ES2269101T3

ES2269101T3 - Vacuna virica con delecion en el gen de bhv-1.

Info

Publication number: ES2269101T3
Application number: ES00904385T
Authority: ES
Inventors: Shafiqul I. Chowdhury
Original assignee: Kansas State University
Current assignee: Kansas State University
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 2000-01-18
Publication date: 2007-04-01
Anticipated expiration: 2020-01-18
Also published as: EP1155119A1; NO20013697D0; AU2615200A; DE60031374D1; NZ512125A; PT1155119E; EE200100396A; WO2000044884A1; EA005736B1; JP2007020574A; EP1155119B1; EA200100720A1; UA75035C2; SK10702001A3; DE60031374T2; CA2359177A1; CA2359177C; YU45601A; CZ20012589A3; HRP20010476B1

Abstract

Un herpesvirus bovino herpesvirus tipo I atenuado que comprende un herpesvirus bovino tipo I con la deleción de una porción de una región nativa del mismo codificadora de una glicoproteína E y su reemplazo con una inserción genética, en el que dicha porción eliminada comprende aproximadamente dos tercios de la región nativa codificadora de dicha glicoproteína E, en el que dicha inserción comprende una región codificadora de un gen de Beta-galactosidasa ajeno regulado por el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano, y en el que dicho virus recombinante expresa la Beta-galactosidasa en una célula huésped.

Description

Vacuna vírica con deleción en el gen de BHV-1.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención se refiere en líneas generales a vacunas recombinantes contra herpesvirus bovino y los métodos correspondientes. Más específicamente, la presente invención se refiere preferiblemente a la construcción de un herpesvirus bovino infeccioso recombinante tipo I (BHV-1) después de la deleción de la porción de la región nativa codificadora de la glicoproteína E (gE) y la inserción de un gen funcional de \beta-galactosidasa (\beta-gal) en el sitio de gE. La deleción de la región nativa codificadora de gE atenúa el virus y sirve como un marcador genotípico o inmunológico que diferencia entre la infección con el virus con la deleción de gE y la infección con el virus natural. Adicionalmente, la inserción del gen de \beta-gal proporciona un método fenotípico de ensayo para detectar la presencia del virus con la deleción de gE mediante la expresión de la actividad de \beta-gal en células huésped.

2. Descripción del estado de la técnica

El herpesvirus bovino tipo 1 (BHV-1), también conocido como el virus de la rinotraqueitis infecciosa bovina (IBRV) se asocia con una variedad de enfermedades clínicas que incluyen la rinotraqueitis, la conjuntivitis, infecciones genitales, y a veces el aborto espontáneo, la enteritis, la encefalitis, e infecciones sistémicas generalizadas en el ganado. El genoma de BHV-1 consiste en una molécula linear de ADN bicatenario de aproximadamente 140 kb. Comprende una región larga única (U_{L}) y una región corta única (U_{S}) flanqueadas a cada lado por secuencias internas y terminales invertidas de repetición (I_{R} y T_{R}, respectivamente). El genoma de BHV-1 codifica aproximadamente 70 proteínas (Misra et al., Proteins Specified Bovine Herpesvirus 1 (Infectious Bovine Rhinotracheitis, 40 J. Virol. 367-378 (1981)). Al igual que algunos otros herpesvirus animales, el genoma de BHV-1 codifica el gene de la glicoproteína (g) E gE. La secuencia del gen de gE de BHV-1, que codifica 575 residuos de aminoácidos (aa), se ha descrito en dos cepas distintas (Leung - Taek, P. et al., The Complete DNA Sequence and the Genetic Organization of the Short Unique Region (U_{S}) of the Bovine Herpesvirus Type 1 Strain (ST strain), 199 Virology 409-421 (1994); Rebordosa, X. et al., Mapping, Cloning and Sequencing of a Glycoprotein-Encoding Gene From Bovine Herpesvirus Type 1 Homologous to the gE Gene From HSV-1, 149 Gene 203-209 (1994)). Los aminoácidos de gE esperados contienen tramos de aminoácidos hidrófobos en el extremo N (secuencia putativa de señal) y cerca del extremo C (secuencia transmembrana), lo que es típico de las proteínas integradas en la membrana de clase I. Se ha demostrado que la gE de BHV-1 y sus homólogos en otros herpesvirus son prescindibles para la replicación in vitro pero la deleción del genoma del virus pseudorabia (PRV) de una secuencia entera que codifica gE es responsable tanto de una virulencia reducida de las cepas de vacunas atenuadas de Norden y Bartha (Petrovskis, E.A. et al., Deletion in Vaccine Strains of Pseudorabies Virus and Their Effect on Synthesis of Glycoprotein gp 63, 60 J. Virol. 1166-1169 (1986) como de la alteración de la neuroinvasividad (Card, J.P. et al., Pseudorabies Virus Envelope Glycoprotein gI Influences Both Neurotropism and Virulence During Infection of the Rat Visual System, 66 J. Virol. 3032-3041 (1992)). Por tanto, se necesita la expresión del gen de gE para que se llegue a una potencial patogénica plena de los virus en animales, pero no se necesita para el crecimiento en cultivos de tejido (Kritas et al., Invasion and Spread of Single Glycoprotein Deleted Mutants of Aujeszky's Disease Virus (ADV) in the Trigeminal Nervous Pathway of Pigs after Intranasal Inoculation, 50 Vet. Microbiol. 323-334 (1994); Kritas et al., Role of Envelope Glycoproteins gI, gp63 and gIII in the Invasion and Spread of Aujeszky's Disease Virus in the Olfactory Nervous Pathway of the Pig, 75 J. General Virol. 2319-2327 (1994)). Las patentes US 5789177 y EP 0668356 describen el BHV-1 con deleción del
gen de gE.

Recientemente, los mutantes de PRV e IBR con deleción del gen de gE han sido objeto de interés por su utilidad como vacunas marcadoras de diferenciación. Actualmente, una vacuna marcadora con deleción del gen de gE se está utilizando en Europa para erradicar el IBR. Sin embargo, a esta cepa de vacuna con deleción de gE, le falta un marcador de \beta-gal que permita métodos de detección histoquímica in situ para detectar la actividad de la enzima \beta-gal y métodos histoquímicos o métodos de inmunotransferencia para la detección de la proteína \beta-gal. La región codificadora de \beta-gal sirve también como un marcador genotípico del virus recombinante. Este virus puede detectarse fácilmente mediante hibridación del tipo transferencia Southern y los ensayos de RCP pueden también determinar la pureza genética del virus de la vacuna con referencia al virus natural. Por lo tanto, lo que se necesita es una cepa de IBRV avirulento con deleción de gE que contiene un marcador fenotípico/histoquímico/genotípico de \beta-gal. La patente US 5599544 describe mutantes de BHV-1 con deleciones en las regiones U52, gb y gE. En una deleción gb, un gen de \beta-gal se insertó como un marcador.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un herpesvirus bovino recombinante tipo I atenuado con la deleción de una porción de una región codificadora de la glicoproteína E del mismo y el reemplazo por un inserto genético, en donde dicha porción eliminada comprende aproximadamente dos tercios de dicha región nativa codificadora de la glicoproteína E, dicho inserto comprende la región codificadora de un gen ajeno de \beta-galactosidasa y el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano, y dicho virus recombinante expresa la \beta-galactosidasa en la célula huésped. La invención también se refiere a una vacuna que es eficaz para inducir los anticuerpos neutralizantes del herpesvirus bovino tipo I que comprende dicho virus recombinante, y a un método para identificar los animales infectados con dicha vacuna vírica recombinante, que comprende las etapas de

(a): analizar una muestra líquida de un animal;

(b): detectar una vacuna vírica recombinante en la muestra; e

(c): identificar una infección en el animal mediante dicha detección.

La presente invención se refiere también al uso de dicho herpesvirus bovino recombinante de la invención para la preparación de una vacuna para inmunizar al ganado contra el herpesvirus bovino tipo I.

Se ha construido un virus recombinante de BHV-1 (gE\Delta3.1IBR\beta) en el que se han eliminado los marcos abiertos de lectura (ORGs) de gE que comprenden una porción de las secuencias codificadoras de gE y se ha insertado un gen indicador/marcador quimérico en su lugar. El gen de \beta-galactosidasa (\beta-gal) insertado no desempeña ningún papel de regulación de la replicación del virus pero sí sirve como un marcador fenotípico para el virus gE\Delta3.1IBR\beta.

Para construir este virus recombinante de BHV-1, se clonaron la región codificadora del gen de gE de BHV-1 y las secuencias que lo flanquean aguas arriba y aguas abajo. Para crear una deleción en la región codificadora del gen de gE, dicho ADN clonado se digirió con enzimas apropiados para liberar los dos tercios amino de dicha región que se une al gen de \beta-gal. El plásmido de ADN resultante se co-transfectó con ADN de la cepa natural entera IBR del virus Cooper en células MDBK. Los virus recombinantes que expresan \beta-gal (placas azules) se purificaron en placa y se sometieron a ensayos adicionales de hibridación para la caracterización genética y de inmunotransferencia para determinar la reactividad contra el anticuerpo policlonal de conejo específico para el péptido de gE de BHV-1. Un virus recombinante, gE\Delta3.1IBR\beta, se caracterizó in vitro para determinar sus propiedades de crecimiento e in vivo en terneros para determinar sus propiedades patogénicas. La capacidad del virus recombinante para inducir los anticuerpos neutralizantes de BHV-1 en los terneros infectados se investigó mediante ensayos de reducción de placas.

Se cree que la regulación y expresión del gen quimérico de \beta-gal son importantes para este virus recombinante de BHV-1 por dos razones. El primer aspecto importante de este virus recombinante es que el gen de \beta-gal se regula mediante un promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (HCMV-IE) potente (y no mediante una secuencia reguladora derivada de BHV-1). El segundo aspecto importante es que el gen se expresa como un gen codificado de BHV-1 tanto en las fases tempranas como en las tardías de la infección. Las propiedades in vitro e in vivo de este virus recombinante con deleción de gE se analizaron comparándolo con la cepa madre Cooper IBRV.

En experimentos de cultivo de tejidos, el virus gE\Delta3.1IBR\beta creció hasta un título más bajo que la cepa natural (la cepa madre Cooper) en los tiempos tempranos después de la infección, pero en los tiempos tardíos después de la infección, el virus recombinante creció hasta un título casi igual a la cepa natural. El virus recombinante normalmente desarrolló placas significativamente más pequeñas que la cepa natural madre Cooper. Este hecho podría deberse a la falta de proliferación de célula en célula del virus y es consecuente con los resultados de otros herpesvirus.

En experimentos en animales, los terneros infectados con gE\Delta3.1IBR\beta desprendieron aproximadamente 100 veces menos virus comparados con los terneros infectados con la cepa madre Cooper durante todo el periodo de desprendimiento viral. Es más, la duración de este desprendimiento viral tardó dos días menos en los terneros infectados con gE\Delta3.1IBR\beta. Mientras que los terneros infectados con el virus gE\Delta3.1IBR\beta permanecieron sanos, los terneros infectados con la cepa madre Cooper mostraron los síntomas típicos de IBR y lesiones. Los resultados de la neutralización sérica indicaron que tanto los terneros infectados con IBRV natural como los infectados con la cepa con IBRV con deleción de gE indujeron concentraciones comparables del anticuerpo neutralizante de BHV-1. Se ha descrito con anterioridad que el IBRV con deleción del gen de la timidina quinasa (TK) creció tanto in vitro como in vivo con una concentración significativamente más baja (Chowdhury, S.L., Construction and Characterization of an Attenuated Bovine Herpesvirus Type 1 (BHV-1) Recombinant Virus, 52 Vet. Microbiol. 13-23 (1996)). Estos resultados considerados en conjunto indican que aunque el virus recombinante gE\Delta3.1IBR\beta crezca relativamente bien comparado con el IBR con deleción de TK, el virus gE\Delta3.1IBR\beta era prácticamente avirulento para los terneros. Las propiedades atenuadas que exhiben el virus recombinante gE\Delta3.1IBR\beta fueron análogas a las exhibidas por: 1) la deleción de TK en BHV-1 tal como demostró Chowdhury, S.I., en Construction and Characterization of an Attenuated Bovine Herpesvirus Type 1(BHV-1) Recombinant Virus (52 Vet. Microbiol. 13-23 (1996); 2) la deleción de gE en PRV tal como mostraron Kritas et al., en, Invasion and Spread of Single Glycoprotein Deleted Mutants of Aujeszky's Disease Virus (ADV) in the Trigeminal Nervous Pathway of Pigs After Intranasal Inoculation (50 Vet. Microbiol. 323-334 (1994)) y Kritas et al., en Role of Envelope Glycoproteins gI, gp63 and gIII in the Invasion and Spread of Aujeszky's Disease Virus in the Olfactory Nervous Pathway of the Pig (75 J. General. Virol. 2319-2327 (1994)); y 3) un aislado de la vacuna IBRV europea con deleción de gE tal como demostraron Kaashoek et al., en An Inactivated Vaccine Based on a Glycoprotein E-Negative Strain of Bovine Herpesvirus 1 Induces Prospective Immunity and Allows Serological Differentiation (13 Vaccine 342-346 (1995)) y Van Englenburg et al., en A Glycoprotein E Deletion Mutant of Bovine Herpesvirus 1 Infects the Same Limited Number of Tissues in Calves as Wild-Type Virus, but for a Shorter Period (76 J. Gen. Virol. 2387-2392 (1994)).

Este estudio también demostró que la deleción de las secuencias del marco abierto de gE y la inserción de un gen funcional de \beta-gal en el sitio de gE del virus atenuó de forma estable el virus. Una aplicación práctica para este virus es su uso como una vacuna atenuada segura contra IBR. La deleción del gen de gE servirá como un marcador inmunológico para diferenciar entre los animales vacunados y los no vacunados. Además, la producción de \beta-gal permitiría una evaluación fácil de la replicación viral de gE\Delta3.1IBR\beta en el epitelio nasal de los animales vacunados en comparación con la cepa de vacuna con deleción de gE que actualmente se usa en Europa a la que le falta este marcador fenotípico de \beta-gal, y también distinguiría entre la infección con la vacuna y la infección de la cepa natural del virus de IBR.

Descripción breve de los dibujos

La figura 1 es un diagrama de flujo que resume la construcción de un virus de BHV-1 con deleción de gE (gE\Delta3.1IBR\beta); y un vector plásmido de inserción/deleción que contiene un gen funcional de \beta-gal que reemplaza dos tercios de la región codificadora de gE del extremo amino;

La figura 2 es una reproducción de la transferencia Southern de hibridación para la deleción pretendida de la región codificadora de gE y la inserción de las secuencias de \beta-gal en el sitio de gE;

La figura 3 muestra la proteína gE de BHV-1 que se detectó en la cepa natural madre Cooper pero no en el virus recombinante con deleción de gE (gE\Delta3.1IBR\beta);

La figura 4 es un gráfico que ilustra el resultado de un experimento de crecimiento de un paso que compara la velocidad de crecimiento de IBR con deleción de gE con la del IBR natural en células MDBK, donde cada punto representa el promedio de resultados obtenidos de cada grupo de terneros;

La figura 5 es un gráfico que compara las puntuaciones clínicas diarias de los terneros infectados con el IBR con deleción de gE con las puntuaciones clínicas diarias de los terneros infectados con el IBR natural, donde cada punto representa el promedio de resultados obtenidos de cada grupo de terneros;

La figura 6 es un gráfico que compara las temperaturas diarias del recto de los terneros infectados con el IBR con deleción de gE con las temperaturas rectales diarias de los terneros infectados en el IBR natural, donde cada punto representa el promedio de resultados obtenidos de cada grupo de terneros;

La figura 7 es un gráfico que compara la secreción nasal del virus de IBR con deleción de gE con la secreción nasal del virus de IBR natural donde cada punto representa el promedio de resultados obtenidos de cada grupo de terneros.

Descripción detallada de la realización preferida

Los siguientes ejemplos describen la construcción de un BHV-1 recombinante infeccioso con deleción de una región nativa codificadora de gE con tal de atenuar el virus en el que se inserta un gen funcional de \beta-gal en el sitio de gE, un método para inmunizar a los animales contra las enfermedades provocadas por BHV-1 con este BHV-1 recombinante como vacuna, y métodos para detectar y diferenciar, tanto genotípicamente como fenotípicamente, entre la infección de un animal con este virus recombinante y con el virus natural. Estos ejemplos se presentan solamente con fines ilustrativos, y no deben interpretarse como una limitación del alcance global de esta invención.

Ejemplo 1 Materiales y métodos

En este experimento, se generó y caracterizó IBRV recombinante con deleción del gen de gE e inserción del gen que expresa \beta-galactosidasa. El virus recombinante construido contiene un gen quimérico (con una longitud de 4,5 kb) que sustituyó a la región codificadora de gE de BHV-1. El gen quimérico está compuesto por un promotor HCMV-IE y sus secuencias potenciadoras enlazadas con las secuencias codificadoras del gen de \beta-gal que se enlazan con los sitios de poliadenilación SV_{40}. Preferiblemente, las secuencias codificadoras de \beta-gal son bacterianas, sin embargo, se cree que funcionará cualquier secuencia codificadora del gen de \beta-gal.

Para construir y caracterizar el BHV-1 recombinante, se obtuvo la cepa Cooper (Colorado-1) de IBRV de la Colección Americana de Cultivos Tipo. Los virus se propagaron y se titularon en células bovinas renales Madin-Darby de acuerdo con el método de Chowdhury S.I., Molecular Basis of Antigenic Variation Between Glycoprotein C (gC) of Respiratory Bovine Herpesvirus 1 (BHV-1) and Neurovirulent BHV-5, 213 Virology 558-568 (1995). El ADN viral se aisló con dodecilsulfato de sodio y la lisis de la proteína K, una extracción con fenol/cloroformo, y una precitación etílica tal como se describió en Chowdhury et al., Equine Herpesvirus Type 1 (EHV-1) Induced Abortions and Paralysis in a Lipizzaner Stud: A Contribution to the Classification of Equine Herpesviruses, 90 Arch. Virol. 273-288
(1986).

El suero anti-péptido policlonal de conejo de BHV-1 específico para gE se sintetizó según la hidropaticidad regional esperada y la antigenicidad. Este péptido gE que contiene los residuos 378 a 398 se sintetizó tal como se describieron Leung-Taek, P. et al., The Complete DNA Sequence and the Genetic Organization of the Short Unique Region (U_{s}) of the Bovine Herpesvirus Type 1 Strain (ST Strain), 199 Virology 409-421 (1994). Se empleó la reacción de 9-fluorenil-metoxicarbonilo (FMOC) tal como se describió en Abdelmagid et al. Fine Mapping of Bovine Herpesvirus-1 (BHV-1) Glycoprotein D (gD) Neutralizing Epitopes by Type-Specific Monoclonal Antibodies and Sequence Comparison With BHV-5 gD, 206 Virology 242-253 (1995) para llevar a cabo la síntesis del péptido gE. Para facilitar la conjugación a la hemocianina extraída de la lapa californiana (KLH), se añadió otra cisteína no revelante (C) (indicado con un *) al extremo C del péptido. El péptido de 17 mer [H]-TSDRLVRAVTDHTRPEC*-[OH] se acopló a KLH y se prepararon antisueros tal como se describió en Kyte, J., Doolittle, R.F., A Simple Method for Displaying the Hydropathic Character of Protein, 157 J. Mol. Biol. 105-132 (1982).

Se llevaron a cabo un SDS-PAGE y una transferencia Western de proteínas celulares simuladas y proteínas del virus en condiciones de reducción tal como se describió en Chowdhury S.I., Molecular Basis of Antigenic Variation Between Glycoprotein C (gC) of Respiratory Bovine Herpesvirus 1 (BHV-1) and Neutrovirulent BHV-5, 213 Virology 558-568 (1995) y Laemli UK., Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4, 227 Nature (London) 680-685 (1970).

Para realizar la construcción de plásmidos recombinantes, se obtuvieron los plásmidos pBHV1HK y pBHV1HF de Dr. W. Lawrence (U. Pennsylvania, Filadelfia, EE.UU.). Los plásmidos contenían los fragmentos HindIII-K y HindIII-F del ADN de BHV-1, respectivamente. Un subfragmento XhoI/HindIII de 4,4 kb del plásmido pBHV1HK que contenía el gD entero, gI, y una porción, preferiblemente dos tercios, del extremo amino de la región codificadora de gE, se subclonó en los sitios XhoI/HindIII del plásmido pGEM7Z (pBHV1gE5'). A continuación, se subclonó un fragmento HindIII/Bsu361 de 1,15 kb (de extremos despuntados mediante el método de Klenow) del pBHV1HF que contenía la tercera parte del extremo carboxi de la región codificadora de gE y la secuencia codificadora entera US9 ORF en los sitios HindIII/HincII del plásmido pBluescript KS (pBHV1gE3'). Finalmente, para construir la región entera del gen codificador de gE y sus secuencias flanqueadoras, el fragmento del sitio vectorial de HindIII/XbaI de 4,4 kb que contenía el fragmento HindIII/XhoI se clonó en los sitios HindIII/XBaI del plásmido pBHV1gE3'. El clon resultante se designó como pBHV1gE5'3'.

Para eliminar la región codificadora de gE, el ADN de pBHV1gE5'3' se digirió parcialmente con AsuII y a continuación se digirió completamente con HindIII de nuevo. El fragmento más largo se purificó sobre gel y se ligó al fragmento PstI de 4,5 kb (con extremos despuntados con polimerasa T4) de pCMV\beta (obtenido de Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.) que contiene el promotor temprano de CMV y secuencias reguladas de \beta-gal. El plásmido resultante de deleción de gE y inserción de \beta-gal, pBHV1gE\Delta\beta, tiene una deleción de las secuencias de ADN de BHV-1 de 1 kb que contienen las secuencias génicas codificadoras de los primeros 372 aminoácidos y una inserción del gen de \beta-gal bajo la regulación del promotor de CMV. El gen de \beta-gal está flanqueado por secuencias de 3,32 kb específicas para el virus aguas arriba (que contienen las secuencias génicas enteras de gD y gI y las secuencias del promotor de gE) y 1,15 kb de secuencias aguas abajo (que contienen la tercera parte del extremo carboxi de la región codificadora de gE y las secuencias completas de US9) que se necesitan para la recombinación con el ADN del virus.

Para generar el virus IBR recombinante con deleción de gE, el ADN de pBHV1gE\Delta\beta en forma lineal (Núm. de accesión ATCC VR-2637) y el IBRV natural entero (cepa Cooper) se cotransfectaron mediante lipofección en células bovinas renales Madin-Darby (MDBK). La inserción correcta de \beta-gal en el sitio de gE en el IBRV completo y la deleción posterior de la porción de la región codificadora de gE de IBRV natural se deben a la recombinación homóloga de las secuencias flanqueadoras específicas para el BHV-1 en el plásmido con la replicación del ADN viral. Las secuencias flanqueadoras específicas se incorporan en el ADN viral nuevamente sintetizado para crear una deleción en la región codificadora así como en la misma región. Se purificaron tres veces en placa los virus recombinantes que expresaban \beta-gal mediante un cribado para placas azules por debajo de una capa superpuesta de Bluo-Gal tal como se describe en Chowdery, S.I., Construction and Characterization of an Attenuated Bovine Herpesvirus Type 1 (BHV-1) Recombinant Virus, 52 Vet. Microbiol. 13-23 (1996). Varios aislados recombinantes se caracterizaron más mediante hibridaciones de transferencia y mediante inmunotransferencia con suero anti-péptido policlonal de conejo de BHV-1 específico para gE. Se empleó el método de hibridación de transferencia de Chowdery S.I. Construction and Characterization of an Attenuated Bovine Herpesvirus Type 1 (BHV-1) Recombinant Virus, 52 Vet. Microbiol. 13-23 (1996). Se empleó el método de inmunotransferencia de Chowdhury S.I., Molecular Basis of Antigenic Variation Between Glycoprotein C (gC) of Respiratory Bovine Herpesvirus I (BHV-1) and Neurovirulent BHV-5, 213 Virology 558-568 (1995).

Resultados

El análisis de ADN de los dos virus recombinantes, gE\Delta3.1IBR\beta (ATCC núm. de accesión VR-2367) y
gE\Delta3.5IBR\beta, mediante la hibridación de transferencia Southern para la deleción deseada y la inserción de las secuencias de \beta-gal en el sitio de gE se muestra en la figura 2. La ausencia de las secuencias AsuII-HindIII de 1 kb que codifican los primeros 372 aminoácidos en el término amino del gen de gE y la presencia de secuencias de \beta-gal en los aislados gE\Delta3.1IBR\beta y gE\Delta3.5IBR\beta demostraron que la recombinación deseada había tenido lugar de forma específica en el sitio en estos aislados. De forma consistente con este hallazgo, la proteína gE de BHV-1 de 92-95 kd se detectó en la cepa natural madre Cooper con el suero anti-péptido policlonal de conejo de BHV-1 específico para gE pero el virus recombinante gE\Delta3.1IBR\beta con deleción de gE no era presente. Este resultado se presenta en la figura 3, y se empleó este aislado para experimentos adicionales. Adicionalmente, gE\Delta3.1IBR\beta podría convertirse de nuevo en una cepa natural de IBR mediante la cotransfección con un plásmido que contenía las secuencias flanqueadoras y la secuencia original de gE de un IBRV natural. En esencia, esto invierte los procesos de cotransfección utilizados para generar gE\Delta3.1IBR\beta.

La cinética de la expresión de \beta-gal en las células MDBK infectadas con el virus se determinó de forma histoquímica a las 3, 6, 12 y 24 horas después de la infección. La actividad de \beta-gal ya pudo detectarse a las 3 horas y hasta las 24 horas después de la infección. Esto demuestra que el gen de \beta-galactosidasa regulado por el promotor CMV-IE del virus gE\Delta3.1IBR\beta se expresa tanto a tiempos tempranos como a tiempos tardíos. Adicionalmente, aunque el gen quimérico se regule con un promotor HCMV-IE extraño del herpesvirus humano y contenga secuencias no virales de \beta gal así como potenciadores que son ajenos tanto a \beta-gal como a BHV-1, se regula y se expresa como un gen auténtico de BHV-1. Por lo tanto, el \beta-gal es ajeno (no presente en el estado natural de BHV-1) a BHV-1 y el HCMV-IE y sus secuencias potenciadoras son ajenas tanto al BHV-1 como al \beta-gal que regulan/potencian.

La deleción del gen de gE servirá como un marcador inmunológico para diferenciar entre los animales vacunados y los animales infectados. A la respuesta de los anticuerpos inducida por la cepa de la vacuna, le faltaría el anticuerpo específico para gE, por lo que la respuesta puede diferenciarse de la respuesta inducida por una infección con BHV-1 natural que contendría anticuerpos específicos para el gE. Por tanto, pueden identificarse y sacrificarse animales infectados en una manada vacunada. Este marcador serológico es importante para la eliminación de BHV-1 de una manada.

El plásmido (pBHV1gE\Delta\beta) utilizado para generar el virus recombinante y el virus recombinante generado,
gE\Delta3.1IBR\beta, se han depositado con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Al plásmido (pBHV1gE\Delta\beta), se le ha asignado el número ATCC de accesión 203607 y al virus recombinante (gE\Delta3.1IBR\beta), se le ha asignado el número ATCC de accesión VR-2637.

Ejemplo 2 Materiales y métodos

En este experimento, se determinó la patogenicidad del virus gE\Delta3.1IBR\beta en terneros y se compararon estos resultados con los de la patogenicidad de la cepa madre Cooper de IBRV. Diez terneros Holstein de seis meses de edad libres del virus bovino de diarrea se dividieron al azar en dos grupos (A y B) de cinco terneros cada uno. Los dos grupos se alojaron en establos de aislamiento bajo condiciones idénticas. Antes de cada experimento, todos los terneros estaban sanos y permanecieron seronegativos hasta que empezó el experimento.

A cada ternero en el grupo A, se le inoculó por vía intranasal con el IBRV recombinante con deleción de gE. A cada ternero del grupo B, se le inoculó por vía intranasal con la cepa madre Cooper de IBRV. Los inóculos contenían 1x10^{7} TCID_{50} de los virus respectivos para cada animal. Todas las inoculaciones se llevaron a cabo mediante aerosolización con un nebulizador DEVILBIS, modelo 50 de Delvis Co., Somerset, Pennsylvania, con 2 ml de inóculo por cada ventana de la nariz durante un periodo de entre 30 segundos y un minuto.

Se realizó una vigilancia clínica estrecha de todos los terneros diariamente durante los 14 días después de exposición al virus (inoculación). Las temperaturas rectales se registraron a diario. Se prestó una atención especial a las siguientes condiciones: el comportamiento (depresión), el apetito, la tos, las secreciones oculares y nasales, la hiperemia o lesiones de las mucosas nasales y orales, la conjuntivitis, y una respiración anormal. Cada condición se puntuó de forma individual y se calcularon las puntuaciones clínicas diarias para cada ternero así como las puntuaciones medias clínicas diarias para cada grupo sumando las puntuaciones para cada condición. Los parámetros de puntuación fueron los siguientes:

Secreción nasal: {}\hskip0.2cm Normal = 0; Moderadamente serosa = 1; Altamente serosa = 2; levemente micropurulenta = 2; {}\hskip0.2cm moderadamente micropurulenta = 3; y altamente micropurulenta = 4

Comportamiento (depresión): {}\hskip0.2cm No presente = 0; leve = 1; moderado = 2; intenso = 3

Hiperemia/enrojecimiento de la mucosa nasal = 1

Úlceras de la mucosa nasal = 1

Conjuntivitis = 2

Tos = 2

Disnea = 2

Temperatura rectal diaria: {}\hskip0.2cm 39.7 - 39.99ºC = 1; 40.0 - 40.5ºC = 2; 40-6 - 41.0ºC = 3; y por encima de 41.0ºC = 4

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Resultados

Los terneros en el grupo B infectados con la cepa madre Cooper de IBRV (IBRV natural) mostraron los signos típicos de la infección: depresión, un apetito reducido, secreciones oculares y nasales, úlceras nasales/placas nasales, y tos. Estos hallazgos clínicos resultaron en una puntuación clínica diaria alta a lo largo de varios días tal como se indica en la figura 5. Sin embargo, los terneros infectados con el virus recombinante gE\Delta3.1IBR\beta (grupo A) no exhibió ningún signo clínico detectable (también presentado en la figura 5) y su comportamiento y apetito permanecieron normales. La figura 6 compara las temperaturas rectales medias de los terneros de cada grupo (A y B). Se registraron altas temperaturas rectales de 39.7ºC a 40.5ºC a lo largo de varios días para los terneros infectados con la cepa madre Cooper (grupo B). Nunca se registraron temperaturas rectales por encima de 38.9ºC para los terneros infectados con gE\Delta3.1IBR\beta (grupo A).

Ejemplo 3 Materiales y métodos

Este experimento comparó la cinética del crecimiento del virus gE\Delta3.1IBR\beta en células MDBK con la de la cepa madre Cooper de IBR en células MDBK. Una serie de replicados de cultivos de células MDBK se infectó por separado con 5 unidades formadoras de placas (UFP)/célula de gE\Delta3.1IBR\beta recombinante o de la cepa madre Cooper. Se cosecharon los cultivos en intervalos sucesivos después de la infección, y se preparó una disolución de partida del virus para utilizar en los ensayos de titulación viral.

Resultados

Los resultados del experimento de crecimiento de un paso se presentan en la figura 4. La curva del crecimiento del virus demuestra que las evoluciones temporales de los descendientes virales fueron similares para gE\Delta3.1IBR\beta y para la cepa madre Cooper. Sin embargo, el virus recombinante produjo menos a tiempos tempranos después de la infección.

Ejemplo 4 Materiales y métodos

Este experimento aisló y cuantificó el virus de cada animal en grupos A y B (del ejemplo 3 arriba). Una torunda de algodón no tratada se pasó tres veces sobre las mucosas. Los virus se eluyeron de la torunda en 3 ml de medio (MEM que contenía 100 \mug/ml de gentamicina, 3% v/v de FBS, amfotericina B a 25 \mug/ml) durante una hora a temperatura ambiente. Las muestras se clarificaron mediante la centrifugación a 1000 g durante cinco minutos y se almacenó a -70ºC. El aislamiento del virus en las células MDBK se llevó a cabo con 100 \mul de suspensión de la muestra diluida a 1:10. Las muestras positivas para el virus se titularon en placas de micropocillos. Se realizaron diluciones de 10 veces en serie con el medio de cultivo, y se añadieron 50 \mul de cada dilución a cada uno de los 8 pocillos (en una placa de 96 pocillos) que contenían 1,5 x 10^{5} células MDBK. Después de 5 días a 37ºC, las placas se sometieron a una lectura bajo un microscopio para determinar el efecto citopatológico (CPE). Las titulaciones del virus se expresaron en TCID_{50} según el método de Reed, L.J. y Muench, H., 27 Am. J. Hyg. 493 (1938).

Resultados

La cantidad de virus que se aisló de las muestras nasales demostró que el virus gE\Delta3.1IBR\beta creció con menos eficacia en las células epiteliales nasales que la cepa madre Cooper. La eliminación del virus en las secreciones nasales se muestra en la figura 7. El nivel de esta eliminación viral fue aproximadamente de 15 a 550 veces menos para el virus gE\Delta3.1IBR\beta que para la cepa natural de BHV-1 (cepa madre Cooper). Además, la eliminación viral duró dos días menos en terneros infectados con gE\Delta3.1IBR\beta que en los terneros infectados con la cepa natural del virus.

Ejemplo 5 Materiales y métodos

Este ejemplo determinó los títulos de los anticuerpos neutralizantes de BHV-1 en suero extraído de los terneros de los grupos A y B (de los ejemplos 3 y 4 anteriores). Las muestras sanguíneas se tomaron a 13 días después de la infección de cada ternero de los grupos A y B. Los títulos de los anticuerpos neutralizantes de BHV-1 en el suero se determinaron mediante el método de reducción de placa con placas de 12 pocillos tal como se describió en Chowdhury, S.I., et al., Molecular Biological Characterization of Equine Herpesvirus 1 (EHV-1) Isolated From Ruminant Hosts, 11 Virus Res. 127-139 (1988).

Resultados

Tanto la cepa natural (cepa madre Cooper) como los virus IBRV con deleción de gE (gE\Delta3.1IBR\beta) indujeron los anticuerpos neutralizantes de BHV-1 en terneros. Sin embargo, los sueros de terneros infectados con la cepa natural tenían unos títulos de anticuerpos neutralizantes un poco más altos (1:20-1:35 con un título medio de 1:30) en comparación con los títulos de anticuerpos de los virus con deleción de gE (1:11-1:30 con un título medio de 1:16).

Claims

1. Un herpesvirus bovino herpesvirus tipo I atenuado que comprende un herpesvirus bovino tipo I con la deleción de una porción de una región nativa del mismo codificadora de una glicoproteína E y su reemplazo con una inserción genética, en el que dicha porción eliminada comprende aproximadamente dos tercios de la región nativa codificadora de dicha glicoproteína E, en el que dicha inserción comprende una región codificadora de un gen de \beta-galactosidasa ajeno regulado por el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano, y en el que dicho virus recombinante expresa la \beta-galactosidasa en una célula huésped.

2. El virus de la reivindicación 1, en el que además dicha inserción comprende secuencias que potencian dicho promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano.

3. El virus de la reivindicación 1, en el que dicho virus no tiene otras deleciones génicos en el mismo.

4. El virus de la reivindicación 2, en el que dicha inserción se enlaza con los sitios de poliadenilación SV_{40}.

5. El virus de la reivindicación 1, en el que dicho gen de \beta-galactosidasa ajeno se expresa como un gen auténtico de herpesvirus bovino tipo I.

6. El virus de la reivindicación 1, en el que dicha región nativa codificadora sirve como un marcador genotípico.

7. El virus de la reivindicación 1, en el que dicha inserción genética sirve como un marcador fenotípico.

8. El virus de la reivindicación 1, en el que dicha región nativa codificadora eliminada sirve como un marcador inmunológico.

9. Dicho virus de la reivindicación 1, en el que dichas secuencias codificadoras de la \beta-galactosidasa se expresan en dicha célula huésped a estadios tanto tempranos como tardíos de la infección.

10. Una vacuna que es efectiva para inducir los anticuerpos neutralizantes de herpesvirus bovino tipo I que comprende el virus recombinante de la reivindicación 1.

11. La vacuna de la reivindicación 10, en la que dicha porción eliminada comprende dos tercios de dicha región nativa codificadora de la glicoproteína E.

12. La vacuna de la reivindicación 10, en la que dicha inserción además comprende secuencias potenciadoras de dicho promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano.

13. La vacuna de la reivindicación 10, en la que dicha inserción se enlaza con los sitios de poliadenilación SV_{40}.

14. La vacuna de la reivindicación 10, en la que dicho gen de \beta-galactosidasa se expresa como un auténtico gen codificado por el herpesvirus bovino tipo I.

15. La vacuna de la reivindicación 10, en la que dichas secuencias codificadoras de la \beta-galactosidasa se expresan en dicha célula huésped en los estadios tanto tempranos como tardíos de la infección.

16. La vacuna de la reivindicación 10, en la que dicha región nativa codificadora de la glicoproteína E sirve como un marcador genotípico.

17. La vacuna de la reivindicación 10, en la que dichas secuencias codificadoras de la \beta-galactosidasa sirven como un marcador fenotípico.

18. La vacuna de la reivindicación 10, en la que dicha región nativa codificadora sirve como un marcador inmunológico.

19. Un método para identificar a los animales que están infectados con la vacuna viral recombinante de la reivindicación 10, que comprende las etapas de:

(a) analizar una muestra de líquido de un animal;

(b) detectar la vacuna viral recombinante en la muestra; e

(c) identificar al animal como infectado en función de dicha detección.

20. El método de la reivindicación 19 en el que dicha etapa (a) de análisis incluye un ensayo para la presencia de \beta-galactosidasa.

21. El método de la reivindicación 20 en el que dicha etapa (b) de detección se basa en la presencia o ausencia de la expresión de \beta-galactosidasa.

22. El método de la reivindicación 19 en el que dicha etapa (a) de análisis incluye una respuesta de anticuerpos específicos para la glicoproteína E.

23. El método de la reivindicación 22 en el que dicha etapa (b) de detección se basa en la presencia o ausencia de una respuesta de anticuerpos específicos para la glicoproteína E.

24. El método de la reivindicación 19 en el que dicha etapa (a) de análisis incluye métodos inmunohistoquímicos in situ para detectar la actividad enzimática de \beta-galactosidasa.

25. El método de la reivindicación 19 en el que dicha etapa (a) de análisis incluye métodos inmunohistoquímicos in situ para detectar la proteína \beta-galactosidasa.

26. El método de la reivindicación 19 en el que dicha etapa (a) de análisis incluye la inmunotransferencia para detectar la proteína \beta-galactosidasa.

27. El método de la reivindicación 19 en el que dicha etapa (a) de análisis incluye métodos histoquímicos in situ para la detección de la glicoproteína E.

28. El virus recombinante con el número de accesión VR-2637.

29. Un plásmido con el número de accesión 203607.

30. El uso del herpesvirus bovino recombinante de la reivindicación 1 para la preparación de una vacuna para inmunizar al ganado contra el herpesvirus bovino tipo I.