KR20040071678A - Ｒｓｖ 유전자 발현 백신 - Google Patents

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KR20040071678A
KR20040071678A KR10-2004-7004654A KR20047004654A KR20040071678A KR 20040071678 A KR20040071678 A KR 20040071678A KR 20047004654 A KR20047004654 A KR 20047004654A KR 20040071678 A KR20040071678 A KR 20040071678A
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샴 에스. 모하프트라
무케시 쿠마르
샤우-쿠 후앙
캄 더블유. 레옹
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유니버시티 오브 사우스 플로리다
죤스홉킨스유니버시티
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Abstract

대응하는 RSV 항원을 코딩하는 최소한 4개의 다른 플라스미드 DNA의 칵테일로 구성된 효율적인 예방용 점막 유전자 발현 백신(GXV)이 키토산과 코아세르베이트화되어 나노스피어로 제형된다. RSV 감염에 관한 마우스 모델에서, GXV의 비강 투여는 폐 및 비장특이 단핵세포에서 RSV-특이적 항체, 비강 IgA 항체, 세포독성 T 림프구, 및 IFN-γ의 현저한 유도를 가져온다. GXV의 일회 투여가 바이러스가의 확실한 감소를 유도한다.

Description

ＲＳＶ 유전자 발현 백신{RSV GENE EXPRESSION VACCINE}
호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytical virus: RSV)는 유아 및 소아의 바이러스성 하기도(lower respiratory tract) 감염의 가장 흔한 원인으로서, 세계적으로 약 400만 소아들에게 감염되어 미국에서만 연간 100,000명의 환자 및 4,500명의 사망자를 발생시키고 있다. RSV 감염은 소아들의 세기관지염의 회귀성 발작, 기관지 폐쇄 및 천식의 악화와 관련이 있다. RSV 감염에 의한 세기관지염의 발병율은 증가하고 있는 상태이다. RSV 감염에 대해 적용가능한 유효한 예방법은 없는 상태이다. 포르말린-불활성화 RSV 백신을 이용한 백신을 개발하기 위한 시도들이 있어 왔으나 이는 실패했을 뿐만 아니라 이후의 RSV 감염이 일어났을 때, 질병을 악화시켰다(Chanock 등, Serious respiratory tract disease caused by respiratory syncytical virus: prospects for improved therapy and immunization,Prediatrics 1992; 90-137-143). 더욱이 RSV에 대한 치료법의 개발은 짧은 잠복기로 인해 제한되어 왔다. 따라서 RSV에 대한 치료방법의 개발은 세계적으로 매우 중요한 문제로 대두되어 왔다.
F 및 G 항원이 RSV에 대한 중화 항체의 대다수를 유도함에도 불구하고, RSV 항원의 대부분은 인간 및 마우스 내에서 면역원성이다(Connors, et al, Respiratory syncytial virus (RSV) F, G, M2(22K), and N proteins each induce resistance to RSV challenge, but resistance induced by M2 and N proteins is relatively short-lived,J Virol 65. 1634, 1991; Wyatt etal, Priming and boosting immunity to respiratory syncytial virus by recombinant replication-defective vaccinia virus MVA.Vaccine 18 : 392, 1999). 인간의 CLT 레퍼토리의 분석은 N, SH, F, M, M2 및 NS2 단백질이 강한 표적 항원임을 보여준다. 이와 유사하게, BALB/c 마우스에서, F,N, 및 특별히 M2 단백질은 CTL 활성의 주요 표적 항원인 것으로 나타났다(Domachowske 등의 Respiratory syncytial virus infection: immune response, immunopathogenesis, and treatment,Clin Microbiol Rev12 : 298, 1999). 바이러스에 특이적인 세포독성 T 림프구는 RSV 감염의 면역매개제거(clearance)의 가장 중요한 역할을 한다. 혈청 및 점막의 항체 및 세포독성 T 림프구(CTLs)가 제한된 MHC-classⅠ은 RSV 감염에 대한 보호를 매개한다(Brandenburg 등의 Pathogenesis of RSV lower respiratory tract infection: implications for vaccine development.Vaccine 19 : 2769, 2001). 이미, 동물 및 인간 모델에서, 중화된 혈청 항체의 수동적인 투여는 RSV 질병의 위험을 감소시키는 것으로 나타났다(Groothuis 등의 Use of intravenous gammaglobulin to passively immunize high-risk children against respiratory syncytial virus: safety andpharmacokinetics. The RSVIG Study Group.Antimicrob Agents Chemother.1991 Jul ; 35 (7) : 1469-73; Hemming 등의 Hyperimmune globulins in prevention and treatment of respiratory syncytial virus infections.Clin Microbiol Rev. 1995 Jan ; 8 (1) : 22-33. Review).
최근까지 연구되어 온 백신들은 RSV-F, G 및/또는 -M2 단백질로 구성되는 서브유닛, 펩타이드, 또는 DNA 백신을 포함한다. 마우스에서 RSV-F 또는 G 단백질을 코딩하는 pDNA의 점막 내 주입은 효과가 있었다(Li 등의 Protection against respiratory syncytial virus infection by DNA immunization,J Exp Med 1998 Aug 17 ; 188 (4) : 681-8; Li 등의 Plasmid DNA encoding the respiratory syncytial virus G protein is a promising vaccine candidate,Virology. 2000 Mar30 ; 269 (1) : 54-65). 코튼 마우스 모델에서, F-G 백신은 중화 항체가를 유도하였고, 이것은 살아있는 RSV와 비교할 때 최대값보다 10배 내지 100배 낮은 것이다(Prince 등의 Efficacy and safety studies of a recombinant chimeric respiratory syncytial virus FG glycoprotein vaccine in cotton rats.J Virol. 2000 Nov ; 74 (22) : 10287-92). 세포성 및 체액성 면역 반응을 유도하는 항원을 발현하는 플라스미드 DNA(pDNA)를 이용한 생체 내 면역화는 다른 백신들과 비교하여 많은 장점을 갖는 것으로 말해지고 있다. 그러나, 단위 체중당 사용될 수 있는 DNA의 양 및 선택된 경로에 따라 이러한 백신을 인간에게 적용하는 것이 부적절할 수도 있다 (Guy 등의 Design, characterization andpreclinical efficacy of a cationiclipid adjuvant for influenza split vaccine,Vaccine 19 : 1794, 2001).
현재, RSV 감염 위험이 매우 높은 유아에게 사용가능한 옵션의 하나는 사람에게 적용가능하도록 된 RSV-F 항원에 대한 항체(humanized antibody)를 이용하여 한달 간격으로 수동 면역화하는 것이다. 다소 불편하고, 비용이 들며 부분적으로만 효과가 있음에도 불구하고, RSV에 대한 안전하고 유효한 백신이 사용가능하지 않기 때문에, 수동 면역이 유일한 옵션으로 고려되고 있다.
따라서 RSV에 대한 축적된 점막 면역을 가능하게 하는 DNA 백신이 필요하다. 2 내지 6개월된 유아가 가장 RSV에 감염되기 쉬우므로, 1개월된 유아에게 백신접종을 하는 것이 바람직하며, 이러한 국소 및 전신 면역 시스템이 미성숙한 유아에게는 국소 면역을 생성시키는 점막 백신이 적합하므로, 점막 RSV 백신이 바람직한 것으로 고려된다.
[발명의 요약]
본 발명은 키토산 나노스피어의, 대응 RSV를 코딩하는 플라스미드 DNA의 칵테일(cocktail)을 포함하는 유전자 발현 백신(GXV)을 제공한다. 제 1의 구현예에서, 칵테일은 F, G 및 최소한 M, M2, SH, NS1, NS2, N 및 P RSV 항원 중의 하나를 포함하는 조합으로 구성된다. 다른 구현예에서, 칵테일은 M2 및 최소한 F, G, M, SH, NS1, NS2, N 및 P RSV 항원 중의 하나를 포함하는 조합으로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 칵테일은 F, G, M2 및 M, SH, NS1, NS2, N 및 P RSV 항원 중 하나를 포함하는 조합으로 구성된다. GXV는 RSV에 대하여 안전하고 효과적이고, RSV감염에 의해 유발된 폐 염증을 상당히 약화시키며, 비강 또는 경구로 투여될 수 있다. GXV의 정확한 세포 및 분자 메커니즘이 연구되지 않았음에도 불구하고, 이론에 의해 제한없이, 면역원성 항원 및/또는 키토산을 이용한 콘쥬게이션의 조합은 효과를 나타낸다.
제 1 구현예에 따르면, 본 발명은 RSV 감염에 대한 예방성 점막 백신을 제공한다.
다른 구현예에서, 비강 또는 경구를 통한 전달을 위해 키토산 나노스피어형으로 제형된 RSV 유전자 발현 라이브러리를 이용하여 백신이 개발된다.
다른 구현예에서, 백신의 투여는 기도 네이키드 DNA응(airway hyper-reactivity)을 유도하지 않는다.
다른 구현예에서, 두 개의 구별되는 부분: 즉, 백신 효능을 갖는 pDNA 칵테일 및 보조 활성을 갖는 키토산을 포함하는 유전자 발현 백신이 제공된다.
다른 구현예에서, 유전자 발현 백신은 살아있는 바이러스 감염에 의해 유도된 면역성과 동일한 정도의 면역성을 유도하는 백신을 제공한다.
다른 구현예에서 백신은 약 25㎍의 칵테일/마우스의 일회량에서 효과가 있다.
다른 구현예에서 백신은 다수의 항원, 바람직하게는 9개 항원에 대한 항체를 유도한다.
다른 구현예에서, GXV 백신을 제조하는 방법이 개시되는데 여기서 L항원을 제외한 모든 RSV 항원에 대한 cDNA가 pVAX 플라스미드로 클로닝되고 칵테일은 키토산과 코아세르베이트되어 나노스피어로 제형된다.
다른 구현예에서, 백신은 특이적인 IgG 가, 비강 IgA 가에서 증가를 유도하고, 비장 조직뿐만 아니라 폐에서 IFN-γ 생산을 증가시킨다.
이하의 설명을 위한 도면을 참조하여 상세한 설명으로부터 다른 목적 및 이점이 본 기술분야의 숙련된 당업자에게 명백해질 것이다.
본 발명은 일반적으로 유전자 발현 백신에 관계한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 비강내로 또는 구강으로 투여될 수 있는 유전자 발현 백신에 관계된다.
도1(A-B).도 1A는 비강 GXV 백신접종에 따른 RSV cDNA의 발현을 보여준다; 레인: Bp, 마커 및 NS1, NS2, M, SH, F, M2, N, G 및 P로 표시된 레인은 RSV cDNA들에 대응되는 PCR에 관한 것이다. 도 1B는 비강내 GXV 백신접종 후의 RSV cDNA의 발현을 보여주는 면역블로팅 분석을 나타낸 것이다. 레인 Kd는 분자량 마커, 레인 1 및 2는 RSV가 감염되고 감염되지 않은 HEp-2 세포 추출물이다.
도 2(A-C).도 2A는 PBS, 네이키드 DNA 및 GXV를 비강 투여한 마우스의 폐로부터 RSV의 플라크 형성 단위를 보여준다. 도 2B는 PBS, 네이키드 DNA 및 GXV를 비강 투여한 마우스의 폐로부터 얻어진 RSV의 항원 로드를 ELISA로 측정한 결과를 보여준다. 도 2C는 전신 체적변동기록기를 이용하여 PBS, 네이키드 DNA 및 GXV를 비강 투여한 마우스의 메타콜린 반응의 측정을 보여준다. 메타콜린 반응은 휴지기(pause)(Penh)가 상승된 백분율 기준선(percent baseline)으로 측정하였다.
도 3(A-C).도 3A는 GXV 백신접종 이후의 항-RSV 항체 반응을 보여준다. BALB/c 마우스는 GXV 백신(25㎍), 네이키드 DNA(25㎍) 또는 PBS가 비강으로 투여된것이다. 백신접종 14일 및 21일 후, 혈청이 마우스로부터 수집되었고 ELISA를 이용하여 항-RSV 항체가를 측정하였다. 도 3B는 백신접종 후의 RSV 중화 항체가의 결정을 보여준다. RSV 현탁액은 다양한 혈청 희석비율의 혈청(0.01, 0.1 및 1)과 배양되고 중화가 수행되었다. 도 3C는 비강 세액(nasal washings)로부터 백신접종 후의 IgA 항체 반응을 보여준다. 비강 세액(i.n.)을 백신접종 후 14일 및 21일에 동물들로부터 수집하여 전체 IgA 항체 농도를 ELISA로 측정하였다.
도4(A-B).도 4A는 GXV 백신접종에 의해 유도된 RSV 특이적 CTLs의 특징을 보여준다. 마우스는 25㎍의 GXV, 25㎍의 네이키드 DNA, 또는 25㎍의 PBS를 이용하여 백신접종한다. 3주 후의 면역성 비장특이 단핵세포(splenocyte)는 영속적으로 RSV 감염된 섬유아세포주 BCH4를 이용하여 자극된다. CTL 활성은 비감염성 BC 세포 및 RSV 감염성 BCH4 섬유아세포를 표적으로 이용한 표준 4-h51Cr-방출 분석에서 평가되었다. 도 4B는 BAL 유체 내어서의 IFN-γ 농도의 측정을 보여준다. 상기에서 백신접종된 마우스 군은 16일째 RSV에 의해 감염되었다. 21일째 이러한 마우스들에 대해 기관지폐포세척(BAL:bronchoalveolar lavage)을 수행하고 ELISA로 IFN-γ 농도를 측정한다. 도 4C는 비장특이 단핵세포 배지에서 IFN-γ 농도의 결정을 보여준다. 상기에서 백신접종된 마우스 군은 16일째 RSV 에 의해 감염된다. 마우스를 21일째 죽이고, 이들의 비장특이 단핵세포를 항-CD3 항체 코팅된 플레이트 상에서 생체 외 배양하고 배지 상등액의 IFN-γ 농도를 ELISA를 이용하여 측정한다.
도 5.도 5는 마우스가 백신접종되고 상기보다 이른시기 및 16일째 RSV를 감염시킨 것을 보여준다. 4일 후, 이 마우스들을 죽이고, 폐를 꺼내어 조직 절편을 헤마톡실린 및 에오신(HE)으로 염색한다. GXV 백신접종된 마우스는 대조군에 비하여 상피세포 손상 및 세포 침윤이 적은 것으로 나타난다.
도 6(A-B).도 6A는 비강내 RGCN 백신접종에 따른 RSV cDNA의 발현을 보여준다. BALB/c 마우스는 플라스미드 벡터 pVAX(GVX) 내에서 클론된 RSV 항원들의 칵테일이 비강으로 투여된 것이다. 각 마우스는 전체 25㎍의 칵테일 DNA를 흡입한다. 동물들을 최종 비강 투여 후 3일 째 죽이고 전체 폐 RNA로부터 RT-PCR을 수행한다. 7개의 RSV mRNA들의 발현이 나타난다. 도 6B는 GXV 단독은 기도 네이키드 DNA응을 유도하지 않는 것을 보여준다. BALB/c 마우스에 RCGN 백신을 경구로 투여하고 3일 후 기도 네이키드 DNA응을 전신 체적기록변동기를 이용하여 측정한다. 네이키드 DNA 또는 PBS 단독(대조군)으로 받은 경우와 비교할 때 GXV를 받은 동물들은 메타콜린 시험감염에 대한 유사한 반응을 나타낸다.
도 7(A-B).도 7A는 gRGCN 백신접종 이후의 항-RSV 항체 반응을 보여준다. BALB/c 마우스에 경구로 GXV(25㎍), 네이키드 DNA(25㎍) 단독, 또는 PBS가 투여된다. 백신접종 14일 및 21일에 동물로부터 혈청이 수집되고 ELISA를 이용하여 항-RSV 항체가가 측정된다. RGCN 백신에 의해 백신접종된 동물은 대조군의 항체가보다 상당히 높은 값을 나타낸다. 도7B는 RGCN 백신접종 후의 IgA 항체의 반응을 보여준다. BALB/c 마우스에 비강 또는 경구로 RGCN 백신(25㎍), 네이키드 DNA(25㎍) 단독 또는 PBS를 투여하였다. 변 펠렛(fecal pellet; 경구) 및 비강 세액(비강)을 백신접종 14일 및 21일째 동물로부터 수집하여 ELISA를 이용하여 전체 IgA 항체가를 측정한다.
도 8(A-B).도 8A는 경구 및 비강 백신접종된 마우스로부터 비장에서의 IFN-γ의 발현을 보여준다. 마우스에 경구 또는 비강으로 RGCN 백신접종을 하고 16일째 RSV를 감염시킨다. 21일째 동물을 죽이고 그 비장을 생체 외에서 배양하거나 BAL을 수행한다. α-CD3 자극된 비장 세포로부터의 발현; 경구로 백신접종된 동물이 비강으로 접종된 군보다 더 많은 IFN-γ를 생산한다. 도 8B는 경구 및 비강 백신접종된 마우스로부터 BAL 유체 내에서의 IFN-γ의 발현을 보여준다. 비강으로 백신접종된 마우스는 경구로 접종된 군보다 그 BAL 유체 내에서 더 많은 IFN-γ를 생산한다.
도 9.도 9는 경구용 GXV가 마우스의 폐에서 폐 염증을 감소시키는 것을 보여준다. BALB/c 마우스는 GXV 또는 네이키드 DNA(25㎍ 전체)를 경구로 투여한 것이다. 동물들을 16일째 RSV에 감염시키고, 4일(21일째) 뒤 죽인다. 폐를 제거하고 조직 절편을 헤마토실린 및 에오신(HE)으로 염색한다. 대표 현미경 사진을 나타내었다. GXV를 받은 마우스는 대조군에 비하여 상피세포 손상 및 사이질 공간(interstitial space) 농후화가 감소됨을 보여준다.
RSV 유전자 발현 라이브러리는 pVAX 플라스미드에서 구축되고 라이브러리는 키토산과 코아세르베이트 되어 나노스피어를 형성하는데, 본원에서 이를 RGCN 백신이라고 한다.
본 발명은 대응 RSV 항원을 코딩하는 플라스미드 DNA들의 칵테일을 포함하는 유전자 발현 백신(GXV)을 제공한다. 칵테일은 F, G, M, M2, SH, NS1, NS2, N 및 P RSV 항원의 조합을 포함한다. 칵테일은 F, G 및, M, M2, SH, NS1, NS2, N 및 P RSV 항원 중 최소한 하나를 포함하는 조합으로 구성될 수 있다. 대안으로, 칵테일은 M2 및, F, G, M, SH, NS1, NS2, N 및 P RSV 항원 중 최소한 하나를 포함한 조합으로 구성될 수 있다. 또한 대안으로 칵테일은 F, G, M2 및, M, SH, NS1, NS2, N 및 P RSV 항원 중 최소한 하나를 포함하는 조합으로 구성될 수 있다. GXV는 생분해가능하고 인체친화적이며 임의의 부작용 없이 백신의 점막 흡착을 상승시킬 수 있는 양이온 고분자인 키토산과 함께 나노스피어의 제형으로 형성된다.
키토산은 매트릭스 내의 혈청 핵산분해효소로부터의 분해를 방지시켜 주기 때문에 DNA의 생체적합성을 향상시킬 수 있고, 따라서 점막 유전자 전달 시스템으로서 큰 가능성을 갖는다. 또한 키토산은 항응고 활성, 상처 치료 효능 및 면역자극 활성을 포함한 많은 유리한 효과를 갖고 있으며 점막 및 기관지-관련 림프 조직의 면역성을 조절할 수 있다. 키토산 나노입자 형의 GXV는, 네이키드 DNA 대조군과 비교하여 폐에서 특이적 중화 IgG 항체가, 및 비강 IgA 가 및 IFN-γ 농도를 현저하게 유도한다. 키토산은 GXV의 면역 효능을 증가시킨다. 그러나, 항바이러스 면역성에 대한 키토산의 상승작용의 기초가 되는 상세한 메카니즘은 밝혀져야 할 것으로 남아 있다. GXV는 매우 효과적일 뿐만 아니라 안전한데, 이는 백신접종되지 않은 감염 집단에 비해 백신접종된 집단에서 폐 염증이 상당히 감소하고,백신접종된 마우스와 접종되지 않은 마우스 사이에 메타콜린 반응에 변화가 없는 것으로 볼 때 입증된다. 이 결과는 질병을 악화시켰던 이전의 포르말린 비활성 백신의 실패의 관점에서 볼때 매우 적합하다.
체액성 및 세포성 면역을 유도하는 백신이 연구되고 있다. GXV는 네이키드 DNA 백신접종된 군 및 백신접종되지 않은 대조군과 비교하여 중화 혈청 및 점막 IgA 항체의 농도를 현저하게 상승시킨다. 분비된 IgA 항체가 점막 경로를 통해 들어간 병원균에 대한 보호를 제공함에도 불구하고, RSV에 대한 분비된 IgA의 보조적인 역할은 거의 이해되지 못하고 있다. 이론에 구애받지 않을 때 RSV가 상기도 및 하기도 양자에 영향을 주는 역할을 하는 세포내 점막 병원균인 것이 당연하기 때문에, 점막 IgA는 RSV의 점막으로의 진입을 배제 및/또는 RSV의 세포-세포 융합성 분포(syncytial spread)를 저해함으로써, 심각한 RSV 질병에 대한 보호를 제공할 가능성이 크다.
GXV는 네이키드 DNA 및 백신접종 하지 않은 대조군과 비교하여 상당히 강한 CTL 반응을 발생시킨다. 다른 실험용 백신과 마찬가지로 이 결과도 바이러스 제거에 있어서 백신-유도 CTLs의 역할을 명백히 뒷받침한다. 여러 연구들이 세포변성(cytopathic) 바이러스에 대한 CTL의 예방효과가 이들의 IFN-γ와 같은 사이토킨의 생산에 의존한다는 것을 보여준다. GXV는 백신접종 후의 IFN-γ의 생산을 현저하게 상승시키고 이것은 RSV의 감염에 대항하는데 유리할 수 있다. IFN-γ는 직접적인 항바이러스 효과를 갖고, 특별히 마우스 및 인간 모델에서 RSV 감염의 조절에 있어서 결정적인 역할을 하는 자연 세포독성(natural killer: NK) 세포 및CD8+ 세포독성 T 림포사이트(CTL)의 세포용해 활성을 자극하는데 특히 중요하다.
GXV의 면역조절 활성뿐만 아니라, GXV에 의해 유도된 염증 가능성은 폐 절편의 면역조직학적 분석에 의해 평가될 수 있다. 상피손상, 및 관부위, 기관지부위 및 사이질 부위의 침윤 세포의 반정량 분석(semi-quantitative analysis)은 GXV가 네이키드 DNA 접종 마우스 및 백신접종되지 않은 마우스와 비교하여 세포 침윤 및 상피 손상이 현저하게 감소하였음을 보여준다. 네이키드 DNA 및 GXV 접종 마우스 사이에서 관찰되는 현저한 차이의 원인은 밝혀지지 않았다. 이론적인 뒷받침은 없지만 GXV는 네이키드 DNA와 비교하여, 점막 시스템의 천연 요소로서 침윤성이 적기 때문인 것으로 생각된다. 또한 상피 세포에 의한 감소된 흡수로 인해 상피 점막하부에서 네이키드 DNA가 축적되어 염증 반응을 증가시킬 가능성도 있다.
종합적으로, 본 발명자들의 데이타는 GXV가 RSV에 대한 신규한 백신 개념을나타내고 단지 일회량 1mg/kg체중에서 1차 감염시의 최고값의 2 순위(100배)까지 바이러스가를 감소시킬 수 있다. 이러한 백신의 효과에 대한 면역 메카니즘은 IgG 혈청 및 점막 IgA 항체의 높은 농도, 효과적인 CTL 반응의 발생, 및 항 바이러스 활성을 갖는 IFN-γ의 폐 특이적 생산의 향상을 포함한다. 단일 투여로서도 백신 GXV가 매우 효과적이기 때문에, 투여량 증가 및 1차 효능 촉진제는 그 효과를 보다 향상시킬 수 있음을 생각할 수 있다. 뿐만 아니라 GXV는 페렴을 현저하게 감소시키고 기도 네이키드 DNA응을 변형시키지 않으므로 안전한 백신이 될 수 있다.
재료 및 방법
동물
6주된 암컷 BALB/c 마우스는 Jackson laboratory(Bar Harbor, ME)로부터 구입되고 동물 센터에서 무균상태로 보존된다. 모든 절차는 University South Florida 및 James A Haley VA Medical Center Committee on Animal Research에 의해 검수되었고 승인되었다.
유전자 구조물, 키토산 나노스피어의 생산 및 유전자 전달
RSV cDNA는 RSV-감염 마우스의 폐 cDNA 라이브러리로부터 벤트 폴리머라제(Vent polymerase; New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭되고 포유동물 발현 벡터 pVAX(Invitrogen, San Diego, CA)로 클론되었다. 결과물인 플라스미드는 이. 콜라이 DH5α 세포에서 증식되었다. 제조자의 설명에 따라서 퀴아겐(Qiagen) 키트(Qiagen, Chatsworth, CA)를 이용하여 대량의 플라스미드가 제조되었다. 이것은 최소한의 내독소 오염(endotoxin contamination)을 갖는 충분히 순수한 DNA를 생산한다. pDNA는 RSV cDNAs의 칵테일을 만들기 위해 혼합되어진다. DNA 키토산 나노스피어가 『Roy, K. 등의 1999, Oral gene delivery with chitosan-DNA nanoparticles generates immunologic protection in a murine model of peanut allegy,Nat Med 5 : 387』에 개시된 바에 따라 제조된다. 비강용 백신의 경우, 마우스를 가볍게 마취한 상태에서 칵테일 DNA 키토산 나노스피어를 비강으로 3회 접종한다. 각 마우스들은 키토산 나노스피어 내에서 전체 DNA가 혼합된 총 25㎍을 접종받는다. 대조군 마우스는 PBS 및 네이키드 DNA를 받는다.
백신의 투여
마우스들은 약간 마취된 상태에서 GXV (25㎍의 전체DNA/mouse)를 비강으로 투여받는다. 대조군 마우스는 동일한 양의 PBS 또는 네이키드 DNA를 투여받는다. 백신접종 후 16일째, 1x106pfu의 인간 RSV A2 균주(ATCC, Rockville,MD) 50㎕ 부피로 마우스를 비강을 통해 감염시킨다. 후감염(p.i.) 5일째 마우스를 죽이고, RT-PCR, 조직병리학 연구, 사이토킨 및 바이러스 플라크 분석을 위해 이들의 폐 및 비장을 방부처리하여 수집한다. 혈청을 얻기 위해 후 백신접종 14일 및 21일째 마우스에서 채혈한다.
동물의 바이러스 감염 및 조직 및 혈청 수집
최종 백신접종 16일째, 1x106pfu의 인간 RSV A2 균주(ATCC, Rockville, MD) 50㎕ 부피로 마우스를 비강을 통해 감염시킨다. 후감염(p.i.) 5일째 마우스를 죽이고 폐 및 비장을 방부처리하여 수집한다. RT-PCR, 조직병리학 연구, 사이토킨 및 바이러스 플라크 분석을 위한 것이다. 최종 백신접종 후 14일 및 21일째 마우스로부터 혈청을 수집한다.
폐 내 RSV가 및 항원의 측량
마우스의 폐에서의 RSV가를 측정하기 위해 먼저 전체 폐의 무게를 달고 10% FBS로 보충된 EMEM 배지에 즉시 넣는다. 폐를 균질화시킨 후, 10분간 4℃에서 10,000 RPM으로 원심분리한다. 깨끗한 상등액을 수집한 후 0.45㎛ 메틸셀룰로오즈 필터(Gelman Sciences, Ann Arbor, MI)를 통해 여과한다. 시료를 플라크 분석에 사용하기 위해 연속적으로 희석한다. 24-웰 플레이트에서 커버 슬립상에서 성장한 Hep-2 세포(60-70% 유착)들은 다른 희석비율의 폐 균질액으로 도포되고 1000 RPM으로 1시간 동안 원심분리된다. 이것은 바이러스가 세포로 빠르게 흡수되도록 한다. 세포들은 24시간 동안 37℃에서 CO2인큐베이터 내에서 배양된다. 배양에 이어, 조직 배양 배지를 흡출기로 빨아들이고, 세포를 PBS로 2회 세정한다. 세포들을 냉장 무수 알코올로 고정하고 건조한 후 FITC-표지된 항-RSV 폴리클로날 항체(Light Diagnostics, Tennecula, CA)와 함께 습윤 챔버에서 30 동안 배양한다. 세정 버퍼(PBST, PBS+0.05% Tween-20, pH 7.4)로 세포를 2회 세정하고 플루오로마운트 G(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)를 이용하여 슬라이드에 커버 슬립을 덮는다. RSV 플라크가 형광 현미경 하에서 계수된다.
RNA 추출 및 RT-PCR 분석
전체 세포 RNA를 제조자의 지시에 따라 TRIZOL 시약(Life Technologies, Gaithersburg,MD)을 이용하여 폐 조직으로부터 분리해낸다. 1ml의 Trizol 제재를50-100 mg의 폐 조직에 첨가하고 균질화한다. 폐 균질물을 피펫팅하여 현탁하고 라이시스를 위해 상온에서 5분간 방치한다. 클로로포름(200㎕)을 각 튜브에 첨가하고 거칠게 혼합한다. 5분 후, 세포를 15분 동안 15-20℃에서 12,000 rpm으로 원심분리한다. 깨끗한 수용액상의 상등액을 새 튜브에 옮기고 같은 부피의 이소프로판올을 첨가하여 잘 혼합한 후 15분간 15-20℃에서 12,000 rpm으로 원심분리한다. RNA 펠렛을 70% 에탄올로 세정하고 공기로 건조시킨 후 디에틸 피르카보네이트 처리된 물(diethyl-pyrcarbonate-treated water)에 용해시킨다. 『Behera, A. K. 등의 2001, Blocking Intercellular Adhesion Molecule-1 on Human Epithelial Cells DecreasesRespiratory Syncytial Virus Infection, Biochem Biophys Res Comm 280: 188』에 개시된 바에 따라서 다른 RSV 유전자들에 대해 RT-PCR을 수행한다.
폐 기능
백신접종된 군 및 대조군에서의 폐기능을 평가하기 위해, 마우스를 GXV로 백신접종한다. 3일 후, 기도 반응(즉, 기관지 수축)은 Matsuo K. 등의 『2000, Recurrent respiratory syncytial virus infection in allergen sensitized mice lead to persistent airway inflammation and hyperresponsiveness,J. Iramuraol 164: 6583』에 따라 전신 체적변동기록기(Buxco Electronics, Troy, NY)를 이용하여 의식있는 구속되지 않은 마우스에서 비침습적으로(non-invasively) 평가된다. 이 시스템을 이용하여, 정상 호흡 순환 동안 일어나는 부피 변화를 동물이 들어가있는 챔버와 호흡 비교 챔버 사이의 압력 차이로서 기록한다. 그 결과 신호는 분당 호흡수(respiratory frequency), 분당 호흡량(minute volume), 일회 호흡량(tidal volume) 및 상승된 휴지기(pause)(Penh)를 계산하는데 사용된다. Penh은 기관지 수축의 단위로 사용되고 공식: Penh = 휴지기(pause) x 최고 날숨 압력/최고 들숨 압력(peak expiratorypressure/peak inspiratory pressure)으로부터 계산되는데, 여기서 휴지기(pause)란 전체 날숨 시간에 비교한 일회 호흡량의 최종 30%를 내뱉는데 필요한 시간의 비율을 의미한다. 마우스를 체적변동기록기 안에 넣고 챔버는 10분 동안 평형상태를 유지시킨다. 이들은 에어로졸화된 PBS에 노출시킨 후(기준선을 구축하기 위한 것임.) 증가된 양(6, 12.5, 25 and 50 mg/ml)의 메타콜린(Sigma Chemicals, St. Louis, MO)을 투여한다. 메타콜린의 각 투여량은 5분 동안 에어로졸화되고 그 후 5분 동안 순환 측정이 기록되었다. 기록 시간 동안 각 변수의 평균은 매 30숨(breaths, 또는 처음 일어날 때마다 30초)으로부터 유도된 것이다. 각 투여 후의 최대 Penh 값은 기관지 수축의 범위를 측정하기 위해 사용된다.
기관지 폐포 세척(bronchoalveolar lavage, BAL), 비장 세포 배양 및 IFN-γ 분석
백신을 접종한 마우스 및 대조군 마우스들에 대해 기관지 폐포 세척을 행하였다. 과량의 펜토바르비탈 (Nembutal Abbot Laboratories, North Chicago, IL)(0.6 g/㎏, i.p.)을 주사하여 감염시킨 후 제 5일에 마우스들을 치사시키고나서 가슴을 절개하였다. 폐의 혈관상(vascular bed)을 2 내지 3 ml의 차가운 식염수로 씻어내었다. 기관을 노출시키고 투베르쿨린 시린지에 연결된 26G 바늘을 도입하였다. 이어서 폐를 0.5 ml의 PBS로 3회 세척하고 폐포 세척액 (BALF)을 풀링하였다. 회수된 BAL 액의 부피는 주입된 PBS의 75%와 85% 사이의 범위내이었다. 대조군 그룹과 실험 그룹 사이에 회수된 BAL 액의 부피 면에서는 통계적으로 유의할만한 차이가 없었다. BAL을 원심분리하여 상청액을 회수하고 싸이토카인에 대해서 분석할 때까지 -70℃에서 보관하였다.
비장 세포 배양의 경우, BALB/c 마우스의 비장들로부터 단일-세포 현탁액(single-cell suspensions)을 준비하여 항-CD3 항체들(1㎍/ml; 클론 17A2, PharMingen, San Diego, CA)로 코팅된 웰 내에서 배양하였다. ELISA 키트 (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 BALF 및 24시간 배양된 상청액에 대해 INF-γ를 분석하였다.
총 IgA 항체의 분석
Matsuo K. 등 2000, Induction of innate immunity by nasal influenza vaccine administrated in combination with an adjuvant (cholera toxin),Vaccine, 18: 2713에 기술된 대로 코 세액(nasal wash)으로부터 IgA를 회수하였다. 주사 바늘을 코인두(nasopharynx)의 뒤쪽 구멍(posterior opening)안으로 삽입하여 0.1%의 소혈청알부민(BSA)을 함유하는 총 1 ml의 PBS를 그 구멍에 3회 주입하였다. 세포 파편을 제거한 후 항체 분석에 이용하기 위해 코 세액을 원심분리하였다. 총 IgA 항체 분석을 위해, ELISA 플레이트를 200 ng/웰의 항-마우스 IgA 항체(02271D, Pharmingen, San Diego, CA)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 3회 세정 후, 시료를 가하여 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 한 번 더 세정하고 나서, 바이오틴화된 항-마우스 IgA (556978, Pharmingen, San Diego, CA) 항체를 가하여 플레이트를 2시간 더 인큐베이션하였다. 3회 세정후, 아비딘 퍼옥시다제 컨쥬게이트 (avidin peroxidase conjugate, 1:10,000, Sigma Chemicals, St. Louis, MO)를 가하여 플레이트를 1시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 기질 테트라메틸 벤즈이딘 (Pharmingen, San Diego, CA)을 첨가하여 발색시키고 자동-ELISA 리더 (automated-ELISA leader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
항-RSV 항체 분석 (Anti-RSV Antibody Assay)
항 RSV 항체가 (anti RSV antibody titers)를 정량하기 위해서, ELISA 플레이트를 정제된 RSV (2000 ng/웰)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 세정하고 블로킹 버퍼 (PBS내의 1% BSA, pH 7.4)로 37℃에서 한 시간 동안 블로킹하였다. 플레이트에 시료를 가하여 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 한 번 세정하고 항-마우스 IgG 과산화효소 컨쥬게이트를 1:10,000 (Boehringer Manheim, Germany) 로 희석하여 가하여 한 시간 동안 인큐베이션하였다. 3회 세정 후, 기질을 가하고 20-30분간 방치하여 발색시켰다. 자동-ELISA 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
바이러스 중화 분석 (Virus Neutralization Assay)
제 14일에 얻은 혈청의 다양한 희석액들을 100㎕의 RSV 접종물과 혼합하여 37℃에서 한 시간 동안 인큐베이션하였다. 이것을 이용하여 48-웰 배양 플레이트에서 배양되고 있는 HEp-2 배양물을 감염시켰다. RSV 역가를 측정하였다.
면역블로팅 (Immunoblotting)
30 마이크로그램의 RSV 감염된 HEp-2 배양 세포 추출물을 4-20% 경사 SDS-PAGE 상에서 분획화하여 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 블로킹 버퍼 (5% w/v 무지방-분유/TBS-0.1% Tween-20, pH 7.6)로 블로킹하고 다양한 그룹의 백신접종된 마우스들로부터 수득한 혈청의 1:250 희석액과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 막을 세정 버퍼 (TBS-0.1% Tween-20, pH 7.6)로 4회 세정하고 항-마우스 IgG 과산화효소 컨쥬게이트와 함께 실온에서 한 시간 동안 인큐베이션하였다. 4회 추가로 세정하고나서, 제조사 (Amerisham Life Sciences, Arlington Heights, IL)의 지시에 따라 ECL 화학발광 검출 시약 (0.15 ml/㎠)을 가하여 블롯을 현상하였다.
기도 염증에 대한 조직학 및 점수평가 (Histology and Scoring for Airway Inflammation)
PBS를 기관내주사하여 폐들을 팽창시킨 후, 폐를 팽창된 상태로 유지하기 위하여 10% 중성 완충 포르말린 용액 (Sigma Chemicals, St. Louis, MO)을 기관내주사하였다. 폐들을 한 시간 후 80 에탄올로 옮기고나서 파라핀에 함몰시켰다.절편들을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 폐포공간, 기관지혈관 다발, 및 사이질(interstitium)을 포함하여 폐 절편들내의 염증성 세포의 반-정량 분석 (semi-quantitative evaluation)을 행하였다. 염증성 침윤물을 위치, 두께 및 세포 조성에 대해 형태학적으로 분석하였다.
CTL 연구 (CTL Studies )
PBS, GXV, 및 네이키드 DNA (naked DNA)로 면역된 마우스들로부터의 비세포들(splenocyte) (2.5×106세포/mL)을 10 U/mL IL-2 및 2.5 × 106세포/ml의 RSV-감염된 미토마이신 (Sigma, St. Louis, MO) 처리된 섬유아세포 (BCH4 세포들)를 포함하는 완전한 RPMI 내에서 인큐베이션하였다. 제 6일에 다양한 수의 이펙터 세포들을51Cr-표지된 동계 (syngeneic) 섬유아세포 RSV-감염된 (BCH4) 또는 감염되지 않은 (BC) 표적 세포들 (1×104)에 첨가함으로써 배양물을 항원-특이적 세포용해 (antigen-specific lysis)에 대해서 시험하였다. 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션하고나서, 감마 카운터로51Cr을 카운트하기 위해 세포 상청액을 회수하였다. 특이적 세포용해 (specific lysis)의 백분율을 [(실험 cpm - 자연 cpm)/(총 cpm - 자연 cpm)]×100으로 계산하였다. 배지만에 의해 인큐베션되거나 2.5% Triton X-100 첨가한 후에 표적 세포로부터 자연 방출 (spontaneous release) 및 총 방출 (total release)을 측정하였다.
결과 (Results )
점막 GXV 백신접종의 안정성 및 효율성
플라스미드 칵테일을 코 안에 투여한 후 폐에서 RSV 항원의 발현을 측정하기위해서, RT-PCR에 의해 mRNA 레벨에서 모든 cDNA에 대해 발현을 측정하였다. NS1, NS2, M, SH, F, M2 및 N을 포함하는 9개의 플라스미드 중 7개에서 mRNA 발현이 검출가능하다. 모든 mRNA들은 예상된 크기이었다. 상이한 mRNA 들의 발현에는 질적인 차이가 있었다. 이러한 결과는 코안으로 투여된 플라스미드들이 폐 세포안에서 코드화된 항원을 용이하게 발현할 수 있다는 것을 나타낸다.
RSV 백신에 대한 주된 관심사는 염증의 향상이다. GXV 백신의 비강내 투여가 기도 과다반응을 유도하는지 시험하기 위해서, PBS 대조군 및 네이키드 플라스미드 칵테일 또는 GXV 백신에 의해 백시접종된 동물을 포함하는 세 그룹의 동물에서 Penh (percentage baseline enhanced pause)를 측정하였다. GXV 백신을 접종한 동물들은 네이키드 DNA 또는 PBS만을 투여한 동물들(대조군)에 비해서 메타콜린 시험 감염에 대해 유사한 반응을 시현하였다. 이들 결과는 GXV 백신이 기도 과다반응(airway hyperreactivity)을 유도하지 않는다는 것을 나타낸다.
백신의 효과를 평가하기 위해서, BALB/c 마우스들에게 GXV 백신 또는 네이키드 DNA를 비강내에 투여하였다. 제 16일 및 4일 후(제 21일)에 동물들을 RSV로 감염시켰다. 폐를 꺼내어 그들의 균등질을 RSV 플라크 테스트에 이용하였다. GXV 백신에 의해 백신접종된 마우스들은 PBS 대조군 및 네이키드 DNA 칵테일에 비해 RSV 역가 면에서 현저한 감소(2배 내지 3배)를 보였다. 폐의 바이러스가(viral titer)의 감소는 백신의 유효성 판단에 있어 절대적 표준(golden standard)으로 생각된다. 이러한 결과들은 키토산이 pDNA의 효능을 증가시켜 GXV 백신이 RSV 감염에 대한 효과적인 백신을 제공한다는 것을 가리킨다.
GXV은 RSV감염-유도 폐 염증을 감소시킨다.
폐 염증을 GXV 백신 및 네이키드 플라스미드 DNA 칵테일을 맞은 마우스 그룹들에서 조사하여 이를 식염수 처리한 대조군 마우스들과 비교하였다. GXV 백신을 투여한 마우스 그룹은 약간의 상피 손상을 보였고, 네이키드 플라스미드 예방접종된 마우스 및 대조군에 비해, 단핵세포(MNC) 및 다형핵세포PMNC; Polymorphonuclear cell)는 사이질 및 기관지혈관주위에 침윤되었다. PBS 그룹은 폐 조직학 측면에서 감염되지 않은 정상 마우스와 유사하였고 네이키드 DNA 예방접종은 상피의 손상을 시현한 반면에, GXV 백신접종된 마우스들은 정상 마우스와 대등한 폐 표현형 (lung phenotype)을 보였다. 이러한 결과들은 백신이 RSV 감염으로 유도된 폐 염증으로부터 마우스들을 보호한다는 것을 시사한다.
GXV 백신은 항-RSV 항체 반응을 유도한다.
GXV 백신의 점막 투여가 마우스에서 특이적인 항체를 유도하는지 알아 보기 위해서, 네이키드 플라스미드 칵테일 또는 GXV 백신이 투여된 마우스에서 RSV 특이적 항체가(RSV specific antibody titers)를 측정하였다. GXV 백신에 의해 백신접종된 동물들은 대조군에 비해서 상당히 높은 항체가를 시현하였다. 분비된 IgA 항체는 코가 RSV의 주된 침입 부위가 되는 경우에 점막 병원균에 대해 보호성인 것으로 생각된다. 이러한 클래스의 항체가 백신접종으로 인해서 변화하는지 확인하기 위해서 코 세액내의 총 IgA 농도를 측정하였다. GXV 백신에 의해 백신접종된 동물들은 대조군에 비해서 상당히 높은 IgA 항체가를 시현하였다. 이러한 결과들은 GXV 백신이 혈청 내에서 항체, 특히 IgA의 분비를 촉진시킨다는 것을 가리킨다.
GXV는 폐 및 비장에서 IFN-γ의 발현을 유도한다.
IFN-γ은 주된 항-바이러스 싸이토카인이므로 백신으로 유용하고, IFN-γ 발현을 유도해야만 한다. GXV 백신이 IFN-γ 발현을 유도하는지 확인하기 위해서, 마우스들에게 GXV 백신을 투여하고나서 제 16일에 RSV로 감염시키고, 동물을 치사시켜, 기관지 폐포 세척을 행하고 그들의 비세포들을 시험관 내에서 배양하였다. GXV 백신접종된 마우스들은 대조군 보다 그들의 BAL액에서 훨씬 많은 IFN-γ 생산을 시현하였다. 또한 GXV에 의해 백신접종된 마우스의 경우 항-CD3 항체로 자극된 배양된 비장 세포들은 대조군 보다 많은 IFN-γ 생산을 시현하였다.
통계적 분석
여러 쌍의 그룹들을 student'st-test에 의해 비교하였다. 그룹들간의 차이는 p<0.05에서 유의할만한 것으로 간주하였다. 모든 측정 값들은 평균± SD로 표현하였다. 데이터는표 1에 나타내었다.표 1에서 각각의 값은 하나의그룹(n=4) 내의 각 마우스로부터의 6개의 개개의 폐 절편들로부터의 5 필드의 평균± SD를 나타낸다. 마우스의 통계적 그룹은 백신접종된 마우스들이 PBS 대조군에 비해 항원 로드 (77%) 면에서 현저한 감소를 시현하였다는 것을 보여준다.도 2B. 이러한 결과들은 키토산이 pDNA 백신의 효능을 증가시켜 GXV 백신이 RSV 감염에 대한 효과적인 백신을 제공한다는 것을 가리킨다. GXV 백신의 비강내 투여가 기도 과다반응의 유도에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 전체 세 그룹의 동물들에 대해서 Penh (percentage baseline enhanced pause)를 측정하였다. GXV 백신을 접종한 동물들은 네이키드 DNA 또는 PBS만을 투여한 동물들(대조군)과 비교시 메타콜린 시험 감염에 대해 유사한 반응을 시현하였다.도 2C. 이들 결과는 GXV 처리가 그 자체로 기도 과다반응(airway hyperreactivity)을 유도하지 않는다는 것을 나타낸다.
혈청 및 점막 반응은 모두 효과적인 백신의 중요한 요소이다. 분비된 IgA 항체는 코가 RSV의 주된 침입 부위가 되는 경우에 점막 병원균에 대해 보호성인 것으로 생각된다. GXV를 비강내에 투여하면 마우스에서 특이적인 항체가 유도되는데, 네이키드 플라스미드 칵테일 또는 GXV 투여된 마우스에서 RSV-특이적 항체가를 측정하였다. GXV 백신에 의해 백신접종된 동물들은 대조군에 비해서 상당히 높은 IgA 항체가를 시현하였다.도 3A. 백신접종된 마우스로부터 수득한 혈청과 함께 RSV를 인큐베이션하면 HEp-2 세포들의 바이러스 감염을 감소시키는데, 이는 중화 항체가 생성되어 예방접종이 된다는 것을 가리킨다.도 3B. GXV 마우스는 네이키드 DNA가 투여된 마우스에 비해 현저하게 높은 중화 역가를 시현하였다. 이러한클래스의 항체가 GXV의 백신 접종의 결과로 변화되는지를 확인하기 위해서 코 세액 내의 총 IgA의 농도를 측정하였다. GXV로 백신 접종된 동물들은 대조군에 비해 훨씬 높은 IgA 항체가를 시현한다.도 3C. 이러한 결과들은 GXV가 혈청 내에서 증성화 항체 및 코 IgA의 생산을 증가시킨다는 것을 가리킨다. 차이는 다음과 같이 표현하였다: PBS 대조군에 비해 a; P<0.05, aa; P<0.01 및 aaa; P<0.001, b: 네이키드 DNA 대조군에 비해 P<0.05.
반-정량 분석 (Semi-quantitative analysis)
조직학 PBS NAKED DNA GXV
상피손상 2.53±0.17 2.25± 0.30 1.4± 0.52aab
사이질-꽈리 침윤물 2.66± 0.21 2.36± 0.33 1.76± 0.35aaa
폐혈관주위 침윤물 2.01± 0.20 1.81± 0.57 1.46± 0.23a
GXV의 비강내 투여는 항구적인 RSV 항원 (constitutive RSV antigen)의 효과적인 발현을 결과시키는데, 마우스들의 폐 조직을 RT-PCR에 의해 조사하고 웨스턴 블롯 분석을 행하였다. 투여된 GXV의 폐 mRNA로부터의 RT-PCR 분석 결과, GXV에 의해 코드화되는 mRNA 모두가 폐 조직 내에서 검출가능하였다,도 1A.이러한 mRNA들이 해독되어 충분한 양의 면역원들을 제조한다는 증거는 이러한 마우스들의 풀링된 혈청(n=4)으로부터 수득하였는데, 면역원들은 웨스턴 블롯 분석에서 RSV-감염된 HEp-2 세포 상청액에 존재하는 다수의 RSV 항원들과 반응하였다.도 1B.이러한 결과들은 GXV가 분명한 항체 반응을 일으키는 RSV 항원의 생산을 유도한다는 것을 가리킨다.
마우스들에게 단일 용량의 GXV (총 25 ㎍의 DNA) 또는, 식염수 내의 네이키드 DNA (대조군)중 하나를 투여한다. 살아있는 RSV 감염후의 폐 바이러스가 (lung virus titers)의 분석 결과, PBS 대조군에 비해서 GXV 마우스에서 RSV 역가가 현저하게 감소한다,도 2A. 네이키드 DNA 투여된 마우스들은 PBS 그룹과 유사한 역가를 보였는데, 이는 네이키드 DNA가 비강내 루트를 통해서 투여되는 경우에 효과적이지 않다는 것을 시사한다. 백신접종된 및 대조군에서 총 RSV 항원 로드를 조사하기 위해서, GXV 백신접종된 마우스를 지속적으로 RSV-감염된 BCH4를 표적으로 이용하고 RSV-음성 BC 세포를 대조군으로 하여 비장, RSV-특이적 CTL의 존재를 조사하였다. PBS 또는 네이키드 DNA 대조군은 검출가능한 CTL 반응을 일으키지 않았다. 이와 대조적으로, GXV로 면역화된 마우스들은 CTL 반응을 생성하였고,도 4A, 이러한 CTL들은 CD8+ 및 MHC 클래스 I-제한적으로 확인되었다 (데이터는 도시하지 않음). INF-γ는 주된 항-바이러스 싸이토카인으로 생각된다. 따라서 백신이 효과적이기 위해서는 백신은 INF-γ 발현을 유도해야만 한다. GXV 백신접종된 마우스 및 대조군 마우스 그룹의 배양된 비장 세포 및 기관지 폐포 세척(BAL)으로부터 INF-γ를 분석하였다. GXV 백신 접종된 마우스들은 대조군에 비해서 그들의 BAL 액에서 훨씬 많은 INF-γ 생산을 시현하였다,도 4B.GXV로 백신접종된 마우스에서 항-CD3 항체에 의해 자극된 배양된 비장 세포들은 대조군에 비해 많은 INF-γ 생산을 시현하였다. 도 4C.
폐 염증을 다른 그룹의 마우스들에서 조사하였다. 대표적인 병리적 특성들을도 5A에 도시하였다. GXV 백신이 투여된 마우스 그룹은 대조군에 비해서 사이질 및 폐혈관 주위에서 더 적은 상피 손상, 단핵 세포(MNC), 다형핵 세포(PMNC) 침윤물을 시현하였다. 도 5B. PBS 그룹과 네이키드 DNA 그룹은 상피의 파괴를 시현하였으나, GXV 백신접종된 마우스들은 정상 마우스와 동등한 폐 표현형을 시현하였다 (데이터는 도시하지 않음). 이러한 결과들은 GXV 백신이 RSV-감염-유도 폐염증으로부터 마우스를 보호한다는 것을 가리킨다. 폐의 염증에 대한 스코어링 시스템을 이용한 반-정량 분석 결과를표 1에 나타내었다. GXV 백신을 접종한 그룹들은 네이키드 DNA 및 PBS 대조군에 비해서 감소된 상피 손상 (p<0.01, PBS에 비해, 그리고 P<0.05; 네이키드 DNA에 비해) 및 폐 염증을 시현하였다. GXV 백신을 접종한 그룹들은 네이키드 DNA 및 PBS 대조군에 비해서 감소된 (P<0.01) 사이질 폐포 침윤 및 폐혈관주위 침윤물 (P<0.05)을 시현하였다. 네이키드 DNA와 PBS 대조군 사이에는 유의할만한 통계적 차이는 발견되지 않았다. 이러한 결과들은 GXV가 RSV-감염-유도 폐염증으로부터 마우스를 보호한다는 것을 가리킨다.
명세서 전반을 통해서, 다양한 문헌이 인용되었다. 이러한 문헌의 내용은 전체가 참고에 의해 본원의 일부로 편입되며 본 발명이 속하는 기술 분야의 기술 수준을 자세하게 설명한다.
이상의 실시예들은 단시 예시의 목적으로 개시된 것으로 본 발명의 보호범범위 또는 구현예를 제한하고자 하는 것은 아니다. 구체적으로 기술되지 않은 기타의 구현예들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들에게 자명할 것이다. 그러한 구현예들은 본 발명의 보호 범위 및 정신에 포함되는 것으로 생각된다. 따라서 본 발명은 이하의 청구범위에 의해서만 적절하게 제한된다.

Claims (20)

  1. 아래의 성분들을 포함하는, 숙주를 호흡기 세포융합 바이러스 (Respiratory Syncytial Virus; RSV)에 의해 발병된 질병에 대해서 보호하는 면역원 조성물:
    F RSV 항원;
    G RSV 항원; 및
    M, M2, SH, NS1, NS2, N, 또는 P RSV 항원 중 적어도 하나.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 점막 백신인 조성물.
  3. 아래의 성분들을 포함하는 숙주를 호흡기 세포융합 바이러스 (Respiratory Syncytial Virus; RSV)에 의해 발병된 질병에 대해서 보호하는 면역원 조성물:
    M2 RSV 항원; 및
    F, G, M, SH, NS1, NS2, N, 또는 P RSV 항원 중 적어도 하나.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 조성물이 점막 백신인 조성물.
  5. 아래의 성분들을 포함하는 숙주를 호흡기 세포융합 바이러스 (Respiratory Syncytial Virus; RSV)에 의해 발병된 질병에 대해서 보호하는 면역원 조성물:
    F RSV 항원;
    G RSV 항원;
    M2 RSV 항원; 및
    M, SH, NS1, NS2, N, 또는 P RSV 항원 중 적어도 하나.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 조성물이 점막 백신인 조성물.
  7. F, G, M, M2, SH, NS1, NS2, N, 및 P로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 두 개의 RSV 항원의 조합을 포함하는 플라스미드 DNA 칵테일을 포함하는, 숙주를 호흡기 세포융합 바이러스 (Respiratory Syncytial Virus; RSV)에 의해 야기된 질병에 대해서 보호하는 유전자 발현 백신으로서, 여기서 상기 플라스미드 DNA 칵테일이 키토산과 코아세트베이트되어 나노구(nanosphere)를 형성하는 유전자 발현 백신.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 투여가 기도 과다반응을 변화시키지 않는 유전자 발현 백신.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 백신이 점막 백신인 유전자 발현 백신.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 점막 백신이 경구 투여에 유리한 유전자 발현 백신.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 점막 백신이 비강내 투여에 유리한 유전자 발현 백신.
  12. 제 7항에 있어서, 상기 백신의 투여가 INF-γ 발현을 유도하는 유전자 발현 백신.
  13. F, G, M, M2, SH, NS1, NS2, N, 및 P로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 두 개의 RSV 항원의 조합을 포함하는
    플라스미드 DNA 칵테일을 포함하는 면역유효량의 조성물을 숙주에게 투여하는 단계로서, 상기 플라스미드 DNA 칵테일이 키토산과 코아세르베이트화하여 나노구를 형성하는 단계를 포함하는, 숙주를 호흡기 세포융합 바이러스 (Respiratory Syncytial Virus; RSV)에 의해 발병된 질병에 대해 면역화하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 투여가 경구 투여 또는 비강내 투여인 방법.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 투여가 기도 과다반응을 유도하지 않는 방법.
  16. 제 13항에 있어서, 상기 면역유효량이 단일 용량 (single dose)으로 투여되는 방법.
  17. 제 13항에 있어서, 상기 면역유효량이 약 1 mg/숙주 체중 kg인 방법.
  18. 다음 단계들을 포함하는 유전자 발현 백신의 제조방법:
    pVAX 플라스미드 내에 적어도 두 개의 호흡기 세포융합 바이러스 (Respiratory Syncytial Virus; RSV) 항원에 대한 cDNA를 클로닝하여 플라스미드 DNA 칵테일을 제조하는 단계; 및
    플라스미드 DNA 칵테일을 키토산과 코아세르베이트화하는 단계.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 코아세르베이트화 단계가 나모스피어의 생성을 결과시키는 방법.
  20. 제 18항에 있어서, 상기 호흡기 세포융합 바이러스 항원들이 F, G, M, M2, SH, NS1, NS2, N 및 P로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012053856A2 (ko) * 2010-10-21 2012-04-26 이화여자대학교 산학협력단 호흡기 신시치아 바이러스 백신 조성물 및 그의 제조방법

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005508927A (ja) * 2001-09-28 2005-04-07 ユニバーシティ オブ サウス フロリダ Ｒｓｖ遺伝子発現ワクチン
AU2003224650A1 (en) * 2002-03-02 2003-09-16 University Of South Florida A method for treating allergic disease and asthma by recombinant adenovirus-and adeno-associated virus-mediated ifn-gamma gene
AU2003225281A1 (en) 2002-04-30 2003-11-17 University Of South Florida Materials and methods for prevention and treatment of rna viral diseases
US7595303B1 (en) 2002-09-05 2009-09-29 University Of South Florida Genetic adjuvants for immunotherapy
US20040175384A1 (en) * 2003-12-12 2004-09-09 Mohapatra Shyam S. Protein kinase C as a target for the treatment of respiratory syncytial virus
US20070116767A1 (en) * 2003-02-14 2007-05-24 Mohapatra Shyam S Chitosan-microparticles for ifn gene delivery
US8796235B2 (en) * 2003-02-21 2014-08-05 University Of South Florida Methods for attenuating dengue virus infection
CN1301131C (zh) * 2003-04-11 2007-02-21 上海欣安基因免疫与疫苗研究开发有限公司 一种病毒性心肌炎基因疫苗及其制备方法和应用
EP1689414A4 (en) * 2003-12-04 2009-04-08 Univ South Florida Res Foundat POLYNUCLEOTIDES FOR REDUCING GENE EXPRESSION OF THE RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS
US8592368B2 (en) 2003-12-19 2013-11-26 University Of South Florida JAK/STAT inhibitors and MAPK/ERK inhibitors for RSV infection
JP4674288B2 (ja) * 2004-03-31 2011-04-20 恵雄 岡畑 歯科用材料。
US20050266093A1 (en) * 2004-04-27 2005-12-01 Mohapatra Shyam S Nanogene therapy for cell proliferation disorders
US20070036867A1 (en) * 2005-05-23 2007-02-15 University Of South Florida Controlled and Sustained Gene Transfer Mediated by Thiol-Modified Polymers
US8852600B2 (en) * 2006-06-08 2014-10-07 The Rockefeller University Codon-optimized DNA molecules encoding the receptor binding domains of Clostridium difficile toxins A and B, and methods of use thereof
WO2008147974A1 (en) 2007-05-23 2008-12-04 University Of South Florida Micro-rnas modulating immunity and inflammation
US8460680B2 (en) * 2009-04-24 2013-06-11 National Health Research Institutes Polyvalent chimeric rubella virus-based vaccines
JP5646620B2 (ja) * 2009-07-17 2014-12-24 インダストリー アカデミック コーポレーション ファウンデーション， ハルリム ユニバーシティー リポソームに被包されたオリゴヌクレオチド及びエピトープを含む免疫増強用組成物
WO2012089231A1 (en) * 2010-12-30 2012-07-05 Okairòs Ag Paramyxovirus vaccines
US10184942B2 (en) 2011-03-17 2019-01-22 University Of South Florida Natriuretic peptide receptor as a biomarker for diagnosis and prognosis of cancer
JP2015091761A (ja) * 2012-02-23 2015-05-14 国立大学法人大阪大学 中枢神経の損傷を治療するための組成物およびその利用
WO2015103602A1 (en) * 2014-01-06 2015-07-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pd1 and pdl1 antibodies and vaccine combinations and use of same for immunotherapy
CA2974956A1 (en) * 2015-01-29 2016-08-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Checkpoint inhibitor and vaccine combinations and use of same for immunotherapy
CN106124767A (zh) * 2016-05-12 2016-11-16 广州瑞辉生物科技股份有限公司 呼吸道合胞病毒IgA抗体检测试纸条及其检测方法
CN110229219B (zh) * 2019-06-21 2021-03-30 中国科学院武汉病毒研究所 一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4609551A (en) * 1984-03-20 1986-09-02 Arnold Caplan Process of and material for stimulating growth of cartilage and bony tissue at anatomical sites
GB8904370D0 (en) * 1989-02-25 1989-04-12 Cosmas Damian Ltd Liquid delivery compositions
IL105456A (en) * 1992-04-21 1996-12-05 American Home Prod Vaccines of attenuated respiratory syncytial virus
JPH11512609A (ja) * 1995-09-27 1999-11-02 アメリカ合衆国 クローン化されたヌクレオチド配列からの感染性ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）の生産
GB9525083D0 (en) 1995-12-07 1996-02-07 Danbiosyst Uk Vaccine compositions
US6184037B1 (en) * 1996-05-17 2001-02-06 Genemedicine, Inc. Chitosan related compositions and methods for delivery of nucleic acids and oligonucleotides into a cell
US6020182A (en) 1996-07-12 2000-02-01 Connaught Laboratories Limited Subunit respiratory syncytial virus vaccine preparation
NZ505876A (en) 1998-01-16 2002-12-20 Univ Johns Hopkins Solid nanosphere composition and delivery of a coacervate polymeric cation (gelatine or chitosan) and a polyanion (nucleic acids)
US6489306B2 (en) * 1998-02-23 2002-12-03 University Of South Florida Method of intranasal gene transfer for protection against respiratory infection
US6900299B1 (en) * 1999-03-11 2005-05-31 University Of South Florida Interrupting the interaction of intercellular adhesion molecule-1 and respiratory syncytial virus for prevention and treatment of infection
AU2001238585A1 (en) * 2000-02-24 2001-09-03 Human Genome Sciences, Inc. Human polynucleotides, polypeptides, and antibodies
AU2002210407A1 (en) 2000-10-27 2002-05-06 Pharmexa A/S Therapeutic vaccine formulations containing chitosan
EP1920783A1 (en) 2000-11-28 2008-05-14 MedImmune Vaccines, Inc. Recombinant RSV virus expression systems and vaccines
JP2005508927A (ja) * 2001-09-28 2005-04-07 ユニバーシティ オブ サウス フロリダ Ｒｓｖ遺伝子発現ワクチン
AU2003224650A1 (en) * 2002-03-02 2003-09-16 University Of South Florida A method for treating allergic disease and asthma by recombinant adenovirus-and adeno-associated virus-mediated ifn-gamma gene
WO2003078576A2 (en) * 2002-03-12 2003-09-25 Nitto Denko Corporation Vector for transfection of eukaryotic cells
US8592368B2 (en) * 2003-12-19 2013-11-26 University Of South Florida JAK/STAT inhibitors and MAPK/ERK inhibitors for RSV infection
EP1727556A2 (en) * 2004-02-17 2006-12-06 University Of South Florida Materials and methods for treatment of inflammatory and cell proliferation disorders
US20050266093A1 (en) * 2004-04-27 2005-12-01 Mohapatra Shyam S Nanogene therapy for cell proliferation disorders

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012053856A2 (ko) * 2010-10-21 2012-04-26 이화여자대학교 산학협력단 호흡기 신시치아 바이러스 백신 조성물 및 그의 제조방법
WO2012053856A3 (ko) * 2010-10-21 2012-08-02 이화여자대학교 산학협력단 호흡기 신시치아 바이러스 백신 조성물 및 그의 제조방법
KR101366702B1 (ko) * 2010-10-21 2014-02-28 이화여자대학교 산학협력단 호흡기 신시치아 바이러스 백신 조성물 및 그의 제조방법

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Publication number Publication date
CN100333792C (zh) 2007-08-29
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US7118888B2 (en) 2006-10-10

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Connors et al. Cotton rats previously immunized with a chimeric RSV FG glycoprotein develop enhanced pulmonary pathology when infected with RSV, a phenomenon not encountered following immunization with vaccinia—RSV recombinants or RSV
Lu et al. A safe and highly efficacious measles virus-based vaccine expressing SARS-CoV-2 stabilized prefusion spike
DK175500B1 (da) Sammensætning til beskyttelse af et dyr eller et menneske mod en infektion fremkaldt af et respiratorisk syncytialt virus samt underenhedsvaccineformulering
Mohapatra et al. Epidemiologic, experimental, and clinical links between respiratory syncytial virus infection and asthma
Garlapati et al. Enhanced immune responses and protection by vaccination with respiratory syncytial virus fusion protein formulated with CpG oligodeoxynucleotide and innate defense regulator peptide in polyphosphazene microparticles
Pierantoni et al. Mucosal delivery of a vectored RSV vaccine is safe and elicits protective immunity in rodents and nonhuman primates
JP6523955B2 (ja) 組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）ｒｓウイルス（ｒｓｖ）ワクチン
Hwang et al. Co-immunization with virus-like particle and DNA vaccines induces protection against respiratory syncytial virus infection and bronchiolitis
Kotomina et al. Recombinant live attenuated influenza vaccine viruses carrying CD8 T-cell epitopes of respiratory syncytial virus protect mice against both pathogens without inflammatory disease
KR20140122258A (ko) Rsv 감염의 예방 및 치료를 위한 혼합 항원 및 dna 백신
Wang et al. Intranasal immunization with live attenuated influenza vaccine plus chitosan as an adjuvant protects mice against homologous and heterologous virus challenge
Bastien et al. Complete protection of mice from respiratory syncytial virus infection following mucosal delivery of synthetic peptide vaccines
Lee et al. A unique combination adjuvant modulates immune responses preventing vaccine-enhanced pulmonary histopathology after a single dose vaccination with fusion protein and challenge with respiratory syncytial virus
Bembridge et al. Respiratory syncytial virus infection of gene gun vaccinated mice induces Th2-driven pulmonary eosinophilia even in the absence of sensitisation to the fusion (F) or attachment (G) protein
KR101442493B1 (ko) 돼지유행성설사병바이러스 약독화주 및 이를 포함하는 돼지유행성 설사병 백신 조성물
KR20230084180A (ko) 베타 코로나바이러스 저온순화 주 및 백신
Li et al. RSV recombinant candidate vaccine G1F/M2 with CpG as an adjuvant prevents vaccine-associated lung inflammation, which may be associated with the appropriate types of immune memory in spleens and lungs
JP2021531783A (ja) 新たな弱毒ウイルス株及びワクチンとしてのその使用
US11896658B2 (en) RSV vaccines and methods of production and use thereof
WO2002062381A1 (fr) Vaccin a vecteur de baculovirus
Kwon et al. Respiratory syncytial virus fusion protein-encoding DNA vaccine is less effective in conferring protection against inflammatory disease than a virus-like particle platform
Lee et al. The efficacy of inactivated split respiratory syncytial virus as a vaccine candidate and the effects of novel combination adjuvants
AU2002242164A1 (en) RSV gene expression vaccine
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