CN1665921A - 用于免疫治疗的腺病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含病毒载体的组合物、方法和试剂盒，所述病毒载体可用于免疫治疗。具体地讲，本发明提供了具有B亚族腺病毒衣壳鞭毛的病毒载体，该病毒载体被构建成在具有高转导效率的抗原提呈细胞(例如，树突状细胞)内表达转基因序列。优选的是，所述转基因序列为retrogen表达框，以及所述腺病毒衣壳鞭毛为Ad11鞭毛。

Description

用于免疫治疗的腺病毒载体
本申请要求美国临时申请序列号60/376,498的优先权，该临时申请的申请日是2002年4月30日，以引用方式并入本文。
本申请的实施例涉及的一些工作受到了国家卫生研究院号码为P01 HL53750政府支持项目的部分资助。政府对此发明可以享有一定的权利。
技术领域
本发明提供了包含病毒载体的组合物、方法和试剂盒，所述病毒载体可用于免疫治疗。具体地讲，本发明涉及具有B亚族腺病毒衣壳鞭毛的病毒载体，所述病毒载体被构建成在具有高转导效率的抗原提呈细胞(例如，树突状细胞)内表达转基因序列。优选的是，所述转基因序列为retrogen表达框，以及所述腺病毒衣壳鞭毛为Ad11鞭毛。
背景技术
据美国疾病控制中心报道：全世界有近3.5亿人感染了人类乙型肝炎病毒(HBV)。75％的感染者生活在亚洲和西太平洋地区。如不进行有效地治疗，平均5～10％的HBV感染者会发展为慢性肝病。在亚洲，慢性HBV的感染率为20～30％。在中国的部分地区，80％的恶性肝细胞癌(HCC)是由于慢性HBV感染导致的。在美国，大约有100万人是慢性HBV的感染者。这种情况的结果是：约15,000人死于肝癌，约20,000人死于肝硬化。人们确定了慢性HBV感染是导致HCC的原因(Beasley and Hwang，Semin.Liver Dis.，4：113：21，1984，以引用方式并入本文)。HBV是非嗜细胞病毒，肝损伤主要是由针对感染了病毒的肝细胞所产生的机体免疫反应和炎性细胞因子的产生引起的。强烈的、多克隆的和多特异性的细胞毒素及辅助T细胞对HBV的反应在急性自身限制性乙肝患者的外周血液中容易被检测到，但在慢性感染者或HCC患者中较弱、有抗原性限制或无法检测到(参见Kagawa et al.，CancerRes.，61：3330-8，2001，以引用方式并入本文)。
因为在慢性HBV感染者和HBV相关的HCC患者中，CTL、Th活性及抵抗HCV的血清免疫性较弱或是缺少，加强T细胞对HBV核心抗原反应的治疗具有终止慢性HBV感染及攻击HCC的潜能(参见Ferrariet al.，J.Immunol.，145：3442-9，1990；和Jung et al.，J.Virol.，69：3358-68，1995，上述两份文献以引用方式并入本文)。研究HBV感染的转基因小鼠、美洲旱獭或黑猩猩模型的几个证据暗示了HBV免疫疗法可有效治疗慢性乙型肝炎(参见Mancini et al.，J.Immunol.，161：5564-70，1998；以及Pancholi et al.，Hepatology，33：448-54，2001，上述两份文献以引用方式并入本文)。在此基础上，最近有两个多中心的随机设对照的研究已证明HBV核心抗原的免疫疗法在降低HBV的复制和病毒血症治疗中的有效性(参见Pol et al.，J.Hepatol34：917-21，2001和Lau，J.Gastoenterol.Hepatol.15 Suppl：E46-52，2000，上述两份文献以引用方式并入本文)。根据上述内容，我们所需要的是改进用于清除慢性HBV感染及消灭HCC的免疫疗法的组合物和方法。
发明内容
本发明提供了含病毒载体的组合物、方法和试剂盒，所述病毒载体可用于免疫治疗。具体地讲，本发明提供了具有B亚族腺病毒衣壳鞭毛的病毒载体，所述病毒载体被构建成在具有高转导效率的抗原提呈细胞(例如，树突状细胞)内表达转基因序列。优选的是，所述转基因序列为retrogen表达框，以及所述腺病毒衣壳鞭毛为Ad11鞭毛。
在一些实施方案中，本发明提供了含腺病毒载体的组合物，其中所述腺病毒载体包含：a)一种腺病毒衣壳，其中所述腺病毒衣壳包含选自Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、以及Ad50的B亚族腺病毒衣壳鞭毛；以及b)核酸分子，其中所述核酸分子包含编码retrogen蛋白质的retrogen表达框序列，其中所述retrogen蛋白质包含：i)抗原蛋白质，ii)连接于所述抗原蛋白质N末端的前导序列(分泌序列)，以及iii)连接于所述抗原蛋白质C末端的细胞结合域。
在某些实施方案中，所述核酸分子还包含Ad ITR左侧序列和AdITR右侧序列。在具体的实施方案中，所述核酸分子还包含一种对腺病毒衣壳鞭毛编码的序列(例如，对选自Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、以及Ad50的腺病毒鞭毛的编码)。在另外的实施方案中，所述核酸分子还包含腺病毒包装序列。在一些实施方案中，所述核酸分子缺少至少一个选自L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、以及E3中的腺病毒基因(例如，E1和/或E3)。在另外的实施方案中，所述核酸分子缺少至少五个选自L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、以及E3中的腺病毒基因(例如，E1、E3、E2A、E2B、以及E4)。在其他实施方案中，所述核酸分子缺少下列所有的或几乎所有的腺病毒基因：L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、以及E3(如，“空壳病毒”)。
在优选实施方案中，腺病毒鞭毛为Ad11鞭毛(如实施例中所示，即使与Ad35鞭毛相比，Ad11鞭毛提供了被显著改善了的转导效率)。在另外的实施方案中，所述腺病毒衣壳还包含Ad5无鞭毛衣壳成分(即，除去鞭毛的衣壳是Ad5)。在一些实施方案中，腺病毒衣壳还包含Ad11或Ad35无鞭毛衣壳成分。在具体的实施方案中，所述核酸分子在腺病毒衣壳内(参见图1)。
在另外的实施方案中，所述抗原蛋白质为与肿瘤相关的抗原。在某些实施方案中，与肿瘤相关的抗原选自MAGE、GAGE、DAGE、前列腺特异性抗原、前列腺特异性膜抗原、酪氨酸酶、Gp100、α-胎蛋白、独特型Ig、TCR、Bcr-abl融合产物、P53变种、NY-ESO-1、Her-2/neu、以及Muc-1。在优选实施方案中，抗原蛋白质为HBeAg或HBcAg(例如，腺病毒用于转导树突状细胞，并把该树突状细胞给药至HBV感染患者或HCC患者)。
在一些实施方案中，细胞结合域包含Fc区(例如，IgG1 Fc区)。在其他实施方案中，所述组合物还包含抗原提呈细胞(APC)，如树突状细胞(例如，未成熟的或成熟的树突状细胞)。在某些实施方案中，所述组合物还包含抗原提呈细胞(例如，树突状细胞)，且腺病毒载体在APC(例如，树突状细胞)内。
在一些实施方案中，本发明提供了包含由本发明病毒载体转导的树突状细胞的组合物。这种组合物可给药至需要免疫治疗的患者。在一些实施方案中，树突状细胞最初来源于接受被转导的树突状细胞的患者(例如，PBMC收集于患者，并进行培养，以便产生未成熟树突状细胞并由本发明的病毒载体转导)。这种被转导的树突状细胞可以冷冻干燥或者以其他方式储存至患者需要治疗时。在具体的实施方案中，被转导的细胞保存在标有患者识别信息的小瓶内。
在一些实施方案中，本发明提供了方法，该方法包括以下步骤：a)提供：i)树突状细胞，和ii)一种含腺病毒载体的组合物，其中所述腺病毒载体包含：A)一种腺病毒衣壳，其中所述腺病毒衣壳包含选自Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、以及Ad50的B亚族腺病毒衣壳鞭毛；以及B)核酸分子，其中所述核酸分子包含编码retrogen蛋白质的retrogen表达框序列，其中所述retrogen蛋白质包含：I)抗原蛋白质，II)连接于所述抗原蛋白质N末端的前导序列，以及III)连接于所述抗原蛋白质C末端的细胞结合域；以及b)将所述组合物与所述树突状细胞在感染复数至少为5(如，每个细胞中5个噬斑形成单位(pfu))的一定条件下进行接触，使得至少30％的所述树突状细胞表达所述retrogen蛋白质，从而产生表达retrogen的树突状细胞，其中所述抗原蛋白质由所述表达retrogen的树突状细胞作为MHC-I类抗原和MHC-II类抗原得以提呈。
在某些实施方案中，在感染复数为5～10的条件下进行接触时，至少35％或55％的树突状细胞表达retrogen蛋白质。在具体的实施方案中，在感染复数为10～100的条件下进行接触时，至少70％的树突状细胞表达retrogen蛋白质(参见图2)。在其他实施方案中，在感染复数为100～500的条件下进行接触时，至少90％的树突状细胞表达retrogen蛋白质(参见图2中Ad11)。
在一些实施方案中，接触发生在体外。在具体的实施方案中，所述方法还包括以下步骤：在进行步骤b)之前从个体(例如，人体)中收集细胞如单核细胞，并培养这些细胞(例如，加入GM-CSF或IL-4)以产生未成熟树突状细胞。在一些实施方案中，树突状细胞可直接收集于个体。在一些实施方案中，PBMC通过白血球电泳或其他合适的方法收集于个体。被搜集的细胞再经PBMC淘析获得纯单核细胞成分。然后，这些被收集的细胞可以经培养得到未成熟树突状细胞。
在其他实施方案中，接触发生在体内。在具体的实施方案中，将本发明含病毒载体的组合物给药至个体，使个体的树突状细胞至少有部分被转导。在优选实施方案中，将本发明的病毒载体在一定条件下给药至患者(或者将含本发明病毒载体的树突状细胞给药至患者)，使得患者的症状减轻或消除。优选的是，个体内的被转导的树突状细胞会激发针对本发明病毒载体表达的抗原的Th(例如，CD4+Th)、以及CTL(例如，CD8+CTL)特异性反应。在一些实施方案，接触包括将所述组合物给药至个体。
在一些实施方案中，所述核酸分子还包含Ad ITR左侧序列和AdITR右侧序列。在其他实施方案中，所述核酸分子还包含一种编码腺病毒衣壳鞭毛的序列。在某些实施方案中，所述核酸分子还包含腺病毒包装序列。在另外的实施方案中，所述核酸分子缺少至少一个选自L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、以及E3中的腺病毒基因(例如，E1和/或E3)。在其他实施方案中，所述核酸分子缺少至少五个选自L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、以及E3中的腺病毒基因(例如，E1、E3、E2A、E2B、以及E4)。在其他实施方案中，所述核酸分子缺少下列所有或几乎所有的腺病毒基因：L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、以及E3(如，“空壳病毒”)。
在优选实施方案中，腺病毒鞭毛为Ad11鞭毛。在某些实施方案中，腺病毒衣壳还包含Ad5无鞭毛衣壳的成分。在一些实施方案中，腺病毒衣壳还包含Ad11或Ad35无鞭毛衣壳成分。在其他实施方案中，所述核酸分子在腺病毒衣壳内(参见图1)。
在某些实施方案中，抗原蛋白质为与肿瘤相关的抗原。在其他实施方案中，与肿瘤相关的抗原选自MAGE、GAGE、DAGE、前列腺特异性抗原、前列腺特异性膜抗原、酪氨酸酶、Gp100、α-胎蛋白、独特型Ig、TCR、Bcr-abl融合产物、P53变种、NY-ESO-1、Her-2/neu、以及Muc-1。在优选实施方案中，抗原蛋白质为HBeAg或HBcAg。
在一些实施方案中，细胞结合域包含Fc区(例如，IgG1 Fc区)。在其他实施方案中，所述组合物还包含抗原提呈细胞(APC)，如树突状细胞(例如，未成熟的或成熟的树突状细胞)。在某些实施方案中，所述组合物还包含抗原提呈细胞(例如，树突状细胞)，且所述腺病毒载体在APC(例如，树突状细胞)内。
在一些实施方案中，所述方法还包括步骤c)将表达retrogen的树突状细胞给药至患者。在具体的实施方案中，患者患有疾病(例如，传染病、癌症、自身免疫性疾病等)。在某些实施方案中，患者是HBV感染继发肝细胞癌的患者或HBV感染者。在具体的实施方案中，接触导致树突状细胞从未成熟状态转变为成熟状态。
在一些实施方案中，本发明提供了方法，该方法包括：a)提供：i)树突状细胞，以及ii)一种含腺病毒载体的组合物，其中所述腺病毒载体包含：A)一种腺病毒衣壳，其中所述腺病毒衣壳包含Ad11衣壳鞭毛；以及B)核酸分子，其中所述核酸分子包含编码目标蛋白质的转基因序列；以及b)将所述组合物与所述树突状细胞在感染复数至少为5的一定条件下进行接触，使得至少55％的所述树突状细胞表达所述目标蛋白质，从而产生表达目标蛋白质的树突状细胞。
在某些实施方案中，接触导致树突状细胞从未成熟状态转变为成熟状态。在其他实施方案中，在感染复数为10～100的条件下进行接触时，至少70％的树突状细胞表达目标蛋白质(参见图2)。在一些实施方案中，在感染复数为100～500的条件下进行接触时，至少90％的树突状细胞表达目标蛋白质(参见图2)。
在具体的实施方案中，所述转基因序列为编码retrogen蛋白质的retrogen表达框序列，其中所述retrogen蛋白质包含：i)抗原蛋白质，ii)连接于所述抗原蛋白质N末端的前导序列，以及iii)连接于所述抗原蛋白质C末端的细胞结合域。在某些实施方案中，细胞结合域包含Fc区。在进一步的实施方案中，抗原蛋白质由表达目标蛋白质的树突状细胞作为MHC-I类抗原和MHC-II类抗原来提呈。
在一些实施方案中，接触发生在体外。在其他实施方案中，所述方法还包括以下步骤：在进行步骤b)之前从个体(比如，人体)中收集细胞如单核细胞，并培养这些细胞(例如，加入GM-CSF或IL-4)以产生未成熟树突状细胞。在一些实施方案中，树突状细胞可直接收集于个体。在其他实施方案中，PBMC通过白血球电泳或其他合适的方法从个体搜集。被搜集的细胞再经PBMC淘析获得纯单核细胞成分。然后，这些被收集的细胞可以经培养得到未成熟的树突状细胞。
在其他实施方案中，接触发生在体内。在具体的实施方案中，将本发明含病毒载体的组合物给药至个体，使个体的树突状细胞至少有部分被转导。优选的是，个体内的被转导的树突状细胞会激发针对本发明病毒载体表达的抗原产生的Th(例如，CD4+Th)、以及CTL(例如，CD8+CTL)特异性反应。在一些实施方案，接触包括将所述组合物给药至个体。
在一些实施方案中，所述核酸分子还包含Ad ITR左侧序列和AdITR右侧序列。在其他实施方案中，所述核酸分子还包含一种编码腺病毒衣壳鞭毛的序列。在某些实施方案中，所述核酸序列还包含腺病毒包装序列。在另外的实施方案中，所述核酸分子缺少至少一个选自L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、以及E3中的腺病毒基因(例如，E1和/或E3)。在其他实施方案中，所述核酸分子缺少至少五个选自L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、以及E3中的腺病毒基因(例如，E1、E3、E2A、E2B、以及E4)。在其他实施方案中，所述核酸分子缺少下列所有或几乎所有的腺病毒基因：L5、L2、TP、E1A、E2A、E4、E2A、Pol、IV、E1B、VA、L4、以及E3(如，“空壳病毒”)。
在优选实施方案中，腺病毒鞭毛为Ad11鞭毛。在某些实施方案中，腺病毒衣壳还包含Ad5无鞭毛衣壳成分。在一些实施方案中，腺病毒衣壳还包含Ad11或Ad35无鞭毛衣壳成分。在其他实施方案中，所述核酸分子在腺病毒衣壳内。
在某些实施方案中，抗原蛋白质为与肿瘤相关的抗原。在其他实施方案中，与肿瘤相关的抗原选自MAGE、GAGE、DAGE、前列腺特异性抗原、前列腺特异性膜抗原、酪氨酸酶、Gp100、α-胎蛋白、独特型Ig、TCR、Bcr-abl融合产物、P53变种、NY-ESO-1、Her-2/neu、以及Muc-1。在优选实施方案中，抗原蛋白质为HBeAg或HBcAg。
在一些实施方案中，所述方法还包括步骤c)将表达目标蛋白质的树突状细胞给药至个体。在具体的实施方案中，个体是HBV感染继发肝细胞癌的个体或HBV感染者。
在具体的实施方式中，本发明提供了含编码本发明病毒载体或编码部分本发明病毒载体的核酸序列的组合物。在一些实施方案中，病毒载体至少由2个核酸序列所编码(例如，辅助病毒依赖性腺病毒序列和辅助病毒腺病毒序列或者是能够允许含有转基因序列(如retrogen表达框)的辅助病毒依赖性腺病毒序列表达的辅助病毒腺病毒)。
在某些实施方案中，本发明提供了试剂盒，该试剂盒包含：a)本发明的病毒载体或包含本发明病毒载体的被转导的树突状细胞；以及b)使用所述病毒载体或被转导的树突状细胞对个体的疾病进行治疗的说明书，或者应用所述病毒载体或被转导的树突状细胞进行科学研究的说明书。在一些实施方案中，本发明提供了用编码本发明病毒载体的核酸序列稳定地或瞬时地转染了的细胞系。
附图说明
图1图示了本发明的一种实施方案，其中病毒载体具有Ad11衣壳鞭毛并被用来转导未成熟的树突状细胞，导致成熟树突状细胞产生。
图2图示了在实施例1中描述的Ad5、Ad5/11和Ad5/35转导未成熟树突状细胞的转导效率。
图3图示了在实施例1中描述的Ad5和Ad5/11感染对树突状细胞成熟过程的影响。
图4A图示了实施例2应用的所述retrogen表达框序列。图4B显示了实施例2中描述的被Ad5和Ad5/11转导的树突状细胞中的GFP或retrogen表达的百分比。
具体实施方式
定义
为了便于理解本发明，下面对一些术语进行定义。
在此使用的术语“个体”和“患者”指任何动物，如狗、猫、鸟、以及家畜，优选人。在优选实施方案中，个体患有能够利用树突状细胞进行免疫治疗的疾病。
在此使用的术语“转导”或“感染”指把病毒内的病毒DNA导入宿主细胞(例如，未成熟树突状细胞)的方法。
在此使用的短语“无鞭毛衣壳成分”指除去衣壳鞭毛的病毒(例如，腺病毒)衣壳。
在此使用的术语“具有编码多肽的核苷酸序列的寡核苷酸”、“具有编码多肽的核苷酸序列的多核苷酸”、以及“编码肽或蛋白质的核酸序列”表示含有特定多肽编码区域的核酸序列。编码区域可以以cDNA、基因组DNA、或RNA的形式呈现。当以DNA形式呈现时，寡核苷酸或多核苷酸可以是单链(例如，有意义链)或双链。如果需要使转录适当地启始和/或初级RNA转录正确地进行，适当的控制因子如增强子/启动子、剪接点、多腺苷酸信号等可能放置于靠近基因的编码区域。或者，用于本发明的表达载体的编码区域可以包含内源的增强子/启动子、剪接点、间插序列、多腺苷酸信号等，或者是内源和外源的控制因子的组合。
同样，在此使用的术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”在序列大小上没有限制或区别。两个术语仅指由核苷酸组成的分子。同样，术语“肽”、“蛋白质”、以及“多肽”也没有序列大小的区别。这些术语仅指由氨基酸残基组成的分子。
在此使用的术语“辅助病毒依赖性病毒DNA”或“有壳病毒DNA”指编码病毒载体的病毒DNA，该病毒载体含病毒复制和包装时必需的顺式作用DNA序列，但通常不包括病毒编码序列(参见美国专利号6,083,750，以引用方式并入本文)。这些载体能够容纳至约36kb的外源DNA并且不能够表达足以用于复制的病毒蛋白质。辅助病毒依赖性病毒载体是通过辅助病毒依赖性病毒DNA在辅助病毒腺病毒存在下的复制产生的，辅助病毒腺病毒单独或加上包装细胞系提供需要的反式病毒蛋白质，使得辅助病毒依赖性病毒DNA能够进行复制。美国专利号6,083,750中描述了有壳载体的构建。
在此使用的术语“辅助病毒DNA”指编码辅助病毒载体的病毒DNA，其单独或加上包装细胞系能提供反式病毒蛋白质，使得有壳病毒能够进行复制。例如，辅助病毒可以提供具有B亚族腺病毒鞭毛的衣壳。术语“辅助病毒腺病毒”或“辅助病毒”指能够在特定宿主细胞内复制的腺病毒。例如，宿主细胞可以提供腺病毒基因产物如E1蛋白质。‘辅助病毒’可以用来提供反式功能(例如，蛋白质)，该功能为第二个非复制型病毒(例如，有壳病毒载体)所缺乏。因此，在含有辅助病毒和第二病毒的细胞内，第一复制型病毒可以“辅助”第二非复制型病毒进行病毒基因组的繁殖。辅助病毒可以包括在某些破坏剂的存在下能削弱辅助病毒复制的序列。具有破坏性序列的辅助病毒的例子是(+)lox(+)pol辅助病毒。(+)lox(+)pol辅助病毒是一个E1-区被删除、E3-区被删除的病毒，该病毒能够利用Cre重组酶进行负选择，并且在它的E3区带有碱性磷酸酶报告基因。由包装因子I-V组成的包装信号在直接重复方向上与loxP位点相连接，因此，在Cre(破坏剂)存在下允许去除包装信号。
术语“病毒”指不能自主繁殖的(如，复制需要利用宿主细胞的繁殖系统)、超显微镜下可见的、细胞内的专性寄生物。腺病毒是双链DNA病毒。左、右反向末端重复序列(ITR)是分别位于腺病毒线性基因组5′和3′末端的短元件，并且在病毒DNA复制时所需要。左ITR通常位于腺病毒基因组的1-130碱基对之间(可表示为0-0.5mu)。右ITR通常位于腺病毒基因组的约35800至末端碱基对之间(可表示为99.5-100mu)。两个ITR序列互相反向重复。
在此使用的术语“目标基因”或“转基因序列”指被插入载体或质粒的基因，其在宿主细胞内的表达(表达目标蛋白质)是所希望的。转基因序列包括具有治疗价值的基因和报告基因。优选的是，转基因序列编码的目标蛋白质是抗原(例如，与肿瘤相关的抗原)。
在此使用的术语“治疗”包括治疗性处理和预防措施。需要治疗的个体包括那些已经出现病症和需要预防病症出现的个体。
短语“在一定条件下使得症状减轻”指对于任何可以通过受病毒转导的树突状细胞的免疫治疗的疾病，任何可检测症状的定性或定量的减轻，包括但不限于以下几方面：对于疾病恢复速度的可观察效果(例如，体重的增长速度)、肿瘤体积的减小、或者减轻至少一种通常与特定疾病有关的症状。
发明详述
本发明提供了含病毒载体的组合物、方法和试剂盒，所述病毒载体可用于免疫治疗。具体地讲，本发明提供了具有B亚族腺病毒衣壳鞭毛的病毒载体，该病毒载体被构建成在具有高转导效率的抗原提呈细胞(例如，树突状细胞)内表达转基因序列。优选的是，所述转基因序列为retrogen表达框，以及所述腺病毒衣壳鞭毛为Ad11鞭毛。以下部分将提供有关本发明的描述：I)具有B亚族腺病毒鞭毛的病毒载体；II)由病毒载体表达的目标蛋白质；以及III)以病毒载体树突状细胞为基础的免疫治疗。
I.具有B亚族腺病毒鞭毛的病毒载体
本发明的病毒载体具有B亚族腺病毒鞭毛。例如，B亚族腺病毒鞭毛可以为Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、Ad50、或者是它们的组合。图1图示了本发明中腺病毒衣壳鞭毛为Ad11的一种实施方案。本发明具有B亚族腺病毒鞭毛(例如，Ad11)的病毒载体有重要的优越性，如增加人类树突状细胞的转导效率，还可以导致未成熟人类树突状细胞的成熟。具有Ad11鞭毛的病毒载体已显示了显著的优势。例如，以Ad11鞭毛为基础的载体的转导效率与以Ad5为基础的载体相比有显著的提高，同样的结果也显示在具有B亚族鞭毛(如，Ad35，参见图2)的其他病毒载体上。本发明的病毒载体由于改善了取向性可以在很低的感染复数下用来转导树突状细胞。这就使得病毒载体在较低的感染复数下在树突状细胞内能够表达目标蛋白质(参见下文)。如此低的感染复数使转导树突状细胞的剂量更低，并且使人类免疫治疗方案(参见下文)得到改进。
任意类型的病毒载体都可以应用于本发明。例如，已经表达B亚族衣壳鞭毛的未包膜的DNA或RNA病毒的任意类型，或者被修饰以表达B亚族衣壳鞭毛(例如，通过删除正常鞭毛基因并且用B亚族衣壳鞭毛替换它)的DNA或RNA病毒的任意类型都可以应用于本发明。例如，在一些实施方案中，病毒载体一部分是具有Ad35或Ad11鞭毛的腺病毒载体，而腺病毒衣壳的其余部分是Ad5。这些病毒载体被称为Ad5/11或Ad5/35腺病毒载体。在现有技术中已描述过产生这种嵌合载体的技术(例如，参见Shayakhmetov et al.，J.of Virol.，74(6)：2567-2583，2000；Shayakhmetov and Lieber，J.of Virol.74(22)：10274-10286，2000；以及WO0073478，上述全部内容以引用方式并入本文)。例如，在Shayakhmetov等人文章中的图5A和在WO0073478的图16、18中提出了有用的构建体。同样值得注意的是，在现有技术中已经有编码Ad11鞭毛的序列(例如，参见Genbank Accession No.L08231、L08232；Mei and Wadell，Virology，194：453-462，1993，以引用方式并入本文)。类似的技术可以用来制造其他嵌合的病毒载体。
如上所述，本发明并不局限于任何特定类型的病毒载体。在现有技术中已知很多适合的载体，包括但并不局限于如下这些：腺病毒载体；第二代腺病毒载体；有壳腺病毒载体；腺相关病毒载体；以及慢病毒载体。所有这些载体可以被修饰以便具有(或者已经包含)B亚族腺病毒鞭毛。腺病毒载体是本发明首选的病毒载体。下文将更详细介绍腺病毒载体。
1.腺病毒载体
本发明优选应用腺病毒载体。有51种腺病毒血清型被分为A至F亚族。B亚族腺病毒载体包含B亚族腺病毒鞭毛，而A亚族、以及C-F亚族可以被修饰以包含B亚族腺病毒鞭毛。自体繁殖的腺病毒(Ad)载体广泛地被应用以在体内和体外向各种各样的细胞类型传输异体基因。“自体繁殖的病毒”指的是通过单链DNA(重组病毒基因组)转染到单包装细胞系中而产生具有感染性病毒的病毒；自体繁殖的病毒在繁殖时不需要使用辅助病毒。第一代腺病毒载体被删除了E1和E3基因。
2.第二代腺病毒载体
为了解决和第一代腺病毒载体有关的病毒复制问题，由此发展了被称为“第二代”的腺病毒载体。第二代同样经过修饰(或已含有)使得其具有B亚族腺病毒鞭毛。第二代腺病毒载体还删除了腺病毒基因组(E2A、E2B、以及E4)的早期区域。在大规模载体制备期间，经高度修饰的第二代腺病毒载体不太可能产生具有复制功能的病毒，并且腺病毒基因组复制的完全抑制作用能够消除后期基因的复制。由此针对后期病毒蛋白质的宿主免疫反应得以降低[参见Amalfitano et al.，J.Virol.72：926-933(1998)]。从腺病毒基因组中删除E2A、E2B、以及E4基因还增加了克隆容量。
3.有壳腺病毒载体
“有壳”、“空壳”、或辅助病毒依赖性腺病毒载体包含顺式作用DNA序列，其指导腺病毒的复制和包装，但并不包含病毒编码序列(参见Fisher et al.，Virology 217：11-22(1996)；Kochanek et AL.，Hum.Gen.Ther.，10：2451-9，1999；和美国专利No.5,994,132，上述全部内容以引用方式并入本文)。有壳载体是通过在辅助病毒存在下进行复制而制备的有缺陷的病毒，其提供了所有必需的反式病毒蛋白质。辅助病毒可以提供必需的序列以制备病毒衣壳。在本发明中，辅助病毒能够表达具有B亚族腺病毒鞭毛(例如，Ad11鞭毛)的衣壳。由于有壳载体不包含任何病毒基因，因此病毒蛋白质的表达是不可能的。现有技术中已经对辅助病毒依赖性病毒的制备进行了描述[参见Hardy et al.，J.Virol.71：1842-1849(1997)和hartigan-O′conner et al.，J.Virol.73：7835-7841(1999)]。有壳腺病毒载体最多能够容纳至约37kb的外源DNA，但是28～30kb的容量更普遍。
II.由病毒载体表达的目标蛋白质
如上所述，本发明对于具有B亚族腺病毒鞭毛(例如，具有B亚族腺病毒鞭毛如Ad11鞭毛的辅助病毒依赖性腺病毒载体)的病毒载体的生产是有益的。在优选的实施方案中，生产的病毒载体包括编码目标蛋白质的转基因序列(异源核酸序列)，使得该载体有利于各种各样的应用(体外蛋白质表达、治疗性应用、使用树突状细胞的免疫疗法等)。适当的异源DNA序列包括，例如，对在接受个体内有缺陷或缺失的蛋白质编码的核酸序列，或对具有希望的生物学或治疗效果(例如，抗菌、抗病毒、或抗肿瘤的作用)的蛋白质编码的异源基因。其他适当的异源核酸包括，但并不限于，对那些用于内分泌、代谢、血液、心血管、神经、肌肉骨骼、泌尿、肺部、以及免疫紊乱治疗的蛋白质编码的核酸，所述的免疫紊乱还包括炎性疾病、自身免疫性疾病、慢性感染性疾病如爱滋病、癌症、高血脂症、胰岛素紊乱如糖尿病和生长失调、各种各样血液病包括各种贫血病、地中海贫血病、以及血友病；遗传缺陷如囊肿性纤维化、高歇氏症、赫尔勒氏症、腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症、以及肺气肿。
在优选实施方案中，转基因序列将编码抗原蛋白质。该抗原可以包括天然的蛋白质或蛋白质片断、或合成的蛋白质或蛋白质片断或肽。抗原的例子包括，但并不限于，能够引起对病毒性或细菌性肝炎、流感、白喉、破伤风、百日咳、麻疹、腮腺炎、风疹、脊髓灰质炎、肺炎球菌、疱疹、呼吸道合胞病毒、b型流感嗜血菌、衣原体、水痘带状疱疹病毒或狂犬病病毒等产生免疫反应的那些抗原。
在其他优选实施方案中，抗原蛋白质为与肿瘤或癌症相关的抗原。例如，抗原蛋白质包括，但并不限于，从MAGE-1至MAGE-3(用于黑色素瘤、肺癌、直肠癌的治疗)、GAGE、DAGE、前列腺特异性抗原(用于治疗前列腺癌)、前列腺特异性膜抗原(用于治疗前列腺癌)、酪氨酸酶(用于治疗黑色素瘤)、Gp100(用于治疗黑色素瘤)、α-胎蛋白(用于治疗肝癌)、独特型Ig(用于治疗B细胞性NHL、骨髓瘤)、TCR(用于治疗T细胞性NHL)、Bcr-abl融合产物(用于治疗CML)、P53变种(用于治疗肺癌、直肠癌、头颈部癌症)、NY-ESO-1(用于治疗黑色素瘤和乳腺癌)、Her-2/neu(用于治疗乳腺癌、肺癌、以及卵巢癌)、以及Muc-1(用于治疗胰腺癌、肺癌、乳腺癌、以及直肠癌)。
在具体的优选实施方案中，抗原是由HBV病毒产生的。如上所述，HBV感染和HCC是世界范围内的主要健康问题。本发明的病毒载体可以包含编码HBV抗原的转基因序列，还可以用来转导树突状细胞(以治疗HBV感染者或HCC患者)。由HBV产生的抗原的一个例子是乙型肝炎核心抗原(HBcAg)。由HBV产生的另一个抗原是HBeAg(现有技术中已知编码这些抗原的序列)。例如，HBcAg的编码序列在基因库中的登记号为M38594。人类乙型肝炎病毒由其中嵌有表面抗原蛋白质的脂质外壳和包含有病毒基因组的蛋白质衣壳内核组成。二十面的病毒粒子是由多个乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的亚结构组成。HBcAg的非微粒形式，即HBeAg，是在HBV感染期间分泌到血清中的。HBeAg的第1-149个氨基酸与HBcAg相同，HBeAg还在N端延伸出10个氨基酸，该10个氨基酸由HBeAg基因前核核心的前核序列编码。在大多数宿主体内HBcAg和HBeAg有高度的免疫原性，在小鼠和短尾猿体内它们主要为体液和T细胞免疫反应。在某些优选实施方案中，在HBeAg基因内，可以将HBeAg C末端的富含精氨酸的氨基酸残基(第150-180位的氨基酸)删除。
在其他优选实施方案中，在本发明病毒载体中的转基因序列是retrogen表达框序列。retrogen技术使用retrogen表达框作为在载体中的转基因。retrogen表达框由编码抗原(例如，与肿瘤相关的抗原)的序列组成，在该抗原的C末端具有细胞结合域序列(用于受体介导的内吞作用)、以及在该抗原N末端具有前导序列/分泌序列(允许分泌抗原)。这项技术已经公开(例如，参见You et al.，Cancer Research，61：197-205，2001；以及Chen等人的WO03025126，上述两份参考文献以引用方式并入本文)。
由于通过MHC-I类抗原提呈途径与通过MHC-II类的明显不同，所以抗原很难由树突状细胞同时通过MHC-I和MHC-II两条途径提呈。例如由被转导的树突状细胞表达的细胞内抗原可以有效地由MHC-I而不是由MHC-II加工并提呈。另一方面，由被转导的树突状细胞表达的分泌蛋白质不能由MHC-I提呈。retrogen表达框技术可以使抗原同时通过MHC-I和MHC-II两条途径提呈，并且可以有效地激活Th、CTL和B细胞(参见上文You et al.)。使用N端前导序列修饰抗原的编码序列以允许分泌，并且使用，例如，IgG的Fc片断修饰抗原编码序列以允许抗原重吸收并通过Fc-γ-受体内吞到树突状细胞内。然后，将该被修饰的基因转导到树突状细胞以产生和分泌融合蛋白质(术语“retrogen”由其逆行性运输/内化的特点而得来)，其通过受体介导的内吞作用被树突状细胞吸收、通过核内体途径被加工以及通过树突状细胞作为MHC-II提呈的外源物质而被提呈，以诱导CD4+Th细胞。内化的抗原也能通过MHC-I途径提呈以直接激活CTL(交叉激活)。在抗原提呈中，通过上调细胞表面的分子和细胞因子使Fc和Fc-γ-受体细胞相互作用激活树突状细胞。表达腺病毒B亚族鞭毛的本发明病毒载体和retrogen表达框的结合显示出在实现树突状细胞转导和人类免疫疗法的有力结合。
III.以病毒载体树突状细胞转导为基础的免疫治疗
本发明的病毒载体更适宜用来转导树突状细胞(例如，人类树突状细胞)，以便该树突状细胞激活需要治疗的患者体内的Th、CTL、和/或B细胞反应。具有腺病毒B亚族鞭毛的本发明病毒载体在较低感染复数(参见图2)下转导树突状细胞并刺激其成熟(参见图3)。在优选实施方案中，本发明的病毒载体包含Ad11衣壳鞭毛，并可以用于转导未成熟树突状细胞(参见图1)。以下对树突状细胞和免疫疗法做进一步描述。
树突状细胞(DC)是专门的抗原提呈细胞，其作为桥梁在先天的、细胞的及体液的免疫反应中起着关键的作用。在体内，树突状细胞战略性地分布在病原体可能进入位置的接触面上。它们捕获抗原，并转移到二级淋巴组织，在那里它们能够激活T辅助细胞(Th)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。它们也和B细胞或可能和NK细胞相互作用。树突状细胞从骨髓祖细胞(CD34+)发展成外周血祖细胞(CD11c+)，其通过同它们的选择素(例如，CD62L)、粘性分子(例如，LFA-1、VLA-4、CD44、CLA)、以及趋化性细胞因子受体(例如，CCR1、-5、-6)的相互作用而向不同外周组织进行迁移。在它们未成熟的状态下，树突状细胞可以有效地捕获抗原。在吸收了抗原并暴露于自然刺激的条件下(自然刺激包括某些传染性物质、炎症细胞因子、或它们CD40受体的触发)，树突状细胞得到活化，并通过引流淋巴迁移至外周淋巴器官，并在那里同T细胞相遇。在这个迁移过程中，树突状细胞成熟为专门的在富于共刺激的情况下提呈大量肽/MHC-I类和MHC-II类复合物的细胞。随着树突状细胞的活化和迁移，抗原的吸收活性和与抗原相关的受体被下调，这导致抗原吸收转变为抗原提呈。同时通过MHC-I类和MHC-II类两条途径将抗原进行加工，这两条途径分别需要CD8+CTL和CD4+Th细胞的活化。CD4+细胞产生细胞因子/共刺激分子，反过来也刺激CTL和B细胞。CTL能够直接杀死肿瘤细胞。树突状细胞的成熟状态在淋巴结中因细胞凋亡而结束。
本发明提供了树突状细胞介导的免疫治疗的方法，特别是用在此描述的病毒载体进行的癌症免疫疗法。采用普通抗原蛋白质/肽的抗肿瘤疫苗的治疗常常得到很差的免疫效果或甚至导致T细胞的免疫耐受作用。通过利用树突状细胞向T细胞提呈肿瘤抗原的能力，树突状细胞能够扮演癌症免疫治疗的重要角色。已有两种疗法用于树突状细胞介导的肿瘤免疫疗法：树突状细胞同抗原蛋白质共同培养(负载)和树突状细胞的基因修饰。树突状细胞被I型限制性合成肽或蛋白质、或同自体肿瘤中提取的天然肽负载。这类方法还包括将树突状细胞暴露在全部肿瘤溶解产物或细胞凋亡体以及肿瘤细胞的融合产物中。树突状细胞基因修饰的疗法是使用病毒载体或非病毒载体(参见Nouri-Shirazi et al.，Immunol.Lett.74：5-10，2000，以引用方式并入本文)将抗原DNA或RNA转入树突状细胞为基础的。与抗原负载树突状细胞相比，被设计为表达给定抗原的树突状细胞具有以下方面的优势：i)能在一段较长的时间内持续地产生出大量的治疗性蛋白质，这对于与MHC-I结合来提呈很重要，因为其转换率比较短；ii)内源产物和对抗原的加工可能使其能更好的接近MHC-I类通路并提呈多元的未经辨认的抗原决定基(相反，肽的使用依赖于对患者的单模标本人白细胞抗原的认知，这将限制任何给定抗原的肽抗原决定基的使用)；以及iii)刺激Th1、Th2和T细胞、B细胞反应的潜力。树突状细胞介导的癌症免疫疗法的可行性已在一系列前沿的研究中得到了证明(参见Nestle，Oncogene，19：6673-9，以引用方式并入本文)。例如，在以载有抗原/肽的树突状细胞为基础的临床试验中，在患恶性黑色素瘤、淋巴瘤、肾细胞癌、以及前列腺癌的患者中频繁地观察到了全部和部分反应，这在以前建立的癌症免疫治疗的方式中没有被观察到(Dannull et al.，Onkologie，23：544-551，200，以引用方式并入本文)。
本发明的病毒载体(具有腺病毒B亚族鞭毛，如Ad11)可以用来向树突状细胞传递转基因(例如retorgen表达框)。通常，非病毒基因体外导入树突状细胞的效率很低。在病毒载体当中，重组逆转录病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒、以及腺病毒已被用于树突状细胞的转导(根据本发明，所有这些病毒都可以被修饰而含有腺病毒B亚族鞭毛)。致癌性逆转录病毒对于培养的树突状细胞的转导率是很低的(Westermann et al.，Gene Ther.，5：264-71，1998，以引用方式并入本文)。然而，本发明的病毒载体具有较高的转导效率，因此最适合于树突状细胞的转导。
在免疫疗法的应用中，本发明的树突状细胞可以在体外或者在体内转导。例如，PBMC可以通过白血球电泳或者其它适合的方法从癌症患者中进行收集。然后单核细胞可以通过淘析或其它适合的方法进行纯化。纯的单核细胞级分可以通过同GM-CFS、IL-4或其他适合的物质共同培养而诱导分化成树突状细胞。然后将未成熟树突状细胞用本发明的病毒载体进行转导，该病毒载体可含有，例如与肿瘤相关的抗原，以获得成熟树突状细胞(参见图1)。接着树突状细胞可给药至患者用来治疗癌症或其它疾病。树突状细胞能最理想地激活患者体内的Th、以及CTL反应(以及B细胞反应)。树突状细胞的转导也可以通过向患者体内直接注射本发明的病毒载体来进行，这样使得患者体内的树突状细胞被转导。
实验部分
接下来提供的实施例是为了证明并进一步举例说明本发明的某些优选实施方案和内容，但并不应被解释为限定其保护范围。
在下面的实验公开中，应用了以下缩写：M(摩尔)；mM(微摩尔)；nM(纳摩尔)；pM(皮摩尔)；mg(毫克)；μg(微克)；pg(皮克)；ml(毫升)；μl(微升)；℃(摄氏度)；OD(光密度)；nm(钠米)；BSA(牛血清蛋白)；PBS(磷酸盐缓冲溶液)。
实施例1具有Ad11和Ad35鞭毛的病毒载体高效转导树突状细胞并激活树突状细胞的成熟
本实施例描述了用于检测具有Ad11或Ad35衣壳鞭毛的腺病毒载体转导人类树突状细胞的能力。这个实施例也检测了这些同样的病毒载体激活人类树突状细胞成熟的能力。
在本实施例中，人类树突状细胞(DC)通过体外分化作用产生。特别是人类树突状细胞可以通过体内分化作用从骨髓CD34+祖细胞(来自于尸体骨髓)产生，也可以在用G-CSF活化后从外周血分离的CD34+祖细胞或CD14+单核细胞产生。这里采用了通过GM-CSF、IL-4、fl3配体、以及TNF对CD34+祖细胞体外分化的标准方法(参见Ferlazzo etal.，J.Immunol.163：3597-604，1999，以引用方式并入本文)。
在本实施例中用的腺病毒载体是第一代腺病毒Ad5载体，该载体经过构建可以表达具有Ad11或Ad35鞭毛(而不是Ad5鞭毛)的GFP。这些病毒载体被称为Ad5/11或Ad5/35腺病毒载体。现有技术中已描述过产生这种嵌合载体的技术(例如，参见Shayakhmetov et al.，J.ofVirol.，74(6)：2567-2583，2000；Shayakhmetov and Lieber，J.of Virol.74(22)：10274-10286，2000；以及WO0073478，上述全部内容以引用方式并入本文)。例如，在Shayakhmetov et al的图5A和在WO0073478的图16、18中提出了有用的构建体。同样值得注意的是，在现有技术中已经有编码Ad11鞭毛的序列(例如，参见Genbank Accession No.L08231、L08232；Mei and Wadell，Virology，194：453-462，1993，以引用方式并入本文)。
Ad5/35和Ad5/11载体、以及Ad5载体用于向未成熟人类树突状细胞转移基因。在37℃、不同的感染复数的条件下进行3个小时的转导，并在感染24小时后用流式细胞技术对GFP的表达进行分析。转导的结果显示，在Ad5/35和Ad5/11的感染复数为5(pfu/细胞)的条件下，分别转染了37％和59％的人类CD11c+树突状细胞。在同样的感染复数下，标准Ad5载体只能转导少于1％骨髓树突状细胞。图2中图示了这些结果。重要的是，在感染复数为100的条件下，获得了Ad5/35和Ad5/11载体的最高转导效率(85～95％)，而最大Ad5剂量(感染复数为1000)的转导效率仅为58％。在许多来自Ad5/35和Ad5/11的驱使转基因表达的启动子中，只有CMV启动子，而不是MSCV或RSV启动子，能启动GFP在树突状细胞中的表达，这说明这些启动子在人类树突状细胞中是无活性的。Ad5/11和Ad5/35载体不能转导小鼠树突状细胞。同Ad5载体相比，Ad5/35和Ad5/11载体的转导动力学特性被显著增强了，这导致在加入病毒后几小时内就出现了很高效的基因表达。在LPS诱导的树突状细胞体外成熟期间，基因表达水平仍然很高。
我们也进行了腺病毒感染对于树突状细胞成熟标记表达影响的检测。未成熟树突状细胞用Ad5-、Ad5/11-、以及Ad5/35-CMV-GFP感染(感染复数为10)或用LPS进行处理。24小时后，用流式细胞技术检测树突状细胞的表面标记。图3图示了这些结果。同未成熟树突状细胞相比，图3表明了表面标记增加的结果。模拟对照试验中只使用了用于稀释病毒的缓冲液。正如图3中的结果所示，在CD86、CD83、以及HLA-DR表达增长的基础上，Ad5/35和Ad5/11的感染也触发了树突状细胞的成熟(图3)。相反，在感染复数为10的条件下，Ad5载体的感染不能诱导成熟标记的显著增加。此外，将未成熟树突状细胞同空的Ad5/11衣壳温育也能诱导树突状细胞的成熟(在图3中所示的相似水平上)，这说明未成熟树突状细胞与假定的Ad11受体和/或颗粒吸收的相互作用已足够激活树突状细胞成熟的信号通路。作为对比，加入LPS后表面标记发生了上调，所述LPS一般被用来诱导树突状细胞的成熟。具有Ad11或Ad35鞭毛的腺病毒载体在很低感染复数的条件下有效转导树突状细胞的能力以及诱导其成熟的能力，说明这些载体将成为人体免疫治疗中十分有用的工具(例如，树突状细胞的体内转导，或树突状细胞的体外转导，然后注射入需治疗的患者体内)。
实施例2HBeAg-Retrogen在由Ad5和Ad5/11第一代载体转导的Hela细胞中的表达
本实施例描述了HBeAg-Retrogen在由Ad5和Ad5/11第一代载体转导的Hela细胞中的表达。本实施例包括具有Ad11鞭毛载体的应用和Retrogen技术。Retrogen技术是使用Retrogen表达框作为载体中的转基因。Retrogen表达框由编码抗原(例如，与肿瘤相关的抗原)的序列组成，在抗原的C末端具有细胞结合域序列(用于受体介导的内吞作用)、以及在抗原N末端具有前导序列/分泌序列(允许分泌抗原)。这项技术已经公开(例如，参见You et al.，Cancer Research，61：197-205，2001；以及Chen等人的WO03025126，上述两份参考文献以引用方式并入本文)。
在本实施例中，RetrogenRetrogen表达框的抗原编码序列是来自人类乙型肝炎病毒(HBV)的HBeAg抗原。人类乙型肝炎病毒由其表面嵌有抗原蛋白质的脂质外壳和含有病毒基因组的蛋白质衣壳内核组成。二十面的病毒粒子是由多个乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的亚结构组成。HBcAg的非微粒形式，即HBeAg，是在HBV感染期间分泌到血清中的。HBeAg的第1-149个氨基酸与HBcAg相同，HBeAg还在N端延伸出10个氨基酸，该10个氨基酸由HBeAg基因前核核心的前核序列编码。在大多数宿主体内HBcAg和HBeAg有高度的免疫原性，在小鼠和短尾猿体内它们主要为体液和T细胞反应。在本实施例中，在HBeAg基因内，将HBeAg C端的富含精氨酸的氨基酸残基(第150-180位的氨基酸)(这段氨基酸残基在HBV感染时被切除)删除。使用的HBeAg来自于“ayw”HBV亚类。该截短的(分泌了的)HBeAg(具有它自身的前导序列，L)在其C端连接于细胞结合域(人类IgG FccDNA)上，用于受体介导的内吞作用。将HBeAg基因置于CMV启动子的控制下，已知所述CMV启动子在树突状细胞中是有活性的。转录被牛生长素聚腺苷酸化信号终止(bPA)。该RetrogenRetrogen表达框图示于图4A。
在本实施例中，在感染复数为10的条件下，用含GFP或HBeAg的Retrogen表达框的第一代Ad5和Ad5/11为基础的载体(参见实施例1)感染Hela细胞。用流式细胞技术对Hela细胞的GFP表达进行分析，或在感染48小时后用FITC标记的抗-Fc抗体对HBeAg表达进行分析。细胞未进行渗透裂解。实验结果示于图4B。(细胞内的)GFP表达和Retrogen表达的相似水平表明Retrogen在活细胞的膜中容易检测到。值得注意的是Hela细胞表达Ad5和Ad11受体。
实施例3HBeAg-Retrogen在由Ad5和Ad5/35第一代载体转导的树突状细胞中的表达
本实施例描述了由Ad5和Ad5/35第一代载体转导的HBeAg-Retrogen的表达。使用的Retrogen表达框在实施例2中进行了描述，所用腺病毒载体在实施例1中进行了描述。在本实施例中，用Ad5和Ad5/35感染未成熟CD11c阳性树突状细胞。同感染了Ad5的细胞相比，感染了Ad5/35的树突状细胞表现了增强的HBeAg表达。未成熟树突状细胞的感染在实施例1中进行了描述。然后感染了Ad5和Ad5/35 HBeAg的树突状细胞和负载了抗原的自体外周T细胞共同培养。同感染了Ad5 HBeAg的细胞相比，在和感染了Ad5/35 HBeAg的树突状细胞共同培养的T细胞中观察到了增强的T细胞增殖和Th1细胞因子IFN-γ的分泌。我们还发现HBeAg特异性CTL活性在用表达Retrogen的Ad5/35载体转导的树突状细胞中比在负载肽的树突状细胞中的强。
综上所述，这些结果表明B族假型腺病毒能在较低的、无毒的感染复数下，使树突状细胞的转导、成熟和抗原特异性免疫反应的刺激更为有效。
实施例4应用具有B亚族衣壳鞭毛的病毒载体的人类免疫疗法
本实施例描述了应用具有B亚族衣壳鞭毛的病毒载体的人类免疫疗法。特别是本实施例描述了通过转导未成熟树突状细胞而实施的免疫疗法来治疗人，该未成熟树突状细胞在(或来自于)HBV感染的肝细胞癌(HCC)患者体内。
患有HCC的人类患者可以用被构建成表达Retrogen表达框的具有B亚族衣壳鞭毛的腺病毒载体进行治疗。例如，具有Ad11鞭毛的病毒载体可以用来转导人类患者的未成熟树突状细胞，该病毒载体包含表达HBeAg的Retrogen表达框。树突状细胞的转导可以发生在体外。来自于患者的树突状细胞可以从患者体内分离，然后使用腺病毒载体进行转导。作为选择，可以将腺病毒载体注射进患者体内靠近树突状细胞的聚集处(例如，淋巴结)或肿瘤附近。转导(体内或体外)能在低感染复数下发生，如感染复数为100或10。被转导的未成熟树突状细胞将在患者体内成熟并向T细胞和B细胞同时提呈MHC-I类和MHC-II类抗原。这提示患者体内的Th、CTL和B细胞反应将被用来对抗HCC肿瘤和HBV感染。这种免疫疗法可以减少或消除HCC和HBV感染的症状。
上述说明书中提及的全部出版物和专利以引用方式并入本文。在不脱离本发明的保护范围和思想的情况下，对本发明的不同改进和对所描述的方法和系统的变形将对本领域技术人员显而易见。尽管本发明结合优选实施方式进行了描述，但是应该理解，本发明的权利要求不应仅仅限定于这样特定的实施方案。事实上，实施本发明所描述方式的不同改变对于化学、医学、以及分子生物学或相关领域的技术人员来说是显而易见的，将落入本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (23)

1.一种含腺病毒载体的组合物，其中所述腺病毒载体包含：
a)一种腺病毒衣壳，其中所述腺病毒衣壳包含选自Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、以及Ad50的B亚族腺病毒衣壳鞭毛；
以及
b)核酸分子，其中所述核酸分子包含编码retrogen蛋白质的retrogen表达框序列，其中所述retrogen蛋白质包含：
i)抗原蛋白质，
ii)连接于所述抗原蛋白质N末端的前导序列，以及
iii)连接于所述抗原蛋白质C末端的细胞结合域。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述腺病毒衣壳鞭毛为Ad11鞭毛。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗原蛋白质为与肿瘤相关的抗原。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗原蛋白质为HBeAg。
5.根据权利要求1所述的组合物，其还包含树突状细胞。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含树突状细胞，而且所述腺病毒载体在所述树突状细胞内。
7.一种方法，该方法包括以下步骤：
a)提供：
i)树突状细胞，以及
ii)一种含腺病毒载体的组合物，其中所述腺病毒载体包含：
A)一种腺病毒衣壳，其中所述腺病毒衣壳包含选自Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、以及Ad50的B亚族腺病毒衣壳鞭毛；
以及
B)核酸分子，其中所述核酸分子包含编码retrogen蛋白质的retrogen表达框序列，其中所述retrogen蛋白质包含：
I)抗原蛋白质，
II)连接于所述抗原蛋白质N末端的前导序列，以及
III)连接于所述抗原蛋白质C末端的细胞结合域；以及
b)将所述组合物与所述树突状细胞在感染复数至少为5的一定条件下进行接触，使得至少30％的所述树突状细胞表达所述retrogen蛋白质，从而产生表达retrogen的树突状细胞，其中所述抗原蛋白质由所述表达retrogen的树突状细胞作为MHC-I类抗原和MHC-II类抗原得以提呈。
8.根据权利要求7所述的方法，其中在感染复数为5～10的条件下进行接触时，至少35％的所述树突状细胞表达所述retrogen蛋白质。
9.根据权利要求7所述的方法，其中在感染复数为10～100的条件下进行接触时，至少70％的所述树突状细胞表达所述retrogen蛋白质。
10.根据权利要求7所述的组合物，其中所述接触发生在体外。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述腺病毒衣壳鞭毛为Ad11鞭毛。
12.根据权利要求7所述的方法，其中所述抗原蛋白质为与肿瘤相关的抗原。
13.根据权利要求7所述的方法，其中所述抗原蛋白质为HBeAg。
14.根据权利要求7所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：
c)将所述表达retrogen的树突状细胞给药至患者。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述患者是HBV感染继发肝细胞癌的患者或HBV感染的患者。
16.一种方法，该方法包括以下步骤：
a)提供：
i)树突状细胞，以及
ii)一种含腺病毒载体的组合物，其中所述腺病毒载体包含：
A)一种腺病毒衣壳，其中所述腺病毒衣壳包含Ad11衣壳鞭毛；
以及
B)核酸分子，其中所述核酸分子包含编码目标蛋白质的转基因序列；以及
b)将所述组合物与所述树突状细胞在感染复数至少为5的一定条件下进行接触，使得至少55％的所述树突状细胞表达所述目标蛋白质，从而产生表达目标蛋白质的树突状细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述接触导致所述树突状细胞从未成熟状态转变为成熟状态。
18.根据权利要求16所述的方法，其中在感染复数为10～100的条件下进行所述接触时，至少70％的所述树突状细胞表达所述目标蛋白质。
19.根据权利要求16所述的方法，其中在感染复数为100～500的条件下进行所述接触时，至少90％的所述树突状细胞表达所述目标蛋白质。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述接触发生在体外。
21.根据权利要求16所述的方法，其中所述目标蛋白质为HBeAg。
22.根据权利要求16所述的方法，其中该方法还包括以下步骤：
c)将表达目标蛋白质的树突状细胞给药至个体。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述个体是HBV感染继发肝细胞癌的个体或HBV感染的个体。
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