JP2002539221A - 組換えバキュロウイルスがコードする遺伝子を含む昆虫細胞による癌の治療 - Google Patents

組換えバキュロウイルスがコードする遺伝子を含む昆虫細胞による癌の治療

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Abstract

(57)【要約】 本願発明は、非表面発現タンパク質およびペプチドをコードするバキュロウイルスを含む昆虫細胞についての組成物および使用方法を提供する。本願発明は特に、サイトカインを発現するバキュロウイルスを含む昆虫細胞を包含する組成物に関する。このような組成物は、例えば、直接腫瘍内注射によって、哺乳動物における腫瘍内にに投与され得、腫瘍の縮小または退行を引き起こす。本願発明の別の局面は、このような腫瘍の退行がすでに起こった哺乳動物における、腫瘍の再発への耐性を誘導する方法に関する。本願発明の特定の局面において、哺乳動物は、種々の形態の癌を示すヒト被験体である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （１．０ 発明の背景） （１．１ 発明の分野） 本発明は一般に、免疫学、癌の治療、分子生物学および細胞生物学の分野に関
する。本発明は特に、バキュロウイルス発現ベクターによってコードされる非表
面発現タンパク質またはペプチドを含む昆虫細胞の使用のための組成物および方
法に関する。このような組成物および方法は、疾患状態（例えば、癌）の処置に
おける治療的用途のものであり得る。
【０００２】 （１．２ 関連技術の説明） 大部分の徐々に増殖する新生物は、腫瘍細胞が、患者の免疫系によって異物と
して認識され得る抗原を発現するという事実にもかかわらず、悪性細胞の増殖を
制御するに充分な免疫学的応答を誘発しない（Ｓｉｂｉｌｌｅら，１９９０）。
【０００３】 細胞免疫系（Ｔ細胞）によって認識され得る腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が同定さ
れている。これらの抗原（腫瘍関連エピトープまたはＴ細胞エピトープとも呼ば
れる）としては、以下が挙げられる：変異および再配置によって活性化された癌
遺伝子産物（例えば、ｐ２１rasにおける１２位の変異；ｂｃｒ／ａｂｌ再配置
のＰ２１０産物）；変異した腫瘍抑制遺伝子産物（例えば、ｐ５３）；成体組織
においては発現されない再活性化胚性遺伝子産物（例えば、Ｐ８１５肥満細胞腫
において見出されるＰ９１Ａ）；ＭＡＧＥ１（黒色腫およびヒト乳癌において見
出される）；腫瘍によって発現される組織特異的自己抗原（例えば、チロシナー
ゼ）；および種々の他のもの（Ｐａｒｄｏｌｌ，１９９３）。大部分の腫瘍細胞
集団は、特定の共通のＴＡＡを発現するが、これらは、発現するＴＡＡのスペク
トルに関して不均質である。腫瘍において発現される非常に多数の腫瘍関連Ｔ細
胞エピトープにもかかわらず、腫瘍細胞はほとんど免疫原性がないままである。
【０００４】 腫瘍細胞の遺伝子操作へのアプローチは、腫瘍細胞を感染させるためのウイル
ス発現ベクターの使用である。ポックスウイルス技術が利用されて、実験的に誘
導された腫瘍の動物モデルにおけるＴＡＡに対する免疫学的応答を惹起している
。癌胎児抗原（ＣＥＡ）をコードする遺伝子は、ヒト結腸腫瘍細胞から単離され
、そしてワクシニアウイルスゲノム（Ｋａｕｆｍａｎら，１９９１）へと挿入さ
れた。ワクシニアベースのＣＥＡ組換え体の接種は、ＣＥＡ特異的抗体および抗
腫瘍効果をマウスモデル（同書）において惹起した。ヒト黒色腫ＴＡＡであるｐ
９７もまた、ワクシニアウイルスに挿入され、そしてマウスを腫瘍移植から防御
することが示された（Ｈｕら，１９８８；Ｅｓｔｉｎら，１９８８）。Ｂｅｒｎ
ａｒｄｓら（１９８７）は、ｎｅｕコードｐ１８５糖タンパク質の細胞外ドメイ
ンを発現するワクシニア組換え体を構築した。この組換えウイルスで免疫したマ
ウスは、ｎｅｕ遺伝子産物に対する強力な体液性応答を発達させ、そしてこれら
のマウスは、その後の腫瘍チャレンジに対して防御された。
【０００５】 免疫系による腫瘍細胞の殺傷は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって媒
介される。しかし、腫瘍関連抗原の認識は、腫瘍組織適合遺伝子複合体によって
指定されるクラス１決定基によって制限される（ＤｅＧｉｏｖａｎｎｉら，１９
９１；Ｐｏｒｇａｄｏｒら，１９８９；Ｋｉｍら，１９９４）。ＭＨＣクラスＩ
抗原を発現することに対する抑制または不全は、腫瘍細胞がＴ細胞媒介宿主免疫
を逃れるのを可能にする、いくつかの立証された機構のうちの１つである（Ｅｌ
ｌｉｏｔｔら，１９９０；Ｔａｎａｋａら，１９８８）。
【０００６】 腫瘍関連抗原に対する免疫応答を増強するためにサイトカインを使用する試み
が行われてきた。このストラテジーの目標は、腫瘍細胞の局所免疫学的環境を変
更して、Ｔ細胞エピトープの提示または腫瘍特異的Ｔリンパ球の活性化を増強す
ることである（Ｐａｒｄｏｌｌ，１９９３）。種々のサイトカイン遺伝子は、腫
瘍細胞に導入されている。とりわけ、ＩＬ−２（Ｐｏｒｇａｄｏｒら，１９９３
ａ；Ｋａｒｐら，１９９３）、ＩＦＮ−α（Ｐｏｒｇａｄｏｒら，１９９３ｂ）
またはＧＭ−ＣＳＦ（Ｄｒａｎｏｆｆら，１９９３）を分泌するように改変され
た新生物性細胞での免疫（Ｐａｒｄｏｌｌら，１９９２；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら
，１９９２）は、サイトカイン分泌腫瘍細胞およびサイトカイン非分泌腫瘍細胞
の両方に対する細胞傷害活性を有するＣＴＬの生成をもたらした。確立された新
生物を有し、サイトカイン分泌細胞で処置された実験動物および少数の患者は、
長期間生存したが、大部分の例では、腫瘍増殖が結局再発した（同書）。
【０００７】 組換えワクシニアウイルスをまた用いて、サイトカイン遺伝子を発現させた（
Ｒｕｂｙら，１９９２）。特定のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−α）の発現
は、マウスにおける自己制限的ワクシニアウイルス感染をもたらし、そして本質
的に、ウイルスを弱毒化するように作用した。他のサイトカイン（すなわち、Ｉ
Ｌ−５、ＩＬ−６）の発現は、同時発現された外因性免疫原に対する免疫応答を
調節することが見出された（Ｒｕｂｙらによる概説，１９９２）。
【０００８】 有望であるとはいえ、これらの観察は、癌を有する個体における腫瘍量（ｔｕ
ｍｏｒ ｂｕｒｄｅｎ）を除去するかまたは実質的に減少させる、臨床的に効果
的な方法を依然としてもたらしていない。高価であることに加えて、精製された
サイトカインの直接的なインビボ投与は、毒性の副作用をもたらし得る。サイト
カインをインビボで発現するように腫瘍細胞を遺伝子操作し、その後に患者へと
再導入することは、困難で、時間がかかり、高価でかつ臨床的効力が証明されて
いないことである。サイトカインを発現するように操作されたヒト感染性ウイル
スを用いた遺伝子治療は、臨床レベルでは未だに好首尾に実行されてはいない。
このアプローチに伴う１つの困難性は、天然に存在するヒトウイルスとのインビ
ボ組換えによる複製欠損ウイルスの可能な活性化である。
【０００９】 この課題に対する可能性のある解決法は、治療的タンパク質を発現するように
遺伝子操作されたバキュロウイルスを用いることを含む。天然に存在する昆虫バ
キュロウイルスは、節足動物のみに感染する。昆虫バキュロウイルスの宿主域は
、広く研究されており、そして感染または病原的応答の証拠は、宿主でない昆虫
でも、植物でも、脊椎動物でもヒトでも同定されていない（Ｇｒｏｎｅｒ，１９
８６）。この特徴は、バキュロウイルスを、薬剤、遺伝子または治療剤の送達の
ために改変および使用される理想的な因子とし得る。
【００１０】 （２．０ 発明の要旨） 本発明は、選択された非表面発現タンパク質またはペプチド（例えば、治療的
タンパク質）をコードする、単離された核酸セグメントを含む昆虫細胞の使用の
ための組成物および方法を開示することによって、当該分野における不足に取り
組む。「非表面発現タンパク質またはペプチド」は、本明細書中で、昆虫細胞の
細胞膜に局在しない、発現されるタンパク質またはペプチドと定義される。この
意味では、このようなタンパク質またはペプチドは潜在的に、細胞外環境へと分
泌され得る。あるいは、非表面発現タンパク質またはペプチドは、昆虫細胞内で
細胞内であり得る。
【００１１】 特定の実施形態において、この単離された核酸セグメントは、バキュロウイル
ス発現ベクター内に含まれる。組換えバキュロウイルスベクターの構築は、当該
分野において周知の技術によって達成され得る。
【００１２】 本発明の１つの局面において、この非表面発現タンパク質またはペプチドは、
サイトカインである。大部分の任意のサイトカインが、本発明の実施に使用され
得ることが意図される。本発明の範囲内に意図されるサイトカインのクラスとし
ては、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子およびコロニー刺激
因子が挙げられる。本発明での潜在的な使用の特定のサイトカインの例としては
、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−
１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インターフェロン−γ（ＩＦ−γ）、ＩＦ−α
、ＩＦ−β、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、およびＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マ
クロファージコロニー刺激因子）が挙げられる。このような例は、代表例として
のみであり、そして当該分野で公知の他のサイトカインを排除することは意図さ
れない。特定の実施形態において、サイトカインは、β−インターフェロンまた
はＧＭ−ＣＳＦである。
【００１３】 当業者は、用語「タンパク質またはペプチド」が、同定されたタンパク質また
はペプチドの天然に存在するアミノ配列を有するタンパク質またはペプチド、な
らびにこのようなタンパク質またはペプチドのわずかな配列改変体を含むことを
認識する。例えば、集団内の天然のバリエーションに起因して生じるポリペプチ
ドのわずかな配列改変体が存在するか、またはそれらは、他の種で見出されるホ
モログであり得る。それらはまた、天然に存在しないが、同様に機能するに十分
な類似性であり、そして／またはポリペプチドの天然形態と交差反応する免疫応
答を誘発する配列であり得る。配列改変体は、部位指向性変異誘発またはペプチ
ド合成の標準的な方法によって調製され得る。ポリペプチドのアミノ配列改変体
は、置換、挿入または欠失の改変体であり得る。欠失改変体は、機能または免疫
原性活性に必須ではないネイティブタンパク質の１以上の残基を欠損する。欠失
改変体の一般的な型は、分泌シグナル配列、または細胞の特定の部分への結合に
タンパク質を指向するシグナル配列を欠損する改変体である。
【００１４】 置換改変体は、代表的には、タンパク質内での１以上の部位での１つのアミノ
酸の別のアミノ酸への交換を含み、そしてポリペプチドの１以上の特性（例えば
、タンパク質分解に対する安定性）を調節するために設計され得る。置換は、好
ましくは、保存的であり、すなわち、１つのアミノ酸は、１つの同様の形状およ
び電荷のアミノ酸と交換される。保存的な置換は、当該分野において周知であり
、そして例えば、アラニンからセリン；アルギニンからリジン；アスパラギンか
らグルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸からグルタミン酸；システイン
からセリン；グルタミンからアスパラギン；グルタミン酸からアスパラギン酸；
グリシンからプロリン；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン；イソロ
イシンからロイシンまたはバリン；ロイシンからバリンまたはイソロイシン；リ
ジンからアルギニン、グルタミンまたはグルタミン酸；メチオニンからロイシン
またはイソロイシン；フェニルアラミンからチロシン、ロイシンまたはメチオニ
ン；セリンからトレオニン；トレオニンからセリン；トリプトファンからチロシ
ン；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン；およびバリンからイ
ソロイシンまたはロイシンへの変化が挙げられる。
【００１５】 挿入改変体としては、このポリペプチドに相同な他のタンパク質およびこのポ
リペプチド由来の配列を含むハイブリッドタンパク質が挙げられる。例えば、挿
入改変体は、別の種由来の相同ポリペプチドの部分に加えて、１つの種由来のポ
リペプチドのアミノ酸配列の部分を含み得る。他の挿入改変体は、さらなるアミ
ノ酸がポリペプチドのコーディング配列内に導入されている改変体を含み得る。
これらは、代表的には、例えば、プロテアーゼ切断部位を破壊するために導入さ
れている。
【００１６】 １つの局面において、本発明は、哺乳動物に対する治療用タンパク質を提供す
る方法に関し、この方法は、選択された非表面発現タンパク質またはペプチドを
コードする単離された核酸セグメントを含む昆虫細胞を含む組成物を調製する工
程、およびこの組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する。特定の実施形態に
おいて、哺乳動物は、ヒト被験体である。特定の実施形態において、昆虫細胞は
、投与前に、凍結乾燥されるか、または凍結融解サイクルに供される。組成物の
投与は、投与の本質的に任意の経路（例えば、筋肉内、皮下、腹腔内、血管内ま
たは動脈内）によって達成され得ることが、本発明の範囲内で意図される。適切
な組成物に関しては、投与は、経口、鼻腔、バッカル、直腸、膣内または局所の
経路によって行い得る。
【００１７】 特定の実施形態において、昆虫細胞を含む組成物は、癌を患う哺乳動物への直
接的な腫瘍内注射によって投与され得る。１以上のＴＡＡに標的化された、宿主
免疫系の生じた活性は、被験体の腫瘍の負荷を軽減または排除するに有用である
。この驚くべき結果は、ヒト癌の臨床上の処置にかなり有意義である。選択され
る特定のサイトカインに依存して、治療用の処置の他の機構が、本発明の範囲内
に意図される。例えば、β−インターフェロンは、新脈管形成を阻害することに
よって腫瘍の増殖を妨害する（Ｆａｂｒａら、１９９２；Ｇｈｏｊｉら、１９９
４ａ；１９９４ｂ；Ｓｉｎｇｈら、１９９５、１９９６ａ、１９９６ｂ；Ｓｉｎ
ｇｈおよびＦｉｄｌｅｒ、１９９７；Ｄｉｎｎｅｙら、１９９８（これらの各々
は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。特定の実施形態にお
いて、昆虫細胞を含む組成物の投与は、より伝統的な腫瘍治療（例えば、化学療
法、放射線療法または免疫療法）を補助としてか、またはそれらと組み合わせて
行い得る。
【００１８】 本発明はさらに、腫瘍の負荷が排除されている被験体が、同じＴＡＡを発現し
ている癌に対するさらなるチャレンジに耐性であるという予期せぬ結果を開示す
る。本発明のなお別の驚くべき局面は、昆虫細胞単独の直接的な腫瘍注射が、腫
瘍増殖の少なくとも部分的な抑制を生じ得るということである。昆虫細胞および
発現された治療用タンパク質の両方を提示する宿主免疫系に対する相加効果また
は相乗効果の可能性は、本発明の範囲内に意図される。
【００１９】 当業者は、同じＴＡＡを示す腫瘍の再発に対する、癌の治療用処置の方法およ
び被験体の免疫化の方法は、本発明の範囲内に意図されることを理解する。治療
用タンパク質を発現する昆虫細胞が、種々の他の疾患状態（例えば、ＡＩＤＳま
たはインフルエンザ）における免疫系応答のブーストにおいて汎用性アジュバン
トとして使用され得ることは、本発明の範囲内であることがさらに意図される。
当業者は、用語「昆虫細胞」が、インタクトな細胞、および凍結乾燥されている
か、または凍結融解サイクルに供されている昆虫細胞を含むことを理解する。
【００２０】 本発明の１つの局面は、目的の選択された非表面発現タンパク質またはペプチ
ドをコードする単離された核酸セグメントを含む昆虫細胞を含む組成物に関する
。種々の異なる型の昆虫細胞が、本発明の範囲内であるとみなされ、この昆虫細
胞としては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ
ｍｏｒｉ、Ｓｐｏｄｏｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅ
ｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｈ
ｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａ、Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｄｏｔｓｕｇａｔａ、Ｌｙｍ
ａｎｔｉｒａ ｄｉｓｐａｒ、Ｐｌｕｔｅｒｉｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、Ｍ
ａｌａｃｏｓｔｏｍａ ｄｉｓｓｔｒｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、
Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ、Ｍｏｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａおよび
Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ ｃｅｃｒｏｐｉａ由来の細胞が挙げられる。特定の実施
形態において、昆虫細胞は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞
またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞である。特定の実施形態において、
このような細胞は、Ｓｆ９細胞またはＨ５細胞（Ｈｉｇｈ ＦＩＶＥTM、Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｏｒｒｅｎｔｏ、ＣＡ）を含み得る。特定の実施形態におい
て、単離された核酸セグメントは、バキュロウイルス発現系に組み込まれる。バ
キュロウイルスが、選択された非表面発現治療用タンパク質またはペプチドをコ
ードする単離された核酸セグメントを発現するように操作され得る任意のバキュ
ロウイルスであり得ることは、本発明の範囲内にあることが意図される。代表的
なバキュロウイルスとしては、ＡｃＭＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉｃａ多核カプシドポリヘドロシス（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅｏｃａｐｓ
ｉｄ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ）ウイルス）、ＢｍＮＰＶ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍ
ｏｒｉ核ポリヘドローシス（ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ）ウイルス
）およびｐＢｌｕｅＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓｏｒｒｅｎｔｏ，ＣＡ）
が挙げられる。米国特許第４，２１５，０５１号（本明細書中に参考として援用
される）を参照のこと。
【００２１】 本発明の別の実施形態は、種々の疾患状態（例えば、癌、ＡＩＤＳまたはイン
フルエンザ）の治療用処置での使用のためのキットを包含する。このキットは、
バキュロウイルスを含む昆虫細胞を含む薬学的組成物を含み、このバキュロウイ
ルスは、選択された非表面発現治療用タンパク質またはペプチドをコードする単
離された核酸セグメントを含む。
【００２２】 （４．０ 代表的な実施形態の説明） 多くの疾患状態（例えば、ガン）は、主に、疾患に対する宿主の免疫応答の操
作により処置され得る（例えば、Ｘｉｅら、１９９７；Ｄｏｎｇら、１９９８、
１９９９）。実際には、宿主の免疫応答を効果的に操作する方法は、当該分野で
は欠落している。本発明は、治療用の非表面的に発現されたタンパク質またはペ
プチドをコードするバキュロウイルスを含む、昆虫細胞を使用する組成物および
方法を提供することによりこれらの欠落に取組む。より詳細には、本発明は、こ
のようなタンパク質またはペプチドを発現する、このような昆虫細胞の治療的に
有効な量を投与して、ガンのような疾患状態を制御する工程に関する。本発明の
特定の実施形態において、タンパク質またはペプチドはサイトカインである。
【００２３】 本発明はまた、非表面的に発現されるタンパク質またはペプチド（例えば、サ
イトカイン）を含む昆虫細胞の投与後に、腫瘍の後退（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）
を誘導する方法に関する。本発明の別の局面は、このようなタンパク質またはペ
プチドを発現する、このような昆虫細胞を投与された被験体における、ガンの再
発を予防する方法に関する。
【００２４】 （４．１ 昆虫細胞） 用語「昆虫細胞」は、バキュロウイルスに感染した昆虫種由来の昆虫細胞を意
味する。例えば：Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙ
ｘ ｍｏｒｉ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｃｈｏｒｉｓｔ
ｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎ
ｓ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａ、Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ
、Ｌｙｍａｎｔｉｒａ ｄｉｓｐａｒ、Ｐｌｕｔｅｌｉａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌ
ａ、Ｍａｌａｃｏｓｔｏｍａ ｄｉｓｓｔｒｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ
ｎｉ、Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ
およびＨｙａｌｏｐｈｏｒａ ｃｅｃｒｏｐｉａ。米国特許第５，４９８，５４
０号および同第５，７５９，８０９号（参考として本明細書において援用される
）を参照のこと。特定の実施形態において、昆虫細胞は、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓ
ｉａ ｎｉ由来のＨ５昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓｏｒｒｅｎｔｏ，Ｃ
Ａ）である。このような昆虫細胞は、インタクトな形態で用いられても良いし、
または凍結乾燥もしくは凍結融解のサイクル後に用いられても良い。
【００２５】 昆虫細胞は、米国特許第５，７５９，８０９号に記載のように、１０％ウシ胎
仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を含む、ＩＰ
Ｌ−４１培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）のような標準的技
術に従って培養され得る。魚血清を含む培地中で昆虫細胞を培養するための別の
手順が最近記載されている。米国特許第５，４９８，５４０号（本明細書におい
て参考として援用される）を参照のこと。培養された昆虫細胞は、標準的なプロ
トコールにより組換えバキュロウイルスでトランスフェクトされ得る。例えば、
米国特許第５，７５９，８０９号（本明細書において参考として援用される）を
参照のこと。
【００２６】 （４．２ サイトカインをコードする単離された核酸セグメント） 本発明の種々の実施形態において、昆虫細胞は、治療用のタンパク質またはペ
プチドの産物をコードする単離された核酸セグメントを含む。本発明の適用にお
いて有用なタンパク質またはペプチドは、サイトカインとして公知のものを含む
。以下の表１は、本発明の実施において有用であり得るサイトカインを列挙する
。
【００２７】
【表１】
【００２８】 上記に列挙されるタンパク質またはペプチドのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列
は、当業者に周知の供給源（ＧｅｎＢａｎｋを含む）から入手され得る。上記に
列挙される多くのタンパク質をコードする単離された核酸は、標準的供給源（例
えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（
ＡＴＣＣ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））由来の従来存在するベクターの
形態で入手され得る。あるいは、目的のタンパク質またはペプチドをコードする
合成遺伝子は、当該分野で周知の方法により（例えば、市販の自動オリゴヌクレ
オチドシンセサイザーで）化学的に合成され得る。
【００２９】 以下に考察するように、選択された治療用タンパク質をコードする遺伝子は、
種々の異なる塩基を含み得、そして天然に存在する遺伝子産物から機能的に（あ
る場合には構造的に）識別できない対応するポリペプチドをさらに産生し得る。
【００３０】 単離された核酸に対するいずれの言及も、その核酸を含みかつその核酸の産物
を発現し得る宿主細胞を包含すると解釈されるべきである。本発明に従う核酸は
、このタンパク質配列の遺伝子全体、治療用タンパク質のドメイン、または任意
の他のフラグメントをコードし得る。この核酸は、ゲノムＤＮＡに由来し得る、
すなわち、特定の生物体のゲノムから直接クローニングされ得る。しかし、特定
の実施形態において、この核酸は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含む。また、ｃ
ＤＮＡプラス天然のイントロンまたは別の遺伝子由来のイントロンも意図される
。このような操作された分子は、時に、「ミニ遺伝子（ｍｉｎｉ−ｇｅｎｅ）」
と呼ばれる。
【００３１】 用語「ｃＤＮＡ」は、鋳型としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を用いて
調製されたＤＮＡをいうことが意図される。ゲノムＤＮＡ、またはゲノムの、非
処理のもしくは部分的に処理されたＲＮＡ鋳型から重合されたＤＮＡと反対に、
ｃＤＮＡを用いる利点は、ｃＤＮＡが、主に対応するコード配列を含むことであ
る。非コード領域が至適発現のために必要である場合など、全ゲノム配列または
部分的ゲノム配列が好ましい場合もあり得る。
【００３２】 治療用タンパク質が、天然の改変体（核酸配列がわずかに異なるが、にもかか
わらず、同じタンパク質をコードする）により代表され得ることも意図される（
以下の表２を参照のこと）。
【００３３】 本出願において用いる場合、用語「非表面的に発現されたタンパク質またはペ
プチドをコードする単離された核酸セグメント」とは、総細胞核酸なしに単離さ
れた核酸分子をいう。用語「機能的に等価なコドン」は、同じアミノ酸をコード
するコドン（例えば、アルギニンまたはセリンについての６つのコドン）（以下
、表２）をいうために本明細書において用いられ、そしてまた以下の頁において
考察されるように、生物学的に等価なアミノ酸をコードするコドンをいう。
【００３４】
【表２】
【００３５】 本発明のＤＮＡセグメントは、生物学的に機能的な等価的非表面発現タンパク
質およびペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む。このような配列は、核
酸配列およびそのようにコードされるタンパク質内に天然に生じることが公知で
ある、コドンの縮重およびアミノ酸の機能的等価性の結果として生じ得る。ある
いは、機能的に等価なタンパク質またはペプチドは、組換えＤＮＡ技術の適用を
介して作製され得、この適用において、タンパク質構造の変化は、交換されるア
ミノ酸の特性の考慮に基づいて、操作され得る。人為的に設計された変化は、部
位特異的変異誘発技術の適用を介して導入され得るか、または無作為に導入され
そして所望の機能についてのちにスクリーニングされ得る。
【００３６】 （４．３ バキュロウイルスベクターでの感染） 本発明の特定の実施形態において、選択される非表面発現タンパク質またはペ
プチドをコードする核酸が、バキュロウイルス発現ベクターに組み込まれ得る。
このようなベクターは、種々の適用のためのタンパク質の産生に有用な道具であ
る（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、１９８７、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら，１９９
２；また米国特許番号４，７４５，０５１（ＳｍｉｔｈおよびＳｕｍｍｅｒｓ）
，同４．８７９．２３６（ＳｍｉｔｈおよびＳｕｍｍｅｒｓ），同５，０７７，
２１４（ＧｕａｒｉｎｏおよびＪａｒｖｉｓ），同５，１５５，０３７（Ｓｕｍ
ｍｅｒｓ），同５，１６２．２２２（ＧｕａｒｉｎｏおよびＪａｒｖｉｓ），同
５，１６９，７８４（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＯｋｅｒ−Ｂｌｏｍ）ならびに同５
，２７８，０５０（Ｓｕｍｍｅｒｓ）（各々が、参考として本明細書中に援用さ
れる））。バキュロウイルス発現ベクターは、目的の特定の遺伝子のコード領域
が非必須バキュロウイルス遺伝子の代わりにプロモーターの後ろに配置されてい
る、組換え挿入ベクターである。組換えバキュロウイルス発現ベクターを単離す
るために使用される古典的アプローチは、目的の外来遺伝子がｐｏｌｙｈｅｄｒ
ｉｎプロモーターの下流に位置する、プラスミドを構築することである。次いで
、相同組換えを介して、そのプラスミドが使用されて、野生型ｐｏｌｙｈｅｄｒ
ｉｎ遺伝子の代わりに、ウイルスゲノム中に新規な遺伝子が移入され得る（Ｓｕ
ｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，１９８７；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら，１９９２）。 生じた組換えウイルスは、培養昆虫細胞を感染させ得、そしてｐｏｌｙｈｅｄ
ｏｒｉｎプロモーターの制御下の外来遺伝子を発現し得る。このプロモーターは
強力であり、そして感染の最後期の間に非常に高レベルの転写を提供する。ｐｏ
ｌｙｈｅｄｒｉｎプロモーターの強さは、発現ベクターとして組換えバキュロウ
イルスを使用する利点である。なぜなら、通常、この強さによって、感染の間に
大量の外来遺伝子産物の合成がもたれらされるからである。
【００３７】 Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａマルチヌクレオキャプシド核
多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰ）は、バキュロウイルスの間で変わっている。なぜ
なら、このウイルスは、ほとんどのバキュロウイルスよりも広い宿主範囲を示す
からである（Ｍａｒｔｉｇｎｏｎｉら、１９８２）。ＡｃＭＮＰＶは、最も広範
に研究されたバキュロウイルスであり、そしてそのゲノム配列は公知である（Ａ
ｙｒｅｓら、１９９４）。ＡｃＭＮＰＶは、その鱗翅目宿主昆虫における独特の
二相性生活環により区別される（ＢｌｉｓｓａｒｄおよびＲｏｈｒｍａｎｎ、１
９９０に概説される）。感染は、高力価の２つの形態の子孫ウイルス（出芽ウイ
ルス（ＢＶ）および封入体由来ウイルス（ＯＤＶ））を生じる。
【００３８】 ２つの経路（吸着エンドサイトーシス（またはウイルス定着）、および原形質
膜とのＢＶエンベロープの直接の融合）が、培養細胞へのＢＶの侵入について提
案される。ＢＶは、融合により細胞に侵入し得る（Ｖｏｌｋｍａｎら、１９８６
；ＫｏｚｕｍａおよびＨｕｋｕｈａｒａ、１９９４）が、大多数のデータは、主
な経路が吸着エンドサイトーシスによる（ＣｈａｒｌｔｏｎおよびＶｏｌｋｍａ
ｎ、１９９３）ことを示す。
【００３９】 （４．３．１ バキュロウイルスのプロモーターおよびエンハンサーからのク
ローン化遺伝子の発現） 本発明の特定の局面において、所望の遺伝子（単数または複数）の発現用に設
計されているバキュロウイルスが必要とされる。従って、特定の実施形態は、選
択された核酸セグメントが制御配列（例えば、プロモーターおよびエンハンサー
）に作動可能に連結されることを、必要とし得る。核酸セグメントおよび配列領
域を組み合わせて配置する状況において、用語「作動可能に連結（される）」と
は、単一の連続する核酸配列を形成するように結合されていることを意味するこ
とが理解され、ここで、プロモーター、エンハンサーおよび他の制御配列が、そ
の遺伝子の最適な発現を提供する様式で、配置されそして方向付けられる。プロ
モーターは、遺伝子の上流に機能的に位置する場合にその遺伝子の発現をもたら
すＤＮＡエレメントであることが、理解される。本発明のベクター中の異種遺伝
子各々は、プロモーターエレメントの下流に機能的に配置される。
【００４０】 一過性系において、目的の遺伝子は、組換えウイルス（例えば、バキュロウイ
ルス）での感染によって、細胞へと導入される。最も広範に使用されるバキュロ
ウイルス系において、目的の遺伝子は、ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎプロモーターの制
御下にある。ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎプロモーターは、最後期プロモーターであり
、この最後期プロモーターとは、バキュロウイルス感染の後期まで目的の遺伝子
の発現が開始しないことを意味する。その発現レベルは高いが、バキュロウイル
ス感染が最終的に細胞死をもたらすので、一過性である。
【００４１】 （４．３．２ バキュロウイルスのプロモーターおよびエンハンサー） バキュロウイルス感染の４つの異なる期（前初期、遅延性初期（ｄｅｌａｙｅ
ｄ−ｅａｒｌｙ ｐｈａｓｅ）、後期、および最後期（ｖｅｒｙ ｌａｔｅ ｐ
ｈａｓｅ）と称する）が存在する。従って、異なるバキュロウイルス遺伝子は、
それが発現されるウイルス感染期によって分類され得る。また、初期遺伝子とし
て規定されており、前初期または遅延性初期のいずれかとして下位区分されてい
ない、遺伝子の種類も存在する。異なる種類のプロモーターは、各種類の遺伝子
を制御する。
【００４２】 前初期プロモーターは、発現を駆動するために宿主細胞因子のみを必要とする
ことにより区別される。例は、ｉｅ１（ＧｕａｒｉｎｏおよびＳｕｍｍｅｒｓ、
１９８７）プロモーター、ｉｅＮ（ｉｅ２；Ｃａｒｓｏｎら、１９９１）プロモ
ーターおよびｉｅ０プロモーターである。
【００４３】 遅延性初期プロモーターは、発現を駆動するために宿主細胞因子に加えて、前
初期遺伝子の産物のみを必要とすることによって区別される。例は、３９Ｋ（Ｇ
ｕａｒｉｎｏおよびＳｍｉｔｈ、１９９１）プロモーターおよびｇｐ６４（Ｂｌ
ｉｓｓａｒｄおよびＲｏｈｒｍａｎｎ、１９８９；Ｗｈｉｔｆｏｒｄら、１９８
９）プロモーターである。
【００４４】 初期プロモーターは、遅延性初期の特定の前初期の種類に配置されていない。
。例は、ＤＡ２６プロモーター、ＥＴＬプロモーターおよび３５Ｋプロモーター
が挙げられる。
【００４５】 後期プロモーターは、遅延性初期遺伝子の産物および前初期遺伝子の産物、な
らびに他の宿主細胞因子を、発現を駆動するために必要とする。例は、ｇｐ６４
（ＢｌｉｓｓａｒｄおよびＲｏｈｒｍａｎｎ、１９８９；Ｗｈｉｔｅｆｏｒｄら
、１９８９）プロモーターおよびキャプシド（ｐ３９；ＴｈｉｅｍおよびＭｉｌ
ｌｅｒ、１９８９）プロモーターである。
【００４６】 最後期プロモーターは、他の宿主細胞因子に加えて、多数のバキュロウイルス
遺伝子産物を、発現を駆動するために必要とする。この種類からのプロモーター
の例は、ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ（Ｈｏｏｆｔ ｖａｎ Ｉｄｄｅｋｉｎｇｅら、
１９８３）プロモーターおよびｐ１０（Ｋｕｚｉｏら、１９８４）プロモーター
である。最も特徴付けられかつ最も頻繁に使用される、バキュロウイルスプロモ
ーターは、ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎプロモーターである。ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎプ
ロモーターの使用は、本発明の好ましい実施形態である。
【００４７】 エンハンサーは、所定のプロモーターからの転写を増強するように位置的に配
置され得る。転写を駆動するために昆虫細胞中で活性なエンハンサーが、本発明
において好ましい。好ましいのは、ウイルスエンハンサーであり、最も好ましい
のは、バキュロウイルスエンハンサーである。バキュロウイルスエンハンサーと
しては、ｈｒ１、ｈｒ２、ｈｒ３、ｈｒ４およびｈｒ５（Ｇｕａｒｉｎｏら、１
９８６）が挙げられる。
【００４８】 （マーカー遺伝子およびスクリーニング） 本発明の特定の局面では、特定の細胞が、特定の遺伝子マーカーでタグされ、
感染、形質導入または形質転換細胞についての情報を提供し得る。従って、本発
明はまた、細胞全体アッセイを基礎にする組換え候補スクリーニングおよび選択
法を提供し、そしてこれは、好ましくは、レポーター遺伝子の上流に配置された
一般ＤＮＡプロモーターが機能的である条件下でのみ出現する容易に検出可能な
表現型を、その組換え宿主に与えるレポーター遺伝子を採用する。一般に、レポ
ーター遺伝子は、例えば、細胞培養の蛍光定量的分析、放射性同位元素分析また
は分光学的分析による、細胞培養の分析により検出可能である、宿主細胞によっ
てそうでなければ産生されないポリペプチド（マーカータンパク質）をコードす
る。
【００４９】 本発明の他の局面では、蛍光定量的プローブ、放射性同位元素プローブまたは
分光学的プローブを用いる、ＰＣＲTMまたはハイブリダイゼーションによるＤＮ
Ａ増幅のような、標準的な遺伝子分析技法による検出可能である遺伝子マーカー
が提供される。
【００５０】 例示のマーカー遺伝子は、当業者に公知であるような、エラスターゼ、ホスフ
ァターゼ、プロテアーゼ（組織プラスミノーゲンアクチベータまたはウロキナー
ゼ）およびそれらの活性により検出され得るその他の酵素のような酵素をコード
する。本発明における使用に意図されるのは、トランスンジーン発現のためのマ
ーカーとしてグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である（Ｃｈａｌｆｉｅら、１
９９４）。ＧＦＰの使用は、近ＵＶまたは青色光による照射のみで、外因的に添
加される基質を必要とせず、そしてそれ故、生存細胞における遺伝子発現をモニ
ターすることにおける使用のために顕著な能力を有する。
【００５１】 その他の例は、放射線標識された基質とともに採用され得るクロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ホタルおよび細菌ルシフェラーゼ
、および細菌酵素βガラクトシダーゼおよびβグルクロニダーゼである。このク
ラス内のその他のマーカー遺伝子が当業者に公知であり、そして本発明における
使用に適切である。
【００５２】 宿主細胞に検出可能な特徴を与える、別のクラスのマーカー遺伝子は、それら
の形質転換体にトキシンに対する耐性を与える、一般に酵素であるポリペプチド
をコードする遺伝子である。このクラスのマーカー遺伝子の例は、多くの当該分
野で周知のその他（Ｋａｕｆｍａｎ、１９９０）とともに、毒性レベルの抗生物
質Ｇ４１８に対して保護するｎｅｏ遺伝子（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ
ら、１９８１）、ストレプトマイシン耐性を与える遺伝子（米国特許第４，４３
０，４３４号）、ハイグロマイシンＢ耐性を与える遺伝子（Ｓａｎｔｅｒｒｅら
、１９８４；米国特許第４，７２７，０２８号、第４，９６０，７０４号および
第４，５５９，３０２号）、メトトレキセートに対する耐性を与えるジヒドロ葉
酸レダクターゼをコードする遺伝子（Ａｌｔら、１９７８）および酵素ＨＰＲＴ
である。
【００５３】 （４．５ 薬学的組成物および投与の経路） 臨床的適用が意図される場合、意図される適用に適切な形態で、ペプチド、タ
ンパク質、核酸、ウイルスおよび細胞の薬学的組成物を調製することが必要であ
る。一般に、これは、エンドトキシン、およびヒトまたは動物に有害であり得る
その他の不純物の本質的にない組成物を調製することを必要とする。
【００５４】 一般に、ペプチド、タンパク質、核酸、ウイルスまたは細胞を、患者中への導
入に適切であるようにする適切な塩および緩衝液を採用することが所望される。
本発明の水性組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体中に溶解ま
たは分散され、そして好ましくはカプセル化された有効量のペプチド、タンパク
質、核酸、ウイルスまたは細胞を含む。語句「薬学的または薬理学的に受容可能
」は、動物またはヒトに投与されるとき、副作用、アレルギー反応、またはその
他の有害反応を生成しない分子実体および組成物をいう。本明細書で用いる「薬
学的に受容可能なキャリア」は、任意かつすべての溶媒、分散媒体、コーティン
グ、抗生物質および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活
性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。
本発明のベクターまたは細胞と適合しない任意の従来の媒体または薬剤の範囲を
除いて、治療的組成物におけるその使用が意図される。その他の抗癌剤のような
補助的な活性成分もまた、この組成物中に取り込まれ得る。
【００５５】 遊離の塩基または薬理学的に受容可能な塩のような活性成分の溶液が、ヒドロ
キシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水に調製され得
る。分散物もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、それらの混合
物および油中に調製され得る。貯蔵および使用の通常の条件下、これらの調製物
は、微生物の増殖を防ぐ保存剤を含む。静脈内ビヒクルは、液体および栄養補助
剤を含む。保存剤は、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスを含
む。ｐＨおよび医薬品中の種々の成分の正確な濃度は、周知のパラメータに従っ
て調節される。
【００５６】 有効量のペプチド、タンパク質、核酸、ウイルスまたは細胞は、意図される目
的に基いて決定される。用語「単位用量」は、被験体における使用に適切な物理
的に別個の単位をいい、各単位は、その投与にともなう（すなわち、適切な経路
および処置養生法）所望の応答を生成するために計算された、予め決定された量
の治療組成物を含む。投与されるべき量は、処置の数および単位用量の両方に従
い、処置される被験体、被験体の状態、および所望される保護に依存する。治療
組成物の正確な量はまた、担当医の判定に依存し、そして各個体に特有である。
【００５７】 腫瘍中に注入するためのバキュロウイルスを含む昆虫細胞の量に関する指針は
、以下の実施例中に提供される。一般に、腫瘍あたり１×１０6細胞の用量が、
サイズが５−６ｍｍの腫瘍中に注入された。腫瘍注入のための用量は、患者のサ
イズによるより、腫瘍の大きさにより多く決定されることが予期される。従って
、ヒトにおける５−６ｍｍの腫瘍中への注入のための標準的用量は、約１×１０6 細胞であり得る。凍結融解サイクルにより破壊された細胞の注入の場合、１×
１０6細胞の用量に等価な量のタンパク質の注入が、５−６ｍｍ腫瘍に適切であ
り得る。
【００５８】 あるいは、投与される組成物の量は、組成物中の活性タンパク質の濃度に基い
て当業者により決定され得る。活性タンパク質の濃度は、バイオアッセイまたは
特定タンパク質量の直接測定によるなどの当該分野で周知の手段により決定され
得る。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ、第１８版、１９９０を参照のこと）。特定タンパク質の直接測定は、ＥＬ
ＩＳＡまたはウェスタンブロッティングのような当該分野で周知の手法により達
成され得る。
【００５９】 投与される活性タンパク質の量は、目的の特定タンパク質について変動する。
例えば、ヒト被験体に投与するためのαインターフェロンの用量は、３×１０5
ＩＵから３×１０6ＩＵの範囲である。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｍａ
ｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、１９９０を参照のこと）。 インターロイキン２に対する標準的な用量は、３０，０００〜３００，０００Ｕ
／ｋｇ／日であると報告されている。（同上）。その他の治療タンパク質に対す
る標準的な用量は当該分野で周知である。
【００６０】 （４．５．１．非経口的投与） 本発明の活性化合物は、しばしば、非経口的投与のため処方、例えば、静脈内
、筋肉内、皮下、またはなお腹腔内経路を経由する注入のために処方され得る。
活性成分として第２の薬剤（単数または複数）を含む水性組成物の調製は、本開
示を考慮して当業者に公知である。代表的には、このような組成物は、液体溶液
または懸濁液の注射液として調製され得；注入の前に液体の添加に際し溶液また
は懸濁液を調製するために用いるために適切な固形形態もまた調製され得；そし
てこれらの調製物はまた、エマルジョンとされ得る。
【００６１】 遊離の塩基または薬学的に受容可能な塩のような活性化合物の溶液は、ヒドロ
キシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水に調製され得
る。分散物もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、それらの混合
物および油中に調製され得る。貯蔵および使用の通常の条件下、これらの調製物
は、微生物の増殖を防ぐ保存剤を含む。
【００６２】 注射可能な使用に適切な薬学的形態は、滅菌水性溶液または分散物；ゴマ油、
ピーナッツ油または水性ポリエチレングリコールを含む処方物；および滅菌注射
可能溶液または分散物の即席調製物のための滅菌粉末を含む。すべての場合にお
いて、この形態は、滅菌され、そしてシリンジに容易に存在する程度まで流体で
なければならない。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、
そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されなければなら
ない。
【００６３】 活性化合物は、中性または塩形態で組成物中に処方され得る。薬学的に受容可
能な塩は、酸附加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）および例えは、
塩酸またはリン酸のような無機酸と、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル
酸などの有機酸と形成される塩を含む。遊離のカルボキシル基と形成される塩も
また、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸
化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒ
スチジン、プロカインなどのような有機塩基由来であり得る。
【００６４】 キャリアはまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロー
ル、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリーコルなど）、それら
の適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適正な流
動性は、例えば、レシチンのようなコーティグの使用により、分散物の場合必要
な粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により維持され得る。微生
物の作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビ
ン酸、チメロサールなどのような種々の抗細菌および抗真菌剤によりもたらされ
得る。多くの場合、例えば、糖類または塩化ナトリウムのような等張剤を含むこ
とが好ましい。この注射可能な組成物の延長された吸収は、例えば、モノステア
リン酸アルミニウムおよびゼラチンである、吸収を遅延する薬剤の組成物におけ
る使用により引き起こされ得る。
【００６５】 滅菌注射可能な溶液は、必要に応じて、上記に列挙された種々のその他の成分
とともに、適切な溶媒中に必要な量の活性化合物を取り込むこと、次いで濾過滅
菌により調製される。一般に、分散物は、種々の滅菌された活性成分を、基礎と
なる分散媒体および上記で列挙されたような必要なその他の成分を含む滅菌ビヒ
クル中に取り込むことにより調製される。滅菌注射可能な溶液の調製のための滅
菌粉末の場合、調製の特別な方法は、活性成分に加えて、先に滅菌濾過されたそ
の溶液からの任意の付加的な所望の成分を生じる、真空乾燥および凍結乾燥であ
る。
【００６６】 水溶液における非経口投与のために、例えば、必要な場合、この溶液は適切に
緩衝されるべきであり、そしてこの液体希釈剤は、十分な生理食塩水またはグル
コースで最初に等張性にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮
下および腹腔内の投与について特に適切である。これに関連して、使用され得る
滅菌水性培地は、本開示の観点から、当業者に公知である。例えば、１投薬量は
、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液中に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入
液の添加または注入の所定部位に注射されるかのいずれかである（例えば、Ｒｅ
ｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１
８版、１９９０を参照のこと）。投薬量におけるいくつかの変化が、処置される
被験体の状態に依存して、必然的に生じる。投与に対して責任のある人は、いず
れにしても、個々の被験体のための適切な用量を決定する。
【００６７】 （４．５．２ 他の投与経路） 静脈内または筋肉内注射のような非経口投与のために処方される化合物に加え
て、他の薬学的に受容可能な形態としては、例えば、錠剤または他の経口投与の
ための固体；時間放出性カプセル；および現在使用される他の任意の形態（クリ
ーム、ローション、うがい薬、吸入剤などを含む）が挙げられる。
【００６８】 本発明の組成物は、伝統的な薬学的調製物を含み得る。本発明に従うこれらの
組成物の投与は、標的組織がこの経路を介して利用可能である限り、通常の任意
の経路を介する。これには、経口、経鼻、舌下、直腸、膣、または局所的な経路
が挙げられる。あるいは、投与は正常位、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静
脈内の注射であり得る。この注射は、例えば腫瘍について全身的、局部的、局所
的または直接的な注射であり得る。切除された腫瘍床の注射、およびカテーテル
を介する連続灌流もまた意図される。このような組成物は、前出の薬学的に受容
可能な組成物として通常投与される。
【００６９】 本発明の組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能な組成物
の形態で有利に投与され；注射前に液体中の溶液または懸濁液として適切な固体
形態もまた好ましくあり得る。これらの処方物もまた乳化され得る。このような
目的のための代表的な組成物は、リン酸緩衝生理食塩水のミリリットル当たり５
０ｍｇまたは約１００ｍｇまでのヒト血清アルブミンを含む。他の薬学的に受容
可能なキャリアとしては、水溶液、非毒性賦形剤（塩、防腐剤、緩衝液などを含
む）が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレング
リコール、植物油およびテイロレート（ｔｈｅｙｌｏｌｅａｔｅ）のような注射
可能な有機エステルである。水性キャリアとしては、水、アルコール性／水性溶
液、生理食塩水溶液、非経口ビヒクル（例えば、塩化ナトリウム、リンゲルブド
ウ等など）が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充剤が挙
げられる。防腐剤としては、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスが
挙げられる。医薬品中の種々の成分のｐＨおよび正確な濃度は、周知のパラメー
ターにしたがって調節される。
【００７０】 さらなる処方物は、経口投与に適切である。経口処方物としては、例えば、薬
学グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム
、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような代表的な
賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放
性処方物または粉末の形態をとる。局所的経路の場合、形態はクリーム、軟膏（
ｏｉｎｔｍｅｎｔ、ｓａｌｖｅ）またはスプレーであり得る。
【００７１】 治療的薬剤の有効量は、意図される目的に基づいて決定される。用語「単位用
量」とは、被験体における使用のために適切な物理的に個別の単位をいい、各単
位は、その投与（すなわち、適切な経路および処置レジメン）に関連して所望の
応答を生じるように計算された所定量の治療的組成物を含む。投与される量（処
置の数および単位用量の両方に従う）は、処置される被験体、被験体の状態およ
び所望される防護に依存する。治療的組成物の正確は量はまた、専門家の判断に
依存し、そして各個体に特有である。
【００７２】 特定の場合、本発明の治療的処方物はまた、局所投与のために安定な形態（例
えば、クリームおよびローション）で調製され得る。これらの形態は、皮膚関連
疾患（例えば、種々の肉腫）を処置するために使用され得る。
【００７３】 処方物に関して、溶液は、投薬処方物と適合する様式および治療的に有効な量
で投与される。この処方物は、薬物放出カプセルおよび使用可能である同等物と
ともに種々の投薬形態（例えば、上記の注射可能溶液の型）において容易に投与
される。
【００７４】 （４．６ 免疫療法、化学療法、生物学的療法または放射線治療と組み合わせ
る治療） 種々の腫瘍としては、皮膚、頭部、頸部（ｎｅｃｋ）、脳、口、食道、胃、腸
、直腸、膣、卵巣、頸部（ｃｅｒｖｉｘ）、子宮、前立腺、精巣、胸部、肺、肝
臓、脾臓、膵臓、腎臓、膀胱、リンパ系、血液、骨、および筋肉の癌が挙げられ
るが、これらに限定されない本発明の範囲内で処置され得ることが考慮される。
本発明の範囲内で考慮される腫瘍の型の処置としては、肉腫、腺腫、癌腫、腺癌
、リンパ腫、ホジキン病、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、骨髄腫、
黒色腫、インスリノーマ、白血病、および他の新形成が挙げられるが、これらに
限定されない。
【００７５】 ＤＮＡ損傷因子に耐性の腫瘍細胞は、臨床的な腫瘍学における大問題を意味す
る。現在の癌研究の１つの目的は、化学療法および放射線治療の効力を改善する
方法を見出すことである。１つの方法は、このような伝統的な療法を新規な療法
（例えば、本発明の方法）と組み合わせることによる。本発明に照らして、治療
タンパク質をコードするバキュロウイルスを有するか、または有しない昆虫細胞
を含有する組成物（「昆虫細胞組成物」）の投与が、化学療法または放射線治療
とともに潜在的に使用され得ることが考慮される。
【００７６】 細胞を殺滅するため、細胞増殖を抑制するため、転移を抑制するため、新脈管
形成を抑制するため、そうでなければ腫瘍細胞の悪性の表現型を逆にするためま
たは減少するために、本発明の方法および組成物を使用し、「標的」細胞を、昆
虫組成物および少なくとも１つのその他の薬剤と接触させ得る。これらの治療は
、細胞の増殖を殺滅するためまたは抑制するために複合的な有効量において提供
される。この過程は、この細胞を昆虫細胞組成物およびその他の薬剤または因子
と同時に接触する工程を包含し得る。これは、この細胞を単一の組成物または両
薬剤を含む薬理学的処方物と接触させることによってか、またはこの細胞を２つ
の異なる組成物または処方物と同時に接触させることによって達成され得、ここ
で、１つの組成物としては、昆虫細胞組成物およびこの薬剤を含むその他の組成
物が挙げられる。
【００７７】 あるいは、この昆虫細胞組成物処置は、分間隔から週間隔の範囲で他の薬剤処
置の前かまたはその後であり得る。このような実施形態において、１つは、有意
な期間が、各送達の時間で失効しなかったことを一般的に保証し、その結果、こ
の薬剤および昆虫細胞組成物はなお、標的細胞に対する有利に組み合わされた（
例えば、相乗効果の）効果を発揮し得る。このような例において、１つは、この
細胞を各その他の薬剤を約１２〜２４時間以内の様式でともに接触し、好ましく
は、各その他の薬剤を約６〜１２時間以内の様式でともに接触し、約１２時間の
みの遅延時間が、最も好ましい。いくつかの状況において、治療剤のみでの治療
の持続期間を延ばすことが顕著に所望され得る。例えば、それぞれの投与の間は
、数日間（２、３、４、５、６または７日）から数週間（１、２、３、４、５、
６、７または８週）経過である。
【００７８】 昆虫細胞組成物またはその他の薬剤のいずれかの１回より多くの投与が所望さ
れることがまた考えられる。種々の組み合わせが使用され得、ここで以下に例示
したように、昆虫細胞組成物は「Ａ」であり、そしてその他の薬剤は「Ｂ」であ
る：
【００７９】
【化１】
【００８０】 細胞の殺滅を達成するために、両薬剤は、複合的な有効的量において細胞に送
達され、細胞を殺滅する。
【００８１】 組合せ治療における使用に適切な薬剤または因子は、細胞に適用されるときに
ＤＮＡ損傷を誘導する任意の化学化合物または処置方法である。そのような薬剤
および因子としては、以下のような、ＤＮＡ損傷を誘導する照射および波が挙げ
られる：γ照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電離放射など。種々の化学化合
物（「化学療法剤」とも称する）は、ＤＮＡ損傷を誘導するように機能し、それ
らはみな、本明細書において開示される組合せ処置方法において有用であること
が意図される。有用であることが意図される化学療法剤としては、例えば、以下
が挙げられる：アドリアマイシン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、エトポシ
ド（ＶＰ−１６）、カムプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ
、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、およびさらに過酸化水素。本発明はまた、放射線
ベースであれ、実際の化合物であれ、１つ以上のＤＮＡ損傷剤の組合せ使用を包
含する（例えば、Ｘ線とシスプラチンとの使用、またはシスプラチンとエトポシ
ドとの使用）。
【００８２】 本発明に従って癌を処置するにおいて、昆虫細胞組成物に加えて薬剤と腫瘍細
胞とを接触させる。これは、照射（例えば、Ｘ線、ＵＶ光、γ線またはマイクロ
波でさえ）を用いて局所化された腫瘍部位を照射することによって達成され得る
。あるいは、その腫瘍細胞は、その被験体に治療有効量の薬学的組成物を投与す
ることによって、その薬剤と、接触され得る。この薬学的組成物は、以下を包含
する：例えば、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル、エトポシド、カムプ
トテシン、アクチノマイシン−ＤまたはマイトマイシンＣ。この薬剤は、上記の
ように、昆虫細胞組成物とそれとをあわせることによって、組合せ治療組成物ま
たはキットとして調製および使用され得る。
【００８３】 核酸（特に、ＤＮＡ）を直接架橋する薬剤は、ＤＮＡ損傷を容易にすることが
意図され、これは、昆虫細胞組成物との相乗作用的な抗新生物組合せをもたらす
。シスプラチンのような薬剤および他のＤＮＡアルキル化剤が使用され得る。
【００８４】 ＤＮＡを損傷する薬剤としてはまた、ＤＮＡ複製、有糸分裂、および染色体分
離に干渉する化合物が挙げられる。そのような化学療法化合物としては、アドリ
アマイシン（ドキソルビシンとしても知られる）、エトポシド、ベラパミル、ポ
ドフィロトキシンなどが挙げられる。新生物の処置のための臨床設定において広
汎に使用されるこれらの化合物は、アドリアマイシンについて２５〜７５ｍｇ／
ｍ2の範囲の用量で、２１日間隔でのボーラス注射を通じて静脈内で、エトポシ
ドについて３５〜５０ｍｇ／ｍ2で静脈内または静脈内用量の２倍で経口で、投
与される。
【００８５】 核酸前駆体およびサブユニットの合成および信頼性を破壊する薬剤は、ＤＮＡ
損傷を生じる。多数の核酸前駆体が、この目的のために開発されている。特に有
用なのは、広汎な試験を受け、そして容易に利用可能な薬剤（例えば、５−フル
オロウラシル（５−ＦＵ））である。５−ＦＵは非常に毒性であるが、局所を含
め広汎なキャリア中に適用可能である。しかし、３〜１５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲
の用量での静脈内投与が一般に使用される。
【００８６】 ＤＮＡ損傷を生じ、そして広汎に使用されている他の因子としては、γ線、Ｘ
線、および／または腫瘍への放射性同位体の直接送達が挙げられる。他の形態の
ＤＮＡ損傷因子もまた意図される（例えば、マイクロ波およびＵＶ照射）。おそ
らく、これらの因子のすべては、ＤＮＡに対して、ＤＮＡの前駆体に対して、Ｄ
ＮＡの複製および修復、ならびに染色体のアセンブリおよび維持に対して広汎な
損傷をもたらすようである。Ｘ線についての投薬量範囲は、長期について（３〜
４週間）５０〜２００レントゲンの一日用量の範囲であり、単回用量で２０００
〜６０００レントゲンである。放射性同位体についての投薬量範囲は、広汎に変
動し、そしてその同位体の半減期、放射される照射の強度および型、および新生
物細胞による取り込みに依存する。
【００８７】 当業者は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ」第１８版（１９９０）を参酌されたい。投薬量においていくらか
の変動が、処置されるべき被験体の状態に応じて必然的に生じる。投与責任者は
、いずれにせよ、個々の被験体について適切な用量を決定する。さらに、ヒト投
与について、調製物は、滅菌性、毒性、ならびに一般的安全性および純度標準を
、ＦＤＡ局によって必要とされる生物学的標準に応じて満たさねばならない。
【００８８】 前立腺癌を有する患者への昆虫細胞組成物の領域的送達は、臨床的疾患を中和
するための治療上有効な昆虫細胞組成物の送達について非常に効率よい方法であ
り得る。同様に、化学療法または放射線療法は、被験体の身体の特定の罹患した
領域に指向され得る。あるいは、昆虫細胞組成物および／または薬剤の全身送達
は、特定の環境、例えば、広汎な転移が起こっている場合において適切であり得
る。当業者は、Ｈ５細胞の破壊（例えば、凍結融解サイクルによる）が発現され
た治療タンパク質に有意に影響を与えることなくバキュロウイルスを不活化する
ことを認識する。
【００８９】 昆虫細胞組成物標的化治療と化学療法および放射両方とを組み合わせることに
加えて、遺伝子治療との組合せが有利であり得ることもまた意図される。例えば
、昆虫細胞組成物に向けて指向された治療およびｐ５３の同時の標的化が、改善
された抗癌処置を生成し得る。任意の他の認識可能な腫瘍関連遺伝子は、この様
式で標的化され得る。例えば、ｐ２１、Ｒｂ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ
−２、ｐｌ６、ＦＨＩＴ、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＶＨＬ、ＦＣ
Ｃ、ＭＣＣ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｆｍｓ、ｊｕ
ｎ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ｂｃｌおよびａｂｌ。
【００９０】 （４．７キット） 本発明の種々の局面に要求される全ての必須の材料および試薬は、キット中に
一緒にアセンブルされ得る。このキットの構成要素が１つ以上の液体溶液中に提
供される場合、その液体溶液は、好ましくは水性溶液であり、ここで、滅菌性水
溶液が特に好ましい。本発明の実施において、そのようなキット構成要素は、単
離された昆虫細胞、バキュロウイルスを含む昆虫細胞、または治療タンパク質を
コードする遺伝子を含むように遺伝子操作されたバキュロウイルスを含む昆虫細
胞を備え得る。好ましい実施形態において、その治療タンパク質は、昆虫内で発
現される。このような昆虫細胞は、不活化または凍結乾燥され得る。好ましい実
施形態において、その昆虫細胞は、凍結融解サイクルまたは他の方法によって破
壊される。この方法は、目的の任意の治療タンパク質を含む、タンパク質成分に
有害な影響を与えることなくその細胞の構造的統一性を破壊する。
【００９１】 インビボでの使用について、本発明の組成物は、単一または別個の薬学的に受
容可能な注射可能な組成物中へと処方され得る。この場合、その容器手段自体は
、吸入器（ｉｎｈａｌｅｎｔ）、シリンジ、ピペット、点眼用容器、またはこの
ような他の器具であり得、これらから、その処方物は、身体（例えば、肺）の感
染した部分に適用され得、動物に注入されるか、またはそのキットの他の構成要
素に適用および混合さえされ得る。
【００９２】 そのキットの構成要素はまた、乾燥したかまたは凍結乾燥した形態で提供され
得る。試薬または構成要素が乾燥した形態で提供される場合、再構成は、一般的
に、適切な溶媒の添加による。その溶媒もまた、別の容器手段において提供され
得る。
【００９３】 本発明のキットはまた、代表的には、所望のバイアルがその中に保持される、
例えば、注射または胴型プラスチック容器のような市販のために密接に詰め込ま
れてそのバイアルを含む容器のための手段を包含する。容器の数またはタイプに
関わりなく、本発明のキットはまた、最終的な複合組成物を動物の体内に注入／
投与するか、または配置することを補助するための装置を包含し得るか、または
パッケージ化され得る。このような装置は、吸入器、シリンジ、ピペット、鉗子
、計測スプーン、点眼用容器、または任意のこのような医学的に認証されている
送達ビヒクルであり得る。さらに、そのキット構成要素の使用のための指示書が
代表的に含まれる。
【００９４】 （５．０ 実施例） 以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実施するために含められる。以
下の実施例に開示される技術は、本発明者らの実施において充分に機能するよう
に本発明者によって発見された技術を表し、従って、その実施のための好ましい
態様を構成すると考えられ得ることは、当業者には理解されるべきである。しか
し、当業者は、本開示に鑑みて、多くの改変が、開示される特定の実施形態にお
いてなされ得、そしてなお同様のまたは類似の結果を本発明者らの精神および範
囲から逸脱することなく得るることを理解するべきである。
【００９５】 （５．１ 実施例１：ＩＦＮ−βをコードするバキュロウイルスに感染したＨ
５細胞によるマクロファージのインビトロ活性化） これらの実施例において用いられたＨ５細胞株（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ、Ｓｏｒ
ｒｅｎｔｏ、ＣＡ）は、Ｂｏｙｃｅ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｔｈａｃａ，ＮＹによって開発され
た。これは、キャベツシャクトリムシ（ｃａｂｂａｇｅ ｌｏｏｐｅｒ）Ｔｒｉ
ｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞に起源を有した。この細胞株は、２４時間
未満で二倍になり、単層で充分に増殖し、懸濁培養および無血清培地に適合可能
であり、そしてＳｆ９細胞よりも５〜１０倍高い分泌発現を提供する。Ｈ５昆虫
細胞株は、主に、組換えタンパク質の高発現のために使用される。
【００９６】 マウスインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）遺伝子をコードする組換えバキュロ
ウイルスを、約５×１０8ＰＦＵ／ｍｌの力価で本発明者らが開発した。バキュ
ロウイルス−ＩＦＮ−βへの感染後、Ｈ５細胞は、高レベルのＩＦＮ−βを分泌
した。このバキュロウイルスを調製するために、マウスＩＦＮ−β ｃＤＮＡの
全コード領域をプラスミドｐｘＣＭＶ中へとサブクローニングした。このｐｘＣ
ＭＶは、アデノウイルスゲノムを含んでシャトルベクターｐＥＣＩＦＮ−βを生
じる（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９１）。次いで、このｃＤＮＡフ
ラグメントを、ｐＥＣＩＦＮ−βをテンプレートとして用いてＰＣＲにより増幅
した。Ｐｓｔ１およびＥｃｏＲＩについての制限酵素を、それぞれ上方（配列番
号１）および下方（配列番号２）のプライマーに付加した。Ｐｓｔ１およびＥｃ
ｏＲＩでの制限消化後、ｍＩＦＮ−βコード配列を含むＰＣＲフラグメントをバ
キュロウイルスベクターｐＢｌｕｅ Ｂａｃ２Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａ）中へとサブクローニングしてｐＢａｃ−ｍＩＦＮ−βを
生じさせた。これを制限マッピングによって確認した。ｐＢａｃ−ｍＩＦＮ−β
を、ＳＦ９昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）へと
トランスフェクトしてｍＩＦＮ−βをコードするバキュロウイルス（Ｂａｃ−ｍ
ＩＦＮ−β）を、製造業者の指示書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ、ＣＡ）に従って生成した。機能的ｍＩＦＮ−βの産生を、バイオアッセイを
用いて評価した。このバイオアッセイにおいて、ＩＦＮ−βおよびＬＰＳは、マ
クロファージを活性化して、一酸化窒素を産生する（Ｄｏｎｇら、１９９８）。
Ｓｆ９細胞によって産生されたストックＢａｃ−ｍＩＦＮ−βを４℃で格納した
。
【００９７】 ５’−ＡＴＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＣＴＣＴＣＣＡＴＣＡＡＣＴＡ−３’（配列
番号１） ５’−ＴＴＣＣＡＡＡＡＣＴＧＡＡＧＡＡＧＧＡＴＴＣＧＡＡＧ−３’（配列
番号２） バキュロウイルスへの昆虫細胞の感染のために、Ｈ５昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、０．１５ｍｌの無血清ＥＸＣＥＬＬ ４００培地（ＪＲＨ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）中に４
×１０4細胞／ｃｍ2の密度で組織培養フラスコ中へとプレートした。２８℃での
ヒト版の培養の後、その細胞を、２プラーク形成単位／Ｂａｃ−ｍＩＦＮ−β細
胞で３６時間インキュベートした。その培養培地を除去し、そしてその感染した
細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し、そして下記のように
治療実験に用いた。
【００９８】 マクロファージ活性化のためのインビトロアッセイを、Ｄｏｎｇら（１９９５
）に従って行った。マクロファージを、コントロール培地、Ｈ５昆虫細胞単独の
培養物からの上清（１：２０希釈）、またはバキュロウイルス−ＩＦＮ−βに感
染したＨ５の培養物からの上清のいずれかに暴露し、次いで、リポポリサッカリ
ド（ＬＰＳ）に試験暴露（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）した。図１に示されるように、
マクロファージ活性化は、バキュロウイルス−ＩＦＮ−βを含むＨ５細胞の存在
下でのみ生じた。従って、コードされるＩＦＮ−βタンパク質の産生は、マクロ
ファージ活性化をインビトロで生じるに充分であった。この実施例は、さらに、
バキュロウイルス感染したＨ５細胞による上清へその発現されたＩＦＮ−βタン
パク質が分泌されたことを実証した。
【００９９】 マクロファージの活性化はまた、Ｈ５細胞の超音波処理細胞溶解物を用いて観
察された（図２Ａ）。超音波処理されたコントロールＨ５細胞は、マクロファー
ジ活性化には影響を有しなかった（図２Ｂ）。標準的な用量応答曲線が、ＩＦＮ
−βによるマクロファージ活性化について観察された（図２Ｃ）。しかし、超音
波処理された細胞溶解物を用いて、マクロファージの最大の活性化が、２００μ
ｌの溶液中で１ウェルあたり１０4細胞の投与量で観察された（図２Ａ）。
【０１００】 （５．２ 実施例２ インターフェロン−βをコードするバキュロウイルスで
感染させたＨ５細胞によって誘導されるインビボ腫瘍退行） Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（ｎ＝１０）に、生存同系ＵＶ−２２３７ Ｍ２線維肉
腫細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。このＵＶ−２２３７Ｍ細胞株（Ｒａｚら、
１９８１）は、ＵＶ２２３７線維肉腫によって生じた自発性肺転移から誘導され
、このＵＶ２２３７線維肉腫は、元来、紫外線照射によってＣ３Ｈ／ＨｅＮマウ
ス中で誘導された（Ｋｒｉｐｋｅ、１９７７）。腫瘍が直径５〜６ｍｍに達した
とき（本研究の９日目）、１×１０6のトランスフェクトしていないＨ５細胞（
Ｈ５）またはＩＦＮ−βをコードするバキュロウイルスでトランスフェクトした
１×１０6のＨ５細胞（Ｈ５−ＩＦＮ−β）を、この腫瘍に注射した。この単回
注射後、Ｈ５−ＩＮＦ−βを注射した全ての腫瘍（ｎ＝１０）は退行し、一方、
生理食塩水（コントロール）またはＨ５細胞を注射した腫瘍は退行しなかった（
図３）。Ｈ５細胞単独の注射は、一般に、腫瘍退行を促進するのに十分ではない
が、いくつかの場合で、生理食塩水を注射したコントロール腫瘍と比較して、腫
瘍増殖の減少を生じた（図３）。本実施例は、少なくとも４回繰り返したが、各
回で同様の結果が観察された。これらの繰り返しのいくつかにおいて、Ｈ５−Ｉ
ＦＮ−β細胞での腫瘍の注射は、腫瘍の完全な退行を促進するのに十分であった
（図４）。腫瘍退行についての代表的な時間経過を、以下の表３に示す。
【０１０１】
【表３】
【０１０２】a ＵＶ−２２３７Ｍ細胞（２×１０5／マウス）を、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスにｓ
．ｃ．注射した。９日後、このマウスを、生理食塩水、Ｈ５またはＨ５−ＩＦＮ
の腫瘍内注射によって処置した。b Ｂａｃ−ＩＦＮをＨ５細胞に感染させる：Ｔ１５０フラスコ中のＨ５細胞に
、５０μｌのＢａｃ−ＩＦＮを２４時間感染させた。この細胞を収集し、処置し
た腫瘍に使用した。c ＵＶ−２２３７Ｍ２細胞（２×１０5）を、同系Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ雌性マウス（
１０〜１２週齢）にｓ．ｃ．注射した。腫瘍が直径３〜４ｍｍに達したとき（９
日目）、マウスを、以下の３グループに無作為化した：生理食塩水コントロール
、Ｈ５細胞（１×１０6）コントロール、およびＨ５ ｍＩＦＮ−β細胞（１×
１０6）。これらを、腫瘍に一回注射した。腫瘍サイズを、カリパスを用いて測
定した。
【０１０３】 （５．３ 実施例３．Ｈ５細胞のインビボでの生存性の欠如） Ｈ５−ＩＦＮ−β細胞を、125ヨードデオキシウリジンで放射標識した。表４
に示されるように、放射標識された細胞は、放射性毒性を全く示さないで１２０
時間、インビトロの培養物中で生存した。対照的に、マウスに静脈内注射した放
射標識したＨ５−ＩＦＮ−β細胞は、４８時間以内に排除された。これらのデー
タによって、腫瘍の退行が、生存Ｈ５−ＩＦＮ−β細胞を必要としないことが示
された。
【０１０４】
【表４】
【０１０５】 （５．４ 実施例４．凍結乾燥したＨ５−ＩＦＮ−β細胞による皮下腫瘍の根
絶） Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスに、生存ＵＶ−２２３７ Ｍ２細胞をｓ．ｃ．注射した
。腫瘍が直径４〜５ｍｍに達したとき、マウスのグループ（ｎ＝１０）に、生理
食塩水（未処置）、１×１０6のＨ５−ＩＦＮ−β細胞、１×１０6の凍結融解（
３回）したＨ５−ＩＦＮ−β細胞、または１×１０6の凍結乾燥したＨ５−ＩＦ
Ｎ−β細胞を、それらの腫瘍に一回注射した。
【０１０６】 図５に示されるように、生存Ｈ５−ＩＦＮ−β細胞、凍結融解した（死亡させ
た）Ｈ５−ＩＦＮ−β細胞、または凍結乾燥したＨ５−ＩＦＮ−β細胞によって
誘導される腫瘍退行には、本質的に差異はなかった。凍結乾燥した昆虫細胞また
は他の不活性化させた昆虫細胞が臨床使用に有利であることから、この結果は、
昆虫細胞を含む組成物の潜在的な治療的使用に重要である。この後の実施例には
、凍結乾燥したＨ５−ＩＦＮ−β細胞の注射を利用した。
【０１０７】 （５．５ 実施例５．Ｈ５−ＩＦＮ−β細胞でのマウスの処置は、同じ腫瘍の
全身性免疫を誘導する） Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスに、生存同系ＵＶ−２２３７ Ｍ２線維肉腫細胞をｓ．
ｃ．注射した。腫瘍が直径５〜６ｍｍに達したとき、マウスに、生理食塩水（未
処置）、トランスフェクトしていないＨ５細胞の凍結乾燥調製物（１×１０6用
量）、またはＨ５−ＩＦＮ−β細胞の凍結乾燥調製物（１×１０6）を腫瘍内に
単回注射した。Ｈ５−ＩＦＮ−β細胞を注射した全ての腫瘍は、本研究の２５日
目までに退行した。
【０１０８】 この処置によって治癒されたマウス（ｎ＝１０）に、５×１０4、２×１０5ま
たは５×１０5の生存ＵＶ−２２３７ Ｍ２細胞をｓ．ｃ．チャレンジした（ｎ
＝５）。図６に示されるように、治癒されたマウスは全て、腫瘍を発生せず、一
方、全てのコントロールマウスは、腫瘍を発生した。
【０１０９】 この予期されない結果は、癌の治療処置に非常に重要なことである。これは、
本発明の範囲内において、本明細書中に記載の昆虫細胞組成物を使用して哺乳動
物を免疫すること、およびこのような哺乳動物に同じ腫瘍によるさらなるチャレ
ンジに対する免疫を提供することが可能であることを、実証する。原理的に、例
えば、肺癌を有する個体へのこの特許請求された昆虫細胞組成物の注射、および
その後の腫瘍の退行は、同じ型の腫瘍のさらなる発生に対する耐性をこの個体に
提供するはずである。このような免疫がどれほど長く継続するかは、現在未知で
ある。しかし、所定の疾患関連抗原に対する周期的な追加免疫の方法が、当該分
野で公知であり、そして本発明の範囲内である。
【０１１０】 （５．６ 実施例６ 全身性免疫は腫瘍特異的である） この腫瘍チャレンジに対する耐性は、特異的であることが決定された。Ｃ３Ｈ
／ＨｅＮマウス、および凍結乾燥したＨ５−ＩＦＮ−β細胞の単回腫瘍内注射に
よってｓ．ｃ．ＵＶ−２２３７Ｍ腫瘍を治癒されたＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスに、非
交差反応性の同系Ｋ−１７３５黒色腫細胞を皮下チャレンジした。正常（コント
ロール）マウスおよびＵＶ−２２３７Ｍ腫瘍を治癒されたマウスは全て、皮下黒
色腫を発生した（図７）。従って、Ｈ５−ＩＦＮ−βでの処置によって誘導され
た全身性免疫は、異なる抗原性の腫瘍には及ばない。
【０１１１】 Ｈ５−ＩＦＮ−βがＵＶ−２２３７Ｍ腫瘍の退行を誘導した２〜３ヶ月後、「
治癒された」マウスおよびコントロール正常マウスを、異なる数のＵＶ−２２３
７Ｍ細胞またはＫ−１７３５黒色腫細胞で再チャレンジした。表５に示されるこ
の結果は、５×１０4、１×１０5または２×１０5細胞／接種でのＵＶ−２２３
７Ｍ細胞は、全てのコントロールマウスにおいて腫瘍を生じた。対照的に、ＵＣ
−２２７３Ｍ腫瘍を処置されたＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスは、ＵＶ−２２７３Ｍ細胞
での再チャレンジに耐性であった。５×１０4、１×１０5または２×１０5 Ｋ
１７３５黒色腫細胞／接種の注射は、全てのコントロール正常マウスおよびＵＶ
−２２７３Ｍ「治癒された」マウスにおいて腫瘍を生じた。
【０１１２】
【表５】
【０１１３】 （５．７ 実施例７．退行する腫瘍の免疫組織化学） Ｈ５−ＩＦＮ−βの腫瘍内注射は、マクロファージ（スカベンジャーレセプタ
ー陽性細胞）、ならびにＣＤ−４陽性Ｔ細胞およびＣＤ−８陽性Ｔ細胞（Ｌ３Ｔ
４陽性細胞およびＬｙｔ２陽性細胞）を漸増し得る。この注射、および腫瘍細胞
増殖の阻害に関連するリンパ系炎症は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）陽性細胞の
減少およびアポトーシス受容細胞（ＴＵＮＥＬ陽性細胞）の増加に反映された（
図８）。従って、Ｈ５−ＩＦＮ−βの注射は、宿主免疫系の活性化に関連する。
【０１１４】 （５．８ 実施例８ 予防的または治療的ワクチンにおけるサイトカイン産生
する昆虫細胞の使用） 弱い免疫原性腫瘍細胞のＧＭ−ＣＳＦ遺伝子での形質導入は、抗原性−免疫原
性を増強することが示されている。ＧＭ−ＣＳＦ形質導入腫瘍細胞は、腫瘍細胞
ワクチンの種々の調製に使用されている。ワクチン接種（腫瘍細胞ワクチン調製
物）部位でのＧＭ−ＣＳＦの注射は、おそらく抗原提示細胞に対する効果によっ
て、免疫原性を増加させることが示されている。これらのデータは、ＧＭ−ＣＳ
Ｆは、免疫応答を増強するために使用され得ることを示唆する。
【０１１５】 マウスＧＭ−ＣＳＦをコードするバキュロウイルスを感染させたＨ５昆虫細胞
を、腫瘍細胞と混合し、そして哺乳動物にｓ．ｃ．またはｉ．ｍ．（筋内）注射
し得る。ＧＭ−ＣＳＦ産生昆虫細胞＋腫瘍細胞（抗原）の組み合わせは、腫瘍細
胞上に存在する特異的ＴＡＡに対してマウスを免疫する。この実施形態において
、サイトカインを産生する昆虫細胞は、ワクチンレジメンにおける汎用性のアジ
ュバントとして作用する。このアジュバントは、癌、ＡＩＤＳ、インフルエンザ
および免疫系介入を受けやすい他の疾患の処置に使用され得る。このサイトカイ
ンを発現する昆虫細胞は、生存していても、凍結融解されていても、または凍結
乾燥されていてもよい。サイトカインと組み合わされた、昆虫細胞タンパク質の
免疫原性は、別のタンパク質（例えば、抗原）、ウイルスまたは細菌に対する免
疫を刺激する。
【０１１６】 本明細書中に開示および特許請求される全ての組成物および方法は、本開示を
考慮して過度の実験なく作製および実行され得る。本発明の組成物および方法は
、好ましい実施形態の点から記載されているが、この組成物および方法に対して
、ならびに本明細書中に開示される方法の工程およびそれらの工程の順序におい
て、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、変更が適用され得るこ
とが、当業者に明らかである。より詳細には、化学的および生理学的の両方に関
連する特定の薬剤が、本明細書中に記載の薬剤と置換され得、同じまたは同様の
結果が達成されることが明らかである。当業者に明らかな、このような類似の置
換および改変の全てが、添付の特許請求の範囲に定義されるような本発明の精神
、範囲および概念内にあるとみなされるべきである。
【０１１７】 （６．０ 参考文献） 以下の参考文献は、それらが、本明細書中に開示されるものを補遺する例示的
な実験的詳細または他の詳細を提供する程度で、本明細書中に参考として詳細に
援用される。
【０１１８】
【表６】
【０１１９】 以下の図面は、本発明の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに実
証するために含まれる。本発明は、本明細書中に示される特定の実施形態の詳細
な説明と組み合わせて、１以上のこれらの図面を参照することによってより良好
に理解され得る。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＩＦＮ−βを発現するバキュロウイルスに感染したＨ５昆虫細胞からの培養上
清による刺激に対する、マクロファージによる酸化窒素のインビトロ産生。
【図２Ａ】 ＩＦＮ−βを発現するバキュロウイルスに感染したＨ５昆虫細胞からの超音波
処理した溶解物による刺激に対する、マクロファージによる酸化窒素のインビト
ロ産生。
【図２Ｂ】 バキュロウイルスを含まないコントロールＨ５昆虫細胞の超音波処理した溶解
物に対する、マクロファージによる酸化窒素のインビトロ産生の欠損。
【図２Ｃ】 上清液中のＩＦＮ−β濃度の関数としての、マクロファージによる酸化窒素の
インビトロ産生についての用量応答曲線。
【図３】 腫瘍増殖に対する、生理食塩水（コントロール）、昆虫細胞単独、またはＩＦ
Ｎ−βを発現するバキュロウイルスを含むＨ５昆虫細胞の腫瘍内注射の効果。Ｕ
Ｖ−２２３７Ｍ線維肉腫細胞（２×１０5／マウス）を、シンジェニックＣ３Ｈ
／ＨｅＮマウスにに皮下（ｓ．ｃ．）で注射した。９日後に、このマウスを、腫
瘍内注射によって処置した。ＩＦＮ−βをコードするバキュロウイルスを含むＨ
５細胞を、Ｔ１５０フラスコ中で５０μｌのバキュロウイルスを用いる２４時間
の感染によって調製した。
【図４】 図３に示される研究の繰り返し（ｎ＝１０のマウス）。
【図５】 Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（ｎ＝１０）に皮下に注射したＵＶ−２２３７Ｍ線維肉
腫細胞の腫瘍増殖に対する、ＩＦＮ−βを発現するバキュロウイルスを含む、凍
結乾燥した生のＨ５昆虫細胞および凍結融解した生のＨ５昆虫細胞の腫瘍内注射
の効果。
【図６】 ＩＦＮ−βを発現するバキュロウイルスを含む凍結乾燥されたＨ５昆虫細胞の
腫瘍内注射によってＵＶ−２２３７Ｍ腫瘍の「治癒」されたマウスにおける全身
性免疫の生成。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（ｎ＝１０）に、ＵＶ−２２３７Ｍ細胞を
皮下に注射した。単回の腫瘍内注射を、直径５〜６ｍｍの腫瘍に投与した。腫瘍
の後退の６週間後に、このマウスを、示される量の新規ＵＶ−２２３７Ｍ細胞の
注射によってチャレンジした。全てのコントロール細胞は、腫瘍を発生したが、
「治癒」されたマウスのいずれもが、腫瘍を発生しなかった。
【図７】 ＩＦＮ−βを発現するバキュロウイルスを含む凍結乾燥されたＨ５昆虫細胞の
腫瘍内注射により皮下ＵＶ−２２３７Ｍ腫瘍が「治癒」したマウスにおける全身
性免疫は、腫瘍型に特異的である。図６の説明文に記載されるような、皮下ＵＶ
−２２３７Ｍ腫瘍を「治癒」されたマウスを、示される量のシンジェニック非交
差反応性Ｋ−１７５３黒色腫細胞株の注射によってチャレンジした。コントロー
ルマウスおよび「治癒」マウスの両方が、腫瘍を発生した。
【図８】 ＵＶ−２２３７Ｍ皮下腫瘍の後退の免疫組織化学。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１０月１１日（２００１．１０．１１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】 以下の図面は、本発明の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに実
証するために含まれる。本発明は、本明細書中に示される特定の実施形態の詳細
な説明と組み合わせて、１以上のこれらの図面を参照することによってより良好
に理解され得る。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Fidler, Isaiah J. <120> Therapy of Cancer by Insect Cells Containing Recombinant Baculovirus Encoding Genes <130> UTFC:585-JP <140> 09/271,013 <141> 1999-03-17 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atctgcagag ccctctccat caacta 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 ttccaaaact gaagaaggat tcgaag 26
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２Ａ】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２Ｂ】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２Ｃ】
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ａ６１Ｋ 35/64 37/66 Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ドン， チョンユン アメリカ合衆国 テキサス 77478， シ ュガーランド， プランテイション コロ ニー ドライブ 5311 (72)発明者 ル， ウェイシン アメリカ合衆国 テキサス 77081， ヒ ューストン， ナンバー 132， ビゾネ ット 5606 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA24 BA26 BA28 BA30 CA04 DA02 EA02 FA02 GA11 HA17 4C084 AA02 AA13 AA17 BA44 CA49 CA56 DA01 DA02 DA19 DA21 DA23 DA25 NA14 ZB262 4C087 AA01 AA02 BB21 BC83 CA04 CA12 CA16 NA14 ZB26

Claims (41)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 選択された非表面発現タンパク質またはペプチドをヒト被験
    体に対して提供する方法であって、該方法は、以下： ａ）選択された非表面発現タンパク質またはペプチドをコードする単離された
    核酸セグメントを含む昆虫細胞を調製する工程； ｂ）該昆虫細胞を培養して該タンパク質またはペプチドを発現する工程；およ
    び ｃ）該タンパク質またはペプチドを含む該昆虫細胞を、該哺乳動物に非精製形
    態で投与する工程、 を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 前記選択された非表面発現タンパク質が治療用タンパク質で
    ある、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記選択された非表面発現タンパク質がサイトカインである
    、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記選択された非表面発現タンパク質が、インターフェロン
    、インターロイキン、腫瘍壊死因子またはコロニー刺激因子である、請求項３に
    記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記選択された非表面発現タンパク質が、β−インターフェ
    ロンまたはＧＭ−ＣＳＦである、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記選択された非表面発現タンパク質またはペプチドをコー
    ドする前記単離された核酸セグメントが、前記昆虫細胞に該単離された核酸セグ
    メントを発現するために適切な組換えベクター内に含まれる、請求項１に記載の
    方法。
  7. 【請求項７】 前記選択された非表面発現タンパク質またはペプチドをコー
    ドする前記単離された核酸セグメントが、組換えバキュロウイルスベクター内に
    含まれる、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記昆虫細胞がＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ細胞またはＴｒｉｃｈ
    ｏｐｌｕｓｉａ細胞である、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記昆虫細胞がＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄ
    ａ細胞である、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記昆虫細胞がＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞であ
    る、請求項８に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記昆虫細胞が前記ヒト被験体に注入される、請求項１に
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記ヒト被験体が腫瘍を有し、ここで、前記昆虫細胞が該
    腫瘍に直接注入される、請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 腫瘍を有する哺乳動物を処置する方法であって、該方法は
    、以下： ａ）選択された非表面発現治療用タンパク質またはペプチドをコードする単離
    された核酸セグメントを含む昆虫細胞を含有する、薬学的組成物を提供する工程
    であって、ここで、該タンパク質またはペプチドは、該細胞中に発現される、工
    程；および ｂ）治療的有効量の該組成物を該哺乳動物に投与する工程 を包含し、ここで、該治療用タンパク質またはペプチドは非精製形態で存在する
    、方法。
  14. 【請求項１４】 前記選択された非表面発現タンパク質またはペプチドをコ
    ードする前記単離された核酸セグメントが、前記昆虫細胞中に該単離された核酸
    セグメントを発現するために適切な組換えベクター内に含まれる、請求項１３に
    記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記選択された非表面発現タンパク質またはペプチドをコ
    ードする前記単離された核酸セグメントが、組換えバキュロウイルスベクター内
    に含まれる、請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記組成物が前期腫瘍内に直接注入される、請求項１３に
    記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記哺乳動物に対する前記組成物の少なくとも２回の投与
    工程を包含する、請求項１３に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記哺乳動物に対する前記組成物の少なくとも３回の投与
    工程を包含する、請求項１３に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記組成物が約１０5と約１０7の間の昆虫細胞を含有する
    、請求項１３に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記選択された非表面発現治療用タンパク質がサイトカイ
    ンである、請求項１３に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記選択された非表面発現治療用タンパク質が、インター
    フェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子またはコロニー刺激因子である、請
    求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記選択された非表面発現治療用タンパク質が、β−イン
    ターフェロンまたはＧＭ−ＣＳＦである、請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記昆虫細胞がＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒ
    ｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞である、請求項１３に記載
    の方法。
  24. 【請求項２４】 前記哺乳動物がヒト被験体である、請求項１３に記載の方
    法。
  25. 【請求項２５】 哺乳動物における癌の再発を予防する方法であって、ここ
    で、該癌は特異的ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）を発現し、該方法は、以下： ａ）選択された非表面発現治療用タンパク質またはペプチドをコードする単離
    された核酸セグメントを含む昆虫細胞を含有する、薬学的組成物を提供する工程
    であって、ここで、該タンパク質またはペプチドは、該昆虫細胞中に発現される
    、工程； ｂ）治療的有効量の該組成物を該哺乳動物に投与する工程；および ｃ）該癌に対する免疫応答を活性化する工程であって、該免疫応答は、該ＴＡ
    Ａに対して標的化される、工程、 を包含し、ここで、該免疫応答が、該癌の退行を引き起こすに効果的であり、さ
    らにここで、該哺乳動物が、該同一のＴＡＡを発現する癌の再発に耐性である、
    方法。
  26. 【請求項２６】 前記選択された非表面発現タンパク質またはペプチドをコ
    ードする前記単離された核酸セグメントが、前記昆虫細胞中に該単離された核酸
    セグメントを発現するために適切な組換えベクター内に含まれる、請求項２５に
    記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記組換えベクターがバキュロウイルスベクターである、
    請求項２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記哺乳動物がヒト被験体である、請求項２５に記載の方
    法。
  29. 【請求項２９】 前記選択された非表面発現治療用タンパク質が、インター
    フェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子またはコロニー刺激因子である、請
    求項２５に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記選択された非表面発現治療用タンパク質が、β−イン
    ターフェロンまたはＧＭ−ＣＳＦである、請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 治療的有効量の別の抗腫瘍剤を前記哺乳動物に投与する工
    程をさらに包含する、請求項１３に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 疾患状態を有するヒトを処置する方法であって、該方法は
    、以下： ａ）バキュロウイルスを含む昆虫細胞を含有する薬学的組成物を提供する工程
    であって、該バキュロウイルスは、選択された非表面発現治療用タンパク質また
    はペプチドをコードする単離された核酸セグメントを含み、ここで、該タンパク
    質またはペプチドは該細胞内で発現される、工程；および ｂ）治療的有効量の該組成物を該ヒトに投与する工程； を包含し、ここで、該投与工程は、該疾患状態に対する免疫応答を活性化し、こ
    れによって該ヒトを処置する、方法。
  33. 【請求項３３】 前記選択された非表面発現治療用タンパク質が、インター
    フェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子またはコロニー刺激因子である、請
    求項３２に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 バキュロウイルスを含む昆虫細胞を含有する薬学的組成物
    であって、該バキュロウイルスは、サイトカインをコードする単離された核酸セ
    グメントを含み、ここで、該サイトカインは該細胞内に発現される、薬学的組成
    物。
  35. 【請求項３５】 前記サイトカインが、インターフェロン、インターロイキ
    ン、腫瘍壊死因子またはコロニー刺激因子である、請求項３４に記載の組成物。
  36. 【請求項３６】 前記選択された非表面発現治療用タンパク質が、β−イン
    ターフェロンまたはＧＭ−ＣＳＦである、請求項３５に記載の組成物。
  37. 【請求項３７】 以下： ａ）バキュロウイルスを含む昆虫細胞を含有する薬学的組成物であって、該バキ
    ュロウイルスは、サイトカインをコードする単離された核酸セグメントを含み、
    ここで、該サイトカインは該細胞内に発現される、薬学的組成物；および ｂ）該組成物のための容器、 を備える、キット。
  38. 【請求項３８】 腫瘍を有する哺乳動物を処置する方法であって、該方法は
    、以下： ａ）昆虫細胞を含有する薬学的組成物を提供する工程；および ｂ）治療的有効量の該組成物を該哺乳動物に投与する工程； を包含し、ここで、該投与工程は、該腫瘍の増殖を阻害するに有効である、方法
    。
  39. 【請求項３９】 前記昆虫細胞が、前記投与工程の前に不活性化される、請
    求項１に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記不活性化が、前記細胞を凍結融解サイクルに供するこ
    とによって生じる、請求項３９に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記昆虫細胞が凍結融解サイクルによって不活性化される
    、請求項３４に記載の組成物。
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