DK175500B1 - Sammensætning til beskyttelse af et dyr eller et menneske mod en infektion fremkaldt af et respiratorisk syncytialt virus samt underenhedsvaccineformulering - Google Patents

Description

i DK 175500 B1 1. Opfindelsens område.

Opfindelsen angår en sammensætning som angivet i krav l, jf. det følgende, og en underenhedsvaccineformulering som angivet i krav 2 og 3, jf. det følgende.

5 Respiratorisk syncytialt virus (RS-virus) er en hoved årsag til sygdom i den nedre luftvej hos spædbørn og i den tidlige barndom. Det er en sag af stor medicinsk og videnskabelig interesse at tilvejebringe sikre og effektive vacciner imod dette virus.

10 RS-virus er et hylster-RNA-virus. Hovedproteinerne i I det ydre hylster, F-proteinet (også kendt som fusionsprotei- I net eller fusionsglycoproteinet) og G-proteinet, spiller en I nøglerolle ved RS-virusinfektion, fordi antistoffer rettet I imod disse proteiner kan neutralisere viruset.

I 15 Til den foreliggende opfindelses formål er en neutra- I liserende epitop på et virusprotein en epitop, som er es- I sentiel for virussmitsomhed som defineret ved den omstændig- I hed, at antistofbinding til epitopen neutraliserer viruset.

I Ligeledes er en fusionsepitop på et virusprotein en epitop, I 20 som er essentiel for viruscellefusion eller intracellulær I spredning af en infektion ved fusion mellem en inficeret I celle og en uinficeret celle som defineret ved den omstændig- I hed, at antistofbinding til epitopen ophæver fusion.

I Den foreliggende opfindelse omhandler sammensætninger I 25 til fremstilling af proteiner og polypeptider, som er asso- I cieret med det ydre hylster i RS-virus. Nærmere betegnet I angår en udførelsesform for opfindelsen sammensætninger I til fremstilling af proteiner og polypeptider, som har rela- I tion til fusionsproteinet i RS-virus. Proteinerne og polypep- I 30 tiderne ved denne udførelses form for opfindelsen har relation I til en neutraliserende epitop eller en fusionsepitop eller I begge dele i fusionsproteinet og kan anvendes som immunogener I i vaccineformuleringer omfattende multivalente vacciner I til aktiv immunisering og til frembringelse af antistoffer I 35 til anvendelse ved passiv immunisering samt reagenser til I diagnostiske afprøvninger.

I DK 175500 B1 I

I 2 I

I En anden udførelsesform for opfindelsen angår sammen- I

I sætninger til fremstilling af proteiner og polypeptider I

I med relation til G-proteinet i RS-virus. Proteinerne og I

I polypeptiderne ved denne udførelsesform for opfindelsen har I

I 5 relation til en neutraliserende epitop i G-proteinet og kan I

I anvendes som immunogener i vaccineformuleringer omfattende I

I multivalente vacciner til aktiv immunisering og til frembrin- I

I gelse af antistoffer til anvendelse ved passiv immunisering I

I samt reagenser til diagnostiske afprøvninger. I

I 10 De hidtil ukendte proteiner og polypeptider med rela- I

I tion til en neutraliserende epitop, en fusionsepitop eller I

I begge dele kan fås ved anvendelse af enten rekombinant-DNA I

I eller kemiske syntesemetoder. I

I Endelig kan de her omhandlede polypeptider eller I

I 15 proteiner ifølge opfindelsen med relation til fusionspro- I

I teinet og G-proteinet, ligesom de bonafide virusproteiner, I

I f.eks. være mærket eller umærket, bundet til en overflade I

I eller konjugeret til et bærestof, afhængigt af den anven- I

I delse, som der gøres af dem. I

I 20 I

I 2. Opfindelsens baggrund. I

I 2,1. Respiratorisk svncvtialt virus i sygdom. I

I RS-virus er en hovedårsag til sygdom i de nedre luft- I

I veje hos spædbørn og i den tidlige barndom {McIntosh og I

25 Chanock, 1985, i Virology, B.Fields (udg.), Raven, NY, side I

1285-1304). I alle geografiske områder er det hovedårsagen I

til bronchiolitis og pneumoni hos spædbørn og unge børn. I

Smitstof fet reinficerer· hyppigt under barndommen, men sygdom I

frembragt af reinfektion er almindeligvis mildere end den, I

30 som er forbundet den indledende infektion, og forårsager I

sjældent store problemer. I

RS-virus er et hylster-RNA-virus af familien Paramyxo- I

viridae og af slægten pneumovirus. De to hovedhylsterprote- I

iner er G-proteinet, som er ansvarligt for tilknytningen af I

35 viruset til værtscellemembranen, og fusionsproteinet, som I

er ansvarligt for fusionering af viruset og cellemembranerne. I

3 DK 175500 B1

Virus-celle-fusion er et nødvendigt trin for infektion. Fusionsprotein er også nødvendigt for celle-celle-fusion, som er en anden måde til at sprede infektionen fra en inficeret celle til en uinficeret celle.

5 Antistoffer rettet imod fusionsproteinet eller imod G-proteinet kan neutralisere viruset. Imidlertid vil kun antistoffer imod fusionsproteinet blokere spredningen af viruset mellem celler, dvs. have anti-fusionsaktivitet. Derfor vil antistoffer mod fusionsproteinet beskytte imod 10 cirkulerende virus samt inhibere spredningen mellem celler af en etableret infektion. Antistoffer mod fusionsproteinet (både polyclonale antisera imod renset fusionsprotein og monoclonale antistoffer, som indeholder både neutraliserende og anti-fusionerende aktivitet) har vist sig at være beskyt-15 tende imod infektion hos dyremodeller (Walsh et al., 1984, Infect. Immun. 43., 756-758).

Aminosyresekvensen af F-proteinet er afledt fra mRNA-sekvensen og et sted kortlagt for den proteolytiske spaltning af proteinet i 48 kD- og 20 kD-fragmenter (Elango et al., 20 1985, Nuc.Acids Res. 13, 1559-1574). F-proteinet er blevet isoleret, og et spaltningsfragment er blevet identificert som en epitop svarende til aminosyrerne 215-236 (Trudel et al., 1987, J. Gen. Virol. 68r 2273-2280). De komplette DNA-sekvenser kodende for F- og G-proteinerne er blevet opnået 25 (Int. Patentans. Nr. WO 87/04185, publiceret 16. juli 1987), og disse to proteiner er blevet udtrykt i rekombinante vac-cinia-vira (Wertz et al., 1987, J. Virol. 61, 293-301); og US ansøgning nr. 6-849.299, indleveret 8. april 1986). Immuniseringsstudier under anvendelse af rensede F- og G-pro-30 teiner er blevet udført i bomuldsrotter (Walsh et al., 1987, J. Infectious Dis. 155, 1198-1204).

2.2. Immunologisk tilnærmelse til forhindring af RS-virusin- f ektion.____ 35 Et praktisk middel til beskyttelse af spædbørn og unge børn imod sygdom i øvre og nedre luftveje ville være

I DK 175500 B1 I

I I

I beskyttende vaccination imod RS-virus. Vaccination af gravide I

I modre (aktiv immunisering) ville beskytte unge børn ved I

I passiv overføring af immunitet, enten transplacentalt eller I

I gennem modermælken. Adskillige tilnærmelser til en RS-virus- I

I 5 vaccine er mulige, men nogle af disse har tidligere vist I

I sig at være uden succes. I

I Vaccination med dræbt RS-virusvaccine er blevet afprø- I

I vet og har vist sig at være ineffektivt (Kim et al., 1969, I

I Am. J. Epidemol. 89, 422-434). Ikke alene er børnene ikke I

I 10 beskyttet, men i nogle tilfælde har efterfølgende infek- I

I tioner med RS-virus resulteret i atypisk og strengere sygdom I

I end hos de ikke-immuniserede kontroller. Dette fænomen er I

I ikke særegent for RS-virus og er også blevet set i dræbte I

I paramyxovirusvacciner, såsom mæslinger. Det er blevet fore- I

I 15 slået, at grunden til, at tidligere, inaktiveret RS-virusvac- I

I cine har svigtet, skyldes inaktiveringen af de biologisk I

I funktionelle epitoper på det ene eller begge virushylstergly- I

I coproteinerne. Dvs. de neutraliserende og fusionerende epito- I

I per på den dræbte virusvaccine . har været "denatureret". I

I 20 Som et resultat heraf udviser det vaccinerede individ ikke I

I de biologisk funktionelle, neutraliserende og fusionerende I

I epitoper. Når det vaccinerede individ derfor møder et levende I

I virus, giver den resulterende antistofreaktion ikke beskyt- I

I tende immunitet. I stedet har der være en antistofmedieret, I

I 25 inflammatorisk reaktion, som ofte har resulteret i en stren- I

I gere sygdom (Choppin og Scheid, 1980, Rev, Inf. Dis., 2, I

I 40-61). I

I Den anden tilnærmelse til en RS-virusvaccine har I

I været at svække levende virus. Temperaturfølsomme mutanter I

I 30 (Wright et al., 1982, Infect. Immun. 37, 397-400) og passage- I

I svækket virus (Belshe et al., 1982, J. Inf. Dis. 145. 311- I

I 319) har vist sig at være dårligt smitsomme og ikke effektive I

I ved forhindringen af sygdom, når de anvendes som immunogener I

I i RS-virusvacciner. I disse tilfælde har der imidlertid ikke I

I 35 været nogen atypisk sygdom som et resultat af vaccination. I

I Baseret på den øjeblikkelige viden om strukturen af I

5 DK 175500 B1 RS-virus og immunreaktionen mod infektion er det tydeligt, at en anvendelig vaccine mod dette virus skal være effektiv til frembringelse af produktion af antistoffer mod fusionsproteinet og/eller G-proteinet. Af særlig betydning for 5 beskyttende immunitet er produktionen af antistoffer, som inhiberer fusion, og som derfor kan standse spredningen af virus mellem celler i luftroret. Desuden kan det være en hjælp at fremkalde en cell'emedieret immunreaktion, herunder stimuleringen af cytotoksiske T-celler (CTL-celler), som er 10 værdifulde imod celler smittet med RS-virus. De her omhandlede forskellige vaccineformuleringer tilsigter at opfylde begge disse formål.

2.3. Rekombinant-DNA-teknologi og geneksoression.

15 Rekombinant-DNA-teknologi indebærer indsættelse af specifikke DNA-sekvenser i en DNA-grundmasse (vektor) til dannelse af et rekombinant-DNA-molekyle, som kan replikeres i en værtscelle. Almindeligvis, men ikke nødvendigvis, er den indsatte DNA-sekvens fremmed for modtager-DNA-grundmas-20 sen, dvs. den indsatte DNA-sekvens og DNA-vektoren stammer fra organismer, som ikke udveksler genetisk information i naturen, eller den indsatte DNA-sekvens omfatter information, som kan være helt eller delvist kunstig. Der er blevet udviklet adskillige, almene metoder, som muliggør konstruktion 25 af rekombinant-DNA-molekyler. P.eks. er der i US patentskrift nr. 4.237.224 beskrevet fremstillingen af sådanne rekombi-nantplasmider ved anvendelse af processer med spaltning af DNA med restriktionsenzymer og sammenknytning af DNA-styk-kerne ved hjælp af kendte metoder til ligation.

30 Disse rekombinante plasmider indføres derefter ved hjælp af transformation og replikeres i encellede kulturer omfattende prokaryotiske organismer og eukaryotiske celler dyrket i vævskultur. På grund af den almene anvendelighed af den i US patentskrift nr. 4.237.224 beskrevne teknik 35 skal der her henvises dertil. En anden metode til indføring af rekombinant-DNA-molekyler i encellede organismer er be-

I DK 175500 B1 I

i I

skrevet i US patentskrift nr. 4.304.863, hvortil der også I

I skal henvises her. Denne metode udnytter et pakkende trans- I

I duktionssystem med bakteriophagvektorer (cosmider). I

I DNA-sekvenser kan også indsættes i vira, f.eks. vacci- I

I 5 niavira. Sådanne rekombinantvira kan f.eks. frembringes I

I ved transfektion af plasmider ind i celler inficeret med I

virus (Chakrabarti et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 3403- I

I 3409). I

I Uanset den anvendte konstruktionsmetode er rekombi- I

I 10 nant-DNA-molekylet fortrinsvis foreneligt med værtscellen, I

dvs. det kan replikeres i værtscellen enten som en del af I

I værtschromosomerne eller som et ekstrachromosomalt element. I

Rekombinant-DNA-molekylet eller rekombinantviruset har for- I

I trinsvis en mærkestoffunktion, som tillader udvælgelsen af I

I 15 det eller de ønskede rekombinant-DNA-molekyler eller -vira. I

Hvis desuden alle de korrekte replikations-, transkriptions- I

I og transversionsignaler er korrekt placeret på rekombinant- I

I DNA-molekylet, vil det fremmede gen blive korrekt eksprimeret I

I i de transformerede eller transficerede værtsceller. I

I 20 Forskellige genetiske signaler og behandlingsbegiven- I

heder kontrollerer genekspression på forskellige niveauer. I

I F.eks. er DNA-transkription et niveau, og messenger-DNA- I

I translation (mRNA) er et andet. Transkription af DNA er I

I afhængig af tilstedeværelsen af en promotor, som er en DNA- I

I 25 sekvens, som dirigerer bindingen af RNA-polymerase og derved I

I fremmer RNA-syntese. DNA-sekvenserne i eukaryotiske promoto- I

rer afviger fra dem i prokaryotiske promotorer. Desuden kan I

eukaryotiske promotorer og ledsagende, genetiske signaler I

eventuelt ikke blive erkendt eller kan eventuelt ikke fungere I

30 i et prokaryotisk system. I

Tilsvarende afhænger translation af mRNA i prokaryoter I

af tilstedeværelsen af de korrekte, prokaryotiske signaler, I

som afviger fra dem i eukaryoter. Effektiv translation af I

mRNA i prokaryoter kræver et ribosombindingssted kaldt Shine- I

35 Dalgarno-sekvensen (SD) på mRNA. En oversigt over maksimering I

af genekspression findes i Roberts og Lauer, 1979, Methods I

DK 175500 B1 I

7 I

in Enzymology 68, 473. I

Mange andre faktorer komplicerer ekspressionen af I

fremmede gener i prokaryoter, selv efter at de korrekte I

signaler er indsat og placeret hensigtsmæssigt. En sådan I

5 faktor er tilstedeværelsen af et aktivt, proteolytisk system I

i E.coli og andre bakterier. Dette proteinsønderdelende I

system ser ud til at ødelægge fremmede proteiner selektivt. I

En uhyre stor anvendelighed ville derfor være tilvejebragt I

ved udviklingen af et middel til beskyttelse af eukaryotiske I

I 10 proteiner eksprimeret i bakterier mod proteolytisk sønderde- I

I ling. En strategi er at konstruere hybridgener, hvori den I

I fremmede sekvens er ligateret i fase (dvs. i den korrekte I

I læseramme) med et prokaryotisk strukturgen. Ekspression af I

I dette hybridgen resulterer i et rekombinantproteinprodukt I

I 15 (et protein, som er et hybrid af prokaryotiske og fremmede I

I aminosyresekvenser). I

I Lignende betragtninger over genekspression i eukaryo- I

I tiske systemer er diskuteret i Enlancers & Eukaryotic Gene I

I Expression, Gluzman & Shenk (udg.), Cold Spring Harbor Labo- I

I 20 ratories, Cold Spring Harbor, New York 1983, og Eukaryotic I

I Viral Vectors, Gluzman (udg.), Cold Spring Harbor Laborato- I

I ries, Cold Spring Harbor, New York 1982. I

I Resultatrig ekspression af et klonet gen kræver effek- I

I tiv transkription af DNA, translation af mRNA og i visse I 25 tilfælde post-translationel modifikation af proteinet. Der I er blevet udviklet ekspressionsvektorer til forøgelse af I proteinproduktion ud fra det klonede gen. I ekspressionsvek- I torer er'det klonede gen ofte placeret næst efter en stærk I promotor, som kan kontrolleres, således at transkriptionen I 30 kan sættes i gang, når dette er nødvendigt. Celler kan dyrkes I til en høj tæthed, hvorefter promotoren kan induceres til I forøgelse af antallet af transkriptioner. Disse vil, hvis I de translateres effektivt, resultere i høje udbytter af I protein. Dette er et særlig værdifuldt system, hvis det I 35 fremmede protein er skadeligt for værtscellen.

I Adskillelige rekombinant-DNA-ekspressionssystemer er I DK 175500 B1

I I

I beskrevet i det følgende med det ene formål at illustrere, I

I og disse eksempler må ikke betragtes som begrænsende for I

I omfanget af den foreliggende opfindelse. I

5 2,3.1. E. coli som ekspressionsvektor. I

I Mange E. coli-plasmider er kendt og er blevet anvendt I

I til ekspression af fremmede gener. Af økonomiske grunde ville I

I det være yderst fordelagtigt at være i stand til at opnå et I

I højt ekspressionsniveau. En måde til opnåelse af store mæng- I

10 der af et givet genprodukt er at klone et gen på et plasmid, I

I som har et meget højt kopiantal inden i bakteriecellen. Ved I

I forøgelse af antallet af kopier af et specielt gen, vil mRNA- I

I niveauerne normalt også vokse, hvilket på sin side vil føre I

I til forøget produktion af det ønskede protein. I

I 15 I

I 2.3.2. Vacciniavirus som ekspressionvektor. I

Vacciniavirus kan anvendes som en klonings- og eks- I

I pressionsvektor. Viruset indeholder et lineært, dobbeltstren- I

get DNA-genom på ca. 187 kb-par og replikerer i cytoplasmaet I

20 i inficerede celler. Disse vira indeholder et komplet, tran- I

skriptionelt enzymsystem {herunder maskerende, methylerende I

og polyadenylerende enzymer) i viruskernen. Dette system I

er nødvendigt for virussmitsomhed, fordi transkriptionelle I

vacciniavirusreguleringssekvenser (promotorer) står for I

25 initieringen af transkription ved hjælp af vaccinia-DNA- I

polymerase, men ikke ved hjælp af cellulær RNA-polymerase. I

Ekspression af fremmed DNA i rekombinant vira kræver I

fusionen af vacciniapromotorer til proteinkodende sekvenser I

i det fremmede gen. Plasmidvektorer, også betegnet indsæt- I

30 telsesvektorer, er blevet konstrueret til indsættelse af I

chimergenet i vacciniavirus. En type indsættelsesvektor I

omfatter: (1) en vacciniaviruspromotor, herunder det tran- I

skriptionelle initieringssted, (2) adskillige særegne re- I

striktionsendonucleasekloningssteder med strømmen fra det I

35 transkriptionelle startsted for indsættelsen af fremmede I

DNA-fragmenter, (3) ikke-essentiel vacciniavirus-DNA (såsom I

DK 175500 B1 I

9 I

thymidinkinasegenet), som flankerer den promotor og de klo- I

ningssteder, som dirigerer indsættelsen af chimergenet i I

den homologe, ikke-essentielle region af virusgenomet, og I

(4) en bakteriel oprindelse af replikation og antibiotikum- I

I 5 resistens mærkestof til replikation og udvælgelse i E. coli. I

I · Eksempler på sådanne vektorer er beskrevet af MacKett, 1984, I

I J. Virol. 49, 857-864. . I

I Rekombinantvira fremstilles ved transfektion af rekom- I

I binantbakterieindsættelsesvektorer indeholdende det fremmede I

I 10 gen ind i celler inficeret med vacciniavirus. Homolog rekom- I

I bination finder sted inden i de inficerede celler og resulte- I

I rer i indsættelsen af det fremmede gen i virusgenomet. Immu- I

I nologisk teknik, DNA-plaque-hybridisering eller genetisk ud- I

I vælgelse kan anvendes til indentifikation og isolering af de I

I 15 ønskede rekombinantvira. Disse vacciniarekombinanter bibehol- I

I der de funktioner, som er essentielle for smitsomhed, og kan I

I konstrueres til at opsamle op til ca, 35 kb fremmed DNA. I

I Ekspression af et fremmed gen kan påvises ved hjælp I

I af enzymatiske eller immunologiske afprøvninger, f.eks. . I

I 20 immunoudfældning, enzymbundet immunosorbentafprøvning I

I (ELISA), radioimmunoafprøvning eller immunopletdannelse. I

I , Desuden glycosyleres naturligt forekommende membranglycopro- I

I teiner fremstillet ud fra rekombinantvacciniainficerede I

I celler, og de kan transporteres til celleoverfladen. Høje I

I 25 ekspressionsniveauer kan opnås ved anvendelse af stærke I promotorer eller kloning af mange kopier af et enkelt gen.

I 2.3.3. Baculovirus som ekspressionvektor.

I Et baculovirus, såsom Autographic califonica nuclear I 30 polyhedrisvirus (AcNPV) er også blevet anvendt som klonings- I eller ekspressionsvektor. Den smitsomme form af AcNPV findes I normalt i en virusocclusion. Denne struktur er stort set I sammensat af et polyhedrinpolypeptid, hvori viruspartikler I er indlejret. Ekspression af polyhedringenet sker meget I 35 sent i infektionscyklusen, efter at der er dannet modne I viruspartikler. Derfor er ekspression af polyhedringenet I DK 175500 B1

I 10 I

I en funktion, som der kan ses bort fra, dvs. ikke-occluderede I

viruspartikler fremstillet i fraværelse af polyhedringen- I

I /ekspression er fuldt aktive og er i stand til at inficere I

I celler i kultur. Ifølge EP patentansøgning nr. 84.105.841.5 I

I 5 kan en rekombinant-baculovirusekspressionsvektor fremstilles I

I i to trin. Først spaltes baculovirus-DNA til frembringelse I

I af et fragment omfattende et polyhedringen eller en del I

I deraf, hvilket fragment indsættes i et kloningsgrundmateri- I

I ale. Det gen, som skal eksprimeres, indsættes også i klo- I

I 10 ningsgrundmaterialet, og det indsættes på en sådan måde, at I

det er under kontrol af polyhedringenpromotoren. Dette rekom- I

I binantmolekyle kaldes en rekombinantoverføringsvektor. Nor- I

I malt forstærkes rekombinantoverføringsvektoren i hensigtsmæs- I

I sige værtsceller. For det andet blandes den på denne måde I

I 15 dannede rekombinantoverføringsvektor med baculovirus-hjæl- I

I per-DNA og anvendes til transfektion af insektceller i kultur I

I til opnåelse af rekombination og inkorporering af det klonede I

I gen på polyhydrin genstedet i baculovirusgenomet. Det resul- I

I terende rekombinantbaculovirus anvendes til infektion af I

I 20 følsomme insekter eller dyrkede insektceller. I

I 3. Resumé af opfindelsen. I

I Den foreliggende opfindelse angår en sammensætning I

I til beskyttelse af et dyr eller et menneske mod en infektion I

I 25 fremkaldt af et respiratorisk syncytialt virus, og omfattende I

I en effektiv mængde af en vaccineformulering, som er egnet I

til indgivelse til et dyr eller et menneske, og som omfat- I

ter et praktisk taget rent polypeptid, som er et respirato- I

risk syncytialt virusfusionsprotein, kendetegnet ved en I

30 molekylvægt på ca. 140.000 dalton og med en nativ, dimer I

form, i kombination med et adjuvans egnet til indgivelse I

til dyret eller mennesket. Opfindelsen angår også en underen- I

hedsvaccineformulering som angivet i krav 2 og 3. I

Polypeptiderne eller proteinerne kan fremstilles ved anven- I

35 delse af rekombinant-DNA-teknik eller syntetiseres ved kemi- I

ske metoder. I

11 DK 175500 B1 I nærværende beskrivelse angives også metoder til molekylær kloning af og ekspression af gener eller genfragmenter, som koder en neutraliserende eller fusionerende epitop eller begge dele i RS-virusfusionsprotein eller en 5 neutraliserende epitop i G-proteinet.

4. Kortfattet beskrivelse af tegningen.

Figur 1 viser de komplette nucleotid- og aminosyre-sekvenser i RS-virusfusionsproteinet, reproduceret fra Col-10 lins et al., 1985, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 131, 7683-7687.

Figur 2 viser den elektroforetiske opførsel i SDS-polyacrylamid-gel af 1 μg af det rensede RS-virusfusionsprotein under forskellige betingelser. I kolonne 2 er proteinet 15 blevet reduceret med 5% S-mercaptoethanol og opvarmet til 100 “C før elektroforese, i kolonne 3 er proteinet blevet opvarmet til 100°C før elektroforese, og i kolonne 4 er proteinet ikke blevet opvarmet eller reduceret før elektroforese. Kolonne 1 indeholder standardmærkestofproteiner, hvis 20 molekylvægte er vist i venstre margin. Højre margin viser molkylvægten af de forskellige fusionsproteinkomponenter.

Gelen er blevet farvet med sølv til synliggørelse.

Figur 3 viser i diagramform en E. coli-rekorribinantvek-tor indeholdende den komplette nucleotidsekvens i RS-virusfu-25 sionsproteingenet.

Figur 4 viser i diagramform en rekombinantekspressi-onsvektor af pPX1044 indeholdende den komplette nucleotidsekvens i RS-virus-G-proteingenet. 1 2 3 4 5 6 5. Detaljeret beskrivelse af opfindelsen.

2

Ifølge en udførelsesform for opfindelsen er en region 3 i RS-virusfusionsproteinet, som afgrænser en eller flere 4 neutraliserende og fusionerende epitoper, blevet identifice 5 ret. Der er tilvejebragt en fremgangsmåde til fremstilling 6 af hidtil ukendte proteiner, polypeptider og peptider omfattende denne eller disse epitoper samt de polynucleotidsek-

I DK 175500 B1 I

I 12 I

I venser, som koder sådanne, hidtil ukendte proteiner og poly- I

I peptider. I

I Fusionsproteinet i RS-virus har en tilsyneladende I

I molekylvægt på 70.000 dalton ved natriumdodecylsulfat-poly- I

I 5 acrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE). Det primære (cistro- I

I niske) translationsprodukt bestående af 574 aminosyrer rester I

I syntetiseres og behandles derefter ved enzymatisk spaltning I

I ved et trypsinfølsomt sted, hvilket giver 2 underenheder I

I betegnet (aminosyrerne 137-574) og F2 (aminosyrerne 1- I

I 10 136). I

I Den komplette nucleotidsekvens i fusionsproteingenet I

I fra A2-strengen i RS-virus (Collins et al., 1985, Proc. I

I Nat11. Acad. Sci . USA, .81, 7683-7687), som koder fusionspro- I

I teinet på 574 aminosyrer, er illustreret i figur 1. Det i I

I 15 figur 1 viste nummereringssystem er anvendt i hele nærværende I

I beskrivelse. Underenhederne F2 (tilsyneladende molekylvægt I

I 88.000 dalton) og F2 (tilsyneladende molekylvægt 23.000 I

I dalton) er knyttet sammen via en disulfidbinding til dannelse I

I af et protein, som betegnes F12 (tilsyneladende molekylvægt I

I 20 ca. 70.000 dalton). Renset fra RS-virus eller inficerede I

I celler eksisterer det native fusionsprotein overvejende som I

I en dimer (tilsyneladende molekylvægt 140.000). Den dimere I

I form er den mest immunogene form af RS-virusfusionsprote- I

I inet. I

I 25 Figur 2 viser den elektroforetiske mobilitet af for-

I skellige proteinkomponenter ved anvendelse af SDS-PAGE. I I

I kolonne 2 er proteinet blevet reduceret med 5% β-mercap- I

I toethanol og opvarmet til 100°C før elektroforese, i kolonne I

I 3 er proteinet blevet opvarmet til 100°C før elektroforese,

I 30 og i kolonne 4 er proteinet ikke blevet opvarmet eller redu- I

I ceret før elektroforese. Kolonne 1 indeholder standardmærke- I

I stofproteiner, hvis molekylvægte er vist i venstre margin. I

I Højre margin viser molkyl vægten af de forskellige fusionspro- I

I teinkomponenter. Gelen er blevet farvet med sølv til synlig- I

35 gørelse (Morrisey, 1981, Anal. Biochem. 117, 307-310). I

Aktiv immunisering af bomuldsrotter med renset RS- I

13 DK 175500 B1 virusfusionsprotein (formen på 140.000 dalton) resulterer i produktionen af antistoffer, som er effektive ved virusneutralisation og ved forhindring af fusion (se f.eks. afsnit 6.2. nedenfor). Som vist i afsnit 6.2. beskytter denne immu-5 nisering lunge- og næsevæv mod infektion af RS-virus. Tilsvarende resultater er blevet opnået i bavianer (se afsnit 6.3. nedenfor). Desuden beskytter aktiv immunisering af dyr med renset RS-virusfusionsprotein, som i forvejen er reduceret med β-mercaptoethanol, dyrene mod efterfølgende RS-virus- 10 infektion (se afsnit 6.2. nedenfor).

Ifølge en anden udføreIsesform for den foreliggende opfindelse er der tilvejebragt praktisk taget rene polypep-tider og proteiner med relation til en neutraliserende epitop i RS-virus-G-proteinet. RS-virus-G-proteinet har en tilsyne-15 ladende molekylvægt på ca. 84.000-90.000 dalton og er kraftigt glycosyleret. Nucleotidsekvensen i det gen, som koder RS-virus-G-proteinet, er blevet beskrevet (Satake et al., 1985, Nucleic Acid Res. .13, 7795-7812, Wertz et al., 1985,

Proc. Nat11 Acad. Sci. USA 82., 4075-4079). Hele gensekvensen, 20 som koder RS-virus-G-proteinet, er blevet klonet og eksprime-ret i en rekombinantekspressionsvektor (se afsnit 9 nedenfor) . Overraskende nok frembringer immunisering af dyr med et rekombinant-ikke-glycosyleret RS-virus-G-protein en beskyttende immunreaktion (se afsnit 10, nedenfor).

25 Et monoclonalt antistof til fusionsproteinet, kolonne 1, indeholder standardmarkørproteiner, hvis molekylvægte er angivet i venstre margen. Højre margen viser molekylvægten af de forskellige fusionsproteinbestanddele. Gelen farves med sølv til visualisering (Morissey, 1981, Anal. Biochem.

30 117, 307-310. '

Aktiv immunisering af bomuldsrotter med renset RS-virusfusionsprotein (140.000 dal ton-formen), resulterer i produktion af antistofer, der er effektive ved virusneutralisering og til hindring af fusion (se f.eks. afsnit 6.2).

35 Som vist i afsnit 6.2 beskytter denne immunisering lunge-og næsevæv mod infektion med RS-virus. Lignende resultater

I DK 175500 B1 I

I 14 I

I er opnået med bavianer (se afsnit 6.3). Desuden beskyttede I

I aktiv immunisering af dyr med renset RS-virusfusionsprotein I

I tidligere reduceret med β-mercaptoethanol dyrene mod efter- I

I følgende RS-virusinfektion (se afsnit 6.29. I

I 5 RS-virus-G-proteinet har en tilsyneladende- molvægt I

I på ca. 84.000-90.000 dalton og er stærkt glycosyleret. Nu- I

I cleotidsekvensen af genet, der koder for RS-virus-G-proteinet I

I er beskrevet (Sataka et al., 1985, Nucleic Acids Res. 13, I

I 7795-7812; Wertz et al., 1985, Proc Natl. Acad. Sci. USA I

I 10 82., 4075-4079) . Hele gensekvensen kodende for RS-G-proteinet I

I er blevet klonet og udtrykt i en rekombinant ekspressionsvek- I

I tor (se afsnit 9) . På overraskende måde fremkalder aktiv I

I immunisering af dyr med et rekombinant, ikke-glycosyleret I

I RS-virus-G-protein et beskyttende immunrespons (se afsnit I

I 15 10). I

I 5.1. Kloning og ekspression af fragmenter i fusionsprotei- I

I net._ I

I Den cDNA, som er vist i figur 1, og som indeholder I

I 20 den komplette nueleotidsekvens af fusionsproteingenet, klones I

I ind i en kloningsvektor, såsom E. coli-plasmidvektoren I

I pBR322. På grund af degenerationen af de nucleotidkodende I

I sekvenser kan andre DNA-sekvenser, som koder praktisk taget I

I samme aminosyresekvens som den, som er vist i figur 1, anven- I

I 25 des. Disse omfatter, men er ikke begrænset til, nucleotidsek- I

I venser, som omfatter alle eller dele af de i figur 1 viste

I fusionsproteinnucleotidsekvenser,.som er ændret ved ombyt- I

I ning af forskellige kodoner, som koder samme eller en funkti- I

I onelt ækvivalent aminosyrerest i sekvensen (f.eks. en amino- I

I 30 syre med samme polaritet), således at der frembringes en I

I tavs ændring. I 1

5.2. Indsættelse af de RS-virusfusionsprotein- eller G- I

I proteinkodende sekvenser i ekspressionsvektorer._ I

I 35 Den nucleotidsekvens, som koder for RS-virusfusions- I

I proteinet eller en del deraf eller for RS-virus-G-proteinet H

DK 175500 B1 I

15 I

eller en del deraf, indsættes i en hensigtsmæssig ekspres- I

sionvektor, dvs. en vektor, som indeholder de nødvendige I

elementer til transkriptionen og translationen af den ind- I

satte, proteinkodende sekvens. Ifølge en foretrukket udfø- I

5 relsesform for denne variant af opfindelsen indsættes nucleo- I

tidsekvenser, som koder for en neutraliserende og/eller I

fusionerende epitop i fusionsproteinet, i en hensigtsmæssigt I

ekspressionsvektor. Kodesekvensen kan forlænges ved enten I

5'- eller 3'-terminus eller begge termini til biosyntetisk I

10 forlængelse af polypeptidet, medens epitopen bibeholdes. I

Forlængelsen kan tilvejebringe en arm til binding, f.eks. I

til et mærkestof (se nedenfor) , til et bærestof eller en overflade. Forlængelsen kan tilvejebringe immunogenicitet, I som ellers kunne mangle i nogle af de kortere antigenpoly- I 15 peptider ifølge opfindelsen.

I En mangfoldighed af vært-vektor-systerner kan anvendes I til ekspression af den proteinkodende sekvens. Disse omfat- I ter, men er ikke begrænset til, pattedyrcellekulturer, såsom I ovariecelleværtskulturer fra kinesisk hamster, pattedyrcelle- I 20 systemer inficeret med virus (f.eks. vacciniavirus eller I adenovirus), insektcellesystemer inficeret med virus (f.eks.

I baculovirus) , mikroorganismer, såsom gær indeholdende gærvek- I torer, eller bakterier transformeret med bakteriophag-DNA, I plasmid-DNA eller cosmid-DNA. Ved en udførelsesform kan I 25 ekspressionsvektoren være en svækket, enteroinvaderende I bakterie, herunder, men ikke begrænset til, Salmonella spp., I enteroinvaderende E. coli (EIEC) og Shigella spp. En sådan I bakterie kan invadere tarmepithelvæv, spredes gennem det I reticuloendothalicale system og få adgang til metenterisk I 30 lymphevæv, hvor de formerer sig og fremkalder humoral og I cellemedieret immunitet. Ekspressionselementerne i disse I vektorer varierer i deres styrke og specificiteter. Afhængigt I af det anvendte vært-vektor-system kan et vilkårligt af en I række egnede transkriptions- og translationselementer anven- I 35 des. Når der klones i pattedyrcellesystemer, kan der f.eks.

I anvendes promotorer isoleret fra genomet i pattedyrceller

I DK 175500 B1 I

I 16 I

I (f.eks. musemetallothionienpromotor) eller fra vira, som I

I vokser i disse celler (f.eks. vacciniavirus 7.5K-promotor). I

I Promotorer produceret af rekombinant-DNA eller ved syntetisk I

I teknik kan også anvendes til tilvejebringelse af transkrip- I

5 tion af de indsatte sekvenser. I

Specifikke initieringssignaler er også nødvendige I

I til effektiv translation af indsatte, proteinkodende sekven- I

ser. Disse signaler omfatter ATG-initieringskodonen og til- I

I stødende sekvenser. I de tilfælde, hvor RS-virusfusions- I

I 10 proteingenet eller RS-virus-G-proteingenet, herunder dets I

I egen initieringskodon og tilstødende sekvenser, indsættes i I

I de hensigtsmæssige ekspressionsvektorer, kan det være unød- I

I vendigt med yderligere, translationelle kontrolsignaler. I I

I de tilfælde, hvor kun en del af den sekvens, som koder for I

I 15 RS-virusfusionsprotein eller G-protein, indsættes, skal I

I der imidlertid tilvejebringes exogene, translationelle kon- I

I trolsignaler, herunder ATG-initieringskodonen. Initierings- I

I kodonen skal ydermere være i fase med læserammen for de I

I proteinkodende sekvenser for at sikre translation af hele I

I 20 indsættelsen. Disse exogene, translationelle kontrolsignaler I

I og initieringskodoner kan være af mange oprindelser, både I

I naturlige og syntetiske. I

I En vilkårlig af de metoder, som tidligere er beskrevet I

I til indsættelse af DNA-fragmenter i en vektor, kan anvendes I

I 25 til konstruktion af ekspressionsvektorer indeholdende et I

I chimergen bestående af hensigtsmæssige, transkriptionelle/- I

I translationelle kontrolsignaler og de proteinkodende sekven- I

ser. Disse metoder kan omfatte rekombinant-DNA- og syntese- I

teknik in vitro og rekombinationer in vivo (genetisk rekombi- I

30 nation). I

Opfindelsen er ikke begrænset til anvendelsen af E. I

coli eller prokaryotiske ekspressionsvektorer. Ekspressions- I

vektorer, som kan anvendes, omfatter, men er ikke begrænset I

til, følgende vektorer eller deres derivater: human- eller I

35 dyrevira, såsom vacciniavira eller adenovira, insektvira, I

såsom baculovira, gærvektorer, bakteriophagvektorer og plas- I

DK 175500 B1 17 mid- og cosmid-DNA-vektorer, for blot at nævne nogle få.

I de tilfælde, hvor der som en ekspressionsvektor anvendes et adenovirus, er RS-virusfusionsproteingenet eller et fragment deraf eller RS-virus-G-proteingenet eller et 5 fragment deraf ligateret til et transkriptionelt/transla-tionelt adenoviruskontrolkompleks, f.eks. den sene promotor og tripartitledesekvenserne. Dette chimergen indsættes derefter i adenovirusgenomet ved rekombination in vitro eller in vivo. Indsættelse i en ikke-essentiel region af virusgenomet 10 (f.eks. region El eller E3) vil resultere i et rekombinant-virus, som er levedygtigt og i stand til at eksprimere proteinet med relation til RS-virusfusionsprotein eller G-protein i inficerede værtsorganismer. For øjeblikket er to stammer af adenovirus (typerne 4 og 7) godkendt og anvendt som vac-15 ciner for militært personel. Disse er primære kandidater til anvendelse som vektorer til ekspression af RS-virus-fusionsprotein- eller G-proteingenet og fragmenter deraf.

Desuden kan der vælges en værtscellestamme, som modulerer ekspressionen af de indsatte sekvenser eller modi-20 ficerer og behandler chimergenproduktet på den specielt ønskede måde. Ekspression ud fra visse promotorer kan forøges i nærværelse af visse induktorer (f.eks. zink- og cadmiumioner for metallothioneinpromotorer) . Derfor kan ekspression af det genetisk konstruerede RS-virusfusionsprotein eller 25 G-protein eller et fragment deraf kontrolleres. Dette er vigtigt, hvis proteinproduktet fra det klonede, fremmede gen er dødeligt for værtscellerne. Endvidere er modifikationer (f.eks. glycosylering) og behandling (f.eks. spaltning) af proteinprodukter vigtige for proteinets funktion. Forskel-30 lige værtsceller har karakteristiske og specifikke mekanismer for den post-translationelle behandling og modifikation af proteiner. Hensigtsmæssige cellelinier eller værtssystemer kan udvælges til at sikre den korrekte modifikation og behandling af det eksprimerede, fremmede protein.

35

I DK 175500 B1 I

I 18 I

I 5.3 Identifikation af rekombinantekspressionsvekorer, som I

I _kan replikere og eksprimere det indsatte gen._ I

I Ekspressionsvektorer indeholdende indsætninger af I

I fremmed gen kan identificeres ved 3 almene tilnærmelser: I

I 5 (a) DNA-DNA-hybridisering, (b) tilstedeværelse eller fravæ- I

I relse af "mærkestof"-genfunktioner og (c) ekspression af I

indsatte sekvenser. Ved den første tilnærmelse kan tilstede- I

I værelsen af et fremmed gen indsat i en ekspressionsvektor I

I påvises ved DNA-DNA-hybridisering ved anvendelse af sonder I

I 10 omfattende sekvenser, som er homologe til det fremmede, ind- I

I satte gen. Ved den anden tilnærmelse kan rekombinantvek- I

I tor/vært-systemet identificeres og udvælges baseret på til- I

I stedeværelsen eller fraværelsen af visse "mærkestof"-gen- I

I funktioner (f.eks. thymidinkinaseaktivitet, resistens mod I

I 15 antibiotika, transformationsphenotype eller occlusionslegeme- I

I dannelse i baculovirus) forårsaget af indsættelsen af frem- I

I mede gener i vektoren. Hvis f.eks. RS-virusfusionsproteinge- I

I net. eller et fragment deraf indsættes i mærkestofgensekven- I

I sen i vektoren, kan rekombinanter indeholdende det indsatte I

20 RS-virusfusionsprotein identificeres ved fraværelsen af I

I mærkestof genfunktionen. Ved den tredje tilnærmelse kan rekom- I

I binantekspressionsvektorer identificeres ved afprøvning af I

I det fremmede genprodukt, som eksprimeres af rekombinanten. I

I Sådanne afprøvninger kan været baseret på genproduktets I

I 25 fysiske, immunologiske eller funktionelle egenskaber. I

I Når først et specielt rekombinant-DNA-molekyle er I

I identificeret og isoleret, kan der anvendes adskillige meto- I

I der til dets formering, afhængigt af om en sådan rekombi- I

I nant udgør en selvreplikerende enhed (en replikon). En selv- I

I 30 replikerende enhed, f.eks. plasmider, vira og celler, kan I

mangfoldiggøre sig selv i det hensigtsmæssige cellemiljø I

og i hensigtsmæssige vækstbetingelser. Rekombinanter, som I

mangler en selvreplikerende enhed, må integreres i et mole- I

kyle med en sådan enhed for at blive formeret. F.eks. er I

35 det nødvendigt, at visse plasmidekspressionsvektorer efter I

indføring i en værtscelle integreres ind i cellechromosomet I

19 DK 175500 B1 for at sikre formering og stabil ekspression af rekombinant-genet. Når først et egnet værtssystem og vækstbetingelser er fastlagt, kan rekombinantekspressionsvektorer formeres og·fremstilles i en større mængde.

5 5.4. Identifikation og rensning af det eksprimerede genprodukt,:____ Når først en rekombinant, som eksprimerer RS-virus-fusionsproteingenet eller et fragment deraf eller RS-virus-10 G-proteinet eller et fragment deraf, er identificeret, skal genproduktet analyseres. Dette kan opnås ved afprøvninger baseret på produktets fysiske, immunologiske eller funktionelle egenskaber. Immunologisk analyse er især vigtig, hvor slutmålet er at anvende genprodukterne eller rekombi-15 nantvira, som eksprimerer sådanne produkter, i vaccineformuleringer og/eller som antigener ved diagnostiske immunoaf-prøvninger.

Eri mangfoldighed af antisera er til rådighed til analyse af produktets immunoreaktivitet, herunder, men ikke 20 begrænset til, monoclonalt L4-antistof, monoclonalt A5-anti-stof, polyclonale antisera imod renset fusionsprotein eller G-protein som beskrevet i afsnit 6. eller 9. nedenfor.

Proteinet bør være immunoreaktivt, uanset om det er resultatet af ekspressionen af hele gensekvensen, en del af 25 gelsekvensen eller to eller flere gensekvenser, som er ligateret til dirigering af produktionen af chimerproteiner.

Denne reaktivitet kan påvises ved immunologisk standardteknik, såsom radioimmunoudfældning, radioimmunkonkurrence eller immunopletdannelse.

30 Når først proteinet med relation til RS-virusfUsions- proteinet eller G-proteinet er identificeret, kan det isoleres og renses ved standardmetoder, herunder chromatografi (f.eks. ionbytnings-, affinitets- og størrelseskolonnechroma-tografi), centrifugering, forskellig opløselighed eller ved 35 en vilkårlig anden standardteknik til rensning af proteiner.

I DK 175500 B1 I

I 20 I

I 5.5. Bestemmelse af rekombinantproduktets immunostyrke. I

I Immunostyrken af produktet med relation til RS-virus- I

I fusionsprotein eller G-protein kan bestemmes ved overvågning I

I af forsøgsdyrs immunreaktion efter immunisering med det I

I 5 rensede protein, syntetiske peptid eller protein. I de til- I

fælde, hvor proteinet med relation til RS-virusfusionsprotein I

I eller G-protein, er eksprimeret ved hjælp af et smitsomt I

I rekombinantvirus, kan selve rekombinantviruset anvendes I

I til immunisering af forsøgsdyr. Forøgsdyr kan omfatte, men I

I 10 er ikke begrænset til, mus, rotter, kaniner, primater og i I

I den sidste ende menneskelige individer. Metoder til indføring I

I af immunogenet kan omfatte orale, intradaumale, intramusku- I

lære, intraperiteronale, intravenøse, subcutane, intranasale I

I eller vilkårlige andre standardveje til immuniseringer. I

I 15 Forsøgsindividernes immunreaktion kan analyseres ved tre I

tilnærmelser: (a) reaktiviteten af det resulterende immunse- I

rum mod autentiske RS-virusantigener, som afprøvet ved kendt I

teknik, f.eks. enzymbundet immunosorbentafprøvning (ELISA), I

immunopletdannelser og radioimmunoudfældninger, (b) evnen I

20 hos immunserumet til' neutralisation af RS-virussmitsomhed I

in vitro (se afsnit 6. nedenfor), (c) evnen hos immunserumet I

til inhibering af virusfusion in vitro (se afsnit 6. neden- I

for) og (d) beskyttelse imod RS-virusinfektion (se afsnit I

6. nedenfor). I

25 I

5.6. Formulering af en vaccine. I

Mange metoder kan anvendes til indgivelse af her I

beskrevne vaccineformuleringer til et dyr eller et menneske. I

Disse omfatter, men er ikke begrænset til, orale, intrader- I

30 male, intramuskulære, intraperitorinale, intravenøse, subcu- I

tane og intranasale veje. De sekretoriske IgA-antistoffer, I

som produceres af det slimhindeassocierede lymphevæv, kan I

spille en hovedrolle i beskyttelsen imod RS-virusinfektion I

ved at forhindre den indledende vekselvirkning mellem påtoge- I

35 nerne og slimhindeoverfladen eller ved at neutralisere de I

vigtige epitoper i patogenerne, som er involveret i infek- I

21 DK 175500 B1 tion eller spredning af sygdommen. Stimulering af slimhinde-immunreaktioner, herunder produktion af sekretoriske IgA-,antistoffer, kan være af væsentlig betydning ved bibringelse af beskyttelse imod infektion i den nedre og øvre luftvej.

5 Når der anvendes en levende rekombinantvirusvaccineformule-ring, kan den indgives via den naturlige infektionsvej for stamviruset af vildtypen, som er blevet anvendt til fremstilling af rekombinantviruset i vaccineformuleringen.

10 5.6.1 Underenhedsvaccineformuleringer.

De omhandlede proteiner og polypeptider med relation til en neutraliserende og/eller fusionerende epitop i fusionsproteinet i RS-virus er anvendelige som immunogener i en underenhedsvaccine til beskyttelse imod sygdom i den 15 nedre luftvej eller andre sygdomssymptomer på RS-virusinfektion. Underenhedsvacciner omfatter kun det relavante immuno-genmateriale, som er nødvendigt til immunisering af en værtsorganisme. Vacciner fremstillet ud fra genetisk konstruerede immunogener, kemisyntetiserede immunogener og/eller 20 immunogener, som omfatter autentisk, praktisk taget rent RS-virusfusionsprotein eller fragmenter deraf alene eller i kombination med på tilsvarende måde fremstillet RS-virus-G-protein eller fragmenter deraf, som er i stand til at udløse en beskyttende immunreaktion, er især fordelagtige, 25 fordi der ikke nogen risiko for infektion af modtagerne.

Derfor kan proteiner og polypeptider med relation til RS-virusfusionsprotein og/eller G-protein renses fra rekombinanter, som udtrykker de neutraliserende og/eller fusionerende epitoper. Sådanne rekombinanter omfatter alle 30 de ovenfor beskrevne bakterietransformanter, gærtransfor-manter, dyrkede celler inficeret med rekombinantvira eller dyrkede pattedyrceller, såsom ovarieceller fra kinesisk hamster, som eksprimerer RS-virusfusionsproteinepitoperne (se afsnit 5.3. ovenfor). Desuden omfatter rekombinanterne 35 rekombinantsvækkede, enteroinvaderende bakterier indeholdende en DNA-sekvens, som koder en neutraliserende og/eller

I DK 175500 B1 I

I 22 I

fusionerende epitop af respiratorisk syncytialt virusfusions- I

protein eller en neutraliserende epitop af respiratorisk I

fl syncytialt virus-G-protein. Sådanne rekombinanter fremstilles I

B ved anvendelse af metoder, som er mage til dem, som er be- I

B 5 skrevet i US patentansøgning nr. 104.735. Disse rekombinant- I

B svækkede, enteroinvaderede bakterier er især egnet til orale I

B vaccineformuleringer. Rekombinantproteinet eller -polypepti- I

B derne kan omfatte mange kopier af den epitop, som har inter- I

B esse. I

B 10 Ved en alternativ udførelsesform kan proteinet eller I

B polypeptidet med relation til RS-virusfusionsproteinet eller I

G-proteinet isoleres i praktisk taget ren form ud fra RS- I

virus eller cellekulturer inficeret med RS-virus (se f.eks. I

6.1. eller 10. nedenfor). I

I 15 Uanset fremstillingsmetoden indstilles proteinet I

eller polypeptidet med relation til RS-virusfusionsproteinet I

B eller G-proteinet på en hensigtsmæssig koncentration, og I

B det kan formuleres med ethvert egnet vaccinehjælpestof. I

B Polypeptiderne og proteinerne kan almindeligvis formuleres I

B 20 i koncentrationer på mellem 0,1 /^g og 100 μς pr. kg/værtsor- I

B ganisme. Fysiologisk acceptable medier kan anvendes som I

B bærestoffer. Disse omfatter, men er ikke begrænset til, I

B f.eks. sterilt vand, saltopløsning og phosphatpufret saltop- I

løsning. Egnede hjælpestoffer omfatter, men er ikke begrænset I

25 til, overfladeaktive stoffer, f.eks. hexadecylamin, octa- I

decylamin, octadecylaminosyreestere, lysolecithin, dimethyl- I

dioctadecylammoniumbromid, N,N-dioctadecyl-Ν'-N-bis-(2-hydro- I

I xyethyl-ethyl-propandiamin) , methoxyhexadecyglycerol og I

pluroniske polyol er,· polyaminer, f.eks. pyran, dextransulfat, I

30 "poly IC", polyacrylsyre, carbopol; peptider, f.eks. muramyl- dipeptide, dimethylglycin, tuftsin; olieemulsioner og mineralgeler, f.eks. aluminiumhydroxid og aluminiumphosphat. Immunogenet kan også være inkorporeret i liposomer eller konjugeret til polysaccharider og/eller andre polymere til 35 anvendelse i en vaccineformulering.

Ved endnu en udførelsesform for denne variant af 23 DK 175500 B1 opfindelsen er proteinet eller polypeptidet med relation til RS-virusfusionsprotein en hapten, dvs. et molekyle, som er antigent, idet det reagerer specifikt eller selektivt med cognatantistof fer, men det er ikke immunogent, idet 5 det ikke kan udløse en immunreaktion. I et sådant tilfælde kan haptenen være covålent bundet til et bærestof eller immunogent molekyle, og f.eks. vil et stort protein, såsom proteinserumalbumin, give den hapten, som er koblet dertil, immunogenicitet. Hapten-bærestoffet kan være formuleret til 10 anvendelse som en underenhedsvaccine.

De omhandlede polypeptider og proteiner kan anvendes, når de er bundet til et egnet, makromolekylært bærestof. Fortrinsvis er bærestoffet og polypeptiderne og proteinerne på over 5.000 dalton efter binding. Mere foretrukket er 15 bærestoffet over 5 kilodalton. Fortrinsvis er bærestoffet en polyaminosyre, enten naturlig eller syntetisk, som er immunogen i dyr, herunder mennesker. Bindingsmåden er konventionel. Mange bindingsteknikformer er beskrevet i US patentskrift nr. 4.629.783, hvortil der her skal henvises. Mange 20 tværbindingsmidler er beskrevet i 1986-87 Handbook And General Catalog, Pierce Chemical Company (Rockford, Illinois), side 311-340, hvortil der her skal henvises.

Ved endnu en udførelsesform for denne variant af opfindelsen omfatter immunogenet i vaccineformuleringen en 25 blanding af polypeptider og proteiner med relation til RS-virusfusionsproteinet og G-proteinet i en eller flere virusundertyper .

6^_Beskyttelse af dvr: RS-virusfusionsprotein.

30 6.1. Almene metoder.

6.1.1. Isolering af fusionsprotein.

Praktisk taget rent RS-virusfusionsprotein, som er egnet til anvendelse som et immunogen i en underenhedsvacci-neformulering, fremstilles i alt væsentligt ved metoden 35 ifølge Walsh et al., 1985, J. Gen. Virol. 66, 409-415. Renset protein er blevet fremstillet ud fra 3 forskellige virusstam-

I DK 175500 B1 I

I 24 I

I mer, herunder Long, A2 og 18537, og fra to forskellige celle- I

I linier, HEp-2 (ATCC nr. CCL23) og Vero (ATCC nr. CCL81). I

I Proteinet stammende fra alle kilder er kraftigt immunogent I

I og giver, når det anvendes som immunogen, antistof, som er I

5 virusneutraliserende og -antifusionerende. Den elektrofore- I

I tiske opførsel af det rensede protein stammende fra Long- I

I stammen af virus i HEp-2-celler kan ses i figur 2 under I

I flere denatureringsbetingelser. Proteinet er praktisk taget I

I frit for forurenende virus- eller celleproteiner. I

I 10 Det som ovenfor beskrevet rensede fusionsglycoprotein I

viser sig at have lipid covalent associeret med F^underenhe- I

I den. Dette er blevet påvist ved infektion af Vero-celler I

I med A2-stammen af RS-virus og mærkning af kulturene med I

I (9,10-3H]-palmitinsyre. Det rensede protein er blevet påvist I

I 15 at have 3H-palmitinsyre associeret med den dimere proteinform I

på 140.000 dalton baseret på PAGE og autoradiografi. Endvide- I

I re har behandling af fusionsproteinet med varme alene eller I

I med varme + reduktion af disulfidbindinger vist, at 3H-palmi- I

I tinsyren er associeret med proteinformerne på 70.000 og I

I 20 48.000 dalton (Fj^-underenhed) . I

I Når 3H-palmitinsyremærket protein ekstraheres med I

I chloroform:methanol {2:1, vægt/vægt), forbliver næsten al I

mærkningen associeret med proteinet og ekstraheres ikke som I

frit lipid over i chloroform:methanol. Derfor er palmitinsy- I

25 ren covalent tilknyttet. Når proteinet først behandles med I

1M hydroxylamin ved pH-værdi 7,0, ekstraheres palmitinsyren I

derefter over i chloroform .-methanol. Protein-lipidbindingen I

brydes derfor af hydroxylamin, vilket viser en covalent I

esterbinding. Da bindingen brydes ved neutral pH-værdi, er I

30 en thioesterbinding via cystein på proteinet den mest sand- I

synlige binding, selvom andre esterbindinger har kunnet dan- I

nes. I

Desuden antyder foreløbige forsøg, at myristinsyre I

også er til stede i RS-virus-F-proteinet. Renset F-protein I

35 hydrolyseres i 1 M methanolisk HCl ved 80°C i 24 timer, I

frigivet lipid ekstraheres over i hexan og analyseres ved I

25 DK 175500 B1 gaschromatografi (GO (Perkin Elmer 8500) ved anvendelse af en kolonne med brændt siliciumoxid bundet med methylsilicon.

De opnåede GC-spektra viser tilstedeværelsen af myristinsyre på det rensede F-protein.

5 Carbonhydratnaturen af det rensede fusionsprotein, som er opnået som ovenfor beskrevet, er også blevet karakteriseret. Det rensede protein stammende fra Long-stammen af RS-virus opnået fra inficerede HEp-2-celler er blevet analyseret som følger: Det rensede protein methanolyseres med 10 HCl-holdigt methanol, acetyleres fuldstændigt, O-deacyleres og per-O-(trimethylsilyl)-eres til sidst. Sukkerresterne identificeres og kvantificeres ved gas-væske-chromatografi (Reinhold, 1972, Methods in Enzymology, 25, 244-249). Proteinet viser sig at indeholde 5,75% totalt carbonhydrat efter 15 vægt. Sukkersammensætningen i procent af det totale sukker er: 11,5% fucose, 3,3% xylose, 26,2% mannose, 9,8% galactose, 9,8% glucose og 39,3% N-acetylglucosamin.

6.1.2 Afprøvninger 20 6.1.2,1. Virusneutralisationsaforøvning.

Virusneutralisationsafprøvninger er blevet gennemført som følger:

Forsøgsserumprøver og positive kontrolserum varme-inaktiveres ved 56°C i 30 minutter. Forsøgsprøver seriefor-25 tyndes. Derefter fortyndes alle sera med samme volumen indeholdende ca. 50 plaquedannende enheder (PFU) af RS-virus og inkuberes ved 37°C i 1 timer. En pulje af sera fra voksne, som tidligere er blevet karakteriseret ved enzymirrcnunoafprøv-ning, neutralisation og antifusionsafprøvninger, anvendes 30 som positiv kontrol. Sera, som tidligere er blevet karakteriseret, og som vides at være ikke-immune, anvendes som negativ kontrol.

Hver enkelt inkuberet serum-virus-blanding podes på HEp-2-celler (ATCC nr. CCL23) i et separat hul i plader med 35 24 huller, og virusadsorption får lov at finde sted i 2 timer ved 37°C. Podningerne fjernes. Cellemonolagene vaskes

I DK 175500 B1 I

I 26 I

I og overhældes med modificeret Eagle's medium plus 5% okse- I

I fosterserum og 1% "Sephadex^" og inkuberes ved 37°C i 3 I

I døgn. Det overliggende medium fjernes, og cellerne vaskes med I

I phosphatpufret saltopløsning (PBS) .. I

I 5 1 ml afkølet PBS-methanol-opløsning (1:5) sættes til I

I hvert hul, og cellerne fikseres i 30 minutter ved stuetempe- I

I ratur. PBS-methanol-fikseringsmidlet fjernes, og der tilsæt- I

I tes pr. hul 1 ml 5%'s "Carnation·^" mælkepulver i PBS, pH I

I 6,8 ("BLOTTO"). Pladen inkuberes i 30 minutter ved 37°C. I

I 10 "BLOTTO" fjernes. Der tilsættes ml pr. hul af mono- I

I clonale antistoffer imod RS-virus (i forvejen titreret og I

I fortyndet med "BLOTTO" til en arbejdskoncentration), og I

I pladen inkuberes ved 37°C i 1 time. Antistofferne fjernes, I

I og de fikserede celler vaskes 2 gang med "BLOTTO", 30 minut- I

I 15 ter ad gangen.

Der tilsættes % ml/hul med peberrodperoxidasekonju- I

I geret gede-anti-muse-IgG (fortyndet 1:250 i "BLOTTO"), og I

I pladen inkuberes i 1 time ved 37°C. Gedeantistofferne fjer- I

I nes, og de fikserede celler vaskes igen 2 gange med "BLOTTO", I

I 20 30 minutter ad gangen. I

I Der tilsættes M ml/hul af en peroxidasesubstratopløs- I

ning (0,05% 4-chlor-l-naphthol, 0,09% H202 i PBS, pH 6,8), I

og farven får lov at udvikles i 15-30 minutter ved stuetempe- I

ratur. Substratopløsningen fjernes, og hullerne vaskes med I

25 vand og lufttørres. Antallet af plaque i hvert hul bestemmes. I

Neutralisationsevnen hos en forsøgsserumprøve udtryk- I

kes som den fortynding, som resulterer i en 60%'s nedsættelse I

i plaquedannelse sammenlignet med ikke-immunkontrolserum, I

udtrykt pr. ml serum. I

30 I

6.1.2.2. Anti-fusionsafprøvning. I

Anti-fusionsafprøvninger gennemføres som følger: I

HEp-2-celler i plader med 48 huller inficeres med I

RS-virus ved 25 PFU/hul i 6 timer ved 37°C. Efter infektion

35 erstattet kulturmediet med frisk kulturmedium indeholdende I

0,1% monoclonale K6-antistoffer (sterilfiltreret ascitesflui- I

27 DK 175500 B1 dum) og enten en varmeinaktiveret forsøgsserumprøve eller et varmeinaktiveret, ikke-immunt kontrolserum. Monoclonalt K6-antistof er specifikt for G-glycoprotein i RS-virus. Tilstedeværelsen af K6 i kulturmediet forhindrer virusspred-5 ning via kulturmediet. "SephadexA" tilsættes til en slutkon-centration på 1%, og pladen inkuberes i 3' døgn ved 37°C. Kulturmediet fjernes, og cellerne vaskes med PBS.

1 ml afkølet PBS-methanol-opløsning (1:5) sættes til hvert hul, og cellerne fikseres i 30 minutter ved stuetempe-10 ratur. PBS-methanol-fikseringsmidlet fjernes, og der tilsættes pr. hul 1 ml 5%'s "CarnationA" mælkepulver i PBS, pH

6,8 ("BLOTTO"). Pladen inkuberes i 30 minutter ved 37°C.

"BLOTTO" fjernes. Der tilsættes H ml pr. hul af mono-clonale antistoffer imod RS-virus (i forvejen titreret og 15 fortyndet med "BLOTTO" til en arbejdskoncentration), og pladen inkuberes ved 37°C i 1 time. Antistofferne fjernes, og de fikserede celler vaskes 2 gang med "BLOTTO", 30 minutter ad gangen.

Der tilsættes % ml/hul med peberrodperoxidasekonju-20 geret gede-anti-muse-IgG {fortyndet 1:250 i "BLOTTO"), og pladen inkuberes i 1 time ved 37°C. Gedeantistofferne fjernes, og de fikserede celler vaskes igen' 2 gange med "BLOTTO", 30 minutter ad gangen.

Der tilsættes M ml/hul af en peroxidasesubstratopløs-25 ning (0,05% 4-chlor-l-naphthol, 0,09% H2O2 i PBS, pH 6,8), og farven får lov at udvikles i 15-30 minutter ved stuetemperatur. Substratopløsningen fjernes, og hullerne vaskes med vand og lufttørres.

Antallet og den typiske størrelse af plaque i hullet 30 svarende til den ikke-immune kontrolserumprøve bestemmes. Antallet af plaque af tilsvarende størrelse bestemmes derefter for de huller, som svarer til forsøgsserumprøverne. Anti-fusionstiteren af en forsøgsserumprøve udtrykkes som den fortynding, som giver en 60%'s formindskelse i talte 35 plaque ved sammenligning med ikke-immunt kontrolserum, udtrykt pr. ml serum.

I DK 175500 B1 I

I 28 I

I 6.1.2.3. Enzvmimmunoafprøvning (EIA). I

I Antistoftiter i serumprøver bestemmes ved anvendelse I

I af en enzymimmunoafprøvning {EIA) gennemført som følger: I

RS-virusfusionsprotein fortyndes til 200 nanogram/ml I

I 5 i carbonat-bicarbonat-puffer, pH 9,6. 100 μΐ af det fortynde- I

I de antigen sættes til hvert hul i rækkerne B-G i en fladbun- I

I det "Nunc^1 -prøveplade med 96 huller. I rækkerne A og Η I

I sættes der til hvert hul 100 μΐ carbonat-bicarbonat-puffer I

I alene. Pladen tildækkes og inkuberes i 2 timer ved 37°C med I

I 10 omrystning og opbevares derefter natten over ved 4°C til I

I immunobilisering af antigenet. I

I De ovenstående væsker fjernes fra "NuncA"-prøvepladen, I

I og pladen vaskes med 0,1% "TweenA"/PBS, pH 7,4, og tørres I

I ved dupning. I

I 15 3 antistofprøver afprøves på hver plade. Hver prøve I

I fortyndes først til en primær fortynding i 0,2% "TweenA", I

I 0,1 M EDTA/PBS, pH 7,5 (0,2%'s TWN). De primære fortyndinger I

I seriefortyndes yderligere som følger i en "FalconA"-plade I

I med 96 huller med U-bund: I

I 20 (a) De primære fortyndinger af prøver podes i række 2 I

I med 200 μΐ/hul. Prøve 1 podes 3 gange, f.eks. i hul- I

I lerne A2, B2 og C2, prøve 2 podes dobbelt, f.eks. i I

I hullerne D2 og E2. Prøve 3 podes tredobbelt, f.eks. I

I i hullerne F2, G2 og H2. I

I 25 (b) 100 μΐ 0,2%’s TWN podes i hvert hul i rækkerne 3-12. I

I (c) Seriefortyndinger frembringes ved i rækkefølge at I

I overføre 100 μΐ fra et hul i række 2 til det tilsva- I

I rende hul i række 3 (f.eks. B2 til B3, C2 til C3) , I

I et hul i række 3 til det tilsvarende i række 4, indtil I

I 30 række 12 nås. I

I (d) Til række 1 sættes der 100 μΐ 0,2%'s TWN til hvert I

I hul som kontrol. I

I 100 μΐ af de primære fortyndinger overføres fra hvert I

I hul på "FalconA" -pladen til det tilsvarende hul i "NuncA"- I

I 35 pladen, f.eks. A2 ("FalconA") til A2 C'NuncA") . "NuncAn- I

I prøvepladen tildækkes og inkuberes i 1 time ved 37°C under I

DK 175500 B1 29 omrystning. De ovenstående væsker fjernes fra prøvepladen, og pladen vaskes med 0,1% "TweenA"/PBS og tørres ved dupning.

Gede-anti-muse-IgG-alkalisk phosphatase-kohjugat ("TAGO") fortyndes med 0,3% "TweenA,,/PBS, pH 7,0 (0,3%'s 5 TWN) til en arbejdsfortynding, f.eks. 1:1500. Det fortyndede konjugat (100 μΐ) sættes til hvert hul i rækkerne 2-12. Til række 1 sættes 100 μΐ 0,3%'s TWN til hvert hul som kontrol. Pladen tildækkes og inkuberes i 1 time ved 37°C under omrystning. Derefter fjernes podningen, og pladen vaskes med 10 0,1% "TweenA,,/PBS, pH 7,4, og tørres ved dupning.

Til hvert enkelt hul sættes 100 μΐ substratopløsning, 1 mg/ml i diethanolaminpuffer, pH 9,8 .(" SIGMAA-104 ") . Den enzymatiske reaktion får lov at finde sted ved stuetemperatur i 1 time. Derefter standses reaktionen, ved at der til hvert 15 hul sættes 100 μΐ 3N NaOH. Udstrækningen af enzymatisk reaktion bestemmes ved aflæsning af den optiske tæthed ved 410 nanometer.

Rækkerne A og H tjener som negative kontroller, fordi der intet antigen er til stede, og række 1 tjener ligeledes 20 som negativ kontrol, fordi der ingen antistoffer er til stede.

6.2. Beskyttelse af dvr: Homolog oa heterolog beskyttelse.

Ved et forsøg opdeles 18 bomuldsrotter (Sigmodon 25 bisporus) i 6 grupper på 3 dyr hver. I ugerne 0, 2 og 4-5 immuniseres dyrene aktivt ved intramuskulær injektion af 10 μg RS-virusfusionsprotein (140.000 dalton), bortset fra gruppe 6, som kun får 5 μg protein, i forskellige hjælpestof-• fer: Gruppe 1 PBS, gruppe 2 IFA, gruppe 3 ISCOM og gruppe 4 30 alun. Gruppe 5 får intramuskulære injektioner af PBS alene og tjener som kontrolgruppe. Gruppe 6 får intramuskulære injektioner af RS-virusfusionsprotein, som i forvejen er reduceret ved anvendelse af β-mercaptoethanol, men uden noget hjælpestof.

35 Serologiafprøvninger er blevet gennemført som be skrevet i afsnit 6.1.2. ovenfor på serumprøver opnået i

I DK 175500 B1 I

I 30 I

I ugerne 6-7. Resultaterne er vist i tabel I. I

I Dyrene inficeres mellem ugerne 6 og 7 med 1 x 104 I

I PFU-RS-virus. Lungerne høstes på 4. dagen efter infektion. I

I Tilstedeværelsen og/eller mængden af RS-virus i lungevæv I

I 5 bestemmes. På 4. dagen efter infektion udtages lunge- og I

næseturbinaterne fra dyrene og homogeniseres i 1-2 ml virus- I

I transportmedium (MEM, 5% FBS, 2mM glutamin, 20 mM HEPES, I

I 10% SPG). Efter centrifugering seriefortyndes de ovenstående I

væsker og påføres på HEp-2-celler i vævskulturplader med 24 I

I 10 huller, og viruset dyrkes. Plaque identificeres som beskrevet I

I i afsnit 6.1.2.1. (virusneutralisationsafprøvning) og udtryk- I

I kes pr. gram væv. Resultaterne er ligeledes vist i tabel I. I

I Tabel I . I

I 15 Immunogenicitet af RSV-fusionsprotein hos bomuldsrotter I

I Gruppe nr. I

I (adjuvans)a _Serologi^_ Beskyttelse0 I

I EIA Virus- I

I 20 neutra- Anti- Virus I

I _._lisation fusion til stede Titer I

I Gruppe 1 I

I (PBS) 6,2 4,4 2,0 0 0 I

I 25 I

I Gruppe 2 I

I (IFA) 7,3 5,1 2,9 00

I Gruppe 3 I

I 30 (ISCOM) 7,4 4,5 2,6 0 0 I

I Gruppe 4 I

I (ALUN) 7,1 5,2 2,7 0 0 I

35 Gruppe 5 I

(konrol) <1,0 <2,0 <1,0 3 4,8 I

Gruppe 6 I

(intet) 4,9 2,3 2,4 3 1,1 I

40 I

a Gruppe 6 får fusionsprotein behandlet med β-mercap- I

toethanol og intet hjælpestof. I

b Afprøvninger er gennemført på prøver fra uge 7. Resulta- I

terne repræsenterer den geometriske middeltiter for 3

45 dyr udtrykt i log^o enheder. Forsøgsdetaljer findes i I

31 DK 175500 B1 teksten.

c Tre dyr i hver af grupperne 1-5 og 4 dyr i gruppe 6 inficeres i ugerne 6-7, og lungerne høstes på 4. dagen efter infektion. Virus isoleres fra lungevævene. "Virus 5 til stede" repræsenterer det antal dyr i hver gruppe, hvor virus har kunnet påvises. "Titer" repræsenterer den geometriske middeltiter (PFU/g væv) af virus isoleret fra lungevævet.

Som vist i tabel I udløser immunisering med RS-virus-10 fusionsprotein produktion af antistoffer, som er effektive til virusneutralisation og til forhindring af fusion. Desuden viser de i tabel I illustrerede resultater tydeligt, at lungevæv fra immuniserede dyr er effektivt beskyttet imod efterfølgende RS-virus infektion.

15 Når fusionsproteinet behandles (reduceres) med S- mercaptoethanol, dissocieres underenhederne, hvilket giver frit Fi og F2. Når bomuldsrotter immuniseres med 5 μς af det reducerede protein uden hjælpestof, producerer de også antistof, som er neutraliserende og har antifusionsaktivitet 20 (se tabel I, gruppe 6) , selv om niveauet af disse aktiviteter er nedsat. På tilsvarende måde er lungerne hos disse dyr praktisk taget beskyttet mod infektion, imidlertid med mindre effektivitet. Derfor er underenhederne af fusionsglycoprote-inet, når de i dissocieret form præsenteres for immunsy-25 stemet, i stand til at frembringe beskyttende immunitet. Man må også lægge mærke til, at -underenheden, som indeholder den hydrofobe membranankerregion, under disse betingelser vil aggregere under dannelse af multimere med højere molekylvægt, som kan forøge immuniteten.

30 Humant RS-virus er underdelt i to undertyper, A og B. Fusionsproteinerne fra begge undertyper deler antigene determinanter, og disse determinanter er kraftigt bevaret blandt RS-virusstammer. Derfor er der blevet gennemført en række forsøg til bestemmelse af, om immunisering med F-pro-35 tein fra den ene undertype af humant RS-virus vil give beskyttelse imod infektion med begge undertyper af humant RS-

I DK 175500 B1 I

I 32 I

I virus. I

I I denne forsøgsrække er 30 bomuldsrotter blevet opdelt I

I i 4 grupper forsøgsdyr og 4 grupper kontroldyr. I ugerne 0, I

I 2 og 4 er forsøgsdyrene blevet aktivt immuniseret ved intra- I

I 5 muskulær infektion af 10 ^g humant RS-virusfusionsprotein I

I (140.000 dalton) opnået fra RS-virus stamme A2, en virus af I

I undertype A. Kontroldyr immuniseres på tilsvarende måde med I

I placeboimmunogen, dvs. PBS. I

I Serologiafprøvninger gennemføres som beskrevet i I

I 10 afsnit 6.1.2. ovenfor til afprøvning af virusneutralisati- I

I onsevnen og anti-fusionsevnen hos de frembragte antistoffer I

I imod begge undertyper A og B i humant RS-virus. Immunisering I

I med RS-virusfusionsprotein af undertype A frembringer anti- I

I stoffer, som udviser ens neutralisations- og anti-fusionsak- I

I 15 tiviteter imod begge undertyper A og B af RS-virus (data I

I ikke vist). I

I Alle forsøgs- og kontroldyr inficeres intranasalt i I

I uge 6 med humant RS-virus som følger: gruppe 1 får stamme I

I A2 (undertype A) 6,2 log 10 PFU, gruppe 2 får Long-stamme I

I 20 (undertype A) 6,1 log 10 PFU, gruppe 3 får stamme 9320 (un- I

I dertype B) 3,5 log 10 PFU, og gruppe 4 får stamme 18537 I

I (undertype B) 5,0 log 10 PFU. 4 dage efter infektionen ind- I

I høstes lungerne, og virustiteren bestemmes som ovenfor be- I

I skrevet. Resultaterne er vist i tabel II. I

I 25 I

I Tabel II . I

I Beskyttelseseffektivitet af fusiohsproteinvaccine imod for- I

I skellige undertyper af RSV_ I

I 30 Infektionsvirus Lungetiter (GMT)b I

I Gruppe nr.a_(undertype)_ Forsøqc_Kontrold

I 1 A2 (A) 1,1 5,0 I

I 2 Long (A) 1,1 4,0* I

I 35 3 9320 (B) 1,43 5,1* I

I 4 18537 (B) 1,1 3,5 I

33 DK 175500 B1 a Forsøgsdyr i hver gruppe immuniseres i uge 0, 2 og 4 med 10 Mg F-protein renset fra RS-virus, stamme A2, undertype A. Kontroldyr i hver gruppe får på samme måde PBS som immunogen. Alle dyr inficeres i uge 6 med 5 RS-virus. Forsøgsdetaljer findes i teksten.

k "Lunge titer (GMT)" repræsenterer den geometriske mid-deltiter (PFU/g væv) af virus isoleret fra lungevæv. c N = 5.

^ N = 3, bortset fra *, som betegner N = 2.

10 Som vist i tabel II frembringer immunisering med fusionsprotein fra en virusstamme af undertype A signifikant beskyttelse imod både et homologt virus af undertype A og et heterologt virus af undertype B i alle tilfælde. Det er derfor klart, at immunisering med F-protein fra den ene 15 undertype af RS-virus giver beskyttelse imod begge undertyper af humant RS-virus.

6.3. Beskyttelse af bavianer.

12 unge bavianer opdeles i 3 grupper med 4 dyr i 20 hver. Dyrene injiceres intramuskulært med 20 Mg renset RS-virusfusionsprotein med mellemrum på 1 måned i 3 måneder som følger: Gruppe 1 får immunogen i PBS, gruppe 2 får immunogen i alun, og gruppe 3 får PBS alene (kontrolgruppe).

Serologiafprøvninger gennemføres 2 uger efter den 25 tredje immunisering som beskrevet i afsnit 6.1.2. ovenfor. Resulaterne er vist i tabel III.

2 uger efter immunisering inficeres 3-4 dyr pr. gruppe med 5,32 PFU af RS-virus, stamme A2, ved direkte podning ned i lungerne. Lungeudskylninger afprøves på dag 2 efter 30 infektion. Lungeudskylninger opnås ved dirkte overføring af medium ned i lungerne og opsamling ved udsugning via rør.

Virus titreres som beskrevet i afsnit 6.2. ovenfor. Resultaterne er ligeledes vist i tabel III.

I DK 175500 B1 I

I 34 I

I Tabel III I

Immunogenicitet af RSV-fusionsprotein hos bavianer I

I Gruppe nr. I

I immunoaen fadiuvans) Serologi^· Virusprove^ I

I 5 ..EIA Virus- ' I

I neutra- Anti- I

I _lisation fusion + - titer I

I Gruppe 1 (PBS) 5,01 2,5 1,83 31 1,05 I

I 10 Gruppe 2 (ALUN) 6,0 3,34 2,56 04 0,00 I

I Gruppe 3 (kontrol) <1,0 <2,0 <1,0 30 2,14 I

I a Afprøvninger gennemføres 2 uger efter den.sidste (tred- I

I je) immunisering. Resulaterne repræsenterer den geome- I

I triske middeltiter af 4 dyr udtrykt i log^Q-enheder. I

I 15 Forsøgsdetaljer findes i teksten. I

I b RS-virus, stamme A2, (5,32 PFU), podes direkte ned i I

I lungerne på 3-4 immuniserede dyr i hver gruppe 2 uger I

I efter immunisering. Lungeudskylninger afprøves på dag I

I 2 efter infektion. "+" repræsenterer antallet af dyr I

I 20 med påviseligt RS-virus i lungeudskylningerne. I

I repræsenterer antallet af dyr uden påviseligt RS-virus I

I i lungeudskylninger. "Titer" er udtrykt som den geome- I

I triske middeltiter "PFU/g væv" af virus isoleret fra I

I lungevæv. I

I 25 Som vist i tabel III udløser immunisering af unge I

I bavianer med renset RS-virus antistoffer, som er i stand til I

I at neutralisere virus og forhindre fusion. Som det ligeledes I

I tydeligt er vist, er immuniserede dyr beskyttet imod efter- I

I · følgende RS-virusinfektion, når alun anvendes som hjælpestof I

I 30 (gruppe 2). I

I en anden forsøgsrække er unge bavianer blevet opdelt I

. i et antal grupper og immuniseret ved intramuskulær injektion I

af renset RS-virusfusionsprotein som følger: 4 dyr får 5 /zg I

immunogen i alun, og 11 dyr får 2 0 μg immunogen i alun på I

35 dagene 0, 28 og 56, 6 dyr får 100 /zg immunogen i alun på

dag 0, 20 μg på dag 28 og 20 μg på dag 56. 12 dyr for PBS I

alene på dagene 0, 28 og 56 og tjener som kontroller. Alle I

35 DK 175500 B1 dyr inficeres med over 106 PFU af RS-virus, stamme A2, på dag 70 ved direkte podning ned i lngerne. Lungeudskylninger opsamles som ovenfor beskrevet på dagene 2, 3 og 4 efter infektion. Resultater fra denne forsøgsrækkke er opsummeret 5 i tabel IV.

Tabel IV

Resume af bavianbeskvttelse RSV-isolering fra lungeudskvlninger^

Immunogen_N_(_+J_(jJ_Titer F (alun) 21 2 19 <0,7 PBS 12 12 0 3,0 a "{+)" repræsenterer det antal bavianer, hvor der er påvist RS-virus i lungeudskylninger. repræsen- 15 terer det antal bavianer, hvor der intet RS-virus er påvist i lungeudskylninger. "Titer" er udtrykt som den geometriske middeltiter (PFU/ml væv) af virus isoleret fra lungeudskylninger.

Som opsummeret i tabel IV er bavianer blevet effektivt 20 beskyttet imod RS-virusinfektion ved immunisering med RS-virusfusionsprotein. Under immuniseringen og de efterfølgende infektionsforsøg har blodkemi og hæmatologiske afprøvninger ikke vist nogen tegn på uheldige reaktioner under hele forløbet af forsøgene.

25 6.4. Beskyttelses imod okse-RS-virus.

Et råt præparat af humant RS-virusfusionsprotein (her betegnet "råt, humant RS-virus-F-protein") fremstilles som følger: Vero-celler inficeret med RS-virus, stamme A2, 30 ekstraheres med en opløsning indeholdende 50 mM Tris, 0,15 M NaCl, 1% "TritonA X-100" og 2% deoxycholat, pH 7,4 (lyse puffer). F-proteinet fås fra det forbrugte cellekulturmedium ved opløseliggørelse af PEG-pelleteret virus ved anvendelse af lysepufferen. Det resulterende, rå præparat renses ved 35 centrifugering. Et immuniaffinitetsrenset præparat fremstilles som beskrevet i afsnit 6.1.1.

15 køer deles i 5 grupper med 3 dyr i hver. Dyrene

I DK 175500 B1 I

i 36 i

injiceres intramuskulært med humant RS-virusfusionsprotein I

I på dagene 0 og 21 som følger: Gruppe får råt, humant RS- I

I virus-F-protein (5 MS) , gruppe 2 får råt, humant RS-virus- I

I F-protein (20 Mg), gruppe 3 får renset, humant RS-virus-F- I

I 5 protein (20 Mg), gruppe 4 får en USDA godkendt okse-RS-virus- I

I vaccine, som er kommercielt tilgængelig fra Diamond Scienti- I

I fic Co. (Des Moines, Iowa) (2 ml på dagene 0 og 21), og I

I gruppe 5 får PBS alene (kontrol). I

I EIA gennemføres på serumprøver opnået på dagene 0, I

I 10 10, 21 og 33 efter immunisering som beskrevet i afsnit 6.1.2. I

I ovenfor med F-protein fra RS-virus, stamme A2, som antigen. I

I Resultaterne er vist i tabel V. I

I Tabel V I

I 15 Immunogenicitet af RSV-fusionsprotein hos køer. I

I Serology (EIA) I

I Immunogena Dag I

I 0 10 21 33 1

I 20 - I

I HRSV-F-protein (5 Mg)* - - 3,6 (2/3) 5,8 I

I HRSV-F-protein (20 Mg)* - 3,8 (2/3) 4,2 (3/3) 6,2 I

I HRSV-F-protein (20 μς) - 3,8 (2/3) 4,6 (2/3) 5,9 I

I Diamond-vaccine (BRSV) 2,2 (1/3) 3,0 (1/3) 3,5 (2/3) 4,7 I

I 25 PBS I

I a Køerne immuniseres på dagene 0 og 21 med enten råt (*) I

I eller immunoaffinitetsrenset F-protein, og immugenicite- I

I ten sammenlignes med den hos den kommercielt tilgænge- I

I lige, USDA godkendte BRSV-vaccine (Diamond Scientific I

I 30 Co.-vaccine). Detaljer findes i teksten. I

I b Resultaterne repræsenterer den geometriske middeltiter I

I fra 3 dyr udtrykt i log^o-enheder. Forholdet i parente- I

I serne er antallet af ELISA-positive dyr. angiver,

I at titeren ikke har været påviselig, dvs. under 1,6. I

I 35 De i tabel V viste data viser, at humant RS-virus- I

I fusionsprotein opnået som beskrevet i afsnit 6.1. og efter I

I immunoaffinitetsrensning udløser høje niveauer af antistof- 37 DK 175500 B1 fer. Sammenligning med en kommercielt tilgængelig okse-RS-virusvaccine viser, at det humane RS-virus-F-protein er lige så immunogent eller mere immunogent hos køer end BRSV-vaccinen.

5 Den beskyttende immunogenicitet hos humant RS-virus fusionsprotein imod okse-RS-virus er blevet undersøgt ved en yderligere forsøgsrække. 25 bomuldsrotter er blevet opdelt i 2 grupper med 10 dyr i hver og en gruppe på 5 dyr. Dyrene er blevet immuniseret intramuskulært på dagene 0 og 21 som 10 følger: Gruppe 1 får den kommercielt tilgængelige BRSV-vac-cine (Diamond), gruppe 2 får humant RS-virus, Long-stamme, F- og G-protein (10 μg af hver)/alun (affinitetsrensede F-og G-proteiner fås som beskrevet i henholdsvis afsnittene 6.1.1. og 10.1.), og gruppe 3 får PBS-alun (kontrol). Serum-15 prøver opnås, og serologiske afprøvninger gennemføres som beskrevet i sektion 6.2. ovenfor, bortset fra at BRSV (stamme 3758) anvendes til neutralisations- og anti-fusionsafprøvningerne. Resultaterne er vist i tabel VI.

20 Tabel VI

Beskyttelseseffektivitet af humant RS-fusionsorotein imod okse-RS-virus— _ Serologi13_ 25 EIA Neutralisation Antifusion dag __dag_ dag_

Immunogen 21 28_21 28_21_28_ 30 Diamond 4,2 5,3 n.d. 2,6 n.d. <1:20 (10) (6) (6) (6) F&G/Alunc 6,0 7,0 n.d. 4,3 n.d. 2,2 (10) (8) (8) (8) 35 PBS/Alun <1:100 <1:100 n.d. <1:20 n.d. <1:20 (5) (10) (4) (4) a Forsøgsdetaljer findes i teksten.

40 13 Resultaterne repræsenterer det geometriske middeltal af 4-10 dyr udtrykt i loglO-enheder. Tallet i parentes angiver antallet af dyr.

I DK 175500 B1 I

I 38 I

c Dosis er 10 μg af hvert protein. I

I Som vist i tabel VI udløser humant RS-virusfusions- I

I protein (og G-protein) en meget høj titer af antistoffer, I

I som udviser en kraftigt neutraliserende og anti-fusionerende I

I 5 aktivitet imod BRSV. På den anden side udløser BRSV-vaccinen I

fra Diamond antistoffer, som ikke har nogen påviselig anti- I

I fusionsaktivitet og signifikant lavere neutralisationsakti- I

I vitet. De i tabel VI viste resultater viser derfor tydeligt, I

I at humant RS-virusfusionsprotein udløser antistoffer, som I

I 10 neutraliserer BRSV og forhindrer fusion fremkaldt af BRSV. I

I Derfor udløser det humane RS-virusfusionsprotein en beskyt- I

I tende immunreaktion imod BRSV. I

I 6.5 Undgåelse af forøget sygdom. I

I 15 Immunisering eller vaccinering med formalininakti- I

I veret RS-virus (portion 100, Pfizer) har været forbundet I

I med udviklingen af atypisk og endog strengere sygdom, når I

I immuniserede individer derefter inficeres med RS-virus (Kim I

I et al., 1969, Am. J. Epidemol. 89, 422-434; Chin et al., I

I 20 1969, Am, J. Epidemol. 89, 449-463). En sådan potentiering I

I . af RS-virusinfektion har været en hovedhindring for udvik- I

lingen af en effektiv og sikker RS-virusvaccineformulering I

til mennesker og dyr. I

Prince et al (1985, J. Virol 57, 721-728) har udviklet I

25 en dyremodel til vurdering af potentieringen eller forøgelsen I

af RS-virusfremkaldt sygdom. Den af Prince udviklede bo- I

muldsrottedyremodel er blevet anvendt til undersøgelse, om I

tilsvarende potentiering eller forøgelse af efterfølgende I

sygdom er forbundet med anvendelsen af RS-virus-F-protein I

30 som immunogen ifølge en udførelsesform for den foreliggende I

opfindelse, eller om den ikke er det. Kort fortalt immunise- I

res bomuldsrotter ved intramuskulær injektion af enten RS- I

virus-F-protein, med eller uden alun som hjælpestof, eller I

et af flere immunogener som vist i tabel VII. Alle dyr får I

35 tre injektioner enten i ugerne 0, 1 eller 2 eller i ugerne I

0, 2 og 4, bortset fra en gruppe, som kun får én immunise- I

DK 175500 Bl 39 ring. 1-2 uger efter sidste immunisering inficeres dyrene med 104-10e PFU/dyr af RS-virus. 1 og/eller 4 dage efter infektion undersøges dyrenes lunger for morphologiske, inflammatoriske og patologiske ændringer i alveolegangene 5 og/éller alveolerne ved metoden ifølge Prince et al., supra.

Den samlede patologi af store og små luftveje i lungerne er blevet bedømt ved anvendelse af et skema, som varierer fra mild (+1), moderat (+2), streng (+3) til meget streng (+4). Resultaterne er vist i tabel VII.

10

I DK 175500 B1 I

I 40 I

lo i

I Tabel VII

I Forøget patologi, bomuldsrottemodel I

I hyppighed af lukkede, små luftveje I

I 5 I

I Alveoler og/eller I

I Prøve- _alveolepatologi*·*_ I

I Immunogen (Dosis)3 injektion Dag N + (%) Strenghed H

I Lot-100 (ufort.) RSV 121 (50) 1,5 I

I Lot-100 (ufort.) RSV 432 (67) 1,5

I 10 I

I RSV-

I formalin (ufort.-1:625)*** RSV 1 18 13 (72) 2,0 I

I RSV- I

I formalin (ufort.-1:625)*** RSV 4 17 11 (65) 1,5

I 15 RSV-levende (101-106 PFU) RSV 1 13 2 (15) . 1,0 I

I RSV-levende (10^--106 PFU) RSV 4 15 3 (20) 1,0 I

I F-(alun)* (0,2-20 pg) RSV 4 52 0 0 — I

I F (5 μ9) RSV 1 3 0 0 — I

I F (0,2-10 μg) RSV 4 23 0 0 — I

I 20 F** (1-20 pg) RSV 4 11 1 (9) 0,5

I Medium RSV 12 0 H

I Medium RSV 421 (50) 1,0 I

I PBS RSV 14 1 (25) 1,0 I

I PBS RSV 4 22 3 (14) 1,0 H

I 25 Intet RSV 1 3 0 0 — I

I Intet RSV 4 3 0 0 — H

I Intet* Medium 4 3 0 0 — H

I Intet* Ingen H

eller PBS 4 9 0 0 — H

30 I

35 DK 175500 Bl 41 a Alle dyrene er blevet immuniseret med en 200 μΐ intra-muskulær injektion af immunogen 3 gange i ugerne 0, 1 og 2, bortset fra dem, som er betegnet *, som er blevet immuniseret i ugerne 0, 2 og 4, og **, som har fået en 5 enkelt, intramuskulær injektion i uge 0, "***" angiver, at det ufortyndede virus er 10^-107 PFU. k "Dag" angiver den dag efter infektion, hvor patologien af lungealveolegange og/eller alveoler er blevet vurderet. "N" angiver det totale antal af vurderede dyr.

10 " + " angiver antallet af dyr, hvor der er iagttaget patologiske ændringer, hvilket angiver forøget eller potentieret, RS-virusfremkaldt sygdom. " (%)" repræsenterer den procentdel af dyrene, hvor der er iagttaget forøget, RS-virusfremkaldt sygdom. "Strenghed" repræ-15 senterer den gennemsnitlige, histopatologiske skore på en skala ved metoden ifølge Prince et al., supra (fra 0 til + 4) .

Som vist i tabel Vil udviser dyr, som er immuniseret med RS-virusfusionsprotein ifølge en udførelsesform for 20 opfindelsen, ikke patologiske ændringer i lungevævene, herunder alveolegangene og/eller alveolerne. På dag 4 har kun 1 ud af 86 dyr immuniseret med fusionsprotein udvist mindre end mild, patologisk ændring. På den anden side har af dyr, som er immuniseret med kommercielt tilgængelig RS-virusvaccine, 25 portion 100, eller formalininaktiveret RS-virus, mere end 65% af de behandlede dyr mild til moderat, patologisk ødelæggelse og/eller inflammation af lungevæv. Desuden har 20% af de dyr, som er immuniseret med levende RS-virus, udvist mindst mild, patologisk ødelæggelse og/eller inflammation 30 af lungevæv. Derfor har anvendelsen af RS-virusfusionsprotein ifølge den foreliggende opfindelse undgået forøgelsen eller potentieringen af sygdom fremkaldt af efterfølgende RS-virus-infektion. Derfor er vaccineformuleringer ifølge den foreliggende opfindelse både sikre og effektive.

35'

I DK 175500 B1 I

I 42 I

I 7. Beskyttelse af mennesker: RS-virusfusionsprotein. I

I FDA-godkendte, kliniske studier, fase I, på mennesker I

I er blevet gennemført til vurdering af sikkerheden og immuge- I

I niciteten af RS-virusfusionsproteinvaccine hos voksne, fri- I

I 5 villige mennesker. Fusionsproteinet fra RS-virus, stamme A2, I

I er blevet renset som beskrevet i afsnit 6.1. ovenfor, kom- I

I pounderet med alun og injiceret intramuskulært i følgede I

I doser: Gruppe 1 får 5 μg (N = 15), gruppe 2 får 15 jig (N = . I

I 16) , og gruppe 3 får 45 μg (N = 9) . En måned senere er 6 I

I 10 frivillige fra gruppe 1 og 7 frivillige fra gruppe 2 blevet I

I forstærket med en gentagen injektion af de respektive mængder I

I af RS-virusfusionsprotein modtaget ved første immunisering. I

I Skemaet for vaccinationer og indsamling af serumprøver fra I

i I

de frivillige er illustreret i tabel VIII.

H

I 15 I

I Tabel VIII I

I Beskrivende data fra fase-I-klinisk I

I afprøvning af RS-virus-F-protein hos voksne I

I _RS-virus-F-protein_ I

I Frivillige_5 μg_15 μg_45 μq_Total I

I N (vacc.=1) 15 16 9 40 I

I (vacc.=2) 6 7 13 I

I 25 Prøve-/vacc.- I

I tider: I

I A (V) middel 0 dage 0 dage 0 dage I

I B middel 14,1 14,1 14,0 I

I C(V) middel 32,5 28,8 30,3 I

I 30 D middel 61,6 55,0 58,4 I

I E middel 88,7 83,0 86,4 I

I F middel 166,0 161,4 165,1 I

I Sikkerhedsdata, herunder kliniske data og symptomer I

I rapporteret af immuniserede, frivillige mennesker er opsum- I

I 35 meret i tabel IX. I

43 0 DK 175500 B1 Ό _____ _____ _______ VW &>(&<*>&> <#> οΨ # # 0 O (N 00 O O W Ό ® O <J\ '— O O •ί’ '

JJ iJiH'-' rH rH

O) t—I ^ " w

Xj ø rn o (no>h ro o o ro o o id vo H

S Μ Η Η H rH

i—i

‘H

σι σι a.

•η η m cq Wi-i Γ' o r-oo r~ ο ο r^oo ro ro η 73

U C

0 3 to λ; σ -η 0) =i __ _ > coin coo in ο η vooo vp ο o ro roo

£ C

0 0 -- ω -H o¥> —. . - ----- 4J o oV° oV — olp — olP oP #

Ο r- <AP <3< oV> C"-· <AP £J\ Η O

j_) ø -U H O ro σ> ID Ch ro -tf vr H

0 0 rl — --- T3 Vj ø σ\ o coho r- o cn Qo ο η σι vo h<

0 . Mforo ro ro Η H

·· jj 73

0 co OJ

a a £

co C

ϋ o u ο -π tu σ > .u 73 =t ø ή in

ίο U > 01 O 01 O O CO Ο H 00 Ο H fO ΙΟ H

^ Ο -Η -H

2 Λ U 73 ^ M U EJ fti . d in -π £ σ »r4 ^ »rH ^ ^ ø 4-iMin in ο ίήο <a< ο o moo vo vo ro

-O JJ «0 (S άI Η Η Η Η H

£ o a

r* ^1 rH

Qj M 0 i0 >-> σ

Pug d a. mo in ο o in ο o moo o in o

1 0 <£ in H H H H H

01 -H

3 -u •H ¢0 · > 0 c — — S12} i μ o u u era co -H 0 Ο O — — --- .— ·Η I—I ·—.

Ojøjj C·· a a CEE E E £ £ 135-10)73 rHø -Hin --0uu υυ ου øs σι·Η iiHøcc υ-Η Γ^Γ-σι en i-ι fts -ο ΓΟΛί-Η υ ® ΓΟΓΟ C Η (Ν Η ΡΊ Η CN C D > Η ου 0 0 \Λ Λ Ή VI Λ) VI ΛΙ VI« ·Η ,Ω Ο 0 U) i—i o > o --- - — — XI — d (0 •η σ > d o i> n 0 S 5-1 O 5-1 5h 0 -U 0

Q, C w U

UH 0 0 C/l OH Ο H CO OHCN Ο Η (Ί OH O)

fO -H

JJ 5-1 X X 0 01 ø £

•H 0 H

c 5-i -u σι •H 5-1 5-1 · d

rH 3 -C 3 -H

X O tN C -U d iø 00 — £ — — —

H 5j O -H 5-1 ri ri H rH ØrH

i ø jj jj ø øø 3ø 00 -)-)1° ø ft CD 0) Λ a EX > ·* £* u x οι E 5c O, ø £ T50 0)0 VtO 00 ØØS Sø 0 S H QjH 0 rH £ ri h Η Ή H U H qC— O"' > — en

I DK 175500 B1 I

I 44 I

I Som vist i tabel IX er de uheldige reaktioner (lokal- I

I reaktioner) på immuniseringen meget minimale og/eller betyd- I

I ningsløse. Blod udtages fra de frivillige med specificerede 1

I tidsintervaller og afprøves for den antistoftiter, som er I

I 5 specifik for RS-virus-F-proteinet som ovenfor beskrevet. I

I Resultaterne er vist i tabel X. I

I Tabel X I

Immunigenicitet af RS-virus-F-protein hos voksne, EIA-serologi* I

I lOVaccina- Blod- _Geometrisk middeltiter (interval) fNl_ I

I tion prøve Gruppe 1_ Gruppe 2_ Gruppe 3_ I

I Primær A 66,4 (15-176) 58,9 (21-200) 90,9 (27-299) I

I [n*15] [n=16] [n=9] I

15 I

B 160,8a(30-328) '229,0a(40-965) 415,3a(179-700) I

I [n=15] [η=1β] [n=9] I

I C 141,3b(33-276) 199,9a(46-828) 386,2a(153-703) I

I 20 [n=15] [n=9] [n=9] I

I D 116,2C (31-217) 235,2a(73-644) 351,lb(121-645) I

I [n=8] [n=9] [n=9] I

I 25 E 119,4C(35-195) 180,2a(60-493) 349,0b(129-705) I

I [n=9] [n=9] [n=9] I

I F 160,1 (25-169) 144,5b(46-330) 314,8b(111-538) I

[n=9] [n=9] [n=9] I

30 I

I Forstærk- I

I ning D 183,4b(98-302) 217,7a(105-117) I

[n=6] [n=7] I

35 E 166,7b(103-352) 217,6a(99-658) I

[n=6] [n=7] - I

F 126,lc(76-234) 180,2b(91-691) I

[n=6] [n=7] I

40 * EIA-titier er udtrykt som titer (x 1000) . Tal repræsen- I

terer den geometrisk middeltiter, intervallet er angivet I

i parentes, og antallet af prøver er angivet i firkantet I

parentes. I

a Sammenligning med blodprøve A-GMT ved T-test viser en I

45 signifikant forskel p under 0,001. I

b Sammenligning med blodprøve A-GMT ved T-test viser en I

45 .

DK 175500 B1 signifikant forskel p under 0,01. c Sammenligning med blodprøve A-GMT ved T-test viser en signifikant forskel p under 0,05.

Som vist i tabel X er signifikant forøgede mængder af 5 antistoffer sammenlignet med de i forvejen eksisterende antistoffer blevet frembragt i alle grupper efter immuniseringen med enten 5 eller 15 eller 45 ^g RS-virus-F-protein. Derfor er RS-virus-F-proteinet ifølge en udførelsesform for opfindelsen meget immunogent, ikke alene hos dyr, men også 10 hos mennesker.

8. Et rekombinant plasmid indeholdende hele RS-virus-fusions -proteinoenet. _;_;_ 8.1. Plasmid PPX1043.

15 cDNA'en i det væsentlige som vist i fig. 1 indehol dende den komplette nucleotidsekvens af fusionsproteingenet klones i E.coli-plasmidvektor pG103 ved BamHI-stedet. Fig.

3 viser det resulterende rekombinante plasmid pPX1043. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 9. Immugenicitet af modificeret RS-virusfusionsprotein.

2 9.1. Konformationel modifikation.

3

Tværbindingsforsøg har vist, at RS-virusfusionspro- 4 teinet eksisterer som en dimer (140.000 dalton) på overfladen 5 af yirusinficerede celler og i praktisk taget rene præpara- 6 ter. Til undersøgelse af de potentielle virkninger af prote- 7 inkonformationen på vaccineanvendeligheden er den kvaternære 8 struktur af F-proteinet blevet modificeret, og de resulte 9 rende virkninger på immunogeniciteten er blevet vurderet.

10

Et monomert F-protein (70.000 dalton) er opnået ud fra 11 praktisk taget rent F-protein ved behandling af F-proteinet 12 ved 100°C i 2 minutter eller ved behandling med 99,9% aceto- 13 nitril/0,1% TFA. Immugeniciteten af dimere og monomere former 14 er blevet afprøvet på bomuldsrotter. Forsøgsdetal jer/resulta 15 ter er vist i tabel XI.

16

I DK 175500 B1 I

I 46 I

I Tabel XI I

I Immunogenicitet af RSV-F-protein: I

Effekt af proteinkonformation3 I

I 5 Dosis & vej EIA Neut. titer I

Immunogen* μq (gange) N log 10 log 10_ I

I F-dimer 5(3x IM) 15 5,7 3,8 I

I F-monomer 5(3x SC) 5 <2,0 <1,7 I

10 ----- I

I a Den monomere form er afledt af den native, dimere form I

I af F-proteinet ved varmebehandling. Efter behandlingerne I

immuniseres bomuldsrotter (intramuskulært eller subku- I

I tant) 3 gange med de angivne immunogener med 2 ugers I

I 15 mellemrum og i uge 6. Serum indsamles og afprøves for I

dets titer. I

De totale, neutraliserende antistoftitere viser sig I

I at være 100-1000 gange mindre i den gruppe, som har fået I

I den monomere form, fremstillet ved varmebehandling. I

I 20 I

9.2. Deacvleret fusionsprotein I

I Til bestemmelse af virkningen af kovalent tilknyttet I

I fedtsyre på immugeniciteten af RS-virus diacyleres fusions- I

I proteinet ved anvendelse af hydroxylamin (1M i 4 timer ved I

I 25 stuetemperatur), og effektiviteten af det deacylerede protein I

sammenlignes med den hos F-protein. Forsøgsdetaljer og resul- I

tater er vist i tabel XII. I

I Tabel XII I

I 30 Immunogenicitet og beskyttende effektivitet af F-protein: I

I Effekt af fedtsyredeacylering3 I

RSV-Isolering og I

I Immunogen GMT før infektion -titere fra lunger^ I

I 35 Type Mængde N EIA-F Neut (A2) (+) (-) GMT I

I (M9) I

I F 0,5 5 155.000 233 5 0 3,36 I

I 5,0 3 163.000 429 2 1 2,04 I

47 DK 175500 B1 deacyleret F 0,5 6 170.000 231 5 1 3,31 5,0 6 363.000 510 6 0 3,20 PBS 0,0 6 <100 <20 6 0 4,32 5 - a Bomuldsrotter immuniseres med de angivne immunogener i ugerne 0, 2 og 4. I uge 6 inficeres de med RSV/A2-virus intranasalt. Serum indsamles fra infektionsdagen og afprøves.

10 ^ " + " betyder antallet af dyr med påviseligt RS-virus.i deres lunger 4 dage efter infektion. betyder antallet af dyr uden påviseligt RS-virus i deres lunger 4 dage efter infektion. GMT-titere er udtrykt som pFU/g væv.

15 Forsøgsresultaterne viser, at den beskyttende virkning af deacyleret F-protein i en dosis på 5 pg er nedsat sammenlignet med det acylerede F-protein.

10. Beskyttelse af dvr: RS-virus-G-protein 20 10.1. Isolering af G-protein.

Praktisk taget rent RS-virus-G-protein, som er egnet til anvendelse som immunogen i en underenhedsvaccineformu-lering, fremstilles i alt væsentligt ved metoden ifølge Walsh et al., 1984, J. Gen. Virol. 65, 761-767.

25 10.2. Passiv beskyttelse.

Kaniner immuniseres ved anvendelse af det affinitetsrensede G-protein med en intramuskulær injektion af 2,4 pg RS-virus-G-protein i Freund's komplette adjuvans i uge 0 og 30 med 4,8 μg G-protein i Freund's ukomplette adjuvans i ugerne 4 og 8. Dyrene årelades i uge 17. IgG-fraktionerne af sera fra de G-immuniserede kaniner og fra en kontrolgruppe af ikke-immuniserede kaniner fås ved anvendelse af en protein A-"SepharoseA"-kolonne.

35 Tyve bomuldsrotter deles i 3 grupper med 4 dyr i hver og 2 grupper med 5 og 3 dyr i hver. Dyrene immuniseres passivt ved intraperitional injektion som følger: Gruppe 1

I DK 175500 B1 I

I 48 I

I får 4,12 mg kanin-anti-G-IgG, gruppe 2 får 1,03 mg kanin- I

I anti-G-igG, gruppe 3 får 4,28 mg normalt kanin-lgG, gruppe I

I 4 får 1,07 mg normalt kanin-lgG, og gruppe 5 (kontrol) får I

I et ækvivalent volumen PBS. 24 timer efter immunisering infi- I

I 5 ceres dyrene med 5,5 log 10 PFU-RS-virus, Long-stamme. Lun- I

I gerne høstes på 4. dagen efter infektion. Tilstedeværelsen I

I og/eller mængden af RS-virus i lungevæv bestemmes som ovenfor I

I beskrevet. Serumprøver indsamles, og afprøvninger gennemfø- I

I res som ovenfor beskrevet. Resultaterne er vist i tabel I

I 10 XIII. I

I Tabel XIII I

I Beskyttende effektivitet af passiv immunisering af anti-G- I

I antistoffer. I

Η I

I Serologi^ Virusprøve£ I

I 15 EIA Virus- I

I Mængde af IgG neutra- I

I indgivet9_lisation__+_-_titer I

I Anti-G-IgG 4,12 mg 5,5 3,3 0 4 s 1,0 I

I 20 Anti-G-IgG 1,03 mg 4,8 3,0 0 4 s 1,0 I

I Normalt IgG 4,28 mg 1,0 2,0 5 0 4,5 I

I Normalt IgG 1,07 mg 1,0 2,0 3 0 4,9 I

I 25 Intet (PBS) 1,0 2,0 40 5,0 I

I a Bomuldsrotter immuniseres passivt ved anvendelse af en I

I intraperitonal injektion af kaninimmunoglobilin udløst I

I ved anvendelse af renset G-protein fra RS-virus, Long- I

I 30 stamme. Antallet af dyr i hver gruppe er 4, bortset I

I fra dem, som får 4,28 mg normalt kanin-lgG (5 dyr) og I

I 1,07 mg normalt kanin-lgG (3 dyr). I

I k Afprøvninger gennemføres på serumprøver opnået på infek- I

I tionsdagen (detaljer findes i teksten). Resultaterne I

I 35 repræsenterer den geometriske middeltiter for 3-5 dyr I

I udtrykt i logio-enhe(3er (EIA) og logio“enheder/ml serum I

I (virusneutralisationsafprøvning). I

I c 5,5 log 10 PFU RS-virus, Long-stamme, podes intranasalt I

49 DK 175500 B1 (IN) i de passivt immuniserede dyr 24 timer efter immunisering, og lungerne høstes 4 dage efter infektion.

Virus isoleres fra lungevævene. "+" angiver det antal dyr i hver gruppe, hvor virus kan påvises i lungerne.

5 angiver det antal dyr, hvor intet virus er påvist.

"Titer" repræsenterer den geometriske middeltiter (PFU/g væv) af virus isoleret fra lungevæv.

Som vist i tabel XIII er passiv indgivelse af kaninantistof fremkaldt ved hjælp af renset G-protein fra RS-virus 10 effektivt til beskyttelse af bomuldsrotter imod infektion af homologt RS-virus; 10.3. Aktiv immunisering og beskyttelse.

37 bomuldsrotter deles i 3 grupper med 12-13 dyr i 15 hver. Den ene gruppe underindeles yderligere i 4 grupper med 3 dyr i hver, således at der dannes 6 grupper. Alle dyr 1 alle grupper, undtagen gruppe 6, immuniseres ved intramus-kulær injektion af 10 ^g RS-virus-G-protein, opnået som beskrevet i ovenstående afsnit, i forskellige hjælpestoffer 20 som følger: Gruppe 1 får 3 injektioner i ugerne 0, 2 og 4-5 af G-protein i PBS, gruppe 2 får 3 injektioner i ugerne 0, 2 og 4 af G-protein i alun. Gruppe 3 får 2 injektioner i ugerne 0 og 5 af G-protein i alun, gruppe 4 får 3 injektioner i ugerne 0, 2 og 5 af G-protein i ISCOM, og gruppe 5 får 2 25 injektioner i ugerne 0 og 5 af G-protein i ISCOM. Gruppe 6, kontrolgruppen, får 3 injektioner i ugerne 0, 2 og 4 af et ækvivalent volumen PBS alene. Mellem ugerne 6 og 7 inficeres alle dyr intranasalt med 4,0-5,0 log 10 PFU-RS-virus, Long-stamme. Serumprøver indsamles på infektionsdagen og afprøves 30 som ovenfor beskrevet i afsnit 6.2. ovenfor. Tilstedeværelsen og/eller mængden af RS-virus i lungevæv bestemmes 4 dage efter infektion som ovenfor beskrevet. Resultaterne er vist i tabel XIV.

I DK 175500 B1 I

I 50 I

I Tabel XIV I

I Immunogenicitet og beskyttende effektivitet af RS-virus-G- I

I protein. I

I Serologi*3 I

I 5 Gruppe Immunogen Neutra- virusprøve^ I

I nr._(Adjuvans)a N EIA lisation N + - GMT I

I 1 (PBS) 12 3,4 4,0 6 1 5 1,4 I

I 2 (Alun) 3 6,1 5,9 3 0 3 <1,0 I

I 10 3 (Alun) 3 6,3 5,3 303 <1,0 I

I 4 {ISCOM) 3 6,4 5,7 3 0 3 <1,0 I

I 5 (ISCOM) 3 6,3 5,3 3 0 3 <1,0 I

I 6 PBS 13 <1,0 <2,0 13 13 0 4,3 I

I 15 a I alle tilfælde er immunogenet 10 -/xg G-protein i et I

I hjælpestof som vist. I

I k Afprøvninger gennemføres på serumprøver opnået på infek- I

I tionsdagen. Resultaterne repræsenterer den geometriske I

I middeltiter udtrykt i logio_en^e<^er · ^ I

I 20 c Virus isoleres fra lungevævene. "N" angiver antallet I

I af undersøgte dyr. " + " angiver det antal dyr i hver

I gruppe, hvor virus kan påvises i lungerne. angiver I

I det antal dyr, hvor intet virus er påvist. "GMT" repræ- I

I senterer den geometriske middeltiter (PFU/g væv) af I

I 25 virus isoleret fra lungevæv. I

I Som vist i tabel XIV fremkalder aktiv immunisering I

af bomuldsrotter med G-protein opnået fra RS-virus, Long- I

stamme, en signifikant immunreaktion som påvist ved høje I

titere af anti-G-antistof (EIA-afprøvning) , som kan neutrali- I

30 sere RS-virus, Long-stamme (neutralisationsafprøvning) . I

Vigtigst af alt er, at de immuniserede dyr, når de inficeres I

med RS-virus, Long-stamme, er effektivt beskyttet imod en I

sådan infektion sammenlignet med kontroldyrene. I 1

11. Immunogenicitet af RS-virus-G-protein eksprimeret i I

rekombinantvektorer,_ I

En rekombinantvektor, som eksprimerer RS-virus-G- 51 DK 175500 B1 protein, stamme A2, fremstilles. Plasmid pPL-=j (pPL) , som bærer PL-promotoren og N-genet på et segment på 1215 bp af bakteriophag-=j -genomet, indkøbes fra Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ). Et særegn Hpal-sted i N-genet er placeret 5 321 bp med strømmen fra starten af P^-transkriptionen. Sek venser indsat i dette restriktionssted vil derfor blive reguleret af PL-promotoren. Et ekspressionsvektorplasmid ρΡΧΙβΟΟ konstrueres ved indsættelse af en syntetisk oligonu-cleotidsekvens i Hpal-stedet i pPL-plasmidet. Dette oligonu-10 cleotid indeholder en translationstermineringskodon i ramme med de N-kodende sekvenser efterfulgt af translationsinitieringssignaler (Shine-Dalgarno-boks + ATG) og særegne restriktionssteder (Ncol, Stul, EcoRV) til indsættelse af heterologe DNA-sekvenser i ramme med det syntetiske ATG. En cDNA af 15 fuld længde svarende til det G-glycoproteingen, som er flankeret af BamHI-linkere {Elango et al., 1980, Proc. Nat'l.

Acad. Sci. USA 83., 1906-1910) klones ind i BamHI-stedet i pBR322. Efter BamHI-digerering udskæres det RS-virusgen, som koder G-proteinet, fra pBR322, udfyldes med Klenow-frag-20 menterne af DNA-polymerase I og ligateres stumpendet til Stul-spaltet pPX1600. Efter transformation af E. coli (stamme N99cl+) isoleres plasmidet pPX1044 (figur 9). I dette plasmid er den RS-virus-G-kodende sekvens i den korrekte orientering og læseramme for pL-dirigeret ekspression ved gennemlæsning 25 fra det syntetiske ATG.

Plasmid pPXl044 indføres i Salmonella typhimurium-celler (LB50150) ved CaCl2-metoden. De transformerede celler dyrkes til den sene logaritmiske fase, og det eksprimerede RS-virus-G-protein renses ved en immunoaffinitetsmetode ved 30 anvendelse af det monoclonale antistof L9 (Walsh og Hruska, 1983, J. Virol. £7, 171-177). Det ikke-glycosylerede rekombi-nant-G-protein frembringer signifikante neutral isat ionstitere (3,7 log/ml imod Long-stammen) i kaniner efter 4 immuniseringer med 10 μg i nærværelse af Freund's adjuvans. En lignende, 35 neutraliserende antistofreaktion udløses i bomuldsrotter efter 3 immuniseringer med 5 μg af det ikke-glycosylerede

I DK 175500 B1 I

I 52 I

I rekombinant-G-protein. Derfor er det bakterieafledte rekom- I

I binant-G immunogent, og de antistoffer, som produceres imod I

I rekombinant-G, er funktionelle og vil derfor være beskyttende I

I imod RS-virusinfektion. I

Is I

I 12. Cellemedierede, immunologiske aspekter af RS-virusvac- I

I . cine ._;_;_;_ I

I De data, som er vist i nærværende beskrivelse, viser, I

I at immunisering med et eller flere RSV-glycoproteiner, enten I

I 10 F-protein alene eller i kombination med G-protein, frembrin- I

I ger cirkulerende antistoffer, som er funktionelle og beskyt- I

I tende. Udover denne antistofreaktion kan cellemedieret immu- I

I nitet være af vigtighed for beskyttelseseffektiviteten. I

I Faktisk har adskillige studier vist, at mange virusinfekti- I

I 15 oner er forbundet med frembringelsen af cytotoksiske T-cel- I

I ler, som erkender virusglycoproteiner. Cytotoksiske T-celler I

I imod RS-virus er blevet beskrevet hos mus og mennesker I

I (Taylor et al., 1984, Infect. Immun. 43, 649-655; Bangham I

I et al. , 1985, J. Virol 56, 55-59; Bangham et al., 1986, I

I 20 Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 83, 9183-9187). Desuden er det I

I blevet vist, at passiv overføring af T-celler fra RSV-grun- I

I dede mus kan udrydde en vedvarende RSV-infektion, når cel- I

I lerne indgives til athymiske, nøgne mus (Cannon et al., I

I 1987, Immunol. 62, 133-138). For at undersøge, om immunise- I

I 25 ring med RS-virus-F-protein eventuelt kunne fremkalde cyto- I

I toksiske T-celle reaktioner, er mus blevet immuniseret med I

I renset RS-virus-F-protein, og immunstimulerede effektor-T- I

I celler er blevet afprøvet in vitro. Reaktioner hos dyr, som I

I er immuniseret med levende RS-virus, er også blevet under- I

I 30 søgt. I praksis er 36 mus blevet opdelt i 4 grupper, og I

I dyrene er blevet immuniseret ved 0 og 2 måneder som følger: |

I Gruppe 1 får 2 x 106 TCID50 RS-virus, Long-stamme, ved hen- I

I holdsvis intranasale og intraperitorenale injektioner, gruppe |

I 2 får 20 μg RS-virus-F-protein (i alun) via intranasale I

I 35 injektioner, gruppe 3 får 20 μg RS-virus-F-protein (i alun) I

I via intramuskulære injektioner, og gruppe 4 er en ikke-immu- I

53 DK 175500 B1 niseret kontrolgruppe. 3 uger efter sidste forstærkningsinjektion aflives dyrene, og miltene høstes. Effektor-T-celler fås fra miltene og stimuleres igen in vitro med enten peri-toneale exudatceller . (PEC) eller miltceller inficeret med 5 RS-virus. Cytotoksiske T-celler afprøves ved anvendelse af en Cr-51-frigivelsesafprøvning (Bangham et al., 1985, J.

Virol 56., 55-59) . Resultaterne er vist i tabel XV.

Tabel XV

10 CTL-reaktion fremkaldt af RSV-F-protein % Cr-frigivelse fra målceller**

Gruppe Stimulering RSV + PEC BCH-4 RSV - PECe nr. a_in vitro_40:1 10:1 40:1 10:1 40:1 10:1 15 1 RSV-PEC 10,1 3,9 6,2 -4,2 0,8 0,2 RSV+milt 23,8 10,0 15,2 -2,0 -0,2 1,1

Ingen -0,2 -- -0,2 -- -0,3 2 RSV-PEC 12,4 4,0 9,2 -2,6 0,97 -0,8 20 RSV+milt -0,2' -0,2 -1,4 -0,6 -0,1 1,5

Ingen -0,7 -- 1,6 -- -0,8 3 RSV-PEC 2,4 2,4 8,4 1,2 0,4 -0,8 RSV+milt -0,3 -0,1 -6,0 -5,3 0,8 -1,6 25 Ingen -0,2 -- 0,2 -- -5,8 1 RSV-PEC 0,4 -- 5,8 -- 0,5 RSV+milt. -0,4 -- 1,0 -- -0,2

Ingen -1/5 -- 0,6 -- 0,2 3 0 - a Forsøgsdetaljer findes i teksten.

Målceller er BCH4-celler (en Balb/c-fibroblastcelle-linie vedvarende inficeret med RSV, Long-stamme), RSV-inficerede peritoneale exudatceller (PEC) og uinficere-35 de PEC-celler.

c Forholdet angiver forholdet mellem effektor og mål celler.

Signifikante niveauer af RS-virus-specifikke, cytotoksiske T-celler frembringes efter immunisering med RS-virus-40 F-protein (IP/IP), dvs. gruppe 2, og med RS-virus (IN/IP) dvs. gruppe 1. Der iagtages ingen signifikant T-cel lereakt ion i dyr, som har fået RS-virus-F-protein via en intramuskulær

I DK 175500 B1 I

I 54 I

I vej, dvs. gruppe 3, eller i kontroldyrene, dvs. gruppe 4. I

I Frembringelsen af cytotoksiske T-celler afhænger således af I

I podningsvejen, proteiner imod levende virus og de celler, I

I som anvendes til fornyet stimulering. Renset F-protein af RSV I

I 5 er i stand til at frembringe ikke alene humoral, men også I

I cellulær immunitet. I

I 13. Deponering af mikroorganismer. I

I Mange polynucleotidsekvenser kan anvendes til udøvelse I

I 10 af den foreliggende opfindelse. E. coli, stamme JM83, som I

I bærer plasmid pPX1043, som udgør det komplette RS-virusfu- I

I sionsproteingen, og E. coli, stamme JM103, som bærer plasmi- I

I det pPX1029, er blevet deponeret hos Agricultural Research I

I Culture Collection {NRRL), Peoria, IL, og er blevet tildelt

I 15 accessionsnumrene henholdsvis NRRL B-18254 og NRRL B-18255. I

I E. coli, stamme N99cl+, som bærer plasmid pPX1044, er også I

I blevet deponeret hos Agricultural Reasearch Culture Collec- I

I tion (NRRL), Peoria, IL, og er blevet tildelt accessionsnum- I

I mer B-18419. I

I 20

Claims (3)

1. Sammensætning til beskyttelse af et dyr eller et menneske mod en infektion fremkaldt af et respiratorisk syncytialt virus, og omfattende en effektiv mængde af en 5 vaccineformulering, som er egnet til indgivelse til et dyr eller et menneske, og som omfatter et praktisk taget rent polypeptid, som er et respiratorisk syncytialt virusfusionsprotein, kendetegnet ved en molekylvægt på ca. 140.000 dalton og med en nativ, dimer form, i kombination 10 med et adjuvans egnet til indgivelse til dyret eller mennesket .

2. Underenhedsvaccineformulering, i hvilken immunoge-net omfatter en effektiv mængde af det i krav l angivne polypeptid blandet med et egnet farmaceutisk bærestof. 15

3. Underenhedsvaccineformulering, i hvilken immunoge- net omfatter en effektiv mængde af "det i krav 1 angivne polypeptid blandet med et i det væsentlige rent polypeptid relateret til en neutraliserende epitop af respiratorisk syncytialt virus G-protein og et egnet farmaceutisk bærestof. 20