                  30

gtg tgt agg acg ggg agg tca cga tgg cgc gac gtc tgc aga aat ttc    144

Val Cys Arg Thr Gly Arg Ser Arg Trp Arg Asp Val Cys Arg Asn Phe

        35                  40                  45

atg agg agg tat cag tct aga gtt acc cag ggc ctc gtg gcc gga gaa    192

Met Arg Arg Tyr Gln Ser Arg Val Thr Gln Gly Leu Val Ala Gly Glu

    50                  55                  60

act gcc cag caa atc tgt gag gac ctc agg    222

Thr Ala Gln Gln Ile Cys Glu Asp Leu Arg

6570

<210>2

<211>74

<212>PRT

<213>人类

<400>2

Gly Arg Asp Tyr Arg Thr Cys Leu Thr Ile Val Gln Lys Leu Lys Lys

1               5                   10                  15

Met Val Asp Lys Pro Thr Gln Arg Ser Val Ser Asn Ala Ala Thr Arg

            20                  25                  30

Val Cys Arg Thr Gly Arg Ser Arg Trp Arg Asp Val Cys Arg Asn Phe

        35                  40                  45

Met Arg Arg Tyr Gln Ser Arg Val Thr Gln Gly Leu Val Ala Gly Glu

    50                  55                  60

Thr Ala Gln Gln Ile Cys Glu Asp Leu Arg

65                  70

Claims (8)

1.一种表达人颗粒溶素的重组腺病毒，其特征在于，该腺病毒的基因组缺失E1区和E3区，并且在E1区位置插入了人颗粒溶素的表达盒，该表达盒依次包括：启动子序列、人颗粒溶素编码序列和聚腺苷酸化信号序列。

2.根据权利1所述的表达人颗粒溶素的重组腺病毒，其特征在于，所述的腺病毒为腺病毒5型Ad5。

3.根据权利1所述的表达人颗粒溶素的重组腺病毒，其特征在于，所述的人颗粒溶素表达盒的启动子为巨细胞病毒启动子或人乳头瘤病毒启动子。

4.根据权利1所述的表达人颗粒溶素的重组腺病毒，其特征在于，所述的人颗粒溶素编码序列具有序列表中序列1所列的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列为序列表中序列2所列的氨基酸序列。

5.一种表达人颗粒溶素的重组腺病毒的制备方法，包括以下步骤：

a.克隆人颗粒溶素基因；

b.构建表达人颗粒溶素的腺病毒质粒pAd-GRA；

c.将重组腺病毒质粒pAd-GRA用PacI酶切消化，常规酚、氯仿/异戊醇抽提，乙醇洗涤，无菌条件下重悬50μl TE中，转染-293细胞，得到表达人颗粒溶素的重组腺病毒rAd5-GRA。

6.一种药物制剂，其特征在于，含有活性成分权利要求1至4中任一项所述的表达人颗粒溶素的重组腺病毒。

7.一种药物组合物，其特征在于，包含有效剂量的权利要求1至4中任一项所述的表达人颗粒溶素的重组腺病毒和药学上可接受的载体、添加剂和/或赋形剂。

8.权利要求1至4中任一项所述的表达人颗粒溶素的重组腺病毒在制药中的应用。

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