ES2279127T3 - Procedimiento para aumentar una respuesta inmunitaria de vacunacion de acido nucleico. - Google Patents

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Abstract

Composición para el suministro conjunto a una célula de un ácido nucleico y una proteína auxiliar que comprende vesículas formadas por componentes anfífilos, en la que el ácido nucleico codifica en un sujeto animal operativamente una proteína antigénica o parte de la misma que comparte por lo menos un epítopo con la proteína auxiliar, comprendiendo la composición dicho ácido nucleico y dicha proteína auxiliar asociados a las mismas vesículas tanto uno como el otro, en la que la composición contiene ácido nucleico y proteína en una proporción en peso en el intervalo comprendido entre 1.000:1 y 1:1.

Description

Procedimiento para aumentar una respuesta inmunitaria de vacunación de ácido nucleico.
La presente invención se refiere a composiciones para el suministro conjunto de ácido nucleico y proteína. Suministro conjunto significa el suministro en la misma vesícula, y éste se cree que produce el suministro de ambos conjuntamente a la misma célula. Las composiciones son útiles para generar una respuesta inmunitaria. En particular, el ácido nucleico codifica operativamente una proteína antigénica o proteína del mismo, cuya secuencia es homóloga, preferentemente idéntica, a la de una "proteína auxiliar" que forma parte de las composiciones.
Los antígenos proteicos procedentes de patógenos han sido utilizados desde hace mucho tiempo en vacunas, se han diseñado para provocar respuestas inmunitarias mediadas por anticuerpos neutralizantes o células en el receptor, específico para el antígeno. Las proteínas sin embargo generalmente no son útiles para provocar determinados tipos de respuesta inmunitaria mediada por células, particularmente la generación de células T activadoras (incluyendo las células T citotóxicas), que son componentes deseables de la respuesta para muchísimas vacunas (particularmente las dirigidas contra patógenos intracelulares o antígenos cancerosos). Recientemente, se han desarrollado vacunas basadas en el ADN desnudo, normalmente ADN plásmido producido a partir de E. coli pero que contienen secuencias activadoras apropiadas para la expresión en células de mamífero. Estas últimas vacunas se ha sabido que son útiles en la generación de inmunidad mediada por células (lo que implica células T activadoras, tales como las células T específicas para el antígeno que segregan interferón-\gamma y células T citotóxicas específicas para el antígeno), pero son deficientes para generar anticuerpos contra el antígeno codificado y expresado. Los anticuerpos son un componente importante de la respuesta inmunitaria protectora de muchísimos patógenos particularmente bacterias y determinados virus tales como los virus de la gripe. Se han propuesto y explorado varios remedios para rectificar las insuficiencias de vacunas a base de ADN como se describe a continuación.
La formulación liposómica se ha utilizado para aumentar la inmunogenicidad de antígenos de la vacuna, en forma de proteína, durante muchos años. La formulación liposómica ha sido aplicada también en los últimos años a la formulación de ADN para vacunas. Existen estudios que han descrito la formulación conjunta de ADN plásmido con proteínas que utilizan liposomas. Sin embargo, estos estudios de formulación conjunta liposómica de ADN con proteína han utilizado generalmente plásmidos que codifican citocinas inmunoestimulantes u otras proteínas biológicamente activas, aparte del propio antígeno. Parece innecesario incorporar la forma proteica del propio antígeno en la composición de vacuna que contiene un ácido nucleico que está diseñado para expresar la proteína in vivo. Los solicitantes son conscientes únicamente de una publicación que ha utilizado antígeno proteico como aditivo en la formulación junto al ADN (Alvarez-Lajonchere, L. et al. Mern Inst. Oswaldo Cruz, Río de Janeiro, 97(1):95-99, enero de 2002). A diferencia de la presente invención, estos autores no han observado ningún aumento de la respuesta del anticuerpo en formulaciones conjuntas del ADN que codifica al antígeno y su proteína afín en comparación con inmunizaciones con la proteína sola. Las formulaciones utilizadas por Álvarez-Lajonchere et al. comprendían mezclas del ácido nucleico activo (un plásmido que codifica el antígeno del núcleo del virus de la hepatitis C) más ADN portador improcedente y polietilenglicol, y la proteína. Después de la inyección, la proteína y el ADN activo (que no estaban físicamente asociados en la mezcla) se difundirían independientemente y alcanzarían a las células presentadoras del antígeno por separado. Los descubrimientos negativos de Álvarez-Lajonchere, sugerirían, a un experto en la materia, que la formulación de la proteína con su ADN afín no era una vía prometedora para conseguir respuestas inmunitarias mejores, por lo menos respuestas del anticuerpo no mejoradas.
En el documento WO-A-9930733 se propone que la respuesta inmunitaria a una vacuna de ácido nucleico sea aumentada por la administración simultánea de una proteína análoga. Los dos componentes no necesitan ser administrados en la misma composición. Ambos deben ser administrados únicamente durante la fase de provocación de la respuesta inmunitaria estando la proteína preferentemente enmascarada o retenida hasta después de que el ácido nucleico haya cebado el sistema inmunitario. En algunos ejemplos una vacuna está compuesta por ADN desnudo y antígeno proteico desnudo en mezcla física. En otros el antígeno proteico se formuló para la liberación retardada en una formulación de polímero-alúmina biodegradable mezclada con ADN desnudo.
En el documento WO-A-9728818 las vacunas están concebidas para suministrar ácido nucleico y antígeno proteico a células presentadoras del antígeno. El ácido nucleico puede expresar la misma proteína como antígeno proteico. El ácido nucleico y la proteína están acomplejados, p. ej. por conjugación covalente. El complejo puede estar formulado como partícula viriforme sintética. Se sugiere también que los sistemas liposómicos pueden utilizarse pero no hay ejemplos en cuanto a cómo la proteína y el ácido nucleico deberían incorporarse a dichos sistemas, ni la memoria incluye resultados cuantitativos para las pruebas in vivo pero predice resultados que pueden no ocurrir en la práctica, especialmente respuestas de clase II.
Es conocido que el ADN plásmido no codificante tiene una acción inmunoadyuvante cuando está ocluido conjuntamente con partículas en vesículas liposómicas (Gursel, M. et al. Vaccine (1999) 17: 1376-1383) y que el ADN con motivos CpG presenta un efecto inmunoadyuvante sobre el ADN desnudo y las vacunas de péptido (Klinman, D. M. et al. Vaccine (1999) 17: 19-25).
En la presente invención sin embargo, los autores imaginaron que si lograban asociar físicamente ácido nucleico, tal como ADN, junto con su proteína afín y ocluirlos, las dos entidades llegarían a células presentadoras de antígeno juntos, produciendo el tratamiento y la presentación de la forma proteica adquirida del antígeno, junto con la expresión de la forma codificada por el ADN de la proteína antigénica en la misma célula. Dado que el tratamiento del antígeno de las proteínas expresadas se produce por una serie de reacciones diferentes y con cinéticas que son algo diferentes a las de las proteínas adquiridas, los autores imaginaron que dicho suministro conjunto de ADN asociado con su proteína afín proporcionaría una oportunidad para un efecto aditivo o sinérgico de estos dos modos de presentación del antígeno y una respuesta inmunitaria mejorada. Actualmente los autores han demostrado esta nueva hipótesis con formulaciones vesiculares de ADN y su proteína afín que proporcionan la asociación del ADN y la proteína. A diferencia de Álvarez-Lajonchere et al., los autores han descubierto que son posibles composiciones de vacuna especiales, de ADN asociado (mediante liposomas) con su proteína afín, denominada "proteína auxiliar", en las que se observan respuestas del anticuerpo aumentadas tras la inmunización (en comparación con la inmunización con proteína sola, o con ADN solo). Los autores han descubierto que si el ADN y la proteína se formulan en partículas por separado, y se mezclan las partículas, entonces los autores no han observado ningún aumento de producción de anticuerpos. Estas observaciones son coherentes con su teoría de el suministro conjunto de ADN y la proteína auxiliar de la misma célula presentadora del antígeno, aunque los autores reconocen que pueden existir otras explicaciones teóricas que no pueden excluirse en este momento.
En los métodos: A companion to methods in Enzymology, Academic Press Inc.,New York, US, 19(1) septiembre de 1999, 156-162, Gregoriadis et al. describen la oclusión en liposomas de vacuna utilizando el método de deshidratación-rehidratación. La vacuna puede ser de virus o bacterias inactivadas, o alternativamente de ADN plásmido.
La presente invención proporciona una composición para el suministro conjunto a una célula de un ácido nucleico y una proteína auxiliar que comprende vesículas formadas por componentes anfífilos, en la que el ácido nucleico operativamente en un sujeto animal codifica una proteína antigénica o parte de la misma que comparte por lo menos un epítopo con la proteína auxiliar, comprendiendo la composición dicho ácido nucleico y estando asociada dicha proteína auxiliar con las mismas vesículas que otra, en la que la composición contiene ácido nucleico y proteína en una proporción en peso comprendida en el intervalo entre 1.000:1 y 1:1.
La expresión proteína auxiliar se refiere a aquellas proteínas o fragmentos de proteínas, proteínas de un solo tipo o proteínas de diferentes tipos.
La proteína antigénica codificada por el ácido nucleico es generalmente la proteína de interés: es decir, el antígeno diana contra el que se desea una respuesta inmunitaria beneficiosa en un paciente. La proteína auxiliar es generalmente idéntica a la forma expresada de proteína antigénica codificada por ácido nucleico, es decir, la proteína afín del ácido nucleico. La proteína antigénica y/o la proteína auxiliar pueden comprender cada una (por separado) la secuencia completa de la proteína natural de la fuente pertinente. Preferentemente el ácido nucleico codifica el antígeno proteico natural completo. Alternativamente, el ácido nucleico puede codificar una parte solamente de la proteína natural, que incluye por lo menos uno de los epítopos de la proteína auxiliar. En una forma de realización favorable de la invención, dicho epítopo es un epítopo de linfocito B que está expuesto sobre la superficie de un agente infeccioso en su forma natural. El ácido nucleico puede codificar una parte solamente de la proteína natural, incluyendo por lo menos uno de los epítopos del agente natural. El agente es, por ejemplo, un microorganismo, por ejemplo una bacteria o una levadura o un virus. Asimismo, la proteína auxiliar contendría epítopos procedentes de la fuente respectiva que son (en una forma de realización) accesibles a la superficie cuando la fuente está en su medio natural. Alternativamente y prácticamente, tanto la proteína antigénica como la proteína auxiliar comparten epítopo(s) con un producto tóxico segregado de un patógeno, tal como la toxina del tétanos, apropiado para la neutralización de dicha toxina. Asimismo, tanto la proteína antigénica como la proteína auxiliar pueden compartir epítopo(s) entre sí, que está(n) también compartido(s) con un producto segregado de un patógeno distinto de una toxina, tal como el análogo de interleucina-10 codificado por el virus de Epstein-Barr y segregado por las células infectadas con el virus de Epstein-Barr.
Los autores han formulado dos teorías relacionadas para explicar el rendimiento mejorado de las nuevas composiciones que no son mutuamente expuestos. Los autores se refieren a estas teorías como teorías general y específica (tal como se describe a continuación).
1. Teoría general
La teoría general plantea que el rendimiento mejorado del material formulado conjuntamente de manera apropiada (en el que tanto el ADN como su proteína afín están asociados a una sola vesícula, de modo que las vesículas en una población tienen tanto ADN como proteína) es debido a la obtención tanto de ácido nucleico como de su proteína afín (proteína auxiliar) por la misma célula presentadora del antígeno (es una célula presentadora del antígeno clásica tal como un macrófago o una célula dendrítica, o un linfocito B, es específica para el antígeno o no específico para el antígeno). El suministro conjunto del ADN y su proteína afín a la misma célula permite una interacción sinérgica en la respuesta inmunitaria resultante que no sería posible si el ADN hubiera de ser proporcionado por una célula presentadora del antígeno, y la proteína por otra. (Las composiciones descritas anteriormente no proporcionan o reconocen la importancia del suministro conjunto del ADN y su proteína afín a la misma célula presentadora del antígeno).
2. Teoría específica
La teoría específica plantea que el rendimiento mejorado del material formulado conjuntamente de manera apropiada (en el que tanto el ADN como su proteína afín están asociados a una sola vesícula, de modo que las vesículas en una población tienen tanto ADN como proteína) implica el direccionamiento (por el antígeno en forma de proteína, expuesto en la superficie de la partícula) de la vesícula a células B específicas del antígeno, suministrando selectivamente de este modo tanto el ADN como su proteína afín de una manera dirigida a la misma célula B específica para el antígeno. Dado que las células B específicas para el antígeno proliferarán normalmente en el curso de una respuesta inmunitaria, estas células proliferantes existen probablemente para formar mejores dianas para la transducción por el ácido nucleico presente asimismo en la partícula que lo serían las células no proliferantes. Como en el caso de la teoría general anterior, el suministro conjunto del ADN y de la proteína afín a la misma célula permite una interacción sinérgica en la respuesta inmunitaria resultante que no sería posible si el ADN hubiera de ser proporcionado por una célula presentadora del antígeno (en este caso una célula B específica para el antígeno), y la proteína por otra. En la forma específica de la teoría, las partículas son capturadas por los receptores específicos para el antígeno (es decir anticuerpos superficiales) de células B, y el ácido nucleico más su proteína afín (proteína auxiliar) son ambos absorbidos por cada una de las células B específicas del antígeno.
La eficacia de la inmunización basada en ácido nucleico está limitada por la baja eficacia de transducción que se consigue in vivo con formulaciones desprovistas del ácido nucleico que codifica el antígeno (p. ej. ADN desnudo), de modo que pocas células recogen y expresan el ácido nucleico de interés. En la ejemplificación de la presente invención los autores han utilizado composiciones vesiculares, principalmente liposómicas, para conseguir la protección del ADN a partir de nucleasas in vivo, y para permitir la formulación conjunta del ADN y su proteína afín (proteína auxiliar) en la misma partícula, aunque debería ser evidente para el lector que pueden utilizarse otras composiciones vesiculares para conseguir la asociación de ADN con su proteína afín para conseguir las propiedades necesarias de suministro conjunto definidas en la presente memoria.
En una composición preferida específica según la invención, las vesículas comprenden liposomas formados a partir de materiales que forman liposomas, es decir formadas por bicapas de lípido. Las vesículas pueden alternativamente ser monocapa. Los liposomas pueden comprender componentes anfífilos sintéticos, tales como moléculas de tipo tensioactivo. Las vesículas no iónicas de este tipo son conocidas con frecuencia como niosomas. Las vesículas pueden no comprender fosfolípidos, pero preferentemente se basan sustancialmente en fosfolípidos.
En el transcurso de los estudios de los autores que utilizan composiciones liposómicas los autores procuraron obtener una oclusión conjunta eficaz y/o una asociación de proteína y ADN en las mismas partículas liposómicas. Los autores descubrieron que las composiciones liposómicas que han desarrollado para la encapsulación y protección del ADN frente a nucleasas y para la inmunización del ADN (descritas en su caso preliminar WO-A-9810748) son también muy eficaces en la encapsulación conjunta de la proteína y el ADN al mismo tiempo. Sorprendentemente, en las condiciones definidas en la presente memoria para la formulación de los liposomas, el ADN y la proteína no compiten entre sí por la asociación o el contenido en la partícula de liposoma. Además, son también capaces de desplegar cantidades significativas de la proteína auxiliar en forma antigénicamente activa en la superficie de la partícula liposómica. Los autores creen que el antígeno proteico localizado en la superficie de su nueva composición (proteína auxiliar) pueden ser capaces de reconocer liposomas, o fragmentos de liposomas generados in vivo procedentes de la destrucción de estas estructuras, en linfocitos B específicos para el antígeno.
Aunque el ADN formulado en liposomas puede ser dirigido a receptores en células presentadoras del antígeno, p. ej. colocando ligando para los receptores celulares de células presentadoras de antígeno en la superficie de liposomas (p. ej. grupos manosilo o proteínas de complemento tales como C3d), el propio antígeno no se ha utilizado previamente como dispositivo de direccionamiento en vacunas a base de ácido nucleico.
Las nuevas composiciones permiten la presentación simultánea por células presentadoras de antígeno de ambas formas de proteína proporcionada del antígeno (proteína auxiliar), más la forma expresada de la proteína procedente de su ácido nucleico afín. Dicha composición permite un nuevo efecto del primer refuerzo por el cual las diferentes cinéticas de presentación de la proteína antigénica expresada y la proteína auxiliar (con máximos en diferentes tiempos) proporcionan una duración mayor y exposición con "acierto doble" de las células inmunitarias aplicables al antígeno. A diferencia de otros fenómenos de primera dosis-refuerzo en el campo de las vacunas de ácido nucleico, las nuevas composiciones proporcionan funciones de primera dosis y de refuerzo con una sola dosis.
Otra característica ventajosa de las nuevas composiciones se refiere a los diferentes modos de presentación del antígeno de las dos formas (forma añadida y formas expresadas in vivo de la proteína). Dado que las proteínas proporcionadas y expresadas están presentadas por dos series de reacciones distintas en las células presentadoras del antígeno (la anterior que se produce en la presentación del péptido por MHC de clase II, la última por MHC de clase I) la nueva invención proporciona una respuesta inmunitaria más amplia que implica la estimulación de células T colaboradoras (restringidas a la clase II), células T activadoras restringidas a la clase II y células T citotóxicas (restringidas a la clase I). El micromedio celular creado por las nuevas composiciones (en el que tanto la presentación de clase II como la de clase I son las que tienen lugar en la misma superficie de la célula presentadora del antígeno) permite las interacciones entre los diferentes tipos de célula T que emplean la célula presentadora del antígeno. Dado que ambos tipos de célula T (restringidos a la clase I y a la clase II) pueden estimularse durante la interacción con la misma célula presentadora del antígeno, y por interacciones entre sí aunque presentes simultáneamente en la superficie de la célula presentadora del antígeno, la nueva formulación tiene varias ventajas teóricas sobre los métodos descritos anteriormente y las composiciones para la inmunización del ácido nucleico. En esta memoria los autores describen que las ventajas teóricas están confirmadas en la práctica a nivel de respuestas del anticuerpo al antígeno. Los autores prevén sin embargo que se descubrirán más ventajas para la nueva estrategia de formulación en la estimulación de la inmunidad mediada por células (incluyendo las respuestas de células T cooperadoras y las respuestas de células T activadoras que incluyen células T citotóxicas). Dado que las respuestas del anticuerpo a los antígenos proteicos son muy dependientes de células T, los datos presentados en esta solicitud sobre la producción de anticuerpos sugieren de manera acusada que las nuevas composiciones son eficaces en la estimulación (por lo menos) de respuestas de célula T cooperadora (restringida a la clase II de MHC). El hecho de que la nueva estrategia de formulación proporcione estimulación simultánea de células citotóxicas cooperadoras restringidas a la clase II y restringidas a la clase I en la misma célula presentadora del antígeno, sugiere también que la estrategia será eficaz en la estimulación de respuestas a células T citotóxicas. Por lo tanto, la proteína auxiliar proporcionará ayuda adicional a las respuestas de células T citotóxicas: es decir, aumentará la concentración y/o duración de la expresión de epítopos de péptidos restringidos a la clase II de MHC del antígeno reconocido por las células T cooperadoras en la superficie de la célula presentadora del antígeno, aumentando las oportunidades para la cooperación de la célula T de respuestas de la célula T citotóxica a la forma expresada para el antígeno proteico presentado por la serie de reacciones de MHC de clase I.
Una respuesta inmunitaria requiere la cooperación entre diferentes células del sistema inmunitario, a saber células presentadoras del antígeno (tales como macrófagos y células dendríticas, que son conocidas como células presentadoras del antígeno "clásicas"), células T (linfocitos T) y células B (linfocitos B). Las células B tienen capacidad para presentar antígenos a células T, de una manera que es en varios aspectos análoga a la presentación por las células presentadoras del antígeno convencionales. Es durante esta interacción célula B-célula T que las células B consiguen la "cooperación" necesaria para producir antígenos específicos. A diferencia del antígeno clásico que presenta células sin embargo, las células B no son útiles para la obtención de antígenos en partículas. Algunas células B sin embargo (es decir, aquellas que son específicas para un antígeno dado) son particularmente útiles para la presentación del antígeno porque son capaces de proporcionar y concentrar pequeñas partículas de antígeno (incluyendo moléculas de antígeno) por sus receptores de inmunoglobulina de superficie específicos para el antígeno. En comparación con las células B no específicas para el antígeno, las células B específicas para antígeno son por lo menos 1.000 veces más eficaces en la presentación del antígeno a células T restringidas de clase II (Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature 11 al 17 de abril de 1985; 314(6011):537-9). Las células B específicas para el antígeno pueden ser por lo tanto importantes objetivos para las composiciones de la presente invención, ya que tienen capacidad para conseguir partículas de proteína antigénica y su ADN asociado.
Las células T y las célula B reconocen antígenos de diferentes maneras. Estos modos diferentes de direccionamiento tienen implicaciones para los diferentes modos de forma de realización de la presente invención. A fin de comprender las formas de realización favorables de la invención en primer lugar es necesario apreciar las propiedades de estos modos diferentes de direccionamiento. Las células T reconocen fragmentos de péptido de proteínas impregnadas en antígenos MHC de clase II o de clase I en la superficie de las células mientras que las células B (que producen finalmente anticuerpo) reconocen propiedades de la superficie del antígeno no fragmentado (que habitualmente es de carácter proteico), por receptores del antígeno de tipo anticuerpo o sus superficies celulares. Los diferentes requisitos de direccionamiento de las células T y de las células B están reflejados en la naturaleza diferente de sus epítopos. Por lo tanto mientras que las células B deben reconocer las propiedades de superficie de un antígeno o de un patógeno (epítopos de célula B), los epítopos de células T (que comprenden péptidos de aproximadamente 8 a 12 aminoácidos de longitud), no están obligados a estar presentes en la superficie de un antígeno, y pueden ser "internos" así como "externos" cuando se observan en el contexto de la estructura tridimensional del antígeno. Según la "teoría específica" de la presente invención (como se definió anteriormente) la situación más favorecida de un epítopo de célula B es la "superficie" en el antígeno o patógeno, que facilita la absorción y estimulación de células B específicas del antígeno por [ácido nucleico + proteína] liposómico formulado de manera apropiada. Sin embargo, según la teoría general de la invención (donde las células presentadoras del antígeno obtienen liposomas de manera no específica para el antígeno], un epítopo (particularmente un epítopo de célula T) puede estar situado internamente en la estructura del antígeno, y no se requiere que esté disponible o expuesto sobre la superficie del antígeno o del agente.
En una forma de realización favorable de la invención tanto la proteína antigénica como la proteína auxiliar proceden de un antígeno de la superficie de una proteína vírica. Las proteínas pueden tener las mismas secuencias que otra o pueden estar mutadas, pueden tener partes eliminadas, o pueden estar fusionadas a otros polipéptidos, con la condición de que compartan por lo menos un epítopo (célula B o célula T) preferentemente varios.
Las partes de la proteína que la proteína antigénica y la proteína auxiliar tienen en común pueden expresarse desde el punto de vista de sus homologías de secuencia. Se cree que las proteínas deberían ser tales que la proteína auxiliar tuviera por lo menos una secuencia contigua de por lo menos diez restos con por lo menos el 50%, preferentemente por lo menos el 75%, más preferentemente por lo menos el 90%, de similitud con una secuencia contigua de la misma longitud de la proteína antigénica. Generalmente las secuencias contiguas respectivas son por lo menos de cincuenta restos de longitud, y presentan por lo menos el 90% de similitud de secuencia, preferentemente por lo menos el 75% de similitud de secuencia. Más preferentemente dichas secuencias contiguas tienen por lo menos el 50%, preferentemente por lo menos el 75%, más preferentemente por lo menos el 90% de identidad de secuencia.
La similitud de secuencia es solamente un índice de similitud estructural sin embargo, y en el caso de la "teoría especial" (definida anteriormente) es necesario únicamente que la proteína auxiliar y la proteína codificada y expresada compartan un solo epítopo de célula B (definido como reconocido por un solo anticuerpo que reconoce al agente) sin ningún requisito para la homología de secuencia.
Las composiciones de la invención son útiles para generar una respuesta inmunitaria, por ejemplo que es suficiente para resistir la infección, por un agente infeccioso. La proteína antigénica y la proteína auxiliar proceden preferentemente por lo tanto de una fuente que es un agente infeccioso, por ejemplo un microorganismo tal como una bacteria o un virus. Propiamente el virus es un virus, contra el que se conocen respuestas inmunitarias (o se cree que es) capaz de neutralizar o eliminar el virus, por ejemplo un virus de hepatitis (tales como los virus de la hepatitis B o C) o un virus de la gripe (tales como los virus de la gripe A o B). Propiamente el agente infeccioso puede ser una bacteria, tal como un estreptococo (p. ej. Streptococcus pneumoniae, o un miembro de los estreptococos del grupo A o del grupo B) o un agente capaz de producir meningitis tal como los grupos A, B y C de meningococos o Haemophilus influenzae, u organismos capaces de producir infecciones en el oído en niños tales como la Moraxella cattharalis. Propiamente el agente puede ser una microbacteria tal como Mycobacterium tuberculosis. Propiamente el antígeno puede ser también una proteína hospedadora que se expresa selectivamente en células o tejidos cancerosos o dentro de ellos, tal como un antígeno carcinoembrionario, o CD55 (proteína complementaria de referencia) o una integrina u otro marcador del sistema vascular del tumor. El antígeno objetivo de esta nueva composición de vacuna puede ser también una proteína o péptido hospedador que requiera la neutralización o eliminación tal como un anticuerpo potente, o un péptido tal como un péptido beta amiloide de la enfermedad de Alzheimer en sus varias formas (A-beta 40 y A-beta 42).
El antígeno objetivo de la vacuna puede ser también un carbohidrato, tal como un polisacárido bacteriano, en el que la forma de la proteína expresada y/o la proteína auxiliar simula(n) la estructura antigénica de dicho antígeno carbohidrato. Se han descrito simuladores de péptido adecuados del polisacárido meningocócico del grupo B (Laing, Granoff Granoff D. M. y Moe G. R. Molecular mimetics of meningococcal B epitopes. Patente US nº 6.030.619) y del polisacárido estreptocócico del grupo B. Dichos péptidos pueden expresarse como formas concatenadas en las que las formas de realización de secuencias de péptido diferentes del epítopo carbohidrato están unidas conjuntamente a nivel del ADN para formar un polipéptido o proteína que comprende epítopos repetidos de secuencia diferente.
Según la presente invención, el(los) epítopo(s) objetivo contra el que se desea una respuesta inmunitaria beneficiosa deberían corresponder a el(los) epítopo(s) que están compartidos entre la proteína codificada por el ADN y la proteína auxiliar. La posición del (de los) epítopo(s) objetivo in situ del antígeno diana puede ser accesible a los anticuerpos (tales como los epítopos neutralizantes de la hemoaglutinina de la gripe A), pero alternativamente pueden útilmente también ser internos en el agente (tal como una proteína de choque térmico de Mycobacterium tuberculosis).
La proteína auxiliar, aunque normalmente es muy similar o idéntica a la proteína codificada por el ácido nucleico en la composición, puede ser el virus completo (virión) o una "escisión" de la preparación vírica (tal como las preparaciones conocidas de virus de la gripe lisadas con detergente) con la condición de que contengan una proteína que tenga por lo menos (y preferentemente varios) epítopos compartidos con la proteína codificada por el ácido nucleico. La proteína auxiliar no estaría compuesta generalmente por un virus viable capaz de replicación en un animal huésped.
En la invención el ácido nucleico puede ser ARN, pero preferentemente es ADN y preferentemente de doble cadena. El ADN que codifica operativamente un antígeno debería comprender preferentemente un activador y, preferentemente, secuencias de control. Propiamente el ADN es ADN plásmido, convenientemente derivado del plásmido C1 de E. coli, pero podría ser ADN lineal.
Puede resultar deseable en la invención incluir un ácido nucleico que codifique más de una proteína y/o incluir una o más proteínas auxiliares diferentes. Para esta forma de realización, se prefiere que se haya asociado una sola vesícula con este ácido nucleico que codifica una proteína antigénica que comparte epítopos como se describió anteriormente con la proteína antigénica o auxiliar asociada a esta partícula. Por ejemplo la composición de la invención puede comprender dos o más tipos diferentes de liposoma mezclados, por ejemplo uno de los cuales comprende ácido nucleico que codifica una primera proteína antigénica con una primera proteína auxiliar, estando relacionadas la proteína antigénica y la proteína auxiliar como se describió anteriormente, y un segundo tipo de liposoma que comprende ácido nucleico que codifica una segunda proteína antigénica asociada a una segunda proteína auxiliar relacionada con la segunda proteína antigénica como se describió anteriormente. Alternativamente, un solo liposoma puede contener dos o más ácidos nucleicos diferentes, uno de los cuales codifica una primera proteína antigénica y el otro codifica una segunda proteína antigénica (etc.), y la primera y segunda (etc.) proteína auxiliar, estando relacionadas las primera y segundas proteínas auxiliares con las primera y segunda proteínas antigénicas respectiva descritas anteriormente. Las dos o más proteínas antigénicas pueden formar parte de la misma molécula de proteína expresada (es decir una proteína de fusión), codificada por un solo ácido nucleico. Alternativamente, dos o más componentes de ácido nucleico independientes, que codifica cada uno diferentes partes de una proteína antigénica, pueden estar incluidos (con la proteína) en un solo liposoma. Una composición favorable puede comprender también los ADN formulados conjuntamente respectivamente y sus proteínas afines (proteínas auxiliares), con la condición de que cada ADN esté asociado a su proteína afín o auxiliar en el mismo liposoma.
La misma disposición de ácido nucleico y proteína puede conseguirse en las composiciones vesiculares de la invención formadas por componentes no fosfolipídicos.
Las formas de realización que implican más de una proteína antigénica, descritas en el párrafo anterior, pueden ser de especial valor cuando la composición va a utilizarse para generar una respuesta inmunitaria, generalmente vacunar a un paciente, contra un agente infeccioso que pueda existir en varias cepas infecciosas. Esta forma de realización de la invención es de especial valor cuando el agente infeccioso es un virus, especialmente un virus de la gripe. Por lo tanto las proteínas antigénicas codificadas por el ácido nucleico y sus proteínas auxiliares correspondientes, pueden proceder de cepas A y B de virus de la gripe. Una forma de realización preferida comprendería dos cepas en circulación (o previstas) actualmente de la gripe A, más una cepa en circulación (o cepa prevista) actualmente de la gripe B. La composición comprendería de manera favorable las seis entidades moleculares asociadas a una sola vesícula (p. ej. una partícula liposómica) de modo que cada partícula esté asociada a los tres ácidos nucleicos y a las tres proteínas. Otra forma de realización favorable que incorpora los virus de la gripe comprendería tres formulaciones vesiculares creadas por separado que comprenden {proteína Ai + ADNAi}; {proteína Aii + ADNAii} y {proteína B + ADN B} (en los que las llaves indican la carga útil de cada partícula) mezcladas junto con una dosis individual o administrada en tres dosis por separado a un receptor humano o animal.
En una forma de realización útil de la invención, el ácido nucleico está por lo menos parcialmente, y preferentemente de manera sustancial, ocluido en su totalidad dentro del espacio intravesicular de las vesículas, normalmente liposomas. Cuando está ocluido en el espacio intravesicular, el ácido nucleico se protege óptimamente de su medio, pero no obstante puede ser suministrado en las células apropiadas una vez administrado a un paciente. Alternativamente, pero menos preferentemente, el ácido nucleico puede estar acomplejado con las vesículas, es decir, estar asociado principalmente a la superficie externa de las vesículas. Dicha disposición proporciona un grado inferior de protección durante la administración y el suministro del ácido nucleico, pero puede también ser eficaz.
En una forma de realización de la presente invención la proteína auxiliar es, preferentemente, por lo menos en parte, accesible a la superficie externa de la vesícula. Esto permitirá la consecución de la vesícula por las células B específicas para el antígeno, y, después de la producción de anticuerpos en las etapas iniciales de la respuesta inmunitaria a la composición de la vacuna, facilitará la absorción de las vesículas acomplejadas por el anticuerpo por las células presentadoras del antígeno por receptores Fc-gamma de gran afinidad que reconocen a IgG específica para el antígeno unido a la superficie en la superficie de la vesícula. Asimismo, el antígeno situado en la superficie en una vesícula liposómica u otras permitirá la fijación del complemento, produciendo la absorción de las vesículas y sus fragmentos por receptores del complemento en las células presentadoras del antígeno y las células B. Para conseguir estos resultados, la proteína puede estar únicamente acomplejada con la superficie externa de la vesícula (p. ej. por interacciones electrostáticas o hidrófobas, en el modo de una proteína de la membrana extrínseca) o, preferentemente, está impregnada en la pared de la vesícula (p. ej. mediante una secuencia de cadena polipeptídica hidrófoba a través de la bicapa) que permanece parcialmente expuesta al medio extravesicular. En cada caso, según esta forma de realización, el epítopo de interés sería accesible desde el exterior de la vesícula. Dicha accesibilidad puede determinarse realizando experimentos de unión que utilizan anticuerpos contra el epítopo respectivo. Dichos datos de unión que demuestran la exposición superficial se describen en las figuras asociadas a este texto para el trabajo de los autores en la formulación conjunta del ADN y la proteína para el virus de la gripe A.
Cuando la vesícula es liposómica, los componentes formadores de liposoma utilizados para formar los liposomas pueden incluir grupos lipídicos neutros, bipolares, aniónicos y/o catiónicos. Éstos pueden utilizarse en cantidades relativas tal como para conferir una carga general sobre el liposoma o, menos preferentemente, los liposomas pueden no tener ninguna carga general. Se observa que el utilizar componentes lipídicos de modo que el liposoma tenga una carga positiva general puede proporcionar buenos resultados (véase el apartado de datos de esta solicitud). Además de los componentes que se denominan propiamente lípidos, incluyendo glicéridos y colesterol, los componentes que forman liposomas pueden incluir componentes no lipídicos (es decir que no son lípidos naturales) tales como agentes tensioactivos no iónicos o catiónicos.
Según una forma de realización particularmente preferida de la invención, la nueva composición comprende liposomas formados a partir de componentes que forman liposomas incluyendo por lo menos un componente con carga catiónica en una cantidad tal que los liposomas tengan una carga positiva general.
En esta forma de realización de la invención el componente catiónico incorporado en el liposoma puede ser cualquiera de los que han sido utilizados en preparaciones de liposomas para mejorar la tasa de transfección por acomplejamiento con polinucleótidos. El componente puede ser un compuesto lipídico o no lipídico y puede ser sintético o natural. Los lípidos catiónicos preferidos son 1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP), 1,2-bis(hexadeciloxi)-3-trimetilaminopropano (BisHOP), cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi) propil]-N,N,N-trietilamonio (DOTMA) y otros lípidos de estructura I definida en el documento US-A-4.897.355 o análogos del éster.
La estructura es la siguiente:
1
o un isómero óptico de la misma, en la que Y1 e Y2 son iguales o diferentes y cada uno son -O- u O-C(O)- en la que el carbono del carbonilo se une a R1 o R2 como puede ser el caso; R1 y R2 son independientemente un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo de 6 a 24 átomos de carbono, R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, arilo o aralquilo de 6 a 11 átomos de carbono; alternativamente dos o tres de R3, R4 y R5 están combinados con el átomo de nitrógeno con carga positiva para formar una estructura cíclica que tiene de 5 a 8 átomos de carbono, en la que , además del átomo de nitrógeno con carga positiva, los átomos en la estructura son átomos de carbono y pueden incluir un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre; n es 1 a 8; y X es un anión.
Las formas de realización preferidas son composiciones en las que R1 y R2 individualmente tienen de 0 a 6 puntos de instauración, y presentan la estructura
2
en la que la suma de a y c está comprendida entre 1 y 23; y b está comprendido entre 0 y 6. Más preferentemente cada R1 y R2 es oleilo. Las formas de realización particularmente preferidas son composiciones en las que los grupos alquilo de cadena larga son ácidos grasos, es decir, en los que Y1 e Y2 son semejantes y son -O-C(O).
Alternativamente pueden utilizarse los lípidos catiónicos de estructura general I o de estructura general II definidos en el documento US-A-5.459.127.
Otros compuestos catiónicos adecuados son el componente no lipídico estearilamina y 3\beta[N-N'N'-dimetilaminoetano)-carbamil] colesterol (DC-Col) (componente lipídico) o análogos del mismo.
Los liposomas, además de comprender componentes catiónicos, comprenden generalmente también componentes no iónicos y/o bipolares que incluyen lípidos, que pueden ser fosfolípidos u otros lípidos que no incluyen grupos fosforilo. Preferentemente los lípidos incluyen fosfolípidos, tales como fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas naturales o sintéticos en algunos de los cuales los grupos alquilos de cadena larga (que pueden estar unidos por enlaces éster o éter) pueden estar saturados o insaturados. Preferentemente los grupos acilo de los lípidos de glicérido están insaturados. Los componentes pueden incluir componentes no lipídicos, por ejemplo tensioactivos no iónicos tales como monoésteres de sorbitán de ácidos grasos, y/o ácidos grasos etoxilados u otros análogos, tales como lanolinas etoxiladas.
Se consiguen mejores resultados cuando los liposomas incluyen lípidos fusógenos, que son normalmente fosfatidiletanolaminas en los que los grupos acilo están insaturados. Puede incluirse colesterol aunque puede hacer que los liposomas sean demasiado estables para el suministro adecuado de polinucleótido en los dianocitos.
La cantidad de componente catiónico está comprendida preferentemente en el intervalo entre 5 y 50% de los moles totales de los componentes que forman el liposoma, preferentemente en el intervalo entre 10 y 25% molar.
Una composición vesicular está generalmente en forma de una suspensión acuosa por ejemplo, en un tampón fisiológico. Alternativamente puede ser una composición secada para su rehidratación.
La composición preferentemente es una vacuna, por ejemplo adaptada a la administración por las vías subcutánea, intravenosa, intramuscular, intradérmica, nasal, oral, otras a través de las mucosas o pulmonar.
Las vesículas pueden prepararse por algunas de las técnicas formadoras de vesículas utilizadas generalmente. Las vesículas pueden ser vesículas multilaminares o unilaminares y pueden ser relativamente grandes (diámetros de vesículas comprendidos en el intervalo de entre 300 nm y 5.000 nm; preferentemente inferiores a 2.000 nm, preferentemente con diámetros medios comprendidos en el intervalo entre 500 y 1.000 nm) o pequeñas (diámetros de la vesícula comprendidos en el intervalo entre 100 nm y 400 nm preferentemente con diámetros medios comprendidos en el intervalo entre 200 y 300 nm). Preferentemente las vesículas tienen un diámetro medio que no excede de 500 nm, y con preferentemente sustancialmente todas tienen diámetros inferiores a 2.000 nm.
Aunque una composición liposómica de la invención puede estar formada por procedimientos de formación de liposomas convencionales tales como por dispersión de los materiales que forman los liposomas de una película en un medio en suspensión que contiene el ácido nucleico y la proteína, seguido de una o más etapas de ajuste de tamaño, o alternativamente disolviendo conjuntamente los materiales que forman el liposoma y ácido nucleico y/o proteína auxiliar en un disolvente común seguido de una etapa de formación del liposoma que implica la adición de un líquido acuoso, o cargando el ácido nucleico y/o la proteína auxiliar a través de las paredes de liposomas preformados utilizando electroporación por gradiente de concentración o técnicas electroforéticas, un método preferido utiliza una técnica de deshidratación-rehidratación.
En el capítulo del libro de Christopher J. Kirby y Gregory Gregoriadis: ISBN 0-471-14828-8 Encyclopedia of Controlled Drug Delivery Editor: Edith Mathiowitz, publicado en julio de 1999 por Wiley capítulo "L" se describen varios métodos adecuados de formulación liposómica para liposomas. Éstos incluyen (no exhaustivamente) liposomas multilaminares preparados por el método del "apretón de manos"; vesículas de deshidratación/rehidratación (método utilizado en los presentes ejemplos, que es muy eficaz) e hidratación simple de lípidos solubilizados en disolvente. La presencia simultánea de ADN y proteína en estos procedimientos producirá varios grados de oclusión conjunta y otras formas de asociación de ambas entidades con los liposomas. El fosfato cálcico puede utilizarse también para precipitar ADN y proteína conjuntamente dando como resultado una versión "formulación conjunta de proteína con ADN" de la invención de los autores descrita en el documento WO-A-0141739.
Otro método favorecido para la formulación de ADN asociado y su proteína afín es el publicado por Judith Senior y Gregory Gregoriadis (Biochimica et Biophysica Acta 1989; 1003, 58-62). Esta es una variante del método de deshidratación-rehidratación en el que el componente de la "proteína auxiliar" de la presente invención puede incorporarse por conjugación covalente en la superficie de pequeñas vesículas unilaminares (SUV). Dichas SUV se liofilizan a continuación, y se rehidratan a continuación según Senior y Gregoriadis (anteriormente), en una solución del ADN que codifica el antígeno. Las vesículas multilaminares resultantes tienen la mayor parte de la carga útil de proteína en la superficie de la partícula liposómica, que es una forma de realización favorecida de la presente
invención.
Un procedimiento según la invención para formar una composición liposómica comprende las etapas siguientes
a)
proporcionar una suspensión acuosa de pequeñas vesículas unilaminares (SUV) formadas por materiales formadores de liposomas;
b)
poner en contacto la suspensión acuosa de las SUV con ácido nucleico que codifica operativamente una proteína antigénica para formar una suspensión de SUV-ácido nucleico;
c)
deshidratar la suspensión de SUV-ácido nucleico para proporcionar una mezcla deshidratada; y
d)
rehidratar la mezcla deshidratada en un medio de resuspensión acuoso para formar una suspensión de liposomas que contienen ácido nucleico,
incluyendo la etapa de introducción de una proteína auxiliar que comparte por lo menos un epítopo con dicha proteína antigénica por lo cual los liposomas que contienen ácido nucleico se asocian a dicha proteína auxiliar y en la que la proporción en peso de ácido nucleico a proteína auxiliar está comprendida en el intervalo entre 1.000:1 y 1:1.
El método de deshidratación-rehidratación produce ácido nucleico que está ocluido dentro del espacio intravesicular de los liposomas producto. Además puede dejarse una pequeña cantidad en el exterior de los liposomas. La proteína auxiliar puede añadirse en varias etapas diferentes del proceso. Puede ponerse en contacto con una suspensión acuosa de las SUV antes, durante o después de la etapa b y antes de la etapa c. La proteína auxiliar llegará a ocluirse conjuntamente dentro del espacio intravesicular de los liposomas con ácido nucleico.
En un procedimiento alternativo, la proteína auxiliar está presente en el medio en resuspensión durante la etapa de rehidratación. En esta forma de realización, por lo menos una parte de la proteína es probable que esté expuesta a la superficie externa de los liposomas. En otro procedimiento alternativo, la proteína puede ponerse en contacto con la suspensión acuosa de los liposomas que contienen ácido nucleico. Esta forma de realización dará como resultado sustancialmente toda la proteína que está asociada a la superficie externa de los liposomas.
A fin de aumentar el grado de incorporación de la proteína, mientras que todavía se permite la exposición de los epítopos a la superficie externa del liposoma, puede ser deseable en algunas formas de realización conjugar la proteína auxiliar con un grupo lipófilo que es adecuado para impregnarse dentro de la pared del liposoma, tal como un grupo acilo graso. La conjugación puede comprender una parte del procedimiento de preparación para la proteína auxiliar. Alternativamente, la proteína auxiliar puede conjugarse químicamente con un componente del liposoma después de la etapa d.
Cuando los materiales que forman el liposoma incluyen el grupo catiónico de modo que existe una carga catiónica general en los liposomas, puede existir una atracción electrostática adecuada entre los liposomas con carga positiva y la proteína auxiliar, cuando ésta tiene una carga negativa global en condiciones del ambiente de modo que la proteína hidrófoba es necesaria y el acomplejamiento de la proteína proporciona una asociación bastante fuerte.
Preferentemente los materiales que forman el liposoma comprenden por lo menos el 5% en moles del compuesto catiónico.
En la invención la proporción en peso de ácido nucleico a proteína auxiliar está preferentemente comprendida en el intervalo entre 1.000:1 y 1:1 más preferentemente la proporción está comprendida en el intervalo entre 5:1 y 30:1.
La proporción en peso de ácido nucleico a materiales formadores de liposoma está preferentemente comprendida en el intervalo entre 1:100 y 1:1.000 más preferentemente la proporción está comprendida en el intervalo entre 1:100 y 1:300.
En el procedimiento de la invención, las partículas liposómicas utilizadas en la etapa a) tienen preferentemente tamaños comprendidos en el intervalo entre 30 nm y 5.000 nm, aun más preferentemente sustancialmente todos los liposomas tienen diámetros inferiores a 1.000 nm. El procedimiento produce liposomas producto que tienen tamaños de partícula comprendidos en el intervalo entre 200 nm y 5.000 nm, preferentemente comprendidos en el intervalo entre 300 nm y 2.000 nm. Cuando sea necesario, el procedimiento puede implicar una propiedad de control de tamaño. Ésta puede implicar, la incorporación de componentes en el medio de resuspensión que controlan el tamaño del liposoma (tales como azúcares, tal como se describe en el documento WO-A-0156548). Alternativamente el control de tamaño puede implicar una etapa adicional según la etapa d, en el que la suspensión se somete a microfluidización, paso a través de filtros u homogeneización. El tratamiento con ultrasonidos es una opción menos preferida pero viable con este objeto pero se produce inevitablemente en algún nivel de fragmentación de ADN.
Después del procedimiento, se prefiere para los liposomas producto, que comprenden tanto el ácido nucleico como la proteína, someterse a una etapa de purificación, en la que la proteína nucleica no ocluida o la proteína auxiliar, u otros componentes, se eliminan de la suspensión producto. Tales procedimientos de purificación pueden implicar centrifugaciones, filtración, paso a través de membrana porosa de tamaño de poro definido, cromatografía por exclusión en gel, tal como cromatografía por exclusión de tamaño, donde las vesículas aparecen en el volumen vacío.
Los autores han observado que la presente invención es muy eficaz para generar una respuesta inmunitaria cuando se administra a un paciente, particularmente una respuesta del anticuerpo mejorada. Los autores creen que la mejora presentada por la presente invención es debida fundamentalmente al reconocimiento conjunto del ácido nucleico y de la proteína auxiliar a las mismas células que presentan el antígeno, (incluyendo posiblemente los linfocitos B específicos para el antígeno), de modo que después del encuentro con una vesícula formulada adecuadamente una célula aislada que presenta el antígeno absorbe tanto al ácido nucleico como a su proteína afín. En el caso de la hemoaglutinina de la gripe, los autores observan que la formulación por separado de ácido nucleico (ADN que codifica la hemoaglutinina) y su proteína afín (proteína hemoaglutinina), aquí en forma de proteína de virus inactivada totalmente exenta de ácido nucleico, en compartimentos o poblaciones liposómicos independientes, seguido de mezclado y administración conjunta in vivo, no consiguen el efecto sinérgico de la formulación conjunta del ADN y su proteína afín en las mismas partículas liposómicas de modo que cada liposoma contiene tanto el ADN como su proteína afín. Estos datos apoyan la hipótesis de los autores de que la sinergia del ADN con su proteína afín en la provocación de una respuesta inmunitaria (en este caso contra la hemoaglutinina de la gripe) requiere la formulación apropiada que permita el direccionamiento conjunto tanto del ADN como de su proteína afín a la misma célula presentadora del antígeno.
La presente invención se ilustra en los ejemplos adjuntos:
Ejemplo 1 Hemoaglutinina en liposomas catiónicos Materiales y procedimientos Lípidos
Fosfatidilcolina de huevo (PC), dioleil fosfatidiletanolamina (DOPE) y 1,2-dioleil-3-(trimetilamonio) propano (DOTAP) se adquirieron en Sigma Chemical Co., UK. Todos los lípidos se almacenaron (-20ºC) disueltos en cloroformo, purgados con nitrógeno.
ADN
El plásmido pCI-OVA (ref. ADN OVA) (una gentileza del Dr. T. Nagata, Hamamatsu University School of Medicine, Japón) contiene la proteína albúmina de huevo de pollo (ovoalbúmina, OVA) (Yoshida A., Nagata T., Uchijima M., Higashi T., Koide Y. Advantage of gene gun-mediated over intramuscular inoculation of plasmad DNA vaccine in reproducible induction of specific immune response. Vaccine. 2000, 18, 1725-1729) ADNc clonado en la secuencia EcoRI del plásmido pCI (Promega, Madison, WI) corriente abajo de la zona potenciadora/activadora del CMV. El plásmido pI.17/SichHA (ref. ADN HA) fue proporcionado por el Dr. J. Robertson (NIBSC, UK) (Johnson, P. et al., J. Gen. Virol. 2000, 1737-1745) que contiene la HA completa del virus de la gripe A/Sichuan/2/87. Ambos plásmidos para dosificación fueron producidos comercialmente por Aldevron (Fargo, USA) y contenían <100 unidades de endotoxina (EU)/mg de ADN sin proteína residual detectable.
Proteínas
La proteína del virus inactivada de la gripe A/Sichuan/2/87 completa (purificada por gradiente de sacarosa, proteína principal HA, ref. antígeno HA) se adquirió en el NIBSC, UK. Ovoalbúmina (calidad VI, ref. antígeno OVA) se adquirieron en Sigma Chemical Co., UK.
Preparación de composiciones de liposoma
En resumen, pequeñas vesículas unilaminares (SUV) preparadas a partir de fosfatidilcolina de huevo (PC) y dioleil fosfatidilcolina (DOPE) y 1,2-dioleiloxi-3-(trimetilamonio) propano (DOTAP) (relación molar 4:2:1) por tratamiento con ultrasonidos se mezclaron con ADN o proteína sola o ADN y proteína conjuntamente (Tabla 1). Se prepararon formulaciones por triplicado, dos viales para dosificación (primera y de refuerzo) y un vial para los cálculo de % de oclusión a base de trazador radiomarcado (HA y OVA, ADN y proteína) se añadieron a los materiales para oclusión y se liofilizaron durante la noche como se describe en Gregoriadis, G., Saffle, R. y Hart, S. L. High yield incorporation of plasmid DNA within liposome: effect on DNA integrity and transfection efficiency, J. Drug Targeting, 1996, 3(6), 467-475 y en Kirby, C., Gregoriadis, G. Dehydration-rehydration vesicles (DRV): A new method for high yield drug entrapment in liposomes. Biotechnology, 1994, 2,979-984. Tras la rehidratación en condiciones controladas, las vesículas deshidratadas-rehidratadas generadas (liposomas DRV) se lavaron por centrifugación para eliminar los materiales no incorporados. Los sedimentos lavados se volvieron a poner en suspensión en PBS a volumen de dosis requerido. El ADN y/o la incorporación de proteína en liposomas se estimaron sobre la base de la radioactividad recuperada de ^{35}S (para ADN) y ^{125}I (para la proteína) en los sedimentos en suspensión. Los liposomas se sometieron a microelectroforesis y espectroscopia de correlación de fotones (PCS) a 25ºC en un Malvern Zetasizer 3000 para determinar su potencial zeta (ZP) y el diámetro medio z respectivamente.
TABLA 1
3
Procedimientos en animales
Ratones Balb/c hembra de 6 a 12 semanas (Harlan, UK) se inmunizaron por inyección subcutánea administrada en un volumen de 0,2 ml de dosis (Tabla 2). Las cantidades de la dosis final se calcularon basándose en el % de material (ADN, proteína o ambos) ocluidos (a partir de viales de recuento de radioactividad). Los ratones de referencia negativos recibieron dosis de PBS respectivamente. Los ratones recibieron dos dosis de antígeno los días 0 y 28, con extracciones de sangre de muestra recogidas de la vena de la cola el día 16, 28 y 42 con respecto a la primera inyección.
ELISA de captura de formulación
Se analizó la inmunización de las formulaciones (Tabla 2) por ensayo inmunosorbente con enzima ligada (ELISA) para la antigenicidad de HA (A/Sichuan). Se recubrieron placas de 96 pocillos de química de fijación certificada durante la noche a 4ºC con 50 \mul/pocillo de dilución 1:2.000 de sueros (NIBSC) con referencia HA de oveja anti A/Sichuan en tampón de carbonato (pH 9,6). Después de eliminar la solución de anticuerpo de oveja, se recubrieron los pocillos con 200 \mul de BSA al 10% (p/v) en PBS. Después de 2 h a 37ºC, se eliminó la solución de bloqueo y se añadieron formulaciones (ref. Tabla 2) diluidas en serie (\times2 series) a los pocillos (50 \mul de muestra/pocillo). Se diluyeron las formulaciones en PBS y Triton X100 (Tx-100) que es capaz de lisar formulaciones liposómicas para poner de manifiesto los materiales ocluidos (5) Gregoriadis, G., Brenda McCornack, Mia Obrenovic, Roghieh Saffle, Brahim Zadi e Yvonne Perrie. Vaccine entrapment liposomes. Methods, 1999, 19, 156-162). Tras 1 h de incubación a 37ºC, se lavaron las placas cuatro veces con PBS/Tween 20 y se recubrieron con diluciones de antisuero específico murino (gripe A/Sichuan) a una dilución de 1/5.000 (50 \mul de muestra/pocillo). Después de 1 h de incubación a 37ºC, se lavaron las placas cuatro veces con PBS/Tween 20 y se recubrieron con 50 \mul/pocillo de suero conjugado de
Ig - HRP antirratón de conejo (Dako). Después de 1 h a 37ºC, se lavaron las placas cuatro veces con PBS/Tween 20 y se recubrieron con 50 \mul/pocillo de solución sustrato de o-fenilendiamina (Sigma, Fast OPD). La reacción se interrumpió añadiendo 50 \mul/pocillo de solución de interrupción (ácido sulfúrico 3 M) y se determinó la absorbancia (DO) de cada pocillo a 490 nm.
ELISA de los sueros
Los sueros obtenidos de las extracciones de sangre de la muestra se diluyeron 20 veces en PBS y se mantuvieron a -20ºC hasta que se analizaron por el ensayo inmunosorbente con enzima ligada (ELISA). Se recubrieron placas de 96 pocillos de química de fijación certificada durante la noche a 4ºC con 50 \mul/pocillo de dilución 1:1.000 de sueros (NIBSC, UK) con referencia HA de oveja anti A/Sichuan en tampón de carbonato (pH 9,6). Después de eliminar la solución de anticuerpo de oveja, se recubrieron los pocillos con 200 \mul de FCS (suero de ternero fetal) al 2% (p/v) en PBS. Después de 2 h a 37ºC, se eliminó la solución de bloqueo y se añadieron a los pocillos (50 \mul de muestra/pocillo) 2,5 mg/\mul (en PBS) de proteína de virus inactivado completa de la gripe A/Sichuan/2/87 (purificada en gradiente de sacarosa, proteína principal HA). Tras 1 h de incubación a 37ºC, se lavaron las placas cuatro veces con PBS/Tween 20 (marca registrada) y se recubrieron con diluciones de diferentes sueros experimentales (extracciones de sangre de muestra de cada animal o mezclas de sueros del grupo) partiendo de una dilución de 1/1.000 (50 \mul de muestra/pocillo). Después de 1 h de incubación a 37ºC, se lavaron las placas cuatro veces con PBS/Tween 20 y se recubrieron con 50 \mul/pocillo de suero conjugado de Ig - HRP antirratón de conejo (Dako). Después de 1 h a 37ºC, se lavaron las placas cuatro veces con PBS/Tween 20 y se recubrieron con 50 \mul/pocillo de solución sustrato de o-fenilendiamina (Sigma, Fast OPD). La reacción se interrumpió añadiendo 50 \mul/pocillo de solución de interrupción (ácido sulfúrico 3 M) y se determinó la absorbancia (DO) de cada pocillo a 490 nm. La respuesta del anticuerpo se expresó como el recíproco de la dilución del suero requerida para que la DO alcance una lectura de 0,200 (dilución del punto final). Se establecieron los criterios de conversión del suero en animales de referencia negativa (véase la Tabla 3, respuestas del grupo 1.12), control negativo x2 (DO aproximadamente de 0,2 unidades).
TABLA 2
4
Resultados
Estos datos demuestran que las composiciones dan lugar a oclusión conjunta muy eficaz del ADN y proteína, teniendo la presencia de proteína solamente un efecto negativo menor sobre la eficacia de la oclusión del ADN y viceversa.
La evaluación de las formulaciones para la antigenicidad del HA (cepa de gripe A/Sichuan) se presenta en la Figura 1, la señal de 490 nm de DO es proporcional a la del antígeno HA. En la Tabla 3 se presentan los resultados de anticuerpo de los sueros para los doce grupos (Tabla 2). En la Figura 2 se ilustran también los resultados (día 16), Figura 3 (día 28) y Figura 4 (día 42), el día 15 después de la segunda dosis).
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(Tabla pasa a página siguiente)
5
Exposición
Se hizo la evaluación de las formulaciones (Tabla 2) para la antigenicidad del HA por ELISA de captura (Figura 1) en las formulaciones en ausencia y presencia de Triton X100 (TX100) un agente destructor de liposomas (nota: los grupos 1.3, 1.4, 1.7, 1.10 y 1.12 sirven como referencias negativas para el análisis ya que estas formulaciones no contienen proteína HA). Las formulaciones analizadas en ausencia de TX100 indican antígeno HA fácilmente detectable en las formulaciones que contienen HA en las que la proteína no está formulada con liposomas (grupos 1.8, 1.9 y 1.10), con una pequeña señal positiva del antígeno HA detectable para las formulaciones 1.1 y 1.2, supuestamente generada por exposición de la superficie del antígeno HA capaz de estar unido por anticuerpos empleados en este ensayo. En presencia de TX100 se obtiene una señal positiva sustancialmente mayor de los grupos de liposomas 1.1 y 1.2, lo que indica la detección del antígeno contenida previamente (véase sin TX100) en la formulación de liposomas. Mientras que las formulaciones 1.5 y 1.6 contienen ambas antígeno HA ocluido por los liposomas en ausencia de ADN en la formulación (véase 1.1 y 1.2) puede resolverse poca antigenicidad de HA.
La respuesta inmunitaria generada después de la inmunización con las formulaciones (Tabla 2) se evaluó por medición de la respuesta del anticuerpo contra la gripe (proteína principal HA). Los resultados se resumen en la Tabla 3 y también se ilustran en las Figuras 2, 3 y 4. La formulación 1.1 que estaba constituida tanto por ADN del HA como por proteína suministrada conjuntamente en la misma formulación liposómica produce una respuesta mayor que todas las demás formulaciones en cada muestra analizada de suero extraída (día 16, día 28 y día 42) (día 15 después de la segunda dosis)). La respuesta para esta formulación suministrada conjuntamente es la mayor desde el punto de vista de magnitud (DO 490 nm dilución del suero 1/100 y título) y el número de animales estimados seropositivos en cada punto de extracción de sangre.
Las formulaciones 1.2 y 1.3 que también están constituidas por proteína y ADN suministrados conjuntamente en la misma formulación liposómica no pueden generar como respuesta sustancial como formulación 1.1. Las formulaciones 1.2 y 1.3 están constituidas por proteína y ADN no afines entre sí.
La formulación 1.6 proporciona más indicación de la presente invención, en la que en términos de proteína y de ADN producto administrado a los animales la formulación 1.1 es equivalente a la 1.6. Sin embargo en la formulación 1.1 los productos se suministran conjuntamente en el mismo vehículo liposómico mientras que en la formulación 1.6 el ADN y la proteína se suministran en vehículos liposómicos separados. De nuevo como se planteó anteriormente la respuesta inmunitaria a la formulación 1.1 es sustancialmente mayor que la de la 1.6.
La respuesta al ADN de HA que contiene formulaciones, que excluyen 1.1, (formulaciones 1.3, 1.4, 1.7 y 1.10) esencialmente no pueden generar una respuesta inmunitaria, sin embargo la respuesta puede estar relacionada con la dosis según Johnson, P. et al. J. Gen. Virol. 2000, 1737-1745 ha descrito la respuesta positiva a este plásmido después de la inmunización (no ocluido).
El efecto adyuvante de los liposomas para la proteína suministrada en formulaciones liposómicas (formulación 1.5 frente a formulación 1.11) descrito anteriormente (Gregoriadis G., Tan L., Ben-Ahmeida E. T., Jennings R. Vaccine 1992; 10(11):747-53) es visible débilmente en el día 15 después de la dosis 2 de la extracción de sangre de muestra y de nuevo la dosis y las diferencias del programa de inmunización pueden considerarse para diferentes resultados experimentales. La acción inmunoadyuvante del ADN plásmico en los liposomas descrita anteriormente (Gursel M. et al. Vaccine 1999:17:1376-1383) se demuestra también en la diferencia en las respuestas a la formulación 1.2 y 1.5. Sin embargo, el efecto sinérgico de la formulación conjunta de la proteína hemoaglutinina con su plásmido (afín) apropiado excede mucho cualquier efecto atribuible a los efectos inmunoadyuvantes bien conocidos del ADN tal como los observados por Klinman (Klinman, D. et al. Vaccine 1999 19:25 19-26) para los motivos de CpG.
Aunque los resultados presentados se obtienen siguiendo la administración subcutánea de la formulación liposómica, los mecanismos de acción propuestos, general y específico (más propiedades cinéticas del antígeno), deberían ser eficaces por vías alternativas de administración: vías intravenosa, intramuscular, intradérmica, nasal/pulmonar y oral, etc. De hecho los liposomas se han utilizado con éxito por estas vías para suministrar tanto proteínas como ADN, y generar respuesta inmunitaria.
En resumen, los autores han demostrado que la presente invención es muy eficaz para generar una respuesta inmunitaria cuando se administran a un paciente. La respuesta implica una respuesta del anticuerpo. La mejora presentada por la presente invención implica la composición de materiales que forman el liposoma y, asociada a los liposomas, ácido nucleico que codifica operativamente una proteína antigénica y una proteína suministrada conjuntamente, en la que la proteína suministrada conjuntamente comparte epítopos con la proteína antigénica.
Ejemplo 2 Vacuna contra la hepatitis B dirigida por manosa Materiales y procedimientos Lípidos
Fosfatidilcolina de huevo (PC), dioleil fosfatidiletanolamina (DOPE) y 1,2-dioleil-3-(trimetilamonio) propano (DOTAP) se adquirieron en Sigma Chemical Co., UK. N-[2-(2-{2-[2-(2,3-bis-octadec-9-eniloxipropoxi)-etoxi]-etoxi]-etoxi]-etil]-3-(3,4,5-trihidroxi-6-hidroxime-til-tetrahidro-piran-2-ilsulfanil)-propionamida (fórmula proporcionada a continuación (DOGP4\alphaMan, gentileza del Prof. Francis Schuber (Université Louis Pasteur Strasbourg I, Faculté de Pharmace 74, Route du Rhin, BP 24 67401 Ulkirch Graffenstaden)). Todos los lípidos se almacenaron (-20ºC) disueltos en cloroformo, purgados con nitrógeno.
6
ADN
Plásmido pRc/CMV-HBs(S) (o simplemente pCMV-S) expresa el antígeno de superficie de la hepatitis B (pequeño, o S, proteína) bajo el control del activador precoz inmediato CMV (Davis H. L., Michel M. L., Whalen R. G., DNA-based immunisation for Hepatitis B induces continuous secretion of antigen and high levels of circulating antibody. Human Molecular Genetics. 1993, 2: 1847-1851). El plásmido para dosificación fue producido comercialmente por Aldevron (Fargo, USA) y contenía <100 unidades de endotoxina (EU)/mg de ADN sin proteína residual detectable.
Proteínas
Proteína recombinante del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg), pureza: >95% por SDS-PAGE, purificado a partir de levadura (Hansenula polymorpha adquirida en Aldevron, Fargo, USA Lote 05/00 HBsAg).
Preparación de composiciones de liposoma
En resumen, pequeñas vesículas unilaminares (SUV) preparadas a partir de fosfatidilcolina de huevo (PC) y dioleil fosfatidilcolina (DOPE), 1,2-dioleiloxi-3-(trimetilamonio) propano (DOTAP) y N-[2-(2-{2-[2-(2,3-bis-octadec-9-eniloxipropoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etil]-3-(3,4,5-trihidroxi-6-hidroximetil-tetrahidro-piran-2-ilsulfanil)-propionamida (DOGP4\alphaMan) (relación molar 4:2:1:1) por tratamiento con ultrasonidos se mezclaron con ADN o proteína sola o ADN y proteína (Tabla 4). Se prepararon formulaciones en dos viales por triplicado, (primera y de refuerzo) cada vial contenía trazador marcado con radio (ADN y materiales proteicos) añadido a los materiales que van a ocluirse (para los cálculos de % de oclusión) y se liofilizaron durante la noche como se describe en Gregoriadis, G., Saffie, R. y Hart, S. L. High yield incorporation of plasmid DNA within liposome: effect on DNA integrity and transfection efficiency, J. Drug Targeting, 1996, 3(6), 467-475 y en Kirby, C., Gregoriadis, G. Dehydration-rehydration vesicles (DRV): A new method for high yield drug entrapment in liposomes. Biotechnology, 1994, 2, 979-984. Antes de la congelación (proceso de precongelación en seco) se añadió sacarosa a cada vial en una proporción lípido a sacarosa (p/p) de 1:3 y se dejó disolver a 20ºC (Brahim, Z. y Gregoriadis, G. A novel method for high-yield entrapment of solutes into small liposomes, J. Liposome Research. 2000, 100(1), 73-80). Tras la rehidratación en condiciones controladas, las vesículas deshidratadas-rehidratadas generadas (liposomas DRV) se diluyeron en PBS al volumen de dosis requerido. Un volumen (\sim25%) de cada vial después de la rehidratación se lavó por centrifugación para eliminar los materiales no incorporados. El porcentaje de incorporación de ADN y/o proteína en la formulación liposómica se estimó sobre la base de la radioactividad recuperada de ^{35}S (para ADN) e ^{125}I (para la proteína) en los sedimentos en suspensión. Los liposomas se sometieron a microelectroforesis y espectroscopia de correlación de fotones (PCS) a 25ºC en un Malvern Zetasizer 3000 para determinar su potencial zeta (ZP) y el diámetro medio z respectivamente.
TABLA 4
7
Procedimientos en animales
Ratones Balb/c hembra de 6 a 12 semanas (Harlan, UK) se inmunizaron por inyección subcutánea administrada en un volumen de 0,2 ml de dosis. Las cantidades de la dosis final se resumen en la Tabla 5. Los ratones recibieron dos dosis de antígeno los días 0 y 28, con extracciones de sangre de muestra recogidas de la vena de la cola el día 28 (tras 1 dosis) y 56 (tras 2 dosis) con respecto a la primera inyección.
TABLA 5
8
ELISA de sueros
Los sueros extraídos de extracciones de muestra se diluyeron en PBS y se mantuvieron a -20ºC hasta que se analizaron por el ensayo inmunosorbente con enzima ligada (ELISA). Se recubrieron placas de 96 pocillos de química de fijación certificada durante la noche a 4ºC con 50 \mul/pocillo de proteína recombinante del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) a 2,5 \mug/ml (Aldevron, Fargo, USA lote 05/00 HBsAg) en tampón de carbonato 0,1 M (pH 9,6). Después de incubación durante la noche, se lavaron los pocillos cuatro veces con PBS/Tween 20^{TM} (PBST) a continuación se recubrieron los pocillos con 200 \mul de BSA al 2% (p/v) en PBS. Después de 2 h a 37ºC, se eliminó la solución de bloqueo y se lavaron los pocillos cuatro veces con PBST y se recubrieron con diluciones de suero experimental diferente (extracciones de muestras de sangre de cada animal) partiendo de una dilución de 1/100 (50 \mul de muestra/pocillo). Después de 1 h de incubación a 37ºC, se lavaron las placas cuatro veces con PBS y se recubrieron con 50 \mul/pocillo de suero conjugado de Ig - HRP antirratón de conejo (Dako). Después de 1 h a 37ºC, se lavaron las placas cuatro veces con PBS y se recubrieron con 50 \mul/pocillo de solución sustrato de 3,3',5,5' tetrametilbencidina (TMB, Pierce). La reacción se interrumpió añadiendo 50 \mul/pocillo de solución de interrupción (ácido sulfúrico 2 M) y se determinó la absorbancia (DO) de cada pocillo a 450 nm.
Resultados
Las características físicas (% de oclusión del producto (ADN y/o proteína), tamaño de partícula y potencial superficial (Zeta)) se resumen en la Tabla 6.
TABLA 6
9 
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Las respuestas del anticuerpo (ELISA de los sueros) se expresan como media (n=5 animales/grupo) señal D.O. \pm SEM a la dilución del suero Log_{10} ensayada. Los resultados se expresan en la Figura 5, que presenta los resultados de Ig total 28 días después de una dosis de HbsAG, y la Figura 6, que presenta los resultados de la Ig total 28 días después de la segunda dosis.
Exposición
La utilización de liposomas dirigidos con el ligando manosa como vehículos de suministro para ADN y proteína destinados a la provocación de una respuesta inmunitaria ha sido descrita anteriormente (Kawakami S., Sato A., Nishikawa M., Yamashita F., Hashida M., Gen. Ther. 2000, 7(4):292-9 (ADN), y Latif N., Bachhawat B. K. Immunol. Lett. 1984; 8(2): 75-8 (protein). Además, la utilidad general de la la absorción de antígeno(s) (proteínas) mediada por el receptor de manosa por las células presentadoras del antígeno es reconocida como un componente potente en la provocación de una respuesta inmunitaria (Lanzavecchia A. Curr. Opin. Immunol. 1996; 8: 348-354). La utilización de liposomas dirigidos por el ligando de manosa para suministrar conjuntamente tanto el ADN como la proteína, en el mismo vehículo de suministro (y probablemente al mismo cianocito) no ha sido descrita.
La respuesta inmunitaria generada después de la inmunización con las formulaciones (Tabla 4 y 5) fue evaluada por medición de la respuesta del anticuerpo del antígeno superficial contra la hepatitis B (HBsAg). Los resultados se ilustran en las Figuras 5 y 6). La formulación 2.1 que estaba constituida tanto por ADN de HA como de proteína suministrada conjuntamente en la misma formulación liposómica produce una respuesta mayor que todas las demás formulaciones a cada extracción de muestra de sangre de sueros analizada (día 28 y día 56 (día 28 después de la segunda dosis)). La respuesta a esta formulación suministrada conjuntamente es mayor desde el punto de vista de la magnitud tanto de la dilución de los sueros a una D.O. de 450 nm como del título (lectura del punto final de D.O. 0,3 unidades).
La respuesta a las formulaciones que contienen ADN, excluyendo la formulación 2.1 y la 2.3, genera una respuesta inmunitaria coherente con los resultados publicados (Gregoriadis G. Pharm. Res. 1998, 15(5):661-70) utilizando el mismo producto de ADN (a una dosis de ADN de 10 \mug) en el mismo vehículo liposómico (PC:DOPE:DOTAP), sin el componente lipídico manosa (DOGP4\alphaMan). La acción inmunoadyuvante del ADN plásmido en los liposomas se ha descrito anteriormente (Gursel M. et al. Vaccine 1999: 17:1376-1383) utilizando el mismo ADN (no codificador, control de capacidad ISS) y los productos proteicos como se describe en la presente memoria. La acción adyuvante descrita del componente del ADN para la formulación ocluida conjuntamente de antígeno-ADNp en este artículo está descrita como moderada, a aproximadamente 3 veces el título, después de los resultados de 2 dosis). El resultado similar ejemplificado en la Figura 6, cuando se utiliza un componente de ADN codificador (HBsAg) (Formulación 2.1) presenta un aumento de 30 veces en la respuesta (de la Formulación 2.2). Por lo tanto el efecto sinérgico de la formulación conjunta de la proteína HBsAg con su plásmido apropiado (afín) excede a cualquier efecto atribuible a los efectos inmunoadyuvantes del ADN, aproximadamente solo 3 veces, tal como los observados por Gursel o Klinman (Klinman, D. et al. Vaccine 1999 19:25 19-26) para los motivos de CpG solos.
En resumen, los autores han demostrado que la presente invención es muy eficaz para generar una respuesta inmunitaria cuando se administran a un paciente. La respuesta implica una respuesta del anticuerpo. La mejora presentada por la presente invención implica la composición de materiales que forman el liposoma incluyendo un componente de lípido monosilado y, asociada a los liposomas, ácido nucleico que codifica operativamente una proteína antigénica y una proteína suministrada conjuntamente, en la que la proteína suministrada conjuntamente comparte epítopos con la proteína antigénica.
Ejemplo 3 Protección en la prueba de provocación con virus de la gripe Material y procedimientos Lípidos
Fosfatidilcolina de huevo (PC), dioleil fosfatidiletanolamina (DOPE) y 1,2-dioleil-3-(trimetilamonio) propano (DOTAP) se adquirieron en Sigma Chemical Co., UK. Todos los lípidos se almacenaron (-20ºC) disueltos en cloroformo, purgados con nitrógeno.
ADN
El pI.18/PR8-HA (ref. ADN HA) fue proporcionado por el Dr. J. Robertson (NIBSC, UK) que contenía HA completo de la gripe A/Puerto Rico/8/34. El plásmido para dosificación fue producido comercialmente por Aldevron (Fargo, USA) y contenía <100 unidades de endotoxina (EU)/mg de ADN sin proteína residual detectable.
Proteínas
La proteína del virus inactivado completa de la gripe A/Puerto Rico/8/34 (purificado en gradiente de sacarosa, proteína HA principal, ref. antígeno HA) se adquirió en el NIBSC, UK.
Preparación de composiciones de liposomas
En resumen, pequeñas vesículas unilaminares (SUV) preparadas a partir de fosfatidilcolina de huevo (PC) y dioleil fosfatidilcolina (DOPE) y 1,2-dioleiloxi-3-(trimetilamonio) propano (DOTAP) (relación molar 4:2:1) por tratamiento con ultrasonidos se mezclaron con ADN (ref. ADN HA) y proteína (ref. HA de antígeno) véase Tabla 7. Se prepararon formulaciones por cuadruplicado, dos viales para dosificación (primera y de refuerzo) y dos viales para los cálculos de % de oclusión basándose en el trazador marcado con radio (HA; ADN y proteína) añadidos a los materiales ocluidos y se liofilizaron durante la noche como se describe en Gregoriadis, G., Saffie, R. y Hart, S. L. High yield incorporation of plasmid DNA within liposome: effect on DNA integrity and transfection efficiency, J. Drug Targeting, 1996, 3(6), 467-475 y en Kirby, C., Gregoriadis, G. Dehydration-rehydration vesicles (DRV): A new method for high yield drug entrapment in liposomes. Biotechnology, 1994, 2, 979-984. Tras la rehidratación en condiciones controladas, las vesículas deshidratadas-rehidratadas generadas (liposomas DRV) se lavaron por centrifugación para eliminar los materiales no incorporados. Los sedimentos lavados se volvieron a poner en suspensión en PBS hasta el volumen de dosis requerido. La incorporación de ADN y/o proteína se estimó sobre la base de la radioactividad recuperada de ^{35}S (para ADN) e ^{125}I (para la proteína) en los sedimentos en suspensión. Los liposomas se sometieron a microelectroforesis y espectroscopia de correlación de fotones (PCS) a 25ºC en un Malvern Zetasizer 3000 para determinar su potencial zeta (ZP) y el diámetro medio z respectivamente.
Procedimientos en animales
Ratones Balb/c hembra de 6 a 12 semanas (Harlan, UK) se inmunizaron por inyección subcutánea administrada en un volumen de 0,2 ml de dosis. Las cantidades de la dosis final se resumen en la Tabla 7. Los ratones recibieron dos dosis de antígeno los días 0 y 28, con extracciones de sangre de muestra recogidas de la vena de la cola el día 21 (tras 1 dosis) y 42 (tras 2 dosis) con respecto a la primera inyección.
TABLA 7
10
Prueba de provocación con virus de la gripe vivo
Se sometieron ratones a la prueba de provocación el día 57, con respecto a la primera inmunización, con aproximadamente 10 MID_{50} (50% de dosis ineficaces para ratón) en PBS con BSA al 2% (p/v) de un virus de gripe vivo adaptado a ratón (A/Puerto Rico/8/34) en el National Institute of Biological Standards and Controls, UK (NIBSC). El virus fue administrado a ratones no anestesiados en 50 \mul de volúmenes bilateralmente por instilación intranasal. A intervalo diarios después de la prueba de provocación, se realizaron lavados nasales utilizando 0,5 ml de PBS con BSA al 2% (p/v) por ratón. La presencia de virus de la gripe declarado en las muestras de lavado nasal fue evaluada inmediatamente después de la toma de muestras. Las muestras de lavado nasal en medio esencial mínimo de Eagle exento de suero se colocaron en placas sobre monocapas confluentes tratadas con TPCK-tripsina de células MDCK en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos. Tras la incubación durante 3 días a 35ºC, se determinó la presencia de virus en cada pocillo por incubación de 50 \mul de sobrenadante con un volumen igual del 0,7% (v/v) de glóbulos rojos de pavo. La muestra positiva al virus produjo hemoaglutinación visible (puntos de aglomeración claramente visibles).
ELISA de sueros
Los sueros extraídos de extracciones de muestra se diluyeron en PBS y se mantuvieron a -20ºC hasta que se analizaron por el ensayo inmunosorbente con enzima ligada (ELISA). Se recubrieron durante la noche con 50 \mul/pocillo de HA de virus de la gripe-antígeno PR8 (20 \mug/ml) en PBS placas de 96 pocillos de química de fijación certificada. Se incubaron durante la noche a 4ºC. Después de incubación durante la noche, se lavaron los pocillos cuatro veces con PBS/Tween 20^{TM} (PBST) a continuación se recubrieron los pocillos con 200 \mul de BSA al 2% (p/v) en PBS. Después de 2 h a 37ºC, se eliminó la solución de bloqueo y se lavaron los pocillos cuatro veces con PBST y se recubrieron con diluciones de sueros experimentales diferentes (extracciones de sangre de muestra de cada animal) partiendo de una dilución de 1/100 (50 \mul de muestra/pocillo). Después de 1 h de incubación a 37ºC, las placas se lavaron cuatro veces con PBST y se recubrieron con 50 \mul/pocillo de suero conjugado de Ig-HRP antirratón de conejo (Dako). Tras 1 h a 37ºC, las placas se lavaron cuatro veces con PBST y se recubrieron con 50 \mul/pocillo de solución sustrato de 3,3',5,5' tetrametilbencidina (TMB, Pierce). La reacción se interrumpió añadiendo 50 \mul/pocillo de solución de interrupción (ácido sulfúrico 2 M) y se determinó la absorbancia (DO) de cada pocillo a 450 nm.
Resultados
Las características físicas liposómicas (% de producto (ADN y/o proteína), oclusión tamaño de partícula y potencial superficial (Zeta)) se resumen en la Tabla 8.
TABLA 8
11
Las respuestas del anticuerpo (ELISA de los sueros) se expresan como media (n=5 animales/grupo) señal D.O. \pm SEM a la dilución del suero Log_{10} ensayada. Los resultados se expresan en la Figura 7, que presenta los resultados después de una dosis y la Figura 8, que presenta los resultados después de dos dosis.
Los resultados de la prueba de provocación con virus vivo se presentan en la Tabla 9, como porcentaje de animales (n = 15 probados)/grupo que presentaba virus detectable en las muestras de lavado nasal extraídas.
TABLA 9
12
Exposición
La respuesta inmunitaria generada después de la inmunización con las formulaciones (Tabla 7) fue evaluada por medición de la respuesta contra el virus de la gripe (específica de la cepa A/PR8). Los resultados se ilustran en las Figuras 7 y 8. El grupo (formulación) 3.1 que estaba constituido tanto por ADN de HA como de proteína suministrada conjuntamente en la misma formulación liposómica produce una respuesta mayor que todos los demás grupos (formulaciones) a cada extracción de muestra de sangre de sueros analizada (día 21 y día 42 (día 14 después de la segunda dosis)). La respuesta a este grupo de formulación suministrada conjuntamente es mayor desde el punto de vista de la magnitud tanto de la dilución de los sueros a una D.O. de 450 nm como del título (lectura del punto final de D.O. 0,3 unidades).
La respuesta a los componentes de la carga útil, ADN de HA y proteína mezclados (grupo 3.3), genera continuamente una respuesta inmunitaria más débil que los mismos componentes de la carga útil suministrados conjuntamente (grupo 3.1). De hecho, utilizando la misma carga útil de ADN (a una dosis de ADN de 10 \mug) con una carga útil de proteína reducida (dosis de proteína de 0,5 \mug) en el mismo vehículo liposómico (grupo 3.2), produce una respuesta inmunitaria de Ig del suero equivalente al ADN de HA y la proteína mezclados con una carga útil del componente de la proteína 3 veces mayor (grupo 3.3). El grupo 3.4 no pudo producir ninguna respuesta específica contra Ig de la gripe, sin embargo este grupo no recibió componentes inmunógenos (PBS solo) por lo tanto este resultado es como era de esperar.
Los resultados de la prueba de provocación con virus vivo sirven para indicar si la respuesta inmunitaria provocada en los ratones en respuesta a la inmunización con las formulaciones es adecuada para proteger los animales de la infección por virus. El grupo 3.4 sirve como referencia negativa, ya que estos son animales esencialmente "sin tratamiento previo" que reflejan el perfil normal de la infección por virus después de la prueba de provocación. En este grupo (3.4) todos los animales se infectan con virus el día 4, con una media en % (durante 5 días) del 68% (sem 18%) animales infectados. El grupo 3.3 que estaba constituido por los componentes de la carga útil, ADN de HA y proteína mezclados, suministrados conjuntamente no en forma de liposomas aunque provocando una respuesta contra la gripe (Figura 7) no pudo demostrar una reducción significativa (en comparación con el grupo 3.4) en el % de animales que están infectados con virus con un % medio (durante 5 días) del 37% (sem 10%) de animales infectados. El grupo (formulación) 3.1 que estaba constituido tanto por ADN de HA y proteína, suministrados conjuntamente en la misma formulación liposómica produjo una respuesta del anticuerpo mayor (Figuras 7 y 8) que todos los demás grupos (formulaciones) y demuestra una reducción significativa (en comparación con el grupo 3.4) (p<0,05) en el % de animales que están infectados con virus con un % medio (durante 5 días) de solamente el 7% (sem 6%) de animales infectados.
En resumen, los autores han demostrado que la presente invención es muy eficaz para generar una respuesta inmunitaria, que es capaz de proteger a un paciente de la infección por un organismo infeccioso cuando se suministra a un sujeto. La respuesta implica una respuesta del anticuerpo. La mejora presentada por la presente invención implica la composición de materiales que forman el liposoma suministrando una carga útil de ácido nucleico que codifica operativamente una proteína antigénica y una proteína suministrada conjuntamente, en la que la proteína suministrada conjuntamente comparte epítopos con la proteína antigénica.
Ejemplo 4 Vacuna multivalente contra la gripe Material y procedimientos Lípidos
Fosfatidilcolina de huevo (PC), dioleil fosfatidiletanolamina (DOPE) y 1,2-dioleil-3-(trimetilamonio) propano (DOTAP) se adquirieron en Sigma Chemical Co., UK. Todos los lípidos se almacenaron (-20ºC) disueltos en cloroformo, purgados con nitrógeno.
ADN
Los plásmidos pI.17/HA-Sichuan y pI.18/PR8-HA fue proporcionado por el Dr. J. Robertson (NIBSC, UK) y contenían la HA completa de, respectivamente, la gripe A/Sichuan/2/87 y la gripe A/Puerto Rico/8/34. Los plásmidos para dosificación fueron producidos comercialmente por Aldevron (Fargo, USA) y contenían <100 unidades de endotoxina (EU)/mg de ADN sin proteína residual detectable.
Proteínas
La proteína del virus inactivado completa de la gripe A/Sichuan/2/87 y de la gripe A/Puerto Rico/8/34 (purificado en gradiente de sacarosa, proteína HA principal, ref. antígeno HA) se adquirieron en el NIBSC, UK.
Preparación de composiciones de liposoma
En resumen, pequeñas vesículas unilaminares (SUV) preparadas a partir de fosfatidilcolina de huevo (PC) y dioleil fosfatidilcolina (DOPE) y 1,2-dioleiloxi-3-(trimetilamonio) propano (DOTAP) (relación molar 4:2:1) por tratamiento con ultrasonidos se mezclaron ya sea con ADN pI17/HA-Sichuan y proteína del virus de la gripe A/Sichuan/2/87 o ADN pI18/PR8-HA y proteína del virus de la gripe A/Puerto Rico/8/34, véase Tabla 10. Se prepararon formulaciones por duplicado, un vial para dosificación y un vial para los cálculos de % de oclusión basándose en el trazador marcado con radio (HA; ADN y proteína) añadidos a los materiales ocluidos y se liofilizaron durante la noche como se describe en Gregoriadis, G., Saffie, R. y Hart, S. L. High yield incorporation of plasmid DNA within liposome: effect on DNA integrity and transfection efficiency, J. Drug Targeting, 1996, 3(6), 467-475 y en Kirby, C., Gregoriadis, G. Dehydration-rehydration vesicles (DRV): A new method for high yield drug entrapment in liposomes. Biotechnology, 1994, 2, 979-984. Tras la rehidratación en condiciones controladas, las vesículas deshidratadas-rehidratadas generadas (liposomas DRV) se lavaron por centrifugación para eliminar el ADN no incorporado. Los sedimentos lavados se volvieron a poner en suspensión en PBS hasta el volumen de dosis requerido. La incorporación de ADN y/o proteína se estimó sobre la base de la radioactividad recuperada de ^{35}S (para ADN) e ^{125}I (para la proteína) en los sedimentos en suspensión. Los liposomas se sometieron a microelectroforesis y espectroscopia de correlación de fotones (PCS) a 25ºC en un Malvern Zetasizer 3000 para determinar su potencial zeta (ZP) y el diámetro medio z respectivamente.
Procedimientos en animales
Ratones Balb/c hembra de 6 a 12 semanas (Harlan, UK) se inmunizaron por inyección subcutánea administrada en un volumen de 0,2 ml de dosis. Las cantidades de la dosis final se resumen en la Tabla 10. Los ratones recibieron una dosis el día 0, con extracciones de sangre de muestra recogidas de la vena de la cola los días 14 y 28. La composición liposómica del grupo 4.3 fue una mezcla de las composiciones para los grupos 4.1 y 4.2 mezcladas inmediatamente antes de la administración.
TABLA 10
13
ELISA de sueros
Los sueros extraídos de extracciones de muestra se diluyeron en PBS y se mantuvieron a -20ºC hasta que se analizaron por el ensayo inmunosorbente con enzima ligada (ELISA). Se utilizaron dos protocolos diferentes dependiendo del sustrato de proteína que se estaba detectando.
Para HA-PR8, se recubrieron placas de 96 pocillos de química de fijación certificada con 50 \mul/pocillo de HA de virus de la gripe-antígeno PR-8 (20 \mug/Ml) en PBS. Después de incubación durante la noche a 4ºC, se lavaron los pocillos cuatro veces con PBS/Tween 20^{TM} (PBST) a continuación se recubrieron los pocillos con 200 \mul de BSA al 2% (p/v) en PBS. Después de 1 h a 37ºC, se eliminó la solución de bloqueo y se lavaron los pocillos cuatro veces con PBST y se recubrieron con 50 \mul/pocillo de diluciones de suero experimental diferente (extracciones de muestras de sangre de cada animal) partiendo de una dilución de 1/100. Después de 1 h de incubación a 37ºC, se lavaron las placas cuatro veces con PBST y se recubrieron con 50 \mul/pocillo de suero conjugado de Ig - HRP antirratón de conejo (Dako). Después de 1 h a 37ºC, se lavaron las placas cuatro veces con PBST y se recubrieron con 50 \mul/pocillo de solución sustrato de 3,3',5,5' tetrametilbencidina (TMB, Pierce). La reacción se interrumpió añadiendo 50 \mul/pocillo de solución de interrupción (ácido sulfúrico 2 M) y se determinó la absorbancia de cada pocillo a 450 nm.
Para HA-Sichuan, se recubrieron placas de 96 pocillos de química de fijación certificada con 50 \mul/pocillo de una dilución 1/2000 de suero de oveja anti-HA Sicuani (reactivo patrón NIBSC) en tampón carbonato 0,1 M (pH 9,6). Después de incubación durante la noche a 4ºC, se lavaron los pocillos cuatro veces con PBS/Tween 20^{TM} (PBST) a continuación se recubrieron los pocillos con 200 \mul de BSA al 2% (p/v) en PBS. Después de 1 h a 37ºC, se eliminó la solución de bloqueo y se lavaron los pocillos cuatro veces con PBST y se recubrieron con 50 \mul/pocillo de antígeno HA-Sichuan (5 \mug/ml) en PBS. Después de 1 h a 37ºC, la solución de antígeno se eliminó y se lavaron los pocillos cuatro veces con PBST y se recubrieron con 50 \mul/pocillo de diluciones de suero experimental diferente (extracciones de muestras de sangre de cada animal) partiendo de una dilución de 1/100. Después de 1 h de incubación a 37ºC, se lavaron las placas cuatro veces con PBST y se recubrieron con 50 \mul/pocillo de suero conjugado de Ig - HRP antirratón de conejo (Dako). Después de 1 h a 37ºC, se lavaron las placas cuatro veces con PBST y se recubrieron con 50 \mul/pocillo de solución sustrato de 3,3',5,5' tetrametilbencidina (TMB, Pierce). La reacción se interrumpió añadiendo 50 \mul/pocillo de solución de interrupción (ácido sulfúrico 2 M) y se determinó la absorbancia (DO) de cada pocillo a 450 nm.
Resultados
Las características físicas liposómicas (% de oclusión del producto (ADN y/o proteína), tamaño de partícula y potencial superficial (Zeta)) se resumen en la Tabla 11.
TABLA 11
14
Las respuestas del anticuerpo (ELISA de los sueros) se expresan como media (n=5 animales/grupo) señal D.O. \pm SEM a la dilución del suero Log_{10} ensayada. Los resultados se expresan en las Figuras 9a-d.
Exposición
La respuesta inmunitaria generada después de la inmunización con las formulaciones (Tabla 10) se evaluó por medición de las respuestas del anticuerpo específicas para la cepa HA-PR8 antigripe y HA-Sichuan. Los resultados se ilustran en las Figuras 9 a-d.
El día 14, se detectó una clara respuesta del anticuerpo a los antígenos de la gripe en todos los grupos experimentales a excepción de la formulación 4.4 (PBS). La inmunización con la formulación 4.3, constituida por ADN de HA y proteínas tanto para la gripe Sichuan como para la gripe Puerto Rico 8, produjo títulos de anticuerpo equivalentes, sin desviación estándar de la media (SEM), para cada una de las cepas como las producidas después de la inmunización con la formulación 4.1 (ADN y proteína del virus de la gripe Sichuan) o con la formulación 4.2 (virus de la gripe Puerto Rico 8).
El día 28, hubo un aumento notable en la respuesta del anticuerpo al antígeno de la gripe en comparación con el día 14. Además, la inmunización con la formulación 4.3, constituida por ADN de HA y proteínas tanto para el virus de la gripe Sichuan como para el virus de la gripe Puerto Rico 8, produjo de nuevo títulos de anticuerpo equivalentes, con SEM, para la cepa del virus de la gripe Sichuan a los producidos después de la inmunización con la formulación 4.1 (ADN y proteína del virus de la gripe Sichuan). En cambio, la inmunización con la formulación 4.3, constituida por ADN de HA y proteínas tanto para el virus de la gripe Sichuan como para el virus de la gripe Puerto Rico 8, produjo títulos de anticuerpo para la cepa del virus de la gripe Puerto Rico 8 inferiores a los producidos después de la inmunización con la formulación 4.2 (virus de la gripe Puerto Rico 8) a los dos puntos de dilución probados.
En resumen, los autores han descubierto que la presente invención, cuando se aplica al suministro de vacuna multivalente (p. ej. multicepa), es muy eficaz para provocar respuestas del anticuerpo a las diferentes cepas presentes en la formulación. Esta respuesta del anticuerpo se desarrolla rápidamente (los títulos de anticuerpo específico para el antígeno son >1.000 solamente 14 días de una sola inmunización) y puede ser del mismo nivel que el producido por la presente invención cuando se suministra solamente ADN y componentes de proteína de una sola cepa (p. ej. formulaciones monovalentes). Incluso en ocasiones cuando la inmunización con una formulación equivalente puede provocar una respuesta del anticuerpo menor a una de las cepas en comparación con la producida por la formulación monovalente equivalente, el nivel de esta respuesta de nuevo es alto (>título 1.000) y aumenta con el tiempo. Por consiguiente, la mejora producida por la presente invención, y ejemplificada en este experimento, es la capacidad para provocar una respuesta clara del anticuerpo a varias cepas antigénicas diferentes después de una sola inmunización con una formulación que contiene ADN y antígenos de proteína de todas estas cepas.
Ejemplo 5 Niveles de oclusión del ADN y proteínas y dimensiones del liposoma
El método general de formulación de liposomas indicado en el Ejemplo 1 se utilizó para ocluir el antígeno superficial de la hepatitis B y el ADN plásmido que codifica a este antígeno, a varias concentraciones de proteína, mostradas en la Tabla 12. Los valores de oclusión en porcentaje se presentan en la Tabla 12 y la Tabla 13 presenta el tamaño medio y el potencial zeta de los liposomas.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 12
15
La Tabla 12 demuestra que la oclusión del ADN fue muy eficaz, mientras que la proteína HbsAg fue moderadamente inferior. La presencia del ADN plásmido tuvo un efecto negativo somero sobre la eficacia de la oclusión de la proteína. Sin embargo, cuando la proteína y el ADN se ocluyeron juntos, no hubo ningún efecto negativo sobre la oclusión del ADN. Estos datos demuestran que la eficacia de la oclusión conjunta del ADN y la proteína en estas formulaciones liposómicas no es única para la hemoaglutinina de la gripe A, o única para ningún plásmido. Es probable que si la oclusión eficaz del ADN y la proteína es una propiedad general de estas composiciones liposómicas, sería aplicable a prácticamente cualquier combinación de ADN plásmido y antígeno de proteína.
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TABLA 13 Tamaño medio Z (nm) y potencial zeta (mV) para liposomas utilizados en formulaciones de HBsAg
16
Resulta evidente a partir de estos datos sobre formulaciones liposómicas y de los resultados de los ejemplos 2, 3 y 4, que el intervalo de tamaño es apropiado para absorber por células presentadoras del antígeno clásicas tales como macrófagos y células dendríticas. La absorción de los materiales de estos liposomas por las células B, es probable que requiera algún grado de fragmentación o degradación in vivo o desarrolle liposomas de tamaño más pequeño dentro de la población heterogénea de formulación de liposomas.
Ejemplo 6 Formulaciones no fosfolipídicas Materiales del vehículo
Los materiales 1-monopalmitoil-rac-glicerol (C16:0) (Monopal), colesterol (CHOL) y 3-beta-[N-(N',N'-dimetilamino-etano)carbamoil] colesterol (DC-Chol) se adquirieron en Sigma Chemical Co., UK. Todos los materiales se almacenaron (-20ºC) disueltos en cloroformo, purgados con nitrógeno.
ADN
El plásmido pCI-OVA (ref. ADN OVA) (una gentileza del Dr. T. Nagata, Hamamatsu University School of Medicine, Japón) contiene la proteína albúmina de huevo de pollo (ovoalbúmina, OVA) (Yoshida A., Nagata T., Uchijima M., Higashi T., Koide Y. Advantage of gene gun-mediated over intramuscular inoculation of plasmad DNA vaccine in reproducible induction of specific immune response. Vaccine. 2000, 18, 1725-1729) ADNc clonado en la secuencia EcoRI del plásmido pCI (Promega, Madison, WI) corriente abajo de la zona potenciadora/activadora del CMV. El plásmido p1.18/PR8-HA (ref. ADN HA) fue proporcionado por el Dr. J. Robertson (NIBSC, UK) que contiene la HA completa del virus de la gripe A/Puerto Rico/8/34. El plásmido para dosificación fue producido comercialmente por Aldevron (Fargo, USA) y contenía <100 unidades de endotoxina (EU)/mg de ADN sin proteína residual detectable.
Proteínas
La proteína del virus inactivada de la gripe A/Puerto Rico/8/34 completa (purificada por gradiente de sacarosa, proteína principal HA, ref. antígeno HA) se adquirió en el NIBSC, UK.
Preparación de composiciones
Se prepararon vehículos del sistema de suministro a partir de Monopal y DC-Chol (relación molar 4:2:1) por secado de la película al vacío se hidrataron con agua agitando durante 1 h a 60ºC, después de enfriar a TA, se mezclaron con ADN (ref. ADN HA o ADN OVA) y/o proteína (ref. HA de antígeno) véase Tabla 14. Se prepararon formulaciones por cuadruplicado, dos viales para dosificación (primera y de refuerzo) y dos viales para los cálculos de % de oclusión basándose en el trazador marcado con radio (ADN y proteína) añadidos a los materiales ocluidos y se liofilizaron durante la noche como se describe en Gregoriadis, G., Saffie, R. y Hart, S. L. High yield incorporation of plasmid DNA within liposome: effect on DNA integrity and transfection efficiency, J. Drug Targeting, 1996, 3(6), 467-475 y en Kirby, C., Gregoriadis, G. Dehydration-rehydration vesicles (DRV): A new method for high yield drug entrapment in liposomes. Biotechnology, 1994, 2, 979-984. Tras la rehidratación en condiciones controladas, las vesículas deshidratadas-rehidratadas generadas (liposomas DRV) se lavaron por centrifugación para eliminar el ADN no incorporado. Los sedimentos lavados se volvieron a poner en suspensión en PBS hasta el volumen de dosis requerido. La incorporación de ADN y/o proteína se estimó sobre la base de la radioactividad recuperada de ^{35}S (para ADN) e ^{125}I (para la proteína) en los sedimentos en suspensión. Los vehículos se sometieron a microelectroforesis y utilizando difracción con láser a 25ºC en un Malvern Zetasizer 3000 para determinar su potencial zeta (ZP) y el diámetro medio z respectivamente.
Procedimientos en animales
Ratones Balb/c hembra de 6 a 12 semanas (Harlan, UK) se inmunizaron por inyección subcutánea administrada en un volumen de 0,2 ml de dosis. Las cantidades de la dosis final se resumen en la Tabla 14. Los ratones recibieron dos dosis los días 0 y 28, con extracciones de sangre de muestra recogidas de la vena de la cola el día 21 (tras 1 dosis) y 42 (tras 2 dosis) con respecto a la primera inyección.
TABLA 14
17 
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En la composición de los grupos 6.1 y 6.2 el ADN y la proteína se ocluyeron conjuntamente. En la composición de los grupos 6.3 el ADN y la proteína se ocluyeron por separado y se mezclaron, es decir ésta fue una mezcla de 6.4 y 6.5. En el grupo 6.6 la proteína no se ocluyó.
ELISA de sueros
Los sueros extraídos de extracciones de muestra se diluyeron en PBS y se mantuvieron a -20ºC hasta que se analizaron por el ensayo inmunosorbente con enzima ligada (ELISA). Se recubrieron placas de 96 pocillos de química de fijación certificada con 50 \mul/pocillo de HA de virus de la gripe-antígeno PR-8 (20 \mug/ml) en PBS. Después de incubación durante la noche a 4ºC, se lavaron los pocillos cuatro veces con PBS/Tween 20^{TM} (PBST) a continuación se recubrieron los pocillos con 200 \mul de BSA al 2% (p/v) en PBS. Después de 2 h a 37ºC, se eliminó la solución de bloqueo y se lavaron los pocillos cuatro veces con PBST y se recubrieron con diferentes diluciones de suero experimental (extracciones de muestras de sangre de cada animal) partiendo de una dilución de 1/100 (50 \mul de \mul/pocillo). Después de 1 h de incubación a 37ºC, se lavaron las placas cuatro veces con PBST y se recubrieron con 50 \mul/pocillo de suero conjugado de Ig - HRP antirratón de conejo (Dako). Después de 1 h a 37ºC, se lavaron las placas cuatro veces con PBST y se recubrieron con 50 \mul/pocillo de solución sustrato de 3,3',5,5' tetrametilbencidina (TMB, Pierce). La reacción se interrumpió añadiendo 50 \mul/pocillo de solución de interrupción (ácido sulfúrico 2 M) y se determinó la absorbancia (DO) de cada pocillo a 450 nm.
Resultados
Las características físicas del vehículo (% de oclusión del producto (ADN y/o proteína), tamaño de partícula y potencial superficial (Zeta)) se resumen en la Tabla 15.
TABLA 15
18
Las respuestas del anticuerpo (ELISA de los sueros) de cada animal (n=5/grupo) se expresan como el recíproco de la dilución del suero requerido para que la D.O. alcance una lectura de 0,270 (dilución del punto final, \sim x2 D.O. de los sueros de ratón normal a una dilución 1/100 ensayada). Los resultados se expresan en la Figura 10.
Exposición
Se evaluó la respuesta inmunitaria generada después de la inmunización con las formulaciones (Tabla 14) por medición de la respuesta contra el virus de la gripe (cepa A/PR8 específica). Los resultados se ilustran en la Figura 10. El grupo (formulación) 6.1 que esta constituido tanto por ADN de HA como por la proteína suministrados conjuntamente en el mismo vehículo de suministro produce una respuesta mayor que todos los demás grupos excepto el grupo 6.2.
Los resultados indican que: el suministro de la proteína HA no ofrece ventajas sobre la proteína sola (Grupo 6.4 frente al Grupo 6.6), el suministro de ADN de HA solo no produce ninguna respuesta de anticuerpo significativa (Grupo 6.5), de hecho 4 de cada 5 animales no pueden provocar una respuesta mayor que el límite de detección del análisis (dilución de suero 1/100), el suministro de la mezcla de ADN de HA y proteína en vehículos independientes (Grupo 6.3) no ofrece ninguna ventaja sobre la proteína sola o la proteína suministrada en el vehículo (Grupo 6.6 y 6.4 respectivamente) y el suministro conjunto de la proteína HA con un componente de ADN (HA u OVA, Grupos 6.1 y 6.2) genera una respuesta contra HA significativamente mayor que, el material suministrado en la mezcla o los materiales suministrados solos (Grupos 6.3, 6.4, 6.5 y 6.6 respectivamente).
En el contexto de la presente invención la última observación es aplicable tanto al componente del ADN "afín" como al "ajeno". La respuesta del sistema inmunitario analizada está restringida a las respuestas del antígeno y a la respuesta inmunitaria mediada celular (T cooperador, CTL, etc.) no se han examinado. Por lo tanto la equivalencia en las respuestas inmunitarias a los grupos ADN "afines" y "ajenos" (Grupo 6.1 y 6.2) no puede concluirse. De hecho, la inmunización con ADN de HA solo (Plasmid DNA encoding influenza virus haemagglutinin induces Th1 cells and protection against respiratory infection despite its limited ability to generate antibody responses. Johnson P. A., Conway M. A., Daly J., Nicolson C., Robertson J., Mills K. H.: J. Gen. Virol. julio del 2000; 81(Pt 7):1737-45) se ha descubierto que proporciona protección en la prueba de provocación del virus de la gripe en ausencia de respuestas de anticuerpo basadas así en la respuesta inmunitaria mediada celular sola. Ya que el suministro conjunto del Grupo 6.1 "afín" posee ADN de HA como componente activo de la formulación y el Grupo 6.2 "ajeno" no contiene ADN de HA como componente activo de la formulación, no parece irrazonable sugerir que el Grupo 6.1 pueda provocar una respuesta inmunitaria mediada por células adicional que no se ha medido.
En resumen, los autores han demostrado que la presente invención es muy eficaz para generar una respuesta inmunitaria. La respuesta implica una respuesta del anticuerpo. La mejora presentada por la presente invención implica la composición de un vehículo para suministro sin componentes fosfolipídicos suministrando una carga útil de ácido nucleico que codifica operativamente una proteína antigénica y una proteína suministrada conjuntamente antigénica.

Claims (25)

1. Composición para el suministro conjunto a una célula de un ácido nucleico y una proteína auxiliar que comprende vesículas formadas por componentes anfífilos, en la que el ácido nucleico codifica en un sujeto animal operativamente una proteína antigénica o parte de la misma que comparte por lo menos un epítopo con la proteína auxiliar, comprendiendo la composición dicho ácido nucleico y dicha proteína auxiliar asociados a las mismas vesículas tanto uno como el otro, en la que la composición contiene ácido nucleico y proteína en una proporción en peso en el intervalo comprendido entre 1.000:1 y 1:1.
2. Composición según la reivindicación 1, en la que las vesículas son liposomas formados a partir de materiales formadores de liposomas y dicho ácido nucleico y dicha proteína auxiliar se asocian con los liposomas.
3. Composición según la reivindicación 2, en la que el ácido nucleico está ocluido en el espacio intravesicular del liposoma.
4. Composición según la reivindicación 2 ó 3, en la que la proteína auxiliar es accesible en la superficie externa de los liposomas.
5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que los componentes anfífilos comprenden por lo menos un componente con carga catiónica en una cantidad tal que las vesículas tienen una carga positiva general.
6. Composición según la reivindicación 5, en la que el componente catiónico se selecciona de entre 1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP), 1,2-bis(hexadeciloxi)-3-trimetilaminopropano (BisHOP), cloruro de \beta-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietilamonio (DOTMA) y 3\beta-(N,N-dimetilaminoetano)carbamil-colesterol (DC-CHOL).
7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el ácido nucleico comprende más de una molécula, cada una de las cuales codifica una proteína antigénica diferente, y en la que la proteína auxiliar comprende las proteínas correspondientes que comparten epítopos con cada una de dichas proteínas antigénicas.
8. Composición según la reivindicación 7, en la que las moléculas de ácido nucleico están asociadas a la misma vesícula.
9. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proteína antigénica y la proteína auxiliar proceden de un virus, preferentemente de la gripe.
10. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el ácido nucleico es el ADN, preferentemente el ADN plásmido.
11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es una vacuna.
12. Composición según la reivindicación 11, adaptada para la administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, nasal, oral, a través de las mucosas o pulmonar.
13. Utilización de vesículas formadas por componentes anfífilos, en la que el ácido nucleico codifica operativamente una proteína antigénica o parte de la misma que comparte por lo menos un epítopo con la proteína auxiliar, comprendiendo la composición dicho ácido nucleico y dicha proteína auxiliar asociados a las mismas vesículas tanto uno como el otro en una proporción en peso en el intervalo comprendido entre 1.000:1 y 1:1, para la preparación de una composición destinada a su utilización en un procedimiento de generación de una respuesta inmunitaria en un animal administrando la composición al animal.
14. Utilización según la reivindicación 11, en la que la composición es una composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12.
15. Utilización según la reivindicación 13 ó 14, en la que la respuesta inmunitaria comprende una respuesta del anticuerpo específica para la proteína antigénica y/o la proteína auxiliar.
16. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en la que la respuesta inmunitaria implica la estimulación de los linfocitos T citotóxicos.
17. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, que proporciona inmunidad contra la infección por un agente infeccioso, preferentemente un virus.
18. Procedimiento para formar una composición liposómica que comprende las etapas siguientes:
\newpage
a)
proporcionar una suspensión acuosa de pequeñas vesículas unilaminares (SUV) formadas por materiales formadores de liposomas;
b)
poner en contacto la suspensión acuosa de las SUV con ácido nucleico que codifica operativamente en un sujeto animal una proteína antigénica para formar una suspensión de SUV-ácido nucleico;
c)
deshidratar la suspensión de SUV-ácido nucleico para proporcionar una mezcla deshidratada; y
d)
rehidratar la mezcla deshidratada en un medio de resuspensión acuoso para formar una suspensión de liposomas que contienen ácido nucleico,
que comprende la etapa que consiste en introducir una proteína auxiliar que comparte por lo menos un epítopo con dicha proteína antigénica por lo que los liposomas que contienen ácido nucleico se asocian a dicha proteína auxiliar y en la que la proporción en peso de ácido nucleico a proteína auxiliar está en el intervalo comprendido entre 1.000:1 y 1:1.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la proteína auxiliar se pone en contacto con la suspensión acuosa de las SUV antes, durante o después de la etapa b y antes de la etapa c.
20. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la proteína auxiliar está presente en el medio de resuspensión.
21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en el que los materiales que forman el liposoma comprenden por lo menos un fosfolípido y por lo menos un esterol.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que los materiales comprenden por lo menos un componente catiónico y los liposomas tienen un carga catiónica general.
23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, en el que la proporción en peso de ácido nucleico a liposoma que forma los materiales está en el intervalo comprendido entre 1:100 y 1:1000, preferentemente entre 1:100 y 1:300.
24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23, en el que la proporción en peso de ácido nucleico a proteína auxiliar está en el intervalo comprendido entre 30:1 y 5:1.
25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, en el que la deshidratación es por liofilización.
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